Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Реакция микроорганизмов на действие экологических факторов высших растений в системе жизнеобеспечения

ВАК РФ 03.02.08, Экология (по отраслям)

Автореферат диссертации по теме "Реакция микроорганизмов на действие экологических факторов высших растений в системе жизнеобеспечения"

На правах рукописи

Бородина Елена Владимировна

РЕАКЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ НА ДЕЙСТВИЕ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ В СИСТЕМЕ ЖИЗНЕОБЕСПЕЧЕНИЯ

03.02.08 - экология (биология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 3 ДПР 1Ш

00501МЮ'

Красноярск - 2012

005019497

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО "Красноярский государственный аграрный университет" и ФГБУН "Институт биофизики Сибирского отделения Российской Академии Наук"

Научный руководитель доктор биологических наук, с.н. с.

Тирранен Ляля Степановна

Официальные оппоненты: Елена Яковлевна Мучкина

доктор биологических наук, профессор кафедры экологии и естествознания Красноярского государственного аграрного университета

Галина Владимировна Макарская

кандидат биологических наук, с.н.с. Института вычислительного моделирования СО РАН

Ведущая организация Институт леса и древесины

им. В.Н. Сукачева СО РАН

Защита диссертации состоится 27 апреля 2012 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д-220.037.04 при ФГБОУ ВПО "Красноярский государственный аграрный университет" по адресу: 660049, г. Красноярск, пр. Мира, 90. Факс: (391) 227-86-52

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО "Красноярский государственный аграрный университет"

Автореферат разослан 27 марта 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

Г.А. Демиденко

Актуальность темы. Высшие растения - один из ключевых звеньев биологической системы жизнеобеспечения (БСЖО). Постоянным компонентом биоценоза фототрофного звена БСЖО является сопутствующая микрофлора, в постоянном взаимодействии с которой находятся высшие растения. Микроорганизмы - индикаторы состояния высших растений (Тирранен, Шиленко, 2008; ОКекоаеЫ., 2003; Тотапеп, 2008), способны быстро и разнообразно отзываться на влияние окружающей их внешней среды (Кожевин, 2000; Заварзин, 2003 и др.).

Установлено, что ингибирует рост растений, снижает их продуктивность и влияет на микробный пейзаж звена высших растений в замкнутой экосистеме комплекс факторов, важнейшими из которых являются: длительное использование питательного раствора, введение в него внутрисистемной сточно-бытовой воды и газовое замыкание системы(Пггапеп, 2001;0ае15опега/., 1997;Тптапеп, 2008).

В ранее проведенных экспериментах в замкнутой экологической системе «БИОС-3» растительные отходы и зкзометаболиты человека (нативные выделения испытателей) выносились из БСЖО (ОкеЬопе?а/., 2003).

Создание биологической системы жизнеобеспечения (БСЖО) нового поколения с более высокой степенью замкнутости круговорота веществ возможно за счет повышения эффективности утилизации растительных и физиологических отходов человека.

Какие изменения произойдут в микробиоте питательного раствора при введении в него жидких выделений человека при бессубстратном (воздушно-субирригационном) методе выращивания разновозрастной монокультуры пшеницы в замкнутой экологической системе и справится ли микрофлора раствора с ролью деструктора жидких выделений человека?

Кроме того, предстояло выяснить, не приведет ли выращивание одновозрастной монокультуры пшеницы в течение нескольких ротаций на почвоподобном субстрате (ППС), созданной на биологически переработанной соломе, к явлению, сходному с почвоутомлением? Известное ингибирование роста высших растений в замкнутых системах жизнеобеспечения человека (Лисовский, Шиленко, 1975; ОкекопеЫ, 2003) определяет необходимость поиска токсикантов, вызывающих это явление. В ряде работ (Беркович, Следь, 1989; СйеЬопеЫ, 2003 и др.) показано, что угнетение роста растений взамкнутойБСЖО связано с особенностями газового состава ее атмосферы.Одним из направлений поиска ингибиторов может быть исследование влияния газообразных веществ атмосферы замкнутой системы на рост микроорганизмов. Известно, что микроорганизмы быстрее реагируют на изменения в замкнутой системе, чем растения, и могут рассматриваться в качестве биоиндикаторов состояния атмосферы (Тотапег^Ойекоп, 2006).

Цель работы состоит в анализе и оценке реакции микроорганизмов на воздействие экологических факторов в фототрофном звене замкнутой системы жизнеобеспечения человека.

Основные задачи:

1. Выявить изменения в микробиоте раствора с жидкими выделениями человека при бессубстратном методе выращивания разновозрастной монокультуры пшеницы в замкнутой экосистеме;

2. Охарактеризовать микрофлору раствора, используемого для культивирования одновозрастных растений пшеницы на почвоподобном субстрате (ППС) без экзометаболитов человека, на ППС с нативными и минерализованными физико-химическим способом физиологическими отходами человека;

3. Оценить влияние отдельных газообразных вешеств - возможных источников загрязнения атмосферы замкнутой экосистемы на рост тест-микроорганизмов.

Научная новизна. Впервые показано, что микрофлора питательного раствора при дробном введении в него жидких выделений человека и 70 % замене нитратного азота на азот мочи при воздушно-субирригационном способе выращивания разновозрастной монокультуры пшеницы успешно справляется с ролью деструктора жидких выделений человека. Обнаружено, что выращивание растений на ППС с использованием физико-химического метода переработки физиологических отходов человека целесообразнее, чем введение в ППС нативных продуктов жизнедеятельности человека. Изучено действие разных концентраций этилена на рост Bacillus cereus 60 в ростовой микрокамере O.K. Кузнецова для ускорения отклика микроорганизмов.

Практическая значимость. Полученные результаты могут быть востребованы при разработке биологических систем жизнеобеспечения, основанных на использовании высших растений и предусматривающих длительное пребывание в таких системах человека в условиях полной изоляции от земной биосферы (в космосе, под водой), в труднодоступных районах планеты - в полярных широтах, пустынях, в высокогорье.

По микробиологическим показателям выращивание растений на почвоподобном субстрате (ППС) с использованием физико-химического метода переработки экзометаболитов человека целесообразнее, чем введение в ППС нативных продуктов жизнедеятельности человека.

Выявленная индивидуальная чувствительность тест-микроорганизмов к разным концентрациям газообразных веществ подтверждает перспективность использования микроорганизмов в качестве биотестов загрязнения атмосферы. Положения, выносимые на защиту:

¡.Микробное сообщество питательного раствора при 70 % замене нитратного азота на азот мочи успешно справляется с ролью деструктора нативной мочи человека.

2.Наблюдаемые изменения в микрофлоре и состоянии одновозрастной пшеницы, культивируемой на почвоподобном субстрате, используемом в течение 3 ротаций, аналогичны изменениям при почвоутомлении.

Наибольшие изменения выявляются в микробиоте раствора и массе зерна одновозрастной монокультуры пшеницы при выращивании ее на почвоподобном субстрате (ППС) с нативными экзометаболитами человека.

3. Индивидуален спектр действия отдельных газообразных веществ атмосферы на рост использованных тест-культур. Спектр чувствительности тест-микроорганизмов к влиянию разных концентраций исследуемых токсикантов также индивидуален.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на Международных совещаниях по искусственным замкнутым экосистемам, Красноярск, 1990, 1991; Всесоюзной конференции "Биотехнология и биофизика микробных популяций", Алма-Ата, 1991; Всесоюзном симпозиуме «Микробиология охраны биосферы Урала и Северного Прикаспия», Оренбург, 1991; XXV и XXXIV Научных чтениях, посвященных разработке творческого наследия К.Э. Циолковского, Калуга, 1990, 1999; Международной конференции «Физиология растений - наука III тысячелетия», Москва, 1999; Международных ассамблеях по космическим исследованиям: Вашингтон, США, 1992; Гамбург, Германия, 1994; Бирмингем, Англия, 1996; Нагоя, Япония, 1998; Варшава, Польша, 2000; Хьюстон, США,' 2002; Париж, Франция, 2004; Пекин, Китай, 2006; на 17 Международном симпозиуме «Человек в космосе» LAA, Москва, Россия, 2009.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 работ, в том числе 4 статьи в журналах, включенных в перечень изданий, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 115 страницах, содержит 16 рисунков и 14 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, материала и методики исследования, результатов и их обсуждения, практических рекомендаций, выводов, списка литературы, содержащего ссылки на 127 источников, из которых 42 - на иностранных языках.

Личный вклад автора. Представленная работа является обобщением научных исследований. Отбор и анализ образцов, эксперименты, обработка, интерпретация результатов, написание работы выполнены лично автором.

Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю д.б.н. JI.C. Тирранен за всестороннюю помощь и поддержку в работе.

Глава 1. Обзор литературы

В первой главе дан обзор литературных источников по изучаемой проблеме. Анализируется не только роль микроорганизмов в жизни растений, но и влияние растений на микроорганизмы.

Глава 2. Материалы и методы исследований

2.1.Объектом исследования служила микробиота бессменного питательного раствора в различных вариантах опытов:

2.1.1.Раствор с добавками в виде жидких выделений человека, использованный при бессубстратном (воздушно-субирригационном) способе

выращивания разновозрастных растений пшеницы (Lisovsky и др., 1997) в течение 190 суток (150 суток в замкнутой экологической системе и 40 суток после размыкания системы) и в опыте без замыкания экосистемы в течение 154 дней;

2.1.2. Раствор, используемый для выращивания одновозрастной монокультуры пшеницы на одном почвоподобном субстрате (ППС) в течение трех ротаций;

2.1.3. Раствор с нативными и переработанными физико-химическим методом экзометаболитами человека, используемый при культивировании одновозрастных растений пшеницы на ППС. В контроле пшеница росла на ППС без добавок.

Исследуемыми объектами загрязнения атмосферного воздуха замкнутой экологической системы (ЗЭС) были аммиак, ацетальдегид, озон, сернистый ангидрид, этилен, углекислота.

В качестве экспериментальной модели апробировано до 96 тест-микроорганизмов из родов Pseudomonas, Erwinia, Enterobacter, Flavobacterium, Nocardia, Achromobacter, Mycobacterium, Bacillus, Micrococcus, Xanthomonas, StreptococcusK другие с разной чувствительностью к действию летучих веществ.

2.2. Методы исследования

2.2.1. Микробиоты раствора с жидкими выделениями человека при бессубстратном методе выращивания разновозрастной монокультуры пшеницы в замкнутой экосистеме

В эксперименте с ЗЭС в течение 102 суток, начиная с 49 суток после замыкания системы, и в опыте без замыкания экосистемы в течение 154 суток в питательный раствор вводили жидкие выделения человека, заменяя 70 % нитратного азота среды на азот мочи. Ежедневная подача жидких выделений человека в питательный раствор проводилась дробно: три раза в сутки. Конвейерную культуру пшеницы из семи возрастов выращивали в условиях интенсивного освещения воздушно-субирригационным способом с вегетационным периодом 63 дня (Lisovskyefa/., 1997; Gitelsoneta/., 2003).

Исследованы индикаторные группы микроорганизмов - общее количество бактерий, в т.ч. бактерий группы кишечной палочки, группы протея, споровых (в стадии спор), микроскопических грибов и дрожжей, актиномицетов, азотфикаторов (аэробных и анаэробных), аммонификаторов, денитрификаторов (косвенных и истинных), клетчаткоразрущающих микроорганизмов, наиболее показательные для контроля и прогнозирования состояния высших растений в замкнутой экосистеме (Тирранен, Шиленко,2008). Выделение и идентификацию микроорганизмов проводили общепринятыми методами (Билай и др., 1988; Практикум по микробиологии ... под ред. Нетрусова, 2005; Поздеев, 2010).

2.2.2.Микрофлоры раствора для выращивания одновозрастной монокультуры пшеницы на одном (ППС) в течение 3 ротаций

В 3-х модельных экспериментах каждый продолжительностью 70 суток изучено поведение индикаторных групп микроорганизмов(п. 2.2.1) в растворе для выращивания одновозрастной монокультуры пшеницы на одном почвоподобном субстрате (ППС) в течение 3 ротаций. В п. 2.2.1 указаны использованные в работе методики.В экспериментах сорт пшеницы «232» селекции Г.М. Лисовского (Замкнутая система... под ред. Г.М. Лисовского, 1979) с вегетационным периодом 70 суток выращивали на ППС при температуре 22-24°С и относительной влажности воздуха 65% в сосудах площадью 0,057 м2 при уровне освещенности 150 Вт/м2 ФАР (Мапикоувуе^в/

1997).

2.2.3.Микробного населения растворов, используемых для выращивания растений пшеницы на почвоподобном субстрате с добавками

Микробиота растворов изучена в двух модельных экспериментах каждый продолжительностью 70 суток. Исследовано поведение 12 индикаторных групп (п. 2.2.2) микроорганизмов в бессменных растворах, использованных для выращивания монокультуры пшеницы на ППС с различными добавками: с нативными выделениями человека и с переработанными физико-химическим методом экзометаболитами человека. Контрольные растения монокультуры пшеницы культивировали на ППС без добавок.

Использованная методика мокрого сжигания экзометаболитов человека, изложена и запатентована Ю.А. Куденко и Р.П. Павленко (Куденко, Павленко,

1998). Физико-химический метод минерализации физиологических отходов человека позволяет использовать полученный окисленный продукт для питания растений как добавка в почвоподобный субстрат (ППС).

2.2.4.Влияния летучих загрязнителей атмосферного воздуха ЗЭС (аммиака, ацетальдегида, озона, сернистого ангидрида, диоксида этилена, углекислого газа) на рост тест-микроорганизмов проведено по схеме 1 —» 2 —» 3

4,где:

1 - чашки Петри с агаризованной питательной средой предварительно экспонировались в атмосфере замкнутой экосистемы с известной концентрацией изучаемого загрязнителя;

2 - питательная среда в чашках Петри подвергалась воздействию атмосферного воздуха замкнутой экосистемы- в среду свободно проникали и накапливались в ней водорастворимые летучие вещества из атмосферы;

3 - затем тест-микроорганизмы наносили методом реплик на поверхность питательной среды с продиффундировавшими в нее летучими веществами из атмосферы. Для этого из 2-суточных исследуемых культур по оптическому стандарту мутности на 10 ед. готовили суспензию, которой пастеровскими пипетками заполняли лунки станины репликатора. С помощью ручки репликатора делали реплики (Пггапепега/., 2001) до 50 тест-культур одновременно на поверхность незасеянной среды, разлитой мерно на дно чашек Петри;

4 -реакцию бактерий на действие изучаемого токсиканта в атмосфере замкнутой системы оценивали по разнице диаметра колоний в опыте и контроле.

Тест-культуры выращивали в разработанном нами устройстве для культивирования микроорганизмов на твердых средах (Безруких и др., 1990). Чашки Петри с питательной средой и свеженанесенными методом реплик тест-культурами на ней размещали на гранях корпуса в отверстиях - питательной средой внутрь камеры и герметично фиксировали специальным прижимным устройством. В опытном варианте к отросткам камеры присоединяли цилиндры с исследуемым газом. Камеру с присоединенными к ней цилиндрами помещали в термостат. Концентрацию исследуемого газа определяли на хроматографе "СЬгот-5". В контроле культуры выращивали в такой же камере, но без подачи исследуемого газа.

2.2.5.Методика исследования действия этилена на рост бактерий (на клеточном уровне) в ростовых камерах О.Ю. Кузнецова. Эксперименты проводили с использованием светового микроскопа МБИ-15 с иммерсионным объективом и фотоаппаратом. Микроорганизмы выращивали в герметично замкнутой ростовой микрокамере О.Ю. Кузнецова (1988), который использовал ее для культивирования организмов в протоке питательной среды. В настоящем исследовании микрокамеру применяли для создания протока газообразных веществ и поддержания определенного состава атмосферы в ростовой полости. Эту полость камеры образуют параллельно установленные покровные стекла. Между ними помещают агаровый блок, на который наносят клетки исследуемой культуры.

Канал для подвода исследуемого газа соединен с мерным сосудом, содержащим газообразный этилен, а канал для отвода газа - с емкостью, в которой находится органический растворитель, улавливающий газ, выходящий из камеры. Объем камеры составляет 0,1 см3. Такая конструкция позволяет заполнить камеру газом и наблюдать за развитием одиночных клеток под микроскопом. Содержание этилена в исследуемых пробах воздуха определяли с помощью газового хроматографа "СЬгот-5". После засева камеры микроорганизмами, ее наполняли смесью этилена заданной концентрации с воздухом. Наблюдения вели за одними и теми же клетками в течение 5 - 7 ч (1 раз в час): учитывали число клеток в поле зрения, фотографировали поле зрения. По фотографиям определяли длину бактериальной цепочки. В качестве критериев роста культуры использовали увеличение числа клеток в поле зрения и удлинение бактериальных цепочек. Все эксперименты десятикратно повторяли.

Статистическая обработка данных проведена по Г.Ф. Лакину (1990).

Во всех экспериментах учитывали среднюю арифметическую величину диаметра колоний (X), ошибку средней арифметической (т). Критерием оценки служила стандартная величина нормированного отклонения (18,), с которой сравнивалось фактическое значение этого критерия (1фагт,.„ое или I разности) для 95 - 99 %-го уровня значимости. Количественный учет микроорганизмов на

жидких элективных средах проведен по таблице Мак-Креди [Теппер и др., 2004], разработанной на основе методов вариационной статистики. С помощью корреляционного анализа изучены взаимосвязи между различными группами микроорганизмов и массой зерна пшеницы; между длительностью поступления жидких выделений человека в питательный раствор и массой зерна пшеницы.

Воздействие газообразных веществ на тест-бактерии оценивали как положительное (стимулирующее) или отрицательное (ингибирующее), когда размер колоний тест-культур в опыте был соответственно достоверно увеличен или снижен по сравнению с контролем. Если размер колоний в опыте достоверно не отличался от контроля, действие газа оценивали как нулевое. Результаты сравнения размеров колоний выражали в процентах и баллах

Разницу в размерах опытных и контрольных колоний от 0 до 19 % оценивали в 0 баллов, а действие считали нейтральным (нулевым). Разницу от 20 до 39% оценивали в I балл, от 40 до 59 % - в 2, от 60 до 79 % - в 3, выше 80 % - в 4 балла.

Глава З.Микробиологическая характеристика питательных растворов с добавками для культивирования высших растений ЗЛ.Микробиота питательного раствора с жидкими выделениями человека, используемого для выращивания растений

Длительное выращивание разновозрастной (7 возрастов) монокультуры пшеницы на питательном растворе с добавками в виде жидких выделений человека (при 70 % замене нитратного азота на азот мочи) не сопровождалось резким увеличением количества всех исследованных групп микроорганизмов в растворе. Органические вещества в среде почти не накапливались, в значительной степени минерализовались и усваивались биоценозом. Влияние замыкания проявилось в росте общего количества бактерий, группы кишечной палочки, группы протея, микроскопических грибов и дрожжей.

После размыкания экосистемы численность вышеназванных групп микроорганизмов снижалась. Изменения микробиоты питательного раствора с добавками в виде жидких выделений человека, используемого для выращивания растений, как в замкнутой экологической системе, так и без замыкания соответствовали изменениям химического состава питательной среды и состояния растений.

О влиянии жидких выделений человека на мобилизационные процессы, происходящие в питательном растворе, судили по динамике численности некоторых физиологических групп микроорганизмов, участвующих в превращении азотсодержащих веществ. С увеличением времени поступления мочи в питательный раствор, численность почти всех исследованных групп микроорганизмов увеличивалась.

К концу длительного эксперимента увеличивалась численность аэробных бактерий, аммонификаторов, олигонитрофилов, фитопатогенных (бактерий, растущих на среде Ферми) за счет накопления в среде легкоокисляемых органических веществ. Количество актиномицетов, микроскопических грибов, клетчаткоразрушающих и жирорасщепляющих микроорганизмов

9

коррелировало с содержанием трудноокисляемых веществ в питательном растворе (рисунок 1)._____

—g ^ч^р^"

/V

—•-

• о

300

s s

- 150

79 92 105 118 131 144 157 170 183 Сутки опыта

мгОг/л), численности бактерий А--), в том числе бактерий группы кишечной палочки (- -•- -)

Рисунок 1 - Динамика перманганатной окисляемости (• (-

в питательном растворе при введении в него жидких выделений человека в замкнутой

экологической системе (КОЕ тыс./мл)

Критерий разности (t3Kal*) между численностью микроорганизмов в исследуемых пробах определяли по следующим точкам: 40 сутки - проба перед началом введения метаболитов, 55 сутки - начало введения метаболитов, 144 сутки - перед окончанием введения мочи и 158 сутки - после окончания введения метаболитов, 1 и 186 сутки - первая и последняя пробы в эксперименте (таблица 1).

Таблица 1 - Критерий разности (tj«n*) между численностью микроорганизмов в исследуемых пробах

сутки 1 40 55** 144 158***

40 10,42

55 13,51 6,35

144 8,72 8,96 7,71

158 13,5 8,42 6,09 2,72

186 8,76 9,48 9,85 2,57 6,09

сутки 1 40 55** 144 158***

40 2,43

55 10,21 11,94

144 10,21 11,94 0,0

158 7,35 7,99 1,79 1,79

186 7,25 18,91 13,9 13,9 8,95

В

сутки 1 40 55** 144 158** *

40 17,15

55 8,7 2,91

144 10,7 6,72 2,23

158 0,0 17,11 8,69 10,67

186 5,39 13,93 6,87 7,16 5,34

Г

сутки 1 40 55** 144 158***

40 112,5

55 6,3 15,89

144 4,2 2,21 3,63

158 8,59 6,25 7,89 2,36

186 2,13 0,39 1,64 1,17 3,42

А - общее число бактерий, Б - бактерии группы кишечной палочки, В - микроскопические грибы, Г - актиномицеты

* 4,ксп - критерий разности достоверен при 1эКП> 15, (Ъ, = 2,78 для р = 0,05; ^ = 4,60 для р = 0,01; и = 8,61 для р = 0,001).Достоверные значения выделены жирным шрифтом. ** - С 49суток в питательный раствор вводятся жидкие выделения человека, *** - После 150суток опыта прекращена подача жидких выделений в питательный раствор, система разомкнута

10

Корреляционный анализ выявил прямую зависимость между временем поступления нативной мочи в питательный раствор и развитием микроорганизмов, участвующих в трансформации азота. Величина коэффициента корреляции между длительностью использования питательного раствора с жидкими выделениями человека в течение 81 суток, 108 и 144 и урожаем зерна пшеницы, выращенной на этом питательном растворе в эксперименте вне ЗЭС, равная г. -0,22; -0,22 и -0,26 (соответственно), указывает на отсутствие достоверных связей между значениями признаков.

Проведен сравнительный анализ между массой зерна пшеницы, выращенной в течение 63-81 суток на питательном растворе без жидких выделений человека и урожаем зерна пшеницы, выращенной за тот же период на питательном растворе с 70 %-ой заменой нитратного азота среды на азот мочи человека в опытах без замыкания системы. Полученные результаты (г= 0,10) позволяют заключить, что дробное введение нативной мочи человека в питательный раствор, используемый для выращивания пшеницы в замкнутой экологической системе жизнеобеспечения человека, при 70 % замене нитратного азота среды на азот мочи возможно. Введение жидких выделений человека в нативной форме в питательную среду не вызвало необратимых изменений в микрофлоре питательного раствора.

3.2.Микробиологическая ситуация в растворах, используемых для выращивания растений пшеницы в течение трех ротаций на одном почвоподобном субстрате (ППС)

В данном эксперименте из 12 исследованных индикаторных групп микроорганизмов к концу 3 ротации (опыт) обнаружено достоверное увеличение численности бактерий группы кишечной палочки, фитопатогенных и флуоресцирующих бактерий, снижение количества клетчаткоразрушающих микроорганизмов и микроскопических грибов (рисунок 2).

Рисунок 2 Динамика численности фитопатогенных бактерий (а) и клетчаткоразрушающих микроорганизмов (б) в питательном растворе

Примечание: по оси X - длительность использования раствора (сутки), по оси У - количество микробных клеток, тыс./1 мл; ряд 1-контроль (1-ая ротация), ряд 2 - опыт (3-я ротация).

Одновременно наблюдалось ухудшение состояния одновозрастной монокультуры пшеницы и снижение массы зерна в 2,2 раза по сравнению с

первоначальным использованием ППС в 1 ротации (контрольный вариант). Масса зерна в контроле была равна 2653 г/и2.

По всей вероятности, наблюдаемые изменения в микрофлоре и состоянии выращиваемых растений на ППС аналогичны изменениям при почвоутомлении (Картвелишвили, 1984).Полагаем, что следует продолжить поиск путей длительного использования ППС для выращивания растений в СЖО.

3.3. Микробиота питательных растворов, используемых для выращивания растений пшеницы на почвонодобном субстрате с добавками

Известно, что к концу вегетации растений с изменением их корневых выделений, за счет которых размножаются микробы, уменьшается количество грамотрицательных бактерий и возрастает доля споровых форм бактерий, микроскопических грибов и клетчаткоразрушающих микроорганизмов (Иванов, 1973; Тптапеп, 2001).

В контрольном варианте полученные данные подтвердили вышесказанное. Выявлено, что в длительно использованном питательном растворе численность всех исследованных групп микроорганизмов, кроме споровых форм бактерий, клетчаткоразрушающих и микроскопических грибов, снизилась к концу эксперимента. Количество аэробных бактерий снизилось с 15 по 70 сутки опыта с 2,4х107±0,28 КОЕ/мл до 0,32х107±0,02 КОЕ/мл.

При добавлении нативных экзометаболитов человека в ППС наиболее показательным было изменение количества бактерий группы кишечной палочки, группы протея, фитопатогенных бактерий, микроскопических грибов

Рисунок 3 - Динамика численности бактерий группы кишечной палочки (БГКП) и микроскопических грибов в питательном растворе, использованном для выращивания растений на почвоподобном субстрате с нативными

экзометаболитами человека в течение 70 суток (фон - питательный раствор без растений)

Следует заметить, что при выращивании растений пшеницы на ППС с добавками (и нативными экзометаболитами, и минерализованными) в микрофлоре питательного раствора появились дрожжи и дрожжеподобные грибы, которые в контрольном растворе отсутствовали. Добавление нативных выделений негативно сказалось и на продуктивности пшеницы - масса зерна была ниже, чем в контроле (таблица 2).

(рисунок 3).

Почвоподобный субстрат с различными добавками Масса зерна

г/м2 %

Контроль без добавок 2486 100

1 опыт с нативными метаболитами 1440 54,2

2 опыт с минерализованными отходами 2051 77

л г .------------------ни ^

использованием физико-химического метода переработки физиологических отходов человека. Данный вариант опыта по микробиологическим показателям в питательном растворе аналогичен контролю, а продуктивность пшеницы выше, чем в опыте с внесением в ППС не переработанных метаболитов человека.

Глава 4. Биотестирование атмосферы звена высших растений в эксперименте с замкнутой экосистемой с помощью тест-микроорганизмов

4.1. Реакция микроорганизмов на действие возможных источников загрязнения атмосферы замкнутой экосистемы (аммиака, озона, этилена, сернистого ангидрида, углекислоты, уксусного альдегида).

В ранее проведенных экспериментах с ЗЭС выявлено ингибирование роста растений и снижение их продуктивности (Лисовский, 1973).Установлено, что из комплекса факторов, отрицательно действовавших на биосинтез выращиваемых культур высших растений, наибольшее влияние оказывал газовый состав атмосферы системы (Гительзон, 1975; С\1е\чопеш1., 2003)Нами было показано, что газовый состав атмосферы отдельных звеньев (технологического оборудования, самих растений, человека и т.д.) не влиял отрицательно на состояние и продуктивность растений, но достоверно действовал на рост некоторых бактерий, что свидетельствует о большей чувствительности микроорганизмов к изменениям газового состава системы.

В эксперименте с ЗЭС, включавшей высшие растения, исследовали влияние различных концентраций газов- возможных источников загрязнения атмосферы на рост 96 тест-микробов (Фрагмент таблицы 3).

Таблица 3 - Реакция тест-культур микроорганизмов на действие различных

Источник загрязнения Концентрация газа Количество прореагировавших тест-культур

Всего действий 0 +

Всего % Всего % Всего %

Озон слабые дозы на уровне ПДК 0,1мг/м3 716 681 95,11 17 2,38 18 2,51

Озон средние дозы 50-100 мкг/м3 706 587 83,14 28 3,97 91 12,89

Диоксид этилена 2.67 мл/м3сут 572 426 12,89 2 0,35 144 25,17

Примечание. Действие: "+" - положительное, "-" - отрицательное, "0"-отсутствует (нулевое).

Диоксид этилена, озон и сернистый ангидрид в большей степени влияли на рост растений и бактерий, чем все остальные изученные источники загрязнения атмосферы системы. В дальнейших работах диоксид этилена заменили на этилен.

В эксперименте также было обнаружено, что биологическая активность исследуемых 96 штаммов бактерий и фотосинтез высших растений изменялись в зависимости от дозы токсиканта. Особенно наглядно это видно на примере действия сернистого ангидрида (рисунок 4).

Рисунок 4 - Влияние сернистого ангидрида БОгСмг/мО на рост тест-микробов (%) и фотосинтез (%) опытных растений ЗЭС.

При концентрации сернистого ангидрида 0,13мг/м достоверное ингибирование роста тест-культур выявлено в 16 случаях из 333 сравниваемых с фоном действий, при концентрации 0,39 мг/м3- в 51 случае (из 352).При концентрации сернистого ангидрида 0,13 мг/м3 фотосинтез составлял 648,7 лС02/сут., а при дозе 0,39 мг/м3 выявлено наименьшее значение фотосинтеза -417,3 лС02/сут. Следует заметить, что максимальное значение фотосинтеза (935,8 лС02/сут.) было при подаче 0,21 мг/м3токсиканта в атмосферу замкнутой экосистемы. Полученные данные свидетельствуют об адаптации растений к токсиканту, не наблюдавшееся у микробов. Выявленная индивидуальная чувствительность тест-микробов к разным концентрациям сернистого ангидрида еще раз подтверждает перспективность использования микроорганизмов в качестве биотестов загрязнения атмосферы.

4.2. Влияние ацетальдегида и этилена на рост тест-культур микроорганизмов (на популяционном уровне)

Тест-микробы выращивали в герметичной камере для культивирования микроорганизмов на твердых средах (Безруких и др., 1990).

Результаты учитывали на третьи сутки. В результате действия различных концентраций ацетальдегида (АА) на рост 79 экспериментально подобранных чувствительных штаммов микроорганизмов выявлен широкий спектр реакций тест-микробов на исследуемый газ. Получена прямая зависимость реакций тест-культур от концентрации газа.

Отмечено три вида реакций микробов: нейтральная, положительная и отрицательная. Количество действий каждого вида находилось в прямой зависимости от концентрации АА. Так, с уменьшением концентрации газа с 1.3 х 10" до 6 х 10" количество отрицательных действий уменьшается, а при концентрации 6 хЮ"8 становится равным нулю. При низких дозах (10"7, 10'8) на большинство культур АА действия не оказывал. Отдельно нужно отметить два штамма - М355 (Mycobacterium lacticolum) и 228 (неидентифицированный штамм), у которых наблюдалась наиболее яркая реакция на низкие концентрации АА. При концентрации 10"7 и 10 АА вызывал достоверную стимуляцию роста штамма М 355 в 4 балла, а штамма 228 - в 3 балла, что позволяет сделать предположение о наличии штаммоспецифичности по отношению к ацетальдегиду.

Одновременно нами изучалось влияние восьми концентраций этилена на рост того же набора 79 тест-культур.

Анализ полученных данных показал отсутствие четкой зависимости реакций исследованных микроорганизмов от концентрации исследуемого этилена. Лишь 2%-ный этилен вызывал достоверную стимуляцию роста тест-микробов. При всех остальных концентрациях газа (1,16; 0,3; 2 х 10"2,2 х10"3,2 х 10 %) большинство реакций было нейтральным. Полученные результаты подтверждают предположение о том, что чистый этилен является нейтральным газом по отношению к микроорганизмам. Д.И. Никитин и Э.С. Никитина [1978] также показали отсутствие какого-либо воздействия ("+" либо "-") этилена на бактерии при его концентрации в инкубационной емкости, равной 90%.

Итак, в результате исследования влияния ацетальдегида (АА) и этилена получен различный спектр действия на рост 79 тест-культур, из которых отобрано 32 наиболее чувствительных к данным газам штамма микроорганизмов. Это дает возможность использовать предложенный метод и данный набор тест-культур для биоиндикации атмосферы ЗЭС.

4.3. Влияние этилена на рост Bacillus cereus (на клеточном уровне)

Ранее использованный нами метод позволял получить ответную реакцию тест-культуры на вторые-третьи сутки после воздействия исследуемого газообразного вещества. Дальнейшая работа была направлена на ускорение отклика тест-культуры на тестируемое вещество в атмосфере ЗЭС. Эту задачу решили, применяя микроскопию ростовой микрокамеры Кузнецова О.Ю., наполненной исследуемым газом.

В работе использовали 10-часовую культуру, суспензию которой наносили на блок, приготовленный из 1 % пептонного агара, диаметром 9 мм и толщиной 1 мм. Культуру засевали так, чтобы в поле зрения находилось не более 8-10 клеток.

Проведенные исследования показали, что под воздействием этилена не изменялись морфологические характеристики клеток Bacillus cereus 60.

В соответствии с полученными результатами достоверная стимуляция роста Bacillus cereus 60 наблюдалась при низких концентрациях этилена

(2*10 4 % и 2 %) через 3-5 ч роста культуры в микрокамере О.Ю. Кузнецова (рисунок 5).

Рисунок 5 - Влияние 2 % этилена на рост клеток Bacillus cereus 60.

1 - через 1 час культивирования в ростовой камере Кузнецова,

2 - через 3 часа; 3 - через 5 часов. Слева - контроль; справа - опыт. Фото в световом микроскопе. Увеличение 100 х 7.

контроль опыт

1

X 2

%J

Выводы

1. Исследования подтвердили зависимость развития микробного сообщества от длительности использования бессменного раствора, введения в него добавок в виде жидких нативных выделений человека и замыкания системы по газообмену.

2. Поступление жидких выделений человека в питательный раствор, используемый для выращивания растений, не привело к необратимым изменениям в микробиоте раствора.

3. Выращивание растений на ППС с использованием физико-химического метода переработки физиологических отходов человека целесообразнее, чем введение в ППС нативных продуктов жизнедеятельности человека.

4. Выявлена индивидуальность спектра действия веществ на рост использованных тест-культур и индивидуальность спектра чувствительности бактерий к влиянию разных концентраций исследуемых токсикантов.

5. Озон, сернистый ангидрид и этилен в большей степени влияют на рост тест-микроорганизмов, чем остальные изученные источники загрязнения атмосферы системы.

Практические рекомендации

1. Рекомендуем научным учреждениям, занимающимся изучением субстратов для выращивания растений, использовать ППС с использованием физико-химического метода переработки физиологических отходов человека, так как это по микробиологическим показателям безопаснее, чем введение в субстрат нативных продуктов жизнедеятельности человека.

2. Рекомендуем территориальному Центру по мониторингу загрязнения окружающей среды использовать для биотестирования атмосферного воздуха набор тест-микроорганизмов с разной чувствительностью к действию летучих веществ.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ

1. Титова, Г.Т. К методике исследования влияния газообразных веществ на микроорганизмы/Г .Т. Титова, Л.С. Тирранен, Г.С. Калачева, Е.В. Бородина //Авиакосмическая и экологическая медицина. - 1994. - № 4. - С. 51-54.

2. Бородина Е.В. Влияние уксусного альдегида и этилена на рост тест-культур микроорганизмов/ Л.С. Тирранен, Г.Т. Титова, Г.С. КалачеваУ/Экология - 1997 - №3,-С. 197-199.

3. Тирранен, Л.С. Изенения в микробиоте питательного раствора с жидкими выделениями человека, используемого для выращивания растений/ Л.С.

Тирранен, Е.В. Бородина//Вестник КрасГАУ. № 10, 2011.-С. 69-74

4. Бородина, Е.В. Влияние возможных источников загрязнения атмосферы замкнутой экосистемы на рост микроорганизмов / Е.В.Бородина, Л.С Тирранен, Г.С. Калачева // Вестник КрасГАУ. №11,2011,- С. 154-157

Другие научные издания

5. Тирранен, Л.С. Влияние этилена на рост споровых бактерий/Л.С. Тирранен, Г.Т. Титова, Е.В. Бородина и др. // Микробиология охраны биосферы в регионах Урала и Северного Прикаспия: Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума. Оренбург, 1991.-С.121-122.

6. Тирранен, Л.С. Реакция бактерий и растений на действие сернистого ангидрида в атмосфере замкнутой экологической системы/ Л.С. Тирранен, В.Е. Рыгалов, Г.Т. Титова, Е.В. Бородина//Тезисы Всесоюзной конференции «Биотехнология и биофизика микробных популяций». Алма-Ата, 1991.-С.128

7. Tirranen, L.S. Response of plants and bacteria to S02 in a cloed ecosystem atmosphere/ L.S.Tirranen, E.V.Borodina, V. Ye.Rygalov, G.T.Titova, I.A Gladchenko //Abstracts/ 29-th COSPAR Scientific Assembly, Washington USA 28 aug.-5 sept., 1992,-P. 351.

8. Tirranen, L.S.Microflora of nutrient solution used to grow wheat plants under the impact of sulphur dioxide/ L.S. Tirranen, G.T.Titova, E.V.Borodina,V.Ye.Rygalov, L.A.Stutko, A.P. Pusyr// Abstracts/30-th COSPAR Scientific Assembly Hamburg, Germany, П.Abstracts, 11-21 Juli, 1994.-P.327.

9. Tirranen,L.S.Test-microorganisms affected by possible sourced of atmospheric pollution in a closed system/ L.S. Tirranen, G.T.Titova, E.V.Borodina,M.P Shilenko V.Ye.Rygalov, L.A.Stutko//Abstracts/ 30-th COSPAR Scientific Assembly Hamburg, Germany, n.Abstracts,ll-21 Juli, 1994. - P.338.

10. Gitelson, I.J.Impraited growth of plants cultivated in a closed system: Possible reasons/ I.J.Gitelson,L.S. Tirranen, E.V. Borodina, V. Ye. Rygalov// Abstracts/ 31th COSPAR Scientific Assembly, Birmingham, England, 14-21 July, 1996. -P.382.

11. Gitelson, I.J.Impraited growth of plants cultivated in a closed system: Possible reasonspress/ I.J.Gitelson, L.S. Tirranen, E.V. Borodina, V. Ye. Rygalov// Adv Space Res. - 1997. - V. 20, N 10. - P. 1927-1930.

12.Tirranen, L.S. Formation of microbial cenoses used to grow wheat plants on human physiological wastes processed by straw biotechnique/ L.S. Tirranen, E.V.

Borodina, V. Ye. Rygalov, I.G.Zolotukhin, L.A Stutko// Abstracts/ 32nd Scientific Assembly of COSPAR, Nagoya, Japan, 12-19 July, 1998. - P.440.

13.Тирранен, JI.С., Микробиологическая ситуация в питательных растворах, используемых для выращивания пшеницы на физиологических отходах человека и растений/Л.С. Тирранен, Е.В. Бородина, И.Г. Золотухин, И.В. Грибовская// Тезисы докладов/IV съезд общества физиологов растений России. Международная конференция «Физиология растений - наука III тысячелетия»,- М., 4-9 октября 1999. - С.280.

14. Тирранен, Л.С., Микробиологическая ситуация в питательных растворах, используемых для выращивания растений пшеницы в течение 3 ротаций на одном почвоподобном субстрате/Л.С. Тирранен, Е.В. Бородина, Н.С. Мануковский, И.Г. Золотухин, Л.А. Стутко// Тезисы докладов/XXXIV научные чтения посвященные разработке творческого наследия К.Э. Циолковского (Калуга, 14-16 сентября,1999 г.).- М.:ИИЕТРАН.-Калуга, 1999. - С. 92-93.

15. Borodina, E.V.Acetaldehyd effect on microorganism growth/ E.V.Borodina, L.S.Tirranen//Abstract 33ЛС08РАК.- 2000. Poland (в электронном варианте).

16. Tirranen, L.S. Structurally functional changes in the microbiota of nutrient solution supplemented with human liquid wastes, used to grow plants in a closed ecological system/ L.S.Tirranen , E.V. Borodina,A.A. Markov // Abstract/ 35 COSPAR (в электронном варианте). 2004.

17.Gros, J.-B. Wheat growth on neutral and soil-like substrates: carbon dioxide exchange and microflora/ J.-B. Gros, C. Lasseur, A A. Tikhomirov, N.S. Manukovsky, S.A. Ushakova, I.G. Zolotukhin, L.S. Tirranen , E.V. Borodina and V.S. Kovalev//ActaHort. -2004 - (ISHS)644, P. 243-248.

18.Tirranen, L.S.The effect of possible sources of closed ecosystem atmosphere pollution on the growth of test microorganisms/ L.S.Tirranen,A.A.Tikhomirov, A.P.Puzyr, E.V. Borodina, G.S.Kalacheva, M.P.Shilenko// Abstract/ 36th COSPAR. China.- 2006 (в электронном варианте).

19.Тирранен, Л.С. Микробиота питательных растворов, используемых для выращивания растений пшеницы на почвоподобном субстрате с добавками/ Л.С.Тирранен, Е.В. Бородина, Ю.А.Куденко, Н.С.Мануковский// Сложные системы в экстремальных условиях/ Материалы XIV Всероссийского симпозиума с международным участием. 23-28 июня 2008 г., Красноярск, 2008. -С. 89-96.

20.Tirranen, L.S. Contribution of higher plant link microflora into the microbial landscape of a closed ecosystem / L.S. Tirranen, E.V. Borodina//Abstract, Moscow, June 7-11,2009.-p. 134.

Санитарно-эпидемиологическое заключение № 24.49.04.953.П. 000381.09.03 от 25.09.2003 г. Подписано в печать 26.03.2011. Формат 60x84/16. Бумага тип. № 1 Печать - ризограф. Усл. печ. л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ № 1668 Издательство Красноярского государственного аграрного университета 660017, Красноярск, ул. Ленина, 117

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бородина, Елена Владимировна, Красноярск

61 12-3/1293

ФГБОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет» ФГБУН «Институт биофизики Сибирского отделения Российской Академии Наук»

БОРОДИНА ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА

РЕАКЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ НА ДЕЙСТВИЕ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ В СИСТЕМЕ ЖИЗНЕОБЕСПЕЧЕНИЯ

03.02.08 - экология (биология)

На правах рукописи

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук Тирранен Л.С.

Красноярск - 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

Введение 6-12

Глава 1. Обзор литературы 13-35

1.1. Сосуществование микроорганизмов 13

1.2. Роль микроорганизмов в жизни растений 14

1.3. Микроорганизмы - продуценты биологически активных веществ 19

1.4. Влияние растений на микроорганизмы 21

1.5. Состав и характеристика почвоподобного субстрата (ППС) 24

1.6. Микробное сообщество почвы и почвоутомление 27

1.7. Биотестирование и биоиндикация воздуха атмосферы закрытых помещений 32

Глава 2. Материалы и методы исследований 36-51

2.1. Объект исследований 36-40

2.1.1. Микробиота бессменного питательного раствора с добавками в виде жидких выделений человека, использованного при бессубстратном (воздушно-субирригационном) методе выращивания растений пшеницы 36

2.1.2. Микробное население растворов, использованных при культивировании одновозрастных растений пшеницы на почвоподнобном субстрате (1111С) в течение трех ротаций и при выращивании растений пшеницы на ППС с нативными и переработанными экзометаболитами человека 38

2.1.3. Объекты изучения возможных источников загрязнения атмосферного воздуха замкнутой экологической системы (ЗЭС) - 38

аммиак, озон, сернистый ангидрид, этилен и углекислота

2.1.4. Объект исследования на популяционном уровне -ацетальдегид и этилен 38

2.1.5. Объект исследования на клеточном уровне - этилен 39

2.2. Методы исследования 40-55

2.2.1. Микробиоты раствора с жидкими выделениями человека при бессубстратном методе выращивания разновозрастной монокультуры пшеницы в замкнутой экосистеме 40

2.2.2.Микрофлоры раствора для выращивания одновозрастной монокультуры пшеницы на одном почвоподобном субстрате в течение трех ротаций 44

2.2.3.Микробного населения растворов, используемых для выращивания растений пшеницы на почвоподобном субстрате с добавками 44

2.2.4. Исследование антимикробной активности летучих метаболитов 45

2.2.5. Влияния аммиака, озона, сернистого ангидрида, этилена, углекислоты на рост тест-микроорганизмов 49

2.2.6. Влияние ацетальдегида и этилена на рост 79 тест-культур микроорганизмов 50

2.2.7. Методика исследования действия этилена на рост бактерий Bacillus cereus 60 (на клеточном уровне) - в ростовых камерах О.Ю. Кузнецова 52

2.2.8. Статистическая обработка 54

Глава 3. Микробиологическая характеристика питательных растворов с добавками для культивирования высших растений 56-78

3.1. Микробиота питательного раствора с жидкими выделениями человека, используемого для выращивания растений 56

3.2. Микробиологическая ситуация в растворах, используемых для выращивания растений пшеницы в течение трех ротаций на одном почвоподобном субстрате (ППС) 69

3.3. Микробиота питательных растворов, используемых для выращивания растений пшеницы на почвоподобном субстрате с добавками 72

Глава 4 Влияние возможных источников загрязнения атмосферы замкнутой экосистемы на рост тест-микроорганизмов 79-98

4.1. Антимикробная активность летучих метаболитов растений укропа, редиса и чеснока 79

4.2. Реакция микроорганизмов на действие возможных источников загрязнения атмосферы замкнутой экосистемы (аммиака, озона, сернистого ангидрида, этилена, углекислоты) 81

4.3. Влияние ацетальдегида и этилена на рост тест-культур микроорганизмов (на популяционном уровне) 87

4.4. Влияние этилена на рост Bacillus cereus (на клеточном уровне) 93

Выводы 99

Практические рекомендации 100

Список литературы 101-115

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Высшие растения - один из ключевых звеньев биологической системы жизнеобеспечения (БСЖО). Постоянным компонентом биоценоза фототрофного звена БСЖО является сопутствующая микрофлора, в постоянном взаимодействии с которой находятся высшие растения.

Микроорганизмы - индикаторы состояния высших растений (Тирранен, Шиленко, 2008; (ЗйеЬоп е1 а1, 2003; Титапеп, 2008), способны быстро и разнообразно отзываться на влияние окружающей их внешней среды (Кожевин, 2000; Заварзин, 2003 и др.).

Установлено, что ингибирует рост растений, снижает их продуктивность и влияет на микробный пейзаж звена высших растений в замкнутой экосистеме комплекс факторов, важнейшими из которых являются: длительное использование питательного раствора, введение в него внутрисистемной сточно-бытовой воды и газовое замыкание системы (Титапеп, 2001; ОкеЬоп et а1, 1997; Титапеп, 2008).

В ранее проведенных экспериментах в замкнутой экологической системе «БИОС-3» растительные отходы и экзометаболиты человека (нативные выделения испытателей) выносились из БСЖО (ОкеЬоп е/ а1., 2003).

Создание биологической системы жизнеобеспечения (БСЖО) нового поколения с более высокой степенью замкнутости круговорота веществ возможно за счет повышения эффективности утилизации растительных и физиологических отходов человека.

Произойдут ли изменения в микробиоте питательного раствора при

введении в него жидких выделений человека при бессубстратном (воздушно-

субирригационном) методе выращивания разновозрастной монокультуры

6

пшеницы в замкнутой экологической системе и справится ли микрофлора раствора с ролью деструктора жидких выделений человека?

Кроме того, предстояло выяснить, не приведет ли выращивание одновозрастной монокультуры пшеницы в течение нескольких ротаций на почвоподобном субстрате (1111С), созданном на биологически переработанной соломе, к явлению, сходному с почвоутомлением?

Известное ингибирование роста высших растений в замкнутых системах жизнеобеспечения человека (Лисовский, Шиленко, 1975; ОкеЬоп е/ а1, 2003) определяет необходимость поиска токсикантов, вызывающих это явление. В ряде работ (Беркович, Следь, 1989; в^екоп & а1, 2003 и др.) показано, что угнетение роста растений в замкнутой БСЖО связано с особенностями газового состава ее атмосферы. Одним из направлений поиска ингибиторов может быть исследование влияния гаообразных веществ атмосферы замкнутой системы на рост микроорганизмов. Известно, что микроорганизмы быстрее реагируют на изменения в замкнутой системе, чем растения, и могут рассматриваться в качестве биоиндикаторов состояния атмосферы (Т1ггапеп, ОМбоп, 2006).

Все вышесказанное и обусловливает актуальность настоящей работы.

Цель диссертационной работы состоит в анализе и оценке реакции микроорганизмов на воздействие отдельных факторов в фототрофном звене замкнутой экологической системы жизнеобеспечения человека.

Основные задачи исследований:

1. Выявить изменения в микробиоте раствора с жидкими выделениями

человека при бессубстратном методе выращивания разновозрастной

монокультуры пшеницы в замкнутой экосистеме;

2. Охарактеризовать микрофлору раствора, используемого для культивирования одновозрастных растений пшеницы на почвоподобном субстрате (ППС) без экзометаболитов человека, на ППС с нативными и минерализованными физико-химическим способом физиологическими отходами человека;

3. Определить антимикробную активность летучих метаболитов растущих растений чеснока, укропа и редиса к некоторым бактериям;

4. Оценить влияние отдельных газообразных веществ - возможных источников загрязнения атмосферы замкнутой экосистемы на рост тест-микроорганизмов.

Научная новизна работы

1. Впервые показано, что микрофлора питательного раствора при дробном введении в него жидких выделений человека и 70 % замене нитратного азота на азот мочи при воздушно-субирригационном способе выращивания разновозрастной монокультуры пшеницы успешно справляется с ролью деструктора жидких выделений человека.

2. Выращивание растений на ППС с использованием физико-химического метода переработки физиологических отходов человека целесообразнее, чем введение в ППС нативных продуктов жизнедеятельности человека. При добавлении нативных экзометаболитов человека в ППС наиболее показательным было изменение количества бактерий группы кишечной палочки, группы протея, фитопатогенных бактерий и грибов. Следует заметить, что при выращивании растений пшеницы на ППС с добавками (и нативными экзометаболитами, и минерализованными) в микофлоре питательного раствора появились дрожжи и дрожжеподобные грибы, которые в контрольном растворе отсутствовали.

3. Летучие метаболиты 50-суточных растений чеснока обладали широким антимикробным действием, ингибируя рост как грамотрицательных, так и грамположительных (споровых) бактерий и кокков.

4. Впервые для ускорения отклика микроорганизмов при исследовании тестируемого вещества на клеточном уровне изучено действие разных концентраций этилена (2 • 10"4; 2; 30 и 80 %) на рост Bacillus cereus 60 в ростовой микрокамере О.Ю. Кузнецова.

Практическая значимость работы

Полученные результаты могут быть востребованы при разработке биологических систем жизнеобеспечения, основанных на использовании высших растений и предусматривающих длительное пребывание в таких системах человека в условиях полной изоляции от земной биосферы (в космосе, под водой) в труднодоступных районах планеты - в полярных широтах, пустынях, в высокогорье.

По микробиологическим показателям выращивание растений на почвоподобном субстрате (ППС) с использованием физико-химического метода переработки экзометаболитов человека целесообразнее, чем введение в ППС нативных продуктов жизнедеятельности человека.

Выявленная индивидуальная чувствительность тест-микроорганизмов к разным концентрациям газообразных веществ подтверждает перспективность использования микроорганизмов в качестве биотестов загрязнения атмосферы.

Положения, выносимые на защиту

1. Микробное сообщество питательного раствора при 70 % замене нитратного азота на азот мочи успешно справляется с ролью деструктора нативной мочи человека. В опытах без замыкания системы величина

коэффициента корреляции (г = 0,10) между двумя урожаями зерна пшеницы, выращенных на питательном растворе с жидкими выделениями человека и без них, свидетельствует об отсутствии достоверных различий между анализируемыми пробами.

2. Наибольшие изменения выявляются в микробиоте раствора и урожае зерна одновозрастной монокультуры пшеницы при выращивании ее на почвоподобном субстрате (ППС) с нативными экзометаболитами человека.

Наблюдаемые изменения в микрофлоре и состоянии одновозрастной пшеницы, культивируемой на почвопообном субстрате, используемом в течение 3 ротаций, аналогичны изменениям при почвоутомлении.

3. Индивидуален спектр действия отдельных газообразных веществ атмосферы на рост использованных тест - культур. Спектр чувствительности тест-микроорганизмов к влиянию разных концентраций исследуемых токсикантов также индивидуален.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на Международных совещаниях по искусственным замкнутым экосистемам, Красноярск, 1990, 1991; Всесоюзной конференции «Биотехнология и биофизика микробных популяций», Алма-Ата, 1991; Всесоюзном симпозиуме «Микробиология охраны биосферы Урала и Северного Прикаспия», Оренбург, 1991; XXV и XXXIV Научных чтениях, посвященных разработке творческого наследия К.Э. Циолковского, Калуга, 1990, 1999; Международной конференции «Физиология растений - наука III тысячелетия», Москва, 1999; Международных ассамблеях по космическим исследованиям: Вашингтон, США, 1992; Гамбург, Германия, 1994; Бирмингем, Англия, 1996; Нагоя, Япония, 1998; Варшава, Польша, 2000; Хьюстон, США, 2002; Париж, Франция, 2004; Пекин, Китай, 2006; на 17 Международном симпозиуме «Человек в космосе» IAA , Москва, Россия, 2009.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 26 работ, в том числе 4 статьи в журналах, включенных в перечень изданий, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ для публикации результатов диссертационных работ.

Связь работы с научными программами

Тема 01.900044 -739 за 1989-1990 гг. Программа фундаментальных исследований СО АН СССР: «Экологические, генетические и эволюционные основы рационального использования воспроизводства и охраны биологических ресурсов»

Тема 01.910012047 за 1991-1995 гг. Программа: «Физико-химические основы биологии и эволюции живых систем, проблемы генетики и селекции, физиологии растений и биотехнологии» - Биофизические основы управления биосинтезом в клеточных популяциях и ассоциациях.

Государственно научно-техническая программа (1996-2000 гг.). «Астрономия. Фундаментальные космические исследования. «Системы жизнеобеспечения».

Хоздоговор с ИБФ-ГНЦ РФ ИМБП за 1997-1998 гг. «Исследование устойчивости фотосинтезирующего звена ЗЭС к отклонению основных факторов среды от оптимальных значений».

ESA INTAS № 99-0444 за 2000-2002. «Пути повышения замкнутости биологического круговорота веществ в искусственных системах жизнеобеспечения человека, основанных на фотосинтетической регенерации его среды обитания».

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 115 страницах, содержит 24 рисунка и 14 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, материала и методики исследования, результатов и их обсуждения, практических рекомендаций, выводов, списка литературы,

содержащего ссылки на 127 источников, из которых 42 - на иностранных языках.

Личный вклад автора. Представленная работа является обобщением научных исследований. Отбор и анализ образцов, эксперименты, обработка, интерпретация результатов, написание работы выполнены лично автором.

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Сосуществование микроорганизмов

Микроорганизмы определяют биологические свойства почвы, а множественные химические и биохимические реакции между соседствующими физиологическими группами почвенных микробов связывают почвенные процессы в некое единство, обладающее внутренней устойчивостью при воздействии на нее факторов внешней среды.

Метаболизм почвы в общем виде зависит от системы внутренних взаимосвязей сообщества микробов (Звягинцев, 1992; Кожевин, 2000).

Разрыв одного единственного звена в микробиологической нише или подавление отдельной функции в этой системе может привести к нарушениям всей цепи питания (http://www.eurolab.ua/microbiology-virology-immunology /3660/3670/30651/).

Мир микроорганизмов служит огромным буфером обмена между живой и неживой средами на Земле. Обмен живой и неживой природы в значительной мере определяется сосуществованием разнообразных микроорганизмов с растениями, животными и человеком.

В одном случае эти взаимоотношения носят антагонистический характер, и мы являемся свидетелями возникновения тех или иных инфекционных заболеваний, вызываемых микроорганизмами, в других -диаметрально противоположных - мы наблюдаем ярко выраженное симбиотическое сосуществование партнеров, взаимодействие которых позволяет им выживать в среде обитания (http://argo.km.ua/eml_use_bio.htm).

Широкое распространение микроорганизмов свидетельствует об их огромной роли в природе. При их участии происходит разложение различных

органических веществ в почвах и водоемах, они обусловливают круговорот веществ и энергии в природе; от их деятельности зависит плодородие почв и т.д.

Только благодаря активной деятельности бактерий реализуется замкнутый характер круговорота азота и углерода как обязательных конструктивных элементов биосферы (http://www.eurolab.ua/microbiology-virology-immunology /3660/3670/30735).

На протяжении миллионов лет макро- и микроорганизмы взаимно приспосабливались и стали необходимы друг другу. Микробы -нормальные обитатели животного или растительного организма стали неотъемлемыми спутниками макроорганизма и играют значительную роль в их жизни.

Деятельность микробов очень обширна и разнообразна, и порой не всегда доступна к пониманию.

Каждый вид микробов в зависимости от конкретной ситуации и от взаимосвязей может биологически проявить себя по - разному, и нередко в диаметрально противоположных ролях (Шлегель, 1987; Лысак, 2007).

1.2. Роль микроорганизмов в жизни растений

Значение микроорганизмов в жизни растений очень велико и многообразно. Значительное число работ посвящено изучению этого вопроса (Красильников, 1958; Возняковская, 1969; Мишустин, 1972; Самцевич, 1972; Oswald, 2010).

Изучение характера взаимодействия микроорганизмов и растений является одной из главных проблем микробиологии, почвоведения и растениеводства (Звягинцев, 1992; Oswald, 2010).

Для нормального роста, развития и питания растений необходимо не только разнообразие почвенных микроорганизмов, но и наличие определенного группового и видового состава, а также их активное состояние, особенно в прикорневой зоне, так как жизнедеятельность

микроорганизмов способствует накоплению пит�