Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Моноклональные антитела к антигену, ассоциированному с клеточной пролиферацией

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Моноклональные антитела к антигену, ассоциированному с клеточной пролиферацией"

"г: п п

. I О V

- 3 МАР 1997

На правах рукописи

МШШЕНКО Ольга Сергеевна

МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА К АНТИГЕНУ, АССОЦИИРОВАННОМУ С КЛЕТОЧНОЙ ПРОЛИФЕРАЦИЕЙ.

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1997

Работа выполнена б Гематологическом научном центре РАМН.

Научный рун о водите ль доктор медицинских наук, профессор Т.И. Булычева Официальные оппоненты: доктор биологических наук Н.И. Дризе доктор медицинских наук, профессор А.Ю. Барышников

Ведущая организация - Онкологический научный центр РАМН.

Защита диссертации состоится " " ______ 1997 г. в ___ час

на заседании диссертационного совета Д 001.45.0*2 в Гематологическо научном центре РАМН ( 125167, Москва, Новозыковский пр., 4а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Гематологическог научного центра.

Автореферат разослан " " __________ 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

старший научный сотрудник Б.Д. Реук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Иммуноцитохимическое исследование клеток с ^пользованием моноклоналъных антител ( МКА ) нашло широкое применение э.к в Фундаментальных исследованиях, так и в практической диагностике, эстижения гибридомной биотехнологии, в основе которой лежит метод со-атической гибридизации клеток, предложенный и разработанный Kohler и listein (1975), способствовали быстрому развитию производства МКА в ашей стране.

В связи с особенностями дифференциальной диагностики злокачест-знных заболеваний системы крови возможности гибридомной техники в элыией степени направлены на получение МКА к диФФеренцировочным анти-гнам лейкоцитов. В настоящее время в России существует широкая панель £А к антигенам различных кластеров дифференцировки лейкоцитов серии £0 (Барышников А.Ю., 1990), серии ВСА (Булычева Т.И., 1990), серии ЛТ Филатов А.В.,1987) , позволяющая в совокупности с общепризнанными ла-эратсрнкми методами проводить исследования иммунофенотипа клеток на 1чественно новом уровне, который стал доступен для любого гематологи-гского учреждения страны.'

Помимо изучения экспрессии мембранных и цитоплазматических анти-;нов информативным для определения степени злокачественности опухоли ишется выявление пролиферативной активности неопластических клеток. 1енка этого параметра предоставляет исследователям возможность изуче-1Я динамической организации здоровых тканей, нарушения регуляции клееного деления при патологических процессах, изменения функциональной :тивности злокачественно трансформированных клеток.

Для исследования пролиферации клеточной популяции применяют раз личные методы: 1) авторадиографию с использованием тимидина, меченог тритием, 2) проточную цитометрию с подсчетом содержания ДНК, 3) имл регнацию нуклеол азотнокислым серебром с морфометрией результатов ре акции. Но в последние годы большой интерес вызывает изучение иммуноци тохимических маркеров делящихся клеток., что сеяний а «иссгеоп спещ| Фичностьк» применяемых в данном методе реагентов, а именно МКА. Антите ла позволяют выявлять антигенные структуры, зкспрессированные либо течение нескольких, либо в течение отдельных Фаз клеточного цикла.Эт существенно расширяет возможности изучения клеточного деления.

"Так как основные события, связанные с процессом деления клеток происходят в ядре, особое внимание исследователей привлечено к ядерны антигенам, ассоциированным о клеточной пролиферацией. За рубежом настоящему времени получен ряд гибридом, секретирующих МКА к ядерным ядрышковым антигенам пролиферирующих клеток, среди которых наибольше признание получили Ki-67 (Gerdes J., et al., 1983) и РСЙА. (Ogata К. et, al. , 198T). К отечественным МКА сходной направленности причисляю лишь антитела №0-38 (Сидоренко С.П. с соавт., 1994). Однако в некото рых случаях, случаях они дают не только ядерное, но и цитоплазматичес кое иммуноокрашивание, что существенно затрудняет оценку пула пролифе рирующих клеток.

В связи с этим являются актуальными и перспективными для практи ческой гематологии исследования по получению и использованию отечест венных МКА к ядерным антигенам, ассоциированным с клеточной пролифере цией. Это даст возможность дополнить существующую в нашей стране па нель антител, что позволит охарактеризовать не только фенотип патолс гических клеток, но и определить степень злокачественности опухолевог

клона. А именно эти показатели являются информативными для дифференциальной диагностики, выбора адекватной терапии и оценки индивидуальных особенностей течения болезни (.Freeman J.W., et al., 1991; Houmand A.., et al., 1992-, Koeealioveka Л.Е. , et al., 19Э1).

Целью работы явилось получение мышиной гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела к ядерному антигену, ассоциированному с клеточной пролиферацией, и изучение специфичности полученных антител.

Задачи работы:

1. Получить штамм перевиваемых гибридомных клеток методом соматической гибридизации в системе мышь х мышь, секретирукчцих моноклональные антитела к ядерному антигену, ассоциированному с клеточной пролиферацией .

2. Изучить характеристики полученного клона гибридомных клеток, его морфологические свойства, особенности роста в культуре и в организме животных.

3. Исследовать специфичность полученных моноклональных антител и проанализировать их пригодность для оценки пролиферативной активности патологических, клеток при злокачественных заболеваниях системы крови человека.'

4. Охарактеризовать антиген, выявляемый полученными моноклональ-■гыми антителами, и е го локализацию в клеточном ядре.

Научная новизна. Получен новый штамм мышиных гибридомных клеток, обозначенный ЗС9, секретмрукдаий моноклон&лъные антитела ВСР.-РС. Охарактеризованы морфологические и ростовые свойства гибридомы в культуре

и организме животных.

Доказано, что секретируемые гибридомой МКА взаимодействуют с я; рышковым антигеном пролиферирукдцих ■клеток, различной линейной, тканевс и видовой специфичности, но не дают иммуноокрашивания в покоящих! клетках.

При определении молекулярной массы связываемого полученными мс ноклональными антителами антигена методом Бестерн- блоттинга выявле! две полосы, соответствующие 35 кД и 43 кД, что свидетельствует об ор1 тональности полученных МКА ВСА-РС (указаний на МКА, выявляющие ядерк антиген со сходными молекулярно- биологическими характеристиками, литературе не обнаружено).

Выявлена практическая ценность МКА ВСА-РС для оценки пролиферг тивной активности патологических клеток при злокачественных заболев) ниях системы крови.

Теоретическое и практическое значение. Научные результаты, пред* тавленные в работе, имеют важное теоретическое и практическое энач< ни©. Полученный новый штамм гибридомных клеток ЗС9, является пригоднз для создания препарата МКА ВСА-РС в лабораторном и промышленном прои: водетве. Секретируемые им МКА могут быть рекомендованы в качестве ре* гента, используемого в дополнение к существующей в нашей стране диа: ностической панели МКА для иммунофенотипирования клеток больных лейк: зами и лимфомами, позволяя производить оценку пролиферативной акти: ности патологических клеток. Полученный препарат может служить инстр; ментом для исследования сложного и многоступенчатого процесса делен клеток при нормальном и патологическом гемопоэзе, что имеет важ»

значение для Фундаментальных исследований в области биохимии, цитологии и молекулярной биологии.

МКА ВСА-РС применяются в лаборатории электронной микроскопии НИИ физика- химической биологии им. Белозерского, МГУ; лаборатории

гибридом НИИ сывороток и вакцин им. И.И.Мечникова РАМН. МКА ВСА-РС включены в диагностическую панель антител -в лаборатории иммунологии ГНЦ РАМН.

Положения, выносимые на защиту:

1. Получены МКА ВСА-РС оригинальной специфичности, связывающие ядрышковый антиген, экспрессируемый клетками культивируемых линий различной видовой, тканевой и линейной принадлежности, ФГА-стимулированными лимфоцитами здорового донора, пролиферирующими клетками больных различными гематологическими заболеваниями и не взаимодействующие с покоящимися клетками.

2. При определении молекулярной массы связываемого полученными яоноклональными антителами антигена методом Вестерн- блоттинга выявлено две полосы, соответствующие 35 кД и 43 кД.

3. Антиген, связываемый МКА ВСА-РС, в интерфазных клетках локализован в ядрышках, а в Фазе митоза выявляется в цитоплазме.

Апробация работы состоялась на заседании проблемной комиссии 'Экспериментальная гематология и виптйхнпппгия" Гематологического научного центра РАМН. Основные положения работы били доложены на II Национальном конгрессе молодых ученых- медиков Украины "Современные вопросы клинической и экспериментальной онкологии" в г. Киеве в 1994 г., га Всеармейской научной конференции "Актуальные вопросы гематологии" в

- а -

г. Санкт- Питербурге в 1995 г., на заседании "Гематологического научного общества" в г. Москве б 19Э6 г. По материалам диссертации опублу ковано 3 журнальные статьи и 2 тезисов. Подготовлены документы для па тентования полученных МКА ВСА-РО.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на _ странице

машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описада материалов и методов исследований, изложения собственных данных, зак лючения, выводов и библиографического указателя, включающего 205 ре бот, в том числе 13 отечественных авторов. Диссертация иллюстрирован 11 таблицами, 4 рисунками и 1 фотографиями.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В основу работы был положен метод соматической гибридизации кле ток, разработанный Kohler и Ullstein (1975).

Опыты проводились на мышах линии BALB/c и гибридах первого пек.с ления линий BALB/c и DBA.

Для получения гибридом, секретируюших МКА к ядерному антигену ассоциированному с клеточной пролиферацией, в качестве иммуногена мс пользовали грубо очищенный от примеси клеточных мембран лизат ядер £ лимфобластоидной линии Daudi, находящейся в логарифмической фазе рос та. Это обеспечивало наличие максимального количества активно пролифе рирующих клеток, экспрессирующих искомые антигены.

Животных трехкратно иммунизировали, стимулируя таким образом и* мунный ответ на смесь вводимых антигенов.

Сенсибилизированные спленоциты мыши сливали с клетками мышинс миеломы, находящимися в логарифмической фазе роста в соотношении 3:1.

В качестве сливающего агента использовали 50% раствор ПЭГ с молекулярной массой 3000- 3700 (Сигма, CU1A).

После процедуры слияния объединенные клетки помещали в микролунки 96- луночных плоскодонных плат и выращивали в среде с селективными агентами при температуре 37в атмосфере Ь% С02 и абсолютной влажности .

Скрининг культуральиых жидкостей иэ лунок, давших рост гибридом-ным клонам проводили в реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) с оценкой результатов на Флюоресцентном микроскопе (Оттеон, Германия). В качестве мишеней использовали фиксированные ацетоном клетки линии Daudi.

Критериями отбора гибридомных клонов служили: 1) хорошие ростовые качества; 2) локализация антигена, выявляемого MRA, в ядре пролифери-зутощих клеток ; 3) отсутствие связывания МКА с антигенными структурами токоящихся клеток.

Клон гиьридомных клеток, отвечающий всем поставленным критериям, шестикратно реклонировали методом лимитирующих разведений и затем ьы-зодили в массовую культуру.

Для получения высоких концентраций МХА штамм гибридомных клеток зыращивали в виде асцитной опухоли в брюшной полости мышей, с предварительным введением пристана и облучением в дозе 400 Рад.

Иммунологическое тестирование полученных ШчА ВСА-РС проводили на риксированных ацетоном клетках культуральных линий и лимфоцитах здоро-зых доноров в реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) с оценкой >еэультатов на флюоресцентном микроскопе (Оптон, Германия). Исследования клеток в РНИФ на проточном цитофлюориметре Эпикс-Ц (Культронике, Франция) осуществляли совместно с н.с. С.Н. Поповой.

Для подтверждения специфического связывания МКА ЕСА-РС с антиге ном пролифериругацих клеток исследовали Фитогемагглютинин (.ФГА)- стиму лированные лимфоциты здорового донора. Анализ проводили на 0; 1; 2; : и 4 сутки культивирования в концентрации 1x10® клеток/мл полной питательной среды с 20% телячьей эмбриональной сыворотки. Пролиферативну! активность клеток оценивали по включению З'й-тимидипа, на бела- счетчике. Параллельно с этим динамику экспрессии антигена, связываемого МК; ВСА-РС, исследовали непрямым иммунопероксицазкым методом.

Изучение реагирования МКА ВСА-РС с клетками больных гематологическими заболеваниями проводили непрямым иммунолероксидазным методом Результаты реакции оценивали с помощью световой микроскопии совместн< с И..А. Асцатуровым.

Для определения класса иммуноглобулинов МКА ВСА-РС .использовал1 метод радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони с применением антител 1 Хе31, 1е<32а, 1б32Ъ, 1вМ, 1еА мыши (Майлс, США) совместно <

к.б.н. И.В. Яковлевой.

Молекулярную массу антигена, связываемого МКА ВСА-РС, определял! методом Вестерн- блоттинга в редуцирующих условиях в 12,5% полиакрила-мидном геле. Данное исследование было проведено совместно с И.А.Галь-видис.

Изучение локализации антигена, маркируемого МКА ВСА-РС, в процес се клеточного цикла проводили в РШФ на фиксированных ацетоном клетка: прикрепляющейся линии СПЭВ совместно с к.б.н. О.А.Дудник.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Б результате одной из проведенных гибридизаций в 23Э ячейках (82!

от общего числа засеянных ячеек) выявлен рост гибридомных клонов. Первичному скринингу на наличие специфического связывания с ядерными антигенами пролиферирующих клеток в РНИФ были подвергнуты все 239 образцов культуральных супернатантов. При этом были отобраны клетки из 1 ячейки, которые обладали хорошими ростовыми качествами и секретировали антитела, специфически связывшвщиьеп е някришл шпигвнои nporo»i&«j«ni>yi9-щнх (культивируемая линия Daudl), но не покоящихся (лимфоциты здорового донора) клеток. Для первичного скрининга культуральных жидкостей была использована РНИФ в связи небольшими временными и материальными затратами на ее осуществление.

Отобранная табридома была 6— кратно клонирована. Штамм клеток, названный ЗСЭ, был выведен в массовую культуру. Титр продуцируемых в культуре In vitro МКА, обозначенных как ВСА-РС (сокращение от Proliferation Cells), определяли в РКИФ на фиксированных метках и он составлял 1:10- 1:100. Для получения концентрированных МКА пассирование гиб-ридомы было проведено в организме самок мышей гибридов первого поколения (DBA х BALB/cjFl путем введения гибридомных клеток в брюшную по-пость. Объем собранной асцитной жидкости колебался от 2 до 4 мл/'мьпаь. Проведенный анализ активности МКА ВСА-РС в РШФ показал, что титр их в асцитной жидкости стабилен и составляет 1:1000.

При изучении характеристик штамма гибридомных клеток ЗСЭ установ-1ено, что он имеет вид стандартной клеточной суспензии с характерной для антителпродуцирующих культур морфологией, стерилен, сохраняет способность к росту in vivo и in vitro после криоконсервирования и размораживания со стабильной секрецией №КА. Исследование класса иммуноглобулинов МКА ВСА-РС показало их принадлежность к IgM.

Для изучения специфичности иКА ВСА-РС применяли непрямой иммуно-

пероксидазный метод, позволяющий не только идентифицировать реэульта связывания антител с антигеном, но и выявлять морфологические особен ности исследуемых клеток.

Результаты этой реакции с МКА ВСА-РС,. где в качестве мишеней был использованы лимфоциты периферической крови (ПК) здоровых доноров ' клетки перевиваемых клеточных линий различной видовой, тканевой и ли нейной принадлежности, представлены в таблице 1.

Было установлено, что МКА ВСА-РС не взаимодействуют с антигенам: покоящихся клеток, что было показано при тестировании лимфоцитов ПК ' здоровых доноров. В то же время полученные МКА связывали ядерный анти ген, зкспрессируемый большинством клеток (Е6%-94%) растущих клеточны культур различного видового, тканевого и линейного происхождения.

Для определения возможности применения МКА ВСА-РС в РНИФ с оцен кой результатов на проточном цитофлюориметре исследовали фиксированн лимфоциты ПК здорового донора (3,07% ВСА-РС"1"- клеток при отрицательно-контроле- 4,18%, где вместо МКА использовали иммуноглобулины мыши) клетки растущей линии Х)аис11 (70,43% ВСА-РС-1-- клеток при отрицательно-контроле 5,1%). Полученные результаты в целом оказались сходными с ре зультатами иммунопероксидазного метода и еще раз подтвердили реактив ность полученных МКА с антигеном пролиферирующих клеток.

Изучение локализации антигена, выявляемого МКА ВСА-РС, в течени клеточного цикла проводили в РНИФ на клетках прикрепляющейся лини СПЭВ, происходящей из ткани почки эмбриона свиньи. Результаты свиде тельствовали о наличии маркируемого антигена только в ядрышках интер Фазных клеток и выходе его в цитоплазму в Фазе митоза. Таким образом полученные антитела отличаются по специфичности от МКА ИПО-'За, которы охарактеризованы как анти-ядерные (Сидоренко с соавт., 1994).

Реактивность МКА. ВСА-РС с клетками перевиваемых клеточных линий и мононуклеарами периферической крови здоровых доноров.

1 I Г-1-1

| Вид клеток |Видовая |Происхождение клеток Количество ]

|принад- ВСА- PC-"- кле- |

|лежность 1 ток (в %) j

j лимфоциты 1 | человек ) периферическая кровь 0 |

1 1 здоровых доноров

1 Клеточные линии: 1 1

| Daudi | человек | лимфома Беркитта 92 1

1 Kajl 1 человек ( лимфома Беркитта 89 )

| Reh 1 человек ) острый В-лимФо$ластный 87 1

1 | лейкоз

| Molt | человек 1 острый Т-лимФобластный 86 |

1 | лейкоз

| HL-60 ) человек 1 острый промиелоцитарный 92 )

1 | лейкоз

1 K-562 ] человек I властный криз хрони- 94 |

1 | ческого миелолейкоза

СПЭВ 1 свинья | эмбриональная почка 92 j

ХбБЗ I мышь | миелома 93 \

Для изучения специфического связывания МКА ВСА-РС с ядерным анти геном, ассоциированным с клеточной пролиферацией, использовали модель ную систему вхождения мононуклеаров ПК в клеточный цикл из Фазы йо по, воздействием митогена 4>ГА. Результаты паралльльного радиометрическоп и иммуноцитохимического (с МКА ВСА-РС) исследований представлены : таблице 2.

Таблица 2.

Динамика связывания МКА ВСА-РС с ядерным антигеном донорских лимфоцитоь ПК в процессе стимуляции их ФГА.

При активации клеток ФГА наблюдался резко возрастающий индекс включения 3Н- тиыидина по сравнению с контрольной культурой (без воздействия ФГА), что свидетельствует об их пролиферативной активности, зыло отмечено, что максимальные значения включения 3Н- тииидота (таи ке как и связывания ядерного антигена МКА ВСА-РС в непрямом иммунопе-?оксидазном методе) приходятся на 2-е и 3-й сутки культивирования, входная динамика результатов, полученных в двух различных методах, косвенно доказывает специфическое взаимодействие полученных антител с штигеном, зкспрессированным пролиферируюшими клетками. Однако, на 4-е :утки культивирования монокуклеаров ПК с ФГА было показано резкое сни-кение доли ВСА-РС- положительных клеток в клеточной популяции в отлн-■ivie от постепенного снижения показателей включения ЕН- тимидина, что юхет свидетельствовать о том, что инкорпорация 3Н~тимидина в клеточ-1ую ПДК и связывание МКА БСА-РС с ядерным антигеном происходят в разумные временные промежутки клеточного цикла. Иммуноиитохимическая ре-1кция с МКА ШО-38 в данном исследовании показала не только ядерное, ю и цитоплазматическое окрашивание, что сильно затрудняло оценку ре-»ультатов.

Исследование изменения локализации антигена в ядре и количества клеток, экспрессируюших его, в течение роста клеточной культуры после >азмораж.ивания с последующим культивированием проводили на клетках ми-¡лобластоидной линии К-562 (таблица 3).

Экспрессия антигена, выявляемого МКА БСА.-РС, в процессе роста клеточной культуры К-582.

1 1 \ Сроки ( | исследования | 1 1 I 0 сутки \ 1 1 V 1 сутки ( 1 1 1 2 сутки 1 1 1 3 сутки

1 1 I 1 | ВСА-РС- поло- | ) жительные ) 1 клетки (%) | \ . 1 1 1 1 5Ь ) 1 ...... 1 1 1 I 83 | 1 ........... .. ] СП 41

Непосредственно после размораживания клеток антиген был диффуэно лок& лизован в ядре. Однако, на вторые сутки культивирования продукт ныму ноокрашивания выявляли только ъ ядрышках. Также отмечено изменение ко личества меченых клеток с максимумом на вторые сутки культивирования Снижение процента ВСА-РС-1-- клеток на третьи сутки культивирования мо лет свидетельствовать о блокировке запуска клеточного цикла вследстви увеличения клеточной плотности. Данные- изменения в экспресии и локади зации исследуемого антигена соответствуют представлениям о процесс роста клеточной культуры, что еще раз доказывает его ассоциацию с кле точной пролиферацией.

Для определения молекулярной массы антигена, связываемого МК ВСА-РС, был использован метод Вестерн- блоттинга п редуцирующих уело виях. В результате иммуноцитохиыической реакции было выявлено две ок

решенные полосы, соответствующие 35 кД и 43 кД. При изучении литературных данных, ссылок на получение МКА к ядерному антигену, обладающему сходной характеристикой обнаружено не было.

Исследование резиситентности эпитопа, маркируемого МКА ВСА-РС, к различным видам Фиксаторов показало, что, в отличие от ацетоновой фиксации, он не выявляется после фиксации препаратов 3% параформапьдедпл-сом и метанолом. Из этого следует, что МКА ВСА-РС можно применять на криостатных , но не на парафиновых срезах.

Результаты изучения реактивности МКА ВСА-РС с клетками больных различными неоплазиями и, в качестве сравнения, здоровых доноров 1редставлены в таблице 4. Диагнозы были установлены на основании результатов клинике- морфологических и иммунофенотипических исследований . Были исследованы цитоцектрифужние препараты клеток ПК и селезенки, мазки ПК и костного мозга (КМ), а также отпечатки лимфатических рэлов (ЯУ) непрямым иммуноперохсидазным методом.

Как ухе указывалось, мононукпеары ПК здоровых доноров не реагиро-аали с МКА ВСА-РС. В то же время количество ВСА-РС"1"- клеток у больных >ыло различным. Реакция считалась позитивной, если количество меченых клеток было больше 1.%. Во всех представленных положительных случаях 5ммуноокрашивания выявляемый МКА ВСА-РС антиген был локализован в ядре I распределялся в виде гранул или в некоторых случаях (в частности, 1ри острых лейкозах) диффузно. Во всех исследованных вариантах острого тйкоза от 1% до ВВ% клеток. ПК и 47% клеток КМ давали положительную ■еакцию с МКА ВСА-РС. В клетках ПК двух больных хроническим лимфолей-.озом (ХЯЛ) антиген, выявляемый МКА ВСА-РС, практически не был экс-[рессирован, в отличие от клеток ЛУ двух других больных (10% и 18/«). В руппе лимфосарком (ЛС) также как и б группе острых лейкозов наблюда-

Реактивность МКА БСА-РС с клетками больных различными неоплазиями и здоровых доноров.

Г 1 | Обследуемые ) Материал 1 ) Частоте реаги- 1 | Количество ВСА-

1 лица 1 | ровання МКА* 1 ( РО- клеток {%) 1

| Здоровые доноры| ПК 1 | 0/6 | 1 1 0

1 Больные: | ! 1 1

| ОЛЛ ** ) ПК | 2/2 | 7; 65

| ОЛЛ | КМ 1 VI 1 47

| ОМЛ | ПК I 25

) ОМонЯ | ПК 1 1/1 1 5 В8 1

| ХЛЛ ( ПК 1 | 0/2 1 1 0; 1

] ХЛЛ | ЛУ ) 2/2 I | 10; 18 1

1 ЛС 1 ЛУ 1 | 6/6 1 ] 8- 77

1 ПС 1 ПК 1 1/31 1 9 1

|Лимфоцитома ) С 1 | 1/2 | 0; 8

|селезенки \ ПК 1 1п 1 1 4 1

| Лимфома мантий-) С 1 1/1 1 1 6

) ной зоны | ЛУ 1 2/2 1 | 5; 22 1

| ВКЛ | ЛУ ! | 1/1 1 1 4 1

| ЛГМ | 1 1 ЛУ 1 | 1/5 1 ....... 1 | 0; 0; 0; 0; 67 I

в числителе- число положительных случаев, в знаменателе- общее количество больных.

ОЛЯ- острый лимфобластный лейкоз; ОМЛ- острый миелобластный ле^ коз; ОМонЛ- острый монобластный лейкоз; ХЛЛ- хронический лимфолейко^ ЛСлимФосаркома; ВКЛ- волосатоклеточный лейкоз; ЛГМ- лимФогранулемЕ тоэ. ПК- периферическая кровь; ЛУ- лимфатический узел; С- селезенка.

лась сильная гетерогенность результатов (.от 6% до 11% ВСА-РС4--хлеток) . В случаях лимфоиитомы селезенки и лимфомы из клеток мантийной зоны в ПК, ЛУ и клетках селезенки уровень экспрессии антигена, выявляемого МКА ВСА-РС, был невысоким, за исключением одного случая, где окрашивалось 22% клеток. Исследование ЛУ больного волосатоклеточным лейкозом показало 4% ВСА-РС- положительных клеток; что соот-Б&тств-ует т-опмчеет-Егу пролиФерируюших клеток в реактивных лимфоузлах (согласно литературным данным). При исследовании клеток ЛУ 5 больных ЛГМ в 4 случаях не было выявлено положительной реакции, в то время как наличие у одного больного экспрессии ядерного антигена в 67% клеток, может свидетельствовать о гетерогенности нозологии в данной группе больных.

Для изучения сходства в выявлении пролиферирующих клеток с помощью МКА ЕСА-РС и зарубежного препарата К1-67 было проведено сравнение результатов имыуноокрашивання этих реагентов (таблица 51. Из 26 параллельно исследованных больных более, чем в половине случаев результаты были сходные, в 3-х- процент К.1-61- меченых клеток превышал процент клеток, окрашенных с МКА ВСА-РС, а в 8-ми препаратах количество ВСА-РС- положительных клеток было больше, чем К1-67- положительных .

Описанные данные свидетельствуют о возможности применения МКА ВСА-РС для оценки пула пролиферирующих клеток в неопластической клеточной популяции. Однако необходимо дальнейшее изучение экспрессии выявляемого полученными антителами антигена при заболеваниях, связанных с клеточной пролиферацией.

Таким образом, на основании представленных данных следует заключить, что полученные МКА БСА-РС, направленные г. ядрышковому антигену

Сравнительное изучение реактивности МК.А ВСА-РС и К.1-67 с клетками больных различными гематологическими заболеваниями.

N Фамилия Диагноз * Исследуе- Результаты иммуноокраши-

п/п мая ткань вания с МКА

ВСА-РС КЗ.- 67

1. 3-в ОЛЛ ПК 7 В

2. 5-о ОЛЛ КМ 47 36

3. П-а ОНЛ ПК 25 0

4. Н-в ХЛЛ ПК 1 3

5. М-а ХЛЛ ПК 0 0

6. Б-о ХЛЛ ЛУ 18 7

7. Х-г ХЛЛ ЛУ 10 4

8. М-я ЛС ЛУ 8 8

9. К-а ЛС ЛУ 11 6

10. С-а ЛС ЛУ 20 31

11. П-а ЛС ЛУ 19 0

12. К-а ЛС ЛУ 40 35

13. Я-а ЛС ЛУ 77 13

14. 3-а ЛС ПК 9 14

15. Е-а Лимфоцитома се- с В 7

лезенки

16. К-а Лимфоцитома се- с 0 0

лезенки

17. К-о Лимфоцитома се- ПК 4 3

лезенки

18. И-я Лимфома мантий- с 6 4

ной зоны

19. М-а Лимфома мантий- ЛУ 5 13

ной зоны

20. Х-а Лимфома мантий- ЛУ 22 1

ной зоны

21. Д-а ВКЛ ЛУ 4 3

22. 0-а ЛГМ ЛУ 0 0

23. М-в ЛГМ ЛУ 0 0

24. Ф-6 ЛГМ ЛУ 0 0

25. К-й ЛГМ ЛУ 0 о

26. Ц-а ЛГМ ЛУ 67 63

ОЛЯ- острый лимфобластный лейкоз; ОМЛ- острый миелобластный ле> коз; ОМонЛ- острый монобластный лейкоз; ХЛЛ- хронический лимфолейко; ЛС- лимфосаркома; ВУЛ- волосатоклеточный лейкоз; ЛГМ- лимфогранулем* тоз. ПК.- периферическая кровь; ЛУ- лимфатический узел; С- селезенка.

1ролиферирующих клеток., обладают оригинальной специфичностью. Они мс-чут быть рекомендованы для оценки пула пролиФерирукяцих клеток в неоп-1&стической клеточной -популяции при гематологических заболеваниях, что 5 совокупности с клинико- морфологическими и иммунофенотипическими шнными расширяет возможности диагностики заболеваний системы крови. 1К.А ВСА-РС могут быть рекомендованы также и для фундаментальных иссле-юваний с целью изучения процесса клеточной пролиферации.

ВЫВОДЫ.

1. Получен штамм мышиных гибрмдомных клеток ЗСЭ, секретирующий ,КА, обозначенные ВСА-РС, направленные к ядрышковому антигену пролифе-■ирующих клеток, способны!'-! к стабильному росту в культуре и организме кшей в виде аоцитной опухоли.

2. Моноклоналъные антитела ВСА-РС относятся к иммуноглобулину М ласса и маркируют ядрышковый антиген, экспрессируемый метками куль-ивируемых линий различной видовой, тканевой и линейной прйнадлежнос-и, ФГА- стимулированными лимфоцитам здорового донора, пролиферируюши-и клетками больных различными гематологическими заболеваниями и не заимодействуют с покоящимися клетками.

3. Антиген, связываемый моноклональными антителами ВСА-РС, ассо-иирован с клеточной пролиферацией, локализован в ядрышках интерфазных леток и в цитоплазме в фазе митоза. При определении его молекулярной ассы в методе Вестерн- блоттинга выявлено две окрашенные полосы, со-тветствукяше 35 хД и 43 хД.

4. Полученные монохлональные антитела ВСА- PC могут быть использованы в фундандамектальных исследованиях для изучении процесса клеточной пролиферации, а также для практического применения с целью выявления пролиферирующих клеток и оценки степени злокачественности неопластического процесса.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Малашенко О.С., Самойлова P.C., Булычева Т.И. "Оценка пролиферации и линейной принадлежности лимфоидных клеток двойным иммуноцито-химическим методом при лимфогхролиферативных заболеваниях". "Гематология и трансфузиология", 1S94, т.39, N3, с.3-7.

2. Малашенко О.С., Самойлова P.C. "Экспрессия ядерного антигене (K.i-67), ассоциированного с клеточным циклом". "Совр.вопр.клин. i зксп.онкологии". Сб.тез.II Нац.конгресса молодых ученых-медиков Украины".Киев, 3.934, с. 17.

3. Малашенко О.С., Булычева Т.И., Самойлова P.C. "Кммуноцитохими-ческие исследования пролиферативной активности лимфоидных клеток", "Акт.вопр.гематологии".06.тез.докладов всеармейской научной конференции С.Питер6ург,1995, с.73.

4. Малашенко О.С., Самойлова P.C. "Кммуноцитохимический мето; оценки пролиферативного статуса лимфоидных клеток при лимфопролифера-тивных заболеваниях". "Клиническая лабораторная диагностика" 1995, N3 с.51-54.

5. Булычева Т.И. Самойлова P.C., Малашенко О.С. "Диагностическа> значимость иммунофенотипирования лимфоидных клеток при лимфопролифера-тивных заболеваниях". "Гематология, РЖ.", 1996, N3, с.В-13.