Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Нарушения морфологии интерфазных ядер в клеточных популяциях животных при оценке влияния на геном дестабилизирующих факторов

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Нарушения морфологии интерфазных ядер в клеточных популяциях животных при оценке влияния на геном дестабилизирующих факторов"

На правах рукописи

I

003054287'

ПРОШИН Сергей Николаевич

Нарушения морфологии интерфазных ядер в клеточных популяциях животных при оценке влияния на геном дестабилизирующих факторов.

03.00.15 - генетика

Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург 2007

003054287

Работа выполнена в лаборатории молекулярной цитогенетики Государственного научного учреждения „ Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных Российской академии сельскохозяйственных наук

Научный консультант: член-корреспондент РАСХН,

заслуженный деятель науки РФ А.ФЛковлев

Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук,

Профессор БЛЗавертяев

доктор биологических наук, ТЛЛСузнецова

доктор биологических наук, А.Е,Хованских

■ Ведущее учреаеденне: Санкт-Петербургская Государственная

Академия Ветеринарной Медицины

Защита состоится "¿^"^¿¿¿£^2007 г. в // часов на заседании Диссертационного совета Д 0Ьб.012.01 ГНУ ВНИИ генетики и разведения сельскохозяйственных животных по адресу: 196601, Санкт-Петербург-Пушкин, ул. Московское шоссе, 55-А, факс (812)465-88-98, Елши1: spbvniigen@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться на Интернет сайте ВАК РФ и в библиотеке ГНУ ВНИИ генетики и разведения сельскохозяйственных животных

Автореферат разослан Ч?" АмчРЯХП г.

Учёный секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук Г.Н. Сердюк

1 .ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 1.1. Актуальность темы днссертации. Изучение структурных и функциональных изменений генома в популяциях соматических и репродуктивных клеток представляет несомненный интерес для всесторонней оценки генетической стабильности организмов как в тест-системах in vitro, так и в условиях in vivo. Геном эукариотических организмов локализован, главным образом, в клеточном ядре. Морфология и структура клеточного ядра во многом отражает функциональное состояние клетки и воздействие разнообразных факторов (внутренней или внешней природы) на клетку, которая является одним из основных элементов клеточной популяции, может быть охарактеризовано по определённым морфофункциональным маркерам интерфазного генома. Так, к настоящему времени, методы интерфазной цитогенетики являются неотъемлемой частью подходов для оценки стабильности эукариотигческого генома, а в ряде случаев, когда необходимо провести экспресс-анализ частоты нарушений генома, дают больше преимуществ по сравнению с классическим метафазным методом (Ильинских и др., 2005). Достоверно установлено, что хромосомные аберрации дицентрического типа могут влиять и изменять морфологию интерфазных ядер, приводя к формированию клеток с мостами (Алов, 1972; Gisselsson, 2000). Интерфазные мосты в клетках формируются из полицентрических хромосом и свидетельствуют о структурных аберрациях хромосом (Бочков и др., 1972). Циклы "разрыв хромосом — слияние фрагментов — образование хромосомного моста" могут длительное время воспроизводиться в ряду клеточных поколений (McClintock, 1942; Прокофъева-Бельговская, 1961; Gisselsson, 2000) и обусловливать кариотипическую гетерогенность клеточных популяций (Оленов, 1967; Олиници, 1982). Поскольку в злокачественных опухолях наблюдаются повышенные спонтанные частоты хромосомных аберраций, в том числе и дицентрического типа (Dijkhuizen et al., 1995; Mondelo et al., 1995), то для получения достоверных значений частот клеток с микроядрами и интерфазными мостами в клонах злокачественных клеток можно обходиться незначительным количеством клеточного материала. Не требует процедура определения частоты клеток с интерфазными мостами и значительных затрат времени. Таким образом, не прибегая к хромосомному анализу по морфологии ядра интерфазной клетки можно с высокой эффективностью определять частоты структурных хромосомных аберраций дицентрического типа в клеточных популяциях in vivo (Кравцов и др., 1997). По этим причинам представляется возможным и перспективным клональный анализ и

искусственный отбор по признакам "частота клеток с микроядрами" и "частота клеток с интерфазными мостами" в клеточных популяциях перевивных опухолей. При этом отбор проводится в больших выборках клонов, каждый из которых состоит из ограниченного числа клеток (Кравцов и др., 1990). Важно отметить, что методы интерфазной цитогенетики, в отличие от классического цитогенетического анализа, позволяют привлечь к анализу по искомому признаку большинство клеток данной клеточной популяции, что с успехом используется в генотоксикологии (Ильинских и др., 2005). Повышенная частота микроядер, как -правило, отражает нестабильность зукариотического генома, что позволяет использовать этот параметр для широкомасштабного мониторинга популяций в условиях с меняющимся техногенным . давлением (Fenech et al., 1997). Сказанное особенно актуально для экотоксикологического мониторинга рыбных ресурсов, когда необходимо оценить антропогенное воздействие на большой выборке рыб (Ilyinskikh et al.,1998).

В настоящее время не вызывает сомнения, что формирующаяся генетическая нестабильность, ведет не только к новообразованиям, но может быть также ответственна и за ряд ее отдалённых феноменов, реализующиеся на организменном уровне. Полагают, что одним из ведущих факторов в возникновении нестабильности генома является оксидативный клеточный стресс, следствием которого являются ошибки в период репарационного восстановления ДНК - молекулы, ответственной за передачу наследственной информации. Ионизирующая радиация, химические мутагены, биологические агенты (вирусы), а также излучения неионизирующей природы, способны вызывать изменения генетического материала. В связи с этим возникает необходимость в дальнейшем развитии подходов, основанных на принципе анализа отдельных интерфазных клеток с возможностью учёта повреждений в молекуле ДНК. Микроэлектрофорез ДНК одиночных клеток, как показывают недавние работы, позволяет выявлять не только двунитиевые разрывы, но и щёлочелабилыше основания ДНК, которые при определённых условиях трансформируются в одношггаевые разрывы (Collins, 2004).

Мутационное (генотоксическое) воздействие на эукариотический геном проявляется, как правило, постепенно и 1 является многостадийным процессом, реализующимся через процессы транскрипции и трансляции. При этом число ядрышкообразующих районов хромосом и их морфометрические характеристики, как свидетельствуют многочисленные работы, могут являться важным показателем функциональной активности

клетки (Mamaev, Mamaeva, 1990; Juntes, Pogacnik, 2000). Доказана прямая зависимость числа рибосомных цистронов от пролиферативного статуса клеток, направления их дифференцировки и степени полиплоидизации ядра (Crocker, 1999). Существуют убедительные доказательства того, что вирусы способны взаимодействовать с ядрышкоформирующими белками или используя их как "челнок", или непосредственно модифицируя функционирование интерфазного ядрышка клетки (Kalland et al., 1994). Большое значение в синтезе белков клетки играют рибосомные гены, являющиеся структурными элементами ядрышек и ядрышковых организаторов, что привлекает внимание экологов к использованию характеристик этих структур (üymskikh et al., 1998; Arkhipchuk, Garanko, 2005).

В своих исследованиях мы использовали надёжно апробированные методы, позволяющие объективно оценивать на

основе морфофункциональных характеристик элементов клетки

степень нестабильности генома.

1J. Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы являлось обоснование использования нарушений морфологии ядра, как интерфазных маркеров в оценке разнохарактерного влияния дестабилизирующих геном факторов и селекционного давления на клеточные популяции.

При этом были поставлены следующие задачи: -доказать на основе использования перевивной органотропной рабдомиосаркомы РА-23 крыс возможность получения клонов клеток с повышенными и пониженными частотами нарушений морфологии ядра по типу "интерфазные мосты"; -провести сравнительную характеристику кариотипической изменчивости в полученных клонах клеток с повышенными и пониженными частотами нарушений морфологии ядра по типу "интерфазные мосты";

-выявить, что в клеточных популяциях такие нарушения морфологии ядра, как "интерфазные мосты" и "хвостатые ядра", взаимообусловлены;

- оценить клеточный состав костного мозга и периферической крови крыс, подвергшихся облучению электромагнитными волнами гектагерцового диапазона;

- определить фоновые показатели нарушений морфологии ядер клеток крови .у хозяйственно значимых видов рыб Каспийского бассейна;

- оценить дестабилизирующее воздействие на геном

низкоэнергетического переменного магнитного поля и лазерного

облучения с применением микроядерного теста и

микроэлектрофореза ДНК одиночных клеток;

-оценить in vivo комбинированное воздействие

низкоэнергетического переменного магнитного поля и лазерного

облучения на концентрацию стволовых клеток в костном мозге

мыши;

- доказать возможность использования метода микроэлектрофореза ДНК одиночных клеток для выявления сперматозоидов быков с нестабильным геномом;

- оценить частоту и провести кариоморфометрический анализ интерфазных ядрышковых организаторов in vivo у животных под воздействием различных факторов;

-исследовать функциональное состояние in vivo лимфоцитов периферической крови коров положительных и отрицательных в РИД с использованием иммуноцитохимического анализа на ядерный антиген пролиферации клеток.

13. Научная новизна. Впервые обосновано использование комплекса информативных показателей особенностей морфологии ядра для оценки нестабильности генома животных. Выявлена положительная корреляция между образованием мостов в ана- и телофазе, формированием клеток с интерфазными мостами и возникновением клеток с «хвостатыми» ядрами и микроядрами в популяциях соматических клеток.

Впервые на основе наследственной гетерогенности клонов перевивных опухолевых клеток in vivo по признаку "частота клеток с интерфазными мостами" и разработанной методики отбора на повышение и снижение частоты встречаемости клеток с интерфазными мостами доказана возможность направленного получения популяций клонов клеток с низкой и высокой дестабилизацией генома.

Установлено, что персистенция в клеточной популяции в ряду нескольких клеточных поколений высоких частот клеток с нарушенной морфологией ядра по типу "интерфазные мосты" приводит к резкому снижению жизнеспособности клеточной популяции.

Установлено, что анализ морфологических нарушений ядер клеток крови ценных видов рыб Каспийского бассейна является надёжным инструментом для контроля антропогенного влияния на дестабилизацию генома рыб.

Результаты микроэлектрофореза ДНК соматических клеток после электромагнитного и лазерного облучения, а также результаты анализа состояния ДНК семени быков в процессе хранения показали,

что этот метод может быть интегрирован в набор приемов регистрации нарушений морфологии ядер для повышения надёжности оценки уровня дестабилизации генома клеток при генотоксических воздействиях на организм животных.

Впервые установлено, что показатель отношения площади ядра к совокупной площади всех ядрышек кпепси снижается у коров, положительных в РИД.

1.4. Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая значимость полученных результатов заключается в том, что вскрыта способность клеточных популяций отвечать на отбор по дестабилизации генома. Достаточно отбора в 4-5-ти генерациях для направленного снижения или повышения дестабилизации генома клонов клеток. Обнаруженные связи частот интерфазных мостов, микроядер и "хвостатых ядер" свидетельствует о том, что эти элементы нарушений морфологии ядра являются отражением одного процесса - дестабилизации генома клетки. Полученные факты о связи носительства коровами вируса лейкоза с состоянием интерфазных ядрыппсовых организаторов свидетельствует о влиянии вируса на рибосомные цистроны.

Практическая значимость работы состоит в том, что разработанный и апробированный способ отбора клеточных популяций перевивных опухолей на стабильность генома (отбор на частоту клеток с интерфазными мостами) можно использовать в биотехнологическом производстве для генотипической стабилизации клеточных линий. Комплексный подход в оценке частоты нарушений морфологии ядер повышает надежность оценки дестабилизации генома при влиянии физических, химических и биологических факторов внешней среды, в том числе и в оценке экологии.

1.5. Апробация результатов диссертации. Материалы диссертационной работы доложены на 40-й научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава (Астрахань, 1996), 18-м международном хонгрессе генетиков (Пекин, 1998), 17-м международном конгрессе по исследованию рака (Рио-де-Жанейро, 1998), на научно-практической конференции 'Ъклад молодых учёных в решейие задач научного обеспечения АПК Северо-Запада РФ" (Санкт-Петербург-Пушкин, 1999), 11-м международном конгрессе по гистохимии и иммуноцитохимии (Йорк, Великобритания, 2000), 23-й конференции по исследованию полисахаридов (Токио, Япония, 2002), на международной конференции "Сохранение генетических ресурсов" (Санкт-Петербург, 2004), 1-й международной научно-практической конференции (Астрахань, Россия, 2005), на 4-й международной

конференции "Актуальные проблемы биологии в животноводстве" (Боровск, 2006).

1.6. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 44 научные работы, в том числе два патента на изобретения. Работы опубликованы в материалах международных конференций и в журналах: «Генетика», «Доклады Академии Наук», «Доклады РАСХН», «Цитолопм», «Ветеринария», «J. of Cytogenetics Cell Genetics», «Вопросы онкологии», «J. of Neurochemical Research», «Бюллетень экспериментальной биологии и медицины», «J. of Molecular Medicine».

1.7. Структура и объём диссертация. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов, практических предложений и списка литературы из 435 источников, среди которых 330 на иностранном языке. Диссертация изложена на 299 страницах, содержит 43 таблицы, 49 рисунков.

1.8.0сновные положения, выносимые на защиту, -частота клеток с интерфазными мостами в клонах перевивной рабдомиосаркомы РА-23 является наследственно гетерогенной и подвержена селективному отбору на повышение или снижение дестабилизации генома;

-клоны с высокими и низкими частотами интерфазных мостов отличаются между собой по частоте клеток с кариотипическими изменениями и частоте клеток с нарушениями морфологии ядер;

- комбинированное воздействие переменного низкоэнергетического магнитного поля и лазерного облучения влияет на формирование экспериментальных метастазов и частоту интерфазных ЯОР клеток рабдомиосаркомы РА-23 крыс;

- электромагнитные волны гектагерцового диапазона оказывают влияние на функциональное состояние кроветворной и репродуктивной систем;

- показатели морфологических нарушений ядер клеток периферической крови рыб являются значимыми для целей экотоксикологаческого мониторинга;

- мгофоядерный тест и метод "микроэлекгрофорез ДНК одиночных клеток" повышают надёжность оценки нестабильности генома клеток при исследовании влияния переменного низкоэнергетического магнитного поля и лазерного облучения;

-метод "микроэлектрофорез ДНК одиночных клеток" позволяет оценивать стабильность ДНК семени быков; -выявление нарушенной морфологии ядер с использованием цитокинетического. блока позволяет учитывать "скрытую" нестабильность генома у сельскохозяйственных животных;

б

- кариоморфометрические показатели и функциональная активность лимфоцитов периферической крови у коров, положительных в РИД, отличаются от аналогичных показателей здоровых животных.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Все исследованные выборки крупного рогатого скота представляли чёрно-пёструю породу Ленинградской области. Кровь при исследовании лейкоза крупного рогатого скота забирали в плановом порядке и сыворотку для анализа направляли в Межобластную Ветеринарную Лабораторию (Санкт-Петербург) для определения вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) с помощью реакции иммунодиффузии.

Мазки крови рыб семейства карповых и осетровых были получены в ходе экспедиции в Северный Каспий в Каспийском научно-исследовательском институте рыбного хозяйства (г. Астрахань). Первая выборка состояла из 22 сеголетков воблы каспийской, вторая - из 40 особей 2-3 летнего возраста, третья - из 28 зрелых (старше 4 лет) особей того же вида. Четвертая выборка была представлена 23 особями обоего пола осетра русского и белуги 5-7 -летнего возраста.

Облучение электромагнитными волнами, формируемыми путём ударного возбуждения антенны высоковольтным импульсом в системах дистанционного зондирования объектов проводили на экспериментальной установке с использованием подопытных беспородных белых крыс. Животные были разделены на пять выборок, каждая выборка облучалась в определённом режиме. Для оценки эффектов на стабильность генома низкоэнергетического переменного электромагнитного поля и лазерного облучения (аппарат "Рикта", Институт квантовой медицины, г.Москва) были использованы мыши линии ВАЬВ/с.

Для получения легочных экспериментальных метастазов (клонов) рабдомиосаркомы РА-23, приготовленные суспензии вводили в хвостовую вену крыс. Для выявления встречаемости ЧКИМ*, ЧИМК, ЧКМ и ЧКХЯ в каждом клоне анализировали не менее 200 клеток. При проведении эксперимента по влиянию на опухолевые клетки электромагаитого поля и лазерного облучения с использованием в качестве источника аппарата "Рикта" крысам вводили внутривенно по 2000 клеток перевивной органотропной рабдомиосаркомы РА-23 и' грудную клетку животных с формирующимися легочными метастазами подвергали 10-кратному действию электромагнитного и лазерного облучения с помощью аппарата "Рикта-02".

При подсчёте микроядер и морфологических нарушений ядер и лейкоцитарной формулы препараты периферической крови готовили по стандартной методике (Гольдберг, 1975). У крупного рогатого скота — из яремной вены, у рыб - из спинной артерии, у крыс и мышей - из хвостовой вены. На каждом препарате просматривали не менее 200 лейкоцитов. Частоту эритроцитов с микроядрами и частоту эритроцитов с "хвостатыми" ядрами выражали в промилле (%о) и определяли в выборках на 10 тыс. эритроцитов у рыб. ЧЛМ выражали в промилле (%о) и определяли на 100-200 мононуклеаров (лимфоцитов) у быков н тёлок. У мышей ЧПЭМ и ЧЭМ анализировали на 1 тыс. полихроматофильных эритроцитов и на 10 тыс. ортохромных эритроцитов, соответственно, что выражалось в промилле (%о).

Препараты клеток костного мозга получали из тазобедренных косточек подопытных крыс по стандартной методике (Гольдберг, 1975). Анализировали не менее 500 ядросодержащих кроветворных клеток. Из семенников, полученных от самцов крыс, приготовляли отпечатки на предметные стёкла. Частоту встречаемости сперматоцитов с микроядрами и анафазными мостами определяли в "кляч"-препаратах и выражали в процентах (%). Для выявления клеток семенников, подвергшихся гибели в результате апоптоза нами использовался метод микроскопического анализа с использованием окраски акридиновым оранжевым (Прошин и др., 1999).

При анализе ДНК повреждений у мышей при воздействии переменного электромагнитного поля и лазерного облучения на 22-е сутки после начала эксперимента костный мозг извлекали из бедреной кости и ресуспендирован в фосфатно-солевом буфере, не содержащем ионы Са2+ и Mg2+. Для выявления повреждённых костномозговых клеток микроэлектрофорез ДНК и окрашивание нитратом серебра проводили согласно Кизшшан с соавторами (KMlian et al., 1999). В 'препаратах окрашенных нитратом серебра анализировали не менее 150 клеток.

Препараты, предназначенные для выявления ИЯОР проводили по стандартной методике, как предложено ранее (Мамаев, 1998). Для анализа стволовых клеток костного мозга на проточном цитометре использовали антимышиные моноклональные антитела, (RAM34, IgG2a изотип), конъюгированные с Р-фикоэритрином (R-Phycoerythrin). Для иммуноцитохимической реакции использовали моноклональные антитела к ЯАПК и авидан-биотиновую систему с пероксидазой хрена.

Статистическую достоверность оценивали с помощью t-критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Вижоксона-

Манна-Уитни, коэффициент корреляции определяли по Спирмену (Лакин, 1990).

* Список сокращений: ЧКИМ - частота клеток с интерфазными мостами; ЧИМК - частота интерфазных мостов на клетку; ЧКХЯ - частота клеток "хвостатыми" ядрами; ЧКМ -частота клеток с микроядрами; ЧПЭМ - частота полихроматофильных эритроцитов с микроядрами; ЧЭМ - частота эритроцитов с микроядрами; ЧЛМ - частота лимфоцитов с микроядрами; ИЯОР - интерфазные ядрышкообразующие районы хромосом; ЯАПК—ядерный антиген пролиферации клеток.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 3.1. Клональные различия in vivo в клеточньи популяциях субштаммов рабдомносаркомы РА-23 крыс по признаку "частота клеток интерфазными с мостами".

Для проведения отбора на повышение ЧКИМ была использована исходная выборка из 48 клонов, средняя ЧКИМ в которой составила 0,6%, а размах изменчивости от 0,0 до 2,2%. В первый цикл отбора взяли три клона с ЧКИМ от 1,0 до 1,2%. В результате проведения 1-го цикла отбора средняя ЧКИМ составила 0,8%, а размах изменчивости от 0,0 до 3,0%. Три клона с ЧКИМ 2,0%, 2,6% и 3,0% были взяты во 2-ой цикл отбора. Пятый цикл отбора оказался наиболее эффективным: средняя ЧКИМ составила 10,0% из 21 клона-потомка не было встречено ни одного клона, который бы имел частоту интерфазных мостов менее 3,2%. Частота клеток с интерфазными мостами в полученных популяциях клеток рабдомносаркомы повысилась с 0,6 до 10,0%, т.е. в 16,7 раза. Различия между выборками исходных клонов и подвергнутых отбору на повышенную ЧКИМ были достоверны при Р<0,001 (критерий Вилкоксона-Манна-Уитни). Полученные данные свидетельствуют об эффективности искусственного отбора, направленного на повышение частоты встречаемости клеток с интерфазными мостами в клонах субпггамма РА-23.

Отбор клонов субштамма РА-23 на понижение частоты встречаемости в них клеток с интерфазными мостами проводился одновременно и параллельно с первой попыткой отбора клонов РА-23 на повышение ЧКИМ В ходе 5-ти циклов отбора частота клеток с интерфазными мостами изменялась постепенно, не претерпевая существенных колебаний. Фракция клонов с низкими ЧКИМ в ходе отборов увеличивалась. Несмотря на то, что в выборках клонов всех циклов встречались клоны с высокими ЧКИМ (1-2%), однако доля клонов, в которых частота ЧКИМ не превышала 0,2% к 5-му циклу отбора составила 60%. Таким образом, предложенным нами

способом, удаётся заметно понизить частоты клеток с интерфазными мостами в популяциях клонов рабдомиосаркомы РА-23.

Так как после отбора на повышение ЧКИМ стали наблюдаться клетки, в которых регистрировалось несколько интерфазных мостов была проанализирована выборка из 38 клонов. Коэффициент корреляции между показателями "ЧКИМ" и "ЧИМК" составил 0,82 (по 1 - критерию Стьюдента, Р<0,01), что указывает на тесную взаимосвязь между изучаемыми признаками. В результате регрессионного анализа (рис. 1) получено уравнение вида: У(Х)= -0,10+0,25хХ, т.е. изменение частоты клеток с интерфазными мостами на 4% вызывает изменение частоты мостов на клетку на 1%. Эти результаты позволяют сделать вывод о том, что частота интерфазных мостов на клетку закономерно изменяется в зависимости от поведения такого признака как частота клеток с интерфазными мостами.

1.0 3,0 5,0 7,0 9,0

Рис. 1. Уравнение регрессии признака ЧКИМ на признак ЧИМК По оси абсцисс — частота клеток с интерфазными мостами, %; по оси ординат - частота интерфазных мостов на клетку, %.

3.2. Сравнительный анализ показателей кариотнпической изменчивости и метастатический потенциал при селекции клонов РА-23 на повышение и понижение образования клеток с интерфазными мостами.

После проведения 5-ти циклов отбора на повышение и 5-ти циклов отбора на понижение ЧКИМ популяции РА-23 были специально протестированы на метастатический

Рис. 2. Метастатический потенциал клеток РА-23 после 5-ти циклов отбора на повышение (1) и 5-ти циююв отбора на снижение (2) частоты встречаемости клеток, с интерфазными мостами. По горизонтали - доза в/в введённых клеток; по вертикали - число сформированных клонов. Вертикальные отрезки - 95%-ые доверительные интервалы средних значений.

потенциал (рис. 2). Видно, что при всех исследованных прививочных дозах популяции клеток с повышенной ЧКИМ имели достоверно меньший метастатический потенциал, чем популяции клеток с пониженной ЧКИМ (во всех случаях Р<0,05, п=6). При этом, различия по величине метастатического потенциала между линиями с высокой и низкой ЧКИМ были более, чем тридцатикратными. Среднее значение метастатического потенциала клеточной популяции с повышенной ЧКИМ в субштамме РА-23 составило 1,4±0,43, а значение метастатического потенциала клеточной популяции этого субштамма с пониженной ЧКИМ составило 33,6±7,4.

33. Нарушения морфологни интерфазных ядер в виде "хвостатых" ядер в клеточных, популяциях субштамма РА-23.

При селекции на пониженную и повышенную ЧКИМ было выявлено, что клоны с повышенной ЧКИМ характеризуются также и высокой ЧКХЯ, тогда как клоны с пониженной ЧКИМ характеризуются низкой ЧКХЯ (табл. 1).

Таблица. 1. Характеристика клонов рабдомиосаркомы РА-23, полученных после 5 циклов отбора на повышение и 5 циклов отбора на понижение частоты встречаемости клеток с интерфазными мостами.

Номер клона Частота клеток с интерфазными мостами, % Частота клеток с хвостатыми ядрами, %

Клоны после отбора на повышение частоты мостов в интерфазе

А6 11,6 3,6

18,6 7,4

156 16,2 14,4

Р1 12,7 8,6

Е4 17,4 16,8

БЗ 11,2 5,6

Е1 - 11,2 6,6

В5 9,0 5,0

Клоны после отбора на понижение частоты мостов в интерфазе

В9 0,0 0,8

012 0,0 0,6

В7 0,0 0,4

С2 0,0 0,8

С11 0,0 0,6

3.4. Генотоксические факторы в индукции клеток с нарушениями морфологии ядер в клонах рабдомиосаркомы

РА-23.

При анализе кариотипических аномалий в опухолевых клетках отмечено, что циклофосфан (табл. 2) вызывал нарушения в ядрах клеток рабдомиосаркомы РА-23, выражавшиеся, прежде всего, в увеличении ЧКМ и ЧКХЯ - 7,80±0,54 и 0,32±0,11%, соответственно. При этом были зарегистрированы достоверные различия по ЧКМ (0,54±0,10%) и ЧКХЯ (0,04±0,03%) в сравнении с клетками клонов, полученных от крыс, которым вводили изотонический раствор хлорида натрия (0,05<Р<0,01, по непараметрическому критерию Вилкоксона-Манна-Уитни).

Таблица 2. Частота выявленных нарушений морфологии ядер в клетках легочных метастазов рабдомиосаркомы РА-23 крыс при введении циклоферона, циклофосфана и их комбинации.

Показатели Воздействие

Изотонический раствор хлористого натрия Цихлоферон Циклофосфан Циклофосфан + циклоферон

1-ая группа 2-ая группа 3-я группа 4-ая группа

Число изученных клеток 5000 4000 2500 1000

Число клеток с микроядрами 27 292 195 . 42

Процент клеток с микроядрами 0,54 ±0,10 7,3 ± 0,41* 7,8 ±0,54* 4,2 ±0,31*

Число клеток с интерфазными мостами 6 8 б 1

Процент клеток с интерфаз-яыми мостами 0,12 ±0,05 0,2 ±0,07 ОД ±0,1 0,1 ±0,1

Число клеток с "хвостатыми" ядрами 2 10 8 э

Процент клеток с "хвостатыми" ядрами 0,04 ±0,03 0Д6 ± 0,08* 0,32 ±0,11* 0,3 ±0,17*

♦Различие достоверно относительно 1-ой группы (Р<0,05).

3.5. Нестабильность генома клеток при облучении электромагнитными волнами гектагерцового диапазона.

Ряд, проведенных нами исследований касался проблем генетической безопасности электромагнитных излучений. Мы изучили изменения, произошедшие с клетками после облучения электромагнитными волнами гектагерцового диапазона (табл. 3). Так мы обнаружили тенденцию к снижению количества

эозинофилышх лейкоцитов в периферической крови животных после всех режимов облучения. Число моноцитов и клеток лимфоидного ряда наоборот превысило показатели крови крыс в контрольной группе. Частота лимфоцитов изменялась в исследованных группах от 53,0 до 88,0 %. Наиболее низкой она была в контрольной группе. Лимиты варьирования в контрольной группе составили от 54,0 до 82,0 %. Средние частоты достоверно отличались между контрольным и вторым режимом облучения при Р<0,01. Изменчивость частот моноцитов была от 0 до 8,0 %. Сравнение средних частот встречаемости моноцитов показало, что относительно контроля в первой, третьей и четвёртой группах наблюдалось повышение этого показателя. При этом средняя частота моноцитов в контрольной группе достоверно отличалась от средних частот в третьей и четвёртой группах (Р<0,01).

Таблица 3. Лейкоцитарная формула периферической крови крыс.

Группа Эозино-филы, % Нейтро-филы, % Моноцита,'% Лимфоциты, % Разрушенные ядро-содержащие клетки, %

Контроль 2,8±0,73 2б,2±5,63 2,4±0,75 67,6±5,20 1,0±0,31

1 2,31±0,55 20,1±3,11 3,9±0,82 74,6±3,48 0,9±0,16

2 2,78±1,39 14,0±2,88 2,6±1,03 *79,8±3,49 1,0±0,4

3 2,1±0,6 19,4±2,37 *4,0±0,65 72,8±2,59 1,7±0,5

4 1,7М,41 19,8±3,09 *4,3±0,73 73,6±338 0,б±0Д9

*Р<0,01

В отношении клеток половой системы не существует единого мнения по поводу того, являются ли они мишенямидля воздействия электромагнитных полей. Из представленных в табл. 4 данных очевидно понижение количества ядрышек на одну клетку во всех группах облученных животных. В контроле значение этого показателя составило 1,61±0Д1.Число фибриллярных центров (ФЦ) на клетку составило у контрольных животных - 5,39±0,34. В первом, третьем и четвертом режимах мы обнаружили повышение индекса фибриллярных центров. Во втором режиме облучения было наоборот снижение этого показателя. Обращает на себя внимание довольно высокая вариабельность индекса ФЦ, коэффициент вариации достигал 35,5%.

Таблица 4. Изменение показателей пролиферативной активности

спермагоцитов крыс при облучении.

Режи -мы Число ядрышек на 1 клетку Число фибриллярных центров на 1 клетку

Х±тх Лимита Cv,% Xtmx Лимиты Cv,%

1 *1,37±0,09 U-1,7 14,5 **6,43±0,11 3,1-10,4 21,9

2 1,51*0,07 1,3-1,9 16,0 **4,10±0,19 3,1-7,6 15,3

3 **U5±0,06 U-1,7 15,1 *7,20±0,71 4,9-8,4 28,2

4 1,46±0Д5 1 »2-2,1 17,7 5,80±1,03 2,6-6,0 35,5

Контроль 1,61±0,21 1,3-2,4 16,1 5,39±0,34 2,8-7,3 22,6

*Р<0,05; **Р<0,01.

Проведённое исследование (табл. 5) частоты встречаемости апоптоза в клетках семенников позволило выявить потенциальные изменения, имевшие место в «легочных популяциях после воздействия облучения. Среднее значение частоты клеток семенников в апоптозе составило в контрольной группе - 0,06%. Как следует из представленных данных, в группах животных

Табл. 5. Частота апоптоза in vivo в клетках семенников крыс, подвергнутых облучению.

Коту роль Режимы облучения

Режим 1 Режим 2 Режим 3 Режим 4

X±mx 0,06«),04 0,1б±0,08* 0,82*0,29» 0Д0±0,09* 0,08±0,05*

Лимиты 0,00-0,80 0,00-0,80 0,05-3,00 0,00-0,70 0,00-0,50

*0,05<Р<0,01 (U-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

первого, второго и третьего режимов облучения наблюдалось повышение частоты апоптотически изменённых клеток семенников. А в четвертом незначительное понижение. Несмотря на достаточно высокую вариабельность исследованного показателя, статистический анализ с использованием непараметрического II-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни обнаружил достоверность различий на достаточном в биологических исследованиях уровне (0,05<Р<0,01), что позволяет сделать вывод о положительном

влиянии электромагнитного облучения в данных режимах на частоту апоптоза в клетках.

3.6. Нестабильность генома эукариот при воздействии низкоэнергетического электромагнитного поля и лазерного

облучения.

3.6.1. Характеристика морфологии ядер в нормальных и опухолевых клетках при сочетанием воздействии ннзкоэнергетического электромагнитного поля и лазерного

излучения.

Результаты по исследованию встречаемости эритроцитов с микроядрами у крыс показывают (табл. 6), что в контроле ЧЭМ составила 0,11 ±0,008%, в то время как в опытных группах при экспозиции 1 мин этот показатель составлял 0,16±0,018%, а при экспозициях 2,5 и 10 мин - 0,20,0,18 и 0,15%, соответственно.

Табл. 6. Частота эритроцитов с микроядрами в крови крыс под влиянием электромагнитного поля и лазерного облучения._.

Режим облучения Число - крыс Частота микроядер (%о) Лимиты СУ

Контроль 31 0,11±0,008*,**, 0-0,30 40,4

1 мин 29 0,16±0,018 0-0,41 60,5

2 мин 28 0,20±0,021 0-0,62 55,5

5 мин 28 0,18±0,016 0-0,33 47,0

10 мин 29 0,15±0,010 0,1-0,2 35,9

♦Различие достоверно относительно группы облучаемой в течение 2 мин (Р<0,001); •♦различие достоверно относительно группы облучаемой в течение 5 мин (Р<0,001); ♦♦♦различие достоверно относительно группы облучаемой в течение 10 мин (Р<0,01).

Достоверными оказались различия между группой контроля и группами с режимами облучения 2, 5 и 10 мин при Р<0,001, Р<0,001 и Р<0,01, соответственно. Облучение не привело к достоверным изменениям числа и размера формирующихся в лёгких экспериментальных метастазов, хотя среднее число экспериментальных метастазов на 1 животное в опытных труппах было несколько выше, чем в контрольной (см. табл. 7). Вместе с тем,

следует отметить, что в группе животных с режимом облучения 10 мин средняя частота опухолевых клеток с микроядрами (ЧКМ) (6,4±0,35%) достоверно отличалась от аналогичного показателя контрольной группы, где ЧКМ составила 5,4±0,32%.

Табл. 7. Влияние электромагнитного поля и лазерного облучения на формирование экспериментальных метастазов рабдомиосаркомы РА-23 крыс в лёгких привитых животных (10-кратное облучение, 10-

Режим облучения Число крыс Число метастазов Частота клеток с микроядрами, %

Контроль 31 30,4±4,03 5,4±0,32

1 мин 29 35,3±3,92 5,2±0,31

2 мин 28 42,8±7,57 5,6±0,33

5 мин 28 37,6±4,14 5,0*0,31

10 мин 29 36,2±4,72 6,4±0,35*,»»,»»»,»»»»

»Различие достоверно относительно контрольной группы (Р<0,01); * »различие достоверно относительно группы облучаемой в течение 1 мин (Р<0,01); »»»различие достоверно относительно группы облучаемой в течение 2 мин (Р<0,05); ♦"'»»различие достоверно относительно группы облучаемой в течение 5 мин (Р<0,001).

3.6.2. Нарушения морфологии ядер, выявляемых в эритроцитах периферической крови и в клетках костного мозга у мышей

линии ВАЬВ/с при сочетанном воздействии низкозпергетнческого электромагнитного поля и лазерного

облучения.

Имеются сведения о возможных эффектах влияния низкочастотного переменного электромагнитного поля и лазерного облучения, влияющих на клеточный геном, с индукцией его разнообразных изменений. Как следует из табл. 8. ЧПЭМ на 15-е сут после начала эксперимента в группе самцов, подвергавшихся ежедневному облучению в течение 10 мин достоверно отличалось от контрольной группы животных (р<0,01), а также от аналогичных показателей групп животных с экспозицией 1 мин (Р<0,05) и 5 мин (Р<0,01). Вместе с тем, на 22-е сут эксперимента в группе самцов

Таблица 8. Частота полихроматофильных эритроцитов с микроядрами у мышей (самцы) линии ВАЬВ/с (15-е и 22-е сутки

Время облучения Частота полихроматофильных эритроцитов с микроядрами

15-е сутки 22-е сутки

М±т,96о СУ М±т,96о СУ

10 мин 2,60±0,34**''т 41,4 1,40*0,21*""" 48,1

5 мин 1,00±0,23 73,3 0,60±0,16 84,6

1 мин 1,50±0,30 63,4 0,70±0Д8 82,2

Контроль 0,95±0,2б 71,9 1,00±0,15 47,7

"различие достоверно относительно группы, облучаемой в течение 5 мин (р<0,01); ***различие достоверно относительно группы, облучаемой в течение 1 мин (р<0,05); различие достоверно относительно группы, облучаемой в течение 5 мин (р<0,05).

подвергшихся облучению в течение 10 мин было зарегистрировано снижение средней ЧПЭМ до 1,40 %о, что не показало существенных различий по сравнению ЧПЭМ контрольной группы. Однако, по сравнению с ЧПЭМ групп мышей, облучаемых в течение 1 и 5 мин на 22-е сут эксперимента различия сохранялись (Р<0,05, в обоих случаях). На 15-е. сут эксперимента средняя ЧПЭМ в группе самок (табл.9), подвергавшихся ежедневному 10-минутному облучению

Таблица 9. Частота полихроматофильных эритроцитов с микроядрами у мышей (самки) линии ВАЬВ/с (15-е и 22-е сутки

Время облучения Частота полихроматофильных эритроцитов с микроядрами

15-е сутки 22-е сутки

М±Ш,%о Су . М±ш,96о Су

10 мин 2,40±0,33'" 43,0 38,2

5 мин 1,00±0,26 81,2 1,КУЮ,17 49,1

1 мин 1,70*0,29 55,6 1,00±0,17 52,8

Контроль 1,оо±ол 66,4 1,10*0,16 44,8

♦♦различие достоверно относительно группы, облучаемой в течение 5 мин (р<0,05); "различие достоверно _ относительно труппы,

облучаемой в течение 1 мин (р<0,05); относительно контрольной группы (р<0,05).

различие достоверно

достоверно отличалась от аналогичного показателя контрольной группы и, хотя, на 22-е сут эксперимента наблюдалась тенденция к снижению ЧПЭМ для группы с ежедневным 10-минутным облучением до 1,8 %о, однако, различия по сравнению с ЧПЭМ контрольной группы сохранялись (р<0,05).

3.63. Эффекты, вызываемые сочетанным воздействием низкоэнергетического электромагнитного поля и лазерного облучения на клетки костного мозга, положительные по антигену СЮ34+, и репарацию кожи.

Частота стволовых клеток костного мозга в контрольной группе мышей, выявленная с использованием крысиных монокпональных антител, направленных ' против мышиных антигенов СБ34 (11АМ34) варьировала от 1,8 до 3,3% и, как следует из табл. 10, в среднем составила 2,53±0,07%.

В группе с длительностью экспозиции к сочетанному воздействию низкоэнергетического переменного магнитного поля и лазерного излучения в 1 мин частота Стволовых клеток варьировала от 1,7 до 3,1%, а средний показатель составил 2,52±0,15%, что не отличалось существенно от аналогичного показателя контрольной группы (Р>0,05, ^критерий Стьюдента). Средняя частота стволовых клеток, определённая для группы мышей с длительностью экспозиции 5 мин частота стволовых клеток составила 2,52±0,18%, что также существенно не отличалось от среднегопоказателя (2,53±0,07%) контрольной группы (Р>0,05, ^критерий Стьюдента). В экспериментальной группе с длительностью экспозиции 10 мин не выявлялись животные, у которых частота стволовых клеток в костном мозге была бы ниже уровня 2,2%. При этом, выявлялись особи (более 15% от числа группы), у которых частота клеток костного мозпц выявляемых с помощью монокпональных антител СЮ34 (НАМ34) составляла не менее 3,5%. Средний показатель составил 2,79±0,16%, что, однако, достоверно не отличается от аналогичного показателя контрольной группы (Р>0,05, ^критерий Стьюдента). Вместе с тем, можно говорить о выраженной тенденции в повышении популяции' СОЭ4 (ИАМ34) позитивных клеток костного мозга у мышей с длительностью экспозиции 10 мин под влиянием магнито-лазерного облучения на фоне стандартизованной травмы кожи.

Таблица 10. Частота (%) стволовых СБ34 позитивных клеток костного мозга мышей. _

- № Контроль Время экспозиции

1 мин 5 мин 10 мин

1 2,4 2,6 2,8 2,5

2 3,3 2,4 2,2 3,1

3 2,8 1,7 2,4 2,2

4 1,9 2,6 2,2 2¿

5 2,5 3,0 1,9 3,5

6 2,3 2,6 3,7 2,7

7 2,6 3,1 2,1 3,9

8 3,3 2,6 3,1 2,4

9 1,8 2,1 1,9 2,3

10 2,3 2,5 2,8 2,8

И 2,7 2,6 2,5 3,0

М±т 2,53±0,07 2,52±0,15 2,52±0,18 2,79±0,16

3.7. Нарушении морфология ядер клеток периферической крови in vivo в эксперименте на рыбах

Несомненный интерес представляет этап работы по изучению границ спонтанной хромосомной нестабильности у рыб Каспийского бассейна. Как свидетельствуют данные, приведённые в табл. 11, существуют достоверные различия по частоте микроядер и частоте "хвостатых" ядер между исследованными видами рыб.

Сравнение частот нестабильности генома между самками и самцами у карповых свидетельствует (табл. 12), что в крови самцов частота эритроцитов с микроядрами, а также частота эритроцитов с

Таблица. 11. Сравнение частот нестабильности генома между двумя видами рыб._,___

Частота эритроцитов с Частота эритроцитов с

микроядрами, %о "хвостатыми" ядрами, %о

п Х±х Х±х

Карп 99 3 1,22±0,07 *0,27±0,02

Осётр 24 *1,45±0,16 0ДЗ±0,04

*Р<0,01

Таблица. 12. Сравнение частот нестабильности генома между полами у карповых рыб.__

Частота эритроцитов Частота эритроцитов с

микроядрами, %о "хвостатыми" ядрами, %о

N Х±х Х±х

9 49 1,24±0,12 0,27±0,04

а 41 ♦1,27±0,11 ♦0,28±0,03

♦Р<0,05

Таблица 13. Сравнение частот нестабильности генома между

полами' у осетровых рыб.

Частота эритроцитов с микроядрами, %> Частота эритроцитов с "хвостатыми'' ядрами, 96о

N Х±х Х±х

$ 6 15 8 1,55±0,19 ♦0,97±0,08 0,21±0,02 ♦♦0,24*0,09

*Р<0,01; **Р<0,05

"хвостатыми" ядрами достоверно выше, чем у самок. У осетров (табл. 13) самцы также отличались повышенной частотой микроядер в эритроцитах (Р<0,01). В отношении признака "частота эритроцитов с хвостатыми ядрами" наблюдалась та же закономерность: самцы достоверно отличались от самок по изучаемому признаку (Р<0,05).

3.8. Исследование антропогенной нагрузки на геном сельскохозяйственных животных.

Как следует из табл. 14. в опытной культуре лимфоцитов только у одного быка выявлены микроядра в мононуклеарных клетках, тогда как в бинуклеированных лимфоцитах микроядра обнаружены у четырёх быков с варьированием частоты от 0 до 5%о. В среднем в контрольной культуре лимфоцитов спонтанная частота клеток с микроядрами была выше, чем в опытной культуре одноядерных лимфоцитов на 2,18%о и двуядерных - на 0,3%о соответственно.

В контрольной и опытных культурах лимфоцитов телок микроядра выявлены и в мононуклеарных, и в бинуклеированных клетках (табл. 15). В контрольной культуре спонтанная ЧЛМ варьировала от 7 до 19%о, а в опытной культуре - от 5 до 25%о. Частота бинуклеированных лимфоцитов с микроядрами изменялась

от 14 до 44%о. У телок значение показателя ЧЛМ в опыте превышает таковое в контроле на 4,4%о.

Таблица. 14. Частота встречаемости микроядер в крови быков чёрно-пёстрой породы in vitro с использованием цитохалазина В._

Контрольная Культура лимфоцитов in vitro с

Номер культура использованием цитокинетического

живот- лимфоцитов блока

ного in vitro

Число Часто- Число Частота Число Часто-

мово- та лим- моно- лимфо- бинук- та лим-

нук- фоцитов нуклеа- цитов с леиро- фоцитов с

леаров с микро- ров микрояд- вапных микро-

ядрами, рами, %о клеток ядра-

%, ми, %п

1006606 610 0,0 775 0,0 300 0,0

58767 695 0,0 805 0,0 330 0,0

741450 650 0,0 765 U 305 5,0

559583 305 3,3 740 0,0 300 2,3'

78087 300 7,6 700 0,0 300 3 Л

6176 300 3,3 940 0,0 420 2,0

£2860 2,4±1Д' £4725 0Д2±0Д2 £1955 2,1±0,8*

*Р<0,05

Таблица 15. Частота встречаемости микроядер в крови тёлок чёрно-пёсгрой породы in vitro с использованием цитохалазина В._

. Контрольная Культура лимфоцитов in vitro с

Номер культура использованием цитокинетического блока

живот- лимфоцитов

ного in vitro

Число Частота Число Частота Число Частота

моно- лимфоци- моно- лимфоци- бинук- лимфоци-

иук- тов с мик- нукле- тов с мик- леиро- тов с мик-

леа- роядра- аров роядра- ванпых роядра-

ров ми, %о ми, %0 клеток МИ, %о

2604 750 15,0 900 8,0 200 14,0

2544 1000 19,0 1000 7,0 120 44,0

2627 1000 7,0 750 5,0 165 16,0

2603 1005 17,0 1005 15,0 355 18,5

2635 1005 15,0 750 25,0 120 42,0

2575 1000 12,0 1000 11,0 250 14,0

2601 1000 14,0 1000 5,0 180 11,0

£7760 14,1±1,4 £6905 10,8±2,7 £500 18,5±6,4*

*Р<0,05

3.9. Морфофункциональная характеристика лимфоцитов периферической крови коров при поражении вирусом лейкоза

крупного рогатого скота. 3.9.1. Интерфазные ядрышкообразующие районы лимфоцитов коров при ВЛКРС Результаты, представленные в табл. 16 свидетельствуют, что средний показатель индекса ИЯОР у животных, положительных в РИД (РИД+), из хозяйства "Детскосельский" составил 2,25±0,10, тогда как аналогичный показатель для животных, которые отрицательны в РИД (РИД-), ИЯОР не превысил 1,73±0,23 (различие достоверно при Р<0,01). Интересно отметить, что индекс ИЯОР для РИД+ животных из хозяйства "Красная славянка", с дважды подтверждённым вирусоносительством варьировал от 2,50 до 3,86 и в среднем составил 3,15±0,08; тогда как индекс ИЯОР для группы РИД- животных варьировал от 1,01 до 2,58 и в

Таблица 16. Индексы ИЯОР в лимфоцитах периферической крови

Хозяйство Индексы ИЯОР

РИД- РИД+

"Детскосельский" 1,73 ±0,23 *2,25 ± 0,10

"Красная славянка" (I) (Щ 1,82 ±0,02 2,01 ±0,07 **3,15 ± 0,08 ***4,22±0,35

"Пушкинское" 1,91 ±0,15 ♦2,85 ±0,11

"Большевик" 3,12 ±0,12

I -первое исследование; П - второе исследование. *Р<0,01; **р<0,005; ♦**р<0,001 (различия достоверны относительно сравниваемых групп животных (см. результаты), отрицательных в РИД).

среднем составил 1,82±0,12 (различие достоверно при Р<0,005). Через год индекс ИЯОР проанализированный в оставшейся группе ) из 10 РИД+ животных уже варьировал от 3,62 до 4,62 и составил в среднем 4,22±0,35, тогда как аналогичные показатели для контрольной группы варьировали от 1,85 до 2,86, а средний индекс ИЯОР составил 2,01±0,07 (различие достоверно при Р<0,001). Некоторую тенденцию в увеличении индекса ИЯОР для контрольной группы можно, по-видимому, объяснить увеличением возраста данной группы животных. Данные, полученные в

результате исследования 20 животных из учхоза "Пушкинское" положительных в РИД свидетельствуют, что индекс ИЯОР, составивший 2,85±0,11, достоверно (Р<0,01) отличался от среднего значения для контрольной группы - 1,91±0,15 (22 головы). Результаты исследования 6 животных, положительных в РИД, го племенного совхоза "Большевик" показывают, что индекс ИЯОР составил 3,12±0Д2, что достоверно отличается от аналогичных показателей для всех исследованных контрольных групп при Р<0,001.

3.9.2. Гетерогенность лимфоцитов периферической крови коров по частоте интерфазных ядрышкообразующих районов в ядре.

В табл. 17 представлены данные относительно анализа ИЯОР в цитологически различных субпопуляциях лимфоцитов из крови коров, положительных в РИД. В крови больных животных выявлялись не только лимфоциты, которые мы обозначаем как лимфоциты с округлой (регулярной) формой ядра, но и лимфоциты с

Таблица 17. . Индексы ИЯОР в различных цитологически верифицируемых субпопуляциях лимфоцитов у коров, положительных в РИД.

Популяции и субпопуляции лимфоцитов Животные (N=7)

1 2 3 4 5 б 7

Общая популяция 2,62 3,11 3,33 3,50 3,42 3,39 3,17

Субпопуляция с регулярной формой ядра 2,56 3,05 3,26 3,29 3,33 3,25 3,13

Субпопуляция с нерегулярной формой ядра* 3,16 3,90 3,77 5,05 Л 4,26 4,21 3,27

*0,05<Р<0,01, различие достоверно относительно субпопуляции лимфоцитов с регулярной формой ядра (Ц-критерий Вилкоксона-Манна-Уигни).

лобулированными ядрами, с ядрами причудливой формы, которые мы обозначаем как лимфоциты с атипичной (нерегулярной) формой ядра. Как показывают результаты анализа, индекс ИЯОР в

субпопуляциях лимфоцитов с регулярной морфологией ядра не превышал 3,33, тогда как в субпопуляции лимфоцитов с атипичной морфологией ядра индекс ИЯОР варьировал от 3,16 до 5,05 (0,05<Р<0,01, по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни).

ВЫВОДЫ

1. В результате 5-ти циклов отбора клонов перевивной рабдомиосаркомы крыс субштамма РА-23 на повышенную частоту клеток с интерфазными мостами средняя частота клеток с интерфазными мостами повысилась с 0,8% до 10,0%. За 5 циклов отбора клонов перевивной рабдомиосаркомы крыс субштамма РА-23 на понижение частоты клеток с интерфазными мостами средняя частота клеток с интерфазными мостами в популяциях понизилась с 0,8% до 0,3%.

2. В процессе отбора клеточных популяций на повышение частоты клеток с интерфазными мостами и отбора клеточных популяций на понижение частоты клеток с интерфазными мостами наблюдается положительная связь этого признака с частотами патологических митозов и клеток с нарушениями морфологии ядра (микроядра, "хвостатые" ядра). Следовательно, частота клеток с интерфазными мостами в клеточных популяциях перевивной рабдомиосаркомы крыс РА-23 является информативным показателем нестабильности клеточного генома.

3. Между признаками "частота клеток с интерфазными мостами" и "частота клеток с 'хвостатыми' ядрами" существует сильная положительная связь (г=Ю,85, Р<0,01). Следовательно, спонтанная частота клеток с "хвостатыми" ядрами в клеточных популяциях перевивной рабдомиосаркомы крыс РА-23 является информативным показателем нестабильности клеточного генома.

4. Облучение низкоэнергетическим электромагнитным полем в сочетании с лазерным облучением в оптимальном режиме снижает частоту формирования метастазов и числа ядрышек на одну клетку.

7. При электромагнитном облучении волнами гектагерцового диапазона в периферической крови подопытных крыс наблюдалось достоверное повышение содержания лимфоцитов и моноцитов.

8. В клетках костного мозга крыс, подвергшихся облучению электромагнитными волнами гектагерцового диапазона выявлено снижение в костном мозге содержания эозинофилов и нейтрофилов и, наоборот, повышение содержания гемогистобластов, метамиелоцитов, лимфоцитов и нормобластов (Р<0,05, ^критерий Стъюдента).

9. В популяции клеток семенников животных, подвергшихся облучению волнами гектагерцового диапазона, выявлено

повышение частоты клеток с апоптотическими изменениями (0,05<Р<0,01; U-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

10. При комбинированном воздействии низкоэнергетического переменного магнитного поля и лазерного облучения выявлена тенденция в повышении частоты эритроцитов с микроядрами у мышей с режимом облучения 1, 5 и 10 мин.

11. При комбинированном воздействии переменного низкоэнергетического магнитного поля и лазерного облучения методом микроэлектрофореза ДНК соматических клеток выявлено достоверное (0,05<Р<0,01, критерий Вилкоксона-Манна-Уитни) повышение частоты клеток с повреждениями в костном мозге у мышей с режимом облучения 10 мин.

12. При комбинированном воздействии переменного низкоэнергетического магнитного поля и лазерного облучения в группе мышей с режимом облучения 5 мин выявлен наиболее выраженный эффект заживления кожи при стандартизованной травме (20,8±2,26; Р<0,001, t-критерий Стъюдента).

13. При комбинированном воздействии переменного низкоэнергетического магнитного поля и лазерного облучения выявлена тенденция в повышении концентрации стволовых CD34 клеток костного мозга у мышей с режимом облучения 10 мин.

14. Спонтанная частота эритроцитов с микроядрами в популяциях карповых рыб Каспийского бассейна составила 1,22±0,07%о, в популяциях осетровых рыб - 1,45±0,16%о. Определены частоты встречаемости "хвостатых" ядер у карповых (0Д7±0,04%о) и у осетровых (0,28±0,03%о). Выявлены достоверные межполовые различия по частоте эритроцитов с микроядрами в выборке осетровых рыб (Р<0,05, t-критерий Стъюдента).

15. Выявлены различия в ipynne тёлок по частоте клеток с микроядрами между популяцией лимфоцитов-мононуклеаров и бинуклеированными лимфоцитами, полученными с использованием цитокинетического блока.

16. В выборке коров, положительных в РИД, обнаружено достоверное увеличение числа ядрышек на одну клетку в лимфоцитах in vivo. Показано, что с помощью индекса "отношение площади ядра к площади интерфазных ядрышкообразующих районов" можно достоверно выявить различия между лимфоцитами от коров, отрицательных и положительных в РИД.

17. Метод иммуноцитохимического анализа достоверно выявил различия по степени проявления ядерного антигена пролиферации клеток в лимфоцитах периферической крови коров, отрицательных и положительных в РИД, что свидетельствует о разном функциональном статусе генома указанных хрупп коров.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Рекомендуется использование показателя "частота клеток с 'хвостатыми' ядрами" в качестве количественного критерия определения нестабильности генома эукариотических клеток как на спонтанном уровне, так и при генотоксическом воздействии на клеточные популяции in vitro и in vivo.

2. Предлагается использовать метод окрашивания клеток нитратом серебра при микроэлектрофорезе ДНК одиночных клеток в сочетании с регистрацией кариоморфометрических показателей как дополнительный подход, позволяющий оценить воздействие генотоксичеких факторов на функцию и стабильность клеточного генома.

3. Применение показателей частота клеток с "хвостатыми" ядрами, эритроцитов с микроядрами и частота эритроцитов с "хвостатыми" ядрами (для эритроцитов рыб) необходимо учитывать при экотоксикологическом мониторинге рыбных ресурсов.

4. Рекомендуется использование метода иммуноцитохимического анализа на клетках периферической крови для выявления ядерного антигена пролиферации клеток у коров положительных в РИД.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Proshin S.N., Kravtsov V.Yu., Novitskiy V.V., üinskikh NJSÍ. The study of micronuclei level in human normal and tumor cells // Abstr. of IntCongress of Human Genetics. - Washington. -1992. - N.324.

2. Пропган СЛ., В.Ю. Кравцов. Субклонирование по признаку признаку "частота клеток с мостами" в клеточных популяциях перевивной рабдомиосаркомы РА-23 !фыс И Мёжд. Симп. Молекулярная генетика и биотехнология в оценке и изменении геномов сельскохозяйственных животных. - 1994. -С.-Петербург. - С.90-91.

3. О возможности выявления частот возникновения хромосомных аберраций в экстремальных условиях с помощью краткосрочных цитогенетических методов in vivo / Федорцева Р.Ф., В.Ю. Кравцов, С.Н. Прошин и др. II Вторая межд. Научно-практическая конференция. - 1995. - г.Надым (Россия). - С.58.

4. Исследование частоты микроядер в клетках костного мозга и эритроцитах периферической крови у детей с детей с ортопедической патологией / Дудин М.Г., Прошин С.Н., Кравцов В.Ю. и др. // Материалы Всероссийской научно-практической конференции детских ортопедов-травматологов. -

1995. - С.-Петербург. - С.293-294.

5. Реакция костной ткани на изменение регионарного кровотока в условиях хронического эксперимента / Дудин MX., Ярошевская Е.Н., Прошин СЛ. и др. // Материалы Всероссийской научно-практической конференции детских ортопедов-травматологов. -

1996. - С.-Петербург. -Казань. - С.204-207.

6. Кравцов В.Ю., С.Н. Прошин, М.Г. Ольнев, А.Ф. Яковлев. О возможности селекции на стабильность генома клонов эукариотических клеток // ХХХХ Научно-практическая конференция профессорско-преподавательского состава. - 1996.

- Астрахань. - С.17.

7. Прошин С.Н., Кравцов BJO., Яковлев А.Ф., Каминская EJB., Бахтин Ю.Б. Селекция in vivo по признаку "частота клеток с мостами" в клеточных популяциях рабдомиосаркомы РА-23 крыс // Генетика. - 1996. -132. - №.3. - С.352-356.

8. Частота клеток с полумостами в клеточных популяциях in vivo / Кравцов BJO., Прошин С.Н., Федорцева Р.Ф. и др. // Доклады Академии Наук. - 1996. - Т.350. - №.6. - С.831-833.

9. Proshin S, Pavlova V, Mamaev N. Comparison of nuclear features and cytogenetic findings in patients with myelodysplastic syndrom (MDS). ЖХ Symposium of the International Association for Comparative Research on Leukemia and Related Diseases // Journal of Molecular Medicine. - 1997. - Vol.75. - №.7. - B160.

10. "Tailed" shape of nucleus as a possible indicator of chromosome aberrations / Kravtsov V.Yu., Starkova E.V., Proshin S.N. et al. // Cytogenet Cell Genet - 1997. - Vol.77. - №.1-2. - P.7.

11. Genomic stability of tumour cells of rat rhabdomyosarcoma with different levels of tumorogenioucity / Vakhtin YilB., Kaminskaya E.V., Proshin S.N. et al. // In: "Molecular determinants of cancer metastasis" (Abstracts) 50й1 Annual Symposium on Fundamental Cancer Research. Houston. - Texas. - USA. - 1997. - P. 122.

12. Кравцов В.Ю., Прошин C.H., Яковлев А.Ф., Каминская EJB., Бахтин Ю.Б. Мосты и многополюсные митозы в популяциях клеток рабдомиосаркомы РА-23 крыс // Бюллетень Экспериментальной Биологии и Медицины. - 1997. - Т. 123.-'№.5.

- С.569-572.

13. Прошин СЛ., Кравцов В.Ю., Ольнев MX., Яковлев А.Ф., Бахтин Ю.Б. Хромосомные мосты и "хвостатые" ядра в

популяциях злокачественных клеток // Генетика. - 1998. - Т.34. -№.1. -С.61-64.

14.ProshinS, KaminskayaE, VakhtinYu, KravtsovV, YakovlevA. Cells with "trailed nuclei" as markers of the breakages of the chromosome bridges // XVIII International Congress of Genetics. - 1998. -Beijing. - China. - P.32.

15. Mutagenecity and tumorigenecity in cells of lung metastases of rat rhabdomyosarcomas / Kaminskaya E.V., Vakhtin Yu.B., Proshin S.N. et al. // 17th International Cancer Congress. - 1998. - Rio de Janeiro -Brazil.-P.216.

16. AgNORs in cardiomyocytes from surgical patients with coronary heart disease / Mamaev N.N., Kovalyeva O.V., Proshin S.N. et al. // J Clin Pathol:Mol Pathol. -1998. - Vol.51. - №.4. - P.218-221.

17. Репродуктивная гибель клонов и популяций перевивной рабдомиосаркомы РА-23 крыс при повышении спонтанных частот кариотипических изменений с помощью искусственного отбора in vivo / Каминская Е.В., Кравцов BJO., Прошив С.Н. и др. // В кн.: Гомеостаз человека, экологическая безопасность и проблемы рака. -Алма-Ата, Республика Казахстан. - 1999.- С.238-240.

18. Частота встречаемости микроядер у быков производителей при лечении нейропротектором зооланом / Гаврилов Б.А., Косякова Г.П., Прошин С.Н. и др> // Научно-практическая конференция "Вклад молодых учёных в решение задач научного обеспечения АПК Северо-Запада РФ". - 1999. - Санкт-Петербург-Пушкин. - С.83-84.

19. Функциональная оценка гемопоэза крупного рогатого скота методом окрашивания ядрышковых организаторов серебром / Гаврилов Б.А., Старожилова Т.П., Прошин СЛ. и др. // Актуальные проблемы ветеринарной науки: Тез.докл. МВА им. КЛСкрябина. - 1999. - 251 с.

20. Прошин СЛ., Смирнова Т.А., Яковлев А.Ф. Прижизненное исследование программируемой клеточной смерти (апоптоза) в клетках гранул ёзы фолликулов, крупного рогатого скота с помощью дифференциального окрашивания акридиновым оранжевым // Актуальные проблемы ветеринарной науки: Тез.докл. МВА им. К.И.Скрябина. -1999. - 251 с.

21. Прошин С.Н., Гаврилов Б А., Косякова Г.П., Яковлев А.Ф. Применение микроядерного анализа с цитохалазиновым блоком для оценки влияния экологических факторов на геном крупного рогатого скота // Научно-практическая конференция "Вклад молодых учёных в решение задач научного обеспечения АПК Северо-Запада РФ". -1999. - Санкт-Петербург-Пушкин. - С.84-85.

22. Proshin S.N., Smimova T.A., Kuzmina T.I., Yakovlev A.F. Vital study of Bovine granulosa cells during follicular development by differential staining with acridine orange for detection of apoptosis // The 50th Annual Meeting of the European Association for Animal Production. - 1999. - Zurich, Switzerland. - P.328.

23. Влияние циклоферона на метастазирование карциномы лёгких Льюис у мышей и рабдомиосаркомы РА-23 у крыс / Забежинский М.А., Коваленко А.Л., Прошин СЛ. и др. // Вопросы онкологии. -1999. - Т.45. - №.6. - С.650-654.

24. Hie effects of okadaic acid on structure of nucleolar organizing regions (AgNORs) and nuclei in tumor cells of rhabdomyosarcoma RA-23 rats observed by light and fluorescent microscopy / Proshin S.N., Kaminskaya E.V., Kuzovatov S.N. et al. // XI International Congress of Histochemistry and Cytochemistry. - 2000. - University of York, UK.-P.100.

25. Прошин СЛ., Гавршюв Б.А., Косякова Г.П., Яковлев А.Ф. Исследование частоты микроядер лимфоцитов крупного рогатого скота с использованием цитокинетического блока // Доклады РАСХН. - 2000. - №.6. - С.37-38.

26. Связь функциональной активности и апоптоза клеток периферической крови крупного рогатого скота / Прошин СЛ., Косякова Г.П., Смирнова ТА. и др. // Актуальные проблемы биологии в животноводстве. - Тез. Докл. - Боровск. - 2000. - С.421.

27. Активность рибосомных цистронов лимфоцитов крови при лейкозе / Прошин СЛ., Гаврилов Б.А., Старожилова Т.П. и др. // Ветеринария. - 2001. - №.2. - С.25-27.

28. Структурные преобразования интерфазных ЛОР в опухолевых клетках рабдомиосаркомы РА-23, индуцированные окадаиковой кислотой / Прошин СЛ., Каминская Е.В., Кузоватов С.Н. и др. //Цитолошя. -2001. - Т.43. -№.8. - С.738-741.

29. Изучение стабильности генома крупного рогатого скота методом микроядерного тестирования / Шумов А.В., Федоркова Н.В., Прошин СЛ. и др. // Тезисы докладов международной научной конференции: "Современные проблемы селекции и племенного дела в животноводстве". - 2002. - ВНИИГРЖ, Санкт-Петербург. - Россия. - С.111-113.

30. Proshin S., Yamaguchi К., Wada Т., Miyagi Т. Modulation of neuritogenesis by ganglioside-specific sialidase in human neuroblastoma NB-1 cells // The 23rd Japanese Carbohydrate Research Meeting. - 2002. - Yokohama, Japan. - P.237.

31. Proshin S., Yamaguchi K., Wada Т., Miyagi T. Modulation of neuritogenesis by ganglioside-specific sialidase (Neu 3) in human neuroblastoma NB-1 cells //Neurochem Res. - 2002. V.27. - C.841-846.

32. Анализ структурно-функционального состояния ядрышковых организаторов кардимиоцитов, фибробласто-подобных клеток и эндотелиоцитов у пациентов с наследственной обструктивной гипертрофической кардиомиопатией / Алмазов В.А., Гудкова А.Я., Прошин С.Н. и др. // Терапевтические архивы. - 2002. - Т.74. J6.ll.-С. 56-59.

33. Морфофункциональные особенности миокарда и ' экспрессия аргентофильных белков областей ядрышковых организаторов кардиомиоцитов и стромальных клеток у больных семейной формой идиопатической рестриктивной кардиомиопатии / Гудкова А.В., Шляхто Е.В., Прошин С.Н. и др. // Цитология. - 2003. - Т.45. - №.9. - С.867-868.

34. Аномалии интерфазных ядер и частота ядрышкоорганизующих районов хромосом в популяциях опухолевых клеток рабдомиосаркомы РА-23 крыс при отборе этих клеток на чувствительность и резистентность к окадаиковой кислоте / Косякова ГЛ., Прошин С.Н., Кузоватов С.Н. и др. // Цитология. -2003. - Т.45. - №.9. С.889.

35. Клинико-диагностические возможности метода микроэлектрофорез ДНК одиночных клеток (comet assay) для оценки целостности ДНК сперматозоидов / Степанов Г.В., Прошин СЛ., Кравцов В.Ю. и др. // Сборник науч. работ / "Актуальные проблемы биологии". - Сибирский гос. Мед. Университет (Томск). - 2004. - Т.З. - № 1. - С. 64-65.

36. Изменение частоты аномалий интерфазных ядер и ЯОР в популяциях опухолевых клеток рабдомиосаркомы РА-23 крыс при отборе на чувствительность и резистентность к окадаиковой кислоте / Косякова Г.П., Прошин СЛ., Гаврилов Б.А. и др. // Сб. науч. тр. "Селекционно-генетические методы повышения продуктивности сельскохозяйственных животных". - ГНУ ВНИИГРЖ (Санкт-Петербург). - 2004. - С.204-208.

37. Оценка влияния криоконсервации на целостность ДНК сперматозоидов быков / Прошин СЛ., Кравцов В.Ю., Паранян И.А. и др. // Цитология. - 2004. - Т.46. - № 9. - С.844-845.

38. Особенности дестабилизации генома ретикулоцитов и эритроцитов мышей под влиянием магнито-лазерного излучения / Яковлев А.Ф., Прошин СЛ., Косякова ГЛ. и др. // XI международная конференция "Новые медицинские технологии и квантовая медицина" (Москва). - Российский Университет Дружбы Народов. - 2005. - С.25-27.

39. Обоснование экологических стандартов по результатам генетического скрининга рыбных ресурсов каспийского моря /

Прошин С.Н., Косякова ГЛ., Курапов А.А. и др. // 1-я межд. научно-практическая конференция: "Проблемы сохранения экосистемы Каспия в условиях освоения нефтегазовых месторождений". - Астрахань. - 2005. - С.167-169.

40. Цитоморфолошческие особенности интерфазных ядрышкообразующих районов лимфоцитов крупного рогатого при лейкозе / Прошин С.Н.,, Косякова Г.П., Сторожилова ТЛ. и др. // Селекционно-генетические методы повышения продуктивности сельскохозяйственных животных: Сб. науч. тр. // ГНУ ВНИИГРЖC.-IL, 2006. - №.2. - C.I59-162.

41. Интерфазные ядрышкообразующие районы лимфоцитов крупного рогатого скота при лейкозе / Прошин СЛ., Косякова Г.П., Сторожилова ТЛ и др. // Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных: Мат. межд. научно-практической конф. // ГНУ ВНИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко. - Москва. - 2006. - С.491-493.

42. Прошин С Л, Косякова ГЛ., Грабовщинер AJL, Яковлев А.Ф. Эффекты переменного магнитного поля и лазерного облучения на репарацию кожи и стволовые клетки у мышей. С.267-268. // Актуальные проблемы биологии в животноводстве: Мат. 4-й межд. конф. // ВНИИФБиП, Боровск. - 2006. - 361 с.

43. Прошин СЛ., Кравцов В.Ю., Яковлев А.Ф., ФедорцеваР.Ф., Бычкова Н.В., Бахтин ЮЛ>., Никифоров А.М. Способ селекции популяций клеток in vivo // Патент на изобретение № 2111249 от 20 мая 1998 г.

44. Кравцов В JO., Старкова ЕЮ., Прошин СЛ., Яковлев А.Ф., Никифоров • А.М., Федорцева Р.Ф. Способ экспресс-выявления облучённых пациентов с повышенными частотами хромосомных аберраций// Патент на изобретение №2141658 от 20ноября 1999 г.

Подписано в печать 11.01.2007 г. Формат 60x841/16 Бумага офсетная. ОбьСн 1.8 пи. я. Тираж 100 экз. Заказ № 8

Отсчитан» на ризографе ГНУ СЗННИМЭСХ Россеяьхозакадемии