Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние среды обитания на активность и pH-зависимость пищеварительных гидролаз у рыб, их потенциальных объектов питания и микробиоты

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние среды обитания на активность и pH-зависимость пищеварительных гидролаз у рыб, их потенциальных объектов питания и микробиоты"

На правах рукописи

Золотарева Галина Викторовна

ВЛИЯНИЕ СРЕДЫ ОБИТАНИЯ НА АКТИВНОСТЬ И рН-ЗАВИСИМОСТЬ ПИЩЕВАРИТЕЛЬНЫХ ГИДРОЛАЗ У РЫБ, ИХ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ОБЪЕКТОВ ПИТАНИЯ И МИКРОБИОТЫ

03.03.01 — физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 И!0Н 2015

Астрахань -2015

005569689

005569689

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессиональногообразования«Приднестровскийгосударственный университет им. Т.Г. Шевченко»

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Кузьмина Виктория Вадимовна

Официальные оппоненты: Неваленный Александр Николаевич,

доктор биологических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Астраханский государственный технический университет», кафедра гидробиологии и общей экологии, профессор

Груздков Андрей Андреевич, доктор биологических наук, ФГБУН «Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН», лаборатория физиологии питания, заведующий лабораторией

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки «Институт биологии Карельского научного центра РАН» г. Петрозаводск

Защита состоится 24 июня 2015 г. в 14:00 часов на заседании объединенного диссертационного совета ДМ 212.009.01 при ФГБОУ ВПО «Астраханский государственныйуниверситет» по адресу: 414000, г.Астрахань, пл. Шаумяна, 1, ауд. 101.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Астраханский государственныйуниверситет» по адресу: 414056, г. Астрахань, ул. Татищева, 20а и на сайте: http://www.asu.edu.ru.

Автореферат разослан « » 2015 г.

Ученый секретарь -

диссертационного совета .с . Курьянова Евгения Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Во второй половине XX века представления о закономерностях функциошгрования пищеварительной системы человека и животных были значительно пересмотрены и сформирована новая концепция процессов пищеварения (Уголев, 1963, 1972, 1985). В частности, двухзвенная схема (пищеварение — всасывание) была заменена трехзвенной (полостное пищеварение - мембранное пищеварение — всасывание), затем — пятизвенной схемой, включающей два дополнительных типа - симбионтное пищеварение и индуцированный аутолиз (Уголев, 1980, 1985). При исследовании рыб была установлена важная роль ферментов объектов питания, реализующих индуцированный аутолиз, и микрофлоры кишечника, осуществляющей симбионтное пищеварение (Уголев, Кузьмина, 1993; Кузьмина, 1996; 2005). Индуцированный аутолиз реализуется лизомальными гидролазами практически всех тканей рыб (Кузьмина, Цветкова, 2001; Кузьмина, 2005). При исследовании протеаз и гли-козидаз, обеспечивающих индуцированный аутолиз, было показано, что ферменты объектов питания вносят значительный вклад в гидролиз пищевых субстратов в желудочно-кишечном тракте рыб. Так, активность протеаз жертвы с учетом ее массы может превышать тотальную активность ферментов слизистой оболочки желудка в 5-10 раз, гаикозидаз - в сотни раз (Кузьмина, 2000; Кузьмина, Скворцова, 2002; Kuz'mina, Golovanova, 2004).

Симбионтное пищеварение реализуется ферментами кишечной микрофлоры, важная роль которых в гидролизе различных компонентов пищи у рыб в настоящее время не вызывает сомнения (Лубянскене и др., 1989, Шивокене, 1989; Уголев, Кузьмина, 1993; Кузьмина, Скворцова, 2002; Кузьмина, 2005, Бурлаченко, 2008; Ray et al., 2012; Ganguly, Prasad, 2012). Если вклад ферментов, обеспечивающих индуцированный аутолиз, в процессы пищеварения рыб из естественных водоемов известен, то вклад ферментов кишечной микрофлоры корректно оценить невозможно. Однако об их роли можно судить, используя сопоставление различных характеристик ферментов энтеральной микро-биоты, а также ферментов, функционирующих в составе слизистой оболочки кишечника и химуса. Именно так были выявлены различия температурных характеристик ферментов у рыб, их объектов питания и энтеральной микро-биоты, гидролизующих одни и те же субстраты (Кузьмина и др., 2012; Шалы-гин, 2013). При изучении влияния ряда значений рН на активность протеаз слизистой оболочки кишечника, химуса и энтеральной микробиоты у рыб из Рыбинского водохранилища были выявлены видовые различия (Скворцова, 2002). Поскольку спектр питания рыб, а также видовой состав и численность микроорганизмов в разных водоемах варьирует (Кузьмина, 2005), характеристики ферментов у рыб могут значительно различаться. Вместе с тем влияние рН на активность протеаз и гликозидаз слизистой оболочки кишечника, химуса и энтеральной микробиоты рыб из различных водоемов, различающихся по экологическим характеристикам, не исследовано. Также нет сведений о влиянии рН в широком диапазоне значений на целый организм потенциальных объектов питания рыб и сопутствующей микробиоты.

Цель работы: Изучить влияние условий среды обитания на активность и рН-зависимость протеаз и гликозидаз, функционирующих в составе слизистой оболочки кишечника, химуса и энтеральной микробиоты у рыб разных видов, а также характеристики одноименных гидролаз у их потенциальных объектов питания и сопутствующей микробиоты.

Задачи исследования:

1. Определить уровень активности протеаз и гликозидаз, функционирующих в кишечнике (слизистой оболочки, химуса и энтеральной микробиоты) у рыб из водоемов, расположенных в разных географических зонах (Рыбинское и Кучурганское водохранилища).

2. Выявить особенности рН-зависимости активности протеаз и гликозидаз, функционирующих в кишечнике рыб разных видов из водоемов, расположенных в разных географических зонах.

3. Исследовать активность протеаз и гликозидаз у потенциальных объектов питания рыб и сопутствующей микробиоты и сопоставить ее с активностью одноименных ферментов, функционирующих в кишечнике рыб.

4. Изучить рН-зависимость активности протеаз и гликозидаз потенциальных объектов питания рыб (рыбы и беспозвоночные) и сопутствующей микробиоты.

5. Оценить активность ферментов слизистой оболочки, химуса и энтеральной микробиоты при разных значениях рН у рыб, обитающих в водоеме и водотоке, расположенных в одной географической зоне (бассейн Нижнего Днестра).

Научная новизна: Впервые при исследовании в единых методических условиях активности и рН-зависимости протеаз и гликозидаз слизистой оболочки кишечника, химуса, и энтеральной микробиоты у рыб из разных водохранилищ выявлена зависимость активности одноименных гидролаз химуса и микрофлоры от условий их среды обитания. Впервые установлено, что активность протеаз энтеральной микробиоты рыб имеет более широкий спектр максимальных значений рН (5-10), чем ферменты слизистой оболочки кишечника (10) и химуса (6-10). Впервые на примере потенциальных объектов питания рыб Кучурганского водохранилища показано, что ферменты целого организма гидробионтов и сопутствующей микробиоты могут эффективно разрушать белковые и углеводные компоненты пищи рыб в широком диапазоне значений рН. Впервые показано, что в наибольшей степени от особенностей биотопа зависят рН зависимые характеристики протеаз энтеральной микробиоты.

Теоретическая и практическая значимость работы: Выполненная работа направлена на решение теоретических проблем трофологии рыб. Результаты исследования расширяют знания о диапазоне значений рН, при которых эффективно функционируют протеазы кишечника рыб. Выявлена особая роль протеаз энтеральной микробиоты, а также потенциальных объектов питания и сопутствующей микробиоты в деградации белковых компонентов пищи рыб при низких значениях рН. Полученные данные могут быть использованы для контроля и коррекции питания рыб в условиях аквакультуры.

Материал и методы исследования: Работа проведена в течение 2007-2014 гг. на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН (п. Борок, Россия), и Государственного образовательного учреждения Приднестровский государственный университет им. Т.Г. Шевченко (г. Тирасполь, Молдова, Приднестровье). Объекты исследования-рыбы из водоемов, значительно различающихся по физико-химическим и биотическим характеристикам, расположенных как в одной, так и в разных географических зонах (табл. 1).

Таблица 1

Краткая характеристика районов исследования

Показатель Рыбинское водохранилище Кучурганское водохранилище р. Днестр (нижний участок)

Общая площадь, км2 4550 27.3 -

Климат Умерено-континентальный Атлантико-континентальный степной Атлантико-континентальный степной

Средняя температура воды 8°С (среднегодовая) (Литвинов, Законнова, 2012) 14.8°С (среднегодовая) (Филипенко и др, 2009) 22° С (среднелетняя) (Мелиян, Кожушко, 2012)

Минерализация 100 мг/л (Экологические проблемы.., 2001). 575-1200 мг/л (Филипенко и др, 2009) 344.38 мг/л (Филипенко и др., 2012)

рН 7.0-8.9 (Экологические проблемы.., 2001). 7.9-8.15 (Филипенко и др., 2009) 8.12-8.25 (Филипенко и др., 2012)

Уровень трофности Эвтрофный (Экологические проблемы.., 2001) Гипертрофный (Мединец и др, 2008) -

Численность и биомасса бентоса 7413 экз./м2, 13.23 г/м2 (Щербина, 2009) 9514 экз./м2, 792.5 г/м2 (Филипенко, 2005) -

Численность и биомасса зоопланктона 40-120 тыс. экз./м3, 1.7-3.0 г/м3 (Лазарева и др., 2001' 48936 экз./м3, 0,68 г/м3 (Чур, 2012). -

Примечание: «-» - нет данных

В Рыбинском водохранилище исследованы: ихтиофаги (щука Es ox lucius L. судак Sander lucioperca (L.)); ихтиофаги факультативные бентофаги (налим Lota lota (L.), окунь Perca fluviatilis L.) и бентофаги (лещ Abramis brama (L.), плотва Rutilus rutilus (L.)), в Кучурганском водохранилище - рыбы, относящихся по типу питания к разным экологическим группам, а также потенциальные объекты их питания (табл. 2), в р. Днестр - бентофаг карась Caras-sius carassius (L.). В качестве консументов исследовано 245 экз. рыб (5670

Таблица 2

Гидробионты из Кучургаиского водохранилища исследованные в качестве консументов и их потенциальных- объектов питания

Консументы Объекты питания

Ихтиофаг: судак Sanderlucioperca (L.) Ихтиофаги факультативные бентофаги: окунь Percafluviatilis L. солнечный окунь Lepomis gibbosus (L.) Бентофаги: лещ Abramis brama (L.), карп Cyprinus carpioL. карась Carassius carassius(L.) тарань Rutilas rutilus heckelii (L.), красноперка Scardinius erythrophthalmus (L.) ёрш обыкновенный Gymnocep haluscernuus (L.) бычок-песочник Neogobiusfluviatilis (Pallas) рачковый зоопланктон (суммарные пробы, включающие представителей OTp.Dafmiformes, Copepoda и Ostracoda) бокоплав Amphipoda sp., личинки хирономид Chironomus sp., олигохеты Oligohaeta sp. дрейссена Dreissenapolymorpha (Pallas)

определений ферментативной активности), в качестве объектов их питания 40 экз. рыб и более 1000 экз. беспозвоночных (1260 определений).

Исследована активность протеаз и гликозидаз слизистой оболочки кишечника, химуса и энтеральной микробиоты у рыб-консументов, а также целого организма потенциальных объектов питания и их сопутствующей микробиоты в широком диапозоне значений рН. Опыты проводили в условиях in vitro. Активность протеаз (суммарная активность трипсина КФ 3.4.21.4, химотрипсина КФ 3.4.21.1 и различных пептидаз КФ 3.4.13) оценивали по приросту тирозина методом Ансона (Anson, 1938) в некоторой модификации (Кузьмина, Егорова, 1988) в диапазоне рН от 5.0 до 10.0. В качестве субстрата использовали 1% раствор казеина, приготовленный на растворе Рингера для холоднокровных животных (103 ммоль/л NaCl, 1.9 ммоль/л КС], 0.45 ммоль/л СаС12, 1.4 ммоль/л MgS04). Активность гликозидаз (суммарная активность а-амилазы КФ 3.2.1.1, у-амилазы КФ 3.2.1.3 и ферментов группы мальтаз КФ 3.2.1.20) оценивали по приросту гексоз методом Уголева и Иезуитовой (1969) в том же диапазоне значений рН. В качестве субстрата использовали 1 % раствор растворимого крахмала, приготовленный на том же растворе Рингера.Сбор материала для микробиологического анализа проводили по методу Матейса (Mattheis, 1964), а также Рихтера-Отто и Фермана (Richter-Otto, Fehrmann, 1956). Результаты обработаны статистически при помощи стандартного пакета программ (Microsoft Office ХР 2010, приложение Excel, STA-TISTICA 10). Достоверность различий оценивали при помощи однофакторно-го дисперсионного анализа (ANOVA-тест, /-"-критерий), при р£0.05.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Уровень активности протеаз и гликозидаз, функционирующих в кишечнике (слизистой оболочки, химуса и энтеральной микробиоты) рыб, в значительной мере зависит от спектра питания и расположения водоема.

2. Характер влияния рН на активность протеаз энтеральной микробиоты зависит от места обитания и вида рыб, гликозидаз — не зависит.

3. Активность иротеаз и гликозидаз целого организма потенциальных объектов питания ихтио- и бентофагов ниже или сопоставима с таковой слизистой оболочки кишечника и химуса у соответствующих видов рыб.

4. Протеазы потенциальных объектов питания рыб и, особенно, энтераль-ной микробиоты в отличие от ферментов слизистой оболочки кишечника проявляют высокую активность в зоне низких значений рН.

Публикации: По теме работы опубликовано 16 статей (в том числе 8 статей входящих в список журналов ВАК РФ).

Апробация работы. Материалы были представлены и доложены на конференциях: «Водные и наземные экосистемы: проблемы и перспективы исследований» (Вологда, 2008); «Актуальные проблемы экологической физиологии, биохимии и генетики животных» (Саранск, 2009); «Геоэкологические и биоэкологические проблемы северного Причерноморья» (Тирасполь, 2009, 2012, 2014); «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2012); «Физиологические, биохимические и молекулярно-генети-ческие механизмы адаптаций гидробионтов» (Борок, 2012).

Личный вклад автора. Сбор материала, определение активности и рН-зависимости ферментов, статистическая обработка данных выполнены лично автором в ФГБУН Институт биологии внутренних вод им. И. Д. Папанина РАН и ГОУ ВПО Приднестровский государственный университет им. Т.Г. Шевченко. Доля личного участия автора в совместных публикациях пропорциональна числу авторов.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 146 страницах машинописного текста; состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Работа включает 17 рисунков, 7 таблиц и 12 приложений. Список литературы включает 365 работ, из которых 205 на английском языке.

Благодарности. Выражаю глубокую благодарность моему научному руководителю д.б.н., профессору В.В. Кузьминой за представленную тему и неоценимую помощь на всех этапах выполнения диссертационной работы. Благодарю д.б.н. В.А. Шептицкого за помощь в организации и руководстве работой в ПТУ им.Т.Г.Шевченко. Искренне признательна д.б.н. Ю.В. Герасимову за предоставление возможности проведения экспериментальных работ в лаб. экологии рыб ФГБУН ИББВ им. И.Д. Папанина РАН, к.х.н. Т.В. Щуке за предоставление возможности проведения экспериментальных работ на каф. химии и МПХ ПГУ им. Т.Г. Шевченко, к.б.н. С.И. Филипенко за помощь в сборе материала, Т.Г. Залевской за помощь в выделении и культивировании микробиоты.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Активность иротеаз и гликозидаз функционирующих в кишечнике у рыб из разных географических зон, а также их потенциальных объектов питания и сопутствующей микробиоты

В главе представлены данные, касающиеся активности протеаз и гликозидаз слизистой оболочки кишечника, химуса и энтеральной микробиоты у

рыб из Рыбинского и Кучурганского водохранилищ, относящихся по типу питания к разным экологическим группам, при стандартной температуре (20°С) и рН (7.4), а также целого организма и сопутствующей микробиоты потенциальных объектов питания рыб Кучурганского водохранилища.

Активность протеаз слизистой оболочки кишечника, химуса и энтераль-ной микробиоты у рыб из Рыбинского и Кучурганского водохранилищ. Показано, что активности протеаз у рыб из Рыбинского водохранилища, как правило, ниже, чем у рыб Кучурганского водохранилища (табл.3).

При этом у рыб из обоих водохранилищ не всегда прослеживается зависимость активности протеаз от характера питания. Так, у рыб из Рыбинского водохранилища наиболее высокая активность протеаз слизистой оболочки выявлена у типичного ихтиофага щуки. Однако между ферментативной активностью ихтиофага судака и бентофагов плотвы и леща нет достоверных различий. В Кучурганском водохранилище максимальная активность выявлена не только у факультативного ихтиофага солнечного окуня, но и у бентофагов карася и карпа. При этом минимальная активность слизистой оболочки кишечника у рыб из обоих водоемов наблюдается у бентофага леща.

Активность протеаз энтеральной микробиоты у рыб из Рыбинского водохранилища также, как правило, значительно ниже, чем у рыб из Кучурганско-

Табпица 3

Активность протеаз слизистой оболочки кишечника, химуса и энтеральной микробиоты рыб Рыбинского и Кучурганского водохранилищ при стандартных значениях температуры (20°С) и рН (7.4), мкмоль/г-мин

Вид Активность протеаз, мкмоль/г'мин

слизистая химус энтеральная микробиота

Рыбинское водохранилище

Судак 0.47±0.08" 1.65±0.17" 1.72±0.20"

Щука 5.85±0.32° 2.38±0.12" 0.87±0.17"

Налим 2.80±0.18° 2.74±0.17° 1.75±0.13"

Окунь ].37±0.15" 1.87±0.11 " 0.58±0.20

Лещ 0.40±0.07 1.58±0.15 0.98±0.23 •

Плотва 0.34±0.05 1.67±0.17 0.46±0.15

Кучурганское водохранилище

Судак 3.68±0.234 4.7±0.274 1.62±0.134

Окунь 3.74±0.274 6.03±0.134 2.20±0.154

Солнечный окунь 8.82±0.424 9.38±0.524 6.60±0.274

Лещ 0.92±0.12 1.35±0.21 1.32±0.11

Карп 4.72±0.154 5.47±0.324 3.41±0.284

Карась 8.02±0.454 5.96±0.364 5.35±0.334

Примечание: различия достоверны между минимальной активностью протеаз и активностью протеаз у других видов рыб из Рыбинского водохранилища (я), Кучурганского водохранилища (Ь) (в столбцах), при уровне значимости р < 0,05 (А]ЧОУА-тест, /"-критерий).

го водохранилища. Максимальная активность протеаз энтеральной микробио-ты у рыб из Рыбинского водохранилища выявлена у ихтиофага судака, минимальная — у бентофага плотвы. Активность протеаз энтеральной микробиоты у рыб из Кучурганского водохранилища, как в случае слизистой и химуса, минимальна у леща, максимальна - у солнечного окуня.

Активность гликозидаз слизистой оболочки кишечника, химуса и энтеральной микробиоты у рыб из Рыбинского и Кучурганского водохранилищ. Активность гликозидаз у массовых видов рыб из Кучурганского водохранилища также, как правило, значительно выше таковой Рыбинского водохранилища (табл. 4). В отличие от активности протеаз, активность гликозидаз зависит от типа питания рыб. У рыб из Рыбинского водохранилища наиболее высокая активность гликозидаз слизистой оболочки выявлена у плотвы, минимальная - у ихтиофага судака, из Кучурганского водохранилища — у карася, а также у окуня и судака соответственно. При исследовании активности гликозидаз химуса выявлена аналогичная закономерность.

При исследовании активности гликозидаз энтеральной микробиоты у рыб Рыбинского водохранилища показано, что максимальная активность характерная для плотвы. Активность гликозидаз энтеральной микробиоты у леща близка таковой плотвы и несколько ниже судака. Соотношение активности гликозидаз энтеральной микробиоты рыб разных видов из Кучурганского водохранилища близко таковому слизистой оболочки кишечника и химуса. Максимальная активность гликозидаз энтеральной микробиоты отмечена у

Таблица 4

Активность гликозидаз слизистой оболочки кишечника, химуса и энтеральной микробиоты рыб Рыбинского и Кучурганского водохранилищ при стандартных значениях температуры (20°С) и рН (7.4), мкмоль/г-мин

Вид Активность гликозидаз, мкмоль/г-мин

слизистая химус энтеральная микробиота

Рыбинское водохранилище

Судак 0.89±0.07 1.02±0.08 4.09±0.28

Лещ 3.98±0.10° 5.02±0.12" 5.18±0.34»

Плотва 9.89±0.36" 10.81±0.38" 5.38±0.38°

Кучурганское водохранилище

Судак 1.59±0.05 0.38±0.02 3.15±0.28

Окунь 1.56±0.06 1.15±0.054 2.83±0.22

Солнечный окунь 7.56±0.364 7.27±0.364 6.30±0.284

Лещ 3.22±0.126 3.97±0.15® 6.22±0.24'

Карп 18.16±0.71* 16.86±0.62' 12.21±0.28®

Карась 32.29±0.834 27.81±0.48' 17.35±0.964

Примечание: различия достоверны между минимальной активностью гликозидаз и активностью гликозидаз у других видов рыб из Рыбинского водохранилища (а), Кучурганского водохранилища (Ь) (в столбцах), при уровне значимости р < 0,05 (/\NOVA-тест, ^-критерий).

карася. При этом достаточно высокая активность наблюдается у карпа, солнечного окуня и леща. Минимальные значения активности гликозидаз энте-ральной микробиоты характерны для судака и окуня (в 5.5 и 6.2 раза ниже, чем у карася).

Активность протеаз и гликозидаз потенциальных объектов питания рыб и сопутствующей микробиоты (на примере гидробионтов Кучурганского водохранилища). Сопоставление полученных данных показало, что потенциальные объекты питания рыб обладают активностью протеаз и гликозидаз, сопоставимой с таковой у консументов (табл. 5).

Максимальная активность протеаз обнаружена у представителей рачко-вого планктона. При этом уровень ферментативной активности в пробах суммарного зоопланктона достоверно выше, чем у ерша (в 1.6 раза), красноперки (в 1.8 раза), бокоплава (в 1.9 раза), личинок хирономид и бычка (в 2 раза), оли-гохет (в 2.1 раза), тарани (в 2.3 раза). При этом активность протеаз у тарани, красноперки, бычка, личинок хирономид, бокоплава и олигохет достоверно не различаются. У дрейссены активность тнрпсиноподобных протеаз не выявлена.

Активность протеаз сопутствующей микробиоты у разных видов потенциальных объектов питания рыб также варьирует. При этом максимальная активность протеаз выявлена у бокоплава, минимальная — у личинок хирономид. Следует отметить, что у тарани, красноперки и бычка активность протеаз сопутствующей микробиоты близка и в 2.7 раза ниже таковой у бокоплава. Активность протеаз сопутствующей микробиоты у ерша, представителей зоопланктона и олигохет достоверно ниже максимальной (в 1.3, 1.6 и 2 раза соответственно).

Таблица 5

Активность протеаз и гликозидаз потенциальных объектов питания рыб

(рыбы и беспозвоночные) и сопутствующей микробиоты при стандартных значениях температуры (20°С) и рН (7.4), мкмоль/г-мин

Потенциальные объекты питания рыб Активность протеаз Активность гликозидаз

Целый организм Сопутствующая микробиота Целый организм Сопутствующая микробиота

Тарань 2.7±0.1 0.87±0.09" 7.8±0.15" 6.2±0.14°

Красноперка 3.4±0.1" 0.86±0.07" 8.2±0.22" 4.8±0.11 °

Ёрш 4.0±0.23" 1.9±0.11 * 2.8±0.06" 3.2±0.15"

Бычок 3.2±0.23" 0.9±0.07" 6.0±0.23 • 1.7±0.08"

Личинки хирономид 3.1±0.16" 0.67±0.13 2.5±0.1" 2.8±0.11»

Дрейссена 0 0 4.6±0.12* 5.4±0.11 *

Бокоплав 3.3±0.12° 2.4±0.13° 1.7±0.08 1.4±0.12"

Олигохеты 3.0±0.13 1.2±0.1" 7.0±0.17" 5.9±0.11"

Зоопланктон 6.2±0.2° 1.5±0.09* 2.0±0.1" 1.1±0.07

Примечание: а — различия достоверны между минимальной активностью протеаз и гликозидаз и активностью протеаз и гликозидаз у других видов (в столбцах), при уровне значимости р < 0,05 (ЛХОУА-гес г).

При исследовании активности гликозидаз у тех же видов гидробионтов выявлены значительные видовые различия. При этом уровень активности гликозидаз в целом организме и сопутствующей микробиоте объектов питания рыб не зависит от их таксономической принадлежности. Так, максимальная активность гликозидаз в целом организме у красноперки в 4.8 раз выше минимальной бокоплава. Активность гликозидаз сопутствующей микробиоты также значительно варьирует. Максимальная активность гликозидаз микробиоты наблюдается у тарани, минимальная — у зоопланктона. При сопоставлении активности протеаз и гликозидаз в целом организме потенциальных объектов питания рыб было показано, что у тарани, красноперки, бычка и олигохет активность гликозидаз выше активности протеаз. У ерша, зоопланктона, личинок хирономид и бокоплава, напротив, активность протеаз выше активности гликозидаз.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о различиях в активности протеаз и особенно гликозидаз слизистой оболочки, химуса и энте-ральной микробиоты у разных видов рыб из Рыбинского и Кучурганского водохранилищ находящихся в разных географических зонах. При этом большая активность протеаз и гликозидаз, как правило, наблюдается у рыб из Кучурганского водохранилища, расположенного значительно южнее (46°36'00"с.ш., 29°58'00"в.д.) Рыбинского водохранилища (58°22'30"с.ш., 38°25'04"в.д.). Различия в уровне ферментативной активности, выявленные у рыб из этих водохранилищ, по всей вероятности, обусловлены разными условиями среды обитания рыб, в том числе различием в численности и биомассе потенциальных объектов питания рыб, различным видовым составом и численностью микробиоты, населяющей пищеварительный тракт рыб, обитающих в различных географических зонах. В кишечнике пресноводных рыб обычно преобладают микроорганизмы, принадлежащие к p.p. Aeromonas, Pseudomonas, Micrococcus, Bacillus, Bacterium, Pseudobacterium, Azotobacter и Sarcina. Иногда, обычно в загрязненных водоемах, встречаются бактерии p. Vibrio (Austin, 2006). В кишечнике рыб из Рыбинского водохранилища чаще встречаются микроорганизмы p. Pseudomonas, Bacillus, а также кокковые формы, корине-бактерии и микромицеты (Кузьмина, Скворцова, 2002). При этом, в отличие от автохтонной, или индигенной (прикрепленной) микробиоты, состав тран-зиторной (полостной) микробиоты в значительной мере зависит от изменения такового в воде и пище (Buddington et al., 1997).

В Кучурганском водохранилище максимальная активность протеаз слизистой оболочки кишечника, химуса и энтеральной микробиоты отмечена у бентофага-факультативного ихтиофага солнечного окуня. Минимальная активность протеаз у ихтиофага судака, что, возможно, объясняется тем, что солнечный окунь, будучи вселенцем, достаточно хорошо адаптирован к условиям Кучурганского водохранилища (Фулга и др., 2012), а популяция судака в последние годы деградирует (Усатый и др., 2009). Наиболее высокая активность гликозидаз у бентофага карася из Кучурганского водохранилища и у бентофага плотвы из Рыбинского водохранилища, по-видимому, обусловлена значительным содержанием в их пище углеводных компонентов. При этом

известно, что рыбы, пища которых отличается высоким содержанием углеводных компонентов, имеют более высокую активность гликозидаз (Cockson, Bourne, 1972; Кузьмина, 1985; Кузьмина, Гельман, 1998; Hidalgo et al., 1999).

Важно отметить, что активность протеаз и шикозидаз в целом организме потенциальных объектов питания рыб Кучурганского водохранилища сопоставима с таковой целого организма потенциальных объектов питания рыб Рыбинского водохранилища (Кузьмина, Голованова, 2001; Кузьмина, Сквор-Цова 2003; Кузьмина и др., 2004, Голованова, 2006, Кузьмина, 2008). Также подтверждены данные о существовании видовых различий в уровне активности гликозидаз в целом организме рыб (Голованова, 2000). Следует отметить, что активность протеаз и гликозидаз сопутствующей микробиоты потенциальных объектов питания рыб ниже таковой энтеральной микробиоты, что подтверждает точку зрения о том, что энтеральная среда более благоприятна для развития бактерий, чем окружающая среда (вода, грунты) и, по-видимому, другие среды организмов гидробионтов (Ganguly, Prasad, 2012).

2. Влияние рН на активность протеаз и гликозидаз функционирующих в кишечнике у рыб из разных географических зон, а также их потенциальных объектов питания и сопутствующей микробиоты

В главе представлены данные, касающиеся влияния рН на активность протеаз и гликозидаз слизистой оболочки кишечника, химуса и энтеральной микробиоты у рыб из Рыбинского и Кучурганского водохранилищ, относящихся по типу питания к разным экологическим группам (рис. 1-3), а также на активность протеаз и гликозидаз целого организма и сопутствующей микробиоты потенциальных объектов питания рыб Кучурганского водохранилища.

Влияние рН на активность протеаз слизистой оболочки кишечника, химуса и энтеральной микробиоты рыб разных видов из Рыбинского водохранилища. Влияние рН на активность протеаз исследованных препаратов в диапазоне значений 5.0 - 10.0 у рыб разных видов различено (рис. 1). При этом оптимум рН действия протеаз слизистой оболочки у всех видов рыб Рыбинского водохранилища соответствует 10.0. Оптимум рН действия ферментов химуса у

5 7 9 11 5 7 9 11

Рис. I. Влияние рН на активность протеаз энтеральной микробиоты (1), химуса (2) и слизистой оболочки кишечника (3) у плотвы (а) и окуня (б) из Рыбинского водохранилища. Обозначения: По оси абсцисс - значения рН, по оси ординат — активность протеаз, мкмоль/(г мин)

щуки равен 6.0, у плотвы - 7.0, у леща и налима - 8.0, у окуня и судака - 10.0. Оптимум рН действия протеаз энтеральной микробиоты у плотвы находится при 5.0, у окуня - при 6.0, у судака и щуки - при 7.0, у леща - при 8.0, у налима - при 9.0. У леща совпадает величина оптимума рН (8.0) активности протеаз энтеральной микробиоты и химуса, а у окуня и судака - слизистой оболочки и химуса (Ю.О).Уровень относительной активности протеаз энтеральной микробиоты при рН 5.0 у рыб разных видов различен. Расчеты показали, что активность протеаз у плотвы составляет 100, у леща-72, у окуня-65, налима-52, щуки 50, судака - 20% от максимальной активности, принятой за 100. В зоне рН 10 активность составляет от 35 у щуки до 89% у плотвы от максимальной, принятой за 100.

Влияние рН па активность протеаз слизистой оболочки кишечника, химуса и энтеральной микробиоты у рыб разных видов из Кучурганского водохранилища. Оптимум рН активности протеаз слизистой оболочки кишечника у всех видов, как и у рыб Рыбинского водохранилища, соответствует 10.0 (рис. 2). Оптимум рН действия ферментов химуса у всех видов рыб, кроме окуня, также равен 10.0. Оптимум рН активности протеаз химуса окуня соответствует 7.0, однако при рН 10.0 уровень ферментативной активности составляет 93% от максимальной активности. Оптимум рН действия протеаз энтеральной микробиоты у карпа находится при рН 6.0, у окуня - при 7.0, у судака - при 8.0, у солнечного окуня - при 9.0, у карася и леща - при 10.0. Важно отметить, что у карася, леща и окуня совпадает величина оптимума рН действия протеаз энтеральной микробиоты и химуса.

0

0

И

11

Рис. 2. Влияние рН на активность протеаз энтеральной микробиоты (1), химуса (2) и слизистой оболочки кишечника (3) у леща (а) и окуня (б) из Кучурганского водохранилища. Обозначения: По оси абсцисс - рН, по оси ординат - активность протеаз, мкмоль/(гмин)

Влияние рН на активность гликозидаз слизистой оболочки кишечника, химуса и энтеральной микробиоты у рыб разных видов из Рыбинского водохранилища. При исследовании активности гликозидаз у рыб разных видов, в широком диапазоне значений рН, обращает на себя внимание достаточное сходство характера влияния рН на уровень ферментативной активности в случае слизистой и различия в случае химуса. Оптимум рН действия ферментов слизистой находится при рН 7.0, химуса - колеблется от рН 6.0 у плотвы до 8.0 у леща (рис. 3).

Рис. 3. Влияние рН на активность гликозидаз энтеральной микробиоты (1), химуса (2) и слизистой оболочки кишечника (3) у плотвы (а), леща (б) и судака (в) из Рыбинского водохранилища.Обозначения: По оси абсцисс - рН, по оси ординат — активность гликозидаз, мкмоль/(г-мин)

Оптимум рН действия гликозидаз энтеральной микробиоты у рыб разных видов находится при рН 7.0. При этом у плотвы, леща и судака при рН 5 активность гликозидаз составляет 33, 37 и 34%, при рН 10 - 29, 24 и 25% максимальной активности соответственно. Важно отметить, что у всех видов рыб, независимо от типа питания, при рН 5.0 и 10.0 активность гликозидаз составляет приблизительно 1/3-1/4 от максимальной активности при рН 7.0

Влияние рН на активность гликотдаз слизистой оболочки кишечника, химуса и энтеральной микробиоты у рыб разных видов из Кучурганско-го водохранилища. У большинства видов рыб оптимум рН действия гликозидаз слизистой оболочки кишечника выше таковой химуса в зоне рН 7.0-10.0. У речного окуня, и солнечного окуня, а также у карпа и карася при рН 5.0 и 6.0 активность гликозидаз близка. При этом у судака зона высоких значений ферментативной активности слизистой и химуса уже, чем у других видов рыб. Кроме того, обращает на себя внимание достаточное сходство действия рН на активность ферментов в случае слизистой и химуса у судака, солнечно-

Рис. 4. Влияние рН на активность гликозидаз энтеральной микробиоты (1), химуса (2) и слизистой оболочки кишечника (3)у карпа (а) и судака (б) из Кучурганского водохранилища. Обозначения: По оси абсцисс - значения рН, по оси ординат — активность гликозидаз, мкмоль/(г мин)

го окуня, карпа и карася (оптимум рН 7.0). У леща оптимум рН активности гликозидаз слизистой оболочки кишечника и химуса выявлен при рН - 6.0, у окуня — 7.0 и 6.0 соответственно.

Оптимум рН действия гликозидаз энтеральной микробиоты у рыб разных видов также находится при рН 7.0.Уровень относительной активности гликозидаз кишечной микрофлоры при рН 5.0 минимален у карася (7.8%), максимален у окуня - 51% от максимальной активности при рН 7.0. У остальных видов рыб, независимо от типа питания, при этом значении рН активность составляет приблизительно 1/3-1/4 от максимальной активности.

Влияние рН на активность протеаз потенциальных объектов питания ихтиофагов и их сопутствующей микробиоты. Активность протеаз потенциальных объектов питания ихтиофагов (рыб) и микробиоты, выделенной из их целого организма при одних и тех же значениях рН, как правило, различна (рис. 5). Оптимум рН действия протеаз целого организма потенциальных объектов питания ихтиофагов находится в зоне щелочных значений. Так, оптимум рН действия протеаз у тарани и красноперки находиться при 10.0 равен, у бычка и ерша - при 8.0. При этом у всех исследованных видов в зоне рН 8.0 - 10.0 активность протеаз составляет не менее 80% от максимальной. В зоне низких значений рН (5.0) у тарани, ерша и бычка сохраняется высокая ферментативная активность, составляющая 42.5, 48.7 и 71.7% от максимальной активности соответственно. У красноперки в зоне рН 5.0 активность протеаз невелика и составляет лишь 11.3%.

Оптимум рН действия протеаз сопутствующей микробиоты объектов питания ихтиофагов варьирует в пределах 6.0-10.0. У красноперки оптимум рН активности протеаз совпадает с таковым целого организма рыб этих видов (10.0). У тарани оптимум рН активности протеаз сопутствующей микробиоты обнаружен при 7.0 и 8.0, у бычка оптимум выявлен - при рН 6.0, у ерша - при 7.0. В зоне рН 10.0 активность протеаз сопутствующей микробиоты у тарани, бычка и ерша уменьшается в 1.1, 2.6, 4.2 раза по сравнению с максимальной

а /

л-*'

11

о

Д"

_ *

п

Рис. 5. Влияние рН на активность протеаз в целом организме (1) и сопутствующей микробиоте (2) бычка (а) и тарани (б). Обозначения: По оси абсцисс - значения рН, по оси ординат - активность протеаз, мкмоль/(г-мин)

активностью соответственно. В зоне низких значений рН (5.0) ферментативная активность у тарани, ерша и бычка составляет 43.7, 62.6 и 77.9%, у красноперки—всего 14.8% от максимальной активности.

Влияние рН на активность протеаз потенциальных объектов питания бентофагов и сопутствующей микробиоты. Активность протеаз потенциальных объектов питания бентофагов и сопутствующей микробиоты при одних и тех же значениях рН значительно варьирует (рис. 6).

Максимальные значения активности протеаз у беспозвоночных находятся в зоне значений рН 8.0 - 9.0. У личинок хирономид, бокоплава и олигохет оптимум рН действия протеаз целого организма находится при рН 8.0, у представителей зоопланктона — при рН 9.0. В связи с тем, что при использовании в качестве субстрата казеина у дрейссены активность протеаз не выявлена, было исследовано влияние рН на активность протеаз по гемоглобину (НЬ). Определения показали, что у дрейссены оптимум рН активности гемопюбинлитических протеаз наблюдается при рН 8.0 и составляет 4.22±0.11мкмоль/г-мин.

При этом в зоне кислых рН (5.0) активность протеаз целого организма у всех видов беспозвоночных варьирует в пределах 33-63% максимальной активности, принятой за 100%. При рН 10.0 уровень ферментативной активности в целом организме беспозвоночных значительно различается. Так, в пробах зоопланктона и в организме бокоплава активность протеаз близка к максимальной и составляет 96 и 93% соответственно. У олигохет активность протеаз составляет 69%, у личинок хирономид и дрейссены - 33% от максимальной.

Максимальные значения активности протеаз сопутствующей микробиоты у беспозвоночных находятся в диапазоне значений рН от 6.0 до 10.0. Оптимум рН активности протеаз сопутствующей микробиоты у дрейссены выявлен при рН 6.0, у бокоплава - при рН 7.0, у олигохет - в зоне рН 8.0-9.0, у представителей зоопланктона - при рН 9.0, у личинок хирономид - при рН 10.0. При увеличении рН от 5.0 до оптимальных значений ферментативная активность протеиназ микробиоты дрейссены увеличивается в 1.1, бокоплава -в 1.2, зоопланктона - в 1.4, хирономид - в 2.3, олигохет - в 5.5 раза.

11

11

Рис. 6. Влияние рН на активность протеаз в целом организме (1) и сопутствующей

микробиоте (2) личинок хирономид (а) и бокоплава (б). Обозначения: По оси абсцисс - значения рН, по оси ординат - активность протеаз, мкмоль/(гмин)

Влияние рН на активность гликозидаз потенциальных объектов питания ихтиофагов и сопутствующей микробиоты. Оптимум рН действия гликозидаз целого организма объектов питания ихтиофагов во всех случаях наблюдается при рН 7.0. В зоне низких значений рН (5.0) относительная активность ферментов колеблется от 29% у бычка до 48% у тарани. В зоне высоких значений рН (10.0) относительные величины активности гликози-дазв целом организме у тех же видов рыб колеблются от 15% (бычок) до 41 % (тарань). Оптимум рН активности гликозидаз сопутствующей микробиоты у разных видов рыб также выявлен при рН 7.0. Активность гликозидаз сопутствующей микробиоты у рыб разных видов при одном и том же значении рН отличается от такового ферментов целого организма рыб. При этом у тарани, красноперки и бычка при рН 5.0 выявляется довольно высокий уровень ферментативной активности — соответственно 44.9, 46.2 и 57%, у ерша — лишь 12.6 % максимальной активности. В зоне высоких значений рН (10.0) только у тарани активность сохраняется на высоком уровне - 36.3%, у остальных видов не превышает 10% максимальной активности.

Влияние рН на активность гликозидаз потенциальных объектов питания бентофагов и сопутствующей микробиоты. Характер влияния рН на активность гликозидаз у всех исследованных видов беспозвоночных и их сопутствующей микробиоты достаточно близок. Максимальный уровень активности гликозидаз у всех исследованных видов беспозвоночных отмечен при рН 7.0, минимум — при рН 10.0. Вместе с тем в зоне низких значений рН, особенно при рН 5.0 наблюдаются видовые различия в уровне активности гликозидаз как у беспозвоночных, так и у сопутствующей микробиоты. Активность гликозидаз целого организма бокоплава и олигохет при рН 5.0 достоверно не различается, и составляет около 20 и 40% максимальной активности. Особо следует отметить исключительно высокий уровень относительной активности гликозидаз у микробиоты рачкового зоопланктона при рН 5.0 - 75% максимальной активности.

Таким образом, приведенные результаты свидетельствуют о том, что наибольшую активность протеазы слизистой оболочки кишечника у разных видов рыб из обоих водохранилищ проявляют в зоне рН 10.0. Максимальная активность протеаз химуса наблюдается в более широком диапазоне значений рН. В связи с этим, необходимо подчеркнуть, что в полости кишечника функционируют ферменты, синтезируемые не только поджелудочной железой и энтероцитами, но также объектами питания (Уголев, Кузьмина, 1993; Кузьмина, 2005; Kuz'mina, 2008) и энтеральной микробиотой (Лубянскене и др., 1989; Шивокене, 1989; Sugita et al„ 1997; Кузьмина, Скворцова, 2002; Кузьмина, 2000, 2005; Nayak, 2010; Ray et al., 2012; Ganguly, Prasad, 2012).

Также важно отметить разную степень пластичности ферментов энтеральной микробиоты, относящихся к различным цепям. Приведенные данные свидетельствуют о сходстве характера влияния рН на активность гликозидаз и о различии в характере влияния рН на активность протеаз, а, следовательно, о большем консерватизме первых и значительной пластичности вторых, что расширяет представления об адаптационных возможностях протеаз энтераль-

ной микробиоты у рыб. При этом, как подчеркивалось ранее (Киг'тша е! а1., 2011), в ряде случаев, в частности при низких значениях рН, протеазы микробиоты могут компенсировать относительно низкую активность протеолити-ческих ферментов, синтезируемых пищеварительной системой рыб. Различия рН действия протеаз микробиоты могут быть обусловлены как разным видовым составом, так и разным соотношением ферментов (нейтральные, щелочные и кислые протеазы), синтезируемых разными видами микроорганизмов.

Особенно важно отметить, что в работе выявлен достаточно высокий уровень активности ферментов обоих цепей при низких значениях рН в тканях у большинства исследованных потенциальных объектов питания рыб. При этом известно, что в кислой среде желудка при рН 5.5-6.0 функционируют не только ферменты пищеварительной системы объектов питания (Кузьмина, 2005; Киг' шша, Сит1оуапо\ а, 2004), но и гидролазы лизосом различных тканей (Кузьмина, Цветкова, 2001; Высоцкая, Немова, 2008). Следовательно, ферменты потенциальных объектов питания рыб могут эффективно деполимеризо-вать белковые и углеводные компоненты пищи рыб в зоне кислых значений рН. Неожиданно высокий уровень активности гликозидаз в целом организме плотвы и красноперки, а также их микробиоты, может быть обусловлен присутствием в их пшце растительных компонентов. Это предположение хорошо согласуется с данными, свидетельствующими о большем количестве амило-литических бактерий в кишечнике бентофагов-факультативных фитофагов по сравнению с эврифагами (§ууоклепб е1 а1., 1996; Шивокене и др., 1996).

3. Влияние условий среды обитания на рН зависимые характеристики слизистой оболочки кишечника, химуса и энтеральной микробиоты рыб из одной географической зоны

В главе представлены данные по влиянию условий среды обитания на активность протеаз и гликозидаз слизистой оболочки кишечника, химуса и энтеральной микробиоты карася из разных участков р.Днестр и Кучурган-ского водохранилища в широком диапазоне значений рН. Исследованы особи карася близкие по размерно-весовым характеристикам, отловленные в один и тот же период (июль) с трех станций: р. Днестр в районе г. Тирасполь (1-я станция), в Кучурганском водохранилище (2-я станция) и низовьях Днестра, недалеко от впадения реки в Днестровский лиман (3-я станция).

Влияние условий среды обитания на рН-зависимость протеаз слизистой оболочки кишечника, химуса и энтеральной микробиоты карася. Полученные данные свидетельствуют о том, что активность протеаз слизистой оболочки кишечника карася из разных мест обитания при рН 7.0 достоверно выше у рыб из р. Днестр в районе г. Тирасполь, химуса и энтеральной микробиоты — у рыб из Кучурганского водохранилища.

Сопоставление уровня ферментативной активности тех же препаратов в диапазоне рН от 5.0 до 10.0 показывает, что динамика активности протеаз слизистой оболочки и химуса у всех исследованных рыб достаточно близка - минимум активности протеаз в обоих случаях наблюдается при рН 5.0, максимум - при рН 10.0. У карасей с первой станции при рН 5.0 выявлено 36.7%

О -1-1-—1 о -1-1-1 0 -1-1—-—1

5 7 9 11 5 7 9 11 5 7 9 11

Рис. 7. Влияние рН на активность протеаз энтеральной микробиоты (1),

химуса (2) и слизистой оболочки кишечника (3) карася из р. Днестр вблизи г. Тирасполь (а), Кучурганского водохранилища (б) и р. Днестр вблизи впадения в Днестровский лиман (в).Обозначения: По оси абсцисс -значения рН, по оси ординат —активность протеаз, мкмоль/гмин

и 33.1%, второй - 30.7% и 37.9% и третьей - 42.8% и 30.2 % от максимальной активности при рН 10.0 соответственно. Относительная активность протеаз кишечной микрофлоры карасей тех же групп при рН 5.0 составила 48.5, 18.1 и 62.9 % от максимальной активности. При этом особого внимания заслуживают различие формы кривых рН-зависимости и оптимумов рН действия протеаз энтеральной микробиоты у рыб из разных мест обитания. Так, у карасей с первой станции оптимум рН действия протеаз отмечен при рН 7.0, второй - при рН 10.0, третьей - в зоне рН 6.0-8.0. У рыб с первой станции резко увеличивается ферментативная активность при рН 7.0, у рыб со второй станции наблюдаются два пика активности протеаз энтеральной микробиоты - при рН 7.0 и 10.0, а для рыб с третьей станции характерно отсутствие достоверных различий в уровне ферментативной активности в зоне рН 6.0-9.0.

Влияние условий среды обитания на рН-зависимость гликозидаз слизистой оболочки кишечника, химуса и энтеральной микробиоты карася.

Полученные данные свидетельствуют о том, что уровень активности гликозидаз слизистой оболочки и химуса у рыб с разных станций в исследованном диапазоне рН различен. При этом активность протеаз слизистой оболочки кишечника, химуса и энтеральной микробиоты при рН 7.0 достоверно выше у рыб из Кучурганского водохранилища по сравнению с таковой из разных участков р.Днестр. Сопоставление уровня ферментативной активности тех же препаратов в диапазоне рН от 5.0 до 10.0 показывает, что динамика активности гликозидаз слизистой оболочки кишечника и химуса у рыб со всех исследованных станций достаточно близка. Действительно, минимум активности гликозидаз в обоих случаях наблюдается при рН 5.0, максимум при рН 6.0 или 7.0. При рН 5.0 у карасей с первой станции активность гликозидаз слизистой оболочки и химуса составляет 39.7% и 64.3%, со второй - 33.1% и 61.8%, с третьей - 51.1% и 46.7% от максимальной активности соответственно. Относительная активность гликозидаз энтеральной микробиоты карасей с тех же станций при рН 5.0 составила лишь 1.7, 7.8 и 1.2 % от максимальной активности. При этом важно подчеркнуть, что оптимум рН действия гликозидаз эн-

теральной микробиоты у рыб из разных мест обитания, в отличие от таковых слизистой и химуса, всегда находится при рН 7.0.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что у карася со всех исследованных станций, несмотря на близкие размерно-весовые характеристики, активность протеаз и гаикозидаз слизистой оболочки кишечника, химуса и энтеральной микробиоты при одних и тех же значениях рН значительно различается. Минимальный уровень активности протеаз для большинства препаратов (кроме слизистой оболочки) при исследованных значениях рН отмечен у рыб, обитающих в р. Днестр в районе г. Тирасполь. Уровень активности гаикозидаз у рыб тех же групп иной, причем уровень активности гаикозидаз у рыб с первой станции близок таковому карасей с третьей станции, обитающих в зоне Нижнеднестровского национального природного парка, в то время как у рыб из Кучурганского водохранилища активность гаикозидаз значительно выше. Это может быть связано как с различиями в температурном режиме и кормовых ресурсах водоемов, так и с различиями в степени влияния антропогенной нагрузки на ферменты разных цепей. Вероятно, на активность протеаз в большей степени, чем на активность гаикозидаз, влияет состав стоков г.Тирасполь. Относительно низкий уровень активности протеаз энтеральной микробиоты у рыб, отловленных в районе г.Тирасполь, может быть обусловлен более бедным видовым составом и низкой численностью микроорганизмов, а также более бедной кормовой базой рыб, что связано не только с более низкой температурой воды, но и более быстрым течением по сравнению с другими участками водной системы. Компенсаторная роль протеаз, синтезируемых энтеральной микробиотой и участвующих в симбионтном пищеварении, в большей степени характерна для рыб, обитающих в р. Днестр, чем для рыб из Кучурганского водохранилища.

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Известно, что активность ферментов пищеварительного тракта рыб в значительной степени отражает их пищевую активность и спектр питания в условиях разных экосистем. Исследование характеристик разных ферментативных цепей рыб из водоемов, расположенных в разных географических зонах, значительно расширяют сведения о роли климатических условий, влияющих на состав кормовой базы и микробиоты, в процессах пищеварения у рыб. При этом значительную роль играет сопутствующая микрофлора, ассоциированная с покровами и различными тканями кормовых объектов, а также входящая в состав энтеральной микробиоты.

Полученные данные подтверждают сведения о том, что активность протеаз слизистой оболочки кишечника и химуса слабо зависит от типа питания рыб (Chakrabarti et al., 1995; Chan et al., 2004; Соловьев, 2011), активность гаикозидаз - в значительной мере зависит от типа питания рыб (Кузьмина, 1985; Hidalgo et al., 1999; Ji et al, 2012). В равной мере это относится к активности гаикозидаз и протеаз энтеральной микробиоты. Помимо этого в работе подтверждены данные, свидетельствующие о значительном сходстве характера влияния рН на активность протеаз слизистой оболочки кишечника у рыб разных видов: низкая активность в зоне кислых и высокая - в зоне щелочных значений рН (Chen et al.,

2006; Коростелев, 2006; Ji et al., 2011, Неваленый и др., 2011; Бедняков, 2014). Полученные результаты хорошо согласуются со сведениями об оптимуме рН трипсина в зоне щелочных значений рН (Yoshinaka et al., 1984; García-Carreo et al., 2002; Hau, Benjakul, 2006). При этом оптимум рН действия протеаз энтераль-ной микробиоты у рыб разных видов наблюдается в более широком диапазоне значений рН, в том числе при рН 5.0 и 6.0, по сравнению с таковым протеаз, синтезируемых пищеварительной системой рыб, оптимум рН которых находится при 10.0. В связи с этим можно предположить, что ферменты, входящие в состав энтеральной микробиоты и потенциальных объектов питания рыб, а также их сопутствующей микробиоты обладают за счет многообразия микрофлоры широкой адаптационной пластичностью, что обеспечивает значительную эффективность пищеварительного процесса у рыб в различных экологических условиях. Результаты работы подтверждают предположение о том, что протеазы микробиоты и потенциальных объектов питания у рыб, относящихся по типу питания к разным экологическим группам, особенно у бентофагов, могут компенсировать низкую активность ферментов слизистой оболочки кишечника в зоне низких значений рН (Кузьмина, Уголев, 1993). Характеристики гликозидаз более однородны. В заключение следует отметить, что выявленные различия рН зависимых характеристик протеаз играют важную роль в системе адаптаций, позволяющих рыбам разных видов эффективно осваивать кормовую базу водоемов из разных географических зон.

ВЫВОДЫ

1. Активность протеаз и гликозидаз слизистой оболочки кишечника, химуса и энтеральной микробиоты у массовых видов рыб из Кучурганского водохранилища, как правило, выше, чем у рыб из Рыбинского водохранилища, что, по всей вероятности, обусловлено более высокой температурой воды и лучшей кормовой базой.

2. Уровень активности гликозидаз слизистой оболочки кишечника и химуса у рыб из Кучурганского и Рыбинского водохранилищ зависит от типа питания рыб, уровень активности протеаз, как правило, не зависит.

3. Активность протеаз и гликозидаз в целом организме потенциальных объектов питания рыб сопоставима с таковой консументов. Активность протеаз и гликозидаз сопутствующей микробиоты потенциальных объектов питания, как правило, ниже таковой энтеральной микробиоты.

4. Характер влияния рН на активность протеаз, функционирующих в кишечнике рыб, различен. Оптимум рН действия протеаз слизистой оболочки кишечника соответствует 10.0, химуса находится в зоне рН 7-10, энтеральной микробиоты - в более широком диапазоне значений рН 5-10.

5. Условия среды обитания, в частности географическая зона расположения водоема, значительно влияют на рН зависимые характеристики протеаз химуса и энтеральной микробиоты рыб.

6. Характер влияния рН на активность протеаз целого организма потенциальных жертв зависит от таксономии вида: у рыб максимальная активность выявлена в более широком диапазоне значений рН (8.0-10.0), чем у беспоз-

воночных (pH 8.0-9.0). В зоне низких значений pH у первых сохраняется в среднем 40%, у вторых - 70% от максимальной активности.

7. Характер влияния pH на активность гликозидаз, функционирующих в кишечнике консументов и в тканях их потенциальных жертв, слабо зависит от вида гидробионтов и условий среды их обитания, протеаз, особенно энтераль-ной микробиоты, — зависит.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК РФ

1. Золотарева, Г.В. Влияние pH на активность протеиназ слизистой оболочки кишечника, химуса и энтеральной микробиоты у рыб / В.В. Кузьмина, Е.Г. Скворцова, Г.В. Золотарева, В.А. Шептицкий // Вестник АПК Верхневолжья. - 2009. - № 4. - С. 15-20

2. Zolotareva, G.V. Influence of pH upon the activity of glycosidases and proteinases of intestinal mucosa, chyme and microbiota in fish / V.V. Kuz'mina, E.G. Skvortsova, G.V. Zolotareva, V.A. Sheptitskiy // Fish Physiol. Biochem. - 2011. -V. 37.-N3.- P. 345-357.

3. Золотарева, Г.В. Активность протеиназ химуса и энтеральной микробиоты в естественном для кишечника рыб диапазоне pH / Г.В. Золотарева, В.В. Кузьмина, Т.Г. Залевская, В.А. Шептицкий//Пробл. биол. продукт, жив. -2013,- №2.-С. 85-92.

4. Золотарева, Г.В. Влияние pH на активность гликозидаз потенциальных объектов питания ихтиофагов и сопутствующей микрофлоры / Г.В. Золотарева, В.В. Кузьмина, Т.В. Щука, В.А. Шептицкий // Пробл. биол. продукт, жив. -2013.-№4.-С. 67-73.

5. Золотарева, Г.В. Влияние условий среды обитания на pH-зависимость протеиназ и гликозидаз кишечной микрофлоры карася / В.В. Кузьмина, Г.В. Золотарева, В.А. Шептицкий // Экология. - 2014. - №4. - С. 301-308.

6. Золотарева, Г.В. Влияние pH на активность протеиназ слизистой оболочки кишечника, химуса и энтеральной микробиоты у рыб из Кучурганского водохранилища / В.В.Кузьмина, Г.В. Золотарева, В.А. Шептицкий // Вопр. ихтиол. - 2014. - Т. 54. - №5. - С. 599-606.

7. Золотарева, Г.В. Активность протеиназ объектов питания и сопутствующей микробиоты рыб-бентофагов в широком диапазоне pH / Г.В. Золотарева, В.В. Кузьмина, В.А. Шептицкий // Пробл. биол. продукт, жив. - 2015. -№ 1.-С. 61-69.

8. Золотарева, Г.В. Активность протеиназ объектов питания и сопутствующей микробиоты у рыб-ихтиофагов в широком диапазоне pH / Кузьмина В.В., Золотарева Г.В., Шептицкий В.А. // Пробл. биол. продукт, жив. - 2015. -№ 1. — С. 42-52.

Работы, опубликованные в других изданиях:

9. Золотарева, Г.В. Влияние pH на активность протеиназ химуса у рыб разных экологических групп / В.В. Кузьмина, Г.В. Золотарева, В.А. Шептицкий // Водные и наземные экосистемы: проблемы и перспективы исследований.

Материалы Всероссийской конференции (24-28 ноября 2008 г., Вологда) -Вологда 2008. - С. 59-62.

10. Золотарева, Г.В. Влияние рН на амилолитическую активность химуса у рыб разных экологических групп / В.В. Кузьмина, Г.В. Золотарева, В.А. Шептицкий // Актуальные проблемы экологической физиологии, биохимии и генетики животных. Материалы II Междунар. науч. конф. (2009г., Саранск). МГУ им. Н.П. Огарева. - Саранск 2009. - С. 82-84.

11. Золотарева, Г.В. Влияние рН на протеолитическую активность эн-теральной микробиоты у рыб разных экологических групп / В.В. Кузьмина, Г.В.Золотарева, Е.Г. Скворцова, В.А. Шептицкий // Геоэкологические и биоэкологические проблемы северного Причерноморья. Материалы 3 Междунар. науч.-практ. конф., (22-23 октября 2009 г., Тирасполь) Приднестр. гос. ун-т им. Т.Г. Шевченко. - Тирасполь 2009. - С.110-112.

12. Золотарева, Г.В. Влияние рН на амилолитическую активность энте-ральной микробиоты у рыб разных экологических групп / В.В. Кузьмина, Г.В. Золотарева, Е.Г. Скворцова, В.А. Шептицкий // Геоэкологические и биоэкологические проблемы северного Причерноморья. Материалы 3 Междунар. науч.-практ. конф. (22-23 октября 2009 г. Тирасполь) Приднестр. гос. ун-т им. Т. Г. Шевченко. - Тирасполь 2009. - С. 112-115.

13. Золотарева, Г.В. Влияние типа питания рыб на характеристики про-теиназ энтеральной микробиоты / В.В. Кузьмина, Г.В. Золотарева, Е.Г. Скворцова, В.А. Шептицкий // Физиологические, биохимические и молекулярно-ге-нетические механизмы адаптации гидробионтов Материалы Всероссийской конференции с международным участием (22-27 сентября 2012 г., Борок) ИБВВ РАН. - Борок 2012. - С. 210-214.

14. Золотарева, Г.В. Влияние рН на протеолитическую активность химуса и слизистой оболочки кишечника у рыб с различным типом питания Рыбинского и Кучурганского водохранилищ / Г.В. Золотарева, В.В. Кузьмина, В.А. Шептицкий // Геоэкологические и биоэкологические проблемы северного Причерноморья: Материалы 4 Междунар. науч.-практ. конф. (9-10 ноября 2012 г., Тирасполь) Приднестр. гос. ун-т им. Т.Г. Шевченко. - Тирасполь 2012. - С.113-115.

15. Золотарева, Г.В. Роль протеиназ объектов питания и энтеральной микробиоты в адаптациях пищеварительной системы рыб и условиям функционирования / В.В. Кузьмина, М.В. Шалыгин, Г.В. Золотарева, Е.Г. Скворцова, В.А. Шептицкий // Механизмы функционирования висцеральных систем. Тезисы докладов VIII Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 220-летию со дня рожд. К.М. Бэра. (25-28 сентября 2012г., Санкт Петербург). - Санкт Петербург 2012. - С. 125-126.

16. Золотарева, Г.В. Влияние рН на активность протеиназ слизистой оболочки кишечника, химуса и энтеральной микробиоты у рыб с разным типом питания из Кучурганского водохранилища / Г.В. Золотарева, В.В. Кузьмина, В.А. Шептицкий, Т.Г. Залевская // Геоэкологические и биоэкологические проблемы северного Причерноморья: Материалы 5 Междунар. науч.-практ. конф. (14 ноября 2014 г., Тирасполь) Приднестр. гос. ун-т им. Т.Г. Шевченко. - Тирасполь 2014. - С.92-95.

Золотарева Галина Викторовна

ВЛИЯНИЕ СРЕДЫ ОБИТАНИЯ НА АКТИВНОСТЬ И рН-ЗАВИСИМОСТЬ ПИЩЕВАРИТЕЛЬНЫХ ГИДРОЛАЗ У РЫБ, ИХ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ОБЪЕКТОВ ПИТАНИЯ И МИКРОБИОТЫ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности

ИЛ № 06150. Сер. АЮ от 21.02.02. Подписано в печать 28.04.15. Формат 60 * 90/16. Усл. печ. л. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ № 562.

Отпечатано в Пзд-ве Приднестр. ун-та. 3300, г. Тирасполь, ул. Мира, 18.