Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимосвязь морфологических характеристик интерфазного ядрышкового аппарата нормальных и трансформированных клеток человека в культуре и пролиферативной активности клеток

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Взаимосвязь морфологических характеристик интерфазного ядрышкового аппарата нормальных и трансформированных клеток человека в культуре и пролиферативной активности клеток"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ

На правах рукописи

выгиниый

Сергей Михайлович

ВЗАИМОСВЯЗЬ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК ИНТЕРФАЗНОГО ЯДРЫШКОВОГО АППАРАТА НОРМАЛЬНЫХ И ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА В КУЛЬТУРЕ И ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ КЛЕТОК

(специальность: 03,00.25 - клеточная биология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт- Петербург 1995

Работа выполнена в Институте цитолотяи РАН.

Научный руководитель - кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник С.Е.Мамаева.

Официальные оппоненты - доктор медицинских наук, профессор ЭЛ.Нейцтщт;

кандидат биологических наук Р.С.Баркан.

Ведущая организация - Гематологический научный центр РАМН

Защита состоится ]}\ У^^' 1995 г. в13час. на заседании специализированного ученого совета Д.002.73.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, С.-Петербург, Тихорецкий проспект,д.4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН,

Автореферат разослан " " февраля 1995 г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор биолотичееких наук

ц/( ихПисарева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема взаимосвязи пролиферативной активности клеток и морфологии интерфазного ядрышкового аппарата постоянно привлекает большое внимание исследователей.

Ядрышко является морфологическим выражением деятельности ядрышкового организатора - района ДНК, где локализованы гены, кодирующие основные классы рибосомной РНК. В интерфазных ядрах ядрышкообразующим районам хромосом (ЯОР) соответствуют элекг-рокнопрозрачные образования, именуемые фибриллярными центрами, которые окружены плотными фибриллярными и гранулярными компонентами. Фибриллярные центры (ФЦ) содержат расплетенную ДНК, а гранулярный компонент ядрышка представлен созревающими прерибосомамн.

Число и размеры (фибриллярных центров в клетках существенно варьируют в зависимости от интенсивности транскрипции рРНК. Интенсивность синтеза рРНК различается у клеток, находящихся в различных фазах клеточного цикла, но особенно большие различия наблюдаются между проли-ферирующими и непролнферирукшшмн популяциями клеток. Следовательно, морфология ядрышка достаточно тесным образом связана с клеточной лролиферацией, изучение морфологии ядрышка может быть использовано для оценки клеточной пролиферации.

Особый интерес исследователей к проблеме взаимосвязи морфологии ядрышка и процессов клеточной пролиферации связан с развитием в последние годы способа окрашивания ядрышкообразующих районов хромосом в интерфазном ядре с использованием нитрата серебра, который избирательно связывается в ядрышке с определенным классом кислых протеинов, имеющих непосредственное отношение к транскрипции и процессингу рибосомной РНК.

К моменту начала нашей работы в литературе имелось лишь небольшое число публикаций, посвященных взаимосвязи состояния ядрышкообра 1у-ющих районов хромосом и кинетики клеточных популяций, выполненных на культурах клеток человека (см. обзор Осгспгнм, Тгеге, 1941). В частости, было показано, что среднее число гранул серебра в ингерфазных ядрах исследованных клеточных линий обратно пропорционально времени удвоения (Пегспгии е! а!., 1989). Ангоры подчеркивали существование корреляции между средней площадью окрашивания ЯОР жиратом серебра, чис шм гранул серебра м жпсрфазном ядре и группой показателей акгпшшеш кле--

1 очной пролиферации- нолей клеток в Б фазе клеточного цикла, интенсивностью сшпеза ДНК в клеточной популяции, долей клеток, несущи* "аигигены пролиферации" (Оегегшги е1 а1., 1990, Оегегшш, Тгеге, 1991).

Однако, в этих работах не было изучено распределение клеток по содержанию гранул серебра в зависимости от положения их в клеточном цикле. Оставаясь неизвестной степень корреляции между долей клеток е 8-фазе клеточного цикла и числом ядрышек, их площадью, показателями, характеризующими положение ядрышек в ядре.

Кроме того, не были изучены некоторые методологические аспекты использования нитрата серебра для оценки состояния ядрышкообразующт районов хромосом, влияние условий гипотонической обработки клеток н обработки клеток препаратом ДРБ (5,6-дихлоро-1Ь-0-рибофуранозилбенз-имидазолом) на результаты окрашивания.

Цели и задачи исследования.

1. Исследовать взаимосвязь доли клеток, включающих радиоактивный тимидин в культуре - индекса мечения (ИМ), и ряда морфологических параметров, характеризующих активность ЯОР интерфазных ядер: числа ядрышек в ядре, площади ядрышек, числа периферических ядрышек (ПЯ) -показателя, характеризующего положение ядрышек в ядре и числа гранул серебра в ядрышке при окрашивании клеток нитратом серебра.

2. Изучить зависимость числа гранул серебра в интерфазном ядре 01 положения клетки в различных фазах клеточного Цикла.

3. Выяснить степень зависимости среднего числа гранул серебра в интерфазном ядре от времени удвоения для различных культур клеток,

4. Определить зависимость числа гранул серебра в интерфазном ядре от условий приготовления препаратов - тоничности используемого гипотонического раствора и длительности инкубации клеток в присутствии препарата ДРБ.

Научная новизна. В результате проведенного исследования изучена зависимость различных морфологических показателей состояния интерфазного ядра исследованных клеточных линий, и показателей интенсивности ю пролиферации.

Результаты работ, проведенных с использованием трансформированные культур клеток и эмбриональных фибробластов человека, показали, чте существует корреляция между долей клеток, включающих радиоактивны! тимиЛг1Н,и числом гранул серебра в. ядре, площадью ядрышек, числом пе риферическнх ядрышек (ПЯ). Впервые обнаружено, что наиболее сильна)

корреляция наблюдается между индексом мечения клеток тимидином (ИМ) и числом ПЯ (г = 0,96), меньшая между ИМ и числом гранул серебра, ИМ и площадью ядрышек. Подавление пролиферации как способом контактного торможения, так и культивированием на среде со сниженным содержанием сыворотки, приводит практически к одинаковым изменениям исследованных морфологических показателен. Показано, что число гранул серебра в ядре и площадь ядрышек в клетках изменяются с разной скоростью при торможении и стимуляции пролиферации клеток: число гранул серебра и площадь ядрышек при прекращении пролиферации, вследствие сывороточного голодания культур, медленно снижаются в течение 10 сут, а увеличение названных показателей при стимуляции пролиферации происходит быстро, в течение 16 ч.

Разработан способ определения числа гранул серебра и содержания ДНК в одном и том же интерфазном ядре. Он использован для изучения распределения клеток Н1-60 по числу гранул серебра в ядре в зависимости от положения клетки в клеточном цикле.

Показано, что наблюдается обратно пропорциональная зависимость времени удвоения популяции и среднего числа гранул серебра в интерфазном ядре для суспензионных культур клеток лейкозного происхождения Н1-60, К-562, и-937.

Отмечено, что использование гипотонической обработки клеток перед приготовлением препаратов приводит к диссоциации ядрышка и увеличению вследствие этого выявляемого числа гранул серебра в ядре. Число гранул серебра увеличивается также при использовании для гипотонической обработки клеток растворов меньшей тонпчности.

Показано, что применение препарата ДРБ (5,6-дихлоро-1Ь-0— рибофура-нозилбензимидазола), вызывающего модификацию ядрышка, облегчает подсчет гранул серебра вследствие уменьшения взаимных наложений гранул и повышения контраста в окраске гранул по сравнению с фоном. Максимальное число гранул серебра наблюдается при обработке клеток этим препаратом в течение 1ч ЗОмин.

Практическая ценность. Данные о взаимосвязи интенсивности пролиферации клеток и морфологических показателей состояния ядрышка дают возможность использовать эти морфологические показатели в диагностической патологии, и особенно н онкологии. Результаты настоящей работы подтверждают наличие корреляции пролиферапшнои активноегм клеток н числа гранул серебра п ядре, площади ядрышек, числа ПЯ нрн окр.шшча-нии ядер азотнокислым серебром. При лом обнаружено, что нзиоилынз*

корреляция наблюдается между ИМ и числом ПЯ, что делает последний показатель наиболее перспективным для оценки пролиферативных процессов в клеточных популяциях.

Анализ влияния условий приготовления препаратов на результаты окрашивания ядер нитратом серебра позволяет рекомендовать, с целью облегчения подсчета числа гранул серебра в интерфазном ядре, гипотоническую обработку клеток 0,055 М раствором КС1 вместо традиционно используемого 0,075 М раствора, а также инкубацию клеток в присутствии 25 мкг/мл ДРБ в течение 1,5ч.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на Всесоюзном совещании "Функциональная морфология клетки" (С. Петербург, 1991), на совещании "Биология клетки в культуре" (С.-Петербург, 1992), на XI симпозиуме "Структура и функция клеточного ядра" (С: Петербург, 1993) и межлабораторных семинарах в Институте цитологии РАН.

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 9-ти работах, список которых приведен в конце автореферата.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, трех основных глав, выводов и списка литературы. Общий объем диссертации составляет 109 страниц, из них 99 страниц машинописного текста, 9 рисунков, 6 таблиц. Список цитируемой литературы содержит 156 работ.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили культура легочных эмбриональных фибробластов человека и культуры лейкозных клеток HL-60, К-562 и U-937. Суспензионные культуры рассевали в чашки Петри, а эмбриональные фибробласты рассевали на матрасы или покровные стекла, помешенные на дно чашек Петри для последующего исследования, культуры клеток в виде монослоя. ' , •

В часть культур перед снятием добавляли препарат ДРБ в концентрации 25 мкг/мл. По окончании срока культивирования проводили гипотоническую обработку клеток 0,075 М раствором КС1 или растворами KCI.с концентрацией 0,055 М или 0.03S М для 1)зуч^ния влияния гипотонической обработки на результаты последующего окрашивания нитратом серебра Клетки фиксировали смесью метанола с ледяной уксусной кислотой (3:1) Препараты из клеток суспензионных линии готовили способом раскапывания. ' ' ' . . . ' ,

Препараты с фиксированными клетками окрашивали нитратом серебра во влажной камере под покровным стеклом при температуре 60'С. Раствор для окрашивания готовили непосредственно перед окрашиванием каждого препарата, смешивая на предметном стекле 100 мкл. 50%-ного раствора AgN03 и 50 мкл 1%-ного раствора муравьиной кислоты в 2%-ном растворе желатины (Ploton et al., 1986). Оптимальное время окрашивания препаратов определяли в предварительной серии опытов по максимальному числу гранул серебра в ядрах клеток. Ядра докрашивали в растворе красителя Гимза.

Число гранул серебра в ядрах интерфазных клеток подсчитывали при увеличении микроскопа об 100 xl.3, ок х 15. Использовали способ полсчета количества гранул серебра, при котором подсчитывается число раздельно лежащих гранул серебра и число гранул, которые контактируют между собой и входят в состав более крупных депозитов серебра (Crocker et al., 1989). В опытах по изучению влияния гипотонической обработки, обработки клеток препаратом ДРБ, влияния контактного торможения и сывороточного голодания подсчитывали число гранул серебра в 200 клетках на точку. .

Морфометрический анализ препаратов проводили с помощью анализатора изображений Magiscan-2AR (Joyce-Loebl, England), используя, стандартное программное обеспечение - программы "Меню". В этих экспериментах анализировали по 100 клеток на каждом препарате. При этом подсчитывали площадь ядрышек, число ядрышек, число периферических ядрышек (ПЯ) в клетках. ПЯ считали ядрышки, которые на препарате имеют общую границу с границей ядра протяженностью более чем 0,5 мкм.

Для определения времени удвоения суспензионных клеточных культур производили подсчет концентрации клеток в 4-х чашках Петри через каждые 24 часа после рассева.

Проточную цитофлюориметрию ДНК проводили после окрашивания клеток красителем Хехст 33258 на проточном цитофлюоримегре АТС-3000 фирмы (Beckman, France).

Для определения содержания ДНК и подсчета гранул серебра в ядрах одних и тех же клеток культуры Н1-60 препараты фотографировали при малом увеличении микроскопа, составляли карты расположения клеток, затем препараты окрашивали с помощью флуоресцентного варианта реакции Фельгена и измеряли содержание ДНК в ядрах клеток с помощью цигоф-луориметра (Розанов, Кудрявцев 1967). После этого препараты окрашивали нитратом серебра и производили подсчет гранул серебра н ядрах тех же самых клеток, в которых ранее было определено содержание ДНК. IV iy.'im.i-

ты исследования представляли на гистограмме в виде 2-х мерного распределения.' Другую часть этой же культуры клеток использовали для выделения 2с ДНК клеточной популяции. Выделение проводили ь градиенте 3 -12% сахарозы под действием силы тяжести. Контроль содержания ДНК выполняли методом проточной цитофотометрии ДНК.

Способы контактного торможения и сывороточного голодания культур были использованы для изменения уровня пролиферации эмбриональных фибропластов и клеток Н1-60 в экспериментах по изучению зависимости между количеством гранул серебра, площадью ядрышек клетки, количеством ядрышек в клетке, количеством ПЯ и долей клеток, включающих тимидиновую метку.

Сывороточное голодание культуры эмбриональных фибробластов осуществляли путем замены ростовой среды с 10% сыворотки на среду, содержащую 0.5% сыворотки. Такую замену осуществляли через 24 ч после рассева клеток. Через 11 сут.культивирования среду заменяли свежей ростовой средой с 10% сыворотки для отмены сывороточного голодания и инициации пролиферации клеток. Контактное торможение пролиферации вызывали,культивируя клетки со сменой ростовой среды без пересева.

Синтез ДНК в клетках изучали методом авторадиографии,для чего в культуральную среду добавляли раствор 3Н тимидина, готовили препараты, покрывали их фотоэмульсией, экспонировали в темноте, обрабатывали и подсчитывали долю меченых клеток.

Для подсчета числа гранул серебра в клетках реплицирующих и мереп-лнцирующих ДНК проводили мечение клеток 3Н тимидином, готовили препараты, окрашивали их нитратом серебра, фотографировали их при малом увеличении микроскопа, составляли карты расположения клеток, иод-, считывали число гранул серебра в ядрах и, наконец, покрывали препараты эмульсией для выявления синтезирующих и нееинтезируюгцих ДНК клеток.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние условии приготовления препаратов па результаты подсчета числа гранул серебра в ядрах клеток

Результаты окрашивания пнтерфазных ядер нитратом серебра зависят о г условий приготовления препаратов. Гипотоническая обработка раствором КС1 с концентрацией 0.075 М наиболее часто используется при исследовании ЯОР шперфазпых ядер для облегчения анализа роультатов окрашивания. Проведение гипотонической обработки клеток приводит к декон-

денсации ядрышка и увеличивает выявляемо? число гранул серебра. Среднее число гранул серебра в интерфазном ядре для эмбриональных фиброб-ластов человека составляет 19.7 + 0.6 для клеток, подвергшихся гипотонической обработке 0.075 М раствором КС1 и 13.4 + 0.4 для клеток, не подвергавшихся гипотонической обработке.

Как показывают результаты, представленные в табл. 1, при уменьшении тоничности гипотонического раствора как для фибробластов, так и для клеток линии HL-60 среднее число гранул серебра в интерфазном ядре возрастает. Визуально, обработка клеток 0,055 М раствором КС1 является оптимальной для подсчета гранул серебра.

Таблица 1. Зависимость числа гранул серебра, определяемых в клетках Н)-60 н эмбриональных фибробластах человека от условий гипотонической обработки клеток

Концентрация раствора КС1 Число гранул серебра X ± Sx

в фибробластах в клетках HL-60

0.075М 19.7 + 0.6 12.5 + 0.5

0.055М 23.1 ±0.8 15.4 i- 0.6

0.038М 24.1 ± 0.8 16.1 + 0.6

Примечание: на каждую точку подсчитывали по 200 клеток.

Для того, чтобы результаты подсчета гранул серебра более точно отражали активность ЯОР, желательно получать препараты, в которых гранулы серебра в ядрышках, максимально изолированы друг от друга. Диссоциация компонентов ядрышка вследствие гипотонической обработки клеток увеличивает долю гранул, лежащих изолированно и облегчает подсчет гранул. Вследствие такой обработки уменьшается субъективность в оценке результатов окрашивания Я01'.

Диссоциация компонентов ядрышка может быть получена при действии на клегки некоторых фармакологических веществ. Одним из таких веществ является препарат ДРВ (Огашк. 1975). Серебрение клеток, подвергнутых «озлепстшно ДРЬ, а затем гипотонической обработке, покалывает на'пгше в ядрышках цепочек гранул сопоставимою размера. Среднее число I ранул серебра при инкубации с ДРБ как эмбриональных фибробластов, так и клепж 111-60 во ¡растет: число 1 ранул серебра в имтерфашом ядре для фибрибдастк \ исли'ншаек'и с И.7 ± 0.г> ло 2-4.6 ± 0.7, а Х1Я клеток Н1-60 с

12.5 + 0.5 до 14.3 + 0.5 - для культур, подвергшихся только гипотонической обработке 0.075 М раствором KCl и для культур, подвергшихся обработке препаратом ДРБ в течение 1.5 ч и последующей гипотонической обработке 0.075 М раствором KCl, соответственно. В обеих культурах максимальное число гранул серебра наблюдалось при сроке инкубации 1.5 ч.

Рядом авторов высказывается мнение о том, что использование препарата является перспективным для визуализации абсолютного числа транскрипционных кластеров в ядрышке (Scheer et al., 1984). Данные нашей работы позволяют рекомендовать для подсчета гранул серебра в ядрах интерфазных клеток при окрашивании нитратом серебра инкубацию клеток в присутствии ДРБ в течение 1,5 часов при концентрации препарата в растворе 25 мкг/мл и последующую гипотоническую обработку клеток.

Взаимосвязь показателей, характеризующих морфологию интерфазного ядрышка клетки и параметров клеточной пролиферации

Зависимость среднего числа гранул серебра в ядрах интерфазных клеток

Нами проанализирована взаимосвязь времени удвоения популяции клеток, числа гранул серебра в интерфазном ядре и числа серебрящихся хромосом в суспензионных культурах клеточных линий человека U-937, Н1-60, К-562 (табл. 2). Выбор суспензионных клеточных культур для исследования обусловлен необходимостью точного определения времени удвоения клеточной популяции.

Таблица 2. Взаимосвязь времени удвоения, числа ЯО хромосом и числа гранул серебра в интерфазном ядре

Линия Число ядрышко-образующих хромосом Число серебрящихся ядрышко-образующих хромосом Число гранул серебра в интерфазном ядре X±Sx Время удвоения клеточной популяции (Ч.) X+Sx

U-937 16 . 4 13.1 ±0.4 52.0 ± 4.9

HL-60 10 7 13.7 ± 0.2 51.6 + 4.2

К-562 16 12 32.0 ± 0.5 29.4 ± 3.1

Примечание; на каждую точку подсчитано по 200 клеток.

Приведенные данные подтверждают обратную зависимость между такими параметрами, как время удвоения популяции и среднее число гранул серебра в ядрах клеток при сравнении линий с высокой пролиферативной активностью (К-562) и с низкой пролиферативной активностью (11-937, Н1-60). Обращают на себя внимание сопоставимые величины числа гранул серебра для культур, имеющих одинаковое время удвоения клеточной популяции, но отличающихся по числу серебрящихся хромосом.

Зависимость числа гранул серебра в интерфазном ядре клеток Н1-60 от содержания ДНК в ядре

На рис. 1 представлены данные о числе гранул серебра в ядрах клеток Н1-60 в зависимости от содержания в них ДНК. Данные получены путем последовательного определения в одних и тех же ядрах числа гранул серебра и содержания ДНК. На рис. 2 представлена гистограмма данной культуры, полученная методом проточной цитофотометрии, свидетельствующая об отсутствии полиплоидной субпопуляции в данной культуре клеток. Т. о., клетки с 2с содержанием ДНК соответствуют клеткам, находящимся в 01 или вО периоде, клетки с содержанием ДНК 4с соответствуют клеткам, находящимся в 02 периоде и митозе, а клетки с содержанием ДНК между 2с и 4с соответствуют клеткам в Б фазе.

Результаты, представленные на рис. 1, свидетельствуют, что среднее число гранул серебра в ядрах увеличивается в ходе клеточного цикла. Эти . данные находятся в соответствии с данными других авторов относительно изменения числа ФЦ по ходу клеточного цикла. Анализ результатов, приведенных на рис. 1, показывает, что среднее число гранул серебра для клеток культуры Н1-60 при увеличении количества ДНК в ядре от 2с до.4с возрастает примерно вдвое с 7,6 до 16,8, в то время как число ФЦ увеличивается более чем в 4-х раза (Зацепина и др., 1988).

Известно, что популяция 2с ДНК состоит из субпопуляции покоящихся (вО) и субпопуляции пролиферирующих клеток (01), которые существенно отличаются между собой по активности клеточного метаболизма, содержанию и уровню синтеза РНК. Для оценки соотношения СО и субпопуляций внутри фракции клеток с содержанием ДНК 2с проведено выделение этой фракции клеток под контролем проточной цитофотометрии с последующей инкубацией фракции в кондиционированной ростовой среде в течение времени меньшего, чем длительность Б+С2 фаз клеточного цикла. При этом клетки субпопуляции 01, в отличие от клеток субпопуляции 60, прогрессируют по циклу, содержание ДНК в ядре таких клеток превы-

ЧИСЛО ГРДНУЛ СЕРЕБРЯ

ни- 60

5» М-

Зй

ах

1М >

111 \ I

50 100 I» 2М 2»

Рис. 2. Гистограмма культуры шст Н1-00 по содержанию ДНК. По оси абсцисс - ДНК, По оси ординат - число клеток. Проточная дитофотометрия.

гг-.

40 О С

О О «о о о о о о во со

ев» »о

4

оо

00 о о

о е ООО

о оаоэо о в

о о « о в А ООО«

О О ©

его о еоо в о '

о оошоо о о о о

е оо о о

ООО о о I о о о

в о о о

О ООО о о о

О «СП «

О

_1_

_1_

л.

5В 10в 150 200 ФЛУОРЕСЦЕНЦИЯ <<зню

Рис. 1. Зависимость числа гранул серебра в ядрах клеток Н1-60 от содержания ДНК в ядре. Каждая точка соответствует одной клетке и нанесена

Г.П рийтннои Т1П П ^ ОЛ ПП ПГ«М ЛПТТЪГОЯТ ТТТ!а и^Л^жяннст пгэаииикпг ид

о

оо о ООО о о

• о

а

со

о

*

во

- И -

щает 2с. Различие в содержании ДНК позволяет оценить соотношение (¡0 л 01 субпопуляций клеток.

Через 8 час после помещения клеток в ростовую среду была получена гистограмма, которая свидетельствует о том, что около 43% популяции, со-зержащей 2с ДНК, в данной культуре представлено покоящимися клетками. Таким образом, заметное различие в количестве и уровне сишсза РНК, :уществующее между 60 и 61 субпопуляциями клеток, не приводит к аналогичному различию клеток этих субпопуляций по числу в них гранул серебра.

Изменение среднего числа гоанул серебра в интерфазном ядре п ку/Ци гурах клеток Н1-60 и Ц-937 при репликации ДНК

При изучении морфологических показателей состояния ЯОР хромосом в интерфазном ядре целесообразно получить не только распределение популяции клеток по числу гранул серебра в зависимости от содержания ДНК, но и распределение клеток по числу гранул серебра в интерфазном идре в зависимости от их прогрессии по клеточному циклу, подсчитать число гранул серебра отдельно для покоящихся и пролиферирующих клеток.

Для идентификации покоящихся и пролиферирующих субпопуляции мы использовали способ длительного мечения клеток тимидином в течение времени, равного длительности фазы С2 клеточного цикла для данною типа клеток. При таком способе мечения оказываются мечеными клетки, которые находятся в Б фазе клеточного цикла, и те клетки, которые вышли в 02 фазу клеточного цикла, завершив синтез ДНК. Клетки, находящиеся и СО, 01, в20 фазах клеточного цикла,метку не включают.

Продолжительность фазы С2 клеточного цикла определяли по появлению меченых митозов.

Результаты определения числа гранул серебра лля популяции клеток, включающих метку, и для популяции клеток, не включающих меI ку, приведены в табл. 3.

Таблица 3. Содержание гранул серебра в интерфазных ядрах для клеток и-937 и Н1-60 в зависимости от положения в клеточном цикле

Линия Число гранул серебра в субпопуляциях клеток С1/С0, БС} и 020 Число гранул серебра в субпопуляциях клеток Б и 02 Кратность увеличения числа гранул серебра в субпопуляциях Б и в2

Н1-60 16,3 ± 0,2 18,7 ±0,1 1,15

и-937 19,2 ±0,1 23,1 ±0,1 1,20

Представленные выше данные свидетельствуют о том, что субпопуляции клеток Н1-60 и клеток и-937 реплицирующих или уже закончивших репликацию ДНК незначительно отличаются по числу гранул серебра в ядре от непролиферирующих или не прошедших репликацию ДНК субпопуляций этих же клеток.

Таким образом, при изучении динамики пролиферативной активности в одной и той же культуре клеток целесообразным является поиск иных, чем среднее число гранул серебра, морфологических критериев, характеризующих состояние интерфазного ядра.

Изменение числа ядрышек, площади ядрышек, числа ПЯ и числа гранул серебра в культурах при изменении уровня их пролиферативной активности

Работа проведена на культуре эмбриональных фибробластов человека. Пролиферативную активность клеток изменяли путем применения способов контактного торможения и сывороточного голодания. Названные ело-' собы изменения интенсивности клеточной пролиферации являются,на наш взгляд,наиболее физиологичными. Кроме того, применение сывороточного голодания позволяет изучить изменение морфологии ядрышка не только при торможении пролиферации, но также и при инициации клеточной пролиферации, вызванной отменой сывороточного голодания. Пролиферативную активность клеток оценивали методом рэдиоавтографии по включению меченого тимидина.

В табл. 4 представлены результаты изучения морфологии ядрышка и доли меченых клеток в культурах, подвергшихся сывороточному голоданию.

Таблица 4. Состояние ядрышкового аппарата эмбриональных фиброб-ластов человека и доля клеток в 5-фазе клеточного цикла в условиях культивирования на среде с пониженным содержанием сыворотки

Длительность культивирования Число гранул серебра Х±Бх * Суммарная площадь ядрышек, мкм2 Х±вх ** Число ядрышек Х±Бх * Число ПЯ Х±Бх * Доля меченых клеток, %***

1 17.1+0.4 14.6 ± 0.9 3.4 ± 0.2 0.68 ±0.12 33.0

2 13.5 ± 0.4 7.5 + 0.4 3.2 ±0.1 0.09 + 0.03 3.4

3 12.5 ±0.3 9.3 + 0.5 3.3 + 0.1 0.24 ± 0.07 3.0

4 11.9 ±0.2 7.1 ±0.4 3.4 ±0.1 0.07 ±..02 0.0

6 9.3 ± 0.2 8.3 ± 0.5 3.2 ±0.1 0.06 ± 0.03 0.0

11 9.1 ±0.3 6.8 + 0.4 3.2 ±0.1 0.02 ± 0.01 0.0

12 14.9 ±0.4 11.9 + 0.6 2.8 + 0.1 0.12 ±0.04 6.4

Примечание. Через 24 ч после рассева ер?аа, содержащая 10% сыворотки, была заменена на среду, содержащую 0.5% сыворотки. Через 11 сут. после рассева клетки были вновь помешены в Среду с 10% сыворотки. На 12-е сут.культивирования клетки были исследовали через 16 час после смены среды.

* - подсчитывали по 200 клеток на точку, ** - подсчитывали по 100 клеток на точку, *** - подсчитывали при анализе 1000 клеток.

Из данных, представленных в таблице, видно, что индекс мечения клеток снижается в течение первых суток сывороточного голодания почти в 10 раз, что характеризует прекращение вступления клеток в Б фазу клеточного цикла. В дальнейшем, снижение индекса мечения клеток (2-11 сут) незначительно. Одновременно со снижением индекса мечения происходит снижение числа Г1Я, площади ядрышек, числа гранул серебра в интерфазном ядре. Наиболее быстро из рассмотренных показателен снижается число -ПЯ, достигая 10% начальною значения на 4-ые сутки от начала сывороточного голодания.- .С 4 по И! сут. эксперимента происходило лишь незначительное снижение числа II Ял як жо.какйнндекса мечения. Средняя

площадь ядрышек и количество гранул серебра в ядре в те же сроки снижаются медленнее, составляя через 4 сут.от рассева (3 сут.от начала сывороточного голодания культур) 49 и 70% от исходных величин, соответственно.

Коэффициенты корреляции между показателями состояния яд-рышкового аппарата в различные сроки культивирования и долей меченых клеток в эти сроки оказались различными: для количества ПЯ коэффициент корреляции (г) составил 0.96, для суммарной площади ядрышек г = 0.88, для количества гранул серебра ь ядре г = 0.79 (во всех случаях Р< 0.001). Количество ядрышек в ядре не коррелировало с долей меченых клеток (г = 0.30, Р >0.05). При торможении пролиферации клеток, помимо указанных изменений показателей состояния ядрышкового аппарата, визуально обнаруживается уменьшение изрезанное™ контура ядрышек и более компактное расположение гранул серебра в ядрышке. Эти данные находятся в соответствии с работами других авторов, касающимися изучения динамики формы ядрышка при изменении пролиферативной активности клеток.

При исследовании культур, в которых замедление пролиферации клеток было вызвано контактным торможением (культуры были оставлены без пересева и три раза проводилась смена ростовой среды на свежую), получены следующие результаты (табл. 5).

Таблица 5. Состояние ядрышкового аппарата эмбриональных фиброб-ластов человека и доля клеток в Б-фазе клеточного цикла в условиях контактного торможения пролиферации

Длительность культивирования. Число гранул серебра Х±5х * Суммарная площадь ядрышек,мкм2 Х±5х *» Число ядрышек Х±Бх * Число ПЯ Х±Бх * Доля меченых клеток, %***

1 17.1 ±0.4 14.6 + 0.9 3.4 + 0.2 0.68 ±0.12 33.0

12 10.4 ± 0.3 6.2 + 0.3 3.7 + 0.1 0.05 ± 0.02 0.4

Примечание. * - подсчитывали по 200 клеток на точку, ** - подсчитывали по 100 клеток на точку, *** - подсчитывали при анализе 1000 клеток.

Как известно, торможение клеточной пролиферации разными способами, хотя и сопровождается одинаковым уровнем падения мечепия клеток.

приводит к разнонаправленному изменению метаболизма- и содержания РНК (ВагсупЫе'адсг "Л аЬ, 1980). Результаты, представленные в табл. 4, 5, показывают, что изменение показателей состояния ядрышкового аппарата при обоих способах торможения пролиферации совпадает. Это свидетельствует о том, что изученные параметры: количество гранул серебра, площадь ядрышек клетки, число ПЯ более чувствительны к уровню синтеза ДНК в клеточной популяции, чем к уровню синтеза РНК.

Наши данные, касающиеся корреляции одного из перечисленных параметров - числа гранул серебра в интерфазном ядре и уровня синтеза ДНК совпадают с наблюдениями других авторов. В то же время следует отметить, что исследования, касающиеся зависимости числа ПЯ в культуре клеток от уровня синтеза ДНК,ранее не проводились.

Представляет интерес исследование корреляции морфологических параметров ядрышка клетки и уровня синтеза ДНК для других культур клеток. В табл. 6 приведены результаты эксперимента, выполненного на суспензионной клеточной линии Н1-60. Изменение уровня пролиферации клеток вызывалось плотностным торможением.

Таблица 6. Состояние ядрышкового аппарата клеток Н1-60 и доля клеток в Б-фазе клеточного цикла

Длительность культивирования Число гранул серебра Х+Бх * Суммарная площадь ядрышек,мкм2 Х+Ях " Число' ядрышек Х±Бх * Число ПЯ Х±вх * Доля меченых клеток,

1 12.9 ± 0.8 43.9 + 3.1 3.2 ± 0.3 1.52 + 0.25 52,3

6 10.9 ± 0.6 38.9 ± 4.1 3.2 ± 0.2 0.78 ± 0.19 21,4

Примечание: * - подсчитывали по 200 клеток на точку, ** - подсчитывали по 100 клеток на точку, *** - подсчитывали при анализе 1000 клеток.

Приведенные данные, так же, как и результаты работы, выполненной на эмбриональных фибробластах, свидетельствуют о наличии корреляции между уровнем синтеза ДНК, количесгвом ПЯ, числом гранул серебра, площадью ядрышек клетки. Среднее число ядрышек в клетках культур с высоким и низким уровнем пролиферации не изменяется.

Использование сывороточного голодания для изменения уровня пролиферации клеток дает возможность изучить морфологию ядрышка не только при торможении пролиферации, но также и при стимуляции пролиферации, вызванной отменой сывороточного голодания.

В представленной работе стимуляция пролиферации достигалась отменой сывороточного голодания и переводом культуры эмбриональных фиб-робластов на обычную ростовую среду (табл. 4, длительность культивирования 12 сут). В культурах возобновилась пролиферация клеток: через 16 час после отмены сывороточного голодания доля меченых клеток возросла от 0 до 6.4% и достигла 19,4% от таковой на 1 сут.культивирования. Одновременно на 12 сут.культивирования (отмена сывороточного голодания) по сравнению с 11 сут.культивирования (условия сывороточного голодания) возросли: число гранул серебра в ядре на 64%, суммарная площадь ядрышек на 75%, число ПЯ на 600% (табл. 4).

Таким образом, результаты изучении морфологии ядрышка при стимуляции пролиферации, так же, как и при торможении пролиферации различными способами, свидетельствуют о наличии корреляции между долей меченых клеток и группой морфологических показателей: площадью ядрышек, числом гранул серебра в ядрышках, числом ПЯ.

Площадь ядрышек и количество гранул серебра в ядре имеют сходную корреляцию с числом меченых • клеток. Обращает на себя внимание, что при прекращении пролиферации снижение площади окрашивания и числа гранул происходит медленно в течение нескольких суток, а при стимуляции пролиферации число гранул серебра и площадь окрашивания быстро, в течение 16 часов, возвращаются к цифрам, которые составляют 87% и 82%, соответственно, от исходных величин. Такое поведение ядрышка, по-видимому, связано с различной динамикой входа клетки в состояние покоя и выхода из него.

Число ПЯ обнаруживает наибольшую степень корреляции с индексом мечения клеток. Увеличение количества Г1Я при стимуляции пролиферации клеток, по-видимому,связано с изменением положения ЯО хромосом в интерфазном ядре и перестройкой цигоскелета. Использование показателя ПЯ представляется нам наиболее перспективным морфологическим параметром для оценки пролиферативных процессов в клеточных популяциях.

ВЫВОДЫ

1. Среднее число гранул серебра в ингерфашом ядре при обрлСнкке клеток нитратом серебра зависит о г условий припнонлешш нрепар.иов.

оно возрастает в случае обработки клеток в гипотоническом растворе. Снижение концентрации КС1 в гипотоническом растворе с 0.075 М до 0.038 М увеличивает число гранул серебра.

2. Обработка клеток препаратом ДРБ (5,6-дихлоро-1Ь-Ор11бофуранознл-бензимидазолом) облегчает подсчет гранул серебра вследствие дпссопиа -цни ядрышка и уменьшения наложений гранул серебра. Максимальное число транул выявляется при обработке клеток препаратом ДРБ п течение 90 мин.

3. Для суспензионных культур клеток человека HI-60, К-562 и U-437 обнаружена обратно пропорциональная зависимость среднего числа гранул серебра в интерфазном ядре и времени удвоения клеточной популяции.

4. Показано, что среднее число гранул серебра в ядре клеток 111-60 возрастает по мере прогрессии клеток по фазам клеточного цикла и увеличения содержания ДНК в ядре от 2с до 4с.

5. Показано, что среднее число гранул серебра в пролиферирующих субпопуляциях клеток Н1-60 и U-937 возрастает на 14,7% и 20,1%,соответственно, по сравнению с непрояиферируюшимн субпопушшиями этих же культур.

6. Обнаружена сильная корреляция между числом гранул серебра, площадью ядрышек, числом периферических ядрышек содержанием клеток в S-фазе клеточного цикла при торможении пролиферации эмбриональных фибробластов человека и клеток Н1-60.

7. Показано, что при торможении пролиферации эмбриональных фибробластов в результате культивирования на среде с пониженным содержанием сыворотки, уменьшение площади ядрышек и числа гранул серебра в них происходит медленно, в то время, как стимуляция пролиферации, вызванная отменой сывороточного голодания, приводит к сравнительно быстрому нарастанию названных показателей.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Выгинный С. М., Г'орюнова J1. Ю., Мамаева С. li. Количественная оценка зависимое!и результатов серебрения ингерфазиых ядер клеточных линии человека от фазы клеточного цикла //' Цитологии, I'Wl. Т. 33. N. '). С. 61-62. Тезисы докл.

2. Выпитый С. М., Абрамова Е. А., Мамаева С. Е. Характеристика ,\ц-NOR-окрашпиания клеток в состоянии покоя и при пролиферации // Цитология, 1992. Т. 3-1. N. <>. С. 58-59. Тез. докл.

3. Выгинный С. М., Мамаева С. Е., Литвинчук Л. Ф. Зависимость состояния ндрмшка культивируемых эмбриональных фибробластов и клеток Н1-<)0 от их нролиферагивного статуса // Цитология, 1993. Т. 35. N. 10. С. 62-63. Тезисы докл.

4. Выгинный С. М., Абрамова Е. А., Мамаева С. Е. Зависимость количества гранул серебра, выявляемых в ннтерфазиых ядрах после окрашивания ядрышкообразующих районов хромосом нитратом серебра, от условий гипотонической обработки клеток и влияние на этот показатель обработки клеток фармакологическим агентом, вызывающим диссоциацию ядрышка // Цитология,1993. Т. 35. N. 11/12. С. 105-110.

5. Выгинный С. М., Мамаева С. Е. Взаимосвязь между морфологическими характеристиками ядрышкового аппарата культивируемых эмбриональных фибробластов человека и пролиферативной активностью клеток // Цитопот*», 1994. Т. 36. N. 3. С. 298-302.

6. Каииносов И. К., Выгинный С. М. Полевая диафрагма микроскопа// Авторское свидетельство на изобретение SU I3778I0 Al, G02 В 21/06 от 29.02.1988

7. Иеганона И. Э., Секирина Г. Г., Выгинный С. М. Морфофункцио-нальная организация ядер зародышей мышей блокирующегося И неблоки-руюшегося генотипов в период второго клеточного цикла дробления // Цитология ,1993. Т.35. N.10. С.85-86. Тезисы докл.

8. Abramova Е., Vyguiimyi S., Mamaeva S. Increased frequency of acrocentric chromosome association during colccmide treatment // Cancer Gen. Cy-togen. 1993. Vol. 68. P. 52-59.

9. Vyguiimyi S., Mamaeva S. The relationship between morphological features of nucleoli and proliferation activity in cell culture//Abstracts of the 4th European Congress of Cell Biology, Prague, June 26th-July 1st 1994. Cell Biology Inlernational.Vol. 18. N. 5. P. 411.

Orne<uT;<iio ми ротипрките ПИЯФ 3.iv 131, тнр.100, v4.-iux.i. 0,9; 7/И-1995г.

f)Cai,u:THit