Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

НАРУШЕНИЯ МОРФОЛОГИИ ИНТЕРФАЗНЫХ ЯДЕР В КЛЕТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ОЦЕНКЕ ВЛИЯНИЯ НА ГЕНОМ ДЕСТАБИЛИЗИРУЮЩИХ ФАКТОРОВ

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "НАРУШЕНИЯ МОРФОЛОГИИ ИНТЕРФАЗНЫХ ЯДЕР В КЛЕТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ОЦЕНКЕ ВЛИЯНИЯ НА ГЕНОМ ДЕСТАБИЛИЗИРУЮЩИХ ФАКТОРОВ"

На ара ви рукопвси

ПРОШИН Сергей Впоямап

Ніртапш морфологам пгкрфшіо ядер ш клеточных і жяаотвых при сцмм ял «яких ва іщм дсспбвлпкрупщп факторо*.

03.00.15—пиет»

Автореферат ДМСфИПП я* еонскяняс

двістор« биологических вяук

Свнкт-Пегервург 2007

Работа ртт""™"" в лаборатория молекулярной цитогенетики

Государственного научного учреждения ь Всероссийский научнр-исследовагельсшй. шсгатут генетики н разведения сельскохозяйственных животпых Российской академии сельскохозяйственных наук

Цаучный консультант: член-корреспондент РАСХН,

заслуженный деятель науки РФ

А-ФЛковяев

і і * .

v .

Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных внук,

профессор БДЗавертаев .

доктор биологических наук, Т.В.Кузнецова

' доктор биологических наук, A.EJXOMHCKHI

Ведущее учрежденяеі Сангі^Петербургская Государственная

• ДуядяммВетеряварвайМедніцднм .

Защита состоится - г. в часов на заседании

Диссертационного совета Д >»6.012.01 ГНУ ВНИИ генетики н разведения сельскохозяйственных животных по адресу: 1^1, Оі^Пи^урт-Пушкин» ул. Московское шоссе. 55-А, факс (812)465-88-98, ВдпшІ: spbvniigen@maiiju

С диссертацией можно ознакомиться на. Интернет сайге ВАК РФ и в библиотеке ГНУ ВНИИ генетики в разведения сельскохозяйственных животных

Автореферат разослан 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук С ' ГЛІСердкис

І.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 1.1. Актуальность темы диссертации. Изучение структурных и функциональных изменений генома в популяциях соматических в репродуктивных клеток представляет несомненный интерес для всесторонней оценки генетической стабильности организмов как в тест-системах in vitro, так и в условиях in vivo. Геном эугариотических организмов локализован, главным образом, в клеточном ядре. Морфология и структура клеточного ядра во многом отражает функциональное состояние клетки и воздействие разнообразных факторов (внутренней шш внешней природа) на клетку, которая является одним из основных элементов клеточной популяции, может бьггь охарактеризовано по определённым морфофунхциональным маркерам интерфазного генома. Так, к настоящему времени, методы интерфазной цитогенетики являются неотъемлемой частью подходов для оценки стабильности эукариотического генома, а в ряде случаев, когда необходимо провести экспресс-анализ частоты нарушений генома, дают больше преимуществ по сравнению с классическим метафазным методом (Ильинских я др„ 2005). Достоверно установлено, что хромосомные аберрации дицептрического типа могуг влиять и изменять морфологию интерфазных ядер, приводя к формированию клеток с мостами (Алов, 1972; Gisselsson, 2000). Иитерфазные мосты в клетках формируются нз полидешрическнх хромосом . и свидетельствуют о структурных аберрациях хромосом (Бочков и др., ■ 1972). Циклы "разрыв хромосом — слияние фрагментов — образование хромосомного моста" могут длительное время воспроизводиться в ряду клеточных поколений (McClintock, 1942; Прокофъева-Бельговская, 1961; Gisselsson, 2000) и обусловливать карнотнпическую гетерогенность клеточных популяций (Оленов, 1967; Олиннци, 1982). Поскольку в злокачественных опухолях наблюдаются повышенные спонтанные частоты хромосомных аберраций, в том числе и дицентраческого типа (Dijkhuizen et al., 1995; Mondelo et bL, 1995), то для получения достоверных значений частот клеток с микроядрами и иэтерфазнымя мостами в клонах злокачественных клеток можно обходиться незначительным количеством клеточного м^Ьериапа. Не требует процедура определения частоты клеток с интерфазпьшн мостами и значительных затрат времени. Таким образом, не прибегая к хромосомному анализу по морфологии ядра интерфазной клетки можно с высокой эффективностью определять частоты структурных хромосомных ■ аберраций дицентрнческого типа в клеточных

популяциях in vivo (Кравцов и др., 1997). По этим цричшрми. _____

представляется возможным н перспеЯІШшм клрд^дъДыйчанализ и

І и*;?«« К.А. Тимирязев?.

ЦНБ имени Н.И: J Фонд нау^ы^т^а^ы •

искусственный отбор по признакам "частота клеток с микроядрами" и "частота клеток с интерфазными мостами*1 в клеточных популяциях перевивных опухолей. При этом отбор проводится в больших выборках клопов, каждый из которых состоит из ограниченного числа клеток (Кравцов и др., 1990). Важно отметить, что методы ннтерфазной цито генетики, в отличие от классического патогенетического анализа, позволяют привлечь к анализу по искомому признаку большинство клеток данной клеточной популяции, что с успехом используется в генотоксикологии (Ильинских и др., 2005). Повышенная частота микроядер, как правило, отражает нестабильность эукариотического генома, что позволяет использовать этот параметр для широкомасштабного мониторинга популяций в условиях с меняющимся техногенным давлением (Fenech et al., 1997). Сказанное особенно актуально для экотоксиколопгческого мониторинга рыбных ресурсов, когда необходимо оценить антропогенное воздействие на большой выборке рыб (Ilymsldkh et al.,1998).

В настоящее время не вызывает сомнения, ^ что формирующаяся генетическая нестабильность, ведет не только к новообразованиям, но может быть также ответственна и за ряд ее отдалённых феноменов, реализующиеся на органгоменном уровне. Полагают, что одним из ведущих факторов в возникновении нестабильности генома является оксидативный клеточный стресс, следствием которого являются ошибки в период репарационного восстановления ДНК - молекулы, ответственной за передачу наследственной информации. Ионизирующая радиация, химические мутагены, биологические агенты (вирусы), а также излучения неионизнрующей природы, способны вызывать изменения генетического материала. В связи с этим возникает необходимость в дальнейшем развитии подходов, основанных на принципе анализа отдельных интерфазных клеток с возможностью учйга повреждений в молекуле ДНК. Мнкроэлектрофорез ДНК одиночных клеток, как показывают недавние работы, позволяет выявлять не только двунитиевые разрывы, но и щблочелабильные основания ДНК, которые при определённых условиях трансформируются в однонитневые разрывы (Collins, 2004).

Мутационное (генотокснческое) воздействие на эукариотический геном проявляется, как правило, постепенно и является многостадийным процессом, реализующимся через процессы транскрипции и трансляции. При этом число ядрышкообразукпцих районов хромосом и их морфометрическне характеристики, как свидетельствуют многочисленные работы, могут являться важным показателем функциональной активности

клепки (Maroaev, Mamaeva, 1990; Juntes, Pogacnik, 2000). Доказана прямая записям ость числа рибосомных цистронов от пролиферативвого статуса клеток, направления их днфференцировкн н степени лолнплоидизацни ядра (Crocker, 1999). Существуют убедитслыше доказательства того, что вирусы способны взаимодействовать с ядрышкоформирующимн белками или используя их как "челнок", или непосредственно модифицируя функционирование интерфазного ядрышка клетки (Kalland et а!., 1994). Большое значение в синтезе белков клетки играют рнбосомные гены, являющееся структурными элементами ядрышек и ядрышковых организаторов, что привлекает внимание экологов к использованию характеристик этих структур (Flyinskilch et aL, 1998; Aithipchuk, Garanko, 2005),

В своих исследованиях мы использовали надёжно апробированные методы, позволяющие объективно оценивать на основе морфофункциональных характеристик элементов клетки степень нестабильности генома.

12. Цель R задачи исследования. Целью диссертационной работы являлось обоснование использования нарушений морфологии ядра, как ннтерфаэных маркеров в оценке разнохарактерного влияния дестабилизирующих геном факторов и селекционного давления на клеточные популяции.

При этом были поставлены следующие задачи: -доказать на основе использования перевивной органотропной рабдомиосаркомы РЛ-23 крыс возможность получения клопов клеток с повышенными и пониженными частотами нарушений морфологии ядра по типу "интерфазные мосты";

- провести сравнительную характеристику кариотшгачеекпй изменчивости в. полученных клонах клеток с повышенными и пониженными частотами нарушений морфологии ядра по типу "янгерфазные мосты";

- выявить, что в клеточных популяциях такие нарушения морфологии ядра, как "ивтерфазные мосты" и "хвостатые ядре**, взаимообусловлены;

- оценить клеточаыв состав костного мозга и периферической крови крыс, подвергшихся облучению электромагнитными волнами гектагерцового диапазона; .

- определить фоновые показатели нарушений морфологии едер клеток крова .у хозяйственно значимых водов ' рыб Каспийского бассейна;

- оценить дестабилизирующее воздействие ва. геном

низкшнергетического переменного магнитного поля и лазерного облучения с применением микроядерного теста И микроэлектрофореза ДНК одиночных клеток;

- оценить 1Л vivo комбинированное воздействие

ншкданергепгчесгого переменного магнитного поля и лазерного облучения на концентрацию стволовых клеток в костном мозге мыши;

• доказать возможность использования метода мтсроэлектрофореза ДНК одиночных клеток для выявления сперматозоидов быков с нестабильным геномом;

• оценить частоту н провести кариоморфометрический анализ интерфазных ядрышко вьгх организаторов in vivo у животных под воздействием различных факторов;

-исследовать функциональное состояние in vivo лимфоцитов периферической крови коров положительных и отрицательных в РИД с использованием иммуноцитохимического анализа на ядерный антиген пролиферации клеток.

Научная попшна. Впервые обосновано использование комплекса информативных показателей особенностей морфологии ядра дня оценки нестабильности генома животных. Выявлена положительная корреляция между образованием мостов в .ана- н тедофазе, формированием клеток с интерфазнымн мостами и возникновением клеток с «хвостатыми» ядрами и микроядрами в популяциях соматических клеток.

Впервые на основе наследственной гетерогенности клонов перевивных опухолевых клеток in vivo по признаку "частота клеток с интерфазнымн мостами" и разработанной методики отбора на повышение и снижение частоты встречаемости клеток с интерфазными мостами доказана возможность направленного получения популяций клонов клеток С низкой и высокой дестабилизацией генома.

Установлено, что персистенция в клеточной популяции в ряду нескольких клеточных поколений высоких частот клеток с нарушенной морфологией ядра по типу "интерфазные мосты5* приводит к резкому снижению жизнеспособности клеточной. популяции.

Установлено, что анализ морфологических нарушений ядер клеток крови ценных видов рыб Каспийского бассейна является надёжным инструментом для контроля антропогенного влияния на дестабилизацию генома рыб.

Результаты микроэлеетрофореза ДНК соматических клеток после электромагнитного и лазерного облучения, а также результаты анализа состояния ДНК семени быков в процессе хранения показали,

что этот метод может бить интегрирован в набор приемов регистрации нарушений морфологии ядер для повышения надёжности оценка уровня дестабилизации генома клеток при генотохснческих воздействиях на организм животных.

Впервые установлено, что показатель отношения площади ядра к совокупное площади всех ядрышек клетки снижается у коров, положительных в РИД.

1Л Теоретическая я практическая значимость работы. Теоретическая значимость полученных результатов заключается в том, «по вскрыта способность клеточных ропуляций отвечать на отбор по дестабилизации генома. Достаточно отбора в 4-5-ти генерациях для направленного снижения или повышения дестабилизации генома ютовов клеток. Обнаруженные связи частот гаггерфззных мостов, микроядер н "хвостатых ядер" свидетельствует о том, что эта элементы нарушений морфологов ядра являются отражением одного процесса — дестабилизации генома клетки. Полученные факты о связи носительства коровами вируса лейкоза с состоянием шггерфазных ядрышковых организаторов свидетельствует о влиянии вируса на рибосомные цистроны.

Практическая значимость работы состоит в том, что разработанный и апробированный способ отбора клеточных 1 популяций перевивных опухолей на стабильность генома (отбор па частоту клеток с интерфазными мостами) можно использовать в биотехлалогическом производстве для генотипнческой стабилизации клеточных линий. Комплексный подход в оценке частоты нарушений морфологии ядер повышает надежность оценки дестабилизации генома при влиянии физических, химических н биологических факторов внешней среды, в том числе и в оценке экологии.

1І. Апробация результатов диссертации. Материалы диссертационной работы доложены на 40-й пйучно-практнческой конференции профессорско-преподавательского состава (Астрахань, 1996), 18-м международном конгрессе генетиков (Пекин, 1993), 17-м международном конгрессе по исследованию рака (Рио-де-Жанейро, 1998), на научно-практической конференции %клад молодых учвных в решение задач научного обеспечения АПК Северо-Запада РФ" (Санкт-Петербург-Пушкин, 1999), 11-м международном конгрессе по гистохимии ' н иммупощггохимии (Йорк, Великобритания, 2000), 23-й конференции по исследованию полисахаридов (Токио, Япония, 2002), на международной конференции "Сохранение генетических ресурсов" (Санкт-Петербург, 2004), 1-й международной научно-практической конференции (Астрахань, Россия, 2005), на 4-й международной

конференции "Актуальные проблемы биологин в животноводстве" (Боровск, 2006).

Публикации. По материалам диссертация опубликовано 44 научные работы, в том числе два патента на изобретения. Работы опубликованы в материалах международных конференций и в журналах: «Генетика», «Доклады Академия Наук», «Доклада РАСХН», «Цитология», «Ветеринария», «J. of Cytogenetics Cell r Genetics», «Вопросы онкологии», «J, of Neurochemical Research», «Бюллетень экспериментальной бнолопш и медицины», «J. of Molecular Medicine».

1.7. Структура н объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов, практических пред ложений и списка литературы го 435 источников, среди которых 330 на иностранном языке. Диссертация изложена на 299 страницах, содержит 43 таблицы, 49 рисунков.

1.8.0сиовиые положении, выносимые па защиту.

- частота клеток с интерфазнымн мостами в клонах перевивной рабдомиоезркомы РА-23 является наследственно гетерогенной и подвержена селективному отбору ва повышение или снижение дестабилизации генома;

-клоны с высокими и низкими частотами интерфазных мостов отличаются между собой по частоте клеток с кзриотипическими изменениями н частоте клеток с нарушениями морфологии ядер;

- комбинированное воздействие переменного низкоэпергетического магнитного поля и лазерного облучения влияет па формирование экспериментальных метастазов и частоту интерфазных ЯОР клеток рабдомлосаркомы РА-23 крыс;

- электромагнитные волны гектагерцового диапазона оказывают влияние на функциональное состояние кроветворной и репродуктивной систем;

• показателя морфологических нарушений ядер клеток периферической крови рыб являются значимыми для целей экотокснкологического мониторинга;

- микроядерыый тест и метод "мнкроэлеюрофорез ДНК одиночных клеток" повышают надёжность оценки нестабильности генома клеток при исследовании влияния переменного визкшнергетического магнитного поля и лазерного облучения;

- метод "микроэлектрофорез ДНК одиночных клеток" позволяет оценивать стабильность ДНК семени быков;

- выявление нарушенной морфологии ядер с использованием цитокииетического. блока позволяет учитывать "скрытую" нестабильность генома у сельскохозяйственных животных;

- кариоморфометрические показатели в функциональная активность лимфоцитов периферической крови у коров, положительных в РИД, отличаются от аналогичных показателей здоровых животных.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Все исследованные выборки крупного рогатого скота представляли чёрно-пёструю породу Ленинградское облает Кровь при исследовании лейкоза крупного рогатого скота забирали в плановом порядке и сыворотку для анализа направляли в Межобластную Ветеринарную Лабораторию (Санкт-Петербург) для определения вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) с помощью реакции иммунодиффузии.

Мазки крови рыб семейства карповых и осетровых были получены в ходе экспедиции в Северный Каспий в Каспийском научно-исследовательском ив статуте рыбного хозяйства (г. Астрахань). Первая выборка состояла из 22 сеголетков воблы каспийской, вторая - из 40 особей 2-3 летнего возраста, третья - из 28 зрелых (старше 4 лет) особей того же вида. Четвертая выборка была представлена 23 особями обоего пола осетра русского и белуги 5-7 -летнего возраста.

Облучение электромагнитными волнами, формируемыми путём ударного возбуждения антенны высоковольтным импульсом в системах дистанционного зондирования объектов проводили на экспериментальной установке с использованием подопытных беспородных белых крыс. Животные были разделены на пять выборок, каждая выборка облучалась в определённом режиме. Для оценхи эффектов на стабильность генома низкоэнергетичесхого переменного электромагнитного поля и лазерного облучения (аппарат "Рикта", Институт квшгтовой медицины, пМосква) были использованы мыши линии ВАЬВ/с.

Для получения легочных экспериментальных метастазов (клонов) рабдомносаркомы РА-23, приготовленные суспензии вводили в хвостовую вену крыс. Для выявления встречаемости ЧКИМ*, ЧИМК, ЧКМ и ЧКХЯ в каждом клоне анализировали не менее 200 клеток. При проведении эксперимента по влиянию на опухолевые клетки электромагните го поля и лазерного облучения с использованием в качестве источника аппарата Тита" крысам вводили внутривенно по 2000 клеток перевивной органслропной рабдомносаркомы РА-23 и грудную клетку животных с формирующимися легочными метастазами подвергали 10-кратному действию электромагнитного и лазерного облучения с помощью аппарата "Риюа-Ог**.

При подсчёте мнкроядер и морфологических нарушений ядер и лейкоцитарной формулы препараты периферической крови готовили по стандартной методике (Гольдберг, I97S). У крупного рогатого скота - из яремной вены, у рыб - нз спинной артерии, у крыс и мышей - из хвостовой вены. На каждом препарате просматривали не менее 200 лейкоцитов. Частоту эритроцитов с микроядрами н частоту эритроцитов с "хвостатыми" ядрами выражали в промилле (%о) и определяли в выборках на 10 тыс. эритроцитов у рыб. ЧЛМ выражали в промилле (%о) и определяли на ] 00-200 мононуклеаров (лимфоцитов) у быков н тёлок. У мышей ЧПЭМ и ЧЭМ анализировали на 1 тыс. полихроматофильных эритроцитов и на 10 тыс. ортохромных эритроцитов, соответственно, что выражалось в промилле (К«).

Препараты клеток костного мозга получали из тазобедренных косточек подопытных крыс по стандартной методике (Гольдберг, 1975). Анализировали не менее 500 ядросодержащих кроветворных клеток. Из семенников, полученных от самцов крыс, приготовляли отпечатки на предметные стёкла. Частоту встречаемости сперматоцитов с микроядрами и анафазными мостами определяли в "кляч^-препаратах и выражали в процентах (%). Для выявления клеток семенников, подвергшихся гибели в результате апоптоза нами использовался метод микроскопического анализа С использованием окраски акридиновым оранжевым (Прошив и др., 1999).

При анализе ДНК повреждений у мышей при воздействии переменного электромагнитного поля и лазерного облучения на 22-е сутки после начала эксперимента костный мозг извлекали из бедреной кости и ресуспендирован в фосфатно-солевом буфере, не содержащем ионы Са2> и Mgi+. Для выявления повреждённых костномозговых клеток микроэлектрофорез ДНК и окрашивание нитратом серебра проводили согласно Кизкяиан с соавторами (Kizilian et а!., 1999). В Препаратах окрашенных нитратом серебра анализировали не менее 150 клеток.

Препараты, предназначенные для выявления ИЯОР проводили по стандартной методике, как предложено ранее (Мамаев, 1998). Для анализа стволовых клеток костного мозга на проточном цитометре использовали антимышиные моноклональные антитела, (RAM34, !gG2a изотил), конъюгированные с Р-фикоэрнтрином (R-Pbycoerythrin). Для иммуноцитохимической реакции использовали моноклональные антитела к ЯАПК и авидин-биотиновую систему с пероксидазой хрена.

Статистическую достоверность оценивали с помощью t-

критерия Стъюдента и непараметрического U-крятерия Вшпсоксона-

&

Манна-Уитви, коэффициент корреляции определяли по Спирмену (Лакин, 1990).

'Список сокращений: ЧКИМ - частота клеток с интерфазными мостами; ЧИМК - частота ингерфазвых мостов на клетку; ЧКХЯ - частота клеток "хвостатыми" ядрами; ЧКМ - * частота клеток с мюероядрамн; ЧПЭМ - частота полихроматофидьных эритроцитов с микроадрами; ЧЭМ - частота эритроцитов с микроядрами; ЧЛМ - частота лимфоцитов с микроядрами; ИЯОР - интерфазные ядрышкообразующис районы хромосом; ЯАПК - ядерный антиген пролиферации клеток.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 3.1. Клоиялькые различая in vivo и клеточных популяции суб штаммов рабдомносаркомы РА-23 крыс по признаку "частота клеток шптрфазными с мостамв".

Дня проведення отбора на повышение ЧКИМ была использована исходная выборка из 48 кловов, средняя' ЧКИМ в которой составила 0,6%, а размах изменчивости от 0,0 до В первый цикл отбора взяли три клона с ЧКИМ от 1,0 до 1Д%. В результате проведения 1-го цикла отбора средняя ЧКИМ составила . 0,8%, а размах изменчивости от 0,0 до 3,0%. Три клона о ЧКИМ 2,0%, 2,6% и 3,0% были взяты во 2-ой цикл отбора. Пятый цикл отбора оказался наиболее эффективным: средняя ЧКИМ составила . 10,0% из 21 клона-потомка не было встречено ни одного клопа, который бы имея частоту интерфазных мостов менее 3,2%. Частота f клеток с интерфазными мостами в полученных популяциях клеток рабдомиосаркомы повысилась с 0,6 до 10,0%, т.е. в 16,7 раза.

'' Различая между выборками исходных кловов и подвергнутых отбору на повышенную ЧКИМ были достоверны при Р<0,001 {критерий Вилкоксона-Манна-Уитни). Полученные данные свидетельствуют об эффективности искусственного отбора, направленного на повышение частоты встречаемости клеток с интерфазными мостами в клонах субштамма РА-23.

Отбор клонов субштамма РА-23 на понижение частоты встречаемости в них клеток с интерфазными мостами проводился одновременно и параллельно с первой попыткой отбора кловов РА-23 на повышение ЧКИМ. В ходе 5-ти циклов отбора частота клеток с ингерфазными мостами изменялась постепенно, не претерпевая существенных колебаний. Фракция кловов с низкими ЧКНМ в ходе' отборов увеличивалась. Несмотря на то, что в выборках клонов всех циклов встречались клоны с высокими ЧКИМ (1-2%), однако доля клонов, в которых частота ЧКИМ не превышала 0,2% к 5-му циклу отбора составила 60%. Таким образом, .предложенным нами .

способом, удаётся заметно понизить частоты клеток с интерфазными мостами в популяциях клонов рабдомиосаркомы РА-23.

Так как после отбора на повышение ЧКИМ стали наблюдаться клетки, в которых регистрировалось несколько интерфазных мостов была проанализирована выборка из 38 клонов. Коэффициент корреляции между показателями "ЧКИМ" и "ЧИМК" составил 0,82 (по t - критерию Сгьюдента, Р<0,01), что указывает на тесную взаимосвязь между изучаемыми признаками. В результате регрессионного анализа (рис. 1) получено уравнение вида: Y{X)= -0,10+0,25 хХ, т.е. < изменение частоты клеток с интерфазными мостами на 4% вызывает изменение частоты мостов на клетку на 1%, Эти результаты позволяют сделать вывод о том, что частота ннтерфазных мостов на клетку закономерно изменяется в зависимости от поведения такого признака как частота клеток с интерфазными мостами.

Рис, 1. Уравнение регрессии признака ЧКИМ на признак ЧИМК. По оси абсцисс - частота клеток с интерфазными мостами, %; по оси ординат—частота интерфазных мостов на клетку, %.

3.2. Сравнительный анализ показателей каркотппической изменчивости н метастатический логенцпал при селекция швов РА-23 иа повышение и понижение образования

клеток с ннтерфазнымп мостами. После проведения 5-ти циклов отбора на повышение и 5-ти циклов отбора на понижение ' ЧКИМ популяция РА-23 были, специально протестированы на метастатический

Рис. 2. Метастатический потенциал клеток РА-23 после 5-ти циклов отбора на повышение (1) и 5-ти Циклов отбора на снижение (2) частота встречаемости клеток, с интерфазными мостами. По горизонтали — доза в/в введённых клеток; по вертикали — число сформированных клонов. Вертикальные отрезки - 95%-ые доверительные интервалы средних значений.

потенциал (рис. 2).' Видно, что при всех исследованных прививочных дозах популяция клеток с повышенной ЧКИМ имели достоверно меньшие метастатический потенциал, чем 'популяции клеток с пониженной ЧКИМ (во всех случаях Р0.05, п=б). При этом, различия по величине метастатического потенциала между линиями с высокой и низкой ЧКИМ были более, чем тридцатикратными. Среднее значение метастатического потенциала клеточной популяции с повышенной ЧКИМ в субппамме РА-23 составило 1,4±0,43, а значение метастатического потенциала клеточной популяции этого субштамма с пониженной ЧКИМ составило 33,6*7,4.

3.3. Нарушения морфологии интерфазных ядер в виде «хвостатых" ядер в клеточных популяциях суб штамма РА-23.

При' селекции на пониженную и повышенную ЧКИМ было выявлено, что клоны с повышенной ЧКИМ характеризуются также и высокой ЧКХЯ, тогда как хлопы с пониженной ЧКИМ характеризуются низкой ЧКХЯ (табл. 1).

Таблица. 1. Характеристика клоков рабдомиосаркомы РА-23, полученных после 5 циклов отбора на повышение и 5 циклов отбора на понижение частоты встречаемости клеток с интерфазяыми мостами.

Номер клона Частота клеток с интерфазными мостами, % Частота клеток с хвостатыми ядрами, %

Клоны после отбора на повышение частоты мостов в интерфазе

Аб 11,6 3,6

ОІ 18,6 7.4

Об 16£ 14,4

Р1 12,7 8,6

Е4 17.4 16,8

БЗ 11.2 5,6

Е1 4 И,2 б,б

В5 9.0 5,0

Клоны после отбора на понижение частоты мостов в интерфазе

В9 0,0 0,8

012 0.0 0,6

В7 0,0 0,4

С2 0,0 0,8

СИ 0,0 0,6

3.4. Г«иотоксичсскне факторы в индукции клеток с нарушениями морфологии ядер в клонах рабдомиосаркомы

РА-23.

При анализе кариотип яческих аномалий в опухолевых клетках отмечено, что цикяофосфан (табл. 2) вызывал нарушения в ядрах клеток рабдомиосаркомы РА-23, выражавшиеся, прежде всего, в увеличении ЧКМ и ЧКХЯ - 7,80±0,54 и 0,32±0,11%, соответственно. При этом были зарегистрированы достоверные различия по ЧКМ (0,54±0,10%) и ЧКХЯ (0,04±0,03%) в сравнении с клетками клонов, полученных от крыс, которым вводили изотонический раствор хлорида натрия (0,05<Р<0,01, по непараметрическому критерию Вилкоксона-Манна-Уитнн).

Таблица 2. Частота выявленных нарушений морфологии ядер в клетках легочных метастазов рабдомиосаркомы РА-23 крыс при введении цихлоферона, цшслофосфана и их комбинации.

Показателя Воздействие

Изотонический рэшор . хлористого натрия Цвкаофероя Цшоюфосфаи Циклофосфав + шигл офероц

1-ая группа 2-а«группа 3-я группа 4-а* группа

Чясло изученных клеток 5000 4000 2500 1000

Число клеток с микро ядрами 27 292 195 , 42

Процетг клеток с шжро*драыя 0,54 ±0,10 7,3 ±0,41* 7,8 ±0,54* 4,2 ± 0,31*

Чясло КВИТОК с ИМІфІІМНИМ молами 6 8 « 1

Процент хлетох с нвтерфаэ-июга мостами 0,12 ±0,05 ±0,07 0,2 ±0,1- 0.1 ±0.1

Число клеток с "хвостатыми" ядрами 2 10 8 3

Процент глегок с "хвостатыми" ядрами 0,04 ±0,03 одб±о,о?* 032 ±0,11* 03 ±0,17*

* Различие достоверно относительно 1-оЙ группы (Р<0,05).

ЗА Нестабильность генома клеток при облучении электромагпвггнымн волнами гсктагсрцового диапазона.

Ряд, проведенных нами исследований касался проблем генетической безопасности электромагнитных излучений. Мы изучили изменения, произошедшие с клетками после облучения электромагнитными волнами гсктагсрцового диапазона (табл. 3). Так мы 'обнаружила тенденцию к снижению количества

эозинофильных лейкоцитов в периферической крови животных после всех режимов' облучения. Число моноцитов и клеток лимфоиднога ряда наоборот превысило показатели крови крыс в контрольной группе. Частота лимфоцитов изменялась в исследованных группах от 53,0 до 88,0 %. Наиболее низкой она была в контрольной группе. Лимиты варьирования в контрольной группе составили от 54,0 до 82,0 %. Средние частоты достоверно отличались между контрольным и вторым режимом облучения при Р<0,01. Изменчивость частот моноцитов была от 0 до 8,0 %. Сравнение средних частот встречаемости моноцитов показало, что относительно контроля в первой, третьей и четвёртой группах наблюдалось повышение этого показателя. При < этом средняя частота моноцитов в контрольной группе достоверно отличалась от средних частот в третьей и четвёртой группах (Р<0,01).

Таблица 3. Лейкоцитарная формула периферической крови крыс.

Группа Эозино-филы, % Нейтро-филы,% Моноциты, % Лимфоциты, % Разрушенные ядро-содержа-пдае клетки, %

Контроль 2,8±0,73 2б,2±5,бЗ 2,4*0,75 67,6±5,20 1,ЩЮ,31

1 231±0>55 20,1 ±3,11 3,9±0,82 74.fch3.48 0,9±0,16

2 2,7)ї±1,39 14,(№2,88 2.6±1,03 *79,8±3,49 1,0±0,4

3 2,1=Ь0,б 19,4±237 •4,0±0,65 72,8*2^9 1,7±0,5

4 1,7І0,41 19,8±3,09 •43±0,73 73,6±338 0,6іОД9

*Р<0,01

В отношении клеток половой системы не существует единого мнения по поводу того, являются ли они мишенями для воздействия электромагнитных полей. Из прсдстшюеппых в табл. 4 данных очевидно понижение количества ядрышек на одну клетку во всех группах облученных животных. В контроле значение этого показателя составило 1,61±0,21.Число фибриллярных центров (ФЦ). на клетку составило у контрольных животных — 5,39±0,34. В первом, третьем и четвертом режимах мы обнаружили повышение индекса фибриллярных центров. Во втором режиме - облучения было наоборот снижение этого показателя. Обращает па себя внимание довольно высокая вариабельность индекса ФЦ, коэффициент вариации достигал 35,5%.

Таблица 4. Изменение показателей пролиферативвой активности сперматоцитов крыс при облучении, _

Режи -мы Число ядрышек на 1 клетку Число фибриллярных центров на 1 клетку

Лимиты См,% Лимиты СУ,У»

1 *1,37±0,09 1,2-1,7 14,5 **6,43±0,11 3,1-10,4 21,9

2 1,51±0,07 13-1,9 16,0 **4,1р±0,19 3,1-7,6 153

3 *МД5±0,06 и-1,7 15,1 *7,2СЫ),71 4,9-8,4 28,2

4 1,46±0Д5 1,2-2,1 17,7 5,80±1,03 2,6-6,0 35,5

Контроль 1,61±0Д1 1,3-2,4 16,1 5,39*0,34 2,8-73 22,6

*Р<0,05; **Р<0,01.

Провед?нное исследование (табл. 5) частоты встречаемости апоптоза в клетках семенников позволило выявить потенциальные изменения, имевшие место в клеточных популяциях после воздействия облучения. Среднее ' значение частоты клеток семенников в апопгозе составило в контрольной труппе - 0,06%. Как следует из представленных данных, в группах животных

Табя. 5. Частота апоптоза ¡п.тоо в клетках семенников крыс,

Контроль ' Режимы облучения

Режим 1 Режим 2 РежимЗ Режим 4

0,06*4,04 0.1&Ю.08* 0,82*0,29* 0,20*0,09* 0,08±0,Си*

Лимиты 0,00-0,80 0,00-0,80 0,05-3,00 0,00-0,70 0,0(>Д50

*0,05<Р<0,01 (Ц-критериЙ Вилкоксона-Маяна-Уитни).

первого,, второго н третьего режимов облучения наблюдалось повышение частоты апоггготически измен бнных клеток семенников, А в четвертом незначительное понижение. Несмотря па достаточно высокую вариабельность исследованного показателя, статистический анализ с использованием непарамегряческого и-критерия Вклкоксона-Манна-Унтыи обнаружил достоверность различий ян достаточном в биологических исследованиях уровне (0,05<Р<0,01), что позволяет сделать вывод о положительном

влиянии электромагнитного облучения в данных режимах на частоту апоптоза в клетках.

3.6. Нестабильность генома эукарнот при воздействии ннзкоэнергетнческого электромагнитного ноля в лазерного

облучения.

З.6.Х. Характеристика морфологии ядер в нормалъпьгг и опухолевых клетках при сочетанием воздействии внзгаэнергетнческого электромагнитного поля в лазерного

излучения.

Результаті по исследованию встречаемости эритроцитов с микроядрами у крыс показывают (табл. б), что в контроле ЧЭМ составила 0,11±0,008%, в то время как в опытных группах при экспозиции 1 мин этот показатель составлял 0,16±0,018%, а при экспозициях 2,5 и 10 мин-0Д0,0,18 и 0,15%, соответственно.

Табл. б. Частота эритроцитов с мпхроядрамн в крови крыс под влиянием электромагнитного поля и лазерного облучения._.

Режим ' облучения Число - крыс Частота микроядер (%о) Лимиты СУ

Контроль 31 0,11*0,008***, 0-0,30 40,4

1 мин 29 0,16*0,018 0-0,41 60,5

2 мин 28 0,2 0±0,021 0-0,62 55,5

5 мнн 28 0,18±0,01б 0-0,33 47,0

10 мин 29 0,15*0,010 0,1-ОД 35,9

•Различие достоверно относительно группы облучаемой в течение 2 мин (Р<0,001); **разлнтае достоверно относительно группы облучаемой в течение 5 мин (Р<0,001); ***различие достоверно относительно группы облучаемой в течение 10 мин (Р<0,01).

Достоверными оказались различия между группой контроля и группами с режимами облучения 2,5 и 10 мин при Р<0,001, Р<0,001 и Р<0,01; соответственно. Облучение не привело к достоверным . изменениям числа и размера формирующихся в лёгких экспериментальных метастазов, хотя среднее число экспериментальных метастазов на 1 животное в опытных группах было несколько выше, чем в контрольной (см. табл. 7). Вместе с тем,

следует отметить, что в группе животных с режимом облучения 10 мин средняя частота опухолевых клеток с микроядрами (ЧКМ) (6,4*0,35%) достоверно отличалась ох аналогичного показателя контрольной группы, где ЧКМ составила 5,4*0,32%.

Табл. 7. Влияние электромагнитного поля и лазерного облучения на формирование экспериментальных метастазов рабдомиосаркомы РА-23 крыс в лёгких Привитых животных (10-кратное облучение, 10-

Режим облучения Чисао крыс Число метастазов Частота клеток с микроядрами, %

Контроль 31 30,4*4,03 " 5,4*0,32

1 мин 29 35,3*3,92 , 5,2*0,31

2 мин 28 42,8*7,57 5,6*0,33

5 мин 28 37,6*4,14 5,0*0,31

10 мин 29 36,2*4,72

** различие достоверао относительно группы облучаемой в течепие 1 мин (Р<0,01); **'различие достоверно относительно группы облучаемой в течение 2 мин (Р0.05); ****различие достоверно относительно группы облучаемой в течение 5 мин (Р<0,001).

ЗА2. Пярушепня морфология ядер, выявляемых в эритроцитах периферической крови и в клетках костного мозга у мышей

линии ВАШс при сочетанием воздействии иизкоэнергетнчсского электромагнитного поля и лазерного

облучения.

Имеются сведения о возможных эффектах .влияния низкочастотного переменного электромагнитного поля и лазерного облучения, влияющих па клеточный геном, с индукцией его разнообразных изменений. Как следует из табл. 8. ЧПЭМ на 15-е сут после начала эксперимента в группе .самцов, подвергавшихся ежедневному облучению в течение 10 мин достоверно отличалось от контрольной группы животных (р<0,01), а также от аналогичных, показателей групп животных с экспозицией 1 мни (Р<0,05) и 5 мкн (Рс0,01). Вместе с тем, ва 22-е сут эксперимента в группе самцов

Таблица Частота полихроматофильных эритроцитов с микроядрами у мышей (самцы) линии ВАЬВ/с (15-е и 22-е сутки

Время облучения Частота поянхроматофильных эритроцитов с мнкроядрзми

15-е сутки 22-е сутки

СУ СУ

10 мин 2,60*0,34'""' 41,4 1,40±0ДГ"*'"Т 48,1

5 мин 1,0040,23 73,3 0,60±0,1б 84,б

1 мин ио±озо 63,4 0.70±0,18 82Д

Контроль 0,95±0Д6 71,9 1,00±0,15 47,7

"различие достоверно относительно группы, облучаемой в течение 5 мин (р<0,01); »♦•различие достоверно^ относительно группы, облучаемой в течение I мин (р<0,05); различие достоверно относительно группы, облучаемой в течение 5 мин (р<0,О5).

подвергшихся облучению в течение 10 мин было зарегистрировано снижение средней ЧГТЭМ до 1,40 %о, что не показало существенных различий но сравнению ЧПЭМ контрольной группы. Однако, по сравнению с ЧПЭМ групп мышей, облучаемых в течение 1 и 5 мни на 22-е сут эксперимента различия сохранялись (Р<0,05, в обоих случаях). На 15-е. сут эксперимента средняя ЧПЭМ в группе самок (табл. 9), подвергавшихся ежедневному 10-минутному облучению

Таблица 9. Частота полихроматоф ильных эритроцитов с микроядрами у мышей (самки) линии ВАЬВ/с (15-е и 22-е сутки

Время облучения Частота полихроматофильных эритроцитов с микроядрамн

15-е сутки 22-е (утки

О Су

10 мин 2,40±0,33'" 43,0 1,8о±одг'* 38,2

5 мин 1,00±0,26 81^ 1,10±0,17 49,1

1 мин 1,70±0Д9 55,6 1,ООаЮ,17 52,8

Контроль . 1,оо±од 66,4 1,10±0,16 44,8

**различие достоверно относительно группы, облучаемой в течение 5 мин (р<0,05); "различие достоверно ^относительно группы, облучаемой в течение 1 мин ОКО,05); различие достоверно относительно контрольной группы (р<0,05).

достоверно отличалась от аналогичного показателя контрольной группы и, хотя, на 22-е сут эксперимента наблюдалась тенденция к снижению ЧПЭМ для труппы с ежедневным 10-минутным облучением до 1,8 %о, однако, различия по сравнению с ЧПЭМ контрольной группы сохранялись (р<0,05).

3.6.3. Эффекты, вызываемые сочетапвым воздействием низкоэиергетнческого электромагннтиого поля н лазерного облучения на клетки костного мозга, положительные по антигену ОТ34+, н репарацию кожи.

Частота стволовых клеток костного мозга в контрольной группе мышей, выявленная с использованием крысиных моноклональных антител, направленных ' против мышиных антигенов СШ4 (ИАМ34) варьировала от 1,8 до 3,3% и, как следует из табл. 10, в среднем составила 2^>3±0,07%.

В ірушзе с длительностью экспозиции к сочетапному воздействию ннзкоэиергетнческого переменного магнитного поля н лазерного излучения в 1 мни частота Стволовых клеток варьировала от 1,7 до 3,1%, а средний показатель составил 2,52±0,15%, что не отличалось существенно от аналогичного показателя контрольной группы (Р>0,05, ^критерий Стъюдента). Средняя частота стволовых клеток, определённая для труппы мышей с длительностью экспозиции 5 мин частота стволовых клеток составила 2,52±0,18%, что также существенно не отличалось от средаегопоказателя (2,5340,07%) контрольной труппы (Р>0,05, {-критерий Стъюдента). В экспериментальной труппе с длительностью экспозиции 10 мин не выявлялись животные, у' которых частота стволовых клеток в костном мозге была бы ниже уровня 2,2%. При этом, выявлялись особи (более 15% от числа группы), у которых частота клеток костного мозга, выявляемых с помощью моноклональных антител СОЭ4 (КАМ34) составляла не менее 3,5%. Средний показатель составил 2,79±0,16%, что, однако, достоверно не отличается от' аналогичного показателя контрольной группы (Р>0,05, ^критерий Стъюдента). Вместе с тем, можно говорить о выраженной тенденции в повышении популяции СОЗ4 (1ЗДМ34) позитивных клеток костного мозга у мышей с длительностью экспозиции 10 мин под влиянием магнитолазерного облучения на фоне стандартизованной травмы кожи.

Таблица 10. Частота (%) стволовых CD34 позитивных клеток костного мозга мышей. _

№ Контроль Время экспозиции

1 мин 5 мин 10 мин

1 2,4 гб 2,8 2,5

2 3,3 2,4 2Л 3,1

3 2,8 1.7 2,4 2Л

4 1,9 2.6' 2J2 23

5 2,5 3.0 Ifi 3,5

б 2J3 2.6 3.7 2,7

7 2.6 3,1 2,1 3,9

3,3 2,6 3,1 2,4

9 1Я 2.1 1,9 2,3

10 23 2,5 2,8 2,8

11 2,7 2.6 2JS 3,0

М±т 2,5Э±0,07 2,52±0,15 2,52±0,18 2,79±0,16

3.7. Нарушении морфологив ядер клеток периферической крови in vivo в эксперименте ия рыбах

Несомненный интерес представляет этап работы по изучению границ спонтанной хромосомной нестабильности у рыб Каспийского бассейна. Как свидетельствуют данные, приведенные в табл. 11, существуют достоверные различия по частоте микроядер и частоте "хвостатых" ядер между исследованными видами рыб.

Сравнение частот нестабильности генома между самками и самцами у карповых свидетельствует (табл. 12), что в кровн самцов частота эритроцитов с микроядрами, а также частота эритроцитов с

Таблица. 11. Сравнение частот нестабильности генома между двумя видами рыб. __

Частота эритроцитов с микроядрами, 9So Частота эрнтропщю» с "хвостатыми" ядрами, %>

п Х±х Xdtx

Карп Осётр 99 24 ) 1Д2±0,07 *1,45±0,1б *0,27±0,02 0,23±0,04

*Р<0,01

Таблица. 12. Сравнение частот нестабильности генома между полами у карповых рыб.__

Частота эритроцитов микроядрами, Частота эритроцитов с "хвостатыми" ядрами, %о

N Х±х Х±х

Я 49 1,24±0,12 0,27±0,04

в 41 *1,27±0Д1 *0,2&±0,03

*Р<0,05

Таблица. 13. Сравнение частот нестабильности генома между

полами' у осетровых рыб.

Частота эритроцитов с микроядрами, Частота эритроцитов с "хвостатыми" ядрами, %>

N Х±х Х±х

9 с? 15 8 1,55±0,19 ♦0,97*0,08 ОД1±0,02 **0Д4±0,09

•Р0.01; **Р<0,05

"хвостатыми" ядрами достоверно выше, чем у самок. У осетров (табл. 13) самцы также отличались повышенной частотой микроядер в эритроцитах (Р<0,01). В отношении признака "частота эритроцитов с хвостатыми ядрами" наблюдалась та же закономерность: самцы достоверно отличались от самок по изучаемому признаку (Р<0,05).

3,8. Исследование антропогенной нагрузка на геном сельскохозяйственных животных.

Как следует из табл. 14. в опытной культуре лимфоцитов только у одного быка выявлены микроддра в мононукяеарных клетках, тогда как - в бинуклеированяых лимфоцитах микроядра обнаружены у четырёх быков с варьированием частоты от О до 5%о. В среднем в контрольной культуре лимфоцитов спонтанная частота клеток с микроядрами была выше, чем в опытной культуре одноядерных лимфоцитов на 2,18%» и двуядерных - на 0,3%о соответственно.

В контрольной и опытных культурах лимфоцитов телок микроядра выявлены и в мононукяеарных, и в бинуклеированных клетках (табл. 15). В контрольной культуре спонтанная ЧЛМ варьировала от 7 до 19%о, а в опытной культуре - от 5 до 25%о. Частота бинуклеированных лимфоцитов с микроядрами изменялась

от 14 до 4496«. У тало« значение показателя ЧЛМ в опыте превышает таковое в контроле на 4,4%о.

Таблица. 14. Частота встречаемости микроядер в крови быков чЄрно-пёстрой породы in vitro с использованием цнтохалазияа В._

Контрольная Культура лимфоцитов in vitro с

Номер культура

ЖИВОТ- лимфоцитов блока

НОГО in vitro

Част Часто- Число Частота Число Часто-

мово- та лим- мово- лимфо- бинук- ТВ лнм-

нук- фоцитов вуклеа- цитов с леяро-. фоцнтовс

лезров с мшгро- рое мшфовд- ванных микро-

ядрами, раын, %> клеток ядра-

%> kDIj

1006606 610 0,0 775 0,0 300 0,0

58767 695 0,0 805 0,0 330 0,0

741450 6S0 0,0 765 U 305 5.0

559583 305 33 740 0,0 300 23-

78087 300 7.6 700 0,0 300 за

6176 300 3,3 940 0.0 420 2.0

£2*60 2,4±1J 74725 одг±одг £1955 2.1±0,8*

*Р<0,05

Таблица 15. Частота встречаемости мнкроядер в крови тБяок чёрно-пВсгрой породы In vitro с использованием щггохалазива В,_

; Кошролшя Культура лимфоцитов in vitro с

Номер культура использованием дкгокнветяческого блока

яивот^ лимфоцитов

аого in vitro

_ Число Частота Число ■ Частота Число Частота

моно- лимфоци- моно- лимфоци- бинук- лимфоци-

гук- тов с мпх- иукде- тов с мик- левро- тов с МИЕ-

леа- роядра- аров ромира- ълниых роядра-

ров МВ,Ка ми, клеток Мв.%0

2604 750 15,0 900 8,0 200 14,0

2544 1000 19,0 1000 7,0 120 44,0

2627 1000 7,0 750 5Л 165 16,0

2603 1005 17,0 ■1005 15,0 355 18,5

2635 1005 15,0 750 25,0 120 42,0

2575 1000 12,0 1000 . 250 14,0

2601 1000 14,0 1000 5,0 180 11,0

г' У7760 14,Ш ,4 7,6905 10,8*2,7 1500 18,5*6,4*

*Р<0,05

3.9, Морфофупкциопальная характеристика лимфоцитов периферической крови коров пря поражении вирусом лейкоза

крупного рогатого скота. 3.9.1. Интерфазные ядрышкообрлзующие районы лимфоцитов коров при ВЛКРС Результаты, представленные в табл. 16 свидетельствуют, что средний показатель индекса ИЯОР у животных, положительных в РИД (РИД+), из хозяйства "Детскоселъский" составил 2,25±0,10, тогда как аналогичный показатель для животных, которые отрицательны в РИД (РИД-), ИЯОР не превысил 1,73±0,23 (различие достоверно при Р<0,01). Интересно отметить, что индекс ИЯОР для РИД+ животных из хозяйства "Красная славянка", с дважды подтверждённым вирусоносительством варьировал от 2,50 до 3,86 и в среднем составил 3,15±0,08; тогда кис индекс ИЯОР для труппы РИД-животных варьировал от 1,01 до 2,58 ив

Таблица 16. Индексы ИЯОР в лимфоцитах периферической крови

Хозяйство Индексы ИЯОР

РИД- РИД+

"Детскосельский" 1,73 ±0,23 ♦2^5 ±0,10

"Красная славянка" (I) <П) 1,82 ±0,02 2,01 ±0,07 **3,15±0,08 ***4,22±0,35

"Пушкинское" 1,91 ±0,15 •2,85 ±0,11

"Большевик" 3,12 ±0,12

I - первое исследование; П - второе . исследование. ♦Р<0,01; **р<0,005; ***р<0,001 (различия достоверны относительно сравниваемых групп животных (см. результаты), отрицательных в РИД).

среднем составил 1,82±0,!2 (различие достоверно при Р<0,005). Через год индекс ИЯОР проанализированный в оставшейся группе 1 из 10 РИД+ животных уже варьировал от 3,62 до 4,62 и составил в среднем 4,22±0,35, тогда как аналогичные показатели для контрольной группы варьировали от 1,85 до 2,86, а средний индекс ИЯОР составил 2,01 ±0,07 (различие достоверно при Р<0,СЮ1). Некоторую тенденцию в увеличении индекса ИЯОР для контрольной группы можно, по-видимому, объяснить увеличением возраста данной группы животных. Данные, полученные в

результате исследования 20 животных из учхоза "Пушкинское4 положительных в РИД свидетельствуют, что индекс ИЯОР, составивший 2,85±0,11, достоверно (Р<0,01) отличался от среднего значения для контрольной группы - 1,91±0,15 (22 головы). Результаты исследования б животных, положительных в РИД, из племенного совхоза "Большевик" показывают, что индекс ИЯОР составил 3,12±0Д2, что достоверно отличается от аналогичных показателей для всех исследованных контрольных груш! при Р«0,001.

3.9.2. Гетерогенность лимфоцитов периферической крови коров по частоте ннтерфаэных ядриш»сообразующих районов в ядре.

В табл. 17 представлены данные относительно анализа ИЯОР в цитологически различных субпоцуляцаях лимфоцитов из крови коров, положительных в РИД. В крови больных животных выявлялись не только лимфоциты, которые мы обозначаем как лимфоциты с округлой (регулярной) формой ядра, но и лимфоциты с

Таблица 17. . Индексы ИЯОР в различных цитологически верифицируемых субпопуляциях лимфоцитов у коров, положительных В РИД.

Популяции и субпопуляции лимфоцитов Животные (N=^7)

1 2 3 4 5 6 7

Общая популяция 2,62 3,11 3,33 3,50 3,42 3,39 3,17

Субпопуляция с регулярной формой ядра 2,56 3,05 3,26 ЗД9 3,33 3,25 3,13

Субпопуляция с нерегулярной формой ядра* 3,16 3,90 3,77 5,05 4,26 4,21 3,27

*0,05<Р<0,01, различие достоверно относительно субпопуляции лимфоцитов с регулярной формой ядра (и-критерий Вилкоксона-Маняа-Уитни).

лобулвровадпыми ядрами, с ядрами причудливой формы, которые мы обозначаем как лимфоциты с атипичной (нерегулярной) формой ядра. Как показывают результаты анализа, индекс ИЯОР в

субпопуляциях лимфоцитов с регулярной морфологией ядра не превышал 3,33, тогда как в субпопуляции лимфоцитов с атипичной морфологией ядра индекс ИЯОР варьировал от 3,16 до 5,05 (0,05<Р<0,01, по критерию В¡шкоксона-Манна-Уитни).

ВЫВОДЫ

1. В результате 5-тн циклов отбора клопов перевивной рабдомиосаркомы крыс субштамма РА-23 на повышенную частоту клеток с интерфазными мостами средняя частота клеток с интерфазными мостами повысилась с 0,$% до 10,0%. За 5 циклов отбора клонов перевивной рабдомиосаркомы крыс субштамма РА* 23 на понижение частоты клеток с интерфазными мостами средняя частота клеток с интерфазными мостами в популяциях понизилась с 0,8% до 0,3%.

2. В процессе отбора клеточных популяций на повышение частоты клеток с интерфазными мостами и отбора клеточных популяций на понижение частоты клеток с интерфазными мостами наблюдается положительная связь этого признака с частотами патологических митозов и клеток с нарушениями морфологии ядра (микроядра, "хвостатые" ядра). Следовательно, частота клеток с интерфазными мостами в клеточных популяциях перевивной рабдомиосаркомы крыс РА-23 является информативным показателем нестабильности клеточного генома.

3. Между признаками "частота клеток с интерфазными мостами" и "частота клеток с 'хвостатыми' ядрами" существует сильная положительная связь (г=0,85, Р<0,01), Следовательно, спонтанная частота клеток с "хвостатыми" ядрами в клеточных популяциях перевивной рабдомиосаркомы крыс РА-23 является информативным показателем нестабильности клеточного генома.

4. Облучение низкоэнергетическим электромагнитным полем в сочетании с лазерным облучением в оптимальном режиме снижает частоту формирования метастазов и числа ядрышек на одну клетку.

7. При электромагнитном облучении волнами пектагерцового диапазона в периферической крови подопытных крыс наблюдалось достоверное повышение содержания лимфоцитов и моноцитов.

8. В клетках костного мозга крыс, подвергшихся облучению электромагнитными волнами гектагерцового диапазона выявлено снижение в костном мозге содержания эозинофилов и нейтрофилов и, наоборот, повышение содержания гемогистобластов, метамиелоцитов, лимфоцитов и нормобластов (Р<0,05, икрнтерий Стьюдента).

9. В популяции клеток семенников животных, подвергшихся облучению волнами гектагерцового диапазона, выявлено

повышение частоты клеток с апоптотичесюади изменениями (0,05<Р<0,01; U-критерий Вилкоксояа-Манна-Уитни).

10. При комбинированном воздействии ниэкоэнергетического неременного магнитного поля и лазерного облучения выявлена тенденция в повышении частоты эритроцитов с микроядрами у мышей с режимом облучения 1,5 и 10 мин.

11. При комбинированном воздействии переменного низкоэнергетического магнитного поля н лазерного облучения методом микроэлектрофореза ДНК соматических клеток выявлено достоверное (0,05<Р<0,01, критерий Вилкоксона-Манна-Унтни) повышение частоты клеток с повреждениями в костном мозге у мышей с режимом облучения 10 МИН.

12. При комбинированном воздействии переменного низкоэнергетического магнитного поля и лазерного облучения в группе мышей с режимом облучения 5 мин выявлен наиболее выраженный эффект заживления кожи при стандартизованной травме (20,8±2,26; Р<0,001, t-хритерий Стьюдента).

13. При комбинированном воздействии переменного низкоэнергетического - магнитного ноля и лазерного облучения выявлена тенденция в повышении концентрации стволовых CD34 клеток костного мозга у мышей с режимом облучения 10 мин.

14. Спонтанная частота эритроцитов с мнкроядрами в популяциях карповых рыб Каспийского бассейна составила 1Д2±0,07%о, в популяциях осетровых рыб - 1,45±0,1б%о, Определены' частоты встречаемости "хвостатых" ядер у карповых (0Д7=Ш,04%«) и у осетровых (0^8±0,03%в). Выявлены достоверные . межполовые различия по частоте эритроцитов с микроядрами в выборке осетровых рыб (Р<0,05, t-хритерий Стьюдента).

15. Выявлены различия в труппе тёлок по частоте клеток с микроядрами между популяцией лимфоцитов-мононуклеаров и бинуклсиро ванными лимфоцитами, подученными с использованием цитокннешческого блока.

16. В выборке коров, положительных в РИД, обнаружено достоверное увеличение числа ядрышек на одну клетку в лимфоцитах in vivo. Показано, что с помощью индекса "отношение площади ядра к площади иягерфазных ядрышкообразукжщх районов" можно достоверно выявить различия, между лимфоцитами от коров, отрицательных и положительных в РИД.

17. Метод иммуноцитохимического анализа достоверно выявил различия по степени проявления ядерного антигена пролиферации клеток в лимфоцитах периферической крови коров, отрицательных и положительных в РИД, что свидетельствует о разном функциональном статусе генома указанных групп коров.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Рекомендуется использование показателя "частота «леток с 'хвостатыми' ядрами" в качестве количественного критерия определения нсстабильиости генома эукариотических клеток как на спонтанном уровне, так и при генотоксическом воздействии на клеточные популяции ш vitro и in vivo. .

2. Предлагается использовать метод окрашивания клеток нитратом серебра при млкрозлектрофорезе ДНК одиночных клеток в сочетании с регистрацией кзриоморфометрических показателей как дополнительный подход, позволяющий оценить воздействие генотокснчеких факторов на функцию и стабильность клеточного генома.

3. Применение показателей частота клеток с "хвостатыми" ядрами, эритроцитов с мнкроадрами и частота эритроцитов с "хвостатыми" ядрами (для зршроцнтов рыб) необходимо учитывать при экотокспкологическом мониторинге рыбных ресурсов.

4. Рекомендуется использование метода иммуноцитохимического анализа на клетках периферической крови для выявления ядерного антигена пролиферации клеток у коров положительных в РИД.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Proshin S.N, Kravtsov V.Yu-, Novitskiy V.V., Dinsldkh N.N. The study of micron uclei level In buman normal and tira or cells // Abstr. of IntCongress of Human Genetics. - Washington. -1992. - N324,

2. Прошин C.H., В JO. Кравцов. Субклонирование по признаку признаку "частота клеток с мостами" в клеточных популяциях перевивной рабдомиосаркомы РА-23 крыс ft Межд. Симп. Молекулярная генетика и биотехнология в оценке и изменении геномов сельскохозяйственпых животных. - 1994. -

• С.-Петербург. -C.90-9I.

3. О возможности выявления частот возникновения хромосомных аберраций в экстремальных условиях с помощью краткосрочных цитогепетических методов in vivo / Федорцева Р.Ф., В ДО. Кравцов, С.Н. Прошин и др. II Вторая межд. Научно-практическая конференция. - 1995. - г.Надым (Россия). - С.58.

4. Исследование частоты микроядер в клетках костного мозга и эритроцитах периферической крови у детей с детей с ортопедической патологией / Дудив МГ., Прошнн С.Н., Кравцов В.ГО. и др. // Материалы Всероссийской научно-практической конференции детских ортопедов-травматологов. -

1995. - С.-Петербург. - С.293-294.

5. Реакция костной наши на изменение регионарного кровотока в условиях хронического эксперимента / Дудин М.Г., Ярошевская БЯ, Прошнн С.Н. и др. // Материалы Всероссийской паучно-пракгической конференции детских ортопедов-травматологов. -

1996. - С.-Петербург. - Казань. - С.20+-207.

6. Кравцов В.Ю., С.Н. Пропши, М.Г. Ольвев, А.Ф. Яковлев. О возможности селекции на стабильность генома клонов эукариотических клеток // ХХХХ Научно-практическая конференция профессорско-преподавательского состава. - 1996. —Астрахань. - С.17.

7. Прошия С.Н., Кравцов BJO., Яковлев А.Ф., Каминская Е.В., Вахтнн Ю.Б. Селекция in vivo . по признаку "частота клеток с мостами". в клеточных популяциях рабдомиосаркомы РА-23 крыс if Гепетита. -1996. - Г32. - №3. - С.352-356.

8. Частота клеток с полумостами в клеточных популяциях in vivo / Кравцов BJO., Прошнн С.Н., Федориева Р.Ф. и др. И Доклады Академии Наук. -1996.-Т.350.-Ж6.-С.831-833.

9. Proshin S, Pavlova V, Mamaev N. Comparison of nuclear features and cytogenetic findings in patients with myelodysplastic syndrom (MDS). XIX Symposium of the International Association for Comparative Research on Leukemia and Related Diseases If Journal of Molecular Medicine. - 1997. - Vol.75, - Ж7. - B160.

10. "Tailed" shape of nucleus as a possible indicator of chromosome aberrations / Kravtsov V.Yii, Starkova B.V., Proshin S.N. et aL tf Cytogenet Cell Genet -1997. - Vol.77.-№.1-2. - P.7,

11. Genomic stability of tumour cells of rat rhabdomyosarcoma with different levels of tumorogenioucity / Vakhtin YiiB., Kaminskaya E.V., Proshin S.N. et aL // In: "Molecular detenninants of cancer metastasis" (Abstracts) 50th Animal Symposium on Fundamental Cancer Research. Houston.-Texas,- USA. -1997. - P. 122.

- 12. Кравцов В.Ю., Прошнн CJL, Яковлев А.Ф., Каминская ЕВ,, Бахтин Ю.Б. Мосты и многополюспые митозы в популяциях клеток рабдомиосаркомы РА-23 крыс . // Бюллетень

Экспериментальной Биологии и Медицины. -1997. - Т.123. - №.5. - С.569-572.

13. Пропши СЛ., Кравцов В.Ю., Ольнев М.Г., Яковлев А.Ф., Бахтин ЮЛ». Хромосомные мосты и "хвостатые" ядра в

популяциях злокачественных клеток // Генетика. - 1998. - Т34. -Ж1.-С.61-64.

M.ProshinS, Kaminskaya Е, VakhtinYu, KravtsovV, YakovlevA, Cells with "trailed nuclei" as markers of the breakages of the chromosome bridges 11XVIH International Congress of Genetics. - 1998. -Beijing. - China. - P32.

15. Mutagenecity and tumorigenerity in cells of lung metastases of rat rhabdomyosarcomas / Kammskaya E.V., Vakhtin Yu.B., Proshin S.N. et al. // 17th International Cancer Congress. - 1998. - Rio de Janeiro -Вгазз1.-Р.216.

16. AgNORs in cardiomyocytes from surgical patients with coronary heart disease / Mamaev NJJ, Kovalyeva O.V., Proshin S.N. et al. // J Clin PathohMol Pathol. - 1998. - Vol.51. - Jfs.4. - P^ 18-221.

17- Репродуктивная гибель клоиов и популяций перевивной рабдомиосаркомы РА-23 крыс при повышении спонтанных частот кариотипяческнх изменений с помощью искусственного отбора in vivo / Каминская Е.В., Кравцов BJO., Прошил СЛ. и др. И В кн.: Гомеостаз человека, экологическая безопасность и проблемы рака. -Алма-Ата, Республика Казахстан. - 1999.- С.238-240.

18. Частота встречаемости микроядер у быков производителей при лечении нейропротектором зооланом / Гаврилов Б А., Косякова ГЛ, Про шин С.Н. и др. // Научно-практическая конференция "Вклад молодых учёных в решение задач научного обеспечения АПК Северо-Запада РФ". - 1999. - Санкт-Петербург-Пушкин. - С.83-84.

19. Функциональная оценка гемопоэза крупного рогатого ската методом окрашивания ядрышковых организаторов серебром / Гаврилов Б.А., Старожилова Т.П., Прошин С.Н. и др. // Актуальные проблемы ветеринарной науки: Тез.докл. МВА им. КЛ.Скрябина. • 1999. -251 с.

20. Прошин СЛ., Смирнова Т.А., Яковлев А.Ф. Прижизненное исследование программируемой клеточной смерти (апоптоза) в клетках гранул€зы фолликулов крупного рогатого скота с помощью дифференциального окрашивания акридиновым оранжевым // Актуальные проблемы ветеринарной науки: Тездокя. МВА им. КЛИСкрябина. - 1999. - 251 с.

21. Прошин С.Н., Гаврилов БА-, Косякова ГЛ., Яковлев А.Ф. Применение микроядерного анализа с цитохалазиновым блоком для оценки влияния экологических факторов на геном крупного рогатого скота // Научно-практическая конференция "Вклад молодых учёных в решение задач научного обеспечения АПК Северо-Запада РФ". -1999.- Санкт-Петербург-Пушкин. - С.84-85.

22. Prosbin S Smirnova ТА, Kuzmina T.I., Yakovlev A J. Vital stuffy of Bovine granulosa cells during follicular development by differential staining with acridine orange for detection of apoptosis // The 50* Annual Meeting of the European Association for Animal Production. - ! 999. - Zurich, Switzerland. - P.328.

23. Влияние цихлоферона на мета стаз ировапие карциномы лёгких Льюис у мышей и рабдомносаркомы РА-23 у крыс / Забежинский М-А-, Коваленко АЛ., Прошив C.IL и др. // Вопросы онкологии. - 1999. - Т.45. - №.6. - С.650-654.

24. ТЪе effects of okadaic acid oat structure of nucleolar organizing regions (AgNORs) and nuclei , in tumor cells of rhabdomyosarcoma RA-23 tats observed by light and fluorescent microscopy / Proshin S.N., Kaminskaya E-V^ Kuzovatov S.N. et al. Н XI International Congress of Histochemistry and Cytochemistry. - 2000. - University of York, UK.-P.100.

25. Прошин С ЛI., Гаврилов Б.А., Косякова ГЛ., Яковлев А.Ф. Исследование частоты микроядер лимфоцитов крупного рогатого скота с использованием цигокннетического блока // Доклады РАСХН. - 2000. - №.6. - С.37-38.

26. Связь функциональной активности и апоптоза клеток периферической крови крупного рогатого скота / Прошин С.Н., Косякова ГЛХ, Смирнова Т.А. и др. // Актуальные проблемы биологии в животноводстве. - Тез. Докл. - Боровск. - 2000. - С.421.

27. Активность рибосомвых цистронов лимфоцитов крови при лейкозе / Прошин СЛ., Гаврилов Б.А., Старожилова TJL и др. d Ветеринария. - 2001. - Ж2. - С.25-27,

28. Структурные преобразования шггерфазных ЛОР в опухолевых клетках рабдомносаркомы РА-23, индуцированные окадааховой кислотой / Прошин СЛ., Каминская ЕЛ., Куэоватов СЛ. и др.//Цитология. - 2001. -Т.43.-J&.8.-C.738-741.

29. Изучение стабильности генома крупного рогатого скота методом ' микроядерного тестирования / Шумов А.В., Федоркова НВ., Прошил СЛ. и др. // Тезисы докладов международной научной конференции: "Современные проблемы селекции и племенного дела в животноводстве". - 2002. - ВНИИГРЖ, Санкт-Петербург. - Россия. - СЛ11-113.

30. Proshin S., Yamaguchi К-, Wada Т., Miyagi Т. Modulation of neuritogencsis by ganglioside-speci 2c sialidase. in Ьшпап neuroblastoma NB-1 cells// The 23rf Japanese Carbohydrate Research Meeting. - 2002. - Yokohama, Japan. - P.237.

31. Proshin S., Yamaguchi K-, Wada Т., Miyagi T. Modulation of neuritogenesis by ganglioside-speci fic sialidase (Neu 3) in neuroblastoma NB-1 cells//Neurochem Res. - 2002. V.27. - C.841-846.

32. Анализ струхтурно-функцтжалыгого состояния ддршшсовых организаторов кардимиоцнтов, фибробласто-подобных клеток и эндотелиоцитов у пациентов с наследственной обструктивной гипертрофической кардиомиопатией / Алмазов ВА., Гудкова АЛ., Прошин С.Н. и др. If Терапевтические архивы. - 2002, - Т.74, Jb.ll.-C. 56-59.

33. Морфофункгоюнальные особенности миокарда и экспрессия аргентофильных белков областей ядрышковых организаторов кардиомноцитов и стромаяьных клеток у больных семейной формой идиопатической рестриктивной кардиомиопатии / Гудкова AJB., Шяяхто Е.В., Прошин С.Н. и др. // Цитология. - 2003. - Т.45. - Jfe.9. - С.867-868.

34. Аномалии интерфазных ядер и частота ядрышкоорганизующих районов хромосом в популяциях опухолевых клеток рабдомиосаркомы РА-23 крыс при отборе этих клеток на чувствительность и резистентность к окадаиковой кислоте / Косякова Г.П., Прошин С.Н., Кузоватов С.Н. и др. // Цитология* -2003. - Т.45. - №.9. С.889.

35. Клинико-диагностические возможности метода мнкроэлектрофорез ДНК одиночных клеток (comet assay) для оценки целостности ДНК сперматозоидов / Степанов ГЛ., Прошин СЛ., Кравцов В.Ю. и др. 7/ Сборник науч. работ "Актуальные проблемы биологии". - Сибирский гос. Мед. Университет (Томск), г 2004. - ТЗ. - № 1. - С. 64-65.

36. Изменение частоты аномалий интерфазных ядер и ЛОР в популяциях опухолевых клеток рабдомиосаркомы РА-23 крыс при отборе на чувствительность и резистентность к окадаиковой кислоте / Косякова Г.П., Прошин СЛ., Гаврилов Е.А- и др. // Сб. науч. тр. "Селекционно-генетические методы повышения продуктивности сельскохозяйственных животных". - ГНУ ВНИИГРЖ (Санкт-Петербург). - 2004. - С.204-208.

37. Оценка влияния криоконсервации на целостность ДНК сперматозоидов быков / Прошин С.Н., Кравцов В.Ю., Паранян ИА. и др. // Цитология. - 2004. - Т.46. - № 9. - С.844-845.

3S. Особенности дестабилизации генома ретикулоцитов н эритроцитов • мьппей под влиянием магниго-лазерного излучения / Яковлев АФ., Прошин С.Н., Косякова ГЛ. и др. // XI международная конференция "Новые медицинские технологии и квантовая медицина" (Москва). - Российский Университет Дружбы Народов. - 2005. - С25-27.

39. Обоснование экологических стандартов по результатам генетического скрининга рыбных ресурсов каспийского моря /

Прошин С.FL, Косякова ГЛ., Курапов A.A. и др. Я 1-я межд. научно-практическая конференция: "Проблемы сохранения

экосистемы Каспия в условиях освоения нефтегазовых месторождений". - Астрахань. - 2005. - СЛ67-169.

40. Цитоморфологические особенности интерфазных ядрышкообразующих районов лимфоцитов крупного рогатого при лейкозе / Прошли СЛ., Косякова Г.П., Сторожилова Т.П. и др. И Селекшюпно-генетическне методы повышения продуктивности сельскохозяйственных животных: Сб. науч. тр. // ГНУ ВНИИГРЖ -- С.-П, 2006. - №.2. - С.159-162.

41. Ивтерфазные ядрышкообразугощие районы лимфоцитов крупного рогатого скота при лейкозе / Проншн CJL, Косякова ГЛ., Сторожилова Т.П. и др. Я Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных: Мат. межд. научно* практической конф. // ГНУ ВНИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко. - Москва. - 2006. - С.491-493.

42. Прошин СЛ., Косякова ГЛ., Грабовщинер АЛ., Яковлев А.Ф. Эффекты переменного магнитного поля и лазерного облучения на репарацию кожи и стволовые клетки у мышей. С.267-268. // Актуальные проблемы биологии в животноводстве: Мат. 4-й межд. конф. Н ВНИИФБиП, Боровск. - 2006. - 361 с.

43. Прошин CIL, Кравцов В JO-, Яковлев АФ., Федорцева Р.Ф., Бычкова Н.В., Бахтин КХБ., Никифоров А.М. Способ селекции популяций клеток In vivo // Патент на изобретение № 2111249 от 20 мая 1998 г.

44. Кравцов В JO., Старкова Е.Ю., Прошин СЛ., Яковлев А.Ф., Никифоров • А.М., Федорцева Р.Ф. Способ экспресс-выявления облучённых пациентов с повышенными частотами хромосомных аберраций// Патент на изобретение №2141658 от 20нохбря 1999 г.

Подписано в печать ] 1.01.2007г. Формат 60х 841/16 Бумага офссіваї. Обь&і 1.8 ю. iL Тира* 100 sao. Заказ № 8

Пи им НИИ «В» рипцм^и ГНУ ПИНЯМТІГУ Йпяудытмяуумпт