Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Природа генетической нестабильности признаков соматических клеток животных в культуре

ВАК РФ 03.00.17, Цитология

Автореферат диссертации по теме "Природа генетической нестабильности признаков соматических клеток животных в культуре"

ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ АКАДЕМИИ ШК СССР

На правах рукописи УДК 575.21:577.21.218

м

ГЛЕБОВ Олег Константинович

ПРИРОДА ГЫШШВСКСЙ НЕСТАБИЛЬНОСТИ ПРИЗНАКОВ СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ В КУЛЬТУРЕ

03.00.17 - Цйтология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации в форма научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук

с&ти, /вцо&у г, JшJ>Psг¿ua^kJ)

Ленинград 1989

Работа выполнена в Инотитуте цитологии АН СССР

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Ю.Б.Бахтин доктор биологических наук, профессор В.А.Гвоздев доктор биологических наук, профессор Л.И.Корочкин

Ведущая организация - Биолого-почвенный факультет Ленинградского государственного университета

Защита оостоится .......... 1989 г. в ... чао.на

заседании Специализированного совета (Д.002.73.01) при Институте цитологии АН СССР по адресу: 194064, Ленинград, Твхорецкий пр., 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Инотитута цитологии АН СССР

Автореферат разослан "...".......... 1989 г.

Ученый секретарь Специализированного совета

канд. биол. наук Л.Н.Писарева

(с) - Институт цитологии АН СССР

) ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Вопрос о природе феиотипичеекой изучив ости и ее связи с генотипической изменчивостью явля-гя одним из центральных в генетике и имеет как фуадамен-яыюе, так и прикладное значение. Известно, что многие ;гатипические варианты, выявляемые в популяциях соматичес-к клеток животных в культуре, являются нестабильными и рачивают при длительном культивировании на среде без се-ктивных агентов признак, по которому их ввделяли. В отли-э от стабильных фенотипических вариантов, возникновение горых, как показано в большом числе работ, связано с му-■щят, происхождение нестабильных фенотипических вариан-з клеток и механизмы, контролирующие нестабильность приз-ков, неизвестны и служат предметом многочисленных дискус-

Например, для стабильных вариантов соматических клеток, гойчивых к 8-азагуанину (АГ), показано, что АГ-резистент-\ фенотип возникает в результате мутаций в локусе гипо-антинфосфорибозилтрансферазы (ГФРТ). В то яе время устой-зые к АГ клоны различаются по частоте реверсий клеток к содному фенотипу и по стабильности воспроизведения прайса устойчивости в ряду клеточных поколений при культиви-зании клеток на среде без АГ, цричины чего не изучены. 1чно считается, что фенотипическая нестабильность (прояв-эщаяся в высокой частоте реверсий к исходному фенотипу и зате признака при культивировании клеток на среде без составного агента) является либо артефактом, обусловленным адэкватностыо селективных условий, либо следствием мода-гационной природы изменений.возникающих в присутствии се-шшных агентов. Однако показано, в том числе и наш (Аб-дян и др., 1979), что фенотипическая нестабильность вари-гов соматических клеток наследуется при их субклонирова-I, т.е. является генетической нестабильностью.11 Следова-

Безотносительно к механизмам наследуемая в ряду кле-шых поколений нестабильность по какому-либо признаку швается далее генетической нестабильностью. Генетическая ;табильность по какому-либо признаку, связанная о высокой нотой изменений в нуклеотидной последовательности (Ш) { соответствующего локуса, ниже называется генотипической :таб1мтыгостъю.

тельно, в большом числе случаев возникновение феиотшшчес нестабильных вариантов соматических клеток обусловливаетс по-видимому, генетически нестабильными изменениями. Для I которых вариантов соматических клеток (происхождение кот рых связано с амплификацией генов),в частности, для устой вых к ыетотрексату клонов, получены данные в пользу тох что фенотипическая нестабильность определяется генотипиче ки нестабильными изменениями. Причины генотипической пест бильности и механизмы возникновения и реализации свойст нестабильности генетических изменений остаются, тем не м нее, неизвестными.Анализ литературных данных (Глебов, Абр мян, 1984а; 19846) показывает, что генетически нестабильн изменения составляют существенную часть наследственной и менчивости поцуляций соматических клеток; очевидно, что б выяснения природа таких изменений невозможно понимайте ос бенностей генетических процессов, происходящих в популяци; культивируемых клеток животных.

Особенно перспективным для выяснения причин фенотип] ческой нестабильности вариантов соматических клеток пре; ставляется использование клонов генетически зранс$ормир< ванных соматических клеток, для которых (независимо от пр< похождения чужеродных генов и клеток-реципиентов), как и: вестно, характерна нестабильность по признакам, детермига рованным чужеродной ДНК. Наличие клонированных НП ДНК-зонде позволяет применить при исследовании таких клонов наряду методами генетики соматических клеток и молекулярно-биолс гические методы, что расширяет возможности анализа причин механизмов генетической нестабильности признаков и ее воз мсскной связи с генотипической нестабильностью соответствуя щих локусов.фоме того .изучение причин нестабильности тра* формантного фенотипа (т.е. признака, обусловленного экспре сией введенного в клетки гена) представляется не только ав туалышм для понимания механизмов взаимодействия чужеродно ДНК с генетическим аппаратом клеток-реципиентов, но и ваи ным о практической точки зрения,в связи с перспективами ис пользования метода генетической трансформации для полученп

гонов соматических клеток, продуцирующих полезные белки, и ' и генной терапии наследственных заболеваний.

Цель и задачи исследования. Задачей работы было иссле->вание и сопоставление свойств фенотипически нестабильных ¡риантов и клонов генетически трансформированных клеток и [явление факторов, контролирующих наследуемую нестабиль-|сть признаков соматических клеток, с целью выяснения приди генетически нестабильных изменений культивируемых кле->к животных. Для этого следовало:

1. Изучить механизмы устойчивости к АГ клеток феноти-чески стабильных и нестабильных клонов.

2. Выяснить причины гетерогенности популяций клеток не-абильных клонов по уровню устойчивости к АГ.

3. Отобрать из популяции клеток нестабильного АГ-резио-нтного клона варианта клеток .различающихся по другим прядкам, и исследовать стабильность таких вариантов.

4. Изучить кариотипичесную структуру клональних популя-1! клеток фенотипически нестабильных вариантов и характер риотишгческой изменчивости в них.

5. Исследовать факторы.влияющие на эффективность гене-ческой трансфоршции, и получить клоны генетически транс-рмированннх соматических клеток,различающиеся по стабиль-сти трансформантного фенотипа.

6. Определить причины утраты и восстановления транс— рмантного фенотипа соматических клеток.

7. Изучить факторы» детерминирующие скорость потери ансформантного фенотипа клеток, т.е. собственно свойство стабильности признаков соматических клеток,

8. Сопоставить особенности проявления генетической не-абильности признаков, контролируемых собственными генами чужеродными генами, введенными в соматические клетки.

Научная новизна. Показано, что признаки устойчивости в и чувствительности к облучению ультрафиолетовым светом ф облучению) могут обусловливаться в соматических клетка* нетически нестабильными изменениями.проявляющимися в слу-е признака устойчивости к АГ в наследуемых в ряду клеточ-

ных поколений вариациях количества ГФРТ. Кариотип сомати ских клеток рассмотрен как генетически нестабильный приз Получены данные в пользу того, что как особенности, та стабильность кариотипической структуры клональных популя клеток обусловливаются упорядоченным (на популяционном yi вне и статистически) характером кариотипической изменчив! ти. Предложена гипотеза, объясняющая как выявленные зако) мерности кариотипической гетерогенности популяций сомати' ских клеток, так и широкое распространение явления гене^ ческой нестабильности признаков соматических клеток, в з торой предполагается, что нестабильность клеток по кариоо пу связана с генетически нестабильными изменениями o^ej ных хромосом, индуцированными встраиванием мобильных reí тических элементов (МГЭ) или появлением в хромосомах т новых БП ДНК (вследствие амплификации или перестроек НП I хромосом).

В работе изучены особенности генетической трансформ ции соматических клеток различной видовой и тканевой прик длежности. Впервые проведен генетический анализ призна "скорость потери трансформантного фенотипа", и показано,ч он контролируется НП геномной ДНК, прилежащими к участ встраивания чужеродных генов в хромосомах клеток-реципие тов. Утрата и восстановление трансформантного фенотипа кл ток обусловливается наследуемыми изменениями активности ч неродных генов. Переключение активности генов, в свою оч редь, связано, по-видимому, с генотипкческими изменениями перестройками в чужеродной ДНК, происходящими с высокой ч стотой. По косвенным данным, между скоростью потери тран формантного фенотипа и частотой генотипических изменений чужеродной ДНК имеется положительная корреляция. Вперв! изучен процесс стабилизации трансформантного фенотипа, npi исходящий щ>и длительном культивировании соматических юн ток на селективной среде, как оказалось, постепенно, a i по типу "все или ничего", и частично связанный с метилир( ванием ДНК.

Обобщение данных, полученных при изучении гепетичес] нестабильных признаков, детерминированных как собственны;

нами соматических клеток, так и введенными в клетки чуже- ' дными генами, позволило сформулировать концепцию геномно-ищунитета. Согласно концепции, эукариотные клетки реа-руют на появление новых для данного района генома НИ ДНК дукцией сайт-специфичной генотипической нестабильности •е. ивдукцией перестроек ДНК, происходящих с высокой частой) независимо от того, является ли появление новых НП К результатом встраивания чужеродных генов,МГЭ, или след-вием амплификации и перестроек НП ДНК собственно района нот. Генотипическая нестабильность участков генома цри-дит к эпигенотипической нестабильности - к происходящим с сокой частотой наследуемым изменениям в активности генов, сположенных в таких участках. Таким образом, генетическая стабильность признаков соматических клеток выступает как едствие эпигенотипической и генотипической нестабильности астков генома, содержащих контролирующие признаки гены, дуцируемой при появлении в них новых НП ДНК.

Практическое значение. Результаты, полученные в работе, зволяют предсказывать характер стабильности трансформант-го фенотипа клеток при изменениях состава или структуры ансформирувдих ДНК и возможные пути стабилизации признав, детерминированных чужеродными генами, что представля-ся важным для решения задачи получения клеток-продуцентов лезних белков с помощь® генетической трансформации сомати-ских клеток. Явление наследуемой дестабилизации трансфор-нтного фенотипа под действием опухолевого промотора 12-о~ традеканоилфорбол-13-ацетата (ТФА) может служить основой я разработки метода тестирования in vitro химических оое-нений на промотиругацую активность. Данные о генетическом рактере нестабильности соматических клеток по устойчивос-к АГ могут представлять интерес для медицины в связи с пользованием АГ в химиотерапии злокачественных новообра-ваний.Полученные клоны генетически трансформированных кле-к используются для выяснения механизмов индукции и реали-ции генотипической и эпигенотипической нестабильности рай-ов генома, содержащих чужеродные гены.Разработаны модифи-цяи методов генетической трансформации соматических кяе-

ток, которые используются в Институте цитологии АН СССР у. ряде других научно-исследовательских институтов.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на I и II Всесоюзных совещаниях по генетике соматических клетог в культуре (Звенигород, 1980;1983); на Всесоюзной конференции "Генетические процессы в популяциях опухолевых теле ток" (Ленинград ,1980); на 1У съезде Всесоюзного общества генетиков и селекционеров им. Н.И.Вавилова (Шнек, 1981); на Всесоюзном совещании "Клеточные и молекулярные механизмы канцерогенеза и антиканцерогенеза" (Ленинград,1982); на I и II рабочих совещаниях по вопросам многостороннего сотрудничества Академий наук социалистических стран по теме 4.3.8 "Перенос генов в эукариотических клетках" (Цущино, 1982; Будапешт, 1983); на Всесоюзной конференции "Рекомбинантные ДНК" Шущино,1982); на Объединенном конгрессе Европейского общества культур ткани и Европейского общества ретикулоэндоте-лия (Будапешт,1983);на Всесоюзных совещаниях "Биология клетки в культуре" (Ленинград, 1983;1987); на У Всесоюзном сим позиума "Молекулярные механизмы генетических процессов" Шо сква, 1983); на 1У симпозиуме СССР-Италия "Макромолекулы в функционирующей клетке" (Киев,1984); на 16-й Конференции Фе дерацшг Европейских биохимических обществ (Москва, 1984);на У1 Симпозиуме СССР-ФРГ "Структура и функция генома" (Ленинград, 1935); на Всесоюзной конференции по генетике соматических клеток в культуре (Звенигород, 1986). Результаты работы неоднократно докладывались и обсуждались на научном се минаре Отдела клеточных культур и Научном собрания Института цитологии АН СССР.

Объем и структура -работы. В качестве диссертации представляется совокупность работ: 35 публикаций в отечественных и международных изданиях и монография "Генетическая трансформация соматических клеток",,Л.: Наука, 351 с. (30 авт. л.). Собственные результаты составляют главу 3 и включены в главы I и 2 монографии. В книге из 47 таблиц 34 и из 41 риоунка 36 отражают собственные результаты, остальные та блицы и рисунки построены на литературных данных;список литературы содержит 1874 названия.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Линии клеток. АГ-резистентные клоны были отобраны на реде, содерж.. 15 мкг/мл АГ, из линии клеток китайского омячка CHO-KI (адаптированной к росту на среде Игла с 105? ыворотаи iqyyriHoro рогатого скота - СКРС) и двух сублиний леток линии CH0-KI, полученных в результате обработки кле-ок в течение 20 ч мутагенами: 5-бровдезоксиурвдином (БДУ, мкг/мл) - сублиния А, и этилметансульфонатом (ЭМС, 300 кг/мл) - сублиния В. Названия АГ-резистентных клонов, полу-еяных из необработанной (контрольной) линии клеток CH0-KI ачинается с буквы "К", а полученных из сублиний А и В - с >укв "А" и "В", соответственно. Клетки АГ-резистенткых кло-:ов культивировали на среде Игла с 10$ СКРС. Для генетической трансформации использовались клетки китайского хомячка пгаий А238 (дефектные по тимвдинкиназе ТК~) и шх11 (дефектам по дигидрофолатредуктазе - ДГФР"), мыши линии LMtk" [ИГ), зеленой мартышки линии Vero и человека линии HeLa. Слетки культивировали на среде F10 (линии А233 и ШХ11) и ;реде Dirai (линии LMtk-, Vero и HeLa), в присутствии неос-ювных аминокислот и 10$ сыворотки эмбрионов коров (СЭК), ¡а исключением особо оговариваемых случаев.

Методы. Для анализа выживаемости клеток и стабильности тризнаков использовались стандартные методы клонирования ¡оматических клеток на соответствующих средах.Трансформацию теток осуществляли с помощью кальций-фосфатного преципитата ДНК, с последующим отбором клеток на селективных средах (Глебов, 1988). Активность ГФРТ (Dunkan, Broolca, 1972¡Sharp it al., 1983) И ТК (Kit et al., 1974} MoBrlde et al., 1978) определяла, как в указанных работах.Изоэлектрофокусироваяие (ИЭФ) в полиакриламидном геле (ПААГ) ТК проводила по методу Кит и Леунг (Kit, Leung, 1974). Манипуляции с плазмидными 5НК и анализ состояния рекомбинантных ДНК в клетках транс-£ормантных клонов осуществляли в основном так, как рекомендовано Маниатисом и др. (Maniatie et al., 1982). Метафазные сромосомы из клеток трансфоршнтных клонов выделяли по методу Блюменталя (Blumenthal et al., 1979)- Кариологические препараты готовили стандартным способом и дифференциально окрашивали на G-диски.

Статистическая обработка результатов. Среднюю часто-выживаемости клеток (5) и стандартную ошибку средней част* ты (з^) рассчитывали по формулам из- -где а и п0 - среднее число колоний на чашку в опыте и ко; троле, соответственно, а N и Н0 - сумма числа колоний в ч; ках опытного и контрольного вариантов. Для контрольных в; риантов 5= и б- «Дг^- . При объединении результат*

независимых опытов по выживаемости клеток после УФ облу1 ния среднюю выживаемость (£б) и стандартную ошибку средне: значения (г-) рассчитывали, исходя из предположения о то: что результаты следуют лог-нормальному распределению (Зах; ров, фивисний, 1972): , где а - число но.

торностей, - значения логарифма выживаемости клеток в ' полученные в повторных опытах для данной дозы; Среднюю летальную дозу (5) и относительную крутизну дозк щнтых (3) вычисляли согласно Хугу и Келлереру (1969). Те ретические распределения клеток по числу отклонений хром сом рассчитывали, как рекомендовано Джексоном и Барбер (¿аскеоп, ВагЪег,1953) и Дучнаком (1963;1968). Скорость п тери трансфорканткого ТК^-фенотипа (у, в % клеток, утрач ващих ТК*-фенотип, за I сут), вычисляли, полагая ее пост янной, по форцуле у—ъ.1пЮ»-2.302бь, где ь - угловой коз фициент линейной регрессии, рассчитанный методом наименьш квадратов по зависимости логарифма (по основанию 10) част ты выживаемости клеток па среде ГАТ от времени культивир вания трансформантных клонов на неселективной среде ГТ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЗДЕНИЕ

I. Генетически нестабильные изменения клеток китайског хомячка по устойчивости к АГ и чувствительности УФ облучению

В работе исследованы клоны клеток китайского хомяч линии СК0-К1, возникшие спонтанно или после обработки кл ток мутагенами (ЭМС, ЕДУ), и отобранные по способности кл ток к росту на среде, содержащей 15 ад/мл АГ (Абрамян, V, натова, Глебов,1979). При анализе таких клонов было обнар *ено, что оня различаются как по уровню устойчивости к

к и по стабильности признака АГ-резистентности. Для одно-из фенотипически нестабильных клонов - А14-2с-1 - было казано.что нестабильность проявляется не только в утрате изнака АГ-резистентности при культивировании клеток на селективной среде, но и в расщеплении по признаку устой-вости к АГ и стабильности признака: выделенные из клона 4-2с-1 субклоны различались как по уровню устойчивости еток к АГ.так и по стабильности воспроизведения признака ряду клеточных поколений. Из этого следует, что фенотипи-ская нестабильность клона А14-2е-1 по устойчивости к АГ терминирована генетически. Для выяснения возможных раз ли- , й в характере генетически стабильных и генетически несильных изменений, придающих клеткам китайского хомячка ¡тойчивость к АГ, были изучены механизмы устойчивости к АГ 1фичины фенотипической гетерогенности клеток стабильных -резистентных клонов я генетически нестабильного клона :4-2с-1.

1.1. Привода устойчивости к АГ клеток стабильных клоков

Эффективность клонирования (ЭК) клеток всех исследование стабильных АГ-резистентных клонов на среде, содержащей ] мкг/мл АГ.достоверно не отличается от ЭК на среде без АГ. лесте с тем, как видно из данных, представленных в тайл.Г,

Фенотипические характеристики стабильных АГ-резистентных

Дсп АГ Дсо ТГ Способ- Активность ГФРТ, нмоль ШФ Клон мй/шг мй/млкость на I бща Ю I Ч-

Таблица I

клонов

а-2 . 50 15-4а-1 70 15-4а-9 94

а-2

15-4е-5 124 15-4е-6 155

Примечание: здесь и в табл.2 и 3 в скобках указано ко-ичество опытов.

клоны различаются по степени устойчивости к АГ и 6-тиогуаш ну (ТГ). Для всех изученных АГ-резистентных клонов характер на пониженная по сравнению с чувствительными к АГ клеткаи активность ГФРТ, которая варьирует от 8 до 123 нмоль инозин монофосфата (ИМФ) на I мг белка за I ч. Это составляет,соот ветственно, 5 и 72$ от активности ' ГФРТ в метках лини СН0-К1, равной 169.6+6.7 нмоль ШФ на I мг белка за I ч. целом степень устойчивости клеток изученных клонов к АГ ТГ увеличивается с уменьшением активности ГФРТ, тогда ка уровень включения в клотки экзогенного гипоксантина (Гн) ЭК клеток на среде ГАТ при этом понижаются.

Для выяснения цричин уменьшения активности ГФРТ в клет ках АГ-резистентных клонов были определены кинетические па раметры катализируемой ГФРТ реакции: кажущиеся константы Ми хаэлиса (К^) для Гн и фосфорибозилпирофосфата (ФРЛФ), и со ответствующие максимальные скорости реакции Оказалось

что ГФРТ всех АГ-резистентных клонов характеризуется иэме ненныш по сравнению с чувствительными к АГ клетками кинети ческими параметрами (на рис. I и 2 приведены данные для 4 и 6 исследованных клонов). Если для ГФРТ клеток линии СНО-К Ку для Гн равна 21.6 мнмоля, а для ФРПФ 22.5 мкмоля, то дл ГФРТ клеток АГ-резистентных клонов К^ для Гн варьирует от 2 до 250 мкмолей, а Ку для ФРПФ - от 8 до 317 мкмолей.

Таким образом, уменьшение активности ГФРТ в клетках АГ' резистентных клонов обусловливается изменениями в свойства молекул фермента, приводящими, в частности, к иному сродств; к субстратам. Сопоставляя этот вывод с тем, что исследованные клоны стабильно воспроизводят АГ-резистентный фенотип, можно заключить, что они возникли в результате «мутаций в ло-кусе, кодирующем ГФРТ. Обнаруженные различия мезду стабиль ными клонами по Д^ АГ и ТГ,в уровне включения в клетки экзогенного Гн и способности к росту клеток на среде ГАТ являются, по-видимому, следствием того, что мутации затрагиваю' разные участки локуса ГФРТ, изменяя в.той или иной степей сродство фермента к АГ, ТГ и Гн.

-2-1 0 1 2 Ъ А 5

+ 1 & г ® 3 О 4

-1-2024 6 8 Ю

Рис Л. Зависимость скоро-и образования ИМФ от кон-нтрацил Гн для ГФРТ из кле-к устойчивых к АГ клонов. По оси абсцисс - величина-, ратная концентрации Гн, 1<Г , по оси ординат - величи-.^об^а^ная количеству ИМФ,

-'В15-4а-1; 2 - В15-4а-9; - В15-4е-5; 4 - К14-Зд-1.

Рис.2. Зависимость скорости образования ШФ от концентрации ФРПФ для ГФРТ из клеток устойчивых к АГ клонов.

По оси абсциссконцентрация ФРПФ, хЮ~ж по оси ординат - частное от деления концентрации ФРПФ на количество ИМФ,х10ь. Обозначения те же, что на рис.1.

1.2. Природа Фенотитшческой гетерогенности генетически нестабильных по признаку АГ-тзезистентяости клонов

Известно, что фенотипические различия между генетически стабильными линиями оцределяются в большом числе случаев менениями в экспрессии, а не изменениями в структуре не-абильных генов (МсСИг^оск, 1956; СЬото1ок ег а1., 1976). связи с этим представлялось важным установить»каковы при-ны различий в степени устойчивости к АГ клеток нестабиль-х клонов. Для этого из генетически нестабильного клона 4-2с-1 в тот момент, когда он ревертировал к чувствительно-

аду к АГ состоянию, на среде без АГ вновь были выделены су клоны, различающиеся по степени ЛГ-резистентности (табл.2

Таблица 2

Фенотипические характеристики мола А14-2с-1 и полученных из него субклонов

Клон (Субклон) Средняя летальная доза АГ.мкг Эффективность клонирования на среде ГАТ,# Активность ГФ. ниоль ИМФ на I белка за I ч

А14-2с-1 2с-И 2с-15 2о-16 2с-17 4.5 15 5.5 14; 0 14.4 99.5+5.1(6} 52.8+2.9(6) 109.7+5.0(6) 83.8+4.4(6) 71.2+3.5(6) 247.1+5.8(5) 136,9+2.4(4) 269.7+6.1(4) 136.0+2,4(4) 118.6+1.8(5)

Исследование фенотипических характеристик субклонов пров далось на 60-100 пассажах (около 100-350 клеточных покол ний) с момента их выделения, и на протяжении этого перио уровень устойчивости клеток к АГ и другие фенотипическ характеристики субклонов, указанные в табл. 2, оставали постоянными. Можно видеть, что уровень устойчивости клет к АГ и ЭК на среде ГАТ зависит от активности ГФРТ в ни Д50 АГ для субклонов 2с-II, 2с-16 и 2с-17 в 3 раза выше, активность ГФРТ в 2 раза ниже, чем для клона А14-2с-1 субклона 2с-15. Различия в активности ГФРТ приводят и различиям во включении экзогенного Гн:клетки клона А14~2с и субклона 2с-15 включают £ среднем в 1.3 раза больше I чем клетки субклонов 2с~П, 2с-16 и 2с-17.

Анализ кинетических параметров катализируемой ГФРТ р акции показал, что хотя максимальные скорости реакции ра личаются в клоне А14-2с-1 и субклонах 2с-П и 2с-17 - в с ответствии с уровнем активности фермента.измеренным при г стоянных концентрациях Гн и ФРПФ, - К^ для Гн и ФРПФ одм ковы и равны 21. §¿0.3 мкмоля и 22.^0.2 мкмоля, соответс венно (рис. 3 и 4), т.е. на отличаются от К^ для Гн и Ф1 ГФРТ из клеток исходной линии СН0-К1. Из этого следует, 1 разная активность ГФРТ в экстрактах из клеток родительскс клона А14-2с-1 и полученных из него субклонов обусловлю

я не изменениями в свойствах молекул ГФРТ, а изменениями :оличестве (концентрации) молекул фермента в клетках ис-дованннх клонов.

Рис.3. Зависимость скорости образования ИМФ от концентрации Гн для ГФРТ из клеток клона А14~2с-1 и его субклонов.

По оси абсцисс и оси ординат - то же, что на рис. I.

1 - А14-2С-1;

2 - 2с-II;

3 - 2с-17.

-3 -2-1

Рис.4. Зависимость >рости образования

> от концентрации 1Ф для ГФРТ из кле-с клона А14-2с-1 и ) субклонов.

По оси абсцисс и г ординат - то же,

> на рис. 2. Обозначения те же, ) на рис. 3.

1 г 3

& 1

Д2

оЗ 3

2

1

-10 12 3

Фенотипически различающиеся субклоны были выделены так-из АГ-резистентного клона В15-4в-4 (табл.3). Степень ус-{чивости клеток субклонов к АГ и ТГ зависит от активности

ЭТ в них: субклоны с, в и клон В15-4в-4,активность ГФРТ в горых составляет в среднем 62 нмоль ИМФ на I мг белка за I, обнаруживают меньшую устойчивость к АГ (Дзд-70 мкг/мл) ГГ (Д50-8 мкг/мл), чем остальные субклоны (А, В, Р, С и Н) средней активностью ГФРТ 16 нмоль ТО на I мг белка за 1 (Д50 АГ - 95 мкг/мл, Д50 1Г - 9 мкг/мл). ЭК на среде ГАТ эток субклонов с,й и клона В15-4в-4 выше, чем ЭК клеток гальных субклонов, более того, клетки субклона Н с мини-яьной активностью ГФРТ не способны расти на среде ГАТ.

Таблица 3

Фенотипические характеристики АГ-резистентного клона В15-4в-4 и полученных из него субклонов

Клон (Оубклон)

Активность ГФРТ, нмоль КМФ на I мг белка за I ч

В отсутствии ТТФ

В присутствии 2 мМ ТЗФ

Средняя летальная _лоза_

АГ, мкг ТГ.мкг

В15-4в~4 А В С

I) р

й н

76.2+3.7 22.5+2.8 10.371.1 65.0+2.8 46.1+2.8 18.5+1.4 18.1+1.6 8.6+1.4

79.8+5.0

18. ¿1.2

50.2+4.1 27.9+0.5

14.5+1.0 (4)

(4) (4)

8)

40 130 130 70 100 36 62 НО

5

4

6

5 15 10 15 II

Анализ кинетических параметров катализируемой ГФРТ реакции показал, однако, что ^ для ГФРТ всех субклонов такие же, как и для ГФРТ родительского клона:Ну для Гн равна 41.2+0.2 мкмоля, а для ФРПФ - 52.1+0.2 мкмоля. Напротив, Уы для клеток разных субклонов различаются более,чем в 15 раз в соответствии с уровнем активности ГФРТ, определенной при постоянных концентрациях Гн и ФРПФ.

Следовательно, вцутриклоналъная гетерогенность меток по устойчивости к АГ в клоне В15-4в-4 связана,как и в клоне А14-2с-1 с изменениями в количестве (концентрации) ГФРТ,т.е. определяется наследуемыми изменениями в экспрессии гена,кодирующего данный фермент. Возможность выделения из клона В15-4в-4 фенотипически различающихся по устойчивости к АГ субклонов на среде без селективного агента указывает на высокую частоту возникновения таких наследуемых изменений, что позволяет отнести клон В15-4в-4 к категории генетически дестабильных. Остается неизвестным, на каком из уровней рефляции экспрессии генов возникают обнаруженные изменения. $то могут быть изменения как в числе копий или активности гена, кодирующего ГФРТ, так и в активности генов, контролирующих процессы синтеза и деградации данного фермента.

Следует отметить, что генетически нестабильные изменения, приводящие к вариациям в количестве ГФРТ, происходят

i клоне В15-4в-4, в отличие от клона А14-2с-1, на фоне ста-ильного изменения в свойствах фермента. Имеющиеся данные :е позволяют решить вопрос о том, связаны или нет в клоне И5-4В-4 нестабильные изменения в активности гена 1'ФРТ с утацией, изменившей сродство фермента к субстратам.

1.3. Внутриклональная гетерогенность и нестабильность клеток китайского хомячка по признаку чувствительности к УФ облучению

Известно, что из линий, обнаруживающих генетическую пе-таоильность по какому-либо признаку, можно, как правило, ыделить линии, генетически нестабильные по другому призна-у, не связанному с первым (Green, 1933). Ряд данных сввде-ельствовал о том, что клон А14-2с-1 может быть нестабилен о чувствительности клеток к УФ облучению (Абрамян, 1979). ействительно, анализ кривых выживаемости клеток после УФ блучения показал, что для клона AI4-2C-I характерна внутри-лональная гетерогенность по этому признаку: внделенные из его субклоны характеризовались различным уровнем чувстви-ельности к УФ облучению (табл. 4).

Таблица 4

Параметры кривых выживания клеток клона AI4-2C-I и полученных из него субклонов

Клон Д3?, Дж/м2 п Д, Ш/яР S ¡количество опытов

I4-2C- C-II с-15 S-I6 2-17 •I 5.80+0.64 8.2Ö+0.99 1.90+0.10 12.60+2.00 5.53+0.56 3.39+0.35 2.34+0.07 1.02+0.02 2.62+0.92 1.82+0.03 5.06+0.22 6.98+0.54 0.99+0.03 8.09+1.93 5.39+0.46 2.97+0.84 5.47+2.13 I.IS+0.0I 2.24+0.81 2.14+0.07 3 3 2 2 3

Примечание: для клонов 2с-15 и 2с-16 приведены характе-истики УФ чувствительности клеток на 3-15 пассажах.

Культивирование в течение года субклонов 2с-П и 2С-17 э оказало влияния на характер зависимости выживаемости кле-эк от дозы УФ облучения, тогда как культивирование субкло-зв 2с-15 и 2с-16 сопрововдалось изменениями в чувствитель-

ности клеток к УФ облучению (табл.5). Фенотипическая нестабильность (реверсия к исходному фенотипу клеток) субклонов 2с-15 и 2с-16 также проявляется,как следует из анализа кривых выживаемости после УФ облучения клеток полученных из них 5 суб-субклонов, во внутриклональной гетерогенности по уровню чувствительности к УФ облучению.

Таблица 5

Параметры кривых выживания клеток субклонов 2с~15 и 2с-16 на разных пассажах культивирования

Клон Пас- Д37, Дж/м^

Д, Дж/м*

сажи

Количе ство

огмто!

2с-15 3-15 40-60 80-90

1.90+0.10 3.53+0.35 5.83±0.17

2С-16 3-15 I2.6ftt2.0C 40-90 5.25±0.13

1.02+0.02 1.0®. 03 1.17+0.11

2.62+0.92 1.5©). 07

0.99+0.03 1.97+0.17 3.36+0.21

8.09+1.93 3.23+0.15

I.18+0.18 I.18+0.01 1.17+0.33

2.24+0.81 2.19+0.34

2 3

3

2

4

Исходя из представленных данных можно заключить, что для клона А14-2с-1 (и его субклонов 2с-15 и 2с-16) характерна генетическая нестабильность по признаку чувствительности клеток к УФ облучению. Было показано, что мевду уровнем выживаемости (Д37 и Д) и эффективностью пострепликативной репарации ДНК в клетках клона А14-2с-1 и его субклонов,а также на разных пассажах культивирования фенотипически нестабильных субклонов обнаруживается положительная корреляция (Таварткиладзе и др., 1980). Кроме того, оказалось, что в клетках субклона 2с-17, в отличие от клеток клона А14-2с-1, отсутствует чувствительная к кофеину быстрая компонента пострепликативной репарации. Все это позволяет предполагать что различия между исследованными клонами в чувствительности клеток к УФ облучению обусловливаются изменениями в системе пострепликативной репарации ДНК. Возможно, что эффективность пострепликативной репарации ДНК варьирует, как и активность ГФРТ, в результате наследуемых изменений в генной экспрессии.

1.4. Кариотипическая структура ч характер кариотипичесуой изменчивости клональных популяций соматических клеток

Для ряда нестабильных вариантов клеток китайского хо-ячка с повышенной чувствительностью к УФ облучению было по-азано, что'' фенотипическая реверсия (понижение чувствитель-ости клеток к УФ облучению) соцрововдается изменениями в . ариотипической структуре клональных популяций клеток (Ка1;о, озШ.с!а,1972). В связи с этим было проверено, не связана ли енотипическая реверсия клеток субклонов 2с-15 и 2с-16 по ризнаку чувствительности к УФ облучению также с изменения-и кариотипической структуры популяций клеток.

Распределения клеток по числу хромосом в выделенных из лона А14-2с-1 субклонах 2с-П, 2с-15 и 2с-1б достоверно от-ичаются (как показывает оценка с помощью критерия X) от распределения клеток родительского клона. Во всех субклонах ущественно повысилась доля клеток модального класса - до '5-80$ по сравнению с 49% в клоне А14-2с-1. Сразу после вычленил субклонов (на 3-ем пасеаке) большинство клеток моральных классов имеют один (основной) структурный вариант ариотипа (СВК)Ж (табл. 6), тогда как в клоне А14-2с-1 клерки модального класса имеют в- основном один из двух СВК: .'+2+5+5+1+4+1 (45$) и 2+2+6+4+1+4+1 (20%). Основные СВК в [зученных субклонах различаются мезду собой как по количест-)у хромосом в группах, так и по морфологии их.С помощью Ифференциального окрашивания на с-сегменты было показано, 1То клетки субклонов с основными СВК действительно имеют >дин СВК: любая хромосома индивидуального набора основного /ВК встречается в йавдой из 15 проанализированных глэтафаз.

Поскольку в выделенных субклонах частоты встречаемости клеток модальных классов и клеток с одним (основным) СВК существенно возросли, очевидно, что клонирование приводит к дгеньшению кариотипической гетерогенности исходной популя-

к Цри анализе хромосомных наборов клеток хромосомы были разделены на 7 групп в соответствии с особенностями морфологии и размером. При изложении результатов приводятся формулы СВК, в которых последовательно указано количество сромосом в группах Тот I до УН группы).

ции клеток клона А14-2с-1 (непрерывно культивировавшегося в течение длительного - более 2 лет - периода времени). Однако, как показал анализ суб-суб кланов, выделенных из субклонов 2с-11 (2с-11/1) и 2с-16 (2с-16/3 и 2с-15/5), повторное клонирование не сопровождается уменьшением кариотипической гетерогенности клональных популяций. Сравнение при помощи 1фитерияУ? распределений клеток по числу хромосом, преобразованных в соответствии с рядом ...М-п,... ,М-2,М-1,:,!,М+1, М+2,...,М+п,..., где М - число хромосом в клетках модальных классов, указывает на отсутствие достоверных различий в таких распределениях в изученных субклонах и суб-субклонах. Частоты встречаемости клеток с основным СВК в суб-субклонах также достоверно не отличаются от таковых в субклонах.

Таблица 6

Частота клеток с основным СВК и количество дополнительных СВК в клонах и субклонах

Количе- КЬличе- Формула основ- Частота Частота Количество ство кого структур- клеток клеток ство Клон пасса- проана- ного варианта с осно- модаль- допол-кей лизиро- кариотипа вным ного нитель-ванных СВК, % масса ных СВК

клеток с основ-

ным СВК,

%

2с-16 3 98 2+2+5+5+1+4+0 65.3+4.8 82.1+4.4 19

15 102 72.5+4.4 89.2+3.4 18

90 93 72. (¿4.6 87.0+3.8 14

20-II 3 101 2+2+5+5+I+4+I 60.4+4.9 88.4+3.8 19

15 105 71.4±4.4 97.4+1.8 13

90 97 45.4+5.1 8I.5t5.3 15

2с-15 3 100 2+2+6+4+I+4+I 52.0¿5.0 67.5+5.3 24

15 99 66.6+4.7 85.7+3.9 21

90 88 39.8+5.2 53.0+6.1 23

2C-I6/3 35 108 2+2+5+5+1+4+0 78.6+3.9 93.0+2.7 15

2с-16/5 35 104 2+2+5+5+1+5+0 80. ¿3.9 93.0+2.7 II

2C-II/I 35 97 2+2+5+5+1+4+2 71.1+4.6 89.6+3.4 12

Следует отметить, что согласно приведенным выше данным жотип соматических клеток является генетически нестабиль-л признаком:наблюдается расщепление клеток по данному при-1Ку (проявляющееся во внутриклональной гетерогенности кле-< по кариотипу) и клетки с разными СВК наследуют свойство стабильности кариотипа.

Кариотипическая структура (распределение клеток по чис-хромосом и частота клеток с основным СВК) остается постовой при длительном культивировании популяций клеток суб-знов 2с-16 и 2с-Пк. В клоне 2с-15 при стабильном расцре-яении клеток по числу хромосом после 60-го пассажа умень-зтся доля клеток с основным СВК, что сопровождается повы-яием, в основном, частоты встречаемости клеток модального асса с двумя другими СВК. Таким образом, фенотипическая версия по признаку чувствительности клеток к УФ облучению жет сопровождаться (субклон 2с-15) и не сопровождаться убклон 2с-16) изменениями кариотипической структуры попу-ций клеток. Следовательно, в общем случае нестабильность риотипической структуры популяций клеток не может расскат-ваться как причина фенотипической реверсии генетически не-абильных вариантов соматических клеток.

Очевидно, что клетки, давше начало клональным популя-ям, имел]! СВК, являющийся основным в соответствующих суб-онах и суб-субклонах. Одинаковый характер кариотипической терогенности клональных популяций,основу которым положили етки с разными кариотипами, и отсутствие изменений в степи кариотипической гетерогенности при реклонировании кло-льных популяций означают, что степень кариотипической терогенности таких популяций определяется, по-видимому, об-м для разных субклонов и суб-с'убклонов параметром, а имен-

х В субклоне 2с-П на 90-м пассаже выявлено уменьшение 1Стоты встречаемости клеток с основным СВК (табл. 6), обус-щленное, однако, временным повышением частоты встречаемо-■и псевдополиплоидных клеток (на 105-м пассаже частота ¡тречаемости таких клеток снижается до первоначального уро-и и восстанавливается исходная кариотипическая структура шуляции клеток субклона).Частота встречаемости клеток мо-шьного класса с основным СВК в субклоне 2с-П при длитель->м культивировании не изменяется.

но частотой нариотипических изменений, сходной для клето разных кариотипов. Должны существовать механизмы подцержа ния кариотишческой структуры клональных популяций клеток подвергающейся вследствие кариотипических изменений, прои сходящих с высокой (как показывают расчеты - порядка 1% н, клетку на поколение) частотой, непрерывно^- разрушающему воздействию.

Анализ характера распределений клеток субклонов 2с-1 и 2с-11 по числу отклонений от исходного для данной клонал ной популяции (основного) СВК, показал, что на кариотипи-ческую гетерогенность популяций соматических клеток действ] тельно наложены определенные ограничения, свидетельствуй®!! о существовании таких механизмов. Распределения клеток п< числу структурных отклонений от основных СВК (когда за одю отклонение принималось изменение на одну хромосому числ; хромосом в той или иной группе основного СВК) соответствуют вырожденному распределению Пуассона (задаваемому двумя пар< метрами),а не распределению Пуассона (задаваемому одним параметром - средней частотой отклонений на клетку), как можно было бы предполагать, исходя из случайности (независимости) структурных отклонений. "Инфекционная" гипотеза, согласно которой взаимозависимость отклонений связана с тег, что в клетке, претерпевшей одно отклонение,с высокой вероят ностыо возникают другие отклонения, не подтверждается: наблюдаемые распределения клеток по числу структурных отклонений от основных СВК не соответствуют ожидаемому при таког> предположении отрицательному биномиальному распределению. Возможно, что первичные кариотипические повреждения действ» тельно могут подвергаться репарации, происходящей по тип> "все или ничего", как это предполагается в модели, описываемой вырожденным распределением Пуассона, но для такого вывода требуются дополнительные эксперименты.Отметим, что несмотря на значительное разнообразие СВК (145 СВК в объединенной выборке клеток трех субклонов).около 20? из них являются общими для исследованных субклонов. Ограничения проявляются также в неравномерном распределении отклонений от основных СВК по разным хромосомам, и в том, что отклонения

is них хромосомах не являются независимыми. Исходя из нежности кариотипических изменений (по крайней мере,тех, происходят с высокой частотой и обусловливают кариотшш-кую гетерогенность) и межклональных различий в стабильно-разных хромосом, можно предполагать, что нестабильность атических клеток по кариотипу обусловливается генетичес-нестабильностью определенных хромосом.

Нами была предложена гипотеза о том, что такие генетики нестабильные изменения хромосом могут быть результа-I локальных нарушений структуры участков генома, обусловите встраиванием МГЭ или появлением иных новых НИ ДНК ¡ледствие амплификации или перестроек собственных НИ ДНК ютка генома). Появление новых Ш ДНК может быть связано пздукцией аберрантной транспозиции МГЭ на ранних этапах гории постоянных линий соматических клеток (подобно тощ, ж это описано в работе Potter et at., 1979), или о теш аотипическими перестройками, которыэ сопровождают возникаете клеток со способностью к неограниченному размноке-в, дающих начало постоянным клеточным линиям.

Как известно, МГЭ, встраиваясь в хромосомы, способна Аудировать генотишсческую нестабильность в участке инте-ации, которая может приводить к тому, что такие хромосомы •дут с высокой частотой вовлекаться в кариотипическую из-¡нчивость. Генотипическая нестабильность характерна и для ¡астков генома,содержащих амплифшэдгаванные последователь-)сти ДНК, и хромосомы с такими участками также претерпева-г кариотипические изменения с высокой частотой.

Эта гипотеза позволяет объяснить особенности кариотипи-зской изменчивости соматических клеток в культуре: неста-ильность и неслучайность хромосомных перестроек, а также айт-специфичность и высокую частоту геномных изменений,не-бходимые для понимания ряда свойств генетически нестабиль-ых вариантов клеток. Молено предполагать, что генетическая естабилъность соматических клеток по многим признакам, в ■ом числе и рассмотренная выше нестабильность клеток по АГ-)езистентности я чувствительности к УФ облучению, связана с

такими генетически нестабильными изменениями хромосом, индуцированными встраиванием МГЗ.

Нарушения в структуре участков генома можно индуцировать посредством генетической трансформации соматических клеток за счет встраивания в геном чужеродных генов. Если изложенная выше гипотеза о причинах генетической нестабильности признаков, контролируемых собственными клеточными генами, верна, генетически трансформированные клетки должны быть нестабильны по признакам .детермшшрованным чужеродными генами. Действительно, к началу нашей работы было известно, что соматические клетки, как правило, нестабильны по транс-формантному фенотипу, и утрачивают признаки, контролируемые чужеродными генами, при культивировании клеток на неселективной среде, хотя причины этого виделись скорее в неупорядоченной сегрегации автономно реплицирующихся структур (пе-келасом), содержащих чужеродные гены (см. обзор: Ниипег, йи<Ше, 1982), чем в генотипической нестабильности встроенной в геном чужеродной ДНК. Исходя из гипотезы, можно было предполагать также, что характер нестабильности трансфор-мантного фенотипа может зависеть от того, в какой участок генома встраивается чужеродная ДНК, и от структуры встраиваемой в геном чужеродной ДНК. Данные.полученные при исследовании особенностей нестабильности соматических клеток по трансформантному фенотипу, подтверждают эти предсказания.

2. Нестабильность клеток по признакам, контролируемым чужеродными генами

2,1. Факторы, влияющие на эффективность генетической трансформации соматических клеток

Генетическая трансформация соматических клеток - многоступенчатый процесс, включающий этапы проникновения чужеродной ДНК в клетку, транспорт ее в ядро клетки.встраивание в геном или автономную репликацию ДНК и экспрессию введенных генов. Очевидно, что соматические клетки разных линий могут отличаться по тем или иным особенностям протекания перечисленных процессов, что, в свою очередь, может стзаться на эффективности генетической трансформации клстск.

Так, хотя показано для клеток многих линий, что оптимальная для трансформации концентрация ДНК составляет 10-20 шаг/мл, мы обнаружили, что при увеличении концентрация эукариотной ДНК-носителя.и фиксированной концентрации ДНК пла-змвды с ТК геном ВИГ1 частота трансформации клеток китайского хомячка линии А238 линейно возрастает вплоть до кон-дентрации ДНК 100 мкг/мл. Обычно, как показано и наш, частота трансформации югеток линейно возрастает при увеличении «энцентрации содержащей селективный ген шазывдноЗ ДНК, вы-:одя, однако, при высоких концентрациях последней на плато. Уклонения от линейности в зависимости частоты трансформации от количества ДНК с селективным геном означают, что эффективность трансформации клеток может изменяться при вари-щиях состава смеси зрансформирущих ДНК, в частности, как юказано нами, в зависимости от присутствия или отсутствия укариотной ДНК-носителя (табл.7). Можно вздеть, что подоб-о тоцу, как это описано и другими авторами, эффективность рансформавди клеток мыш линии uatk" Ж reno:i ВПГ1 повыша-тся в присутствии эукариотной ДНК-носителя, но только если плазмвдной ДНК с ТК геном ВПГ1 отсутствует фрагмент сател-итной ДНК III человека (СЧЗ). В то же время, эффективность рансформадии клеток китайского хомячка линии ШХ1Т геном ГФР повышается в присутствии эукаряотпой ДНК-носителя хсак том случае, когда плазмида.с геном ДРФР содержит СЧЗ, так в том случае, когда в такой плазмзде СЧЗ отсутствует, йа-эотив, эффективность трансформации клеток зеленой мартышки ищи Vero геном ксантин-гуанинфосфо^ибозилтрансферазы дГФРТ) падает на порядок в присутствии эукариотной ДНК-но-гтеля. Представленные в табл.7 данные показывают,что и ча-?ота генетической трансформалди клеток может, вопреки ожи-шиям*5, повышаться в присутствии эукариотной ДНК-носителя.

к Поскольку общая концентрация ДНК в наших эксперименте оставалась постоянной, следовало бы ожидать обратного: лее высокой частоты трансформации клеток в отсутствие шкентеля, так как последняя заменяется на плазмидную ДНК с лективным геном, как это наблюдается,например, при транс-ркации клеток линии А238.

Таблица 7

Влияние эукариотной ДНК-носителя и присутствия в плаз-мвдной ДНК фрагмента сателлитной ДНК III человека (СЧЗ) на частоту и эффективность генетической трансформации соматических клеток

Видовое Селек-происхо- тивный вдение ген клеток, линия

Селек- Наличие Присутст-тивная в плаз- вие в сме-среда «да сидаи-

носителя

Частота трансформации,- на 10 клеток

Эффективность тра сформации на 10ь кл ток на 1м ДНК

Китайский хомячок, А23В ТК ВПГ1 ГАТ 1 + 1 + + + X X 22.0 59.0 7.8 8.9 2.5 17.7 5.0 7.1

Китайский хомячок, ШХ11 ДГФР Среда без нуклеоти-дов + + + + XX XX 458.2 2986.0 1666.7 333.1 12.6 11.2 100.0 55.0

Мышь, ТК ВПГ1 ГАТ + + + + X X 67.0 11.7 33.6 99.3 4.1 4.4 23.0 3.6

Человек, Не1д КГФРТ МКГАТ - + X 986.2 103.1 '19.7 14.4

Зеленая мартыш- КГФРТ 1ЛКГАТ - + X 124.0 1.3 6.6 0.6

ка.Уего

Примечание:5 соотношение ДНК плазмид с селектившм геном'и ДНК-носителя 1:10; 334 соотношение ДНК плазмиды с хреном ДГФР и ДНК-носителя 1:5:общая концентрация ДНК при трансформации 20 мкг/шг. Среда ГАТ содержит гипоксантин, аг.ино-птерин и тимидин; среда ШТАТ содержит, кроме того, шкофе-нольную кислоту и ксантин.

Такое повышение зависит как от происхождения клеток-реципиентов, так и от присутствия СЧЗ в плазмидных ДНК с селективными генами.

ДНК СЧЗ не является уникальной нуклеотадной последовательностью , присутствие которой сказывается на характере зависимости частоты к эффективности генетической трансформации клеток от присутствия эукариотной ДНК-коситслк: так.пр;: трансформации клеток клока А238 плазмидныг.в: Д^сорсгзашнк ТК геи ВДГ2 под контролем промоторов днища кошишш;

оров (ДКП) ретровирусов, мы обнаружили, что эффективность рансформации при удалении ДНК-носителя может как уменьшать-я, так и увеличиваться в зависимости от структуры плазмид.

Кэ представленных данных можно сделать вывод о том,что лияние эукариотной ДНК-носителя на частоту и эффективность енетической трансформации зависит как от происховдения ли- . ий меток-реципиентов, так и от структуры содержащих селек-ивный ген плазмид. Следовательно, роль эукариотной ДНК-но-ателя не ограничивается только функцией поддержания опти-альной для образования преципитата с фосфатом кальция кон-ентрации ДНК,или функцией "насыщения" эвдосомно-лизосомных омпартментов клеток, вовлеченных в процесс переноса ДНК в цро клеток.

Известно, что соматические клетки в культуре эффектив-о соединяют гомологичные и негомологичные ДНК, что приводит образованию пекеласом, содержащих находившиеся в смеси в эмент трансформации клеток ДНК. Возможно, что эукариотная НК-носитель "поставляет" в процессе образовали пекеласом П, модифицирующие частоту и эффективность трансформации, ричем характер взаимодействия и рекомбинации эукариотной ЯК-носителя (или заменяющей ее ДНК иного происхождения) и Ж плазмид, содержащих селективный ген, зависит от струк-¡фы плазмидных ДНК. Очевидно, что взаимодействие ДНК-носи-эля и плазмидных ДНК с селективным геном контролируется ге-зтически, что и обусловливает вариации в характере зависи-эсти частоты и эффективности генетической трансформации теток разных линий от изменений состава смеси трансформи-,тащх ДНК.

С другой стороны, возможно,что изменения состава смеси пи структуры трансформирующих ДНК, приводящие к изменениям ютоты и эффективности генетической трансформации,обусловит! модификация!,ш взаимодействия (в процессе рекомбинации) 5 только чужеродных молекул ДНК лруг с другом, но и чуже-эдных молекул ДНК с геномом клеток-реципиентов (непосред-гвенно, или после образования пекеласом).

Многочисленные попытки выделения НП ДНК, усиливающих экспрессию селективных генов (усилителей), при котрансформа-дни клеток с эукариотной ДНК, не привели пока к успеху, хотя таким методом ("ловушки усилителей") выделены и идентифицированы вирусные усилители и усилители клонированных генов. Это косвенным образом свидетельствует в пользу того, что отмеченные вариации в эффективности и частоте генетической трансформации клеток при изменениях в составе и структуре трансформирующих ДНК(не затрагивающих непосредственно структуры селективного гена) действительно скорей связаны с модификациями процесса рекомбинации чужеродных ДНК и встраивания пекеласогл в геном клеток-реципиентов, чем с изменениями в структуре пекеласом, влияющими на экспрессию селективных генов.

2.2. Состояние НЦ чужеродных ДНК в траноЬормантных клонах клеток китайского хомячка линии А238

В клетках мыши линии iiitk" и китайского хомячка линии А238,трансформированных ТК геном ВШЧ»активность ТК составляет от 5 до 100$ от активности ТК в постоянных линиях клеток шит и китайского хомячка дикого типа. Доказательства того, что в клонах меток мыши линии latk" и китайского хомячка линии А238, отобранных на среде ГАТ после обработки клеток кальций-фосфатным преципитатом ДНК с ТК геном ВНГ1, экспрессируется ТК ВПГ1, были- получены посредством ИЗФ ТК в ПААГ, и с помощью предложенного нами метода, позволяющего различать клетки, обнаруживающие собственную ТК или ТК ВПГ1, по эффективности клонирования клеток на среде ГАТ, содержащей 100 мкг/мл (0.4 тюль/л) тимидина. Были получены такие данные.подтверждающие трансформантную природу отобранных на соответствующих селективных средах клонов клеток китайского хомячка линии ШХ11, трансформированных геном ДГФР, и станов клеток зеленой мартышка линии Vero и человека лиши HeLa, в которые был введен ген КГФРТ. Эти клоны,однако,практически не использовались при исследовании природы нестабильности трансформантного фенотипа клеток,и указанные данные, а также результаты изучения состояния чужеродных ДНК в

летках таких клонов далее не приводятся.

Анализ фракций высокомолекулярной и низкомолекулярШл. НК, выделенных из трансформантных клонов клеток китайского омячка линии А238 по методу Хирта (Hirt, 1967), с помощью очечной гибридизации ДНК (Kafatos et al., Т979) и гибриди-ации ДНК после электрофореза рестрикциоиных фрагментов ДНК агарозном геле и переноса их на нитроцеллюлознне фильтры Southern, 1975). показал, что НЕ шшмидных ДНК локализова-ы, главшм образом, во фракциях высокомолекулярной ДНК.При том выявляются как перестроенные фрагменты ДНК,так и непе-зстроенные фрагменты ДНК, характерные для обработанных со-гветствуюдиш рестриктазами кольцевых плазмвдных ДНК. Было эказано, что НЕ ДНК 0В40 находившиеся в смеси с плазмидны-1 ДНК, содержащими ТК ген ЕЛИ, в момент трансформации iure-эк линии А238, также локализуются во фракциях высокомолеку-зрной ДНК клеток трансформантных клонов.

Денситометрия радиоавтографов позволила, шдочлтать .что исследованных трансформантных клойах клеток линии А238 со-зржится около 20-50 копий на геном рестряпциопннх фрагмен-эв ДНК, гибридизующихся с плазшдной ДНК. Наличие много!фат-d повторенных рестрикпронных фрагментов ДНК,совпадающих по 1змеру с фрагментами кольцевых плазмздных молекул,указыва-г на тандемную повторяемость полноразмерных копий плазкид-£Х ДНК. С другой стороны, рестрнкциотшэ фрагменты, гибри-1зующиеся с меченой плазмидной ДНК и отличающиеся по разке-г от фрагментов, выявляет,та при обработке соответствующей гстриктазой кольцевой плазмидной ДНК, таюш присутствуют в хлъшом числе копий,сопоставимом с числом копий непзрестро-пшх фрагментов ДНК. По-вндимоьу, перестроенные фрагменты Ж являются участками соединения плазмидных молекул ДНК с I ДНК-носителя или геномной ДНК клеток-реципиентов. Их по-?оряемость в геноме может быть следствием амплификации обивавшейся вначале пегюласомы небольшого размера, в сос-ше которой присутствовали несколько (2-3) тандемно-повто-!нных копий плазмид, соединенных с фрагментами ДНК-носите-[ или геномной ДНК.

Обнаружение плазмидных НП ДНК во фракциях высокомолекулярной ДНК не позволяет решить вопрос о том,встроена ли чужеродная ДНК в геном клеток-реципиентов, или же находится в составе пекеласом большого (100 тпн и более) размера,реплицирующихся автономно. Для выяснения локализации пекеласом с ТК геном ВПГ1 в клетках чэансформантных клонов.ведущих свое происхсвдение от клеток китайского хомячка линии А238, из клеток были выделены метафазные хромосомы и получены фракции лизата метафазных клеток, которые должны были бы содержать автономно реплицирующиеся пекеласомы, сопоставимые по размеру с двойными микрохромосомаш, и автономно реплицирующиеся плазмиды. При помощи точечной гибридизации с фрагментом плазмвдной ДНК, содержащим ТК ген ВПГ1, установлено,что копии ТК гена ВПГ1 локализованы в основном в ДНК,полученной из штафазных хромосом. Частота и эффективность трансформации клеток китайского хомячка линии А238 с ДНК из изолированных метафазных хромосом даже несколько выше (в 1.5-2 раза) , чем с тотальными высокомолекулярными ДНК из клеток тех же трансформантных клонов.

Представленные результаты показывают,что функционально активные копии ТК гена ВПГ1 локализованы, главным образом, в хромосомах клеток трансформантных клонов (т.е. встроены в геном клеток-реципиентов) и организованы в тацдемно повторяющиеся структуры.

При анализе с помощью гибридизации по Саузерну в 3 из 25 трансфорглантных клонов клеток китайского хомячка линии А238 плазмадше НП были обнаружены также и во фракциях низкомолекулярной ДНК. В низкомолекулярной ДНК одного из клонов - 2TI5 - выявляются все характерные для введенной в клетки плазмвдной ДНК рестрикциошше фрагменты: по-видимому, в клетках этого клона присутствуют экстрахромосомные полноразмерные неперестроенные копии плазмвдной ДНК. При трансформации клеток E.coli с помощью низкомолекулярной ДНК из клеток клона 2T30I были получены ампициллин-резистентные клоны,содержащие плазмиды длиной 4.8 тпн, соответствующие по размеру наиболее часто выявляемым при электронной микроскопии ирепа-

атов такой ДНК кольцевым молекулам ДНК, отсутствующим во ракции низкомолекулярной ДНК из клеток клона А238.Рестрик-донный анализ одной из "спасенных" плазмвд - рНТ301 - пока-ал, что в ней делетированы НИ векторной плазмвды рВН325, аходящиеся "вниз по течению" от точки начала репликации ЛК (включая, так называемую, "отравляющую" последователь-:ость) и ТК ген ВПИ. Показано татае (Тогашга, Дубе, 1987), ;то в районе СЧЗ в плазмиде рЮ!301 произошли множественные ■очковые мутации. В высокомолекулярной ДНК клеток клона 1Т301, из которого была "спасена" плазшда рКГ301, так же, ак и в высокомолекулярной ДНК клонов, в клетках которых присутствуют иные экстрахромосомные ДНК, выявляются диагно-¡тические рестришщонные фрагмзнты ДНК, характерные для эк-!трахро»лосомных плазмидных ДНК. Обработка клеток некоторых грансфориантных клонов ТФА и ыитомицином С щ)иводит к накопили» во фракции низкомолекулярной ДНК шгазиидных ДНК, но гзменяя при этом организации встроенной в генсн чужеродной ЩК. Эти данные указывают на то, что внегепсгшз кошт плаз-яздных ДШС образуются, скорее всего, в результате исипочепт 13 генома в процессе репликации чужеродной ДНК по типу "лу-кзвичной кожуры". Одной из причин гепотипичвской нестабзлъ-гости чужеродной ДНК (см. ниже) мозет быть, такем образом, «однократная инициация в течение одного клеточного цикла репликации в районе чужеродной ДНК.

2.3. Притом утраты и восстановления транссГютавдтного сВвкоппгд клеток

Для понимания природы нестабильности трансформантного фенотипа меток необходимо, очевидно .выяснить причины и механизмы, обусловливающие утрату й восстановление признаков, детерминируемых чуаеродныда генами, и установить фаютори,непосредственно ответственные за нестабильность, т.е. контролирующие частоту изменений,приводящих к утрате и восстановлению трансформантного фенотипа.Для выяснения характера изменений, приводящих к потере трансформантного фенотипа,из 6 клонов клеток китайского хомячка, трансформировании* ТК геном ВПГ1, на среде, содержащей БДУ, были выделены и охарактеризованы ПГ-субклоны-ревертантн (рис.5). В тести БДУ-

Клон А238 ^-

Трансформация геном ТК ВПГ1

Селэкция на среде ГАТ

Рис. 5. Происхождение исследованных трансформантных клонов и суйклонов.

бклонах не наблюдалось спонтанных реверсий к ТК*"-феяотипу о условиям эксперимента могли бы быть выявлены реверсии о стотой, большей 4 - 6х10~5), в остальных 19 БДУ-субклонах стота реверсий к Тй^-фенотипу составляла от 1x10""^ до Ю~2. Поскольку частота устойчивых к среде ГАТ клеток (ТК^-:еток) определялась сразу после культивирования на среде, держащей ЦЦУ, она является, по сути, частотой возншшове-и клеток с ТК^-фенотипом. С помощью ИЭФ ТК в ПААГ и опре-!ления эффективности клонирования клеток на среде ГАТ, со-фжащей 100 мкг/вд тимадина, было показано,что вырастающие ш этом на среде ГАТ клетки обнаруживают ТК со свойствами, факторными для ТК ВПГ1, т.е. являются реревертантами, эк-трессируицими ТК ген БИГ1.Активность ТК в клетках ДДУ-суб-юнов не превышает таковой в ТК"-клетках-реципиентах линии 238, что подтверждает связь возникновения ЕДУ^-ч^енотипа с гратой экспрессии ТК гена ВПГ1.

Для решения вопроса о том, связана лн потеря ТК^-феяо-гаа с изменениями в ДНК пекеласом, содержащих ТК ген БПГ1, т же она определяется другими причинами, Т1Г-клетки линии 238 были трансформированы при помощи препаратов ДНК аз кла-ок рада БДУ-субклонов. Средние значения частота (3.0 колонн ТК^-клеток на Ю6 клеток) и эффективности (4.1 колонии К*"—клеток на Ю6 клеток на 10 мкг ДНК) трансформации для репаратов ДНК их 3 родительских клонов и из рада ГАТ-суб-лонов (3.4 колонии ТК^-югеток на ТО6 клеток и 4.0 колонии К^-клеток на 106 клеток на 10 мкг ДНК) хорошо совпадают, отя для некоторых препаратов ДНК различия в указанных ха-актеристиках выражены настолько резко, что могут быть не лучайными (предельные значения частоты трансформации: 1.61.0 колоний ТК*'-клеток на Ю6 клеток, и эффективности тран-¡формации: 2.1 - 5.9 колоний ТК^-клеток на 10® клеток на 10 пег ДНК). Различия в трансформирующей активности ДНК из ТК^ теток разных клонов, содержащих ТК ген ВПГ1, отмечались и (ругими исследователями. В отличие от препаратов ДНК из ГАТ-;убклонов более половины (7) препаратов ДНК из одиннадцати ЗДУ-субклонов (в том числе и из 4 БДУ-субклонов с высокой

частотой спонтанных реверсий к ТК*-фенотипу) не обнаружив вт трансформирующей активности. Условия экспериментов (в стности, сравнительно небольшое превышение частоты трансф нации над частотой реверсий к ТК*-фенотипу в клетках лик А238, обработанных гомологичной ДНК) не позволяют различи' ситуации, когда трансформирующая активность ДНК отсутству( или снижена в 10 и более раз.Вследствие этого из получена результатов можно только заключить,что более чем в половш БДУ-субклонов ТКГ-фенотип определяется изменениями, сущест венно снижающими трансформирующую активность ДНК, т.е. изн нениями в структуре или числе копий ТК гена ВПГ1. Посколы некоторые БДУ-субкдоны, ДНК из клеток которых не обнаружь вает трансформирующей активнооти, характеризуются высоко частотой спонтанных реверсий к ТК^-фенотипу.можно заключит что изменения в структуре трансформирующей ДНК, приводящи к ТК~-фенотипу а клетках БДУ-субкяонов, могут быть как ста билышми, тш: в нестабильными.

Сопоставление данных о частоте спонтанных реверсий : ТК^-фенотипу с 1рансфоргарупщей активностью ДНК для клонов в которых на выявляется снижение трансформирующей активности ДНК по сравнению с родительскими клонами и ГАТ-субклона-ми, показывает, что препараты ДНК из клеток БДУ-субклонов с меньшей частотой реверсий обнаруживают и меньшую (в 1.3-1.' раза) трансформирующую активность ДНК, чем препараты ДНК иг клеток БДУ-субклонов с более высокой частотой спонтанных ре версий к ТК*'-фенотипу. Частота реверсий в БДУ-субклонах ,ДШ из клеток которых обнаруживает сниженную трансформирующую активность, также меньше (в 1.6 раза), чем частота реверсий к ТК*"~фенотипу в БДУ-субклонах, ДНК из клеток которых не об наруживает уменьшения трансформирующей активности. Следовательно, частота спонтанных реверсий к ТК*"-фенотипу коррелирует с трансформирующей активностью ДНК, что свидетельствует о связи ТК~-фенотипа во всех БДУ-субклонах, характеризующихся высокой частотой реверсий, с изменениями в структуре ДНК, а не с чисто эпигенотипическимп нзменешдам.

Таким образом,в клетках изученных БДУ-субклонов ТК~-4>е-нотип сопряжен более чем в половине случаев (7 из II) с из-

менениямн, существенно понижающими (или инактивирующима) трансформирующую активность ТК гена ВПГ1. Стабильные изменения .инактивирующие трансформирующую активность ДНК и приводящие к неревертирующему ТК"-фенотину, могут быть связаны с утратой ТК:гена ВПГ1. Однако, большая часть БДУ-субклонов характеризуются высокой частотой восстановления трансфор-мантного фенотипа.Очевидно, что потеря трансформантного фе— нотипа в клонах-ревертантах такого типа связана не о утратой, а с инактивацией ТК гена ВПГ1, причем, как следует аз представленных данных, такая инактивация является результатом обратимых изменений в ДНК,происходящих в клетках транс-формантных клонов с высокой частотой.

Известны три типа изменений в ДНК .удовлетворяющих требованию обратимости: метилирование ДНК, амплификация генов и высокоспецифичные перестройки ДНК, подобные происходящим при изменении типа спаривания у дрожжей,

ТК ген ВПГ1 относится к группе генов» экспрессия которых подавляется при метилировании ДНК и активируется при де-метшщровании ДНК под действием 5-азацитидина (азаЦ). Для выяснения вопроса о роли метилирования НЕ ДНК ТК гена ШГ1 в возникновении и поддержании ПС-фенотипа била сопоставлены результаты обработки клеток 6 трансформациях клонов и полученных из них 15 БДУ-субклонов ингибитором метилирования ДНК - азаЦ. Очевидно, если в изученных клонах процесс метилирования ТК гена служит основной причиной потери клетками трансформантного фенотипа, то постоянное присутствие в среде азаЦ должно стабилизировать ТК^-фенотип клеток. И напротив, если метилирование ТК гена ВПГ1 в основном только фиксирует ТК~-фенотип,то присутствие в среде азаЦ не окажет заметного влияния на скорость потери клетками ТК^-фенотипа, хотя может существенно повысить частоту реверсий к ТК*"-фе-нотипу в популяциях ТК"-клеток БДУ-субклонов.

В шести БДУ-субклонах азаЦ повышает частоту реверсий к ТК*-фенотипу в 2-15 раз, а в двух БДУ-оубклонах реверсии к ТК^-фенотипу происходят только под действием азаГр.В двух

к АзаЦ, начиная с концентрации 0.5 мкг/мл, оказывает заметное цитотоксичное действие, понижая выишапмость кле-

ВДУ-субклонах ни спонтанных,ни индуцированных азаЦ ревер к ТК^-фенотипу выявлено не было. Таким образом, ТК~-фено в 8 из 15 изученных БДУ-субклонов связан, по-видимому,с ] тилкрованием ТК гена ВПГ1. Процесс метилирования, вероят] в разной степени мокет затрагивать ТК ген ВПГ1, опреде. наблвдаемое разнообразие в степени индукции азаЦ реверси! ТК^-фенотипу.Действительно, имеются субклоны с высокой ч; тотой спонтанных реверсий (3.4хЮ~2 - Э.ЗхЮ""2) ,не повыш; щейся под действием азаЦ, в которых, очевидно,ТхГ-фенотиг не связан с каким-либо метилированием ТК гена БПГ1, субкд. ны с меньшей, чем у первых частотой спонтанных реверс (1.9x10"® - 3.3x10 ), которая повышается в 2-15 раз пос обработки клеток азаЦ, и субклоны, в которых ТК*"~фенотип дуцируется только в присутствии азаЦ, что указывает на да ко зашедший процесс метилирования ТК гена ВПГ1 как на при ну отсутствия спонтанных реверсий к ТК^-фенотипу.

Клетки родительских трансформация« клонов также отлз чаются по реакции на азаЦ. фльтивирование клеток на сред* содержащей I мкг/мл азаЦ, практически стабилизирует ТК^—ф< нотип клеток клонов 2Т213 и 2Т301.уменьшает скорость поте! трансформантного фенотипа в клонах 2Г7Т и 2Т18Т,но не ска: вается на стабильности ТК^-фенотипа в популяциях клеток к.1 нов 9СТ11 и 9СТ12 (рис. 6). Отметим, что даже в "стабилизир ванных" по трансформантному фенотипу клонах 2Т213 и 2Т301 стота возникновения клеток с ТК"-фенотипом составляет 10" ПГ®, что существенно выше частоты мутаций в собственных г нах соматических клеток. Следовательно, в общем случае, не стабильность ТК^-фенотипа клеток трансформантных клонов н связана с процессом метилирования ДНК.хотя метилирование Т. гена ВПГ1 может препятствовать, частично или полностью, реверсии к ТК^-фенотипу в популяциях клеток БДУ-субклонов.Иш ш словами метилирование ДНК может быть фактором,стабилизирующим ТК"-фенотип клеток БДУ-субклонов.

ток линии А238 и полученных из них клонов и субклонов; кроме того, обработка клеток линии А238 азаЦ в концентрации ] мкг/мл и особенного мкг/мл повышает частоту реверсии к ТК' фенотипу до ЬсЮ"-". Эти данные были учтены при расчете частоты реверсий к ТКТ-фенотипу в популяциях клеток БДУ-субклонов.

100 60 60 40 20

0

о 1

оЗ

» О--О

х °

\ _ _ "

. 1. < 1

о5 «б

20 10 60 0 20 40 60 0 20 40 60

Рис. 6. Стабильность ТК^-фенотипа в популяциях клеток трансфорлЕШТных клонов,культивируемых на среде с азац.

По оси абсцисс - продолжительность культивирования клеток, сут; по оси ординат - количество клеток, способных расти на среде ГАТ, * от контроля. Клоны I - 2Т213, 2 - 2Т301, 3 - 2Т7Т, 4 - 2Т18Т, 5 - 9СТП, 6 - 9СТ12.Штриховые кривые -соответствующие данные для трансформантных клонов, культивируемых в отсутствие аза!;.

По-видимому.различия в свойствах изученных БДУ-субкло-нов (выделенных из популяций клеток трансформантных клонов, культивировавшихся в течение длительного, около 20 сут.времени на неселектквной среде) отразсапт не только и не столько возможность комбинирования факторов.детерминирующих ТК~~ фенотип, сколько временную последовательность изменений, сопряженных с ПС-фенотипом кдеток. Сопоставление эффективности трансформации ТК"-клеток линии А238 препарата!,® ДНК из клеток БДУ-субклонов с частотой спонтанных и индуцируемых азаЦ реверсий к ТК*-—>фенотипу позволяет разделить изученные субклоны на 6 типов (табл.8). Для клеток 1-го типа характерны высокая частота спонтанных реверсий к ¡ГК^-фенотипу,высокая трансформирующая активность ДКК и отсутствие метилирования ТК гена БПГ1. Можно предполагать, что возникновение 'ПГ-фенотипа в таких клетках обусловлено изменениями типа фено-типического переключения, связанными тем не менее - гозмож-

но.посредством эффекта положения - с перестройками структуры пекеласом, содержащих ТК ген ВПГ1 (происходящими в клетках всех БДУ-субклонов, см. ниже). Не исключено,что высокая трансформирующая активность ДНК из ТК"-клеток 1-го типа свя-ваца с обратимостью таких изменений в процессе трансформации.

Более существенные перестройки структуры пекеласом(на-прлмер, потеря большинства копий ТК гена БПГ1) приводят к возникновению ТК"-клеток 2-го типа - с пониженной трансформирующей активностью ДНК и с уменьшенной частотой реверсий к ТК*~фенотшу, не индуцируемых азаЦ.Дальнейшие перестройки структуры пекеласом могут привести к полной потере способных функционировать копий ТК гена ВПГ1 и к возникновению Т1С-клеток 6-го типа.Частичное метилирование копий ТК гена ВПГ1 на фоне изменений, характерных для клеток 1-го типа, приводит к возникновению ТК"-клеток 3-го типа с несколько уменьшенной частотой спонтанных реверсий к Т^-фенотицу .повышающейся при обработке клеток азаЦ. Относительно высокая трансформирующая активность ДНК из клеток такого типа может быть связана как с процессом деметилирования ДНК, происходящим при трансформации,так и с возможным стабилизирующим структуру пекеласом эффектом метилирования ДНК.Дальнейшее метилирование копий ТК гена ВПГ1 может снижать трансформирующую активность ДНК, приводя к возникновению ТК"-клеток 4-го типа, и, наконец, запрещать спонтанные реверсии к ТК^-фенотипу, давая начало ТК"-клеткам 5-го типа.

Таким образом, процесс метилирования ДНК,не будучи причиной (по 1файней мере, основной) возникновения клеток,утративших грансформантный фенотип, протекает, по-видимому,в несколько этапов, и является одним из факторов.обусловливающих •различия в свойствах БДУ-субклонов трансформантных клонов.

. Для выяснения природы обратимых нестабильных изменений в ДНК,сопряженных с ТК~~фенотипом клеток БДУ-субклонов трансформантных клонов (которые, как следует из представленных выше данных, не связаны в отличие от стабильных изменений с утратой или метилированием ТК гена ВДГ1), было исследовано как изменяется число копий ТК гена ВПГ1 и НП, векторной пла-

Таблица 8

Сопоставление свойств изученных ВДУ-субклонов .

ЕДУ- Частота спон- Индуцируе- Относжгель- Твп нзмэяе-субклон тайных ревер- мость ре- ная транс- пай, сопря-сий к Тк+-фе- версий к формирующая кенних ИГ-нотипу ТК*"-феноти- активность фенотипом

ду пря об-„ДНК из кле-работке ша1г ток субклона*^

2БДУ23 6БДУЗЗ 5.1x10" о 7.6x10 - 1.83 1.85 1-й

6БДУ15 4БДУА4 1.6x10 4 - 0 0.32 2-й

5БДУ23 2БДУ43 1.9хКГ2 5.6x10 5.8 4.2 1.23 1.51 •3-й ,

ЗБДУ12 ЗБДУ42 1.7x10"? 2.2x10 14.8 7.3 0 0 4-й

ЗБДУ25 5x10""® 1000 0 5-й

1БДУ41 4x10"® - 0 &-Й

ЗБДУЭ4 6хЮ~6 - 0 1

Примечание. а - отношение частоты ГАТ-клеток. в субялона после его обработки азаД к таковой без обработка;*31 - за единицу трансформирующей активности принята средняя .эффективность трансформация для препаратов ДНК из Тгс-клэток-транс-формантов.

зшды рВН325 (в составе которой ТК ген вводился в клетки) в клетках субклонов, выделенных как на неселективной среде (ГТ-субклоны), так и на среде с БДУ (БДУ-субклонн).

При анализе препаратов высокомолекулярной ДНК из кло- ■ ток 28 ГТ-субклонов (полученных из б трансфоркантных клонов) с помощью точечной гибридизации с 32Р-ДНК фрагмента ТК гена ВПГ1 выяснилось, что некоторые ГТ-субклопы в значительной мере, если не полностью, утратили ТК ген ВПГ1, тогда как в других субклонах наблюдается повышенное по сравнению с родительскими трансформантными клонами количество копий ТК гена ВПГ1. Таким образом, при культивировании трансформантных клонов в неселективных по отношена» к исследуемому признаку условиях, в большинстве клеток наблюдаются перестройки структуры трансформирующей ДНК, проявляющиеся в уменьшении ели

увеличении числа копий ТК гена ВПГ1. Это свидетельствует о высокой частоте перестроек ДНК,затрагивающих район встроенной в геном чужеродной ДНК,т.е. о генотипической нестабильности этого района генома клеток трансформантных клонов.

С помощью точечной гибридизации ДНК было показано,что, как можно было и ожидать.число копт! ТК гена ВПГ1 в клетках БДУ-субклонов меньше, чем в клетках родительских трансформантных клонов (табл. 9). Отметим, что в ЕДУ-субклонах из более нестабильных по Т^-фенотипу клонов 2Т7Т, 2Т18Т,9СТП и 9СТ12 (см.раздел 2.4)количество копий ТК гена ВПГ1 снижено в большей степени, чем в БДУ-субклонах. из клонов 2Т213 и

Таблица 9

Содержание ТК гена ВПГ1 в клетках БДУ-субклонов трансформантных клонов

Родительский Число изучен- Содержание ТК гена ВПГ1

трансформант- них ВДУ-суб- ---

шй клон клонов . Усл. опт. ед. % от его содержа-

ния в клетках родительского клона

2Т213 5 9.8 4.3(2.8-6.2) 43.4(28.5-63,2)

2Т301 3 15.2 7.1(3.5-11.4) 46.5(22.7-74.8)

217Т 4 74 9 4.6(119-7.9) 6.1(2.5-10.5)

2Т18Т 5 14 9 3.6(1.*3-5.8) 24.2(8.8-38.6)

. 9СТ11 4 37 2 1.9 (<0.5-3.8) 5.1 (<1.3-10. Ь)

9СТ12 5 43.0 12.1(0.9-24.8) 28.2(2.1-57.6)

Примечание. После фотометрии радиоавтограмм относительные количества НП ДНК, гибридизующихся с меченой ДНК ТК гена ВПГ1 (или с ДНК плазмиды рВЮ2$, см. табл. 10) рассчитывали по отношениям площадей соответствующих пиков денситограш с вычтенной величиной фоновой гибридизации с препаратами ДНК из клеток китайского хомячка, не содержащих НП влазмидных ДНК. Для ДЦУ-субклонов указаны средние значения и в скобках предельные значения содержания ТК гена ВПГ1 (или НП плазмиды рВй325 - табл. 10) для выборки субклонов.

2Т301, более стабильных по ТЕ^-фенотипу. Как показывает сопоставление содержания ТК гена ЗПП и НП ДНК плазмида рВВ325 (с которыми ковалентно соединен ТК ген ВПГ1 во введенной в клетки плазшде р5Т826), изменение числа копий ТК гена осуществляется,главным образом, за счет перестроек трансформирующей ДНК, а не в результате амплификации и сброса копий плазмидной ДНК (например, по механизму "луковичной кожуры"). В большинстве БДУ-субклонов уменьшено числа копий ТК гена ВПГ1 сопровождается существенным изменением в соотношении числа копий этого гена я числа копий НП ДНК плазмвди рВй325 как это можно видеть из сопоставления данных табл. 9.и табл. 10. В ряде БДУ-субклонов с уменьшенным количеством копий ТК гена ВПП число плазмидных НП возросло по сравнению с родительскими трансформантными клонами. Увеличение числа копий плазмида рВН325 характерно также для всех БДУ-субклоков из клона 9СТ12. Однако, клетки этого клона, как и клона 9СТ11, содержат наряду с шшзмидой рЗТ82б (с ТК геном ВПГ1)и плаз-гаду рБУ1 (рЕН322::Э740), ДНК которой способна гибридизо-

Таблкда 10

Содержание НП ДНК плазмвды рВН325 в клетках БДУ-субклонов трансформантных клонов

Родительский грансформант-]шй клон Число изучен-1шх БДУ-субклонов Содержание ДНК плазмида

Усл. опт. ед. % от ее содержания в клетках ро~. дительского клена

2Т213 5 17 6 26.3(9.2-34.5) 149.1(52.4-195.8)

2Т301 3 27 4 20.1(1518-25.0) 73.3(57.8-91.2)

217 Т 3 43.1 32.7(19.0-55.6) 86.1(44.0-129.3)

2Т18Т 5 32.0 14.7(11.0-22.8) 46.0(34.4-71.2)

9СТ11 4 27 9 8.4(<0!5-18.0) 30.2(<1.8-64.5)

9СТ12 5 29.6 50.4(43.8-62.2) 170.5(148.2-210.5)

Примечание. См. примечание к табл. 9.

ваться с ДНК плазмиды рВНЭ25, поэтому неизвестно, число Ш какой плазмиды возросло в БДУ-субклонах. В ряде субклонов, напротив, уменьшение НП плазмиды рВКЭ25 хорошо коррелирует с уменьшением числа копий ТК гена ВПГ1, что указывает на возможность координированного удаления НП трансформирующих ДНК. Необходимо отметить, что поскольку НП плазмиды рБТ82б тацдемно повторяются в некоторых клонах 20-50 раз, существенное уменьшение числа копий ТК гена ВПГ1 с одновременным увеличением числа копий векторной плазмиды рвнз25 (несущей ТК ген) не может происходить за счет простых перестроек ДНК. Такие изменения могут осуществляться либо с участием процесса генетической коррекции,либо при одновременном протекании двух процессов - амплификации одной из дефектных копий плазмиды р3182б и делеционного сброса копий плазмиды рзтагб с геном ТК.

Несмотря на то, что полученные результаты доказывают положение о высокой частоте перестроек в районе трансформирующей ДНК (не индуцируемых БДУ, а происходящих спонтанно, как следует из анализа ГТ-субклонов), связь между перестройками, в частности, уменьшением числа копий ТК гена ВИИ и возникновением ТК"-фенотипа клеток, как показывает анализ,-неоднозначна. Если предположить, что перестройки трансформирующей ДНК, проявляющиеся в уменьшении числа копий ТК гена ВПГ1 и изменении соотношений между количеством разных фрагментов плазмиды р31В2б, являются основной причиной утраты клетками ТК^-фенотипа, то восстановление ТК*"-фенотипа (ре-реверсия) в ТТГ-клетках долено сопровождаться обратными изменениями, в частности.увеличением числа копий ТК гена ВПГ1. Для проверка этой гипотезы мы сопоставили с помощью точечной гибридизации ДНК количество копий ТК гена ВПГ1 в последовательном 'ряду клеток: ТК^-родительскае трансформантные клопы —»■ ИГ-БДУ-субклоны —«- ТК^-клоны-реревертанты. Оказалось, что в 7 из 10 клоноз-реревертантов число копий ТК гана ЕПГ1 повысилось по сравнению с родительскими БДУ-суб-клонамя, в которых число копий ТК гена, напротив, уменьшено по сравнению с родительскими трансформантными клонами.

•Следовательно, в клетках изученных трансформантных клонов фенотип (ТК* или ТК") коррелирует с количеством копий ТК гена ШП. Данные, полученные для клонов-реревертантов, указывают на то, что основной причиной возникновения ТК"^фенотипа клеток, давших начало БДУ-субклонам, являются,по-ви-димому, перестройки трансформирующей ДНК,приводящие к уменьшению числа копий ТК гена ВПГ1.

Очевидно, что чем выше частота перестроек в чужеродной ДНК, тем меньшим может быть число копий ТК гена ВПГ1 к моменту анализа БДУ-субклонов.Как упоминалось, клетки БДУ-суб-клонов из более нестабильных.имеющих более высокую скорость потери ТК^-фенотипа трансформантных клоков содержат в среднем меньшее число копий ТК гена ВПГ1, чем клетки БДУ-субклонов из более стабильных трансформантных клонов,т.е. для первых характерна, по-видимому.более высокая частота перестроек в трансформирующей ДНК, чем для вторых. Исхода из этого, можно предполагать, что скорость потери ТК*-фенотипа определяется частотой перестроек в районе чуяеродной ДНК, встроенной в геном клеток-реципиентов.

Однако, в случае изученных трансформантных клонов, содержащих мнсдествешше кошш ТК гена ВПГ1, очевидно, что в ИС-клетках БДУ-субклоноз имеются функционально активные кошш гена ТК, с чем и связана реверсия к ТК^-фэнотипу в популяциях клеток БДУ-субклонов: известно, что и одной кошш ТК гена ВПГ1 достаточно, чтобы придать клеткам ТК^-фенотшх. Поскольку метилирование ДНК в клетках многих • БДУ-субклонов не является причиной подавления экспрессии ТК гена ВПИ,следует допустить,что инактивация гена ТК является результатом каких-то эпигенотипических изменений, причем высокая частота возникновения ТК~-клеток в трансформантных клонах и высокая частота ререверсий к ТК*-фенотипу в БДУ-субклонах свидетельствуют о нестабильности таких эпигенотипических изменений. Так как ТК^-субклоны-реревертанты столь же нестабильны по ТК*-фенотипу, как и родительские трансформаптные клоны, можно полагать, что эпигенотишческая нестабильность клеток трансформантных клонов (как и генотипическая) является наследуемой.

Таким образом, генетическая нестабильность клеток по трансформантновду фенотипу сопряжена как с генотипической нестабильностью (изменениями в чужеродной ДНК, происходящими с высокой частотой), так и с эпигенотипической нестабильностью (переключениями экспрессии чужеродных генов, происходящими с высокой частотой и непосредственно не связанными с изменениями в структуре селективных генов). Вклад эпигенотипических и генотипических изменений в процессы утраты и восстановления ирансформантного фенотипа может, по-вэдимо^, различаться в кавдоы отдельном случае. По крайней мере, в изученных наш трансформантных клонах клеток китайского хомячка, содержащих множественные копии ТК гена ВПГ1, утрата и восстановление трансформантного фенотипа сопряжены, главным обра-801!, с нестабильными изменениями (перестройками) в ДНК,приводящими соответственно к уменьшению и увеличению числа копий ТК гена БПГ1, и, понидаищу, шадуцирувщиш наследуемые изменения в экспрессии- ТК гена ВПГ1.

2Т4. Фактору?, детешаниртждте скорость потери транс-йормантного Фенотипа соматических клеток

Для выяснения причин генетической нестабильности кле- . ток по трансформантному фенотипу необходимо изучить и сравнить клетки клонов, различающихся по зтоцу признаку. В качестве показателей генетической нестабильности признаков, контролируемых чужеродными генами, могут рассматриваться частоты генотипических и эпигенотипическпх изменений, приводящих к утрате и восстановлению трансформантного фенотипа, но прямое определение этих величин затруднено. Поэтому в качестве' меры генетической нестабильности был выбран признак "скорость потери трансформантного фенотипа": хотя он не является непосредственным показателем скорости генотипи-чэсеш: и ошгевотшщческах изменений, различия в генетической нестабильности клеток по трансформантному фенотипу дол-гнн, очевидно, сказываться и на скорости потери трансфор-шптвого фенотипа клеток.

Экспрзссирущие ТК^-фенотип соматические клетки способен расти на среде ГАТ, а не экспрессирувдае - на среде, со-

держащей БДУ. Как упоминалось, все ввделешше наш клоны клеток, содержащих и экспрессиругада ТК ген ВПГ1 (раздел 2.3) нестабильны по трансформантному фенотипу, и по кара культивирования на неселективной (не содержащей аминоптара-на) среде ГТ в популяциях клеток клонов уменьшается частота клеток, способных расти на среде ГАТ, и повышается частота клеток, способных расти на среде, содержащей 50 мкг/ил БДУ. На рис. 7 приведены примеры зависимости частоты ГАТ-резас-тентных (ГАТ11) клеток от времени культивирования на неселективной среде трансформантных клонов клеток китайского хомячка линии А238. Можно ввдеть, что в некоторых клонах при длительном культивировании на среде ГТ наблюдается повшенза частоты ГАТ^-клеток.Это обстоятельство и выявленные особенности изменений соотношения частот ГАТ®- л БДУн-клеток при культивировании клонов на неселективной среде указывают на то, что процесс уменьшения частоты ГАТ^-клеток коает быть

Рис. 7. Стабильность ТК^-фекотипа в клетках клонов, полученных при трансформации клеток китайского хомячка линии А238 с ДНК плазмид рЗТ82б и рТ8119 в присутствии эукамотной ДНК-носителя.

По оси абсцисс - время культивирования клеток на среде ГТ, сут; по оси ординат - количество клеток,способных расти на среде ГАТ, % от контроля.Клоны, полученные при трансформации с помощью ДНК плазмиды рЗТ82б: I - 21213, 2 - 2Т301, 3 - 2Т15, 4 - 21121; плазмиды рТ8119: 5 - 9ТАЗЗ, 6 - 9ТАД11, 7 - 9ТАД22: плазмиды рэтвгб, клетки которых были обработаны ТФА: 8 - 2Т18Т, 9 - 2Т7Т, 10 - 2ТЗТ, II - 2Т11Т.

суммарным результатом нескольких процессов: потери, восстановления и стабилизации ТК*"-фенотипа. Кроме того, доля ГАТ^ клеток может изменяться и вследствие разной скорости размножения клеток с ТК1"- и ПС-фенотипом на среде ГТ (хотя разно-направленность изменений в частоте ГА^-клеток по мере культивирования ряда трансформантных клонов на среде ГТ, свидетельствует против такой возможности, прямых экспериментальных данных для ее исключения нет).

Том не менее, начальные участки кривых зависимости частоты ГА^-клеток от времени культивирования клонов на среде ГТ в большинстве случаев довольно хорошо аппроксимируются прямыми в полулогарифмическом масштабе координат.Это позволяет предполагать, что несмотря на сложность процессов, происходящих в популяциях клеток трансформантных клонов, на первых этапах культивирования на неселективной среде преобладает процесс потери ТК*"-фенотипа, протекающий с кинетикой первого порядка, и, следовательно, угловой коэффициент линейной регрессии логарифма частоты ГАТ^клеток на время ' культивирования клона на среде ГТ может служить основой для сравнения скорости потери ТК*"-фенотипа популяциями клеток в первоначальный период культивирования клонов в неселективных условиях.

В табл.II обобщены данные о влиянии изменений в структуре трансформирующей ДНК на скорость потери ТК^-фенотипа в трансформантных клонах клеток китайского хомячка и мыши.Можно заключить,что при трансформации клеток китайского хомячка линии А238 замена часта ДНК плазмиды рэтагб (с ТК геном БПИ и СЧЗ) на ДНК плазмид, не содержащих ТК ген ВПИ, приводит к повышению скорости потери ТК*"-фенотипа,сопоставимо-. му с повышением скорости потери ТК*"-фекотица в клонах, полученных при трансформации с ДНК плазмиды рзтвгб в присутствии эукариотной ДНК-носителя. В то же время дестабилизирующее Ж^-фенотип действие ДНК-носителя может зависеть от структуры ее НП, как это видно на примере клонов, трансформированных ДНК плазмиды ргтвгб в присутствии ДНК плазшд, несувдх фрагменты повторяющихся НП ДНК генома крысы. Следо-

Таблица II

Зависимость скорости потери ТК^-фенотипа в грансфор-мантных клонах клеток китайского хомячка и мши от структуры ДНК плазмид, содержащих ген ТК БПГ1, и эу-кариотной ДНК-носителя

Наличие в пла- Наличие ДНК-носителя Число Средняя скорость змаде с геном в момент трансформа- изу- потеря ТК^-фено-ТК ШГ1 фраг- ции клеток ченных типа для группы

мента ДНК СЧЗ-клонов клонов, % клеток

человека эукариотной плазмвдной за I сут

Кяоны клеток китайского хомячка линии А238

+ + + + + +

Клоны

+ +

+ +

клеток +

+

+ + + +

мыши

(рЗТ1) (оср1)

(рВН322) линии

7 2.38(1.52-3.07)

3 9.19(6.64-13.31) 7 0.50(0.13-1.23) 7 3.50(1.50-7.69) 6 4.19 (1.46-11.91)

4 4.50(2.06-7.43) 4 3.97(1.56-7.92)

4 14.99(12.50-17.68)

1МЬк~

5 3.07(2.14-3.70) 5 5.10(4.21-5.97) 5 0.87(0.44-1.89) 4 2.45(1.11-3.79)

Примечание. В скобках - предельные значения скорости потеря Пе-фекотипа. * - в качестве ДНК-носителя использовали выборку плазмид рВН322 со вставками ДНК крысы.

вательно, не только изменения в структуре ДНК олазмиды, содержащей ТК ген ВПГ1 (присутствие или отсутствие СЧЗ),и изменения в составе смеси трансформирующих ДНК, но и пока не расшифрованные наг,а изменения в структуре ДНК плазмид, не содержащих ген ТК, могут влиять на скорость потери ТК^-фе-нотипа клеток траксформантных клонов. Как и в случае клеток китайского хомячка линии А238,присутствие в плазмидной ДНК, содержащей ТК ген ВПГ1, фрагмента СЧЗ стабилизирует ТК^-фе-нотип траисформантных клонов клеток мьшш линии Ш-Ьк", а эу-кариотная ДНК-носитель дестабилизирует его. -

Таким образом, характер изменений в стабильности транс-форшнгного фенотипа при изменениях структуры и состава

трансформирующих ДНК одинаков в клетках китайского хомячка и шии. Указанные изменения, как будет показано ниже,наследуются в ряду клеточных поколений. К наследуемой дестабилизации трансформантного фенотипа приводит также обработка клаток китайского хомячка линии А238 (вслед за трансформацией ТК геном ЕПГ1) опухолевым промотором ТФА (табл. 12), при атом обработка, клеток форболом и метиловым эфиром ТФА (цТЭА) - агентами, сходными по структуре с НА,но не являющимися опухолевыми промоторами, - не приводит к изменешхям в скоросш потери ТК^-фенотипа трансформантных клонов.

Все 24 ГТ-субклона .выделенные из 6 трансформантных клонов клаток китайского хомячка,содержащих ТК ген ВПГ1 и культивировавшихся на неселективной среде в течение 30-40 сут, оказались мозаичными по ПС^-фенотипу. Следовательно.большинство (если не все) клеток нестабильных трансформантных клонов нестабильны по. ТК^-фенотипу и после длительного культивирования клонов, т.е'. нестабильность клеток исследованных клонов по трансформантному фенотипу является наследуемой (генетической), что можно было .предполагать и на основе представленных в разделе 2.3 данных.

Таблица 12

Скорость потери ТК*"-фенотипа в трансформантных клонах клеток китайского хомячка, подвергавшихся и не подвергавшихся обработке форболом, мТфА и ТФА

Присутствие эукариотной ДНК-носнтеля' Агент \ Число изученных клонов Средняя скорость потери ЙГгфенотипа, % клеток за I сут

_ 8 0.43(0-1.23)

_ мТФА 4 0.22(0-0.75)

- . ТФА 5 2.83(1.76-4.00)

+ _ 8 3.45(0.93-7.69)

+ форбол 4. 3.50(1.57-6.13)

+ мТОА 4 3.58(0.92-6.10)

+ ТФА 7 16.80(11.28-21.24)

Примечание. Клетки китайского хомячка линии А238 трансформировали с помощью ДНК плазмиды рэтегб в присутствии эу-кариотной ДНК-носителя или без нее. В скобках - предельные значения скорости потери 'ПГ-феноткпа.

Для того, чтобы установить.наследуется или нет признак "скорость потери трансформантного фенотипа",бала проанализирована стабильность ТК^-фенотипа клеток ГАТ-субклонов.выделенных из трансформантных клонов клеток китайского хомячка линии А238. Родительские клоны были получены при трансформации ДНК плазмвды рЗТ82б (содержащей СЧЗ) в присутствии эука-риотной ДНК-носителя без обработки Ш. (2Т213 и 2Т301Д-Я группа) и с обработкой ТФА (2Т7Т и 2Т18Т, 2-я группа), а также при котраисформации ДНК плазмвды р5Т82б и плазмвды рЭУ1 (рБИ322:¡5У40) без зукариотной ДНК-носителя (9СТ12,3-я группа).

Все ГАТ-субклоны оказались нестабильными по ТК^-феноти-пу, что вновь подтверждает вывод о генетической нестабильности клеток по трансформантноцу фенотипу. Скорость потери ТК*-фенотипа в ГАТ-субклонах из более нестабильных клонов (2Г7Т, 2Т18Т, 9СТ12), выше, чем в ГАТ-субклонах из более стабильных трансформантных клонов (2Т213 и 21301) (табл.13). Тем не менее, хотя различия в скорости потери ТК*-фенотипа выявляются с достоверностью между группами полученных из трансформантных клонов ГАТ-субклонов (статистический анализ

Таблица 13

Скорость потери Т^-фенотипа в ГАТ-субклонах трансформантных клонов

Родительский клон Число изученных ГАТ-субклонов Скорость потери ТК^-фенотипа, % клеток-за I сут

2Т213 4 1.81 0.90(0.40-1.72)

2Т301 3 1.50 0.72(0.02-1.44)

2Т18Т 3 18.34 4.04(1.04-5.69)

2Т7Т 4 .21.24 2.48(1.17-5.16)

9СТ12 4 2 35 3.70 {2.96-5.64)

Примечание. Приведены значения средней скорости потери Т1\-фенотипа для группы ГАТ-субклонов. В скобках - предельные значеищ скорости потери ТК^-фенотипа в группе субклонов.

см. Глебов, 1984), что указывает на наследуемость признака "скорость потери ТК^-фенотипа", ГАТ-субклоны все же отличаются от родительских клонов (за исключением субклонов-клона 9СТ12). Поскольку различие между родительскими клонами и ГАТ-субклонами (выделение которых сопровоздается культивированием на среде ГАТ в течение 20-25 сут) заключается в том, что скорость потери ТК^-фенотипа в последних меньше,можно предположить, что это является результатом наложения на наследование скорости потери ТК^-фенотипа процесса стабилизации арансформантного фенотипа.

Действительно/как следует из данных, представленных в табл. 14, культивирование на среде ГАТ в течение 50 сут сопровождается уменьшением скорости потери ТК^-фенотипа в четырех из шести орансформантных клонах. Это свидетельствует в пользу того, что различия в скорости потери ТК^-фенотипа между ГАТ-субклонами и родительскими клонами действительно обусловливаются процессом стабилизации трансформантного фенотипа ,происходящим при выделении и размножении субклонов на среде ГАТ(а также.по-видимому,при культивировании клеток Водительских клонов на неселективной среде ГТ до субклонирования).Этот вывод подлепляется также и тем обстоятельством, что в клоне 9СТХ2, три из четырех ГАТ-субклонов которого не отличаются от родительского клона по скорости потери ТК*-фе-нотипа,при культивировании на среде ГАТ в течение 50-70 сут не наблюдается стабилизации трансформантного фенотипа. Клоны 9СТ11 и 9СТ12 получены при трансформации клеток с помощью ДНК плазмяд рБТвгб и рЗУ1, тогда как другие четыре клона -при трансформации с помощью ДНК плазмиды рэтвгб в присутствии эукариотной ДНК-носителя,т.е. при разных условиях трансформации. Можно, следовательно, полагать,что различия в скорости стабилизации трансформантного фенотипа клонов (оцениваемые по продолжительности культивирования на среде ГАТ, достаточной для статистически значимого уменьшения скорости потери Т^-фенотипа) связаны с различиями в структуре чужеродной ДНК, введенной в их клетки.

Как показал анализ стабильности ТК^-фенотипа тринадцати ГАТ-субклонов, выделенных из клонов 2Т213, 2Т301 и 217Т,

Таблица 14

Стабилизация ТК^-фенотипа трансформантных клонов яра культивировании клеток на среде ГАТ

Время культиви-Югон роваяия клеток на среде ГАТ, сут

Скорость потери Продолжительность ИГ-фенотипа, % культивирования клеток за I сут клеток на среде ГТ, сут

2Т213

2Т301

2Т7Т

2Т18Т

9СТ11

9СТ12

6-8

50 70 90

6-8

50 70 90

6-8 50 70 90

6-8 50 70 90

6-8 50 70 90

6-8 50 70 90

1.81 + 0.38 1.10 ~ 0.70 0.06 + 0.07 0.07 £ 0.09

1.50 ± 0.62 ± 0.17 ± 0.41 ±

21.24 + 4.44 + 2.15 + 0.83 ±

18.34 12.76 1.57 0.68

± ± ± ±

11.91 ± 9.56 ± 9.77 + 1.52 ±

2.35 + 7.70 ± 4.52 + 2.17 ±

0.15 0.61 0.14 0.17

7.81 1.01 0.73 0.13

1.42 2.20 0.07 О.П

0.87 1.78 1.13 0.37

0.48 1.93 0.64 0.Г7

27 17 62 35

45 17 62 35

17 24 40 35

17 24 62 35

24 24 21 35

26 24 62 35

Примечание. Приведет средние значения' и стандартные ошибки скорости потери Т1г-фенотипа на протяжении указанного в табл. периода врсмеш; в скобках - число измерений.

культивировавшихся до субклонирования в течение 50 сут на среде ГАТ, процесс стабилизации трансформантного фенотипа протекает постепенно и выражается з уменьшении скорости потери ТК^-фенотипа во всех клетках клона, а не связан с увеличением доли клеток, стабильных по ПС-фенотипу, возникающих по типу "все или ничего".

Обработка стабилизированных по трансформантному фенотипу культивированием на среде ГАТ в течение 90 сут клонов ингибитором метилирования ДНК азаЦ (в отличие от обработки иестабилизированных клонов - см. рис. 6), повышает в них скорость потери ТК^-фенотипа в 1.3-8.1 раза. Следовательно, по щ)айней мере, частично,стабилизация трансформантного фенотипа клеток связана с метилированием ДНК.

Таким образом, можно сделать вывод о наследовании признака "скорость потери ТК*-фенотипа" в ряду клеточных поколений, которое, однако, нарушается под влиянием процесса стабилизации ТК^-фенотипа при культивировании клеток как на среде ГАТ, так и, вероятно, на неселективной среде, что, возможно, связано с процессом метилирования (чужеродной)ДНК.

Исходя из представленных в предыдущих разделах результатов, можно предполагать, что изменения в структуре и составе трансформирующих ДНК приводят к наследуемым изменениям в скорости потери ТК^-фенотипа трансформантных клонов в результате модификаций процессов образования пекеласом и встраивания последних в геном клеток-реципиентов. Скорость потери ТК*-фенотипа может определяться, во-первых, НИ трансфор-Шфущцих ДНК, входящих в состав пекеласом с ТК геном ВДГТ; во-вторых, может быть детерминирована НП геномной ДНК, прилежащими к пекеласоме; и, в-третьих, может обусловливаться Щ ДНК, удаленными на значительное расстояние от встроенного в геном ТК гена ВПГ1, т.е. не сцепленными с пекеласомой. Известно, что при трансформации соматических клеток геномными ДНК тесно сцепленные гены могут передаваться совместно. Для проверки того, могут ли НП ДНК, контролирующие цризнак "скорость потери трансформантного фенотипа" передаваться совместно с ТК геном ШГ1, была изучена стабильность вторичных трансформантных клонов, подученных при трансформации клеток линии А238 геномными ДНК из клеток трансформантных клонов 2Т213 г 2Т18Т,. отличающихся по скорости потери ТК*"-фенотипа. Экспрессирующке (как показал тест на чувствительность клеток к высоким концентрациям тимвдина в среде ГАТ)ТК ген ВПГ1 вторичные трансформантные клоны оказались гетерогенными по

признаку "скорость потери ТК^-фенотипа" (табл. 15). Два из трех клонов, полученных при трансформации с помощью ДНК из клеток клона 21213, имеют, однако,ту же скорость потери ТК*-фенотипа, что и клетки клока-донора ДНК. Два из шести клонов, полученных при трансформации с помощью ДНК из клона 2Т18Т, обнаруживают близкую к клону-донору ДНК кинетику утраты ТК1"-фенотипа, хотя скорость потери ТК^-фенотипа в них меньше, чем в клоне 2Г18Т. Следует отметить, что вторичных трансфор-мантных клонов, которые бы характеризовались такой же скоростью потери трансфорыантного фенотипа, как и клоны, полученные при трансформации с помощью ДНК из другого первичного трансформантного клона, выявлено не было.

Таким образом, с помощью ДНК, выделенной из клеток нестабильных по трансфорглантному фенотипу клонов, можно перенести совместно с ТК геном ВНГ1 и детерминанты признака "скорость потери Т1^-фенотипа".Полученные результаты указывают на довольно тесную сцепленность НП ДНК.детормшшрующих скорость потери ТК^-фенотипа, с ТК геном ВПГ1: по данималь-

Таблица 15

Скорость потери ТК^-фенотипа в клетках вторичных трансформантных клонов

Клон-до- Вторичный транс- Скорость потери Продолжительность нор ДНК формантный клон ТК^-фенотипа, % культивирования

клеток за I сут на среде ГТ, сут

2Т213 - 1.81 + 0.38 5) 2?

155Т202 1.51+0.59(4) 35

155Т182 1.85 + 0.24 (3) 35

155Т141 0.42+0.15(4) 46

2Т18Т - 18.34 + 1.42 (5) 17

156Т213 3.13 + 0.54 (4) 35

156Т221 3.01 ~ 0.07 3) 20

156Т234 6.60 + 1.12 (3) 21

156Т242 5.50+0.56(3) 20

156Т263 3.41+0.23(3) 20

157Т294 3.40 ¿0.53 (4) 35

Примечание. Приведет средние значения и стандартные ошибки скорости потери Т1Г-фенотипа на протяжении указанного в таол. периода времени; в скобках - число из мер гни!!.

ной оценке 20% вторичных трансформантных клонов (два из девяти) обнаруживают характерную для клеток-доноров скорость потери трансформантного фенотипа.

Как обсуздалось выше ' (раздел 2.3), утрата к восстановление ИС-фенотипа в изученных трансформантных клонах клеток линии А238 сопровождается изменениями в структуре пекеласом, включающих ТК ген ВПГ1. Если НП ДНК, контролирующие скорость потери ТК*-фенотипа, расположены внутри пекеласом, то можно ожидать, что скорость потери трансформантного фенотипа в большей части субклонов-реревертантов будет отличаться от таковой родительских трансформантных клонов. Оказалось, что субклоны-реревертанты (экспрессирующие, как показано с помощью ЮФ в ПААГ, ТК ген ВПГХ), полученные из БДУ-субклонов более стабильных по Т^-фенотипу клонов 2Т213 и 2Т301, имеют меньшую скорость потери ТК*-фенотипа, чем субклоны-реревертанты, полученные из БДУ-субклонов менее стабильных клонов 2Т18Т и 217Т (табл.16). Б то же время субклоны-реревертанты имеют, в общем, более низкую скорость потери ТК*-фенотипа, чем родительские трансформантные клоны.Отметим, что выделение субклонов-реревертантов сопровоадается таким же по продолжительности культивированием на среде ГАТ, как и выделение ГАТ-субклонов.Можно полагать,что уменьшение скорости по-

Таблица 16

Скорость потери ТК^-фенотипа в субклонах-реревертантах

Родительский клон Число изученных суб-„ клонов-реревертантов Скорость потери ТК^фенотипа, % клеток за I сут 148

2Т18Т 4 (2) 18.34 6.64(3.27-9.43)

2Г?Т 4 (2) 21.24 4.51(1.45-7.10)

2Т301 3 (2) 1.50 0.59(0.36-0.91)

2Т213 2 (2) 1.81 0.54(0.49-0.58)

Примечание, а - в скобках указано число БДУ-субклонов, из которых подучены субклоны-реревертанты; т -,в скобках . указаны предельные значения скорости потери ТЬГ-фенотипа в выборта субклонов-реревертантов.

тери ТК^-фенотипа в суб клонах-рер е в ер тантах по сравнению о родительскими трансформантными клонами связано,как и в случае ГАТ-субклонов, со стабилизацией ТК^-фенотипа, протекающей при их культивировании на среде ГАТ в процессе выделения. Действительно, скорость потери ТК*-фенотипа в клонах-реревертантах ближе к таковой в ГАТ-субклонах,чем к скорости потери ТК^-фенотипа в родительских трансформантных клонах. Однако, между некоторыми субклонами-реревертантами,полученными из одного БДУ-субклона, наблюдаются различия в скорости потери ТК*-фенотипа (в 5 раз), т.е. расщепление по признаку "скорость потери ТК^-фенотипа". Такое расщепление может быть, конечно, и следствием процесса стабилизации трансформантного фенотипа, но не исключено,что происходящие при смене фенотипа ТК* —- ТК" —>- ТК*" изменения в структуре пекеласом могут затрагивать в отдельных случаях и фланкирующие их Ш ДНК, определяющие скорость потери ТК*-фе-нотипа.

Следовательно, с учетом стабилизации ТВ^-фенотипа при культивировании клеток трансформантных клонов на среде ГАТ (а также и на кеселективной среде) можно сделать вывод о воспроизведении скорости потери трансформантного фенотипа, характерной для клеток родительских трансформантных клонов, большей частью субклонов-реревертантов.

Таким образом, можно заключить,что скорость потери ТК^-фенотипа в клетках трансформантных клонов детерминируется НП ДНК, тесно сцепленными с содержащими ген ТК ВПГ1 пекела-сомами, встроенными в геном клеток-реципиентов. Эти НП ДНК могут быть отделены от НП, содержащих ген ТК ВПГ1,в процессе переноса этого гена о помощью геномной ДНК и, напротив, могут оставаться относительно неизменными при перестройках пекеласомной ДНК, сопровождающих последовательную смену фенотипа (ТК1" —»■ ТК" —ТК*) клеток трансформантных клонов. В табл. 17 сопоставлены данные о наследовании скорости потери и скорости восстановления ТЛС-феноти'па (частоте возникновения ТК^-клеток в БДУ-субклонах) в субклонах трансформантных клонов и во вторичных трансформантных клонах.

Таблица 17

Наследование скорости потери трансформантного фенотипа

Число изу- Скорость потери Частота рерс-Клоны и субклоны ченных суб- Т1Г-фенотипа, % версий к Т|Г-клонов клеток за I сут фенотипу, %

21213 - 1^81 ' -

ГАТ-субклоны 4 0.90(0.40-1.72)

БДУ-субклоны 4 - 0.48(0.0005-1.7)

фгбклоны-реревер- 2 0.54(0.49-0.58) танты

Вторичные транс- 3 1.26(0.42-1.85) формантные клоны

2Т18Т - , 18.34

ГАТ-субклоны 3 4.04(1.04-5.69)

ДЦУ-субклоны 5 - 1.64(0.32-5.10)

Субклоны-реревер- 4 6.64 (3.27-9.43) танты

Вторичные транс- 6 4.18(3.01-6.60) формантные клоны

Примечание.В двух.из четырех ДЦУ-субклонах клона 2Т213 не выявляются спонтанные реревертанты к ИГтфенотипу; для них в качестве значений частоты реверсий к ИГтфенотипу взяты предельные значения частот возникновения Т1Г-клеток, которые могли бы быть выявлены по условиям экспериментов. В двух БДУ-субклонах, в которых 'наблюдается спонтанное возникновение ИГ-клеток. средняя частота ререверсий к ТК7-фенотц-пу составляет 0.96$. В скобках - предельные значения рассматриваемых показателей.

Большая скорость потери ТК*"-фенотипа, как можно видеть, сопряжена и с более высокой скоростью восстановления ТК^-фе-нотипа. Это подтверждает вывод о том, что потеря и восстановление ТК^-фенотипа клеток трансформантных клонов связаны с однотипными' процессами - уменьшением и увеличением числа копий гена'ТКВПИ (см. раздел 2.3). Можно предполагать,следовательно , что НП ДНК, детерминирующие скорость потери ТК*"-фенотипа,' определяют и скорость восстановления ТК*-фенотипа в ВДУ-субклонах трансформантных клонов, задавая, по-видамо-цу» скорость генотипических перестроек в районе встроенной в геном чугеродной ДНК.

Это предположение подтверждается и результатами изучения трансформантных клонов клеток китайского хомячка линии 1)0111, в которые был введен ген ДГ4Р мыши. Показано,что частота устойчивых к метотрексату клеток (возникновение кото-

рых связано, по многочисленным данным, с амплификацией гена ДГФР) в ДГФР+-клонах, полученных при трансформации в присутствии эукариотной ДНК-носителя, в среднем в 8 раз выше, чем в клонах, полученных при трансформаций без ДНК-носителя.Хотя мы не определили числа копий рекомбинантного гена ДГФР в клетках метотрексат-резистентных клонов, активность ДГФР в них повышена в 5-10 раз по сравнению с ДГФР+-клетками родительских трансформантных клонов.Это свидетельствует в пользу того, что причиной возникновения метотрексат-резистентных клеток является амплификация рекомбинантного гена ДГФР, скорость которой (связанная, очевидно,с частотой перестроек в районе чужеродной ДНК) повышена в клонах, полученных пт>и трансформации в присутствии эукариотной ДНК-носителя, т.е. в условиях .дестабилизирующих трансформантный фенотип клеток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Природа нестабильности признаков соматических клеток и явление геномного иммунитета-

Представленные результаты указывают на то, что нестабильность изученных признаков, контролируемых как собственными клеточными генами, так и введенными в клетки чужеродными генами, детерминирована генетически и определяется наследуемыми изменениями в активности соответствующих генов, происходящими с высокой частотой. Если в случае признаков, контролируемых клеточными генами, можно толькр предполагать, исходя из проведенного анализа особенностей кариотипической изменчивости клоналышх популяций клеток, что наследуемые изменения в активности генов связаны с генотапической нестабильностью соответствующих районов хромосом, то для генетически нестабильных признаков.детерминированных чужеродными генами, это положение получило прямое подтверждение.

Эксперименты по генетической трансформации соматических клеток показали, что сайт-специфичная генотипическая нестабильность присуща не только МГЭ или определенным образом организованным вирусным ДНК, а представляет собой общее явление, отражающее активную реакцию генома эукариот на внед-

рение любой чужеродной ДНК в любой участок генома.Более того, генетическая нестабильность со свойствами, сходными,если не идентичными свойствам нестабильности инсерционного типа (индуцируемой встроенными в геном МГЭ), присуща также признакам, обусловленным амплификацией генов. При этом показано, что для районов хромосом с амшшфицированными НП ДНК также характерна генотипическая нестабильность. Частота перестроек ДНК,' приводящих к увеличению или уменьшению числа копий гена, по сравнению с исходными клетками на порядок выше в клетках, содержащих амплифицированный ген ДГФР (Johnstone et al.,1983). Это непосредственно указывает на индукцию генотипической нестабильности в районе амплифицирован-ных НП ДНК. Хотя участки встраивания чужеродной ДНК могут быть, как показано в некоторых случаях, сайтами хромосом, подверженными в исходных клетках-реципиентах перестройкам, утрата НП чужеродной ДНК и их перестройки могут происходить без потери или изменений окружающих ее НИ геномной ДНК. Следовательно, генотипическая нестабильность является не только сайт-специфичной, но и присущей, главным образом, НП чужеродной ДНК, даже если она встроена в предрасположенные к перестройкам участки хромосом. Поскольку скорость генотипи-■геских изменений, как показано, по крайней мере,в некоторых случаях, различается в разных сайтах встраивания чужеродной ДНК, предположение о том, что прилежащие НП геномной ДНК контролируют скорость потери трансформантвого фенотипа, детерминируя частоту генотипических изменений в чужеродной ДНК (встроенной в геном клеток-реципиентов), представляется весьма вероятным.

Таким образом, эукариотные клетки реагируют на появление новых (чужеродных) для данного района генома НП ДНК индукцией сайт-специфичной генотипической нестабильности независимо от того.является ли появление новых НП ДНК результатом встраивания чужеродных для данной области генома НП ДНК или следствием амплификации и перестроек НП ДНК собственно района генома. Это явление характерно не только для Культивируемых соматических клеток (которым, в особенности

клеткам постоянных линий,в общем случае присуща генотипи-ческая нестабильность, проявляющаяся в высокой частоте ка-риотипических изменений), но и для соматических и половых клеток организмов, в пользу чего свидетельствуют данные о генотипической нестабильности чужеродной ДНК в трансгенкых животных.

3 основе указанной реакции лежит, очевидно.способность клеток распознавать "свое" и "чужое" (перестроенные НИ ДНК) в геноме. В связи с этим, и поскольку такая реакция клеток может рассматриваться как средство, в известных пределах препятствующее существенным перестройкам генома и поддерживающее стабильность генома, ее можно назвать геномным иммунитетом.35 Степень проявления геномного иммунитета, как следует из имеющихся данных о зависимости частоты генотипичес-ких перестроек и скорости амплификации от сайта встраивания чужеродной ДНК или локализации амплифицированных НП ДНК в геноме, различна для разных участков генома. Явление геномного иммунитета можно рассматривать как особый тип реакций генетического стресса (см.: ЫсСИп4оск,1984), следует только подчеркнуть, что ответ эукариотннх клеток на появление в геноме новых НП ДНК, хотя к включает стохастическую компоненту, запрограммирован, и, в отличие от многих реакций на генетические сгрессоргше воздействия, предсказуем и имеет локальный характер.

Природа механизмов генотипической нестабильности новых (чужеродных) НП ДНК и факторы, ее предопределяющие,пока неизвестны. Можно полагать, что встраивание МГЭ или иных чужеродных для данной области генома НП ДНК также, как и амплификация и перестройки НП геномной ДНК, модифицируют пространственную организацию (внутриядерную кошарткентализа-цию) участков генома, их решшкационную и рекомбинациош(уп организацию.Это может сопровождаться нарушешшш репликации или изменениями в характере рекомбшсациокных процессов в

* Впервые термин "геномный имму!£ктетч был использован при обсуждении ряда представленных выше данных И.А.Захаровым, хотя, насколько известно автору, не употреблялся в печатай работах.

прилежащих к чужеродным НП геномной ДНК,что и является причиной генотипической нестабильности соответствующее участков хромосом. Происходящие с высокой частотой перестройки ДНК, нарушающие пространственную организацию хромосом в интерфазном ядре, а также решжкационную и рекомбинадаонную организацию участков генома, могут приводить к неупорядоченной экспрессии генов в таких участках, проявляющейся в форме эпигенотипической нестабильности. При этом реакция данного участка генома на появление новых НП ДНК в свою очередь будет зависеть, очевидно, от особенностей его структурной и функциональной организации, в частности, емкости реп-ликояа, типа рекомбинационных процессов, характерных для данного района хромосом, и других причин.

Описанные гипотетические причины индукции генотипической нестабильности чужеродных (новых) НП ДНК можно отнести к механизмам пассивного геномного иммунитета. Существуют, вероятно, и механизмы активного геномного иммунитета, основанные на сопоставлении структуры гомологичных участков хромосом и включающие последующую генную конверсию или дополнительные перестройки ДНК, компенсирующие эффекты выявленных различий. К таким механизмам относятся, возможно,во многом еще загадочные системы, обеспечивающие гомогенизацию тавдемно повторяющихся и диспергированных повторяющихся НП ДНК, а также магнификацию и компенсацию генов рРНК у дрозофилы.

Возможность стабилизации трансформантного фенотипа соматических клеток, а также имеющиеся примеры стабилизации встроенных в геном НП вирусных ДНК.амплифицированных геномных НП ДНК и интегрированных в геноме амплифицированных чужеродных генов подчеркивают то обстоятельство,что механизмы геномного иммунитета могут приводить не только к исключению чужеродных НП ДНК из участков, генома, но и обеспечивать каким-то образом.стабильное сосуществование появившихся в геноме новых НП ДНК и фланкирующих их НП геномной ДНК. В раде случаев показано, что стабилизация признаков сопряжена со стабилизацией участков генома,содержащих контролирующие при-

знаки гены. Ло-ввдимоцу, необходимым условием эпигенотипи-ческой стабильности,т.е. отсутствия спонтанных переключений в активности генов.является генотипическая стабильность со-державдос их участков генома. Учитывая данные о дестабилизирующем трансформантный фенотип действии ингибитора метилирования ДНК азаЦ, можно предполагать,что стабилизация чужеродной ДНК связана с восстановлением спектра метилированных сайтов НП геномной ДНК, деметилированных вследствие встраивания (или, в общем случае.появления в результате перестроек) новых НП ДНК и сопровождающей этот процесс репарации ДНК.

Таким образом, широкое распространение генетически нестабильных признаков в популяциях культивируемых соматических клеток животных связано, по всей вероятности, с достаточно часто происходящими в них перестройками ДНК, приводящими к появлению новых, чужеродных для данных участков генома НП ДНК, что сопровождается индукцией сайт-специфичной генотипической нестабильности и сопряженной с ней эпигено-типической нестабильности. Если сформулированные предположения о природе генотипической и эпигенотипической нестабильности справедливы, то соматические клетки, генетически нестабильные по тем или иным признакам (в частности,по тран-сформантному фенотипу), могут рассматриваться как перспективная модель для изучения механизмов геномного иммунитета, репликационной и рекомбинационной организации, а также взаимосвязи высших уровней структурной и функциональной организации генома эукариот.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

I. Клоны, выделенные па среде, содержащей АГ, из популяций клеток китайского хомячка, обработанных мутагенами (ЭМС, БДУ), различаются как по уровню устойчивости клеток к АГ, так и по способности сохранять признак АГ-резистентнос-ти при культивировании клеток на неселективной среде.Нестабильность клонов по устойчивости к АГ проявляется не только в утрате признака, но и во внутриклональной гетерогенности клеток по признаку АГ-резистентности. Устойчивость к АГ и

различия в уровне устойчивости к АГ клеток разных стабильных клонов связаны с мутациями в локусе ГФРТ, приводящий! к изменениям в свойствах фермента. Различия в уровне устойчивости к АГ клеток субклонов, выделенных из нестабильных клонов, напротив, связаны с изменениями, приводящими к вариациям в количестве ГСРТ, не затрагивающими свойств фермента.

2. Из популяций клеток китайского хомячка субклонированием на неселективной среде можно выделить клоны.различающиеся по уровню чувствительности клеток к УФ облучению и по стабильности этого признака.Нестабильность клонов по признаку чувствительности к УФ облучению также проявляется во внутриклональной гетерогенности клеток и утрате признака при культивировании клеток. Кариотипическая структура популяций клеток нестабильных по чувствительности к УФ облучению вариантов может оставаться постоянной при их длительном культивировании, несмотря на высокую частоту кариотипачес-ких изменений.

3. Исследованы особенности трансформации линий соматических клеток различной видовой и тканевой принадлежности генами ТК ВПГ1, ДР5Р миши(кДНК под контролем основного промотора поздних генов аденовируса 12) и КГФРТ Е.ооН (под контролем промотора ранних генов 0В40). Выявлены изменения в частоте и эффективности генетической трансформации соматических клеток, связанные с вариациями в составе и структура трансформирующих ДНК. Все клоны генетически трансформированных клеток оказались нестабильными по трансформант-ному фенотипу (т.е. по признакам,контролируемым чужеродными генами). С помощью ДНК-ДНК гибридизации и других методов по казано, что чужеродная ДНК в клонах клеток китайского хомяч ка лиши А238 встроена в хромосомы и организована в тандем-но повторяющиеся структуры.

4. Свойство нестабильности признаков соматических клеток (устойчивости к АГ, чувствительности к УФ облучению I трансформантного фенотипа) детерминировано генетически и ш следуется в ряду клеточных поколений, при субклонировании клеток, а также у вариантов клеток с альтернативными состо-

яниями признака. Генетическая нестабильность признаков обусловливается наследуемыми изменениям» в активности контролирующих признаки генов. "Такие изменения, как следует из возможности выделения различающихся по признаку вариантов при субклонировании клеток на неселективной среде, а также из анализа частот утраты и восстановления трансформавтного фенотипа клеток, происходят с высокой - 1х1СГ3 - МО"1 -частотой. (.

5. Наследуемые изменения в экспрессии чужеродных генов, детерминирующих трансформантный фенотип соматических клеток, сопряжены с происходящими с высокой частотой перестройками чужеродной ДНК, встроенной в геном клеток-реципиентов; и,по-видимоцу, ивдуцируются такими перестройками. Метилирование ДНК,не будучи непосредственной причиной утраты трансформантакого фенотипа, может препятствовать реверсии клеток к транс-формантному фенотипу. Высокая частота (около 1x10"^ на клетку на поколение) и неслучайность кариотипнчесяих изменений свидетельствуют о том, что нестабильность соматических клеток по кариотипу обусловливается геноткпичосвой нестабильностью определенных хромосом. Возможно, что нестабильность экспрессии клеточных генов.контролирующих генетически нестабильные признаки,связана также с генотипической нестабильностью определенных участков хромосом соматических клеток.

6. Степень нестабильности признаков.оцениваемая по скорости потери трансфоршнтного фенотипа соматических клеток, также детерминировайа генетически: признак "скорость потери трансформантного фенотипа" наследуется в ряду клеточных поколений, в том числе, при последовательной смене состояний трансформантного фенотипа, которая сопровождается перестройками в структуре чужеродной ДНК. Данный признак мотет быть передан с высокой частотой совместно с селективным геном при трансформации клеток-реципиентов с помощью ДНК из клеток первичных трансформантных клонов. Это означает,что степень нестабильности признаков контролируется последовательностями геномной ДНК, прилежащими к встроенным в хромосом! чужеродным генам. Рад данных указывает на то, что различая

в скорости потери трансформантного фенотипа обусловлены различиями в частоте перестроек в районе чужеродной ДНК, которая задается, по-видимому, прилежащими к чужеродной ДНК последовательностями геномной ДНК соматических клеток.

7. Наследование признака "скорость потери трансформант-ного фенотипа" нарушается, в той или иной степени.процессом стабилизации транс-формантного фенотипа, происходящим при культивировании клеток на селективной среде. Стабилизация трансформантного фенотипа протекает постепенно,а не по типу "все или ничего" и, пс крайней мере, частично, связана с метилированием ДНК. Скорость стабилизации трансформантного фенотипа зависит от структуры чужеродной ДНК, введенной в соматические клетки.

8. Сопоставление полученных нами и имеющихся в литературе данных свидетельствует в пользу существования общих причин возникновения и механизмов реализации генетической нестабильности признаков, контролируемых как собственными клеточными генами, так и введенными в соматические клетки чужеродными генами. Эукариотные клетки реагируют на появление новых для данного района генома нуклеотвдных последовательностей ДНК иадукцией генотипической нестабильности, ограниченной новыми и прилежащими к ним последовательностями геномной ДНК. Индукция перестроек ДНК и связанных с ними эшгенотипических изменений не зависит от того, появляются ли новые НП ДНК в результате встраивания в геном чужеродной ДНК, МГЗ или Вследствие амплификации и перестроек ДНК в самом участке генома.Это свойство, названное геномным иммунитетом, лежит, по нашему мнению, в основе генетической нестабильности признаков эукариотных клеток. Согласно предлагаемой концепции, по щгайней мере, часть генетически нестабильных изменений в эукариотных клетках обусловлена нарушениями структуры участков генома, связанными с появлением в них новых НП ДНК. Эти нарушения индуцируют генотипическую и эпиге-нотипичэскую нестабильность участков генома,результатом которой является генетическая нестабильность признаков, контролируемых' генами , расположенными в таких участках.

■ СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Глебов O.K. Генетическая трансформация соматических клеток. - Л.: Наука, 1989. - 351 с,

2. Полянская Г.Г., Абрамян Д.С., Глебов O.K. Кариотипиче-ская структура клоновых популяций клеток китайского хомячка при длительном культивировании. // Цитология. 1981. Т. 23,

№ 7. С. 818-830.

3. Абрамян Д.С., Глебов O.K. Внутриклональнач гетерогенность и нестабильность клеток китайского хомячка (CHO-KI). // Цитология. 1981. Т. 23, № 9. С. I03I-I040.

4. Абрамян Д.С., Глебов O.K. Наследуемые изменения генной активности как одна из причин фенотипической гетерогенности устойчивых к 8-азагуанину клонов китайского хомячка. // Цитология. 198I. Т. 23, № 10. С. II6I-II73.

5. Абрамян Д.С., Глебов O.K. Нестабильность клеток китайского хомячка по устойчивости к 8-азагуанину и чувствительности к ультрафиолетовому облучению. // I Всесоюз. совея.по генетике соматических клеток, в культуре: Тез. докл. М., 1981. С. 6.

6. Глебов 0. К., Абрамян Д. С. Фенотипическая гетерогенность устойчивых к 8-азагуанину клонов китайского хомячка (CH0-KI). // I Всесоюз. совещ. по генетике соматических клеток в культуре: Тез. докл. М., 1981. С. 7.

7. Томилин Н.В., Глебов O.K., Светлова М.П., Жеребцов С. В. Влияние клонированных фрагментов повторяющейся ДНК млекопитающих на процесс рекомбинации in vivo и щ vitro. //1У съезд Всесоюз. общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова: Тез. докл. 1981. Т. I. С. 224.

8. Глебов O.K., Титомиров A.B., Токилин Н.В. Дестабилизация ТК^-фенотипа трансформированных плазмидой рВЮ25: :tkH3Vi : :HS3(pST826)iaeT0K китайского хомячка под действием опухолевого промотора ТФА. // Цитология. 1982." Т. 24, й 9. С. 1097-1098.

9. Глебов O.K., йтомиров A.B., Панаев Г.П., ТЬмилин Н.В. Трансформация клеток китайского хомячка плазмидой pBR325:t tk::HS3 и влияние опухолевого промотора ТФА на стабильность

трансформантов. // Докл. АН СССР. 1982. Т. 267, & 6.' С. I49&-1498.

10. Томилин Н.В., Подгорная О.И., Светлова М.П., Глебов O.K. Внехромосомный кольцевой плазмидный элемент в клетках китайского хомячка, образовавшийся из плазмиды со вставкой сателлита человека. // II Всесоюз. совещ. по генетике соматических клеток в культуре: Тез. докл. М., 1983. С. 114.

11. Томилин Н.В., Глебов O.K. Перенос генов в клетки китайского хомячка и закрепление чужеродных последовательностей в трансформантах. // Рекомбинантные ДНК: Тез. докл. Всесоюз. конф. Пущино, 1982. С. 25.

12. Tomilin N.V., Glebov O.K., Abramyan D.S., Titomirov А.V., Podgornaya O.I,, Pinaev G.P. Expression and stability of H3V1 TK gene In transformed Chinese Hamster cells.//Joint Congress of the Europ. tissue culture society (ETC3) and the Europ. reticuloendothelial society (eures): Abstract. Budapest. 1983. P. 56. •

13. Глебов O.K., Абрамян Д.С. Нестабильность фенотипа генетически трансформированных соматических клеток: сопоставление двух моделей. // Молекулярные механизмы генетических процессов. У Всесоюз. симп.: Тез. докл. М., 1983. С. 18.

14. Глебов O.K., Абрамян Д.С., Томилин Н.В.Последовательности вирусных (sv40) и эукариотных ДНК, влияющие на. стабильность П^-фенотипа клеток китайского хомячка, трансформированных геном тимидинкиназы вируса простого герпеса. // II Всесоюз. совещ. по генетике соматических клеток в культуре: Тез. докл. М., 1983. С. 92.

15. Глебов O.K., Абрамян Д.С. Природа фенотипической изменчивости соматических клеток в культуре : стабильные и возникающие с высокой частотой фенотипические изменения. // Цитология. ¿984. -Т. 26, Jé 2. С. 150-164.

16. Глебов 0. К., Абрамян Д. С. Природа фенотипической изменчивости соматических клеток в культуре: нестабильные фенотипические изменения. // Цитология. 1984. Т. 26, № 3. С. 235-251.

17. Глебов O.K., Абрамян Д.С., Смирнова Т.М. Генетическая

нестабильность генетически трансформированных соматических клеток и пути ее преодоления. // "Макромолекулы в функционирующей клетке". 1У Симпозиум СССР-Италия: Тез. докл. Кйев, 1984. С. 46.

18. Сасина Л. К., Глебов O.K., Михайлов В.Ы., Абрамян Д. С., Апреликова О.Н., Ландау С.М., Кордам В.А., Томилин Н.В. Изучение экспрессии ji-лактамазного бактериального гена в ТК*-трансформантах клеток китайского хомячка. // "Макромолекулы

в функционирующей клетке". 1У Симпозиум СССР-Италия: Тез. докл. Киев, 1984. С. III.

19. Томилин Н.В., Подгорная О.И., Федорцева Р.Ф.; Абрамян Д.С., Светлова М.П., Глебов O.K. Репликация и стабильность чужеродной ДНК в клетках китайского хомячка. // 16-я Конф. ФЕБО: Тез. докл. М., 1984. С. 383.

20. Глебов O.K., Абрамян Д.С., Томилин Н.В. Генетическая трансформация соматических клеток. 1.Клон клеток китайского хомячка, дефектных по тимидинкиназе, отличающийся высокой эффективностью трансформации. // Цитология. 1985. Т. 27, Ii 4. С. 467-475.

21. Томилин Н.В., Подгорная О.И., Абрамян Д.С., Глебов 0. К. Генетическая трансформация соматических клеток. II. Анализ состояния плазмидных последовательностей в хромосомных ДНК и активности тимидинкиназы в клетках трансформантных клонов. // Цитология. 1985. Т. 27, № 5. С. 554-564.

22. Томилин Н.В., Подгорная О.И., Светлова М.П., Глебов O.K. Генетическая трансформация соматических клеток. III. Анализ состояния плазмздных последовательностей ДНК во вне-хромосомной ДНК клеток трансформантных клонов и "спасение" экстрареплкцирующихся плазмидных ДНК. Ц Цитология. 1985. Т. 27, № 5. С. 565-571.

23. Глебов O.K., Абрамян Д. С., Томилин Н.В. Генетическая трансформация соматических клеток. 1У.Скорость потери трано-формантного фенотипа зависит от структуры трансформирующей ДНК и изменяется при обработке клеток опухолевым промотором 12-о-тетрадеканоил-форбол-13-ацетатом. // Цитология. 1985.

Т. 27, а 5. С. 572-581.

24. Глебов O.K., Абрамян Д.С., Смирнова Т.М. Генетическая трансформация соматических клеток. У.Наследуемость скорости потери и стабилизация трансформантного фенотипа. // Цитология. 1985. Т. 27, S Б. С. 670-677.

25. Глебов O.K., Абрамян Д.С. Генетическая трансформация соматических клеток. У1. Передача признака "скорость потери трансформантного фенотипа" с помощью ДНК из клеток, содержащих ген тимидинкиназы вируса герпеса, // Цитология. 1985. Т. 27, й 6. С. 678-687.

26. Томилин Н.В., Глебов O.K., Михайлов В.М., Сасина Л. В., Абрамян Д.С., Апреликова О.Н., Ландау С.М., Кордом В.А. Экспрессия в трансформангаых ТК*-клетках китайского хомячка бактериального гена jb-лактамазы. // Цитология. 1985. Т. 27,

№ 6. С. 688-692.

27. Глебов O.K., Абрамян Д.С. Генетическая трансформация соматических клеток. УН. Потеря трансформантного фенотипа сопровождается как стабильными, так и нестабильными изменениями в ДНК. // Цитология. 1985. Т. 27, й 7. С. 797-804.

28. Глебов O.K., Абрамян Д.С. Генетическая трансформация соматических клеток. У111. Влияние ингибитора метилирования ДНК 5-азвцитидина на стабильность негативного и позитивного по тимидинкиназе фенотипа клеток трансформантных клонов. // Цитология. 1985. Т. 27, К 7. С. 805-813.

29. Глебов O.K., Абрамян Д.С., Подгорная О.И., Томилин Н. В. Генетическая трансформация соматических клеток. IX,Потере трансформантного фенотипа сопряжена о перестройками последовательностей плазмидпой ДНК, содержащей ген тимидинкиназы вируса fepneoa. // Цитология. 1985. Т. 27, JS 7. С. 814821.

30. Томило! Н.В., Глебов O.K. Генетическая трансформация клеток ылекопитавдих. // Молекулярные в клеточные аспекты биотехнология. Л., Наука. 1986. С. 62-82.

31« Галактионов К.И., Павлова О.И., Абрамян Д.С., Глебов O.K. Эвггресеия гена актина дрожжей в клетках китайского хомячка. // Всессюа, конф. по генетике соматических клеток в дондос Тез. докл. Ы<, 1986. С. 14-15.

32. Глебов O.K. Генетический контроль экспрессии» рекомбинации и ашшфикации чужеродной ДНК в соматических клетках. // Всесоюз. конф. по генетике соматических клеток в культуре: Тез. докл. М., 1986. С. 15-16.

33. Глебов O.K., Абрамян Д.С. Роль метилирования ДНК в поддержании генотипической стабильности эукариотных клеток. // Всесоюз. конф. по генетике соматических клеток в культуре: Тез. докл. М., 1986. С. 16-17.

34. Ейханская Ф.Л., Глебов O.K., Томилин Н.В. Эксцизня плазмиды, содержащей вставку сателлитной ДНК человека, из хромосом клеток китайского хомячка при слиянии с клетками человека. // Цитология. 1987. Т. 29, »9. С. 1076-1077.

35. Глебов O.K. Генетическая трансформация соматических клеток. // Методы культивирования клеток. JL, Наука, 1988. С. 205-221.