Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Минорные компоненты метаболизма в исследовании межмолекулярного взаимодействия

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Минорные компоненты метаболизма в исследовании межмолекулярного взаимодействия"

Нефедова Наталия Сергеевна

МИНОРНЫЕ КОМПОНЕНТЫ МЕТАБОЛИЗМА В ИССЛЕДОВАНИИ МЕЖМОЛЕКУЛЯРНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

03.01.04 - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

005537710 1 ? НОЯ 201

Челябинск 2013

005537710

Работа выполнена на кафедре фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава России, кафедра фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой, профессор Гильмиярова Фрида Насыровна

Официальные оппоненты:

Салмина Алла Борисовна доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России, кафедра биологической химии с курсом медицинской, фармацевтической и токсикологической химии, заведующая

Бородулин Владимир Борисович доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет имени В.И. Разумовского» Минздрава России, кафедра биологической химии, заведующий

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

диссертационного совета Д ж ЮУГМУ Минздрава России по

адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования " Южно-Уральский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64.

Защита состоится

в _ часов на заседании

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Н.В. Тишевская

ОБЩАЯ ХАРАКГЕРИСТКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования и степень се разработанности

Непреходящая актуальность изучения регуляторных механизмов обусловлена их ключевым значением в процессах жизнедеятельности, многообразием выполняемых функций, появлением новых взглядов на роль и значимость отдельных механизмов в формировании ответа на различные стимулы. Как известно, в основе управления биологическими системами лежит принцип узнавания, белок-лигандного взаимодействия, индуцирующего на клеточном уровне каскад реакций в метаболических, транспортных, иммунологических процессах. Посттрансляционные модификации белков расширяют их функции в отношении распознавания, передачи сигналов и протеолнза. Эти процессы регулируют дифференцировку клеток и их пролиферацию (Егоров В.В. Мембранный механизм реакции клетки на внешний сигнал. Прикладная токсикология. 2011. № 1. С. 52-55; Иванов, A.C. Исследование межмолекулярных взаимодействий с помощью оптических биосенсоров, работающих на эффекте поверхностного плазменного резонанса / A.C. Иванов // Современные технологии в медицине. - 2012. - № 4. - С. 142-153; Seuthcott M.J. The expression of human blood group antigens during erythropoiesis in a cell culture system Blood. 1999. № 93. P. 4425-4435.). Важную роль в специфической и неспецифической защите организма, энергетическом, метаболическом обеспечении принадлежит крови и прежде всего эритроцитам, участвующим в поддержании динамического го-меостаза организма (Кондратенко И.В. Клеточные основы иммунного ответа: лекция. Вопросы гематологии, онкологии и иммунопатологии в педиатрии. 2003. Т. 2, № 3. С. 71-78; Муронец В.И. Нобелевская премия получена - загадки остались. История открытия инфекционных прионов. Сб. научно-популярных статей. Российская наука: мечта светла / под ред. чл-корр. РАН В.И. Конова. М.: Октонус-природа, 2006. С. 239-245; Patnaik S.K. Patterns of human genetic variation inferred from comparative analysis of allelic mutations in blood group antigen genes 2011. №32(3). P. 263-271.).

Полиморфная система антигенов эритроцитов, включая ABO антигены, обладающая из 350 известных систем наибольшей иммуногенностью, обеспечивает механическую устойчивость мембран при трении о стенки капилляров, служит рецепторами эндогенных и экзогенных лигандов, выполняет защитную, структурную роль, обуславливает различия в физико-химических и антигенных свойствах организма. Есть данные о том, что иммуноглобулины обладают ферментативной активностью, расщепляя и фосфорилируя белки, полисахариды и липиды, нуклеиновые кислоты (Донское С.И. Группы крови человека: рук. по иммуносерологии. 2011,- 1016 е.; МинееваН.В. Группы крови человека. Основы иммуногематологии СПб. 2004. 188 е.; Antibody-mediated targeting of the uro-kinase-type plasminogen activator proteolytic function neutralizes fibrinolysis in vivo / Chem. 2008. Vol. 283, № 47. P. 32506-32515; M. Wahrmann et al. Anti-A/B an-

tibody depletion by semis electivc versus ABO blood group-specific immunoadsorption. European Renal Association. 2012. №27(5). P. 2122-2J29).

Важное медицинское значение имеет определение биологической индивидуальности организма человека при чрезвычайном разнообразии и общности признаков популяции. Наряду с известными возрастными и индивидуальными особенностями метаболизма появились новые данные об ассоциированности метаболических, гемостазиологических показателей, клеточного состава с групповой принадлежностью крови (Гильмиярова Ф.Н. с соавт. Группы крови: биологическая вариабельность клеточного состава и метаболизма в норме и патологии М.: Известия, 2007. - С. 490; Golemis, Е.Д. Protein-protein interaction. А molecular cloning manual N.Y., 2005. 938 р.; Anstee, D.J. The reiationship between blood groups and disease / J.D. Anstee // Blood. - 2010. - № 115. - P. 4635^643). Для раскрытия значения гликопротеинов А и В в формировании биологической индивидуальности человека актуальным является изучение роли малых молекул в процессах белок-лигандного взаимодействия с учетом принадлежности к группам крови. Это будет способствовать составлению представлений о возможностях управления иммунологическими, ферментативными, рецепторными процессами, в основе которых лежат лигандные взаимодействия. Интерес представляет этанол, дифильность молекулы которого, высокая химическая активность данного метаболита и нутриента, определяет важность изучения его влияния на процессы антиген-антительного и фермент-субстратного взаимодействия.

Настоящее исследование выполнено в рамках Федеральной программы: «Взаимодействие биологически активных веществ растительного и животного происхождения с системами жизнеобеспечения организма с учетом биологической вариабельности метаболизма, ассоциированной с групповой принадлежностью крови» (номер гос. регистрации 0120.0809698).

Цель исследования: выяснить характер ответа гликолитических дегид-рогеназ и гликопротеинов А и В на действие этанола.

Задачи исследования:

1. Определить содержание эндогенного этанола в крови клинически здоровых лиц с 0(1)- AB(I V) группами крови.

2. Охарактеризовать резерв метаболических свойств этанола, оценив спектр биологической активности in silico.

3. Изучить потенциальные свойства и биологическую активность антигенных детерминант системы АВ0 методом компьютерного моделирования.

4. Оценить влияние этанола на процессы взаимодействия гликопротеинов А и В с антителами в модельных экспериментах с визуализацией антиген-антительных комплексов методом лазерной сканирующей конфокальной микроскопии.

5. Изучить прямые и опосредованные эффекты этанола на функцию глицераль-дегидфосфатдегидрогеназы, а-глицерофосфатдегидрогеназы, лактатдегидроге-назы.

Методология ii методы исследования

Работа включала несколько этапов:

1. Определение эндогенного этанола ферментативным методом в крови клинически здоровых лиц с учетом групповой принадлежности по ABO системе.

2. Изучение потенциальных свойств и биологической активности этанола и антигенных детерминант системы ABO методом компьютерного моделирования.

3. Изучение влияния этанола на белок-белковые взаимодействия антигена с антителом в различных условиях эксперимента, используя в качестве объектов антигены А и В, моноклональные и естественные анти-А и анти-В антитела.

4. Визуализация антиген-антительных комплексов методом лазерной сканирующей конфокальной микроскопии.

5. Оценка влияния этанола на активность дегидрогеназ: глицеральдегид-фосфатдегидрогеназы, а-глицерофосфатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы в гемолизате и на гомогенные ферменты, с использованием кинетических методов исследования.

Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора

Достоверность результатов работы, обоснованность выводов и рекомендаций базируется на достаточном числе наблюдений и использовании современных методов исследования статистической обработки материалов с помощью пакета компьютерных программ SPSS 12.0 «ANOVA».

Результаты исследований были представлены на II международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: геномика, протеомика, биоинформалгика» (Новосибирск, 2011); Всероссийской научно-практической конференции биохимиков и специалистов по лабораторной медицине «Медицинская биохимия и клиническая лабораторная диагностика в аспекте модернизации системы научных исследований» (Омск, 2011); научно-практической конференции «Обеспечение доступности современных клинических лабораторных исследований: аналитические возможности, клинические потребности, организационно-экономические условия» (Москва, 2011); Всероссийской конференции с международным участием «Молодые ученые - медицине» (Самара, 2011); Международной Интернет-конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии» (Казань, 2011, 2012); научно-практической конференции «Реальные клинико-диагностические лабораторные услуги: степень соответствия стандартам лабораторной медицины, качество, себестоимость и цена» (Москва, 2012); XVI международной научной конференции «Здоровье семьи в XXI веке» (Будапешт, 2012); I Всероссийской конференции молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века» (Москва 2012); совместном заседании кафедр фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой и общей, бионеорганической и биоорганической

б

химии ГБОУ ВПО « Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Самарского отделения Всероссийского общества биохимиков и молекулярных биологов, Самарского отделения научно-практического общества специалистов по лабораторной медицине (Самара, 2013).

Личное участие автора состояло в получении научных результатов, изложенных В диссертации, в проведении научно-информационного поиска, анализа, обобщения данных литературы по профилю диссертационного исследования, формулировке цели и задач, определении показателей групповой принадлежности крови и содержания эндогенного этанола у клинически здоровых лиц, в проведении серии модельных экспериментов по изучению белок-белкового взаимодействия in vitro, визуализации антиген-антительных комплексов методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, выяснении возможных свойств и механизмов действия этанола и антигенных детерминант А и В антигенов, выполнении статистической обработки полученных результатов исследования. Участие автора в сборе первичного материала и его обработке - более 90%, обобщении, анализе и внедрении в практику результатов работы - 100%. Все научные результаты автором получены лично.

Положения, выносимые на защиту

1. Уровень эндогенного этанола в крови клинически здоровых лиц. Ассоциированность с группами крови по системе ABO. Возможные метаболические эффекты этанола и антигенов А и В , установленные in silico, прогнозируемые с помощью компьютерной системы Prediction of Activity Spectra for Substances (PASS).

2. Влияние этанола на характер белок-белкового взаимодействия. Уменьшение времени наступления агглютинации антигенов А (II) и В (III) с моноклональными антителами, модифицированными этанолом. Особенности аитиген-антителыюго реагирования анти-А и анти-В антител с эритроцитами АВ (IV) группы крови. Специфика межмолекулярного узнавания анти-А и анти-В антител человека с антигенами. Визуализация антигеи-антительных комплексов методом лазерной сканирующей конфокальной микроскопии.

3. Действие этанола на каталитические белки с различным уровнем структурной организации. Активация этанолом глицеральдегидфосфат-дегидрогеназы, а-глицерофосфатдсгидрогеназы, лактатдегидрогеиазы.

Научная новизна

Получены новые сведения, раскрывающие роль малых молекул в белок-лигандных взаимодействиях белков с различными функциями. В серии модельных экспериментов установлено, что дифильная молекула этанола, обладающая активными физико-химическими свойствами, способна изменять процесс межмолекулярного узнавания антигена с антителом. Высокая биологическая активность этилового алкоголя показана нами в исследованиях in silico. Монокло-нальные анти-А и анти-В антитела, модифицированные этанолом, быстрее уз-

нают и связываются с эритроцитами А(Н) и В(Ш) группы крови. Специфику антиген-антительного взаимодействия отражают данные о более выраженной полноте агглютинации и укорочение времени узнавания антигена В с анти-В антителами. Сродство анти-А антител плазмы человека к антигену под влиянием этанола возрастает, а для анти-В антител наблюдается противоположный эффект. Индуцированные этанолом сгерические, электростатические изменения в структуре антител и антигенов характеризуются группоспецифическими особенностями. Изменения более значимы для процесса узнавания антигена антителом, предшествующему образованию комплекса. Выяснено, что избирательное действие оказывает этанол и на ферментные белки разного уровня структурной организации. Характерен более значимый эффект на тетрамерную молекулу глицеральдегидфосфатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы, чем на димерную структуру а-глицерофосфатдегидрогеназы. Это действие типично для изолированных ферментов и находящихся в естественном окружении. В условиях целостного организма, очевидно, за счет этого реализуется регуляция обменных процессов, усиление или замедление потока субстратов по различным метаболическим путям.

Показано, что не только иммуногенетическая индивидуальность организма, но и специфика ответа на различные стимулы обеспечивается групповыми антигенами ABO системы. Прогнозирование биологической активности А и В антигенов и механизмов ее реализации с помощью компьютерной системы Prediction of Activity Spectra for Substances (PASS) выявило полифункциональность и особенности свойств антигенов А и В. Более многообразный спектр эффектов и выявленных механизмов характерен для антигена В. Данные in silico позволяют по-новому оценить антиген-антительное взаимодействие, включающее не только связывание чужеродного молекулярного или клеточного материала, но и оказывающее фронтальный эффект на ферментативные метаболические, транспортные процессы, экспрессию генов. При этом групповая принадлежность крови определяет специфику ответа на внешние стимулы, составляя фенотипичсский признак, сопряженный с функцией белков различной структуры и выполняемой ими биологической роли, формируя индивидуальные метаболические признаки.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные результаты имеют теоретическое значение. Они раскрывают регуляторную роль этанола, определяющую характер межмолекулярного узнавания. Показано, что структурные особенности белков, уровень организации обуславливает специфику молекулярного ответа на действие этого биологически активного соединения. Экспериментально разработана и обоснована информативность использования модели антиген-антителыюго взаимодействия, применение конфокальной микроскопии с целью визуализации узнавания, степени полноты взаимодействия антигенов и антител системы группы крови ABO. Отличия процесса агглютинации антигена А и антигена В с анти-А и анти-В антителами свидетельствуют об избирательности эффекта и аргументируют

возможность оценки на этой модели действия биологически активных соединений, лекарственных веществ. Результаты, полученные на этой модели, служат обоснованием для роли интермедиатов, малых молекул, в регуляции белок-лигандных взаимоотношений при использовании их в качестве молекулярных зондов. Метаболиты, на долю которых приходится значительная часть клеточного и внеклеточного пространства являются регуляторами процессов, в основе которых лежат белок-лигандные взаимодействия. Они, очевидно, обеспечивают адекватность молекулярных процессов запросам организма. Это выявлено на примере этанола.

Изменение интенсивности катализа лактатдегидрогеназы, глицеральде-гидфосфатдегидрогеназы и а-глицерофосфатдегидрогеназы, усиливающееся под влиянием этанола, характеризует этот минорный компонент как регулятор ферментативных процессов, меняющий в разной степени активность ферментов с димерной и тетрамерной структурой молекулы, тем самым способствуя определенной направленности метаболических потоков.

Данные, полученные in silico с помощью программы PASS (Prediction of Activity Spectra for Substances), раскрывают многомерность биологической активности этанола и служат основанием дня дальнейшего углубленного экспериментального изучения свойств, всего спектра возможного действия этого соединения. Данные, полученные при изучении in silico биологической активности антигенов А и В являются иллюстрацией их полифункционапьности, возможности выполнения других, помимо канонических, функций в организме.

В прикладном отношении значение полученных результатов обуславливают необходимость при оценке данных клинико-лабораторного исследования учитывать отклонения в фонде метаболитов, так как это может отразиться на показателях активности ферментов, изменить антиген-антительное взаимодействие. Специфика ответной реакции энтигенов и антител 0(I)-AB(IV) групп крови системы АВО определяет необходимость учета групповой принадлежности пациента при диагностике и назначении лекарственных препаратов.

В социальном отношении важным является сведения о наличии фонового уровня эндогенного этанола вне приема алкоголя, что необходимо учитывать при проведении медицинского освидетельствования на состояние опьянения.

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты диссертационного исследования используются в работе клинико-диагностической лаборатории клиник СамГМУ ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации; в учебном процессе кафедры фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации; кафедры биологической химии ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации; кафедры биологической химии с курсом медицинской, фармацевтической и токсикологической химии ГБОУ ВПО «Красноярский го-

сударственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Получен патент на изобретение № 2484480 «Способ оценки действия биологически активных веществ на антиген-антителыюе взаимодействие» от 10 июня 2013 г.

Конкурсная поддержка исследования

Данная работа выполнена при поддержке губернского гранта в области науки и техники за II полугодие 2012 г. «Способ визуализации антиген-антительного взаимодействия методом конфокальной микроскопии»; гранта РФФИ, проект 13-04-9712 «Модель визуализации белок-белкового взаимодействия».

Публикации

Опубликовано 17 работ, из них но теме диссертации 17 научных работ общим объемом 49 печатных листа, в том числе 7 статей в научных журналах и изданиях, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций. Получен 1 патент, 10 работ опубликовано в материалах всероссийских и международных конференций и симпозиумов.

Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 156 страницах машинописного текста, иллюстрированы 25 таблицами и 20 рисунками, состоят из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, трех глав собственных данных, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 341 источник, из них 166 — отечественных и 175 — зарубежных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Применительно к цели и задачам был сформирован дизайн исследования (рисунок 1).

I. Определение эндогенного этанола в крови клинически здоровых лиц:

0(1)

А (II)

AB(IV)

II. Изучение потенциальных свойств и биологической активности антигенных детерминант системы ABO и этанола методом компьютерного моделирования:

этанола

Антигенной детерминанты антигена А

Антигенной детерминанты антигена В

III. Оценка влияния этанола на белок-белковые взаимодействия антигена с антителом:

BL_ Ч®

Антиген А Антиген В

Моноклонсльные антитела

Естественною ачти-А, анти-В антитела

IV. Визуализация антиген-антительных комплексов с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии:

Гликопротеины А + анти-А антитела

Гликопротеины В анти-В антитела

V. Влияние этанола на активность дегидрогеназ:

Гдиаеральдегидфосф"-

деГИАРогеНаЗЫ

В полиферментной, полисубстратной системе

Глицеральдегидфосфат-дегидрогеназы

»•™®офосфа,4євдрогеншьі

Ло«іоідегидри(

еназы

Рисунок 1 - Этапы проведения исследования

Исследование проводилось иа кафедре фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава России.

Объектом изучения была цельная венозная кровь, взятая у 233 клинически здоровых лиц обоего пола, не употреблявших алкоголь, сопоставимых по возрасту. Состояние здоровья всех добровольцев, участвующих в экспериментах, оценивалось по отсутствию обострения хронических соматических и стоматологических заболеваний и латентных социально значимых вирусных инфекций. Женщины 19-22 лет составили группу 166 человек, мужчины 19-22 лет 67 человек. Использовалась вакуумная система и пробирки с антикоагулянтом K2-3DTA. Распределение групп крови по системе ABO в группе обследуемых при определении содержания эндогенного этанола было следующим: с О (I) — 25%, А(И) - 40%, В(Ш) - 29%, AB(IV) - 6%. Для оценки влияния этанола на процесс антиген-антительного взаимодействия брали кровь у 150 человек, из них носителей А(II) - 60, В(Ш) - 60, AB(IV) - 30 человек. Использованы моно-клональные анти-А и анти-В антитела, антигены системы ABO (Trans Clone Anti-ABOl (A), Trans Clone Anti- AB02 (B), Trans Clone Anti-AB03(AB) - фирма Bio-RAD (США). Гомогенные препараты ферментов - глицеральдегидфосфат-дегидрогеназы, а-глицерофосфатдегидроге-назы, лактатдегидрогеназы (ICN Biomedical inc.) были использованы в постановке 47 опытов in vitro.

Группу крови определяли с использованием ЭРИТРОТЕСТ - Цоликлонов Анти-А, Анти-В диагностических жидких методом прямой агглютинации на плоскости. Выраженность агглютинации оценивалась визуально с использованием базалыюй оценки интенсивности агглютинации - pt (Marsh W. 1972). Определение группы крови также проводилось на автоматическом анализаторе для проведения иммуногематологических исследований «Хемос СП И» фирмы BIO-Rad с использованием коммерческих реактивов Trans Clone Anti-ABOl (А), Trans Clone Anti-AB02 (В), Trans Clone Anti-AB03 (AB) (BIO-Rad, США).

В трех сериях экспериментов in vitro проведено изучение влияния этанола на изолированные белки - моноклональные антитела, антитела и эритроциты 0(I)-AB(IV) групп крови человека, а также антигены А и В.

Для моделирования биологического действия малых молекул на антигены А, В, анти-А и апти-В моноклональные и естественные антитела группы крови ABO перед постановкой реакции гемагглютинации 100 мкл эритроцитов инкубировали с 20 мкл этанола в конечной концентрации 0,03 мМ в течение 5 минут. Концентрация определялась методом подбора дозы.

В качестве объекта изучения регуляторного влияния этанола на метаболические процессы нами использовались ферменты. В условиях in vitro этанол в конечной концентрации 0,03 мМ в течение 5 минут инкубировался при температуре 25°С с препаратами ферментов - глицеральдегидфосфатдегидрогена-зой(КФ 1.1.1.12), а-глицерофосфат-дегидрогеназой (КФ 1.1.1.8), лактатдегид-рогеназой(КФ 1.1.1.27) (ICN Biomedical Inc., США). Активность ферментов определялась кинетическими методами на спектрометре Lambda 20 (Perkin El-

mer, Швейцария). Помимо экспериментов с индивидуальными белками - ферментами, нами в аналогичных условиях в опытах in vitro в качестве источника ферментов использован гемолизат, полученный разведением крови бидистили-рованой водой 1:10.

Определение содержания эндогенного этанола в сыворотке крови лиц с различной АВО групповой принадлежностью осуществлялось с помощью набора реактивов «ЕТОН2» («Roche-Diagnostics», Германия) на полностью автоматизированном биохимическом анализаторе Кобас ИНТЕГРА 400 Плюс (Cobas INTEGRA 400 plus) фирмы «Roche-Diagnostics», Япония. Изделие зарегистрировано в Госреестре под номером 19507-00.

Совместно с отделом биоинформатики и лабораторией структурно-функционального конструирования лекарств ( заведующий - профессор В.В . Поройков) НИИ Биомедицинской химии им. В.Н.Ореховича РАМН, использовали компьютерную систему Prédiction of Activity Spectra for Substances. Программа позволяет прогнозировать большое число вероятных видов биологической активности вещества на основе его структурной формулы с использованием единообразного описания химической формулы и универсального математического алгоритма установления зависимости «структура - активность», с использованием обучающей выборки, содержащей большое количество разнородных химических соединений с различными видами биологической активности. В PASS результат прогноза спектра биологической активности представляется в виде упорядоченного списка названий соответствующих активностей и вероятностей Ра « быть активным» («to be active») и Pj « быть неактивным» («to be inactive»), которые являются функциями значений в статистике для прогнозируемого соединения (Филимонов Д.А . Прогноз спектра биологической активности органических соединений Российский химический журнал. 2006. №50 (2). с. 66-750; Поройков В.В ., Филимонов Д.А . Компьютерное предсказание биологической активности химических веществ: виртуальная хемогеномика. Информационный вестник ВОГиС. 2009. 13 (1). с.137-143; Поройков В.В. с соавт. Компьютерное прогнозирование биологической активности природных соединений и их производных 2010. с. 142-148).

Визуализация антиген-антительного взаимодействия осуществлялась с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, реализованной при помощи экспериментального стенда, состоящего из конфокального микроскопа Olympus IX 71 («Olympus», Япония), сканирующего блока и лазерного комбайна («ANDOR», Япония) (Лежнев Э.И. с соавт. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия: принципы, устройство, применение (часть 1) Научное приборостроение. 2001. Т. 11, № 3. С. 26-42; Мухитов А.Р. с соавт. Метод конфокальной лазерной сканирующей микроскопии в выявлении тирозинового фосфорилирования белков растений. Ученые записки Казанского Государственного Университета. Сер. Естественные науки. 2008. Т. 150, Кн. 2. С. 144—154; Лежнев Э.И. с соавт. Конфокальная лазерная сканирующая

микроскопия: принципы, устройство, применение (часть 2) Научное приборостроение. 200). Т. 11, № 3. С. 26-42). Анализ данных интенсивности флуоресценции (F1TC) осуществляли с помощью компьютерной программы Europe Medical Biological Image (2011).

Статистическая обработка результатов проводилась с помощью программы MS EXCEL 2007 с последующим статистическим анализом в пакете прикладных программ SPSS 12.0 ANOVA (statistical package for social sciences). В результате проведенных исследований полученные данные были упорядочены и систематизированы в относительно однородные группы по некоторым признакам. Были использованы статистические характеристики, такие как средняя арифметическая (М), стандартная ошибка от средней арифметической (ш), медиана (Me), среднее значение - информативная мера «центрального положения» наблюдаемой переменной, позволяющая сделать вывод относительно популяции в целом. Помимо статистической характеристики вариационных рядов нами проводилась сравнительная оценка генеральных параметров. Оценка формы распределения исследуемых показателей осуществлялась с помощью графического метода (визуальная оценка гистограмм распределения, оценивали показатели скошенности и крутизны, отражающие асимметрию распределения. Получаемые распределения значений содержание этанола в крови не отличались от классического Гауссовского распределения. Для сравнения здоровых лиц по группам крови применяли двухфакторный дисперсионный анализ (Платонов А.Е. Статистический анализ в медицине и биологии: задачи, терминология, логика, компьютерные методы 2000. 52 е.; Мидлтон М.Р. Анализ статистических данных с использованием MS Excel для Office ХР 2005. 296 е.; Серги-енко В.И. Математическая статистика в клинических исследованиях М.: ГЭО-ТАР-Медиа, 2006. 304с.). Критическое значение уровня значимости принимали равным 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

В литературе имеются противоречивые сведения об уровне эндогенного этанола в крови (Баринская Т.О. с соавт. Кинетика этанола в биологических средах. Наркология. 2007. № 5. С. 50-57.; Logan A.W., Jones B.K. Endogenous ethanol production in a Child with Short Gut Syndrome 2003. Vol. 36, № 3. P. 419 420.) Актуальным является выяснения содержания этого низкомолекулярного метаболита и ассоциированности ег о уровня с генетически детерминированным признаком - группой крови системы ABO (таблица 1).

Таблица 1- Содержание эндогенного этанола у клинически здоровых лиц 0(1)-АВ(1У) групп крови

Единицы измерения этанола Группа крови п М±ш ско 95% интервал ог среднего Me (Q1-Q3) Min Max

Верхний уровень Нижний уровень

ммоль /л 0(1) 60 0,284*0,013 0,104 0,257 0,311 0,27 (0,217-0,379) 0,010 0,490

А (Н) 93 0,31 ¡±0,010 0,097 0,291 0,331 0,30 (0,240-0,389) 0,043 0,582

В(Ш) 66 0,331 ±0,015 0,118 0,302 0,360 0,32 (0,245-0,436) 0,096 0,545

АВ (IV) 14 0,334*0,018 0,068 0,295 0,374 0,32 (0,275-0,392) 0,240 0,454

Всего 233 0,311*0,007 0,105 0,298 0,325 0,30 (0,239-0,396) 0,010 0,582

г/л 0(1) 60 0,013*0,001 0,005 0,012 0,014 0,01 (0,010-0,017) 0,000 0,023

А (II) 93 0,0140=0,000 0,004 0,013 0,015 0,01 (0.011-0,018) 0,002 0,027

В(Ш) 66 0,015*0,001 0,005 0,014 0,017 0,01 (0,011-0,020) 0,004 0,025

АВ (IV) И 0,015*0,001 0,003 0,014 0,017 0,01 (0,013-0,018) 0,011 0,021

Всего 233 0,014*0,000 0,005 0,014 0,015 0,01 (0,011-0,018) 0,000 0,027

мг% 0(1) 60 1,308.+0,062 0,480 1,184 1,432 1,25 (0,998-1,745) 0,044 2,257

А(П) 93 1,435*0,047 0,449 1,342 1,527 1,40 (1,108-1,792) 0,197 2,684

В(Ш) 66 1,524*0,067 0,544 1,390 1,658 1.48 (1,128-2,010) 0,442 2,510

АВ (IV) 14 1,541*0,084 0,314 1,359 1,722 1,48 (1,266-1,807) 1,106 2,092

Всего 233 1,434*0,032 0,484 1,371 1,496 1,39 (1,103-1,823) 0,044 2,684

Выявлено наиболее низкое значение у клинически здоровых лиц с 0(1) группой крови не зависимо от пола. У женщин с 0(1) группой крови уровень эндогенного этанола достоверно ниже, чем с В(Ш) группой крови (р=0,014). У мужчин данный показатель превышает значение по сравнению с женщинами (р—0,063). Характерно, что содержание данного метаболита увеличивается от 0(1) к AB(JV) группе крови. Полученные нами результаты по определению эн-

догенного этанола свидетельствуют о биологической индивидуальности этого параметра, определенной специфике метаболомного фонда при различных группах крови системы ABO.

Нами изучались потенциальные свойства и биологическая активность этанола и антигенных детерминант системы ABO методом компьютерного моделирования. Установлено, что для этанола является возможным наличие способности регулировать проницаемость клеточных мембран (Ра 0,906). С этим, вероятно, связано и свойство - выступать цитопротектором (Ра 0,713), возможность оказывать антитоксическое действие (Ра 0,579), влиять на процессы созревания клепок крови (Ра 0,620), являясь стимулятором эрифо- и лейкопоэза (Ра 0,740). Кроме того, для данного метаболита характерна способность инги-бировать синтез миелобластов (Ра 0,609), выступать как антагонист фибриноге-новых рецепторов (Ра 0,752), что обуславливает его фибринолитический эффект. У этанола прогнозируется вероятность регулятора липидного, углеводного обмена (Ра 0, 630). Интересным фактом является способность этанола выступать антагонистом медиаторов (Ра 0,586). Спрогнозировано также антиканцерогенное и антимутагенное действие (Ра 0,599), свойства антидота (Ра 0,530), из-за способности ингибировать алкогольдегидрогеназу, предотвращая образование ацетальдегида. В настоящее время ряд эффектов этанола, спрогнозированные программой PASS, подтверждены экспериментально и согласуются с полученными нами результатами.

В трех сериях модельных экспериментов нами проведено изучение влияния этанола на изолированные белки - антигены А и В (таблица 2), монокло-нальные и естественные антитела.

Таблица 2 - Влияние этанола на антигены системы ABO

Показатели Контроль Антиген А А(П) Антиген В В(Ш) Антиген А АВ (IV) Антиген В AB(1V)

Время (сек.) Агглютинация (Р!) Время (сек.) Агглютинация (РО Время (сек.) Агг-лю-тина-ция (РО Время (сек.) Агглютинация (Pt) Время (сек.) Агглютинация (pt)

М * 6 12 * 5,6 11 * 5,2 12 * 6,2 11 * 6 11

Me 6 12 5 12 6 12 6 12 6 12

Д% - - -7 - -14 - +3 - - -

СКО 0 0 0,96 0,48 1,03 0 1,31 Го/18 0 0,48

*- р<0,05

Нами выявлены индивидуальные отличия параметров, характеризующих узнавание и взаимодействие антигенов с антителом обусловленные, очевидно, спецификой строения антигенов АВО, а также их фенотипической неоднород-

ностью. Оценивая время визуализации агглютинации алкоголизированного А антигена с моноклонапьными антителами А(И), отмечается уменьшение времени агглютинации, но в меньшей степени по сравнению с В антигеном.

Постановка реакции с моноклонапьными антителами показала следующие результаты (таблица 3).

Таблица 3 - Влияние этанола на моноклональные антитела

Показа- Контроль Анти-А антитела А(П) Анти-В антитела В(Ш) Анти-А антитела АВ (IV) Анти-В антитела АВ(1У)

тели Время (сек.) Агглютинация (РО Время (сек.) Агглютинация (Р1) Время (сек.) Агглютинация (РО Время (сек.) Агглютинация (РО Время (сек.) Агглютинация (р1)

М * 4 12 * "" 5,2 12 5,2 12 6,6 12 6 12

Ме 6 12 6 12 6 12 6 12 6 12

А% - - -14 - -14 - +10 - - -

ско 0 0 1,03 0 1,03 0 0,96 0 0 0

*-р<0,001

Установлено, что алкоголизация моноклональных антител обусловливает одинаковое облегчение узнавания анти-А и анти-В антител антигенами эритроцитов А(Н) и В(Ш) групп крови.

Показано, что действие этанола на систему цельной крови оказывает такое модифицирующее влияние на иммуноглобулины плазмы человека, что полнота взаимодействия с анти-А антителами выше, чем с анти-В антителами.

Во всех сериях эксперимента выявлено, что антигены АВ(1\') группы, предварительно инкубированные с этанолом, вступают во взаимодействие аналогично контрольным образцам. При этом нивелируется специфика, характерная для А и В антигенов.

Наблюдаемые нами изменения белок-лигандных взаимодействий антигена с антителом является результатами суммарных модификаций вызнанных этанолом и регистрируемых по скорости и полноте процесса агглютинации. Проведенные эксперименты отчетливо показали, что этанол способен активно влиять на процессы межмолекулярного белок-белкового узнавания и взаимодействия.

Для оценки результатов белок-белковых взаимодействий гликопротеинов А и В со специфичными моноклонапьными конъюгированными антителами при введении этанола в систему, использован современный высокотехнологичный способ визуализации - конфокальная лазерная сканирующая микроскопия.

Установлено однонаправленное действие на экспрессию антигенов системы ABO, инкубация с этанолом ведет к нарастанию комплексов антиген-антитело для обеих групп (рисунок 2). Однако, под влиянием этанола количество и размер антиген-антительных комплексов, образованных гликопротеином В возросло существенно больше, чем образованных гликопротеином А.

i»

А' В'

Рисунок 2 - Визуализация системы антиген-антитело с помощью метода конфокальной лазерной сканирующей микроскопии: А - гликопротеин А+ антитело, меченое FITC (исходное); В - гликопротеин В + антитело, меченое FITC (исходное); А'- гликопротеин А, инкубированный с этанолом+антитело; меченое FITC В' - гликопротеин В, инкубированный с этанолом+антитело, меченое FITC

При анализе данных пространственного распределения интенсивности флюоресценции свечения флюорохрома с помощью компьютерной программы EMBL Image (Europe Medical Biological Image, 2011) в системе антиген-антитело (рисунок 3) установлено, значительное увеличение пиков флюоресценции для антигена В и практически неизменное количество для антигена А.

Рисунок 3 — Диаграммы пространственного распределения интенсивности флуоресценции Р1ТС:

А - гликопротеин А + антитело (исходное);

А' - гликопротеин А, инкубированный с этанолом+ антитело;

В - гликопротеин В + антитело (исходное);

В' - гликопротеин В, инкубированный с этанолом + антитело

Делая вывод о данных микроскопии, важно отметить, что антигены А(II), В(Ш) групп крови по-разному реагируют на действие внешнего стимула. Что заключается в ускорении агглютинации гликопротеинов В и моноклональных антител, меченных флуоресцеинизотиоционатом под действием этанола, демонстрирующее высокую реакционоспособность антигена третьей группы крови и устойчивость гликопротеина А к действию изучаемого фактора.

Оценка результатов исследования позволила прийти к заключению, что этанол, модифицируя молекулу антигена , оказывает большое влияние на процесс узнавания антигена антителом, их взаимодействие - более консервативный процесс, менее варьирующий, менее зависящий от нативности антигена.

Не исключено, что избыточное поступление экзогенного этанола может служить фактором, нарушающим белок-лигандные взаимодействия в организ-

ме, изменяя процессы метаболизма в мембранах, в цитоплазме и в биологических жидкостях.

Следующим этапом стало выяснение потенциальной биологической активности антигенов, определяемой структурной характеристикой антигенных детерминант ABO системы. Для реализации этой задачи мы вновь использовали компьютерную программу PASS (рисунок 4).

1

0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 h 0,3 0,2 0,1 0

■ Антиген А " Антиген В

7 8 9 10 II 12 13

15 16

Рисунок 4 - Прогнозируемые биологические эффекты антигенных детерминант А и В

1 - антибактериальный 11 - регулятор фактора некроза нервов

2 - иммуностимулятор 12 - регулятор фактора некроза опухоли

3 - противоопухолевый 13 — ингибитор синтеза белка

4 - противогрибковый 14 - стимулятор каспазы 3,8,9

5 — антикоагулянт 15 - стимулятор интерлейкина 2

6 — стимулятор ангиогенеза 16 - ингибитор митохондриальной

7 — вазопротектор электротранспортной цепи

8 — подсластитель

9 — ингибитор тканевого каллекреина

10 - ингибитор проницаемости мембран

При оценки полученных свойств антигена В с терминальным моносахаридом галактозой и антигена А с М-ацетилгалактозамином, очевидна количественная и качественная разница выявленных эффектов и механизмов их реализации.

Антигенная детерминанта В антигена обладает 106 фармакологическими эффектами, т.е. на 7% больше, чем А антиген, используя при этом 311 молекулярных механизмов действия. Количество побочных эффектов уменьшилось до 16 возросла метаболическая активность на 25%, регуляторное влияние на экс-

прессию генов по-прежнему невелико, но увеличилось на 50%, вовлечение транспортных систем для осуществления действия возросло на 20%. Возможно, именно эта разница лежит в основе избирательного сродства антигенов А и В к чужеродному молекулярному, клеточному материалу, что визуализируется различной заболеваемостью носителей 0(I)-AB(IV) групп крови.

Естественно, что результаты, полученные компьютерным моделированием нельзя отождествлять со status vivo. Однако можно допустить, что олигоса-харидные детерминанты системы ABO, представленные на мембранах всех клеток организма, обладают, как и все биомолекулы организма полифункциональностью и помимо защитной функции, реализующейся во взаимодействии с антителами, способны оказывать множественное влияние на процессы жизнедеятельности, поддерживая чистоту нашей эндэкологии и обеспечивая динамический гомеостаз наряду с другими факторами.

Далее в условиях in vitro изучалось влияние этанола на активность глице-ральдегидфосфатдегидронегназы, лактатдегидрогеназы, а- глицерофосфатде-гидрогеназы поэтапно в гемолизате и с гомогенными белками (таблица 4).

Таблица 4 - Влияние этанола на активность ферментов гемолизата (Е/мг)

ГАФД а-ГФД лдг

Контроль Опыт Контроль Опыт Контроль Опыт

Исходные значения 0,25 5± 0,002 0,251± 0,003 0,200Н: 0,007 0,192+ 0,003 0,315± 0,005 0,317± 0,004

Инкубация 0,250± 0,005 0,440 ±0,004 0,203¿ 0,011 0,244 ±0,009 0,312± 0,008 0,517 ±0,006

Изменение % -2,0 +75,3 + 1,5 +27,1 -1,0 +63,1

Р >0,05 <0,001 >0,05 <0,05 <0,05 <0,01

Установлено, что в лизате эритроцитов удельная активность ГАФД, ключевого фермента гликолиза, в среднем составляет 0,255±0,002 Е/мг. Этанол вызывает значительное повышение дегидрогеназной активности. Выявленное усиление активности ГАФД гемолизата после инкубации с этанолом свидетельствует о том, что этиловый спирт, обладающий реакционоспособной гидро-ксильной группой в силу наличия короткого двууглеродного радикала и незначительного индуктивного эффекта, может вступить в донорно-акцепторные отношения с функциональными группами апофермента, что ведет к повышению его реакционоспособности.

В этих условиях наряду с прямым действием этанола возможны и косвенные эффекты, т.е. опосредованные взаимодействием этилового спирта с другими реакционоспособными соединениями и создание оптимального микроокружения для взаимодействия с коферментом и субстратом.

Сравнивая активирующее влияние этанола очевидно более значимое влияние на ГАФД, чем на а-ГФД. Эти данные свидетельствуют, что эффекты этанола при одинаковой биодоступности ферментов определяются их субъединичным составом. Этанол за счет неферментативного взаимодействия с функциональными группами белков модулирует их функцию.

Инкубация с этанолом ведет к значимому повышению активности ДЦГ. Величина сопоставима с возрастанием уровня активации ГАФД. Это может свидетельствовать о сходстве механизмов влияния этанола на тетрамерные молекулы каталитических белков и об обеспечении им слаженности и преемственности реакций гликолиза.

Далее нами были проведены эксперименты с изолированными гомогенными ферментами (таблица 5). Установлено, что тенденция сдвигов, которые вызывает этанол, аналогична тем, которые выявлены для гликолитических ферментов гемолизата.

Таблица 5 - Влияние этанола на активность гомогенных каталитических белков

ГАФД а-ГФД ЛДГ

Контроль Опыт Контроль Опыт Контроль Опыт

Исходные значения 22,21± 1,78 23,19± 2,53 2,950± 0,831 2,936± 0,055 504,2± 45,3 493,4± 32,1

Инкубация 21,68+ 2,13 30,17 ±1,27 3,010+ 1,334 3,270 ±0,049 488,1± 39,7 625,1± 41,0

Изменение, в% -2,4 +30,1 +2,0 + 11,4 +3,2 +26,7

Р >0,05 <0,01 >0,05 <0,5 >0,05 <0,01

Характерно, что в количественном отношении они значительно менее выражены. Активность ГАФД увеличилась на 30,1%, а-ГФД на 11,4%, ЛДГ на 26,7%. Следовательно, экстраполируя эти данные к status vivo, можно предположить, что поступление экзогенного этанола закономерно усиливает процесс окислительного метаболизма углеводов.

С позиции оценки метаболических особенностей организма очевидна многомерность, иерархическая многоуровненность, наличие разнородных систем регуляции жизнедеятельности. Установленные особенности биологической активности антигенных детерминант антигенов А и В, специфика регуляторного действия этанола на антиген-антительное взаимодействие 0(I)-AB(1V) групп крови визуализирует ассоциированность протеомного профиля с ABO системой, раскрывает особенности молекулярного ответа на действие низкомолекулярных лигандов.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что колебания содержания эндогенного этанола у лиц 0(1)-AB(IV) группами крови свидетельствуют о биологической вариабельности данного метаболита, ассоциированной с ABO - групповой принадлежностью крови. Наиболее низкий уровень отмечен у клинически здоровых лиц с 0(1) группой крови. У женщин с 0(1) группой крови его содержание ниже на 22%, чем с В(Ш) группой крови (р=0,014).

2. Определено, что этанол по данным in silico с использованием программы Prediction of Activity Spectra for Substances, будучи низкомолекулярным минорным компонентом метаболизма, является высокоактивным соединением, обладая возможностью проявления 306 биологических эффектов, реализуемых 479 механизмами действия. Антигены А и В помимо основных функций связывания соответствующих антител, обладают широким спектром биологической активности. Для гликопротеина А характерно 99 свойств, включая преимущественно ингибиторные эффекты. Гликопро-теин В обладает 106 эффектами. Более выраженная активность антигенной детерминанты антигена В подтверждена экспериментально в опытах in vitro с экзогенным этанолом в реакциях антиген-антительного взаимодействия.

3. Выявлено, что этанол активирует процесс антнген-антителъного узнавания. Особенностью является более выраженная полнота агглютинации и укорочение времени узнавания антигена В с анти-В моноклональными антителами. Визуализация с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии подтверждает полученные результаты экспериментов по количеству образовавшихся антиген-антительных комплексов под влиянием этанола.

4. Установлено, в опытах in vitro с моноклональными антителами этанол способствует уменьшению времени агглютинации для анти-А и анти-В антител. Сродство анти-А антител плазмы человека к антигену мод влиянием этанола возрастает, а для анти-В антител наблюдается противоположный эффект. Спецификой AB(IV) группы крови является отсутствие выраженных изменений.

5. Выявлено, что этанол служит модулятором функции ферментов, активируя за счет прямого и опосредованного действия глицеральдегидфосфат-дегидрогеназу, а-глицерофосфатдсгидрогеназу и лактатдегидрогеназу. Характерен более значимый эффект на тетрамерные белки, чем на ди-

мерную молекулу а-глицерофосфатдегидрогеназы,что может служить одним из механизмов регуляции метаболических процессов 6. Групповая принадлежность крови системы ABO определяет специфику ответа на внешние и внутренние стимулы белков различной структуры и функции, формируя индивидуальные признаки организма Малые молекулы в иерархии регуляторных систем контролируют метаболические процессы,влияя на характер межмолекулярного взаимодействия.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

1. При определении содержания алкоголя необходимо учитывать биологическую вариабельность содержания эндогенного этанола, ассоциированную с ABO групповой принадлежностью крови:

0(1)-0,013 ±0,001 г/л; А(II)-0,014 ± 0,000 г/л; В (III)-0,015 ±0,001 г/л; АВ (IV)-0,015 ±0,001 г/л

2. Молекулярная модель антиген-антительного взаимодействия может быть использована для тестирования широкого спектра биологически активных веществ. Получен патент на изобретение № 2484480 «Способ оценки действия биологически активных веществ на антиген-антительное взаимодействие» от 10 июня 2013 г. / Ф.Н. Гильмиярова, В.М. Радом-ская, Е.А. Шахнович, Н.А. Колотьева, Н.С. Нефедова, А.А. Чудинова.

Список работ, опубликованных автором по теме диссертации

1. Гильмиярова, Ф.Н. Прогнозируемая биологическая активность антигенных детерминант ABO системы крови / Ф.Н. Гильмиярова, В.М. Радомская, H.A. Колотьева, Е.А. Шахнович, Н.С. Нефедова, Е.А. Рыскина, A.A. Епифанова, A.B. Бабичев // Альманах «Жизнь плюс наука». Интернализация и инновации.-Вып. 7. Самара:000 «Книга». - 2011. - с. 24-27.

2. Колотьева, H.A. Модифицирующее влияние малых молекул на белок-лигандное взаимодействие / H.A. Колотьева, Е.А. Шахнович, Н.С. Нефедова, Е.А. Рыскина, A.A. Епифанова, К.И. Колесова, O.A. Долгова// Тезисы II Международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: геномика, протеомика, биоинформатика». - Новосибирск. -2011.-С.211

3. Колотьева, H.A. Роль малых молекул в реализации белок-белковых взаимодействий/ H.A. Колотьева, Е.А. Шахнович, Н.С. Нефедова, Е.И.

Кобозева, Е.Д. Волков, Е.А. Рыскина // Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии: сборник трудов II Международной Интернет-конференции. - Казань: изд-во «Казанский университет». - 2011. - с. 152153.

4. Нефедова H.C. Влияние этанола на фермент-субстратное взаимодействие / H.C. Нефедова // Материалы докладов Всероссийской конференции с международным участием «Молодые ученые - медицине». - Самара, 2011. -с. 216 - 217.

5. Рыскина, Е.А. Полиморфизм и полифункционалыюсть антиг енов ABO системы крови / Е.А. Рыскина, Ф.Н. Гильмиярова, H.H. Чернов, A.A. Епифанова, Н.С. Нефедова // Вестник РУДН, серия Медицина -Москва, 2011, №4. - с. 31 - 36.

6. Шахнович Е.А. Группоспецифические особенности лигандного взаимодействия под влиянием силистронга / Е.А. Шахнович, H.A. Колотьева, Н.С. Нефедова, Е.А. Рыскина, A.A. Епифанова, О.И. Мелешкина, O.A. Долгова, Е.И. Кобзева // Здоровье и образование в XXI веке. Инновационные технологии, модернизация, качество, доступность и безопасность лекарственных средств в системе здравоохранения современной России. Школа формирования принципов здорового образа жизни. - Москва.: РУДН. - 2011. - с. 510-511.

7. Гильмиярова Ф.Н. Белок-белковые взаимодействия в присутствии минорных компонентов метаболизма / Ф.Н. Гильмиярова, H.A. Колотьева, Е.А. Шахнович, Е.А. Рыскина, A.A. Чудинова, Н.С. Нефедова // Тезисы III Международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лаборатной и клинической медицине: гсномика, протеомика, биоинформатика», 22 - 24 ноября 2012. Казань. - С. 152.

8. Гильмиярова, Ф.Н. Метаболический профиль 0(1) - AB(IV) групп крови / Ф.Н. Гильмиярова, В.М. Радомская, Е.А. Шахнович, Н.С. Нефедова, H.A. Колотьева, Е.А. Рыскина, A.A. Епифанова // Медицинский альманах. - 2012. - № 1 (20) - с.174 -178.

9. Гильмиярова, Ф.Н. Оценка иммуногенетических особенностей донорской крови / Ф.Н. Гильмиярова, Е.А. Шахнович, H.A. Колотьева, Н.С. Нефедова, И.Ф. Сидорова, A.A. Епифанова, Н.И. Гергель // Клиническая лабораторная диагностика. - 2012. - №9. - С. 42.

10. Гильмиярова, Ф.Н. Оценка полиморфизма ABO и резус-систем крови доноров / Ф.Н. Гильмиярова, В.М. Радомская, O.A. Гусякова, A.A. Епифанова, Е.А. Рыскина, И.Ф. Сидорова, Е.А. Шахнович, H.A. Колотьева, Н.С. Нефедова, O.A. Николаева, A.A. Чудинова, Е.И. Кобозева // XVI Международная научная конференция «Здоровье семьи в XXI веке» Будапешт (Венгрия). - 2012. - с. 70-72.

11. Нефедова Н.С. Влияние этанола на функцию дегидрогеназ / Н.С. Нефедова И Аспирантский вестник Поволжья, серия Медицина -Самара, №1-2,2012, с. 266 - 268.

12. Шахновнч Е.А. Визуализация лигандных свойств минорных компонентов метаболизма при взаимодействии с каталитическими и рецепторными белками / Е.А. Шахнович, Н.С. Нефедова, A.A. Чудинова // Материалы I Всероссийской конференции молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века». - Москва, 2012. - с. 205 - 206.

13. Гильмиярова, Ф.Н Биологическая активность антигенных детерминант системы крови ABO / Ф.Н. Гильмиярова, Н.С. Нефедова, H.A. Колотьева, В.М. Радомская, Е.А. Рыскина, A.A. Епифанова, Е.А. Шахнович // XVI Международная научная конференция «Здоровье семьи в XXI веке» Лиссабон. - 2013. - с. 83 - 86

14. Гильмиярова, Ф.Н. Минорные компоненты метаболизма в регуляции белок-белковых взаимодействий / Ф.Н. Гильмиярова, В.М. Радомская, Е.А. Рыскина, O.A. Гусякова, Н.А.Колотьева, Е.А. Шахнович, Н.С. Нефедова, A.A. Чудинова // Медицинский альманах. - 2013, № 2(26). - с. 181-184.

15. Гильмиярова, Ф.Н. Ключевые показатели углеводного обмена у клинически здоровых людей с различной групповой принадлежностью крови по системе ABO / Ф.Н. Гильмиярова, H.A. Колотьева, O.A. Гусякова, Н.С. Нефедова, Е.А. Шахнович, H.H. Гергель II Казанский медицинский журнал. - 2013. - № 5 (94) - с. 672- 674.

16. Гильмиярова, Ф.Н. Антигены ABO системы / Ф.Н. Гильмиярова, В.М. Радомская, Н.С. Нефедова, H.A. Колотьева, Е.А. Шахнович, Е.А. Рыскина, A.A. Чудинова // Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. — 2013. — №8 - с. 21 — 28.

17. Нефедова Н.С. Белки, обладающие каталитической активностью - объект изучения влияния минорных компонентов метаболизма / Н.С. Нефедова // Материалы докладов Всероссийской конференции с международным участием «Молодые ученые - медицине», 2013. Самара. - с. 154 - 156.

18. Получен патент на изобретение № 2484480 «Способ оценки действия биологически активных веществ на антиган-антительное взаимодействие» от 10 июня 2013 г. / Ф.Н. Гильмиярова, В.М. Радомская, Е.А. Шахнович, H.A. Колотьева, Н.С. Нефедова, A.A. Чудинова.

На правах рукописи

Нефедова Наталия Сергеевна

МИНОРНЫЕ КОМПОНЕНТЫ МЕТАБОЛИЗМА В ИССЛЕДОВАНИИ МЕЖМОЛЕКУЛЯРНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

03.01.04- Биохимия

Автореферат диссертации па соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск - 2013

Подписано в печать 31.10.2013 Формат бумаги 210x297. Объем издания 1,0 усл. печ. л. Отпечатано в типографии ГБОУ СПО "СГИПТ" адрес: г. Самара, ул. Молодогвардейская 59, ИНН 6317005231 №31/10 Тир. 120 экз.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Нефедова, Наталия Сергеевна, Челябинск

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

На правах рукописи

04201454317 Нефедова Наталия Сергеевна

МИНОРНЫЕ КОМПОНЕНТЫ МЕТАБОЛИЗМА В ИССЛЕДОВАНИИ МЕЖМОЛЕКУЛЯРНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

03.01.04 - Биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель: Гильмиярова Фрида Насыровна Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор

Самара-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Страницы

ВВЕДЕНИЕ.......................................................................... 4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Характеристика ABO системы крови...................................... 13

1.2. Белок - лигандные взаимодействия: влияние высоко и

низкомолекулярных соединений................................................. 24

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объект исследования.......................................................... 37

2.2. Этапы исследования........................................................... 38

2.3. Методы исследования

2.3.1. Определение группы крови по системе ABO.............................. 39

2.3.2. Определение содержания в крови эндогенного этанола............. 42

2.3.3. Методы определения активности дегидрогеназ........................ 43

2.3.4. Компьютерное прогнозирование спектра биологической активности этанола и антигенов А и В............................................................... 44

2.3.5. Визуализация антиген-антительного взаимодействия с применением конфокальной микроскопии.............................................................. 46

2.3.6. Статистическая обработка результатов исследований................ 48

ГЛАВА 3. СОДЕРЖАНИЕ ЭНДОГЕНННОГО ЭТАНОЛА В КРОВИ С РАЗЛИЧНОЙ АВО-ГРУППОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТЬЮ. ПРОГНОЗИРОВАНИЕ Ш 811ЛСО БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЭТАНОЛА

3.1. Содержание эндогенного этанола в крови клинически здоровых

лиц с различной АВО-групповой принадлежностью крови................. 50

3.2. Прогнозирование т бШсо биологической активности этанола

и механизмов ее реализации....................................................... 58

ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ ЭТАНОЛА НА БЕЛОК-БЕЛКОВЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ АНТИГЕНА С АНТИТЕЛОМ

4.1. Влияние этанола на антигены системы ABO............................. 65

4.2. Влияние этанола на моноклональные антитела.......................... 67

4.3. Оценка прямых и опосредованных эффектов этанола на естественные антитела ABO системы............................................ 68

4.4. Визуализация антиген-антительного взаимодействия с применением лазерной сканирующей конфокальной микроскопии....... 71

4.5. Изучение потенциальных свойств и биологической активности антигенных детерминант системы ABO методом

компьютерного моделирования.................................................... 75

4.5.1. Возможные свойства и механизмы действия антигенной детерминанты антигена А.......................................................... 78

4.5.2. Возможные свойства и механизмы действия антигенной детерминанты антигена В.......................................................... 85

4.5.3. Сравнительная оценка потенциальных признаков

и механизмов действия антигенных детерминант антигенов АиВ....... 91

ГЛАВА 5. ОЦЕНКА КАТАЛИТИЧЕСКОЙ ФУНКЦИИ БЕЛКОВ МЕТОДОМ МЕТАБОЛИЧЕСКОГО ЗОНДИРОВАНИЯ

5.1. Влияние этанола на функцию дегидрогеназ в полиферментной полисубстратной системе........................................................... 97

5.2. Влияние этанола на активность изолированных

каталитических белков.............................................................. 105

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...................................................................... 109

ВЫВОДЫ.............................................................................. 118

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ....................................... 120

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ......................................................... 121

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. Непреходящая актуальность изучения ре-гуляторных механизмов обусловлена их ключевым значением в процессах жизнедеятельности, многообразием выполняемых функций, появлением новых взглядов на роль и значимость отдельных механизмов в формировании ответа на различные стимулы. Как известно, в основе управления биологическими системами лежит принцип узнавания, белок-лигандного взаимодействия, индуцирующего на клеточном уровне каскад реакций в метаболических, транспортных, иммунологических процессах. Посттрансляционные модификации белков расширяют их функции в отношении распознавания, передачи сигналов и про-теолиза. Эти процессы регулируют дифференцировки клеток и их пролиферацию [171, 172]. Важная роль в специфической и неспецифической защите организма, энергетическом, метаболическом обеспечении принадлежит крови и прежде всего эритроцитам, участвующим в поддержании динамического го-меостаза организма [44, 207].

Полиморфная система антигенов эритроцитов, включая ABO антигены, обладающими из 350 известных систем наибольшей иммуногенностью, обеспечивает механическую устойчивость мембран при трении о стенки капилляров, служит рецепторами эндогенных и экзогенных лигандов, выполняет защитную, структурную роль, обуславливает различия в физико-химических и антигенных свойствах организма. Есть данные о том, что иммуноглобулины обладают и ферментативной активностью, расщепляя и фосфорилируя белки, полисахариды и липиды, нуклеиновые кислоты [92, 157, 90, 119, 148, 176, 297, 174, 208, 247].

Важное медицинское значение имеет определение биологической индивидуальности организма человека при чрезвычайном разнообразии и общности признаков популяции. Наряду с известными возрастными и индивидуальными особенностями метаболизма появились новые данные об ассоциированности метаболических, гемостазиологических показателей, клеточного состава с

групповой принадлежностью крови. [26, 223, 174]. Для раскрытия значения гликопротеинов А и В в формировании биологической индивидуальности человека актуальным является изучение роли малых молекул в процессах белок-лигандного взаимодействия с учетом принадлежности к группам крови. Это будет способствовать составлению представлений о возможностях управления иммунологическими, ферментативными, рецепторными процессами, в основе которых лежат лигандные взаимодействия. Интерес представляет этанол, ди-фильность молекулы которого, высокая химическая активность данного метаболита и нутриента, определяет важность изучения его влияния на процессы антиген-антительного и фермент-субстратного взаимодействия.

Настоящее исследование выполнено в рамках Федеральной программы: «Взаимодействие биологически активных веществ растительного и животного происхождения с системами жизнеобеспечения организма с учетом биологической вариабельности метаболизма, ассоциированной с групповой принадлежностью крови» (номер гос. регистрации 0120.0809698).

Цель исследования: выяснить характер ответа гликолитических де-гидрогеназ и гликопротеинов А и В на действие этанола. Задачи исследования:

1. Определить содержание эндогенного этанола в крови клинически здоровых лиц с 0(1)- AB(IV) группами крови.

2. Охарактеризовать резерв метаболических свойств этанола, оценив спектр биологической активности in silico.

3. Изучить потенциальные свойства и биологическую активность антигенных детерминант системы ABO методом компьютерного моделирования.

4. Оценить влияние этанола на процессы взаимодействия гликопротеинов А и В с антителами в модельных экспериментах с визуализацией антиген-антительных комплексов методом лазерной сканирующей конфокальной микроскопии.

5. Изучить прямые и опосредованные эффекты этанола на функцию глице-ральдегидфосфатдегидрогеназы, а-глицерофосфатдегидрогеназы, лактатде-гидрогеназы.

Методология и методы исследования:

Дизайн исследования состоял из следующих этапов.

1. Определение эндогенного этанола ферментативным методом в крови клинически здоровых лиц с учетом групповой принадлежности по ABO системе.

2. Изучение потенциальных свойств и биологической активности этанола и антигенных детерминант системы ABO методом компьютерного моделирования.

3. Изучение влияния этанола на белок-белковые взаимодействия антигена с антителом в различных условиях эксперимента, используя в качестве объектов антигены А и В, моноклональные и естественные анти-А и анти-В антитела.

4. Визуализация антиген-антительных комплексов методом лазерной сканирующей конфокальной микроскопии.

5. Оценка влияния этанола на активность дегидрогеназ: глицеральдегидфосфатдегидрогеназы, а-глицерофосфатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы в гемолизате и на гомогенные ферменты, с использованием кинетических методов исследования.

Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора

Достоверность результатов работы, обоснованность выводов и рекомендаций базируется на достаточном числе наблюдений и использовании современных методов исследования статистической обработки материалов с помощью пакета компьютерных программ SPSS 12.0 «ANOVA».

Результаты исследований были представлены на II международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: геномика, протеомика, биоинформатика» (Новосибирск, 2011); Всероссийской научно-практической

конференции биохимиков и специалистов по лабораторной медицине «Медицинская биохимия и клиническая лабораторная диагностика в аспекте модернизации системы научных исследований» (Омск, 2011); научно-практической конференции «Обеспечение доступности современных клинических лабораторных исследований: аналитические возможности, клинические потребности, организационно-экономические условия» (Москва, 2011); Всероссийской конференции с международным участием «Молодые ученые - медицине» (Самара, 2011); Международной Интернет-конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии» (Казань, 2011, 2012); научно-практической конференции «Реальные клинико-диагностические лабораторные услуги: степень соответствия стандартам лабораторной медицины, качество, себестоимость и цена» (Москва, 2012); XVI международной научной конференции «Здоровье семьи в XXI веке» (Будапешт, 2012); I Всероссийской конференции молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века» (Москва, 2012); совместном заседании кафедр фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой и общей, бионеорганической и биоорганической химии ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Самарского отделения Всероссийского общества биохимиков и молекулярных биологов, Самарского отделения научно-практического общества специалистов по лабораторной медицине (Самара, 2013).

Личное участие автора в получении научных результатов, изложенных в диссертации, состояло в проведении научно-информационного поиска, анализа, обобщения данных литературы по профилю диссертационного исследования, формулировке цели и задач, определении показателей групповой принадлежности крови и содержания эндогенного этанола у клинически здоровых лиц, в проведении серии модельных экспериментов по изучению белок-белкового взаимодействия in vitro, визуализации антиген-антительных комплексов методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии,

выяснении возможных свойств и механизмов действия этанола и антигенных детерминант А и В антигенов, выполнении статистической обработки полученных результатов исследования. Участие автора в сборе первичного материала и его обработке - более 90%, обобщении, анализе и внедрении в практику результатов работы - 100%. Все научные результаты автором получены лично.

Положения, выносимые на защиту:

1. Уровень эндогенного этанола в крови клинически здоровых лиц. Ассоциированность с группами крови по системе ABO. Возможные метаболические эффекты этанола и антигенов А и В, установленные in silico, прогнозируемые с помощью компьютерной системы Prediction of Activity Spectra for Substances (PASS).

2. Влияние этанола на характер белок-белкового взаимодействия. Уменьшение времени наступления агглютинации антигенов А(П) и В(Ш) с моноклональными антителами, модифицированными этанолом. Особенности антиген-антительного реагирования анти-А и анти-В антител с эритроцитами АВ (IV) группы крови. Специфика межмолекулярного узнавания анти-А и анти-В антител человека с антигенами. Визуализация антиген-антительных комплексов методом лазерной сканирующей конфокальной микроскопии.

3. Действие этанола на каталитические белки с различным уровнем структурной организации. Активация этанолом глицеральдегидфосфатдегидрогеназы, а-глицерофосфатдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы.

Научная новизна

Получены новые сведения, раскрывающие роль малых молекул в белок-лигандных взаимодействиях белков с различными функциями. В серии модельных экспериментов установлено, что дифильная молекула этанола, обладающая активными физико-химическими свойствами, способна изменять процесс межмолекулярного узнавания антигена с антителом. Высокая биологическая активность этилового алкоголя показана нами в исследованиях

in silico. Моноклональные анти-А и анти-В антитела, модифицированные этанолом, быстрее узнают и связываются с эритроцитами А(П) и В(Ш) группы крови. Специфику антиген-антительного взаимодействия отражают данные о более выраженной полноте агглютинации и укорочение времени узнавания антигена В с анти-В антителами. Сродство анти-А антител плазмы человека к антигену под влиянием этанола возрастает, а для анти-В антител наблюдается противоположный эффект. Индуцированные этанолом стерические, электростатические изменения в структуре антител и антигенов характеризуются группоспецифическими особенностями. Изменения более значимы для процесса узнавания антигена антителом, предшествующему образованию комплекса. Выяснено, что избирательное действие оказывает этанол и на ферментные белки разного уровня структурной организации. Характерен более значимый эффект на тетрамерную молекулу глицеральдегидфосфатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы, чем на димерную структуру а-глицерофосфатдегидрогеназы. Это действие типично для изолированных ферментов и находящихся в естественном окружении. В условиях целостного организма, очевидно, за счет этого реализуется регуляция обменных процессов, усиление или замедление потока субстратов по различным метаболическим путям.

Показано, что не только иммуногенетическая индивидуальность организма, но и специфика ответа на различные стимулы обеспечивается групповыми антигенами ABO системы. Прогнозирование биологической активности А и В антигенов и механизмов ее реализации с помощью компьютерной системы Prediction of Activity Spectra for Substances (PASS) выявило полифункциональность и особенности свойств антигенов А и В. Более многообразный спектр эффектов и выявленных механизмов характерен для антигена В. Данные in silico позволяют по-новому оценить антиген-антительное взаимодействие, включающее не только связывание чужеродного молекулярного или клеточного материала, но и оказывающее фронтальный эффект на ферментативные метаболические, транспортные процессы,

экспрессию генов. При этом групповая принадлежность крови определяет специфику ответа на внешние стимулы, составляя фенотипический признак, сопряженный с функцией белков различной структуры и выполняемой ими биологической роли, формируя индивидуальные метаболические признаки.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные результаты имеют теоретическое значение. Они раскрывают регуляторную роль этанола, определяющую характер межмолекулярного узнавания. Показано, что структурные особенности белков, уровень организации обуславливает специфику молекулярного ответа на действие этого биологически активного соединения. Экспериментально разработана и обоснована информативность использования модели антиген-антительного взаимодействия, применение конфокальной микроскопии с целью визуализации узнавания, степени полноты взаимодействия антигенов и антител системы группы крови ABO. Отличия процесса агглютинации антигена А и антигена В с анти-А и анти-В антителами свидетельствуют об избирательности эффекта и аргументируют возможность оценки на этой модели действия биологически активных соединений, лекарственных веществ. Результаты, полученные на этой модели, служат обоснованием для роли интермедиатов, малых молекул, в регуляции белок-лигандных взаимоотношений при использовании их в качестве молекулярных зондов. Метаболиты, на долю которых приходится значительная часть клеточного и внеклеточного пространства являются регуляторами процессов, в основе которых лежат белок-лигандные взаимодействия. Они, очевидно, обеспечивают адекватность молекулярных процессов запросам организма. Это выявлено на примере этанола.

Изменение интенсивности катализа лактатдегидрогеназы, глицеральдегидфосфатдегидрогеназы и а-глицерофосфатдегидрогеназы, усиливающееся под влиянием этанола, характеризует этот минорный компо