Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение фенотипической нестабильности генетически трансформированных клеток китайского хомячка

ВАК РФ 03.00.17, Цитология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Глебов, Олег Константинович

ВВЕДЕНИЕ . 6*

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. II

1.1. Способы введения чужеродной ДНК в соматические клетки.

1.2. Системы "ген-селективная среда',' используемые для выделения генетически трансформированных клеток.

1.3. Особенности процесса генетической трансформации соматических клеток

1.4. Гомологичная и незаконная рекомбинация чужеродных молекул ДНК в соматических клетках: совместный перенос генов и встраивание в геном.

1.5. Стабильность и причины утраты трансформантного фенотипа соматических клеток.

1.6. Экспрессия ^трансформированных генов в соматических клетках.

1.7. Стабильность экспрессии ^трансформированных генов в соматических клетках

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

2.1. Культивирование клеток.

2.2. Трансформация клеток китайского хомячка ТК геном ВПГ

2.3. Анализ стабильности ТК^-фенотипа клеток трансформантных клонов.

2.4. Выделение и анализ субклонов трансформантных клонов

2.5. Обработка клеток Мит, Т£А и определение устойчивости клеток к Мит и ОТ

2.6. Происхождение плазмцц, использован- ' ных в работе

2.7. Выделение пдазмидных ДНК из клеток е.coli

2.8. Выделение ДНК из соматических клеток

2.9. Выделение метафазных хромосом и получение ДНК из фракций лизата метафазных клеток.

2.10.Обработка ДНК рестривдионннми эндонуклеазами, электрофорез и выделение фрагментов ДНК.

2Д1.Мечение ДНК с помощью переноса разрывов ДНК полимеразой I из клеток Е. coli или Micrococ-. cus luteus и гибридизация ДНК.

2.12.Трансформация клеток е.coli SK1592 гес+ низкомолекулярной ДНК из клеток транс-формантного клона 2T30I

2.13.Определение активности и изоэлектрическое фокусирование в полиакриламщщом геле тимидин киназы.

2.14.Статистическая обработка результатов.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОВОТДЕНИЕ

3.1. Вццеление и характеристика клона А

ТК""-клеток китайского хомячка.

3.2. Особенности процесса трансформации клеток клона

А238 плазмидными ДНК, содержащими ТК ген ВПГ

3.3. Активность ТК в клетках трансформантных клонов.

3.4. Метод различения соматических клеток, экспрессирующих собственную или вирусную ТК.

3.5. Анализ состояния плазмццных последовательностей во фра. циях высоко- и низкомолекулярной ДНК клеток трансформантных клонов, и "спасение" экстрахромосомных молекул плазмидных ДНК.

3.6. Локализация ТК гена ВПГ1 в клетках трансформантных клонов.

3.7. Стабильность ТК^-фенотипа клеток трансформантных клонов.

3.8. Наследуемость нестабильности по ТК+-фенотипу и стабилизация ТК+-фенотипа клеток трансформантных клонов

3.9. Связь потери ТК^-фенотипа с изменениями в ДНК.

3.10.Модель генетической трансформации соматических клеток.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение фенотипической нестабильности генетически трансформированных клеток китайского хомячка"

Одной из основных проблем общей генетики, имеющей как фундаментальное, так и прикладное значение, является вопрос о природе фенотипической изменчивости и ее взаимосвязи с генотипиче-ской изменчивостью. Существенную часть наследуемых изменений в популяциях соматических клеток в культуре составляют фенотипиче-ски нестабильные изменения*. Для ряда вариантов соматических клеток (в частности, для клеток, устойчивых к метотрексату) показано, что фенотипическая нестабильность (т.е. высокая частота реверсий и утрата признака при культивировании клеток на среде без селективных агентов) связана с генотипически нестабильными изменениями (см. обзор Глебов, Абрамян, 19846). Причины генотипичес-кой нестабильности, и механизмы, посредством которых реализуется нестабильность генетических изменений остаются, однако, неизвестными.

Анализ свойств многих других вариантов соматических клеток также указывает на то, что обнаруживаемая ими генетическая нестабильность является, скорее всего, следствием генотипической нестабильности (Глебов, Абрамян, 1984а; 19846). Одной из основных

Безотносительно к механизмам нестабильности, мы называем наследуемую в ряду клеточных поколений нестабильность по какому-либо признаку генетической нестабильностью. Генетическая нестабильность по какому-либо признаку, обусловленная высокой частотой изменений в последовательности ДНК соответствующего локуса далее называется генотипической нестабильностью. Исходя из этих определений, наследуемую фенотипическую нестабильность следует называть генетической нестабильностью. причин возникновения таких вариантов может быть встраивание внутри или. вблизи соответствующих локусов чужеродных для данной области генома фрагментов ДНК. Как известно, существенную часть генома эукариот составляют диспергированные средне-повторяющиеся последовательности ДНК, значительная часть которых, по современным представлениям, способна участвовать в процессах реорганизации генома, либо изменяя свою локализацию (т.е. выступая как МГЭ), либо индуцируя перестройки в прилежащих последовательностях ДНК (Spradling, Rubin, 1981; Ильин, 1982а). Как показали исследования организации МГЭ и особенностей процесса их перемещения, клетки эукариот обладают особыми системами, контролирующими процессы реорганизации генома (см. обзоры: Shapiro, 1982; Shapiro, Cordeil, 1982). И хотя в случае млекопитающих о работе таких систем известно крайне мало, пример с генами иммуноглобулинов показывает, что реорганизация генома является результатом действия на специфические последовательности ДНК специфических ферментов (или других, узнающих последовательности ДНК, белков), синтез которых в определенных типах клеток и в определенное время детерминирует характер перестроек ДНК (Tonegawa, 1983). Очевидно, что в клетках млекопитающих, как и в клетках дрозофилы (Ильин, 19826), перемещение МГЭ, в том числе и последовательностей ДНК типа описанных МакКлинток (McCiintock, 1950) контролирующих элементов, непосредственно вовлеченных в процессы перестроек хромосом, находятся под контролем специальных генетических систем. В настоящее время можно утверждать, что основной причиной генетической нестабильности клеток эукариот являются не ошибки или нарушения в работе систем репликации, рекомбинации или репарации ДНК, а процессы реорганизации генома, опосредуемые специфическими белками, и зависящие от особенностей структуры и, возможно, суперструктуры тех или иных участков генома.

Генетически нестабильные мутации, если они являются результатом встраивания МГЭ или других подобных последовательностей ДНК, отражают процессы реорганизации генома эукариот, и могут быть полезным инструментом для их анализа. Таким образом, один из возможных подходов к выявлению последовательностей ДНК, участвующих в реорганизации генома эукариот, и изучению механизмов генотипической нестабильности заключается в исследовании природы генетически нестабильных изменений. Другой возможный и более общий, на наш взгляд, подход может основываться на использовании молекулярных зондов - фрагментов ДНК известной структуры, переносимых и встраиваемых в геном эукариот в процессе генетической трансформации соматических клеток. Таким путем можно, по-видимому, выявить участки хромосом, подверженных перестройкам в разной степени, и приступить к изучению особенностей структуры и организации таких участков генома. Этот подход представляется тем более перспективным, что одной из особенностей генетически трансформированных клеток: является нестабильность по признакам, детерминированным чужеродной ДНК, а это - по соображениям, указанным выше, может быть результатом генотипической нестабильности клеток;

Однако, несмотря на интенсивные исследования и важные результаты, полученные с помощью метода генетической трансформации соматических клеток, многие вопросы, касающиеся механизмов репликации, встраивания в геном и экспрессии чужеродной генетической информации, а также иных структурных и функциональных взаимодействий экзогенной ДНК с геномом клеток-реципиентов, остаются невыясненными. В частности, не решены вопросы не только о природе фенотипической нестабильности генетически трансформированных клеток, но даже и о том является ли она наследуемой, т.е. генетичесг кой нестабильностью, поскольку полученные в ряде работ данные противоречат друг другу. Имеющиеся обобщения и модели процесса генетической трансформации построены, главным образом, на основе результатов, полученных при трансформации дефектных по ПК клеток МЫШИ ЛИНИИ LMtk" (см. обзоры: Scangos, Ruddle, 1981; Huttner, Ruddle, 1982). Данные же, полученные в некоторых работах, указывают на то, что особенности процесса генетической трансформации клеток: другой видовой принадлежности - человека (Shiroki et al., 1983) и китайского хомячка (Abraham et al., 1982), - могут быть иными. В этих условиях особое значение приобретает сравнение параметров генетической трансформации для линий клеток-реципиентов независимого происхождения, которое может помочь выявить как общие, присущие всем соматическим клеткам, так и частные, свойственные только данной линии клеток, закономерности. Поскольку нестабильность трансформантного фенотипа (т.е. признака, обусловленного экспрессией чужеродной генетической информации) является характерной особенностью генетически трансформированных соматических клеток, очевидно, что без выяснения причин такой нестабильности невозможно и понимание механизмов генетической трансформации клеток. Исследование причин и механизмов нестабильности трансформантного фенотипа клеток позволит, с другой стороны, оценить перспективы использования метода генетической трансформации для изучения процессов реорганизации генома эукариот и систем, контролирующих такие процессы.

Целью работы было выяснение особенностей процесса генетической трансформации клеток китайского хомячка и изучение природы нестабильности трансформантного фенотипа клеток. Для этого следовало:

I. Выделить клон дефектных по ТК клеток: китайского хомячка, трансформировать клетки плазмидными ДНК, содержащими Ж ген ВПГТ, и выделить клоны клеток с Ж^-фенотипом.

2. Доказать трансформантную природу выделенных клонов ТК+-клеток, для чего изучить свойства экспрессируемой в них ТК.

3. Изучить зависимость частоты трансформации и эффективности трансформации -клеток китайского хомячка от количества плазмидной ДНК, содержащей ТК ген ВПГ1, и от количества эукари-отной ДНК-носителя. Установить, влияют ли на частоту и эффективность трансформации изменения в составе смеси трансформирующих ДНК и в структуре плазмидных ДНК.

4. Проанализировать состояние и изучить локализацию плазмидных последовательностей ДНК, содержащих 1К ген ВПГ1, в клетках трансформантных клонов.

5. Изучить стабильность ТК4"-фенотипа клеток трансформантных клонов. Выяснить, влияют ли на этот признак изменения в структуре и составе смеси трансформирующих ДНК, и как сказывается на стабильности трансформантного фенотипа обработка клеток опухолевым промотором ТМ.

6. В случае, если клетки трансформантных клонов будут нестабильны по ТК+-фенотипу, определить, является ли свойство нестабильности клеток по трансформантному фенотипу наследуемым в ряду клеточных поколений признаком, и изучить детерминацию признака "скорость потери И^-фенотипа".

7. Исследовать возможность и закономерности процесса стабилизации ТК^-фенотипа клеток трансформантных клонов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Первое сообщение об успешной генетической трансформации соматических клеток в культуре было опубликовано в 1962 г (Szybai-ski et al., 1962; Szybalska, Szybalski, 1962). Шибальский и сотрудники трансформировали дефектные по П&РТ клетки человека линии Д98 (получившей впоследствии наименование HeLa) тотальной ДНК из ГФРТ*"-клеток человека. Дня выделения трансформированных ГФРТ1"-клеток: авторы впервые использовали селективную среду ГАТ, и показали при помощи соответствующих контролей, что только ДНК из ГФРТ^-клеток увеличивает частоту ГАТ-резистентных клеток в популяции ГФРТ-клеток-реципиентов. Однако, поскольку для трансформации использовалась ДНК из клеток той же видовой принадлежности, авторы не смогли убедиться в том, что ими действительно получены генетически трансформированные соматические клетки. Долгое время попытки воспроизвести результаты Шибальского и др. были безуспешными, возможно, потому что на была оценена роль образования преципитата ДНК-фосфата кальция для успешной трансформации клеток;в этих опытах (см.: Scangos, Ruddle, 1981). Впервые доказательство того, что фенотип соматических клеток способен изменяться за счет экспрессии чужеродных генов, было получено Мак Брайдом и Озером (McBride, Ozer, 1973). Авторы использовали для трансформации ГФР^Г-клеток мыши изолированные из ГФРТ^-клеток' китайского хомячка метафазные хромосомы, и показали, что ГФР^-фе-нотип ГАТ-резистентных клеток определяется присутствием фермента со свойствами, характерными для донорных клеток:.

Основные результаты, полученные при трансформации соматических клеток, изолированными метафазными хромосомами, суммированы в обзорах ( McBride, Peterson, 1980; Klobutcher, Ruddle, 1981 ) и вкратце таковы: I) при обработке изолированными метафазными хромосомами большинство соматических клеток включает одну или несколько хромосом., подвергающихся затем перестройкам и деградации; частота генетической трансформации даже с использованием усовершенствованных методик (Wullems et al., 1975; Miller, Ruddle, 1978;

-5

Klobutcher et al., 1980) не превышает 5 x 10 , и для выделения трансформированных клеток необходимо использовать селективные среды; 2) максимальный размер переносимого фрагмента ДНК (трансгенома), обнаруживаемого в трансформированных клетках достигает значительного размера, так, что его можно выявить с помощью световой микроскопии (до 196 ДНК от генома клеток-реципиентов); наблюдается не только совместный перенос генов, сцепленных с определяющим селективный фенотип геном, но и перенос несцепленных с таковым генов; 3) встраивание трансгенома в геном клеток-реципиентов происходит во многие сайты (но, в основном, в какой-то один для каждой трансформированной клетки), роль гомологичной рекомбинации в этом процессе остается неизвестной; при обратной селекции клеток трансформантных клонов (т.е. селекции клеток: с исходным фенотипом) наблюдается утрата цитологически обнаружимых фрагментов чужеродных хромосом, и утрата генов, перенесенных совместно с геном, определяющим селективный фенотип, как сцепленных, так и несцепленных с ним в геноме донорных клеток; однако имеются примеры и некоординированной утраты генов, совместно перенесенных при трансформации и сцепленных в геноме донорных клеток (Wlllecke et al., 1976); 4) трансформантный фенотип клеток, как правило, нестабилен; при длительном культивировании клеток: на селективной среде может происходить стабилизация признаков, детерминированных чужеродными генами; стабилизация трансформантно-го фенотипа является необратимым процессом. Представленные данные позволили предположить, что основной причиной нестабильности фенотипа соматических клеток, трансформированных при помощи изолированных метафазных хромосом, может быть неупорядоченная сегрегация автономно реплицирующихся фрагментов чужеродных хромосом, и что стабилизация трансформантного фенотипа связана с встраиванием таких фрагментов в геном клеток-реципиентов (Klobutcher, Ruddle, 1979; Klobutcher et al., 1980). В связи с трудностями анализа состояния чужеродной ДНК в клетках, трансформированных изолированными метафазными хромосомами (т.е. фактически тотальной ДНК клеток; эукариот), в настоящее время этот метод используется только для специальных целей (см., например:Bostock, Tyler

Smith, 1982; Bostock, Clark, 1983).

В 1977 г ряд исследователей сообщил о трансформации соматических клеток мыши и человека фрагментами ДНК ВПГ1, содержащими Ж ген (Bachetti, Graham, 1977; Maitland, McDougall, 1977; Wig-ler et al., 1977). Успех этих работ был связан с использованием для трансформации преципитата ДНК-фосфат кальция - метода, который, как было показано ранее, существенно повышает инфекционноеть ДНК аденовируса при трансфекции соматических клеток (Graham, van der Eb, 1973). Сравнительно небольшой размер генома ВПГ1 о около 10 дальтон - позволил довольно быстро локализовать Ж ген в Вашн1-фрагменте ДНК (Wigler et al., 1977) и клонировать этот же ген в составе указанного, либо несколько большего по размеру

Kpnl-фрагмента ДНК (Colbere-Garapin et al., 1979; Enquist et al.,

1979; Wilkie et al., 1979; McKnight, Gavis, 1980). Высокая частота трансформации соматических клеток с клонированными генами вирусов и эукариотных организмов (до I х 1СГ3) и возможность детального анализа состояния чужеродной ДНК в клетках (с использованием ме-32 ченой Р-ДНК соответствующего вектора) привели в короткое время к тому, что метод генетической трансформации соматических клеток; в культуре стал широко использоваться как для решения теоретических проблем, связанных, например, с анализом функциональной роли тех или: иных последовательностей ДНК гена, так и для решения прикладных задач, в частности выделения и идентификации генов эукариот.

При помощи переноса генов в соматические клетки в культуре была твердо установлена роль "ТАТА"-последовательности (последовательности Хогнесса) в корректной инициации транскрипции эукариотных генов, что после опытов по транскрипции генов, введенных микроиньекцией в ооциты шпорцевой лягушки выглядело сомнительным (обзор: Breatnach, Chambón, 1981). Посредством этого метода в геноме вирусов и эукариотных организмов были выявлены принципиально новые по сравнению с прокариотами регуляторные последовательности ДНК - так называемые усилители (enhancers), стимулирующее действие которых на транскрипцию вирусных и эукариотных генов не зависит от их ориентации и (в значительных пределах) удаленности от точки инициации транскрипции регулируемых генов (обзоры: Boss, 1983; Khoury, Grúas, 1983). Метод генетической трансформации соматических клеток позволил разработать схемы выделения генов, для которых осуществление традиционных схем - с обогащением и выделением специфических мРНК- затруднительно или невозможно. С помощью этого метода были выделены гены ТК курицы (Perucho et al., 1980b), человека (Bradshaw, 1983; Lin et al., 1983) и китайского хомячка (Lewis et al., 1983), АФРТ китайского хомячка ( Lowy et al. ,1980 ) и мыши ( Sikela et al. ,1983 ), и ГФРТ человека ( Jolly et al., 1982;1983 ). Особенно обещающим является использование для клонирования и выделения генов космидных челночных векторов (Lindenmaier et al., 1982; Lan, Kan, 1983) f которые, после введения в соматические клетки и идентификации экспрессирующих нужный ген клеток, могут быть с легкостью выделены и размножены в бактериях; таким способом уже клонирован ген Ж человека (Lan, Кап, 1984). Наконец, с помощью генетической трансформации соматических клеток: идентифицирован ряд генов из семейств множественных генов главного комплекса гистонесовместимости человека, свиньи и мыши (обзор: Marx, 1982), для которых проблема идентификации стоит даже более остро, чем проблема клонирования.

Значительное число работ последних лет посвящено идентификации и выделению с помощью генетической трансформации клеток мыши линии HIH/3T3 эукариотных генов, способных в определенных обстоятельствах приобретать онкогенную активность; эти работы существенно повлияли на понимание механизмов злокачественной трансформации клеток эукариот (обзор: Cooper, 1982).

Другое перспективное направление, в котором используется метод генетической трансформации, связано с выделением и идентификацией генов эукариот, кодирующих молекулы поверхности клеток, специфичные для процесса цитодифференцировки. Продукты таких генов могут быть обнаружены с помощью антител, меченых флюоресцентными красителями, непосредственно на живых клетках, которые могут быть узнаны и отделены в проточном микрофлюориметре. Это позволяет конструировать "библиотеки" трансформированных клеток, экспрессирующих гены поверхностных антигенов, из которых можно, отобрав нужный трансформантный клон, выделять последовательности ДНК, способные, по крайней мере, служить молекулярными зондами для идентификации интересующих исследователя генов в геномных библиотеках (обзор:Kamarck et al., 1983 ). Таким способом идентифицированы трансформированные клетки, несущие чужеродные гены, кодирующие специфические для гранулоцитов и лимфоцитов дифферен-цировочные антигены (Chang et al., 1982)#

С помощью метода генетической трансформации соматических клеток можно, в принципе, выделять любые гены, если существуют селективные среды, позволяющие отделять клетки, экспрессирующие нужный ген. Как подготовительный этап для выделения генов системы репарации ДНК клеток эукариот, рассматривают авторы свои работы, в которых осуществлена генетическая трансформация чувствительных к ультрафиолетовому облучению клеток китайского хомячка и пигментной ксеродермы человека к устойчивому к облучению ультрафиолетовым светом фенотипу (Takano et al., 19В2; Rubin et al., 1983).

Успешные работы по генетической трансформации соматических клеток в культуре, и развитие методов генной инженерии послужили стимулом для исследований, посвященных введению чужеродных генов в соматические клетки организмов. Ставридис и Лсаллидополус (Stavridis, Psaiiidopolous,1982) использовали способность эрит-робластов избирательно поглощать в процессе опосредованного рецепторами эндоцитоза трансферрин для введения в клетки крови собаки комплекса трансферрин-ДНК-гистоны, а Николау с сотрудниками (Sene, Nicolau, 1981; Nicolau et al., 1983; Soriano et al.,1983) сообщили о введении с помощью липосом гена препроинсулина крысы в клетки печени, клетки Купфера и эндотелиальные клетки крысы, и о его экспрессии. Другой возможный путь введения экзогенной генетической информации в организм - это генетическая трансформация in vitro клеток костного мозга с последующей инъекцией трансформированных клеток в кровь облученным подопытным животным (так называемая, замещающая генотерапия). Используя этот метод, Карр и др. (Carr et al., 1983) показали, что в экстрактах клеток селезенки мыши обнаруживается фермент (ДГФР, устойчивая к метотрек-сату), кодируемый введенным в клетки костного мозга чужеродным геном. Вце один возможный путь введения генов в эукариотные организмы - микроиньекция ДНК в яйцеклетки, с последующей имплантацией яйцеклеток в матку животного. Показано, что чужеродные гены не только встраиваются в геном, на и способны экспрессиро-ваться в соматических клетках мышей, полученных из яйцеклеток:, подвергнутых микроиньекции (Costantini, Lacy, 1981; Brinster et al., 1981; Palmiter et al., 1982a; 1982b). Однако, как число копий интегрированных чужеродных генов, так и уровень их экспрессии чрезвычайно варьируют в трансформированных таким способом мышах. Кроме того, и структура введенных генов, и характер их экспрессии существенно изменялись в последующих поколениях животных (Palmiter et al., 1982b). Следует отметить, что в случае ТК гена ВПГ1, поставленного под контроль регуляторной последовательности ДНК гена металлотионеина, показано, что, как этого и можно было ожидать, экспрессия гибридного гена стимулируется ионами кадмия (Palmiter et al., 1982а). В противоположность результатам, полученным при введении генов в яйцеклетки мыши (гетерогенность в экспрессии, отсутствие тканеспецифичности экспрессии и нестабильное наследование чужеродных генов), инъецированные в эмбрионы дрозофилы гены, - алкогольдегидрогеназы (Goldberg et al., 1983), допадекарбоксилазы (Scholnick et al., 1983) и ксантинде-гидрогеназы (Spradling, Rubin, 1983), - корректно экспрессируют-ся в развитии и подвергаются соответствующей тканеспецифической регуляции. Возможно, что эти различия связаны с использованием для переноса генов в клетки дрозофилы особого вектора - на основе одного из МГЭ дрозофилы, Р-элемента, - встраивание которого в геном клеток-реципиентов существенно отличается от того, что известно для векторов, использованных для переноса генов в клетки мыши (ИиЪ1п, БргайИпе, 1982; Брга<П1пё, НиМп, 1982). Однако, В недавней работе Бринстеру и др. (ВгИ^ег et а1., 1983) удалось показать, что инъецированный в яйцеклетку мыши функционально перестроенный ген легкой к-цепи иммуноглобулина экспрессируется у трех потомков только в клетках селезенки, но не экспрессируется в клетках печени (хотя и присутствует в них). Возможно, что описанные выше различия в характере экспрессии чужеродных генов у дрозофилы и мышей не являются принципиальными, связанными с особой организацией генома или необходимостью сайт-специфичной интеграции чужеродной ДШ, а обусловлены различием в наборе генов, вводившихся в эти организмы.

Хотя возможность переноса генов в соматические клетки эука-риотных организмов была доказана этими (и рядом других) работами, они поставили гораздо больше вопросов, чем решили. Во-первых, неясно, как получить стабильную экспрессию чужеродных генов, даже если они введены в конкретные клетки; во-вторых, неизвестно, регулируется ли, и если - да, то каким образом, экспрессия введенных генов; в третьих, неизвестно, как повлияет введение чужеродного гена и его экспрессия на функционирование генома клеток-реципиентов; и наконец, в-четвертых, неясно, каким способом можно добиться корректной регуляции генов, введенных в клетки эукариот-ных организмов, и как - при необходимости - существенно усилить экспрессию введенных генов в клетках-реципиентах.

Решение этих и многих других возникших в связи с работами по генетической трансформации клеток эукариот вопросов настоятельно требует не только использовать метод генетической трансформации для решения теоретических или прикладных проблем молекулярной генетики, но и более глубоко изучать сам процесс генетической трансформации соматических клеток и его особенности в клетках-реципиентах разных типов.

I.I. СПОСОБЫ ВВЕДЕНИЯ ЧУЖЕРОДНОЙ ДНК В СОМАТИЧЕСКИЕ КЛЕТКИ

Соосаждение ДНК с фосфатом кальция и обработка клеток образующимся преципитатом (Graham, van der Eb, 1973) является наиболее употребительным способом введения ДНК в соматические клетки в культуре. ДНК в составе преципитата значительно более устойчива к действию дезоксирибонуклеаз, как внеклеточных (в частности, В сыворотке), так И внутриклеточных (Loyter et al., 1982а). Хотя преципитат ДНК-фосфат кальция образуется в широком диапазоне концентраций ДНК и значений pH раствора, для эффективного проникновения в клетки необходимо поддерживать при его образовании значение pH 7.1 ~ 7.4 и концентрацию ДНК в районе 10-20 мкг/мл. Комплекс ДНК-фосфат кальция сорбируется на поверхности клеток и затем, в основном, фагоцитируется (Loyter et al., 1982а). Проникновение преципитата в клетки является энерго-зависимым процессом и блокируется ингибиторами дыхания; кроме того, эффективность проникновения преципитата в клетки зависит от целостности системы микротрубочек, и падает в присутствии агентов, разрушающих микротрубочки (в частности, колхицина), но не зависит от целостности микрофиламентных систем клеток (Loyter et al., 1982b). Как показано с помощью специфически связывающегося с ДНК флюоресцентного красителя (41б-аминило-2-фенилиндолдигидрохлорида), большинство клеток эффевтивно включают комплекс ДНК-фосфат кальция в цитоплазму, но в ядрах клеток обнаруживается уже существенно меньшее число частиц преципитата (Loyter et al., 1982а; 1982b).

По характеру реакции на ингибиторы дыхания и агенты, разрушающие микротрубочки, фагоцитоз преципитата ДНК-фосфат кальция напоминает, так называемый, опосредованный рецепторами фагоцитоз. Если в эндоцитозе преципитата участвуют специфические рецепторы, то получает естественное объяснение тот факт, что комплекс ДНК-фосфат кальция, образованный при кислых или щелочных значениях рН, или при высоких концентрациях ДНК в растворе (т.е. имеющий иную структуру), не проникает в клетки (Loyter et al., 1982Ъ). В то же время постулируемая зависимость проникновения преципитата ДНК-фосфат кальция в клетки от узнавания специфическими рецепторами (и наличия таковых), указывает на необходимость индивидуального подбора условий образования этого комплекса для эффективного введения ДНК в клетки-реципиенты разных линий, Действительно, как показали Мур и др. (Moor et al., 1983), для успешной генетической трансформации клеток опухоли гипофиза мыши линии AtT20 необходимо проводить соосаждение с фосфатом кальция при концентрации ДИК около 100 мкг/мл, т.е. в условиях, которые по данным Лойтера и др. (Loyter et al., 1982а; 1982b), приводят К образованию комплекса ДНК-фосфат кальция, практически не проникающего в клетки мыши LMtk*".

Кристаллы фосфата кальция, как известно (Zakai et al., 1977), способствуют слиянию биологических мембран и могут вызывать локальное растворение фосфолипидных двуслойных мембран. Это обстоятельство, возможно, играет решающую роль в высвобождении ("спасении") преципитата ДНК-фосфат кальция из фагоцитирующих вакуолей, в выходе его в цитоплазму клеток и проникновении в ядро клеток. Солюбилизация мембран под действием фосфата кальция может также приводить к прямому проникновению ДНК в клетки, минуя фагоцитирующие вакуоли, что, как было показано (Loyter et al., 1982Ъ ), действительно имеет место для части молекул ДНК. В этой же работе установлено, что введенная в клетки в комплексе с фосфатом кальция ДНК не подвергается обнаружимой деградации в течение, по крайней мере, первых 24 ч.

Кан известно, спустя 48-72 ч после введения ДНК, наблюдается максимальное число клеток, экспрессирующих чужеродную генетическую информацию, затем доля таких клеток существенно уменьшается; это явление получило название временной экспрессии чужеродных генов (обзор: Banerji, Schaffner, 1983)х. Доля клеток, способных благодаря экспрессии чужеродных генов образовывать колонии на селективной среде- обычно существенно ниже, чем клеток, временно экспрессирующих такие гены. Так, при введении ДНК в комплексе с фосфатом кальция доля клеток, временно экспрессирующих чужеродные гены, составляет 0.5-1%, тогда как частота генетически трансформированных клетоке- около I х 10"^ (Rigby, 1982; 1983). Следует отметить, что обработка клеток ДНК без каких-либо протекторов, хотя и сопровождается поглощением ДНК, не приводит ни к генетической трансформации, ни к временной экспрессии чужеродных генов в соматических клетках. Эффективность временной экспрессии чужеродных генов можно существенно повысить, обрабатывая преципитатом ДНК-фосфат кальция не прикрепленные к подложке, а находящиеся в суспензии клетки (Chu, Sharp, 1981); если затем (после прикрепления к подложке) клетки еще обработать и 40%-нм раствором (в ростовой среда; с 4% сахарозы) полиэтиленгликоля (м.в. 6000 дальтон), то можно получить временную экспрессию чужеродных генов в 70% обработанных клеток: (shen et al., 1982). Однако, насколько нам известно, указанные модификации метода введения в клетки ДНК в комплексе с фосфатом кальция, не применялись для полу

Д^лее в целях удобства генетически трансформированными клетками называются только клетки, способные благодаря экспрессии чужеродных генов образовывать колонии на селективной среден чения генетически трансформированных клеток, способных образовывать колонии на селективной среден

Т&ким образом, использование комплекса ДНК-фосфат кальция способствует переносу генов в соматические клетки благодаря, по всей вероятности, следующему (Loyter et al., 1982b): преципитат увеличивает локальную концентрацию ДНК вследствие осаждения комплекса на поверхности клеток.; защищает ДНК от действия нуклеаз в сыворотке; индуцирует фагоцитоз; и защищает ДНК от внутриклеточных нуклеаз.

Другой довольно употребительный способ введения ДНК в соматические клетки в культуре, требующий, однако, дорогостоящего оборудования, - это микроиньекции н ядра клеток. Показано, что при введении раствора ДНК (I - 20 х 10~мл на клетку, что составляет 0.1 - 2% объема клетки мыши) в ядра соматических клеток до 50% инъецированных клеток способны временно экспрессировать чужеродные гены, а до 25% - образовывать колонии в селективных условиях, требующих экспрессии введенного гена (Graesmann et al., 1979; Anderson et al., 1980; Capecchi, 1980; Polger et al.,1982). Как для временной экспрессии, так и для генетической трансформации достаточно ввести в ядро клетки 2-5 молекул ДНК гена; инъекции в цитоплазму клеток не эффективны (частота клеток, временно экспрессирующих введенный ген в этом случае ниже на 3-4 порядка - Capecchi, 1980). Один из вариантов метода микроиньекций -микроукалывание клеток (и ядер) в среде, содержащей ДНК, позволяет существенно уменьшить время, требующееся для введения ДНК в клетки без снижения эффективности временной экспрессии и генетической трансформации клеток (Yamamoto et al., 1982). Микроинье-кция и микроукалывание приводят к такому же, как и при переносе ДНК в комплексе с фосфатом кальция, характеру встраивания чужеродной ДНК в геном клеток-реципиентов, тогда как микроиньекция с использованием микроэлектрофореза - к принципиально иному (Lo, 1983). В этой модификации метода микроинъекции в ядро клетки помимо микропипетки с раствором ДНК вводится микроэлектрод, и молекулы ДНК переходят в клетку под действием электрического поля, а не под действием механического давления. Это позволяет вводить в клетки гораздо большее число молекул ДНК, ввиду того, что отсутствуют ограничения, налагаемые при использовании механического давления вязкостью концентрированных растворов ДНК. Поскольку при микроэлектрофорезе в клетку не вводится значительный объем жидкости, существенно уменьшаются механические повреждения; и -что, возможно, определяет иной характер встраивания чужеродной ДНК в геном, - нет локального скопления молекул ДНК: они свободно распределяются по клетке под действием электрического поля.

Довольно часто для введения клонированных фрагментов ДНК используют метод слияния соматических клеток с протопластами бактерий, несущих соответствующие векторы - плазмиды, космиды или рекомбинантные фаги (Schaffner, 1980; de Saint Vincent et al., 1981; 1983; Wahl et al., 1984). Эффективность введения чужеродных генов при использовании этого метода в меньшей степени варьирует в клетках-реципиентах разных линий, чем при использовании преципитата ДНК-фосфат кальция (Schaffner, 1980), возможно, потому что не зависит от наличия специфических рецепторов на поверхности клеток. Кроме того, метод не требует выделения и очистки рекомбинантных молекул ДНК, что устраняет стадии, на которых они могут надрезаться или деградировать. Благодаря этому обстоятельству удалось ввести в соматические клетки включенные в космиды фрагменты ДНК генома сирийского хомячка длиной 40-45 т.п.н., содержащие CAD-ген ( de Saint Vincent et al., 1981). Недостатком метода слияния клеток с протопластами бактерий является то, что при этом наряду с интересующими исследователя генами в клетки вводится значительное количество бактериальной ДНК, способной вызвать нежелательные побочные эффекты.

По сравнению с рассмотренными выше способами, метод введез-ния ДНК с помощью липосом имеет определенные преимущества - он столь же прост как методы с использованием преципитата ДНК-фосфат кальция или слияния с протопластами бактерий, но в меньшей степени токсичен для клеток, хотя столь же эффективен. Кроме того, этот метод используется для введения ДНК in vivo, в клетки организмов. Озвученная водная суспензия липидов и ДНК выпаривается под вакуумом, и вновь суспендируется в воде; при этом наблюдается, так называемое, обращение фаз (Szoka, Papadjopolous, 1978)f и ДНК эффективно включается внутрь однослойных липасом. Однослойные липосомы, полученные методом обращения фаз, больше по размеру, и захватывают большие количества ДНК, чем многослойные липосомы или однослойные липосомы, полученные другими методами (Hof-firian et al., 1978; Dimitriadis, 1979; Lurquin, 1979 ). "Нейтральные" липосомы, состоящие только из фосфатидилхолина и холестерина, плохо переносят ДНК в клетки; введение же в состав липосом отрицательно заряженого фосфатидилсерина существенно повышает эффективность такого переноса (praley et al., 1980; Rizzo et al., r

1983). Возможно, что большая эффективность переноса ДНК в составе липосом, содержащих фосфатидилсерин (даже в срвнении с другими отрицательно заряженными липидами - praley et al., 198о), обусловлена тем, что такие липосомы легче сливаются с мембранами клеток (Poste et al., 1980). Механизм переноса ДНК с помощью липосом точно не установлен; считается, что липосомы включаются в клетки посредством эндоцитоза, а также либо прямо сливаясь с клеточной мембраной, либо встраиваясь внутрь мембраны клеток (Pagano, Weinstein, 1978). В отличие от переноса ДНК в составе комплекса ДНК-фосфат кальция или с помощью микроиньекции, когда ограничивающим эффективность генетической трансформации клеток этапом является переход ДНК из цитоплазмы в ядро клетки (Capecchi, 1980; Loyter et al., 1982т), при переносе ДНК с помощью липосом критическим моментом является или число участков клеточной мембраны, способных адсорбировать липосомы, или процесс интернали-зации липосом (rízzo et al., 1983). Доля клеток, временно экспрес-сирующих чужеродные гены, и частота генетически трансформированных клеток при введении ДНК с помощью липосом сопоставимы с таковыми при использовании преципитата ДНК-фосфат кальция, или*при слиянии клеток с протопластами бактерий (Praley et al., 1980; Wong et al., 1980; Schafer-Ridder et al., 1982; Rizzo et al., 1983). Как показано, с помощью липосом можно переносить не только ДНК, но и минихромосомы QB40 (Rizzo et al., 1983), и этот метод может быть использован для изучения взаимодействия ДНК с белками.

Хотя частота генетической трансформации при слиянии клеток (с помощью вируса Сендай) с тенями эритроцитов, нагруженных ДНК, не высока (lino et al., 1983), модификация условий введения ДНК в тени эритроцитов (включение в раствор ЭДТА и использование процедуры замораживания-оттаивания теней) и замена вируса Сендай для слияния с клетками на полиэтиленгликоль, позволяют получить временную экспрессию чужеродных генов в 20% обработанных клеток (wi-berg et al., 198з). Неясно, однако, каковы преимущества этого метода в сравнении с более простым - введением ДНК посредством липосом. Клетки, в которых ДНК вводили посредством электрического пробоя мембран (иеидаап et al., 1982), или после ее упаковки в оболочку вируса Сендай (boyter et al., 1983)» также обнаруживают временную экспрессию чужеродных генов; для получения генетически трансформированных клеток эти методы не использовались.

В последнее время начал разрабатываться метод введения генов в соматические клетки с помощью рекомбинантных ретровирусов. Табин и др. (TaMn et al., 1982) заменили внутренний BamHl-фраг-мент ДНК клонированного провируса вируса лейкемии Молони на BamHi-фрагмент ДНК ВПГ1, содержащий ТК ген. При трансформации ТК~-клеток преципитатом ДНК химерного провируса-фосфат кальция были получены ТК+-клетки, в которых после инфекции вирусом лейкемии Молони продуцировался не только вирус-помощник, но и химерный вирус с ТК геном ВПГ1. Смесь двух вирусов при инфекции ТК"-клеток трансформировала их к Ж^-фенотипу. Поскольку уже получены линии клеток, содержащих дефектный по собственной упаковке провирус лейкемии Молони, и синтезирующих все необходимые для упаковки других вирусов лейкемии Молони продукты (Mann et al., 1983), имеется возможность получать свободные от вирусов-помощников рекомбинантные вирусы. Векторы этого типа, основанные на провирусах ретровирусов, могут быть использованы, очевидно, и для введения генов в клетки организмов in vivo. Использование рекомбинантных ретровирусов для переноса генов в клетки эукариот представляется перспективным в связи еще и с тем, что вирусы способны эффективно инфицировать широкий спектр клеток первичных эксплантатов, генетическая трансформация которых другими методами затруднительна, и, кроме того, интеграция провирусной ДНК является высокоспецифичным по отношению к вирусным последовательностям процессом, что может иметь важное значение для создания векторов с высокой специфичностью встраивания в геном клеток-реципиентов

Mulligan, 1982).

Таким образом, за короткое время после работ, показавших принципиальную возможность трансформации соматических клеток клонированными генами, в дополнение к методо с использованием преципитата ДНК-фосфат кальция, разработаны и широко используются другие эффективные методы введения ДНК в соматические клетки. В табл. I на примере клеток линии LMtk", в которых вводился ТК ген ВПГ1, сопоставлена эффективность генетической трансформации соматических клеток при использовании описанных выше методов введения ДНК в клетки. Вариабельность в частоте трансформации при введении ТК гена посредством микроиньекций обусловлена различием в структуре вводимых плазмидных ДНК (в частности, присутствием в некоторых из них последовательности-усилителя 0В40). Несмотря на высокую частоту генетической трансформации клеток при введении ДНК с помощью микроиньекции, до сих пор не описано ни одного случая, когда бы клоны генетически трансформированных клеток: были бы выделены без использования специальных селективных сред.

Заключение Диссертация по теме "Цитология", Глебов, Олег Константинович

ВЫВОДЫ

1. ТК~-клетки китайского хомячка выделенного нами клона А238 способны с высокой частотой (7 х 10*"®) и эффективностью (130 колоний на I мкг плазмидной ДНК) трансформироваться при обработке ДНК плазмид, содержащих ТК ген ВПП. Частота трансформации линейно возрастает с увеличением концентрации плазмидной ДНК с ТК геном ВПП, а также с увеличением концентрации эукариотной ДНК-носителя вплоть до концентрации ДНК 100 мкг/мя. Трансформация клеток клона А238 не ингибируется избытком ДНК прокариотного происхождения. Изменения в структуре ДНК плазмид, не затрагивающие ТК ген ВПП, и изменения в составе смеси трансформирующих ДНК влияют на частоту и эффективность трансформации клеток клона А238.

2. Соматические клетки, экспрессирующие собственный ТК ген, в сравнении с клетками, экспрессирующими ТК ген ВПП, отличаются повышенной чувствительностью к высоким концентрациям тимидина в среде ГАТ. Вследствие этого, о происхождении ГАТ^-клонов можно судить, определяя эффективность клонирования клеток на среде ГАТ, содержащей 100 мкг/мл тимидина.

3. Выделенные после обработки клеток клона А238 плазмидными ДНК с ТК геном ВПП ГА^-клоны содержат последовательности плазмидных ДНК и экспрессируют ТК ген ВПП. Активность ТК в клетках изученных трансформантных клонов составляет от 3% до 50% активности ТК в клетках китайского хомячка дикого типа. В клонах, клетки которых содержат множественные копии плазмидных ДНК, плазмидные последовательности организованы в тандемно-пов-торяющиеся структуры. Все изученные клоны нестабильны по ТЕС*"-фенотипу, В клетках нестабильных по ТК+^енотипу клонов ТК ген ВПП локализован в хромосомах.

4. Плазмидные ДНК могут в некоторых случаях присутствовать в клетках трансформантных клонов и в виде экстрахромосомных копий. Анализ одной из таких плазмид, "спасенной" при трансформации клеток е.coli, свидетельствует о том, что во фрагменте сателлитной ДНК III человека имеются последовательности, способные, по-видимому, функционировать в клетках эукариот в качестве точки начала репликации ДНК.

5. Изменения в составе или структуре трансформирующих ДНК так же, как и обработка клеток опухолевым промотором приводят к наследуемым изменениям в скорости потери ТК+-фенотипа.

6. Нестабильность ТК+-фенотипа клеток трансформантных клонов детерминирована генетически и не устраняется при многократном субклонировании. Скорость потери трансформантного фенотипа также является наследуемым признаком.

7. Длительное культивирование клеток трансформантных клонов на селективной среде ГАТ приводит к частичной стабилизации ТК*~-фенотша, выражающейся в уменьшении скорости потери трансформантного фенотипа. Скорость стабилизации ТК^-фенотипа различна для клонов, в клетки которых введена различающаяся по структуре трансформирующая ДНК.

8. Анализ собственных и тлеющихся в литературе данных позволяет заключить, что фенотипическая нестабильность генетически трансформированных соматических клеток является следствием одного из первых этапов генетической трансформации - интеграции чужеродной ДНК в геном клеток-реципиентов; процесса, в результате которого индуцируется нестабильное состояние трансформирующей ДНК.

- 269 -ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе исследованы особенности генетической трансформации клеток китайского хомячка и причины нестабильности трансформантного фенотипа клеток. Показано, что частота и эффективность трансформации ТК~-клеток китайского хомячка плазмидными ДНК, содержащими ТК ген ВПГ1, не снижаются при удалении из смеси трансформирующих ДНК эукариотной ДНК-носителя, но зависят от из:-менений в структуре ДНК плазмид, не затрагивающих собственно ТК ген. Ряд особенностей процесса генетической трансформации ТК~-клеток китайского хомячка отличается от таковых для ТК~-клеток мыши линии Mtk", и эти различия позволяют по-новому оценить роль эукариотной ДНК-носителя в трансформации соматических клеток. Анализ состояния плазмидных последовательностей ДНК в клетках трансформантных клонов позволил заключить, что основным путем закрепления чужеродной генетической информации в клетках китайского хомячка является встраивание ее в геном клеток-реципиентов, хотя плазмидные последовательности, содержащие фрагмент сателлитной ДНК III человека, способны, по-видимому, и к автономной репликации в клетках эукариот. Следует подчеркнуть, что в клетках нестабильных по ТК+-фенотипу трансформантных клонов ТК ген ВПП локализован в хромосомах; поэтому причина нестабильности клеток по трансформантному фенотипу не может заключаться, как это считается обычно, в неупорядоченной сегрегации автономно реплицирующихся пекеласом.

Свойство нестабильности трансформантного фенотипа детерминировано генетически, и воспроизводится в последовательном ряду ТК^-клеток трансформантных клонов, ТК"-клеток субклонов-ревер-тантов, и ТК*-клеток клонов-реревертантов, вновь экспрессирую-щих ТК ген ВПГ1 . Ряд данных указывает на то, что скорость потери трансформантного фенотипа наследуется в ряду клеточных поколений (в том числе и при последовательной смене состояний трансформантного фенотипа), хотя наследование этого признака нарушается процессом стабилизации ТК^-фенотипа, происходящим не только при культивировании клеток на среде ЕА.Т, но и, по-видимому, при культивировании на неселективной среде. Изменения в составе и в структуре трансформирующих ДНК приводят к наследуемым различиям в скорости потери трансформантного фенотипа, и влияют на скорость стабилизации ТК*"-фенотипа при длительном культивировании клеток на среде ГАТ. Обработка клеток сразу после трансформации опухолевым промотором ©А также приводит к наследуемым изменениям в скорости потери ТК*"-фенотипа клеток трансформантных клонов.

Полученные в работе данные позволяют предсказывать характер стабильности трансформантного фенотипа клеток при манипуляциях со структурой или составом трансформирующих ДНК, и указывают возможные пути стабилизации трансформантного фенотипа, что представляется полезным при решении с помощью генетической трансформации задач конструирования клеток-продуцентов полезных белков. В результате работы получена коллекция клонов клеток китайского хомячка, различающихся по скорости потери и по скорости стабилизации трансформантного фенотипа. Эти клоны могут быть использованы для изучения природы изменений, происходящих при стабилизации трансформантного фенотип, и для выделения последовательностей ДНК, различающихся по реакции на встраивание вблизи или внутри них чужеродной ДНК.

Сопоставление имеющихся в литературе и собственных данных позволило сформулировать модель генетической трансформации соматических клеток, согласно которой нестабильность трансформантного фенотипа является результатом генотипически нестабильного состояния трансформирующей ДНК, которое, в свою очередь, выступает как необходимое следствие одного из этапов генетической трансформации - встраивания чужеродной ДНК в геном клеток-реципиентов. Это позволяет понять общность свойства нестабильности трансформантного фенотипа, характерного как для линий клеток-реципиентов различной видовой принадлежности, таге и для разных генов, введенных в соматические клетки. Полученные результаты свидетельствуют о том, что встраивание чужеродных для данной области генома фрагментов ДНК индуцирует, как правило, генотипически нестабильные изменения, и позволяют предполагать, что возникновение существенной части фенотипически нестабильных вариантов соматических клеток в культуре может быть связано с генотипически нестабильными изменениями инсерционного типа.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Глебов, Олег Константинович, Ленинград

1. Абрамян Д.С. Изучение УФ-чувствительности клеток китайского хо-мячка (CH0-KI). Радиоцитология-78. Оперативно-информ. материалы, Л., ЛИЯФ, 1979, с. 3.

2. Абрамян Д.С», Глебов O.K. Внутриклональная гетерогенность и нестабильность клеток китайского хомячка CH0-KI по чувствительности к ультрафиолетовому свету и устойчивости к 8-азагуанину, Цитология, 1981 а, т. 23, & 9, с. IQ3I-I040.

3. Абрамян Д.С., Глебов O.K. Наследуемые изменения генной активности как одна из причин фенотипической гетерогенности устойчивых к 8-азагуанину клеток китайского хомячка (CH0-KI). Цитология, 1981 б, т. 23, № 10, с. II6I-II73.

4. Глебов O.K., Полянская Г.Г., Пинаев Г.П. Идентификация изолированных метафазных хромосом. П. Сравнение с узнаваемостью хромосом в составе метафазных пластинок. Цитология, 1981 б, т. 23, № 9, с. I04I-I046.

5. Глебов O.K., Абрамян Д.С. Природа фенотипической изменчивостисоматических клеток в культуре: нестабильные фенотипические изменения. Цитология, 1984 б, т. 26, № 3, с. 235-251.

6. Джексон Н., Лион Ф. Статистика и планирование эксперимента втехнике и науке. Методы обработки данных. М.: Мир, 1980, 610 с.

7. Ильин Ю.В. Повторяющиеся гены эукариот. Мол. биол., 1982,т. 16, № 2, с. 229-257.

8. Ильин Ю.В. Мобильные диспергированные гены эукариот. Итогинауки и техники ВИНИТИ. Мол. биол., 1982, т. 18, с. 5-18.

9. Светлова М.П., Федорцева Р.Ф., Томилин Н.В. Опухолевый промотор 12-о-тетрадеканоил-форбол-13-ацетат (ТФА) индуцирует в лимфоцитах человека белок, связывающий сателлитную ДНК. -Цитология, 1982, т. 25, № 4, с. 572-580.

10. Урбах В.Ю. Биометрические методы. М.: Наука, 1964.

11. Федорцева Р.Ф., Светлова М.П., Томилин Н.В. Кариотипические ибиохимические изменения в лимфоцитах человека после обработки опухолевым промотором ТРА. Цитология, 1982, т. 24, № 9, с. III2.17« Abraham I., Tyagi J.S., Gottesman М.М. Transfer of genes to

12. Diacumakos E.G. Replication and expression of thymidine kinase and human globin genes microinjected into mouse fibroblasts. PNAS, 1980, v. 77, p. 5399-5403.

13. Andrulis I.L., Siminovitch L. DUA-mediated gene transfer ofaspartylhydroxamate resistance into Chinese hamster ovary cells. PNAS, 1981, v. 78, p. 5724-5728.

14. Andrulis I.L., Siminovitch L. Amplification of the gene for asparagine synthetase. In: Gene Amplification Ed. by Schimke R.T. Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, p. 75-81.

15. Ardeshir F., Giulotto E., Zieg J., Brison 0., Liao W.S., Stark

16. Blair D.G., McClements W.L., Oskarsson M.K., Fischinger P.J.,

17. Vande Woude G.P. Biological activity of cloned Moloney sarcoma virus DNA: terminally redundand sequences may enhance transformation frequency. PNAS, 1980, v. 77, p. 3504-3508.

18. Buetti E., Diggelman H. Cloned mouse mammary tumor virus DNAis biologically active in transfected mouse cells and its expression is stimulated by glucocorticoid hormones. Cell, 1981, v. 23, p. 335-345.

19. Carter A.D., Hamer D.H. Use of the E.coli galactokinase gene to study an inducible mouse metallothionein promoter. J. Cell Biochem., Suppl., v. 7A, p. 114» 1983«59» Chang L.J.-A., Gamble C.L., Izaquirre C.A., Minden M.D., Mak

20. T.W., McCulloch E.A. Detection of genes coding for human differentiation markers by their transient expression after DNA transfer. PNAS, 1982, v. 79, p. 146-150.

21. Chao M.V., Mellon P., Charnay P., Maniatis T., Axel R. The regulated expression of -globin genes introduced into mouseerytroleukemia cells. Cell, 1983, v. 32, p. 483-493»

22. Chapman A.B., Cootello M.A., Lee P., Ringold G.Ivi. Amplification and hormone-regulated expression of a mouse mammary tumor virus E^q gpt fusion plasmid in mouse 3T6 cells. - Mol. and Cell Biol., 1983, v. 3, p. 1421-1429.

23. Chen M.—I•, Nienhuis A.W. Structure and expression of humanglobin genes introduced into mouse fibroblasts. J. Biol. Chem., 1981, v. 256, p. 968O-9683.

24. Chia W., Rigby R.W.J. Pate of viral DNA in nonpermissive cellsinfected with simian virus 40. PHAS, 1981, v. 78, p. 66386642.

25. Christman J.K., Gerber M., Price P.M., Flordellis C., Edelman

26. J., Ais G. Amplification of expression hepatitis B surface antigen in 3^3 cells cotransfected with a dominant-acting gene and cloned viral DNA. PITAS, 1982, v. 79, p. 1815-1819*

27. Christy B., Scandos G. Expression of transferred thymidine kinase genes is controlled by methylation. PNAS, 1982, v. 79, p. 6299-6303.

28. Chu G., Sharp P.A. SV 40 DTJA transfection of cells in suspension: analysis of the efficiency of transcription and translation T-antigene. Gene, 1981, v. 13, p. 197-202.

29. Clayton C.E., Rigby P.W.J. Cloning and characterization of theintegrated viral DNA from three lines of SV 40-transformed mouse cells. Cell, 1981, v. 25, p. 547-559*

30. Clewell D.B., Helinslci D.R. Effect of growth, conditions on theformation of relaxation complex of supercoiled ColE1 deoxyribonucleic acid and protein in Escherichia coli- J. Bacte-riol., 1972, v. 110, p. 1135-1141.

31. Clough D.W., Kunkel L.M., Davidson R.L. 5-azacytidine-inducedreactivation of a herpes simplex thymidine kinase gene. -Science, 1982, v. 216, p. 70-73.

32. Gorsaro G.M., Pearson M.L. Competence for D1TA transfer of oubain resistance and thymidine kinase: clonal variation in mouse 1-cell recipients. Somat. Cell Genet., 1981, v. 7, p. 617-630.

33. Costantini P., Lacy E. Introduction of a rabbit beta-globin gene into the mouse germ line. Nature, 1981, v. 294» P* 92-94«

34. Daniel-Vedeke P., Morello D., Benicour H., Transy C., LeBail0., Plata P., Kourilsky P. Functional expression of a mouse H-2K gene isolated from non-expressing teratocarcinoma cells.- EMBO J., 1984, v. 3, p. 597-602.

35. Daniels P.J.L., Yehaskel A.S., Morton J.B. The structure of antibiotic G418. Thirteenth interscience conference on antimicrobial agents and chemotherapy, Washington, 1973» Abstr., p. 137.

36. Davidson R.L., Adelstein S.J., Oxman M.1J. Herpes simplex virusas a source of thymidine kinase for thymidine kinase-deficient mouse cells: suppression and reactivation of the viral enzyme. PUAS, 1973, v. 70, p. 1912-1916.

37. Davies R.L., Fuhrer-Krusi S., Kucherlapati R.S. Modulation oftransfected gene expression mediated by changes in chromatin structure. Cell, 1982, v. 31, p. 521-529»

38. Degnen G.E., Miller I.L., Eisenstadt J.M., Adelberg E.A. Chromosome-mediated gene transfer between closely related strains of cultured mouse cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1976, v. 73, P* 2838-2842.

39. Degnen G.E., Miller I.L., Adelberg E.A., Eisenstadt J.M. HGPRÏase expression in mouse gene transfèrent s. In Brookhaven Symp. in Biology, no 29« Genetic interaction and gene transfer in mammalian cells. C.W.Andersson, ed., N.Y., 1977, p. 135-146.

40. Dimitriadis G.J. Translation of rabbit globin mRNA introducedby liposomes into mouse lymphocytes. Nature, 1978, v. 274, 1978, v. 274, p. 923-924.

41. Di Nocera P.P., Dawid I.B. Transient expression of genes introduced into cultured cells of Drosophila. PITAS, 1983, v. 80, p. 7095-7098.

42. Doehmer J., Barinaga M., Vale W., Rosenfeld M.G., Verma I.M.,

43. Evans R.M. Introduction of rat growth hormone gene into mouse fibroblasts via a retroviral DNA vector: expression and regulation. PNAS, 1982, v. 79, P« 2268-2272.

44. Praley R., Subramani S., Berg P., Papahadjopoucos D. Introduction of liposome encapsulated SV 40 DM into cells. J. Biol. Chem., 1980, v. 255, p. 10431-10442.

45. Geurge D.L., Powers V.E. Cloning of DM from double minutesof Y1 mouse adrenocortical tumor cells: evidence for gene amplification. Cell, 1981, v. 24, p. 117-123»

46. Goldberg D.A., Posakony J.W., Maniatis T. Correct developmental expression of a cloned alcohol dehydrogenase gene transduced into the Drosophila germ line. Cell, 1983» v. 34» p. 59-73.

47. Goodenow R.S., McMillan M., Nicolson M., Sher B.T., Eakle K.,

48. Davidson N., Hood L. Identification of the class I genes of the mouse major histocompatibility complex by DITA-mediated gene transfer. Nature, 1982, v. 300, p. 231-236.

49. Goodenow R.S., McMillan M., Orn A., Nicolson M., Davidson IT.,

50. Gorman C.M., Moffat L.P., Howard B.H. Recombinant genomeswhich express chloramphenicol acetyltransferase in mammalian cells. Mol. Cell Biol., 1982, v. 2, p. 1044-1051.

51. Gorman C.M., Howard B.H., Reeves R. Expression of recombinantplasmids in mammalian cells is enhanced by sodium butyrate. Nucl. Acids Res., 1983, v. 11, p. 7631-7648.

52. Haber D.A., Schimke R.T. Chromosome-mediated transfer and amplification of an altered mouse dihydrofolate reductase gene. Somat. Cell Genet., 1982, v. 8, p. 499-508.

53. Hakala M.T., Zakrzewski S.P., Nichol C. Relation of folicacid reductase to amethopterin resistance in cultured mammalian cells. J. Biol. Chem., 1961» v. 236, p. 952-958.

54. Hamer D.H., Pavlakis G.N., Walling M.J., Schmidt C.J. Induction of a mouse metallothionein 1 gene in animal virus vectors. Cold Spring Harbor, N.Y., N 4, 1982, p. 7-12.

55. Hanahan D., Lane D., Lipshich L., Wigler M., Botchan M. Characteristics of an SV 40-plasmid recombinant and its movement into and out of genome of a murine cell. Cell, 1980, v. 21, p. 127-139.

56. Hardies S.A., Axelrod D.E., Edgbll H.H., Hutchison C.A. Phenotypic variation associated with molecular alterations at a cluster of thymidine kinase genes. Mol. Cell Biol., 1983» v. 2, p. 1163-1171.

57. Harris M. Induction of thymidine kinase in enzyme-deficient

58. Chinese hamster cells. Cell, 1982, v. 29, p. 483-492.

59. Hartman J.R., Nayak D.P., Pareed G.C. Human influenza virushemagglutinin is expressed in monkey cells using simian virus 40 vectors. PNAS, 1982, v. 79, p. 233-237.

60. Hauser H., Gross G., Bruns W. et al. Inducibility of human-interferon gene in mouse L-cell clones. Nature, 1982, v. 297, p. 650-654.

61. Jackson J., Lowy I., Ostrander M. et al. Stable and unstableexpression of genes in DNA transformed cells. Mobilization and Reassembly Genet. Inf. Proc. Miami Winter Symp., 1980, N.Y. e.a., 1980, p. 181-199.

62. Jimenez A., Davies J. Expression of a transposable antibioticresistance element in Saccharomyces. Nature, v. 287, p. 869-871.

63. Kai R., Nishimoto T., Sekigucki M. DNA-mediated gene transferto baby hamster kidney cells. Cell Struct, and Funct., 1982, v. 7, p. 193-201.

64. Kamarck M.E., Barbosa S.A., Kuhn L. et al. Somatic cell genetics and flow cytometry. Cytometry, 1983, v. 4, P» 99-108.

65. Karin M., Haslinger A., Holtgreve H. et al. Characterizationof DNA sequences through wich cadmium and glucocorticoid hormones induce human metallothionein II^ gene. Nature, 1984, v. 308, p. 513-519.

66. Kaufman R., Brown P., Schimke R. Loss and stabilization ofamplified dihydrofolate reductase genes in mouse sarcoma S-180 cell lines. Mol. Cell Biol., 1981, v. 1, p. 1084-1093«

67. Khoury G., Gruss P. Euhancer elements. Cell, 1983, v. 33,p. 313-314.

68. Kit S., Leung Y/.-C., Jorgensen G.N., Dubbs D.R. Distinctiveproperties of thymidine kinase isozymes induced by human and avian herpesvirus. Int. J. Cancer, 1974 a, v. 14» p. 598-610.

69. Klobutcher L.A., Miller C.L., Ruddle P.H. Chromosome-mediated gene transfer results in two classes of unstable transformants. PNAS, 1980, v. 77, p. 36IO-3614.

70. Klobutcher L.A., Ruddle P.H. Phenotype stabilization and integration of transferred material in chromosome-mediated gene transfer. Nature, 1979, v. 280, p. 557-560.

71. Lee F., Mulligan R., Berg P., Ringold G. Glucocorticoids regulate expression of dihydrofolate reductase cDNA in mouse mammary tumor virus chimaeric plasmids. Nature, 1981, v. 294, p. 228-232.

72. Lin P.-F., Zhao S.-Y., Ruddle F.H. Genomic cloning and preliminary characterization of the human thymidine kinase gene. PNAS, 1983, v. 80, p. 6528-6532.

73. Littlefield J.W. Selection of hybrids from matings of fibroblasts in vitro and their presumed recombinants. Science, 1964, v. 145, p. 709-710.

74. Littlefield J.W. Hybridization of hamster cells with high andlow folate reductase activity. Proc. Nat. Acad, Sci. USA, 1969, v, 62, p. 88-95.

75. Harbor, N. Y., p. 99-107* 219* Lusky M., Berg L., Weiher H., Botchan M. Bovine papilloma virus containts an activator of gene expression at the distal end of the early transcription unit. Mol. Cell Biol., 1983, v. 3, p. 1108-1122.

76. Lusky M., Botchan M. Inhibition of SV-40 replication in Simian cells by specific pBR 322 DNA sequences. Nature,1981, v. 293, P* 79-81.

77. Maitland N.J., McDeugall J.K. Biochemical transformation ofmouse cells by fragments of herpes simplex virus DNA. -Cell, 1977, v. 11, p. 233-241.

78. Maniatis T., Pritsch E.P., Sambrook J. Molecular cloning. Alaboratory manuel. Cold Spring Harbor Lab., 1982, p. 545«

79. Mayo K.E., Palmiter R.D. Glucocorticoid regulation of metal-lothionein-I mRNA synthesis in cultured mouse cells. J. Biol. Chem., 1981, v. 256, p. 2621-2624.

80. Mayo K.E., Warren R., Palmiter R.D. The mouse metallothine-in I gene is transcriptionally regulated by cadmium following transfection into human or mouse cells. Cell, 1982, v. 29, p. 99-108.

81. Martin R.G. The transformation of cell growth and transmogrification of DNA synthesis by simian virus 40.-Adv. Cancer Res., 1981, v. 34, p. 1-68.

82. McBride O.W. , Burch S.W., Ruddle P.H. Cotransfer of thymidine kinase and galactokinase genes by chromosome-mediated gene transfer. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1978,v.75,p. 914-918.

83. McClintock B. The origin and behavior of mutable loci. -Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1950, v. 36, p. 344-355.

84. McKnight S.L. The nucleotide sequence and transcript map of the herpes simplex virus thymidine kinase gene. Nucl. Acids Res., 1980, v. 8, p. 5949-5964.

85. McKnight S.L. Functional relationships between transcriptional control signals of the thymidine kinase gene of herpes simplex virus. Cell, 1982, v. 31, p. 355-365.

86. Mellon P., Parker V., Gluzman I., Maniatis T. Identification of DNA sequences required for transcription of the human1.globin gene in a new SV40 host-vector system. Cell, 1981, v. 27, p. 279-288.

87. Minson A.C. The expression of the integrated HSV-2 thymidine kinase in biochemically transformed cells is dependenton upstream host sequences. In: International worksshop on herpes viruses, Eds. Caplan A.S., Bologna, Italy, 1981,p.40.

88. Minson A.C., Wildy P., Buchan A., Darby G. Introduction of the herpes simplex virus thymidine kinase gene into mouse cells using virus DNA or transformed cell DNA. Cell, 1978, v. 13, p. 581-587.

89. Mulligan R.C., Howard B.H., Berg P. Synthesis of rabbit -globin in cultured monkey kidney cells following infection with a SV40- -globin recombinant genome. Nature, 1979» v. 277, p. 108-114.

90. Mulligan r.c., Berg P. Selection for animal cells that express the Escherichia coli gene coding for xanthine-guanine phosphoribosyltransferase.- Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1981a, v. 78, p. 2072-2076.

91. Mulligan R.C., Berg P. Factor governing the expression of a bacterial gene in mammalian cells. Molec. Cell Biol., 1981b, v. 1, p. 449-459.

92. Murray M.J., Kaufman R.J., Latt S.A., Weinberg R.A. Construction and use of a dominant, selectable marker: a Harvey sarcoma virus-dihydrofolate reductase chimera. Molec. Cell Biol., 1983, v. 3, p. 32-43.

93. Myers R.M., TJian R. Construction and analysis of simian virus 40 origins defective in tumor antigen binding and DNA replication. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1980, v. 77,p. 6491-6495.

94. Nakabayashi Y., Chattopadhyay S.K., Lowy D.R. The transforming function of bovine papilloma virus DNA. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1983, v. 80, -p."5832-5836.

95. Neuberger M.S. Expression and regulation of immunoglobin heavy chain gene transfected into lymphoid cells. EMBO J.,1983, v. 2, p. 1373-1378.

96. Neuman B., Schaefer-Ridder M., Wang Y., HofSchneider P.H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J., 1982, v. 1, p. 841-846.

97. Nielsen D.A., Chou J., MacKrell A.J.t Casadaban M.J., Steiner D.F. Expression of a preproinsulin- -galactosidase gene fusion in mammalian cells. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1983, v. 80, p. 5198-5202.

98. Palmiter R.D., Chen H.Y., Brinster R.L. Differential regulation of metaliothionein thymidine kinase fusion genes in transgenic mice and their offspring. Cell, 1982b, v. 29, p. 701-710.

99. Pavlakis G.N. , Hamer D.H. Regulation of a métallothionein growth hormone hybrid gene in bovine pappiloma virus. -Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1983, v. 80, p. 397-401.

100. Pellicer A., Esteban M. Gene transfer, Stability, and biochemical properties of animal cells transformed with vaccinia DNA. Virology, 1982, v. 122, p. 363-380.

101. Pellicer A., Robins D. , Y/old B. , Sweet R., Jackson J., lowy I., Roberts J.M., Sim G.K., Silverstein S., Axel R. Altering genotype and phenotype by DNA-mediated gene transfer.-Science, 1980, v. 209, p. 14U-1422.

102. Perucho M., Hanahan D. , Wigler M. Genetic and physical linkage of exogenous sequences in transformed cells. Cell, 1980a, v. 22, p. 309-317.

103. Perucho M., Hanahan D., Lipsich L., Wigler M. Isolation of the chicken thymidine kinase gene by plasmid rexcue. -Nature, 1980, v. 285, p. 207-210.

104. Perucho M., Wigler M. Linkage and expression of foreign, DNA in cultured animal cells. Cold Spring Harbor Symp. Quant Biol., 1981, v. 45, p. 829-838.

105. Pollack Y., Stein R., Razin A., Cedar H. Methylation of foreign DNA sequences in eukaryotic cells. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1980, v. 77, p. 6463-6467.

106. Poste G., Lyon N.C., Macauder P., Porteer C.W., Reeve P., Bachmeyer H. Liposome-raediated transfer of integral membrane of cultured cells. Exp. Cell Res., 1980, v. 129,p. 393-408.

107. Rabourin-Combe C., Mach B. Expression of HLA-DR antigens at the surface of mouse L cells co-transferred with cloned human genes. Nature, 1983, v. 303, p. 670-674.

108. Radman M., Villani G., Boiteux S., Kinsella A.R., Glickman B.V/. , Spadori S. Replication fidelity: mechanisms of mutation avoidance and mutation fixation. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 1979, v. 43, p. 937-946.t

109. Ragg G., Weissmann C. Not more than 117 base pairs of 5 -flanking sequence are required for inducible expression of a human IPN- gene. Nature, 1983, v. 303, p. 439-442.

110. Razzaque A., Mizusawa H. , Seidman M.M. Rearrangement and mutagenesis of a shuttle vector plasmid after passage in mammalian cells. Proc. Nat; Acad. Sci.USA, 1983, v. 80, p . 3010-3014.

111. Razzaque A., Chakrabartis S., Joffee S., Seidman M. Mutagenesis of a shuttle vector plasmid in mammalian cells. -Molec. Cell Biol., 1984, v. 4, p. 435-441.293« Reddy V.B., Tevethia S;S., Tevethia M.J., Weissman S.M.

112. Nonselective expression of simian virus 40 large tumor antigen fragments in mouse cells. Proc. Nat. Acad. Sci.USA, 1982, v. 79, p. 2064-2067.

113. Reyes G.R., Gavis E.R., Buchan A., Raj N.B.K., Hayward G.S., Pitha P.M. Expression of human ^-interferon сША under the control of a thymidine kinase promoter from herpes simplex virus. Nature, 1982, v. 297, p. 598-601.

114. Reyes G.R., Jeang Hayward G.S. Transfection with the isolated herpes simplex virus thymidine kinase genes. I.Minimal size of the active fragments from HSV1 and HSV2.

115. J. Gen. Virol., 1982, v. 62, p. 191-206.

116. Reyes G.R., McLane M.W., Hayward G.S. Transfection with the isolated herpes simplex virus thymidine kinase genes. 2. Evidence for amplification of viral and adjacent cellular DNA sequences. J. Gen. Virol., 1982, v. 60, p»209-223.

117. Rice D., Baltimore D. Regulated expression of an immunoglo-bin kappa-gene introduced into a mouse lymphoid cell line.-Proc. Nat. Acad. SCi. USA, 1982, v. 79, p. 7862-7865.

118. Rigby P.W.J. Expression of cloned genes in eukaryotic cells using vector systems derived from viral replicons. -Ins Genetic Engineering, Ed. by R.Williamson, N.Y-L. , Acad. Press., 1982, v. 3, p. 83-141.

119. Rigby P.W.J. Cloning vectors derived from animal virus. -J. Gen. Virol., 1983, v. 64, p. 255-266.

120. Rigby P., Dieckmann M., Rhodes C., Berg P., Labeling deoxyribonucleic acid to high specific activity in vitro by nick translation with DNA polymerase I. J. Mol. Biol., 1977, v. 113, p. 237-251.

121. Riggs A.D., Jones P.A. 5-methylcytosine, gene regulation, and cancer. Adv. Cancer Res., 1983, v. 40, p. 1-30.

122. Roberts J.M., Axel R. Amplification and correction of transformed genes. Cold Spring Harbor, N.Y., 198213,p.251-255.

123. Roberts J.M., Buck L.B., Axel R. A structure of amplified DNA. Cell, 1983, v. 33, p. 53-63.

124. Robins D.M., Axel P., Henderson A.S. Chromosome structure and DNA sequence alterations associated with mutation of transformed genes. J. Mol. Appl. Genet., 1981, v. 1,p. 191-203.

125. Robins D.M., Ripley S., Henderson A.S., Axel R. Transforming DNA integrates into the host chromosomes. Cell, 1981, v. 23, p. 29-39.

126. Robins D.M.,,Pack I., Seeburg P.H., Axel R. Regulated expression of human growth hormone genes in mouse cells. -Cell, 1982, v. 29, p. 623-631.

127. Robinson R.A., 0'Callaghan D.J. A specific viral DNA sequence is stably integrated in herpes virus oncogenically transformed cells. Cell, 1983, v. 32, p. 569-578.

128. Rose J., Bergman J.E. Expression from cloned cDNA of cell surface secreted forms of the glycoprotein of vesicular stomatitis virus in eucaryotic cells. Cell, 1982, v. 30, p. 753-762.

129. Rosenberg H., Singer M., Rosenberg M. Highly reiteratedsequences of SIMIANSIMIANSIMIAN. Science, 1978, v. 200, p. 394-402.

130. Salitzky P., Radbruch A., Rajewsky K. Spontaneous immunoglobulin class switching in myeloma and hybridoma cell lines differs. Immunol. Rev., 1982, v. 67, p. 59-72.

131. Sabourin D., Davidson R.L. Transfer of the herpes simplex thymidine kinase gene from human cells to mouse cells by means of metaphase chromosomes. Somat. Cell Genet., 19791 v. 5, p. 159-174.

132. Sager R., Anisowicz A., Howell N. Genomic rearrangements and tumor forming potential in an SV40-transformed mouse cell line and its hybrid progeny. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 1981a, v. 45, p. 747-754.

133. Sager R., Anisowicz A., Howell N* Genomic rearrangements in a mouse cell line containing integrated SV40 DNA. -Cell, 1981b, v. 23, p. 41-50.

134. Santos E., Reddy E.P., Pulciani S., Peldman R.J., Barbacid M. Spontaneous activation of a human proto oncogene. -Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1983, v. 80, p. 4679-4683.

135. Santi D.V., Garrett C.E., Barr P.J. On the mechanism of inhibition of DNA-cytosine methyl transferases "by cytosine analogs. Cell, 1983, v. 33, p. 9-10.

136. Sarver N., Byrne J;C., Howley P.M. Transformation and replication in mouse cells of a bovine papillomavirus pML2 plasmid vector, that can be rescued in bacteria. - Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1982, v.79, p. 7147-7151.

137. Sarver N., Gruss P., Law M.F.f Khoury G., Howley P.M. Bovine papilloma virus deoxyribonucleic acid: a novel eucaryo-tic cloning vector. Molec. Cell Biol., 1981a, v. 1,p. 486-496.

138. Scahill S.J., Devos R. , van der Heyden J., Piers W. Expression and characterization of the product of a human immune interferon cDNA gene in Chinese hamster ovary cells. -Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1983, v. 80, p. 4654-4658.

139. Scangos G.A., Huttner K.M., Juricek D.K., Ruddle P.H. Deoxyribonucleic acid-mediated gene transfer in mammalian cells: molecular analysis of unstable transformants and their progression to stability. Molec. Cell Biol. , 1981, v. 1, p. 111-120.

140. Scangos G.A., Huttner K., Silverstein S., Ruddle P.H. Molecular analysis of chromosome-mediated gene transfer. -Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1979, v. 76, p. 3987-3990.

141. Scangos G., Ruddle P.H. Mechanisms and applications of

142. DNA-mediated gene transfer in mammalian cells a review. -Gene, 1981, v. 14, p. 1-10.

143. Schaefer-Ridder M., Wang Y., Hofschneider P.H. Liposomes as gene carriers: efficient transformation of mouse L cells by thymidine kinase gene. Science, 1982, v. 215, p. 166-168.

144. Schaffner W. Direct transfer of cloned genes from bacteria to mammalian cells. Proc. Hat. Acad. Sci. USA, 1980, v.77, p. 2163-2167.

145. Schimke R.T. Studies on gene duplications and amplifications an historical perspective. - In: Gene amplification. Ed. by R.T.Schimke, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, p. 1-9.

146. Sene C., Nicolau C. Liposome-mediated gene transfer in eukaryotic cells. In: Liposomes, drugs and immunocompetent cell functions. Ed. Nicolau C., Paraf A., N.Y., Acad.Press, 1981, p; 63-77.

147. Shapira G., Stachelek J.L., Letson A., Soodak L.K., Liskay R.M. Novel use of synthetic oligonucleotide insertion mutants for the study of homologous recombination in mammalian cells. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1983, v. 80,p. 4827-4831.

148. Shaw G.D., Boll V/., Taira H., Mantel N., Lengyel P., Weis-sman C. Structure and expression of cloned murine INF -genes. Nucl. Acids Res., 1983, v. 11, p. 555-573.

149. Shen Y.M., Hirschhorn R.R., Mercer W.E., Surmacz E., Tsu-tsui Y., Soprano K.J., Baserga R. Gene transfer: DNA microinjection compared with DNA transfection with a very high efficiency. Molec. Cell Biol., 1982, v. 2, p. 11451154.

150. Sinclair J.H., Sang J.H., Burke J.F., Ish-Horowicz D. Extrachromosomal replication of copia-based vectoro in cultured Drosophila cells. Nature, 1983, v. 306, p. 198-200.

151. Singer D.S., Camerini-Otero K.D., Satz M.L., Osborne B., Sachs D., Rudikoff S. Characterization of a porcine genomic clone encoding a major histocompatibility antigen: expression in mouse L cells. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1982,v. 79, p. 1403-1407.

152. Small M. , Gluzman Y., Ozer H.L. Enhanced transforation of human fibroblasts by origin-defective simian virus 40. -Nature, 1982, v. 296, p. 671-672.

153. Small J., Scangos G. Recombination during gene transfer into mouse cells can restore the function of deleted genes. -Science, 1983, v. 219, p. 174-176.

154. Smiley J.R., Steege D.A., Juricek D.K., Summers W.P., Ruddle F.H. A herpes simplex virus 1 integration site in the mouse genome defined by somatic cell genetic analysis. Cell, 1978, v. 15, p. 455-468.

155. Spandidos D.A., Paul J. Transfer of human globin genes to erythroleukemic mouse cells. EMBO J., 1982, v. 1, p.15-20.

156. Spradling A.C., Rubin G.M. Drosophila genome organization conserved and dynamic aspects. Ann. Rev. Genet., 1981, v. 15, p. 219-264.

157. Spradling A.C., Rubin G.M. Transposition of cloned P elements into Drosophila germ line chromosomes. Science, 1982, v. 218, p. 341-347.

158. Spradling A.C., Rubin G.M. The effect of chromosomal position on the expression of the Drosophila xanthine dehydrogenase gene. Cell, 1983, v. 34, p. 47-57.

159. Stafford J., Queen C. Cell-type specific expression of a transfected immunoglobulin gene. Nature, 1983, v. 306, p. 77-79.

160. Stavridis J.C., Psallidopoulos M. Use of transferrin as a gene carrier to the erythroid cells of the marrow. - Cell. Mol. Biol., 1982, v. 28, p. 15-18.

161. Stein R., Gruenbaum Y., Pollack Y., Razin A., Cedar H. Clonal inheritance of the pattern of DNA methylation in mouse cells. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1982a, v.79, p. 61-65.

162. Stein R., Razin A., Cedar H. In vitro methylation of the hamster adenine phosphoribosyltransferase gene inhibits its expression in mouse L cells. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 19821), v. 79, p. 3418-3422.

163. Subramani S., Mulligan R., Berg P. Expression of the mouse dihydrofolate reductase complementary deoxyribonucleic acid in simian virus 40 vectors. Molec. Cell Biol., 1981,1. Vi 1, p. 854-864.

164. Sweet R.W., Chao M.V., Axel R. The structure of the thymidine kinase gene promoter: nuclease hypersensitivity correlates with expression. Cell, 1982, v. 31, p. 347-353.

165. Szoka P., Magnusson K., Wojceiszyn J., Hou Y., Derzko Z.,

166. Jacobson K.Use of lectins and polyethylene glycol for fusion of glycolipid-containing liposomes with eukaryotic cells. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1981, v.78,p.1685-1689.

167. Szybalska E.H., Szybalski E. Genetics of human cell lines. IY. DNA-mediated hereditable transformation of a "biochemical trait. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1962, v. 48,p. 2026-2034.

168. Szybalski E., Szybalska E.H., Ragni G. Genetic studies with human cell lines. Nat. Cancer Inst. Monogr., 1962, v. 7, p. 75-89.

169. Tabin C.J. , Hoffmann J.W. , Goff S.P. , Y/einberg R.A. Adaptation of a retrovirus as a eucaryotic vector transmitting the herpes simplex virus thymidine kinase gene. Mol. Cell. Biol., 1982, v. 2, p. 426-436.

170. Takano T., Noda M., Tamura T. Transfection of cells from a xeroderma pigmentosum patient with normal human DNA confers UV resistance. Nature, 1982, v. 296, p* 269-270.

171. Taniguchi T., Matsui H., Fujita T., Takaoka C., Kashima N., Yoshimoto R., Hamuro J. Structure and expression of a cloned cDNA for human interleukin-2. Nature, 1983, v. 302,p. 305-310.

172. Thacker J., Debenham P. G., Stretch A., Yfebb M;B. The use ofa cloned bacterial gene to study mutation in mammalian cells. Mutat. Res. 1983, v. 111, p. 9-23.

173. Thillet J., Kunst P., Lasserre C., Bucchini D., Pictet R., Jami J. Transformation of teratocarcinoma stem cells andfibroblasts with various vectors containing the Eco.gpt gene as a selection marker. Exp. Cell Res., 1984, v. 151, p* 494-501.

174. Tindall K.R., Stankowski L.F.,Ir., Machanoff R., Hsie A.\7. Analysis of mutation in DNA transformed Chinese hamster ovary cells. Environ. Mutagenes., 1983, v. 5, p. 415.

175. Tomilin N.V., Hofemeister J. Site-specific recA-independent recombination (fusion) of pMB8-related replicons in Escherichia coli in the region of the replication origins. -Gene, 1982, v. 17, p. 65-73.

176. Tonegawa S. Somatic generation of antibody diversity. Nature, 1983, v. 302, p. 575-581.

177. Twigg A.J., SHerrat H.D. Trans-comple3ientable copy-number mutants of plasmid ColE1. Nature, 1980, v.283, p.216-218.

178. Urielli-Shoval S., Gruenbaum Y., Sedat J., Razin A. The absence of detectable mrthylated bases in Drosophila melanoga*» ster DNA. PEBS Lett., 1982, v. 146, p. 148-152.

179. Urlaub G., Chazin L.A. Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient in dihydrofolate reductase activity. -Proc. Nat. Acad. ScijUSA, 1980, v. 77, p. 4216-4220.

180. Varshavsky A. On the possibility of metabolic control of replicon "mispiring"relationship to emergence of malignant phenotypes in mammalian cell lineages. Proc. NAt. Acad. Sci. USA, 1981a, v. 78, p. 3673-3677.

181. Varshavsky A. Phorbol ester dramatically increases incidence of methotrexate resistant colony-forming mouse cells: possible mechanisms and relevance to tumor promotion. -Cell, 1981b, v. 25, p. 561-573.

182. Verma I.M., Doehmer J., Barinaga M. , Vale W. , Rosenfeld M.G., Evans R. Expression and regulation of rat growth hormone gene in mouse fibroblasts. In: Eukaryotic viral vectors. Cold Spring Harbor, 1982, p. 159-164.

183. Wagner T.E., Hoppe P.C., Jollick J.D., Scholl D.R., Hodinka R.L., Gault J.B. Microinjection of a rabbit -globin gene into zygotes and its subsequent expression in adult mice anfl their offspring. Proc. Nat.Acad.Sci. USA, 1981,v. 78, p.6376-6380.

184. Wahl G.M., Vitto L., Padgett R.A., Stark G. Single-copy and amplified CAD genes in Syrian hamster chromosomes localized by a highly sensitive method for in situ hybridization. -Molec. CE11 Biol., 1982, v. 2, p. 308-319.

185. Wahl G.M., de Saint Vincent B.R., de Rose M.L. Effect of chromosomal position on amplification of transfected genes in animal cells. Nature, 1984, v. 307, p. 516-520.

186. Walker M.D., Kushner P., Goodman H.M. Regulation of rat growth hormone gene expression studied by gene transfer and somatic cell hybridization. J. Cell Biochem., 1982, suppl. 6, p. 350.

187. Viang M.L., LEE A.S., Polymerization of vector DNA after transfection into hamster fibroblast cells. Biochem. Bio-phys. Res. Ccmmun., 1983, v. 110, p. 593-601.

188. Warren C.J., Clark A.J. Sequence-specific recombination of plasmid ColE1. Proc. Nat.Acad.Sci. USA, 1980, v.77, p. 6724-6728.

189. Y/asylyk B., Y/asylyk C., Angereau P., Chambon P. The SV40 72bp repear preferentially potentiates transcription starting from proximal natural or substitute promoter elements. Cell, 1983, v. 32, p. 503-514.

190. Y/eidle U., Y/eissmann C. The 5f-flanking region of a human IPN- gene mediates viral induction of transformation. -Nature, 1983, v. 303, p. 442-446.

191. Y/einberg R.A. Integrated genomes of animal viruses. Ann. Rev. Biochem., 1980, v. 49, p. 197-226.

192. YJiberg P.C., Sunnerhagen P., Kaltoft K., Zanthen J., Bjnr-sell G. Replication and expression in mammalian cells of tra-nsfected DNA; description of an improved erytrocyte ghost fusion technique. Nucl. Acids Re., 1983, v. 11, p. 72877302.

193. Yfigler M. , Silverstein S. , Lee L.S., Pellicer A., Cheng Y; Axel R. Transfer of purified herpes simplex virus thymidine kinase gene to cultured mouse cells. Cell, 1977,v. 11, P.223-232.

194. Y/igler M. , Pellicer A. , Silverstein S. , Axel R. , Urlaub G* , Chasin L* DNAemediated transfer of the adenine phosphoribosyl transferase locus into mammalian cells. Proc« Nat. Acad* Sci. USA, 1979a, v. 76, P. 1373-1376.

195. Y/igler M. , Sweet R. , Sim Gj-K.; Y/old B. , Pellicer A., Lasy E.,

196. Maniatis T., Silverstein S., Axel R. Transformation of mammalian cells with genes from procaryotes and eucaryotes. -Cell, 19791?,v. 16, p. 777-785.

197. Wigler M., Perucho M., Kurtz D., Dana S., Pellicer A., Axel R., Silverstein S. Transformation of mammalian cells with an amplifiable dominant-acting gene. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1980, v. 77, p. 3567-3570.

198. Wigler M., levy D., Perucho M. The somatic replication of DNA methylation. Cell, 1981, v.24, p. 33-40.

199. Wilkie N.M., Clements J.B. , Boll W., Mantei N. , lOnsdale D., Y/eissmann C. Hybryd plasmide containing an active thymidine kinase gene of herpes simplex virus 1. Nucl.Acids Res., 1979, v. 7, p. 859-877.

200. Willeeke K., Lange R., Kruger A., Reber T. Cotransfer of two linked human genes into cultured mouse cells. Proc. Nat.Acad. Sci. USA, 1976, v. 73, p. 1274-1278.

201. Wold B., Wigler M., lacy E., Maniatis T., Silverstein S., Axel R. Introduction and expression of rabbit -globin gene in mouse fibroblasts . Proc. Nat. Acad. Sci. USA,1979, v. 76, p. 5684-5688.

202. Wong T., Nicolau C., Hofschneider P.H. Appearance of -lactamase activity in animal cells upon liposome-mediated gene transfer. Gene, 1980, v. 10, p. 87-94.4.10. Woodward J.G., Orn A., Harmon R.C., Goodenow R;S., Hood L.,

203. Frelinger J.A. Specific recognition of the product of a transferred major histocompatibility complex gene by cytotoxic T lymphocytes. Proc. Nat. Acad. SCi. USA, 1982, v. 79, p. 3613-3617.

204. Y/ullems G.S., van der Horst S. , Bootsma D. Transfer of the human-chinese hamster cell hybrids via isolated HeLa metaphase chromosomes. Somat. Cell Genet., 1976, v. 2,p. 359-371.

205. Yamamoto K., Furusawa M., Purusav/a I., Obinata M. The "pri-cking"method. A new efficient technique for mechanically introducing foreign DNA into the nuclei of culture cells. -Exp. Cell Res. , 1982, v.142, p. 79-84.

206. Yoshie 0., Schmidt H. , Reddy E.S. , T/eissman S., Lengyel P. Mouse interferons enhance the accumulation of a human HLA RNA and protein in transfected mouse and hamster cells. -J. Biol. Chem., 1982, v. 257, p. 13169^13204.

207. Zimi K.,Mellon P.,Ptashne M.,Maniatis T. Regulated expression of an extrachromosomal human -interferon gene in mouse cells.- Proc.Nat.Acad.Sci.USA,1982, v«79, p.4897-4901.