Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

МЕТОД 1Н ЯМР СПЕКТРОСКОПИИ В ИССЛЕДОВАНИИ ЭКЗОМЕТАБОЛИТОВ РАЗВИВАЮЩИХСЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "МЕТОД 1Н ЯМР СПЕКТРОСКОПИИ В ИССЛЕДОВАНИИ ЭКЗОМЕТАБОЛИТОВ РАЗВИВАЮЩИХСЯ МИКРООРГАНИЗМОВ"



На правах рукописи

Юркевич Дмитрий Иосифович

МЕТОД 'Н ЯМР СПЕКТРОСКОПИИ В ИССЛЕДОВАНИИ ЭКЗОМЕТАБОЛИТОВ РАЗВИВАЮЩИХСЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Специальность 03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 2002

Работа выполнена в Научно-учебном центре физиологии и биофизики Путинского государственного университета и лаборатории изотопных методов ИТЭБ РАН.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор физико-математических наук Кутышенко В.П.

доктор технических наук, профессор Лежнев Э.И. доктор биологических наук, профессор Чемериз Н.К.

Институт Биохимии и Физиологии микроорганизмов РАН.

Защита состоится «_»_2002 года в_ч, на заседании

диссертационного совета Д 002.093.01 в Институте Теоретической и

Экспериментальной биофизики РАН.

Адрес: 142290, г. Пущине, МО, ул. Институтская, д.З

С диссертацией можг.о ознакомится в Центральной библиотеке Путинского научного центра РАН

Автореферат разослан «_»_2002 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета .Іанина Н.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Стремительное развитие биофизики значительно расширило наши знания о физико-химических процессах и структуре биологических систем на всех уровнях организации живой материи - от молекулярного уровня до уровня целого организма. Прогресс в этой области знаний тесно связан с интенсивным взаимопроникновением идей, теоретических подходов и методов современной биологии, физики, химии и математики. Важное значение имеет разработка и совершенствование физических методов исследования биологических систем. Одним из таких методов является открытый полвека назад метод спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР), постоянное совершенствование которого позволяет применять его для решения многочисленных проблем биологии.

В настоящее время для исследования образцов биологического происхождения в основном используют ЯМР на ядрах ,3С и 1(Р. Неинвазивный характер ЯМР спектроскопии дает возможность соотносить полученные данные с физиологической и морфологической информацией об объекте, не разрушая его. Имеющиеся на данный момент методики позволяют исследовать метаболизм углеводов и фосфорилированных соединений, внутриклеточный окислительно-восстановительный потенциал, метаболизм аминокислот, лнпидов и жирных кислот, ферментативные кинетики, следить за мембранными градиентами ионов. Дополнительную информацию о ходе обмена вешеств, можно получить, используя селективное обогащение продуктов метаболизма стабильными изотопами, например углеродом-13 и дейтерием.

Однако ядерный магнитный резонанс на ядрах углерода, фосфора и дейтерия обладает рядом недостатков. В их числе низкая чувствительность 3|Р-ЯМР, длительные времена накопления "С-ЯМР (не только из-за низкой чувствительности, но и из-за релаксационных характеристик) и неудовлетворительное разрешение гН спектров. Мы предположили, что часть этих недостатков можно преодолеть, используя для исследования метаболизма протонный резонанс. 'Н-ЯМР-спектроскопия является наиболее удобным методом с точки зрения регистрации спектров. Присутствие водорода во всех органических соединениях и высокая магнитная восприимчивость протонов делает метод универсальным для исследования всех аспектов клеточного метаболизма.

Отработка предложенных нами методик проходила на чистых линиях культур клеток - фибробластов. Они были выбраны из-за своей доступности, хорошей воспроизводимости и достаточной стандартности ростовых характеристик. На поверхности двумерного субстрат

образуют монослой, легко открепляются, что позволяет подсчитывать их количество. Однако для дальнейшего их совершенствования понадобился менее требовательный к условиям культивирования объект исследований. На наш взгляд, таким объектом, позволяющим проводить более оперативные эксперименты в рамках ЯМР-лабораторин, является симбиотический организм - медузомицет. Этот малоизученный, но интересный объект исследования, предоставляет уникальную возможность изучать не только особенности метаболизма в симбиозе, но и влияние внешних условий на связи и целостность симбногической ассоциации. Таким образом, исследование медузомицета позволило не только полностью раскрыть потенциал разработанных нами методик 'Н-ЯМР-спектроскопии, но также представляет практический интерес с точки зрения изучения благоприятных для человеческого организма и стимулирующих здоровье свойств этого организма.

Цель данной работы состояла в разработке новых методик исследования клеточного метаболизма методом 'Н-ЯМР-спектроскопни высокого разрешения и установлении зависимости параметров, определяемых из протонных спектров с параметрами цикла роста клеток.

Для выполнения данной цели решались следующие задачи:

1) Изучение методом 'Н-ЯМР утилизации глюкозы и производства экзометаболитов в чистых культурах клеток фнбробластов. Установление связи между кинетикой накопления экзометаболитов и численностью клеток.

2) Изучение методом 'Н-ЯМР утилизации глюкозы и производства экзометаболитов в медузомицете в НгО и 020.

3) Анализ путей образования дейтероизотопомеров этанола и ацетата в медузомицете по протонным спектрам.

4) Изучение по протонным спектрам перераспределения в экзометаболитах метки углерода-13 в случае использования изотопно-меченой глюкозы.

5) Изучение адаптации медузомицета к 020 и низким температурам.

Научная новизна исследований состоит в том, что протонный резонанс известный, в основном, как метод структурного исследования молекул, был впервые применен для количественного определения концентрации как обычных, так и обогащенных изотопами углерода-13 и дейтерия экзометабол итов.

Практическая значимость работы заключается в том, что данные о физиологических и биохимических особенностях роста медузомицета могут

быть использованы В биотехнологии для получения биологически активных веществ и использования организма в медицине, а так же для получения дейтерированиых соединений.

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на 2-х конференциях молодых ученых, проходивших в Пущино в 1996 и 1997.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ в ведущих отечественных журналах и 2 тезисов.

Структура работы. Диссертация изложена на 201 стр. текста компьютерного набора и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы (198 источников, из которых 158 зарубежных авторов). Работа содержит 13 таблиц и 45 рисунков.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Во введения кратко обоснованы выбор темы и актуальность работы, сформулированы цели и задачи исследования, обосновывается выбор объектов исследования.

В первой главе дается обзор существующих на данный момент методик и современных тенденций применения 'Н-ЯМР спектроскопии для исследования различных аспектов клеточного метаболизма. Дается краткое описание метода ЯМР и основные положения о клеточных культурах и их культивировании. Проводится анализ известных данных об особенностях адаптации и культивирования микроорганизмов в DjO. Один из разделов посвящен литературному обзору имеющихся данных о научной истории, составе, особенностях физиологии и метаболизма медузомицета.

Во второй главе даются характеристики объектов исследования и методики, используемые для культивирования культур клеток фибробластов и медузомицета. Описываются методики приготовления различных типов субстратов для культивирования, подсчета количества клеток. Дано описание техники проведения ЯМР экспериментов на спектрометрах «Bniker» \VM-400 и "Bruker" АМХ 500, приготовления образцов, проведения измерений и обработки результатов.

Третья глава состоит из б разделов, в которых представлены экспериментальные данные (оригинальные спектры и кинетики зависимости

полученных спектральных параметров от времени культивирования микроорганизмов) и их интерпретация.

Поиск корреляции между кривыми накопления метаболитов и кривой роста клеток

Для исследования процессов роста и обмена веществ в растущих организмах необходимо в реальном времени следить за изменениями концентраций основных метаболитов. Спектроскопия протонного магнитного резонанса является неинвазивным методом, позволяющим идентифицировать и определять концентрации всех метаболитов в среде для культивирования.

Для доказательства связи между кинетикой накопления экзометаболитов в среде и параметрами роста клеток, нами были проведены эксперименты по культивированию клеток фибробластов линий ВНК21/С13 и Н5Я-8,

НЕТ-вЯ (Институт канцерогенеза РАМН). Для этого было проведено отнесение сигналов в спектрах растворов, используемых в процессе культивирования клеток: сбалансированного солевого раствора Хэнкса, раствора трипсина и версена, стандартных сред. На рис. 1 представлены обзорные ЯМР спектры свежей и отработанной культуральных сред. Сигналы в области 2.5+4.0 ррш принадлежат сахарам, а ярко выраженный дублет на частоте 1.3 ррш -молочной кислоте. По спектрам измерялся безразмерный параметр «5», являющийся нормированной к начальному значению относительной интегральной интенсивностью сигналов. Измерение в спектрах интегральных интенсивностей этих веществ показало, что в процессе роста культуры происходит утилизация глюкозы и накопление молочной кислоты. Кривые изменения интегральных интенсивноетей сигнала лактата при культивировании клеток двух линий на стеклянной и пластиковой поверхностях представлены на рис. 2. Во всех экспериментах графики представляли собой в-образные кривые с явно выраженными участками: лаг-фазы, фазы экспоненциального роста, переходящей в стационарную фазу. Такая форма характерна и для кривой роста клеток. Параллельный подсчет клеток с помощью гемоцитометра (камеры Горяева) и нанесенной на монокуляре микроскопа сетки показал, что на этапах лаг-фазы и логарифмической фазы потребление глюкозы и накопление молочной кислоты пропорционально увеличению их количества. Таким образом, кривые накопления лактата, полученные из спектров, с точностью до постоянного коэффициента представляют кинетики роста культур клеток. Эксперименты показали, что значение этого коэффициента зависит от того, какого типа энергетический метаболизм преобладает в культуре микроорганизмов.

Рис. 1. ЯМР спектры свежей (а) и отработанной (б)

куаьтуральных сред н раствора трипсина и версена (в)

арреля

Рис,

юны Фалькона сть

I ( I I I | I I I I I Г Н1'| lili l'll'l'l | I I I I

О 20 40 60 30 100 120 140 t, час.

2. Кинетика изменения относительных интегральных интенсл вностей сигнала лактата вереде для культивирования при росте популяции фибробластов

Известно, что на величину выхода клеток влияют многие факторы: рН, ограничение доступа кислорода, истощение питательных веществ, пространственные ограничения. Как только один из этих факторов вступает в действие, рост клеток прекращается, что и отражается стационарной фазой на кривой роста. Поэтому целью следующих экспериментов было доказать что кинетики роста клеток, определяемые по спектрам ЯМР отражают влияние этих факторов.

Эксперименты по культивированию фибробластов трех линии в пластмассовых флаконах показали, что скорость роста на поверхности пластмассы меньше, чем на поверхности стекла. Это выражается в замедлении скорости накопления лактата в среде (см. рис. 2). Достижение плотного монослоя (конфлюента) сопровождается прекращением клеточных делений, что соответствует фазе плато на кривой роста клеток. Происходит так называемое плотноегное торможение роста (топоингибирование), v сопровождающееся изменением характера метаболизма. Подобное поведение культуры фибробластов характеризует их как «вышедшие из клеточного цикла» или находящиеся в фазе GO, Анализ спектров ЯМР показал, что при этом кинетика накопления лактата представляет монотонно возрастающую прямую. Напротив, изменение сложившихся условий (например, удаление части монослоя) приводит к выходу клеток из фазы GO и стимуляции клеточного .деления. При этом восстанавливается экспоненциальное накопление молочной 'кислоты в среде.

В экспериментах по культивированию клеток фибробластов линий HSR-1 и HET-SR, иммобилилизованных в 3-х мерном коллагеновом геле, одновременно С взятием проб, измерялся диаметр контракторного диска. Анализ данных ЯМР спектроскопии показал, что процессы роста клеток в коллагеновом матриксе проходят медленнее, чем на стекле или пластмассе. Морфологическая картина роста культуры, полученная методом оптической микроскопии, коренным образом отличается от монослоя и наиболее близка к картине роста ткани. Однако, как и в монослое, синтезируется молочная кислота и расходуется глюкоза. Химическая энергия в этом случае тратится, в основном, на реорганизацию {сжатие) коллагенового геля. Кинетика накопления лактата отражает процессы взаимодействия клеток с матриксом.

Таким образом, эксперименты с культурами клеток фибробластов трех линий доказали, что по характеру изменения концентраций экзоиетаболнтов в спектрах ЯМР можно выяснить, на каком этапе цикла роста и клеточного цикла находится популяция клеток.

Исследование методом 'Н-ЯМР спектроскопии процессов роста н утилизации глюкозы медузомииегом

Культивирование медузомицета в средах на Н20

Разработанная методика ЯМР спектроскопии использовалась далее для изучения углеводного метаболизма медузомицета. Этот си мбиотический организм представляет собой более сложную для исследования систему, чем культура клеток. Основная проблема заключается в невозможности контролировать в нем число клеток или прирост биомассы, что является довольно обычным явлением при исследовании биологических систем in vivo. В экспериментах мы исходили из выводов о тождественности ростовых характеристик и кинетики накопления экзометаболитов в культуральной среде.

На рис. 3 представлены спектры настоя чайного гриба в начале и в конце цикла культивирования. В спектре были идентифицировании сигналы глюкозы в области 3-4 ррш, этанола при 1.2 и З.б'ррт, и синглет ацетата при 2 ррш. Кннетика изменения концентраций этих экзометаболитов при начальной концентрации глюкозы в среде 0.03 М представлена на рис. 4. На графиках можно выделить 3 участка, соответствующие жизненному циклу медузомицета:

1) уменьшения концентрации глюкозы и роста этанола (отО до 120*140 часов);

2) уменьшение концентрации этанола и роста ацетата (от 120-Н40 до 280 часов); 3) падение концентрации ацетата (>280 часов). Из анализа литературных данных (Abadie, 1962) известно, что чайный гриб -симбиотический организм, состоящий из дрожжей и уксуснокислых бактерий. Дрожжи сбраживают глюкозу в этанол и СОг> а уксуснокислые бактерии начинают активно производить ацетат при высокой концентрации этилового спирта в среде. Дополнительные эксперименты показали, что этанол является хорошим источником углерода для уксуснокислых бактерий, участвующих в симбиозе медузомицета. Медузомнцет толерантен к высоким концентрациям этанола в среде, но при увеличении его концентрации с 0,06 М до 0,6 М наблюдается уменьшение скорости утилизации спирта в 2 раза. Чтобы исследовать влияние разных концентраций глюкозы на рост и метаболизм организма, чайный гриб выращивали на средах, содержащих 0.03,0.06 н 0.09 М этого вещества. Анализ кинетики накопления экзометаболитов в культуральной среде позволяет сделать вывод, что в исследуемом организме уксуснокислые бактерии представлены двумя видами. Для одного из них благоприятны условия, когда вся глюкоза быстро превращается в этанол, который он активно утилизирует. Для второго штамма более благоприятна высокая начальная концентрация глюкозы в среде.

этанол

глюкоза

этанол

\

3.6 3.2

ацетат

X . . I . . ■ ■ ■ I ■ I

28

1,6

24 20 (РР™)

Рис. 3. 'Н-ЯМР спектр настоя чайного фиба, в среде на НгО в начале (а) и в конце (б) цикла культивирования

Рис, 4. Кинетика изменения молярной концентрации экзометаболмтов в кондиционированной среде в процессе роста медузомицета (начальная'концентрация глюкозы 0.03 М)

Культивирование медузомицета в средах на В^О

Наиболее удобным методом для исследования путей метаболизма углеводов является введение в субстрат метки стабильного изотопа и ■ наблюдение за ее включением в промежуточные продукты метаболизма. Для этой цели мы использовали изотоп водорода — дейтерий и разработанную нами методику наблюдения за его распределением по спектрам протонного ЯМР. Дополнительный интерес такого подхода состоит в возможности исследования процесса адаптации организма к тяжелой воде.

Нами было установлено, что в случае культивирования медузомицета в среде на 98% ЭгО с 0.03 М ['Н]-глюкозы, уже с первых часов начинают образовываться дейтероизомеры этанола. Такая быстрая адаптация не > свойственна другим до сих лор исследованным организмам в ЕУЭ. Кинетики изменения концентраций глюкозы, этанола и ацетата имеют вид, аналогичный кинетике для простой воды. Однако мы наблюдали торможение процессов роста в культуре медузомицета, свойственное любому организму в ОгО. Утилизация глюкозы и накопление этанола в кондиционированной среде происходит в 2.5-3 раза медленнее, чем при росте в НгО, однако скорость производства ацетата остается прежней. Эксперименты с различной начальной концентрацией [!Н]-глюкозы (0,03+0.09 М) в среде показали, что максимальные значения экзо метаболитов не превышают 0.025-Н).03 М. Измеренные концентрации экзометаболитов в спектрах меньше измеренных в Н^О из-за того, что дейтроны, заместившие прогоны в необмениваемых позициях экзометаболито» становятся «невидимы» для 'Н-ЯМР. Таким образом, разница между измеренными значениями концентраций промежуточных продуктов обмена веществ в НгО и Б^О коррелированна со степенью их дейтеризации.

Для экспериментов по определению дейтероизотопомеров был выбран хорошо адаптированный к тяжелой воде организм, много раз пересевавшийся на свежеприготовленные минимальные среды. Через 7 дней культивирования в спектрах сигналы глюкозы практически полностью отсутствовали, что давало возможность наблюдать только сигналы метаболитов. На рис. 5(а) и 5(6) представлены 'Н-ЯМР спектры в области поглощения метильных протонов этанола и ацетата в тяжелой воде. Нами было проведено отнесение линий в спектрах каждою из дейтерированных изотопомероа. Рис. 5(а) иллюстрирует, что по степени замещения протона на дейтерий в метальной группе ацетата, различают три язотопомера: синглет -СН5; -триплет СНгО и квинтет -СНТЬ-Спектральные хинин приобретают уширенный и сложный мультиплетный характер из-за большего электрического квадрупольиого момента дейтрона и протон-де Йтрон во го взаимодействия. Чем больше дейтронов включается в

о

Рис. 5. 'Н-ЯМР-спекгры настоя чайного гриба в области поглощения метильных протонов ацетата (а) и этанола (б) в Р20

Этапы гл и кол та

Глюкозо-6-фосфат

| Фруктозо-6-фосфат

Фосфоеиояпируват |

®

Пируват

1

Возможный

изотопный состав метальной группы этанола

Лч

Н(О) н Н Н V

ЩО) ЩО)

V /

Г ' 4

Н(Р) Н(О) \ /

'Счн

Рис. 6. Общая схема шагов гликолиза, ведущих к

включению изотопа - дейтерия в метальную группу этанола.

молекулу, тем в более высокопольной области наблюдается спектр этого вещества. Поскольку в этаноле происходит взаимодействие метальной ,« метилековой групп, в его спектре (рис. 5(6)) образуется шесть изотоломеров: -СНО-СНь -СД1-СН3; -С0гСН20; -СОгСНОг; -СШ)-СН20; СНО-СШ^. Сигналы -СН0-СН20 и -СНО-СШ^ плохо разрешены в спектре на ряс. $(<}}, поскольку перекрываются с другими лияиямн. По спектрам были измерены относительные концентрации всех изотопомеров. Для метальной группы этанола степень дейтеризации Рц = 43%, для метиленовой Рц = 82%, и степень дейтеризации этанола по метиленовой и метальной - 58%. Степень дейтеризации учитывалась при определении концентраций метаболитов. Измеренные концентрации этанола корректировались в 1/(1-Ро)=1.75 раза (1-\ РП«РН - степень про тонизации}.

Анализ путей включения изотопов гН » |3С в экзометаболнты. Влияние включения дейтерия на ход обмена веществ

Из анализа данных, полученных при культивировании медузомнцета в РгО следует, что частичная дейтеризацияг молекул экзометаболитов может происходить только в ходе гликолиза. Как видно из рис. б, изменения'в метальной группе этанола и ацетата возможны на двух этапах гликолиза. При преобразовании глкжозо-6-фосфата в фруктозо-6 фосфат образуются новые С-Н связи в позициях С( и С2, что делает их доступными растворителю. Посредством фермента фосфоглюхозизомеразы в позицию С) может включаться один дейтрон. Еще. один дейтрон может включаться в каждую молекулу пиру вата во время его превращения из фосфоенол пиру вата. Максимальное включение дейтерия в метальную группу составляет не более 2-х атомов для первого фрагмента глюкозы (С)-С2-Сз) и не более 1-го для второго (С4-С)-Са). Причем по отдельности ни один из этих шагов не может отвечать за сложившееся распределение дейтерия. Аналогично было показано, что метиленовая группа более доступна для дейтронов. Атомы углерода и С3 полностью меняют свое протонное окружение. Одна из, двух возможных позиций водорода замещается при преобразовании пирувата в ацетальдегид. Второй дейтрон переносится посредством н икотинам идаде ниндинуклеоти да из альдегидной группы глииерал ьдегид-3-фосфата в мет кленовую группу этанола, этот процесс стереоспецифичен и происходит без обмена со средой. Таким образом, наибольший обмен протонов достигается в положениях и С3, несколько меньший в положении С) и менее всего в положении С&, Изотопный состав ацетата должен в точности повторять состав этанола, поскольку дополнительной дейтеризации при образовании ацетата не происходит.

Нами были проведены эксперименты по исследованию влияния на медузомицет разных концентраций тяжелой, воды в среде. На рис. 7 представлена зависимость интегральной интенсивности протонированной компоненты ацетата от соотношения фракций легкой и тяжелой воды. На графике явно видны три области с разным коэффициентом наклона. При малых а (<20% НгО в среде) образование протонированных изотопомеров при гликолизе происходит в 2.4 раза эффективнее, чем при средних значениях а (20+60% НгО) и почти в 5 раз эффективнее, чем при высоких значениях о (60+100% НгО). Поскольку единственным признаком, который отличает молекулы метаболитов, является наличие или отсутствие дейтронов, можно предположить, что происходит селекция протонированного субстрата. Исходя из простого кинетического механизма захвата субстрата пропорционально его концентрации, это означает, что не всякий захват ферментом молекулы метаболита с присутствующим в нем дейтроном приводит к продолжению 'реакции. Система, как бы, ждет протона, что бы ее завершить и только в некоторых случаях (одна из двух или трех попыток) система удовлетворяется дейтроном. По-видимому, этим и объясняется замедление метаболизма организма при увеличении доли тяжелой воды в среде.

Нами была разработана методика, позволяющая наблюдать наличие углеродной метки в экзометаболитах по их протонным спектрам. Протон, связанный с 1гС, в силу его магнитной нейтральности не будет испытывать гетеро ядерного спин-спинового взаимодействия, в то время как протон, связанный с магнитным ядром 13С превращается в дублет с константой ,/нс-н »130 Гц. В спектрах это наблюдается как симметрично отстоящие от основного сигналы-сателлиты. Соотношение основного и сателлитных сигналов отражает процентное содержание изотопной метки в экзометаболитах. Наблюдение за утилизацией "С-обогащенноЙ глюкозы по спектрам 'Н-ЯМР вместо "С-ЯМР существенно повышает точность измерения из-за высокой чувствительности протонного резонанса. Наблюдение по спектрам ЯМР за естественным биохимическим обогащением изотопом ,3С промежуточных продуктов метаболизма в случае использования [ I -13С]-,[2- пС]-,[6-13С ]- глюкоз ы, позволило получить дополнительные данные об утилизации трехуглеродных фрагментов глюкозы в медузомнцете. Значительно повышает эффективность згой методики наличие в веществе и дейтерия и |}С.

Анализ кинетики изменения доли Н-компоненты ацетата в основном и сателлитных сигналах (Н/Н+О) и отношения интенсивностей дейтронов (20зЛЭо) и протонов (2Н<^Но) в молекулах, образующихся из 1-го и 2-го фрагментов глюкозы, показал, что преимущественно утилизируются протон и рованные изотопомеры из первого фрагмента глюкозы СгСг-С}.

s

♦

а о

X

1.0 0,8 0.6 0.4 0.2 0.0

и [ 11 J i l^- Ъ1

i ---

: kl - lili lili

; , ITI { ЧТГ r "TTTTTTTTT -г TI' Г"

(¿írr -гтгг 1111'

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0,5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 а, отн. ед.

Рис. 7. Зависимость относительной интегральной итенсивности Н-компоненты сигнала ацетата от фракции легкой воды в среде (а =[Н20]/(Н20]+(020])

=t »

а &

а i

50 100 150 200 250 300 350 400 450 5001. час

0,65 S 0.60

550 1, час

Рис. 8. Зависимость от времени относительной интегральной

интенсивности Н-компоненты основного (Но) и сателлита ых (На) сигналов ацетата при обычных условиях культивирования (а) н в эксперименте с начальным глубоким охлаждением (б)

То есть, селекция субстрата происходит на этапе образования тржюофосфатов. Эксперименты показали полную симметрию при использовании тяжелой . глюкозы и легкоИ воды, с одной стороны, и легкой глюкозы и тяжелой воды, с другой - в биохимических процессах трансформации глюкозы. В обоих случаях происходит адаптация медузомицета к новым условиям культивирования и наблюдается замедление преобразования глюкозы в этанол. Поскольку скорость производства ацетата во всех экспериментах практически не меняется, тормозящее действие тяжелой воды на рост медузомицета связано со стерическими свойствами трехуглеродных фрагментов молекулы глюкозы на пути преобразования ее в этанол.

Особенности метаболизма симбиоза лрн адаптации

I Кроме основных экзометаболитов глюкозы - этанола и ацетата, в спектрах ЯМР нами была обнаружена глюконовая кислота, концентрация которой в 24-3 раза меньше чем ацетата. Она не содержит дейтероизомеров, то есть получается прямым окислением из глюкозы. Независимо от условий культи вироаания и того, какая вода (HjO или DjO) используется, концентрация глюконовой кислоты при росте медузомицета монотонно возрастает. Как следует из анализа. литературных данных, основным бактериальным симбионтом медузомицета является Acetobacier xylinum (De Ley ei a!., 1984; "The Prokariotes 1981). В то же время, существование независимого пути получения энергии путем прямого окисления глюкозы в глюконовую кислоту характерно для бактерий GluconobacUr oxydans, наличие которых в культуре медузомицета также описывалось в литературе (De Ley et а!., 1984; "The Prokariotes 1981). Анализ образующихся в ходе культнвирования медузомицета экзометаболитов и кинетики нх накопления подтверждает тот факт, что медузомицет представляет собой симбиоз дрожжей и как минимум двух видов уксуснокислых бактерий Acetobacier xylinum и Gluconobacler oxydans.

Большинство организмов, участвующих в симбиозе медузомицета, связаны между собой коммуникационно-трофическими отношениями .посредством среды для культивирования. Этанол производится дрожжами и затем преобразуется в ацетат бактериями. Если углеродная метка вводится в 1 или 6 положении глюкозы, то перейдет она только в один из ее трехуглеродных фрагментов, то есть в одну из двух молекул этанола. В этом случае интенсивность основного и сателлитных сигналов этанола должны совпадать. Однако из спектров ЯМР следует, что уже через 40 часов после начала культивирования складывается ситуация, когда эти интенсивности неравны,

что видно на рис. 8(а). Около 10% треозы, происходящей из первого фрагмента глюкозы, не попадает в этанол. Объяснить этот факт можно, только предположив, что около 10% членов ассоциации в медузомицете находятся в особом состоянии динамического экстрацеллюлярного эндосимбиоза (ДЭС). Эти организмы характеризуются особым обменом веществ, элементы которого локализованы у разных партнеров. Передача экзометаболитов осуществляется через плотный межклеточный контакт, минуя внешнюю среду.

Дополнительные данные, необходимые для понимания функционирования партнеров этого симбиоза были получены в ходе так называемого «холодового эксперимента». Сразу после посева организма в среду с изотопно-меченной глюкозой и тяжелой водой, культиватор был перенесен в холодную комнату (1=2°С). Тем не менее, метаболизм в этих условиях продолжался. В спектрах наблюдался слабый сигнал ацетата, увеличивающийся во времени, а затем и сигнал этанола. Через некоторое время организм был возвращен в нормальную температуру, скорость метаболизма восстановилась. Однако, как следует из рис. 8(6), в начальный момент .в спектрах ацетата практически отсутствовали сателлитные сигналы.

Данный факт говорит о том, что при низких температурах интеграция процессов метаболизма свободных партнеров симбиоза нарушается. Продолжают развиваться только клетки ДЭС за счет внутренних запасов, не содержащих изотопной метки. За счет этого, при возвращении в нормальные условия, клетки ДЭС более активны и основная доля производства, не имеющего метки ацетата, приходится на них. Со временем, как свободные организмы, так и участвующие в ДЭС, начинают утилизировать глюкозу из среды, производя меченый этанол н ацетат, В конечном итоге восстанавливается обычное соотношение основного и сателлитных сигналов в спектрах.

Методами двумерной ЯМР-спектроскопии было показано, что в случае^ неблагоприятных внешних условий или в период адаптации к ^О в культуральной среде появляются вещества с малой концентрацией: янтарная кислота и глицерин. Их концентрация в среде составляет не более 2,5% от концентрации ацетата. Включения изотопа ,3С в молекулу сукцнната, а следовательно и в цикл трикарбоновых кислот, не происходит. Отсутствие в экстрацеллюлярном пространстве фосфорсодержащих производных глицерина и других метаболитов доказывает, что нарушения клеточной целостности не происходит. Из этого следует, что образование, и распад симбиотической ассоциации - динамический процесс и число его членов зависит от внешних условий. Распад его целостности приводит к выбросу в окружающую среду продуктов, участвующих в передаче через клеточный контакт.

Таким образом, проведенные эксперименты доказывают наличие прямого межклеточного проникновения метаболитов в медузомицете и его способность легко адаптироваться к неблагоприятным внешним условиям за счет внутреннего резерва метаболитов.

ВЫВОДЫ:

1) Разработана методика применения 'Н-ЯМР спектроскопии для исследования клеточного метаболизма, позволяющая ненявазивно в режиме реального времени отслеживать концентрации всех промежуточных продуктов обмена веществ в культуральной среде. Кривые накопления экзометаболитов в ходе гликолиза, полученные с помощью этой методики в культуре клеток фибробластов, представляют собой, с точностью до постоянного коэффициента, кинетики роста численности клеток и отражают особенности взаимодействия клеток между собой и с матриксом.

2) С помощью разработанной методики 'Н-ЯМР спектроскопии установлено, что в процессе роста медузомицета идет утилизация источника углерода - глюкозы с образованием этанола и последующим его превращением в уксусную кислоту. В растущей культуре медузомицета идентифицированы вещества, присутствующие в малом количестве, такие как глюконовая и янтарная кислоты, глицерин, измерены их концентрации. Установлено, что Медузомицет представляет собой симбиоз дрожжей и как минимум двух видов уксуснокислых бактерий,

3) В случае культивирования медузомицета на средах, приготовленных вместо обычной воды на 98% О^О, происходит его быстрая адаптация в течение нескольких часов, что несвойственно другим до сих пор исследованным организмам в Б20. Методом 'Н-ЯМР спектроскопии показано, что в ОгО происходит частичное дейтерирование промежуточных продуктов метаболизма медузомицета. Установлено, что сложившееся процентное соотношение изотопомеров этанола и ацетата определяется на этапах интерконверсии глюкозы в фрухтозо-б-фосфат и превращения фосфоенол пиру вата в пируват. Максимально« включение дейтерия в метальную группу этанола не превышает 2-х атомов, протоны метиленовой группы способны полностью замещаться дейтронами.

4) Разработана методика наблюдения «о спектрам 'Н-ЯМР за естественным биохимическим обогащением экзометаболитов изотопами гН и ПС, поступающими из питательной среды. Установлено, что при культивировании медузомицета в 020 происходит селекция субстрата на этапе образования триозофосфатов, заключающаяся в преимущественной утилизации протон и рованных изотопомеров из первого фрагмента глюкозы С|-Сз-Сз-

Таким образом, замедление метаболизма медузомицета в 2.5-гЗ раза при увеличении доли тяжелой воды в среде связано со стерическими свойствами фрагментов молекулы глюкозы на пути преобразования ее в этанол.

5} Предложенными методиками использования 'Н-ЯМР для исследования клеточного метаболизма показано, что около 10% симбионтов в медузомицете находятся б особом состоянии «динамического экстрацеллюлярного эндосимбиоза». Они образуют организм с обменом веществ, элементы которого локализованы у разных партнеров, а передача промежуточных продуктов метаболизма осуществляется через плотный межклеточный контакт, минуя внешнюю среду. Относительное число членов такой ассоциации может меняться в зависимости от внешних условий. Благодаря этому факту и способности накапливать внутренний резерв источника углерода, медузомицет обладает способностью к быстрой адаптации.

Материалы диссертации опубликованы в работах:

1. Кутышенко В.П., Юркевич Д.И., Идентификация частично деитерированных метаболитов при культивировании чайного гриба в тяжелой воде. ¡¡Биофизика, 2000, том 45, вып. 6, с. 1096- 1101.

2. Кутышенко В.П., Юркевич Д.И., Идентификация минорных компонент экзометаболитов медузомицета. Особенности 1 Н-ЯМР спектров при некоторых замещениях 13С и дейтерия //Биофизика, 2001, том 46, вып. 3, с. 452- 459.

3. Кутышенко В.П., Юркевич Д.И., Влияние тяжелой воды на метаболизм снмбиотического организма /¡Биофизика, в печати.

4. Юркевич Д.И., Кутышенко В.П., Селезнева И.И., Рочев Ю.А., Применение 'Н-ЯМР спектроскопии для исследования культур клеток. ¡¡Биофизика, 1996, т. 41, вып. 6, с. 1284-1288.

5. Юркевич Д.И., Кутышенко В.П., Исследование методом 'Н-ЯМР спектроскопии процессов роста и утилизации глюкозы медузомицетом ИБиофизика, 1998. том 43, вып. 2, с. 319- 322.

6. Юркевич Д.И., Кутышенко В,П„ Влияние тяжелой воды на рост и утилизацию глюкозы в процессе роста медузомицета ¡¡Биофизика, 1999, том 44, вып. 2, с. 284- 287.

7. Юркевич Д.И., Кутышенко В.П., Анализ путей включения изотопов 2Н и "С в экзометаболиты в ходе утилизации глюкозы медузомицетом ¡¡Биофизика, 2001, том 46, вып. 3, с. 445- 451.

8. Юркевич Д.И., Кутышенко В.П., Медузомицет (чайный гриб): научная история, состав, особенности физиология и метаболизма ¡¡Биофизика, в печати.

Отпечатано с готового оригинал-макета Объем и. |._Зак. W_Тираж wo

AHO «Издательство МСХА» 127550, Москва, yjf. Тимирязевская, 44