Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Факторы, влияющие на микробиоту раствора для выращивания растений в экспериментальной модели экологической системы жизнеобеспечения

ВАК РФ 03.02.08, Экология (по отраслям)

Автореферат диссертации по теме "Факторы, влияющие на микробиоту раствора для выращивания растений в экспериментальной модели экологической системы жизнеобеспечения"

На правах рукописи

СЫСОЕВА Ольга Валерьевна

Факторы, влияющие на микробиоту раствора для выращивания растений в экспериментальной модели экологической системы жизнеобеспечения

03.u2.0S — экология (биология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

-6МАР 2014

Красноярск - 2014

005545754

Работа выполнена в ФГЪОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет» и в ФГБУН «Институт биофизики СО РАН»

Научпый руководитель доктор биологических наук,

старший научный сотрудник Тирранен Ляля Степановна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор, ФГБУН

«Институт леса им. В.Н. Сукачева СО РАН», заведующий лабораторией микробиологии и экологической биотехнологии Сорокин Николай Дмитриевич

кандидат биологических наук, доцент ФГБОУ ВПО «Сибирский государственный аэрокосмический университет им. М.Ф. Решетнева», доцент кафедры инженерной экологии Трухницкая Светлана Мячеславовпа

Ведущая организация: ГНУ Агрофизический Научно-исследовательский

институт Россельхозакадемии, г. Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится «24» апреля 2014 г. в 9.00 часов на заседании диссертационного совета Д 220.037.04 при ФГБОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет» по адресу: 660049, г. Красноярск, проспект Мира, 90. Факс: (391) 227-36-09

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет»

Автореферат разослан « » февраля 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

Г.А. Демиденко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время существуют различные системы жизнеобеспечения (СЖО), в которых функции регенерации кислорода, воды и обеспечение растительной пищи для человека выполняют высшие растения (Киренский и др., 1969; Лисовский, 1973; Барцев, 2008; Морозов, Малоземов, 2009; Сычев и др., 2012; СИеЬоп е/ а/., 2003).

Увеличение замыкания системы по массообмену свыше 70 % возможно за счет включения экзометаболитов человека и несъедобных частей растений в круговорот веществ в СЖО (Кис1епко <?/ а!., 2000; Мапцкоукку е! а!., 2005; ПкЬот^гоу е/ а/., 2005). В связи с вышеизложенным, определение наличия микроорганизмов в растворе, получаемом после утилизации нативных выделений человека, и оценка воздействия способов обработки органических отходов на микробный ценоз субстратов, применяемых для выращивания высших растений, актуальны.

Цель работы — исследовать влияние факторов на микробиоту почвоподобного субстрата и растворов, используемых для выращивания растений в экспериментальной модели экологической системы жизнеобеспечения.

Задачи работы:

1 - Выявить влияние абиотического фактора (№ 1) «утилизация физико-химическим способом физиологических отходов человека» на наличие микроорганизмов в растворе, получаемом после окисления экзометаболитов.

2 - Проанализировать воздействие абиотического фактора (№ 2) «способ обработки пшеничной соломы» на численность индикаторных групп микроорганизмов в почвоподобном субстрате.

3 - Оценить вклад биотического фактора (№ 3) «внесение несъедобных отходов редиса, салата, чуфы и пшеницы в почвоподобный субстрат» в формирование микробного ценоза ирригационного раствора, используемого для выращивания растений.

Научная новизна работы заключается в оценке влияния на микробиоту ирригационного раствора или почвоподобного субстрата (ППС), внесенных в ГПТС несъедобных растительных отходов, используемых: для увеличения замкнутости круговорота веществ в системе; для восстановления объема почвоподобного субстрата в системе; в качестве удобрения для выращивания монокультуры редиса и поликультуры высших растений в экспериментальной модели экологической системы жизнеобеспечения.

Практическая значимость

Полученные результаты могут быть востребованы при разработке экологических систем жизнеобеспечения, основанных на использовании высших растений и предусматривающих длительное пребывание в таких системах человека в условиях полной изоляции от земной биосферы (в космосе, под водой и т.д.), в труднодоступных районах планеты (в полярных широтах, в высокогорье, в пустынях и др.).

Положения, выносимые на защиту:

1 - изученные группы микроорганизмов не обнаружены в выделениях человека, утилизированных физико-химическим способом, что свидетельствует о

микробиологической безопасности раствора, полученного после минерализации физиологических отходов человека;

2 - внесение в почвоподобный субстрат (ППС) обработашюй любым из применявшихся способов соломы пшеницы достоверно влияет на численность изученных групп микроорганизмов в субстрате, используемом для выращивания растений редиса;

3 - добавление в почвоподобный субстрат несъедобных отходов чуфы оказывает сильное (г > 0,7) и среднее (0,5 < г < 0,7) влияние на индикаторные группы микроорганизмов ирригационного раствора, использованного для выращивания поликулыуры высших растений на почвоподобном субстрате.

Личный вклад автора. Отбор и анализ образцов, обработка, интерпретация полученных результатов, написание работы выполнены лично автором.

Апробация работы: материалы диссертации доложены на: 1-ой региональной студенческой конференции «Современные проблемы биологии: успехи научной молодежи», Красноярск, СФУ, 20-21 апреля, 2007 г.; XIV Всероссийском симпозиуме с международным участием «Сложные системы в экстремальных условиях», Красноярск, природный парк «Ергаки», 23 - 28 июня, 2008 г.; 1 Всероссийской научно-практической (заочной) конференции «Естественные науки и современность: проблемы и перспективы исследований», Москва, 2009 г.; XV Всероссийском симпозиуме с международным участием «Сложные системы в экстремальных условиях», Красноярск, 2010 г.; Международной интернет-конференции «Растения и микроорганизмы», Казань, 18 - 21 апреля, 2011 г.; IV международной (заочной) научно-практической конференции молодых ученых «Инновационные тенденции в развитии российской науки», Красноярск, апрель, 2011 г.

Основные материалы диссертации опубликованы в 9 печатных работах, 4 из которых в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 136 страницах текста. Работа включает 20 рисунков и 40 таблиц, состоит из введения, 3 глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и их обсуждение), выводов, практических рекомендаций, списка литературы, содержащего ссылки на 209 источников, из которых 60 - на иностранных языках, и приложения, содержащего 1 рисунок и 2 таблицы.

Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю, д.б.н. Тирранен Л.С. за помощь и поддержку в написании диссертационной работы.

Глава 1. Литературный обзор

В первой главе диссертации дан обзор литературных источников по изучаемой проблеме. Анализируется роль микроорганизмов в жизни растений, влияние растений на микроорганизмы, возможность использования растительных остатков и экзометаболитов человека в качестве удобрения, применяемого для выращивания растений в СЖО.

s

Глава 2. Материалы и методы исследования

2. 1 Объекты исследования

Объектом исследований служило микробное сообщество в различных экспериментах. Контролем (фоном) являлись микробные сообщества этих же объектов без растений и добавок (Sysoeva, Tirranen, 2011).

В эксперименте по определению наличия микроорганизмов в экзометаболитах человека, обработанных разными объемами перекиси водорода (Н202) в электромагнитном поле (фактор № 1) (физико-химический метод Ю.А. Куденко и P.A. Павленко, 1998) объектом исследования являлась микробиота раствора (Тирранен и др., 2008), получаемого из реактора после окисления нативных выделений человека.

При исследовании влияния способа обработки соломы (фактор № 2) объект исследований - микробный ценоз почвоподобного субстрата (ППС) с выращиваемой на нем культурой редиса Raphanus sativus L. Растения редиса (сорт Вировский белый) культивировали в вегетационной камере при нормальной (0,03 %) концентрации С02, круглосуточном освещении, температуре воздуха, равной 24 °С (Сысоева и др., 2013).

В эксперименте по изучению влияния несъедобных растительных отходов (фактор № 3) объектом микробиологических исследований служило микробное сообщество ирригационного раствора, использовавшегося в течение 306 суток для выращивания разновозрастной поликультуры высших растений (редиса, салата и чуфы) на почвоподобном субстрате (ППС). Учитывали структуру и динамику численности индикаторных групп микробных сообществ (Тирранен и др., 2009).

2.2 Методы исследования

Для определения влияния факторов № 1, № 2, № 3 на микробный ценоз почвоподобного субстрата и ирригационного раствора были проведены три эксперимента.

2.2.1 Эксперимент I

При оценке влияния фактора № 1 (экзометаболитов человека, обработанных физико-химическим способом по методу Ю.А. Куденко и P.A. Павленко), на микробиоту раствора, получаемого из реактора после минерализации нативных выделений человека, было взято три пробы с различными концентрациями перекиси водорода:

1 - на 1 г фекалий добавили 4 мл Н202, на 1 мл мочи - 1 мл Н202;

2 - на I г фекалий добавили 2 мл Н202, на 1 мл мочи - 0,5 мл Н202;

3 - на 1 г фекалий добавили 1 мл Н202, на 1 мл мочи - 0,25 мл Н202.

Различные объемы перекиси водорода (Н202) использовали для определения

наименьшей её концентрации, необходимой для полного окисления экзометаболитов человека.

Концентрацию перекиси водорода (Н202) меньше, чем в 3-ей пробе, не применяли, так как Н202 в концентрации ниже 0,25 мл на 1 мл урины и 0,5 мл на 1 г фекалий не окисляет нативные выделения человека полностью, т.е. до простых неорганических соединений.

2.2. 2 Эксперимент II

При определении действия фактора № 2 (способы обработки пшеничной соломы) на микробоценоз почвоподобного субстрата фоном служил ППС без

выращиваемых растений редиса и без добавок соломы пшеницы. Перед посевом семян редиса в каждый вегетационный сосуд с почвоподобным субстратом вносили 40 г соломы, обработанной одним из 3 способов (Сысоева и др., 2013):

1 - солому минерализовали физико-химическим способом по методу Ю.А. Куденко и P.A. Павленко (1998). Полученный раствор в течение всего периода вегетации равномерно добавляли в раствор для полива растений. В конечном продукте присутствовали все необходимые для растений формы азота: N02 , N03~, NH4+ (Куденко, Павленко, 1998);

2 - в ПГ1С вносили сухую пшеничную солому, не подвергшуюся какой-либо

обработке;

3 - солому ферментировали: предварительно замачивали, выдерживали в термостате при температуре 50 °С. Отжатую пшеничную солому вносили в ППС, а сам отжим равномерно добавляли в раствор для полива в процессе вегетации редиса.

2. 2. 3 Схема эксперимента III

Для анализа влияния фактора № 3 (различных несъедобных растительных отходов) на микробное сообщество ирригационного раствора эксперимент проведен по следующей схеме: растения культивировали ирригационным методом (подтапливание ирригационным раствором ванн с растениями) на ППС (рисунок 4) в условиях светокультуры в вегетационной камере при темперагуре 25 ± 1 °С и относительной влажности воздуха 60 - 70 % (Величко и др., 2011).

Растения чуфы, редиса и салата выращивали в разных ваннах. Подтапливание растений производили бессменным ирригационным раствором из одного бака двумя насосами последовательно. Подтапливание осуществлялось 1 раз в сутки в режиме чередования. Пшеницу выращивали на отдельном почвоподобном субстрате и не использовали исследуемый ирригационный раствор.

В конце вегетационного периода выращиваемых растений происходила уборка урожая, высаживались новые растения. При этом в почвоподобный субстрат в начале каждой вегетации закладывалась несъедобная биомасса выращенных высших растений, полученная в предыдущей вегетации. Вместо их съедобной биомассы в ППС вносили эквивалентное количество ферментированной соломы пшеницы, ранее выращенной на другом почвоподобном субстрате.

Фоном служила микробиота раствора на 66 день эксперимента, когда в вегетационной камере присутствовали все возраста растений (4 возраста чуфы, 2 возраста редиса и 2 возраста салата) до внесения в ППС соломы пшеницы и несъедобных частей выращиваемых растений.

Последующие микробиологические пробы проведены на 96, 165, 193 и 306 дни опыта. При уборке урожая вместо съедобной биомассы выращиваемых растений в ППС добавлялась пшеничная солома и несъедобные части растений: листья редиса (96, 165, 193 и 306 сутки опыта), стебли и листья чуфы (165, 193 и 306 сутки опыта). Пробы отбирали через двое суток после уборки урожая и внесения растительных отходов. Несъедобными отходами салата (корнями салата) можно пренебречь, т.к. ввиду их малой массы корни салата из почвоподобного субстрата никогда не собирали и не удаляли.

Для изучения видового состава микробиоты ирригационного раствора выделили 21 изолят микроорганизмов (11 изолятов в фоне (66 сутки эксперимента) и 10 - в конце применения раствора (306 сутки эксперимента)).

2. 2. 4 Микробиологические методы

Для выбора техники посева, учета, сред, метода выделения микроорганизмов и т.д. использовали практические руководства (Теппер и др. 2004; Поздеев, 2010; Нетрусов, Котова, 2012). Для учета микроорганизмов использовали метод предельных разведений. Посев проводили из различных разведений - в зависимости от группы учитываемых микроорганизмов. Для получения более полного представления о качественном и количественном составе микробиоты ill 1С пробы стерильно брали из среднего слоя субстрата (с глубины 5-10 см) из нескольких точек, затем перемешивали и отбирали среднюю пробу для разведений.

Статистическую обработку данных проводили по Г.Ф. Лакину (1990) и с помощью программы Microsoft Excel. Математическая обработка осуществлялась методами корреляционного дисперсионного анализа и оценки параметров при помощи t-критерия Стьюдента. Влияние различных добавок оценивали по критерию разности между численностью микроорганизмов в исследуемых пробах. Критерием оценки служила стандартная величина нормированного отклонения (tstudema), с которой сравнивалось фактическое значение этого критерия (t,KCn) для р< 0,05, р < 0,01, р < 0,001. Численность микроорганизмов отдельных физиологических групп определяли методом предельных разведений на жидких элективных средах. Количественный учет проводили по таблице Мак-Креди, разработанной на основе методов вариационной статистики.

Для определения силы связи между вносимыми отходами растений и численностью отдельных групп микроорганизмов рассчитывали коэффициент корреляции (г) по метод}', заложенному в статистическом пакете Microsoft Excel и программе STATISTICA, version 6,0.

В экспериментах с разновозрастной поликультурой высших растений на 3 -5 день инкубирования проводили учет и выделение чистых культур бактерий из чашек с пептонным агаром с последующей идентификацией до вида.

Для определения состава бактериального сообщества были использованы молекулярно-биологические методы: клонирование и секвенирование 16s рРНК.

Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение

3. 1 Численность микроорганизмов в физиологических отходах человека, утилизированных физико-химическим способом

В ходе проведения экспериментов по окислению твердых и жидких экзометаболитов человека (фактор № 1) различными концентрациями перекиси водорода в электромагнитном поле не зафиксирован рост микроорганизмов ни в одном из опытов ни на одной из использованных сред. Наличие микроорганизмов не обнаружено ни в одной из проб ни в одном из исследованных разведений. Бактерицидное действие на изученные группы микроорганизмов оказала каждая из концентраций перекиси водорода, применявшаяся в работе.

Следовательно, даже наименьшая концентрация перекиси водорода, использованная в работе, обладает бактерицидным действием: на 1 г фекалий — 1 мл Н2О2, на 1 мл урины — 0,25 мл Н2О2.

3. 2 Влияние способа обработки соломы на микробиоту почвоподобного субстрата

Для анализа влияния различных способов обработки пшеничной соломы (фактор № 2) на микробиоту почвоподобного субстрата (1ТПС) была подсчитана численность различных индикаторных групп микроорганизмов в ППС.

Данные, полученные в ходе эксперимента, свидетельствуют о зависимости численности исследованных групп микроорганизмов в почвоподобном субстрате от способа обработки пшеничной соломы (рисунки 1 - 6).

Достоверно наименьшее количество бактерий, усваивающих органический азот, выявлено в фоне - почвоподобном субстрате, не использовавшемся для выращивания редиса (рисунок 1, таблица 1), что, видимо, вызвано отсутствием питательных веществ, поступающих с корневыми выделениями растений редиса.

Обработка пшеничной соломы любым из использовавшихся способов при внесении в почвоподобный субстрат для выращивания растений редиса статистически значимо увеличило численность бактерий, усваивающих органический азот (рисунок 1, таблица 1) по сравнению с фоном._________________________

е 5 4 3 2 1 О

а 1е

¿1

К фон 12 3

Варианты эксперимента

! __ _________________

Рисунок I - Количество бактерий, усваивающих органический азот, в почвоподобном субстрате (ППС) в зависимости от способа обработки соломы Примечание: Варианты опыта: фон - ППС без растений и без соломы; I - ППС с соломой, минерализованной перекисью водорода; 2 - ППС с сухой соломой; 3 - ППС с ферментированной соломой; КОЕ - колониеобразующие единицы: I - доверительный интервал.

Таблица I

Критерий достоверности различий (^ксп*) между численностью микроорганизмов

фон 12 3

Варианты эксперимента

Рисунок 2 - Количество бактерий группы кишечной палочки в почвоподобном субстратев зависимости от способа обработки соломы

Группы микроорганизмов ] ** 2** з**

Бактерии, усваивающие органический азот 4,19 4,63 4,75

Бактерии группы кишечной палочки 2,9« 4,48 0,70

Спорообразующие бактерии в стадии спор 0,03 0,08 0,06

Фитопатогенные бактерии 3,26 13,85 7,12

Бактерии, усваивающие минеральный азот 8,91 7,33 7,04

Микроскопические грибы 2,78 6,95 14,23

Анаэробные бактерии 2,75 2,54 6,26

Примечание: * - 1ЭКСП - критерий разности достоверен при {эКСП > Сыиод (^Ыеш = 2,78 для р = 0,05; = 4,60 для р = 0,01; tstucb.it = 8,61 для р = 0,001). ** Варианты опыта: 1 - солома, минерализованная перекисью водорода; 2 - сухая солома; 3 - ферментированная солома.

Между исследованными способами обработки пшеничной соломы обнаружены статистически значимые (Р-значение < 0,05), неслучайные (Рф > Ркр) различия в численности бактерий, усваивающих органический азот (таблица 2). Сила влияния способа обработки пшеничной соломы на количество бактерий, усваивающих органический азот, составила 60,87 % (таблица 2).

Таблица 2

Однофакгорный дисперсионный анализ влияния способа обработки пшеничной

Источник вариации 85 Р-Значение Ркр

Между вариантами способа обработки пшеницы 14,00 7,00 0,02 4,26

Внутри вариантов способа обработки пшеницы 9,00

Итого 23,00

Показатель силы влияния, % 60,87

Примечание: 88 - дисперсия; Рф - фактическое значение критерия Фишера; Р-Значение -статистически значимые различия при Р < 0,05; Ркр - табличное значение критерия Фишера

Численность бактерий группы кишечной палочки (БГКП) в варианте с минерализованной соломой (рисунок 2, вариант 1) является результатом присутствия в растворе легкодоступных для бактерий форм азота (ЫСЬ-, Ж)3—, N1^') (Куденко. Павленко, 1998). Достоверно (таблица 1) меньшая численность БГКП по сравнению с фоном в варианте с сухой соломой (рисунок 2, вариант 2) объясняется низким содержанием в пшеничной соломе легкоокисляемых органических веществ для роста бактерий (Кузнецов и др., 2009).

Внесение сухой соломы (во 2 варианте опыта), ферментированной соломы и ее отжима (в 3 варианте опыта) в 11ПС привело к достоверному росту численности фитопатогенных бактерий по сравнению с фоном (рисунок 3, таблица 1). Количество фитопатогенных бактерий в варианте с минерализованной соломой было достоверно меньше, чем в фоне (рисунок 3, таблица 1).

Численность микроскопических грибов во всех вариантах эксперимента достоверно выше, чем в ППС без добавок соломы пшеницы - фоне (рисунок 4, таблица 1).

20

12

4

О

20

16

12

* фон 12 3

Варианты эксперимента {

Рисунок 3 — Численность фитопатогенных бактерий в ППС в зависимости от способа обработки соломы пшеницы Примечание: см. рисунки 1, 2.

фон 12 3

Варианты эксперимента

Рисунок 4 - Численность микроскопических грибов в ППС в зависимости от способа обработки соломы пшеницы

Значимому (таблица 1) увеличению численности бактерий-анаэробов (рисунок 5) способствовало внесение в ППС только ферментированной соломы пшеницы.

Добавление соломы пшеницы, обработанной любым из использовавшихся способов, достоверно изменило в ППС численность бактерий, усваивающих минеральный азот (рисунок 6, таблица 1) в сравнении с фоном.________________________________

С 2,5

X 2

о"

С С 1,5

О и

1 1

о

, V 0,5

из

г 0

6 8

фон 1 2 3

Варианты эксперимента

Рисунок 5 - Численность бактерий-анаэробов в зависимости от способа обработки соломы пшеницы

фон 12 3 Варианты эксперимента

Рисунок 6 - Численность бактерий, усваивающих минеральный азот, в зависимости от способа обработки соломы пшеницы

Примечание: см. рисунки I, 2.

На рисунке 7 показан процент спорообразуюших бактерий в ППС от общего числа бактерий, усваивающих органический азот, обработки соломы пшеницы. ...................................................

в зависимости от способа

20

фон 12 3

Варианты эксперимента

Рисунок 7 - Процент спорообразуюших бактерий от общего числа бактерий, усваивающих органический азот Примечание: Варианты опыта: фон - ППС без растений и без соломы; 1 - ППС с соломой, минерализованной перекисью водорода; 2 - ППС с сухой соломой; 3 - ППС с ферментированной соломой.

Процент споровых бактерий от общего количества бактерий в ППС был самым высоким в фоне. Полагаем, что внесение питательных веществ в виде переработанной различными способами пшеничной соломы снизило процент споровых бактерий в стадии спор во всех вариантах опыта. В вариантах с добавлением соломы в ППС спорообразующих бактерий было от 12 до 20 % (рисунок 7). Обычно наличие споровых бактерий указывает на присутствие

трудноокисляемых органических веществ (URL: http://www.sunhome.ru/ books /b.Iekcii_ро__ mikrobiologii _i_biotehnologii/23).

Численность физиологических групп микроорганизмов, выделенных на жидких питательных средах, представлена в таблице 3.

Таблица 3

Численность физиологических групп микроорганизмов в зависимости от способа обработки* соломы, НВЧ** х 103 / 1 г сухого ППС_

Варианты опыта

Фон

Аммонифицирующие

1340

762

9390

17900

Микроорганизмы:

Денитрифицирующие

косвенные

44,7

7,62

35,7

9.93

истинные

2,23

0,08

0,28

3,77

Целлюлозоразрушающие

2,23

3,77

28,18

9,14

Примечание: * - варианты обработки соломы: фон - ППС без растений редиса и пшеничной соломы; 1 - солома, минерализованная перекисью водорода; 2 - сухая солома; 3 -ферментированная солома. ** - НВЧ - наиболее вероятное число микроорганизмов рассчитанное по таблице Мак-Креди, основанной на методах вариационной статистики.

Количество микроорганизмов различных физиологических групп также зависело от способа обработки соломы. Внесение в ППС соломы, минерализованной по методу Ю.А. Куденко и P.A. Павленко (1998), значительно снижало численность аммонифшсаторов, косвенных и истинных денитрификаторов (в 1,8, 5,9 и 28,6 раза соответственно по сравнению с фоном), так как в растворе, полученном из реактора после окисления соломы перекисью водорода и используемом для полива, не содержалось органических соединений. Количество целлюлозоразрушающих микроорганизмов увеличилось в 1,7 раза по сравнению с фоном, вероятно, благодаря поступлению в почвоподобный субстрат трудноокисляемых органических соединений с корневыми выделениями растений редиса.

Добавление в почвоподобный субстрат сухой соломы значительно увеличило численность аммонифицирующих и целлюлозоразрушающих микроорганизмов и снизило количество косвенных и истинных денитрификаторов. Данные по росту численности целлюлозоразрушающих микроорганизмов находят подтверждение в литературе (Применение соломы 2004).

Предварительная ферментация соломы и использование отжима в качестве раствора для полива растений редиса так же отразилось на численности физиологических групп микроорганизмов. Для этого варианта опыта характерен самый высокий уровень аммонификаторов (численность увеличилась по сравнению с фоном в 13,36 раза), что может свидетельствовать о наличии в субстрате органических веществ.

3. 3 Микробный ценоз ирригационного раствора для выращивания разновозрастной поликультуры высших растений

При исследовании влияния несъедобных отходов растений (фактор № 3) па микробиоту ирригационного раствора в почвоподобный субстрат (ППС) вносили листья и стебли чуфы, листья редиса, корни салата. Вместо съедобной биомассы

добавляли ферментированную солому пшеницы, чтобы восполнять потери ППС в объеме и минеральных веществах.

Для изучения качественного и количественного состава микробиоты ирригационного раствора для выращивания разновозрастной поликультуры растений (редиса, салата и чуфы) были исследованы индикаторные группы микроорганизмов на плотных и жидких селективных средах.

3.3.1 Динамика численности микроорганизмов в ирригационном растворе, выделенных на плотных питательных средах

Результаты исследований групп микроорганизмов на плотных питательных средах в течение эксперимента представлены на рисунках 8 - И. В ирригационном растворе без добавления в почвоподобный субстрат (ППС) растительных отходов (фон^обнаружены представители всех исследованных групп микроорганизмов.

к-¡во 145

80 105 1 SO 155 180 205 230 255 280 305

Время, сутки

SS 80 105 130 1SS 180 20S 230 255 2В0 305 Время, сутки

Рисунок 9 - Динамика численности бактерий группы кишечной палочки в ирригационном растворе в течете эксперимента.

Рисунок 8 - Динамика численности бактерий, усваивающих органический азот (— —), и бактерий, усваивающих минеральный азот (—.), в ирригационном растворе. Примечание'. КОЕ - копоштеобразутощие единицы ; I - доверительный интервал . Микробиологические пробы проведены на 66, 96, 165, 193 и 306 дни опыта.

В растворе на 66 сутки опыта (фон) количество бактерий, усваивающих органический азот, составило 12,8 х 105 КОЕ / 1мл (рисунок 8). Добавление на 96 сутки опыта отходов редиса и салата и соломы пшеницы в ППС достоверно не изменило численность гетеротрофных бактерий (Р-значение > 0,05, таблица 4).

Таблица 4

Однофакторный дисперсионный анализ влияния внесения отходов на 66 и 96 сутки на численность бактерий, усваивающих органический азот

Источник вариация

Между группами

Внутри групп

Итого

Показатель силы влияния, %

S S

19,6

216

235,6

S ,32

Ja!_

0,73

Р-Значение

0,42

5,32

Примечание- 55 - дисперсия; Рф - фактическое значение критерия Фишера; Р-Значение -статистически значимые различия при Р < 0,05; Ркр - табличное значение критерия Фишера.

Различия между количеством бактерий на 66 и 96 сутки эксперимента были

случайными (Рф < Ркр, таблица 4).

Для оценки вклада разных растительных отходов в формирование микробиоты ирригационного раствора был подсчитан критерий достоверности

различий между численностью исследованных групп микроорганизмов, определенных на разные сутки эксперимента (таблица 5).

Число бактерий достоверно повышалось до 193 суток (рисунок 8, таблица 5) культивирования растений при добавлении в ППС (кроме вышеназванных добавок) несъедобных отходов чуфы. На 306 сутки численность бактерий, усваивающих органический азот, достоверно не отличалась от значений в фоне (рисунок 8).

Таблица 5

Критерий разности (!,„„+) между численностью микроорганизмов в исследуемых

Группы микроорганизмов

пробах по сравнению с фоном

Бактерии, усваивающие органический азот

Бактерии, усваивающие минеральный азот

Бактерии в стадии спор

Бактерии группы кишечной палочки

Микроскопические грибы

96* 1,45

0,72

1,41

2,84

0,08

165***

5,83

9,38

2,94

31,98

3.48

193"

5,74

8,86

7,11

5,06

3,14

306**

0,65

5,94

6,77

18,61

3,95

Примечание: * - 1ЭХСП - критерий разности достоверен при 1ЭКП > - 2,78 для р = 0 05' 4,60 для р = 0,01; 8,61 для р = 0,001). ** - вносили несъедобные отходы редиса и салата и пшеничную солому; *** - вносили несъедобные отходы редиса, салата и туфы и пшеничную солому.

Количество бактерий, усваивающих минеральный азот (рисунок 8), в течение всего эксперимента было достоверно выше, чем на 66 сутки культивирования растений (в фоне). Несъедобные части редиса и салата и солома пшеницы в ППС достоверно не изменили число бактерий.

Добавление отходов чуфы в почвоподобггый субстрат (ППС) достоверно увеличило численность бактерий, усваивающих минеральный азот. Максимум количества бактерий, усваивающих минеральный азот, приходится на 193 сутки (82,5 х 10 КОЕ / 1 мл), когда в ППС повторно внесли несъедобные отходы чуфы.

Количество бактерий группы кишечной палочки (БГКП) на протяжении всего эксперимента было достоверно выше (рисунок 9) по сравнению с фоном - 66 сутками выращивания растений. Подача несъедобных частей растений редиса и салата (96 сутки) достоверно увеличила (рисунок 9, таблица 5) численность бактерий группы кишечной палочки в 2 раза. Максимума численность БГКП достигла после внесения чуфы в ночвоподобный субстрат (ППС) на 165 сутки опыта. Обнаружение значительных количеств бактерий группы кишечной палочки указывает на загрязнение среды и свидетельствует о развитии гнилостных процессов и наличии легкоокисляемой органики (Санитарная микробиология, 1969). Длительное внесение несъедобных отходов чуфы в ППС снизило количество БГКП к 306 суткам.

Численность спорообразующих бактерий на 66 сутки использования раствора составляла 3,25 х 105 КОЕ / 1мл. После добавления отходов редиса количество бактерий достоверно не изменилось. Общее количество споровых бактерий (в вегетативной форме) и количество бактерий в стадии спор достоверно уменьшилось, начиная со 165 суток эксперимента (рисунок 10). Со 193 по 306 сутки эксперимента их численность достоверно не изменялась.

0,52

r£U5_

55 80 105 130 155 180 205 230 255 280 305 Время, сутки

55 SO 105 130 155 180 205 230 255 280 305 Вр«мя, сутки

Рисунок 10 - "Динамика численности Рисунок 11 - Динамика численности споровых бактерий в ирригационном микроскопических грибов в

растворе (--общее число споровых ирригационном растворе.

бактерий, — — - количество споровых

бактерий в стадии спор). _

Примечание: КОЕ - колониеобразующие единицы; I - доверительный интервал для р -

0,05.

Количество микроскопических грибов в питательном растворе исчислялось от нескольких сотен до нескольких тысяч в 1 мл раствора. Численность микромицетов достоверно уменьшалась на протяжен™ всего эксперимента (рисунок 11).

Известно что из прикорневой зоны чуфы выделен новый вид актиномицета -ЪгерЮтусез сурегтиз *р. пог. (Кузнецов и др., 1986). Данный вид актиномицета синтезирует два новых полициклических антибиотика: циперомицин I, подавляющий рост грамположительных бактерий, и циперомицин II, подавляющий рост грибов и дрожжей (Кузнецов и др., 1986). По-видимому, изменение численности грамположительных бактерий, в том числе и споровых, зависело от действия антибиотика щшеромицина I. Рост численности микроскопических грибов подавлял антибиотик циперомицин II.

3.3.2 Динамика числеиности физиологических групп микроорганизмов в ирригационном растворе, выделенных на жидких питательных средах

Для определения численности физиологических групп микроорганизмов были исследованы аммонифицирующие, истинные и косвенные денитрифицирующие, целлюлозоразрушающие микроорганизмы. Данные об изменении численности отдельных физиологических групп микроорганизмов в течение эксперимента представлены в таблице 6.

Среди микроорганизмов, участвующих в превращении азотистых веществ, наиболее многочисленна была группа аммонифицирующих, количество которых исчислялось миллионами клеток в 1 мл раствора (таблица 6). ^

Количество аммонифицирующих бактерий в фоне составило 0,05 х 10 НВЧ / 1 мл раствора и увеличивалось в течение всего эксперимента (таблица 6). К 306 суткам численность аммонифицирующих бактерий достигла максимума. Видимо, такая тенденция связана с постоянным внесением в почвоподобный субстрат растительных отходов.

Таблица 6

Численность микроорганизмов на жидких питательных средах в течение _ эксперимента (НВЧ* / 1 мл раствора)

ГРУППА МИКРООРГАНИЗМОВ

Аммонифицирующие, 1 х 10'

Денитрифицирующие косвенные, 1 х 103

Де1гитрифицирующие истинные, 1 х103

Целлюлозоразрутающие, 1 х 103

Продолжительность эксперимента.

66 (фон)

15

25

0,1

4,5

96*

25

95

0,5

200

165"

45

140

110

200

сутки

193-"

25

250

1,5

300

306*

45

95

0,12

45

Примечание: * НВЧ - наиболее вероятное число микроорганизмов; ** - присутствовали несъедобные отходы редиса, салата и солома пшепицы; *** - присутствовали несъедобные отходы редиса, салата, чуфы и солома пшеницы. Статистическая обработка проведена при расчете количества микроорганизмов по таблице Мак-Креди, основанной на методах вариационной статистики.

Количество косвенных денитрификаторов, восстанавливающих нитраты до нитритов или аммиака, варьировало от нескольких тысяч до сотен тысяч клеток в 1 мл ирригационного раствора. Численность истинных денитрификаторов, восстанавливающих нитраты до молекулярного азота значительно колебалась (таблица б).

Присутствие денитрифицирующих микроорганизмов не может служить прямым доказательством наличия процесса денитрификации, так как одни и те же бактерии в зависимости от условий могут участвовать в различных микробиологических процессах. Денитрификация зависит от наличия нитратов, легкоусвояемого органического вещества, нейтральной или слабощелочной реакции среды и анаэробных условий. Последнее не обязательно, т.к. восстановление нитратов до свободного азота не подавляется и при полном доступе воздуха (Умаров и др., 2007).

О присутствии азота в нитратной и аммонийной формах в ирригационном растворе свидетельствуют химические анализы (Величко и др., 2011). Реакция ирригационного раствора была нейтральной или слабощелочной (таблица 7).

Таблица 7

Сутки 66 96* 165** 193** 306**

РН 7,7 7,85 8,3 7,5 6,8

Примечание: * - присутствовали несъедобные отходы редиса,салата и пшеничная солома; ** - присутствовали те же отходыи несъедобные части чуфы. Сочетание вышеперечисленных условий (присутствие азота в нитратной и аммонийной формах, нейтральная реакция раствора) в ирригационном растворе, видимо, приводило к росту числа истинных денитрификаторов и, как следствие, потерям азота в среде.

Увеличение численности целлюлозоразрушающих микроорганизмов (таблица 6) до 193 суток может свидетельствовать об интенсификации разложения трудноокисляемых органических веществ в растворе. Уменьшение количества вносимых отходов вызывает снижение количества бактерий, редуцирующих клетчатку (306 сутки эксперимента).

Со 193 по 306 сутки эксперимента численность всех физиологических групп микроорганизмов, за исключением аммонификаторов, уменьшилась на 1 - 2 порядка.

3.3.3 Влияние вносимых несъедобных отходов растений на состав микробиоты ирригационного раствора

В ирригационный раствор в течение эксперимента вносили несъедобные растительные отходы (рисунок 12) (Величко и др., 2011). Вместо собранных съедобных частей растений вносилось эквивалентное количество ферментированной ' пшеничной соломы, выращенной на отдельном почвоподобпом субстрате (рисунок 13). Среди несъедобных частей растений большую часть составляли листья растений чуфы (рисунок 12).

80 105 13С 155 180 205 230 255 280 305 Время, су№11

Рисунок 12 - Динамика внесения Рисунок 13 - Динамика внесения в ППС

несъедобных отходов растений в ППС несъедобных отходов, включая солому пшеницы Примечание: —— - общее количество Примечание: — - общее количество

несъедобных частей растений; — ■--внесенпых отходов; — — - пшеничная солома

несъедобные отходы чуфы (листья); — о вместо съедобных частей растений; • • • -. — - несъедобные отходы редиса (листья) несъедобные части растений (редиса и чуфы).

Для более точного определения зависимости между численностью отдельных групп микроорганизмов и количеством внесенных несъедобных растительных отходов был подсчитан коэффициент корреляции между ними (таблица 8).

Численность большинства изученных групп микроорганизмов не зависела от несъедобных частей редиса (таблица 8).

Таблица 8

Коэффициент корреляции (г*) между числом микроорганизмов и количеством

Гпуппы миксоооганизмов Листья редиса Листья чуфы Солома пшеницы

Бактерии, усваивающие органический азот -0.11 0,72 0,55

Спорообразующие бактерии -0,10 -0,79 -0,97

Бактерии группы кишечной палочки -0,09 0,69 0,30

Бактерии, усваивающие минеральный азот -0,03 0,83 0,86

Микроскопические грибы -0,18 -0,93 -0,73

Аммонифицирующие 0,44 0,73 0,65

Истинные дснитрификаторы -0,04 0,53 0,12

Косвенные денитрификаторы -0,05 0,57 0,78

Целлголозоразрушающие 0,28 0,50 0,51

Примечание: * г - при г

зависимость; 0,5 < г < 0,7 обратная зависимость.

■ средняя зависимость; г > 0,7 - сильная зависимость; «-»

Между отходами чуфы и числом микроорганизмов различных групп показана сильная (г > 0,7) или средняя (0,5 < г < 0,7) зависимость.

Количество микроорганизмов зависело от массы соломы пшеницы в различной степени: от сильной (г > 0,7), средней (0,5 < г < 0,7), слабой (0,3 < г < 0,5) связи и до ее отсутствия (г = 0,12).

Несъедобными отходами салата (корнями салата) можно пренебречь, т.к. ввиду их малой массы корни салата из ППС никогда не собирали и не удаляли.

ВЫВОДЫ

1. Исследуемые группы микроорганизмов - индикаторы состояния высших растений и еанитарно-показательные для человека в растворе из реактора после окисления экзометаболитов человека перекисью водорода в электромагнитном поле (фактор № 1) не обнаружены. Полученные растворы не представляют потенциальной (микробиологической) опасности ни для растений, ни для человека и могут использоваться в качестве удобрения для выращивания растений в экологических системах жизнеобеспечения.

2. При добавлении в почвоподобный субстрат, используемый для выращивания монокультуры редиса, соломы пшеницы, обработанной любым из применявшихся способов (фактор № 2), численность бактерий, усваивающих органический азот, микроскопических грибов, анаэробных бактерий и целлюлозоразрушающих микроорганизмов достоверно выше, чем в фоне, а количество косвенных денитрификгаторов - достоверно ниже по сравнению с фоном.

3. При использовании минерализованной соломы пшеницы достоверно ниже численность фитопатогенных бактерий, споровых бактерий в вегетативной стадии и стадии спор, микроскопических грибов в почвоподобном субстрате по сравнению с другими способами обработки соломы (фактор № 2).

4. Присутствие ферментированной соломы пшеницы и несъедобных частей редиса и салата (фактор 3) в почвоподобном субстрате на 96 сутки использования ирригационного раствора для выращивания поликультуры высших растений достоверно влияет только на численность бактерий группы кишечной палочки.

5. Добавление в почвонодобный субстрат несъедобных отходов чуфы (фактор № 3) оказывает сильное (г > 0,7) и среднее (0,5 < г < 0,7) действие на индикаторные группы микроорганизмов ирригационного раствора, использованного для выращивания поликультуры высших растений на почвоподобном субстрате.

Практические рекомендации

1 - Рекомендуем ФГБУН «Институт биофизики СО РАН», Пекинскому аэрокосмическому университету:

а) при выращивании растений в СЖО использовать минерализованные физиологические отходы человека, не представляющие микробиологической опасности ни для человека, ни для растений, способствующие увеличению замкнутости экологической системы жизнеобеспечения по круговороту веществ;

б) выращивать растения чуфы на почвоподобном субстрате для регулирования численности микроорганизмов - индикаторов состояния растений и санитарно-ноказательных для человека в экологических системах жизнеобеспечения.

2 - Результаты исследований используются в учебном процессе студентов по направлениям 110400 «Агрономия» и 110100 «Агрохимия и агропочвоведение» в ФГОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет» (акт о

внедрении прилагается).

Список работ по теме диссертации В журналах, рекомендованных ВАК РФ

1. Тирранен, Л.С. Влияние растительных отходов на микрофлору раствора, использованного для выращивания растений/ Л.С. Тирранен, О-В. Сысоева, В.В. Величко// Вестник КрасГАУ, вып. 10. - Красноярск, 2009. - с. 80 - 85.

2. Торотенкова, В.Н. Взаимодействия микроорганизмов через продуцируемые ими летучие вещества/ В.Н. Торотенкова, Л.С. Тирранен, О.В. Сысоева// Вестник КрасГАУ, вып. 12. - Красноярск, 2009. - с. 150 - 154.

3. Сысоева, О.В. Зависимость микробиоты почвоподобного субстрата от способа обработки соломы пшеницы/ О.В. Сысоева. Л.С. Тирранен, С.А. Ушакова, Г.С. Калачева// Вестник КрасГАУ, вып. 3. - Красноярск, 2013. - с. 91 - 95.

4. Сысоева, О.В. Оценка влияния способа обработки соломы пшеницы на микробиоту почвоподобного субстрата с помощью однофакторного дисперсионного анализа/ О.В. Сысоева, Л.С. Тирранен// Вестник КрасГАУ, вып. 2.

- Красноярск, 2014. - с. 104 - 108.

В других научных изданиях

5. Сысоева О.В. Обнаружение микроорганизмов в отходах человека, утилизированных физико-химическим способом/ О.В. Сысоева// Тезисы докладов 1 -ой Региональной студенческой научной конференции по биологии (Красноярск

- Сибирский федеральный университет, 20 - 21 апреля 2007 г.). - Красноярск, 2007.

6: Тирранен, Л.С. Наличие микроорганизмов в отходах человека, утилизированных физико-химическим способом/ Л.С. Тирранен, Ю.А. Куденко, О.В. Сысоева// Тезисы докладов XIV Всероссийского симпозиума с международным участием «Сложные системы в экстремальных условиях» (природный парк «Ергаки», 23 - 28 июня, 2008 г.) - Красноярск, 2008. - с. 62.

7. Сысоева, О.В. Влияние способа обработки соломы пшеницы на микрофлору почвоподобного субстрата/ О.В. Сысоева// Материалы 1 Всероссийской научно-практической (заочной) конференции «Естественные науки и современность: проблемы и перспективы исследований». - Москва, 2009. - с. 100- 104.

8. Сысоева, О.В. Микробиота раствора, использовавшегося для выращивания растений кермека Гмелина (Limonium gmelinli) в модели БСЖО/ О.В. Сысоева// Растения и микооорганизмы: сборник трудов международной интернет-конференции. (Казань, 18-21 апреля, 2011 г.). - Казань: Казанский (Приволжский)

федеральный университет, 2011. - с. 226 - 228.

9. Sysoeva, O.V. Microbiota of the solution used to grow plants on the SLS containing plants wastes in the experimental model, of the BLSS// O.V. Sysoeva, L.S. Tirrancn// материалы IV международной (заочной) научно-практической конференции молодых ученых «Инновационные тенденции в развитии российской науки». (Красноярск, апрель, 2011 г.). - Красноярск, 2011.-е. 31 — 35.

Подписано в печать 20.02.2014 г. Формат 60 х 84/16. Усл. печ. л. 1. Тираж 70 экз. Заказ № 9

Отпечатано в типографии ФГБУН Института физики им. Л.В. Киренского СО РАН 660036, Красноярск, Академгородок, 50, стр. 38.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сысоева, Ольга Валерьевна, Красноярск

ФГОУ ВПО «КРАСНОЯРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ

УНИВЕРСИТЕТ»

ФГБУН «ИНСТИТУТ БИОФИЗИКИ СО РАН»

На правах рукописи 04201457635 ^^

СЫСОЕВА Ольга Валерьевна

Факторы, влияющие на микробиоту раствора для выращивания растений в экспериментальной модели экологической системы жизнеобеспечения

Специальность 03.02.08 - экология (биология)

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук Тирранен Л.С.

Красноярск - 2014

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.............................................................................................................4

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................10

1.1 Взаимодействие растений с микроорганизмами...................................10

1. 2 Микробиота почв.........................................................................................12

1. 3 Корневые выделения растений.................................................................15

1. 4 Индикаторные группы микроорганизмов..............................................16

1. 5 Состав и характеристика почвоподобного субстрата..........................18

1. 6 Перспективы применения пшеничной соломы.....................................21

1. 7 Микробный ценоз нативных выделений человека..............................25

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.......................29

2.1 Объекты исследования...............................................................................29

2. 1. 1 Объект исследований утилизированных экзометаболитов человека..........29

2. 1. 2 Объект исследований при изучении влияния способов обработки соломыЗО 2. 1. 3 Объект исследований при оценке влияния внесения растительных отходов в почвоподобный субстрат...............................................................................................30

2. 2 Методы исследования.................................................................................34

2. 2. 1 Эксперимент 1..........................................................................................................34

2. 2. 2 Эксперимент II.........................................................................................................37

2. 2. 3 Схема эксперимента III..........................................................................................37

2. 2. 4 Микробиологические методы...............................................................................39

2. 2. 5 Идентификация выделенных бактерий молекулярно-генетическими методами..............................................................................................................................44

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.........................................47

3.1 Численность микроорганизмов в физиологических отходах человека,

утилизированных физико-химическим способом........................................47

3. 2 Влияние способа обработки соломы на микробиоту почвоподобного

субстрата...............................................................................................................49

3. 2. 1 Химический анализ водной вытяжки соломы..................................................49

3. 2. 2 Микробиоценоз почвоподобного субстрата с добавками пшеничной соломы..................................................................................................................................51

3. 3 Микробный ценоз ирригационного раствора для выращивания

разновозрастной поликультуры овощей........................................................68

3. 3.1 Динамика численности микроорганизмов в ирригационном растворе,

выделенных на плотных питательных средах.............................................................69

3. 3. 2 Динамика численности физиологических групп микроорганизмов в

ирригационном растворе, выделенных на жидких питательных средах...............89

3. 3. 3 Влияние вносимых несъедобных отходов растений на состав микробиоты

ирригационного раствора.................................................................................................92

3. 3. 4 Видовой состав микроорганизмов, выделенных из раствора........................95

ВЫВОДЫ:.............................................................................................................98

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:......................................................100

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:..............................................................................101

ПРИЛОЖЕНИЕ.................................................................................................129

ПРИЛОЖЕНИЕ А.............................................................................................130

ПРИЛОЖЕНИЕ Б.............................................................................................131

ВВЕДЕНИЕ

Работы по созданию биологических систем жизнеобеспечения человека в экстремальных условиях начались в нашей стране с середины XX в. (Проблемы 1967; Киренский и др., 1969; Лисовский, 1973; Сидорова, 2006, Bartsev et al, 1996; Gitelson et al., 2003). Подобные системы разрабатываются также и за рубежом (Cabello et al., 2001; Hidenori et al, 2007). Помимо поддержания жизни человека в неблагоприятных условиях окружающей среды, эти системы позволяют исследовать биологические и экологические процессы на разных уровнях их организации (Проблемы ..., 1967).

В настоящее время существуют различные системы жизнеобеспечения (СЖО), предназначенные для поддержания жизни человека в экстремальных условиях (Барцев и др., 2008; Морозов, Малоземов, 2009). Одной из особенностей систем жизнеобеспечения является создание искусственной среды обитания, в частности атмосферы, отличающейся от природной, земной (Аргунова и др., 2009).

Системы жизнеобеспечения должны выполнять такие функции, как регенерация кислорода, воды и обеспечение пищи для человека (Самсонов и др., 2009; Cabello et al, 2001; Gitelson et al, 2003). Одна из основных функций СЖО - регенерация пищи - в обозримом будущем выполнима лишь биологическим путем (Лисовский, 1973; Беркович, 2008; Левинских и др., 2010; Головко и др., 2011).

Существующие концепции (Сычев и др., 2008) обеспечения жизнедеятельности человека в биолого-технических системах жизнеобеспечения предусматривают разработку биорегенеративных систем жизнеобеспечения (БСЖО), основанных на круговороте веществ (Проблемы..., 1967), где в качестве ключевых компонентов, выполняющих

три вышеперечисленные функции, будут выступать высшие растения (Левинских и др., 2010; Gitelson et al, 2003; Morin et al, 2010).

Основой, позволившей создать устойчивую систему круговорота веществ, включающую внешний метаболизм человека, являлся метод параметрического управления биосинтезом в непрерывной культуре популяций одноклеточных организмов (Печуркин и др., 1969; Печуркин, 1982; Терсков, Гительзон, 1982).

Перспективными биокомпонентами системы жизнеобеспечения являются высшие растения — основные претенденты на роль фототрофного полифункционального звена, способного регенерировать атмосферу, воду, растительную пищу (Сычев и др., 2012) и утилизировать метаболиты человека (Проблемы..., 1967; Киренский и др., 1969; Яздовский, Воронин, 1969; Лисовский, 1973; Беркович, 2008; Gitelson, Okladnikov, 1996; Morin et al, 2010).

Фотосинтезирующее звено системы формируется в виде разновозрастных многовидовых ценозов (Лисовский, 1973; Нефедова, Левинских, 2007; Bartsev et al, 1996; Gitelson et al., 2003).

Использование высших растений для выполнения всех вышеуказанных функций системы жизнеобеспечения позволило создать систему «Биос-3» (Лисовский, 1973; Гительзон и др., 1975; Gitelson et al., 2003). Во время экспериментов в системе «Биос-3» находился экипаж (из двух-трех человек), растения, снабжавшие людей кислородом, водой и растительной пищей, а так же микроорганизмы, входящие в обычную микробиоту человека и растений.

Циркуляция кислорода и воды полностью выполнялась растениями -замкнутость системы по воздухо- и водообмену составила 100 %. (Лисовский, 1973; Salisbury et al., 1997). Замкнутость по массообмену составляла не более 70 %, так как несъедобная биомасса растений и физиологические отходы человека не использовались и выносились из системы (Лисовский, 1973; Bartsev et al., 1996; Gitelson et al, 2003).

Такие методы утилизации экзометаболитов человека и растительных остатков как высушивание, сжигание, заморозка могут использоваться только в незамкнутых системах вследствие выноса химических элементов из круговорота веществ (Яздовский, 1976). Увеличение замкнутости системы по массообмену возможно за счет включения нативных выделений человека и растительных отходов в круговорот веществ в системе (Kudenko et al., 2000; Manukovsky et al., 2005; Tikhomirov et al., 2005).

Проектирование систем переработки и утилизации отходов в замкнутых системах осуществляется не только за рубежом (Fisher et al., 2009), но и в нашей стране. В последнее время были предложены более удачные способы обработки органических отходов, позволившие использовать их для питания растений (Винаров и др., 2009; Парахин и др., 2009; Садраддинова и др., 2009; Ушакова и др., 2009; Сутормина, 2011; Kudenko et al., 2000).

Выращивание высших растений для БСЖО возможно на различных субстратах, имитирующих почву (Manukovsky et al., 1997; Chengying et al., 2008). N.S. Manukovsky et al (1996) предложена переработка растительных отходов в почвоподобный субстрат (ППС) с достаточно высоким плодородием, позволяющим культивировать на нем растения в искусственных условиях.

В связи с вышеизложенным, определение наличия микроорганизмов в растворе, получаемом после утилизации нативных выделений человека, и оценка воздействия способов обработки органических отходов на микробный ценоз субстратов, применяемых для выращивания высших растений, актуальны.

Цель работы - исследовать влияние факторов на микробиоту почвоподобного субстрата и растворов, используемых для выращивания растений в экспериментальной модели экологической системы жизнеобеспечения.

Задачи работы:

1. Выявить влияние абиотического фактора (№ 1) «утилизация физико-химическим способом физиологических отходов человека» на наличие микроорганизмов в растворе, получаемом после окисления экзометаболитов.

2. Проанализировать воздействие абиотического фактора (№ 2) «способ обработки пшеничной соломы» на численность индикаторных групп микроорганизмов в почвоподобном субстрате.

3. Оценить вклад биотического фактора (№ 3) «внесение несъедобных отходов редиса, салата, чуфы и пшеницы в почвоподобный субстрат» в формирование микробного ценоза ирригационного раствора, используемого для выращивания растений.

Научная новизна работы заключается в оценке влияния на микробиоту ирригационного раствора или почвоподобного субстрата (ППС), внесенных в ППС несъедобных растительных отходов, используемых: для увеличения замкнутости круговорота веществ в системе; для восстановления объема почвоподобного субстрата в системе; в качестве удобрения для выращивания монокультуры редиса и поликультуры высших растений в экспериментальной модели экологической системы жизнеобеспечения.

Практическая значимость

Полученные результаты могут быть востребованы при разработке экологических систем жизнеобеспечения, основанных на использовании высших растений и предусматривающих длительное пребывание в таких системах человека в условиях полной изоляции от земной биосферы (в космосе, под водой и т.д.), в труднодоступных районах планеты (в полярных широтах, в высокогорье, в пустынях и др.).

Положения, выносимые на защиту:

1 - изученные группы микроорганизмов не обнаружены в выделениях человека, утилизированных физико-химическим способом, что

свидетельствует о микробиологической безопасности раствора, полученного после минерализации физиологических отходов человека;

2 - внесение в почвоподобный субстрат (ППС) обработанной любым из применявшихся способов соломы пшеницы достоверно влияет на численность изученных групп микроорганизмов в субстрате, используемом для выращивания растений редиса;

3 - добавление в почвоподобный субстрат несъедобных отходов чуфы оказывает сильное (г > 0,7) и среднее (0,5 < г < 0,7) влияние на индикаторные группы микроорганизмов ирригационного раствора, использованного для выращивания поликультуры высших растений на почвоподобном субстрате.

Личный вклад автора

Отбор и анализ образцов, обработка, интерпретация полученных результатов, написание работы выполнены лично автором.

Апробация работы:

Материалы диссертации доложены на следующих конференциях и симпозиумах: 1-ой региональной студенческой конференции «Современные проблемы биологии: успехи научной молодежи», Красноярск, СФУ, 20 — 21 апреля, 2007 г.; XIV Всероссийском симпозиуме с международным участием «Сложные системы в экстремальных условиях», Красноярск, природный парк «Ергаки», 23 - 28 июня, 2008 г.; 1 Всероссийской научно-практической (заочной) конференция «Естественные науки и современность: проблемы и перспективы исследований», Москва, 2009; XV Всероссийском симпозиуме с международным участием «Сложные системы в экстремальных условиях», Красноярск, 2010; Международной интернет-конференции «Растения и микроорганизмы», Казань, 18 - 21- апреля, 2011 г.; IV международной (заочной) научно-практической конференции молодых ученых «Инновационные тенденции в развитии российской науки», Красноярск, апрель, 2011.

Основные материалы диссертации опубликованы в 8 печатных работах, 3 из которых в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Место проведения работы

Работа выполнена на базе ФГОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет» и ФГБУН «Институт биофизики СО РАН» г. Красноярска.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 136 страницах текста. Работа включает 20 рисунков и 40 таблиц, состоит из введения, 3 глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и их обсуждение), выводов, практических рекомендаций, списка литературы, содержащего ссылки на 209 источников, из которых 60 - на иностранных языках, и приложения, содержащего 1 рисунок и 2 таблицы.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. 1 Взаимодействие растений с микроорганизмами

Взаимоотношения между микроорганизмами и растениями сложны и многообразны. Значительное число работ посвящено изучению этого вопроса (Возняковская, 1969; Мишустин, 1975; Сомов и др., 1988; Tirranen, 2001; Minh et al, 2004; Narula et al., 2009).

Роль взаимодействия растений с ассоциацией микроорганизмов активно изучается, многое во взаимоотношениях растений и микроорганизмов ещё предстоит выяснить (Кожевин, 2000; Маркова, Турская, 2012).

Сосуществование макро- и микроорганизмов носит противоречивый характер. В одном случае ассоциация способствует возникновению тех или иных инфекционных заболеваний, вызываемых микроорганизмами (антагонизм) (Берестецкий, 2008), в другом - диаметрально противоположном - наблюдается ярко выраженное симбиотическое взаимодействие партнеров, которое позволяет им выживать в среде обитания (Chen et al., 2006).

Растения тесно взаимодействуют с различными группами микроорганизмов (бактериями, актиномицетами, грибами и дрожжами) (Возняковская, 1969).

В фитоценозах за счет симбиоза с микроорганизмами растения обеспечиваются минеральным питанием, защитой от патогенов и растительноядных животных (Экспериментальная экология, 1991; Блинков, 2011), а иногда регуляцией роста и развития (Minh et al., 2004; Traquair, White, 2005).

Мир микроорганизмов служит посредником между живой и неживой средой на Земле (Игнатов, 2005). Обмен между различными уровнями биосферы в значительной мере определяется взаимодействием разнообразных микроорганизмов с растениями, животными и человеком (Игнатов, 2005; Воробьев и др., 2010).

Следует отметить, что среди микроорганизмов встречаются как фитопатогенные бактерии, оказывающие отрицательное воздействие на растение (Берестецкий, 2008), так и микроорганизмы - антагонисты фитопатогенных бактерий, оказывающие положительное влияние на растительный организм (Билай и др., 1988; Захарченко и др., 2010).

Антагонистический характер взаимоотношений с растениями наблюдается у некоторых микроорганизмов бактериального и грибного происхождения, например, представителями отрядов Аго^Ьа^еНасеае, ВасШасеае, Р$еас1отопас1асеае, Тг1скос1егта и других (Лархер, 1978).

Симбиотические микроорганизмы растений исследуются в связи с процессами фиксации атмосферного азота клубеньковыми бактериями бобовых растений (Экспериментальная... под ред. В.И. Кефели, В.Н. Кудеярова, 1991; Игнатов, 2005).

Продукты жизнедеятельности микроорганизмов имеют различное значение для жизни растения. Одни виды микробов, развивающиеся на корнях, являются активаторами, основными продуцентами различных физиологически активных веществ (Блинков, 2011), которые стимулируют рост растения (Маркова, Гарипова, 2011) и синтез ими биологических соединений (Лёшина и др., 2011). Другие виды являются ингибиторами, они образуют токсические вещества, угнетая рост и развитие растений или подавляя те или иные их функции (Фундаментальная фитопатология, под ред. Ю.Т. Дьякова, 2012). Третьи оказывают защитное действие своими метаболитами, повышая засухоустойчивость растений, сопротивляемость воздействию УФ-излучения (Мартыненко, Архипова, 2011; Панова и др., 2011). Возможно положительное влияние микроорганизмов (Куан, 2011) на

продуктивность растений за счет стимуляции ассоциированной с растением микробиоты (Ржевская, Теплицкая, 2011).

Положительное влияние ассоциативных микроорганизмов на растения включает в себя как опосредованную стимуляцию роста растений за счет вытеснения и подавления почвенных фитопатогенов путем продуцирования соединений, ингибирующих патогенную микрофлору (Торотенкова и др., 2009; Ветошкина и др., 2011), так и непосредственную стимуляцию - за счет синтеза микроорганизмами различных экзометаболитов, фитогормонов, которые проникают в растения и оказывают влияние на биохимические процессы (Цавкелова и др., 2006).

1. 2 Микробиота почв

Взаимоотношения высших растений и почвенных микроорганизмов являются одной из интереснейших и