Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональный анализ моноклональных антител, кроссреактивных к вирусным антигенам, при рассеянном склерозе

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональный анализ моноклональных антител, кроссреактивных к вирусным антигенам, при рассеянном склерозе"

На правах рукописи

Ломакин Яков Анатольевич

Структурно-функциональный анализ моноклональных антител, кроссреактивных к вирусным антигенам, при рассеянном

склерозе

Специальность 03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 АПР 2014

Москва - 2014

005547219

Работа выполнена в лаборатории биокатализа Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН).

Научный руководитель:

Кандидат химических наук Белогуров Алексей Анатольевич

Официальные оппоненты:

Лагарькова Мария Андреевна, доктор биологических наук, заведующий лабораторией генетических основ клеточных технологий Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук.

Тиллиб Сергей Владимирович, доктор биологических наук, руководитель лаборатории молекулярных биотехнологий Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии гена Российской академии наук (ИБГ РАН).

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук (ИМБ РАН).

Защита диссертации состоится 28.05.2014 г., в 10:00 на заседании Диссертационного совета Д 002.019.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук по адресу: 117997, ГСП-7, г. Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте www.ibch.ru Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

Автореферат разослан ОI

2014 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

д.ф.-м.н.В.А. Олейников

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

Рассеянный склероз (PC) — одно из наиболее социально и экономически значимых неврологических заболеваний современности. Особенностью PC является возникновение заболевания в основном у лиц среднего возраста, то есть молодой и трудоспособной части населения, ведущей активную социальную жизнь. Последствия заболевания за 10-15 лет приводят практически к полной потере трудоспособности, а при недостаточно эффективном и своевременном лечении — и к летальному исходу. Патогенез заболевания обусловлен разрушением миелиновой оболочки нервных волокон. При этом наблюдается активация иммунных клеток и увеличение их количества в центральной нервной системе (ЦНС), что в дальнейшем приводит к демиелинизации, аксонально-му/нейрональному повреждению и гибели олигодендроцитов, клинически проявляющемся в уменьшении нервной проводимости. Несмотря на огромное количество молекулярно-биологических данных и клинических наблюдений, к настоящему времени не удалось составить полную и однозначную картину механизма индукции рассеянного склероза. В качестве факторов, влияющих на его возникновение, называются как наследственная генетическая предрасположенность, гормональный статус организма и даже климатические условия местности, так и бактериальные или вирусные инфекции, к которым относятся вирус Эпштейн-Барра (EBV), вирус герпеса человека 6 типа (HHV6), вирус простого герпеса первого типа (HSV1), Варицелла зостер вирус (VZV), вирус TT (Torque Teno virus) и другие.

На начальных этапах изучения PC основную роль в развитии заболевания отводили Т-лимфоцитам. Но в последнее десятилетие B-клеточный ответ приобретает все большее значение в понимании этиологии и патогенеза не только PC, но и аутоиммунных заболеваний в целом. Было установлено, что наряду с продукцией патологических аутореактивных антител, участвующих в процессе демиелинизации нервного волокна, B-клетки могут способствовать как развитию воспалительного ответа, так и его подавлению путем продукции различных цитокинов. Ещё одной из основных функций B-клеток является презентация антигена, а следовательно, и активация Т-клеток. Таким образом, на сегодняшний день можно с уверенностью сказать, что для развития патологии необходима активация и B-клеточного звена. Выявление конкретного вирусного антигена, способного индуцировать выработку аутоантител к компонентам миелиновой

оболочки, возможно играющих роль в деградации нервных волокон в центральной нервной системе при РС, может оказаться весьма перспективным с точки зрения понимания механизмов развития заболевания, разработки новых подходов к терапии и диагностике данного заболевания.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ И ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В качестве основных аутоантигенов выделяют четыре белка миелиновой оболочки: основной белок миелина (ОБМ), миелин-олигодендроцитарный гли-копротеин (МОГ), протеолипидный протеин 1 (ПЛП1) и миелин-ассоциированный гликопротеин. На сегодняшний день существует целый ряд работ, демонстрирующих повышение титра антител в сыворотке крови или цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) к данным аутоантигенам при РС. Однако, последовательность этих антител и соответствующие им В-клеточные рецепторы изучены недостаточно полно, для многих из них не установлена даже конкретная специфичность. В связи с вышеизложенным выявление и анализ структур таких антител может прояснить механизм развития заболевания, а взаимнооднозначное соответствие «структура-функция» может способствовать появлению улучшенных методов диагностики и направленной терапии РС.

Для решения этой проблемы были поставлены следующие задачи:

1. Получение моноклональных одноцепочечных антител из фаг-дисплейной библиотеки РС, специфичных к основному белку миелина, и определение их структур.

2. Создание полноразмерных моноклональных иммуноглобулинов человека на основании одноцепочечных антител, связывающих основной белок миелина, и доказательство их функциональности.

3. Характеризация миелин-реактивных аутоантител больных РС.

4. Определение поли- и кроссреактивности моноклональных миелин-реактивных аутоантител больных РС.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.

В настоящей работе работе получен ряд моноклональных аутоантител к белкам миелиновой оболочки, определена их аминокислотная последовательность. Определены константы связывания антител с основным белком миелина.

Впервые показано кроссреактивное связывание вирусного и эндогенного антигенов моноклональным аутоантителом из больного РС. Полученные данные являются важным шагом в прояснении патологической роли В-клеток при РС, так как ранее кроссреактивность наблюдалась в основном на поликлональных сыворотках крови больных РС. С использованием технологии Ьиттех показана полиреактивная природа ряда отобранных анти-ОБМ антител. Полученные данные, подтверждаемые структурной гомологией отобранных антител, свидетельствуют в поддержку непосредственного участия различных вирусов в индукции РС путем механизма молекулярной мимикрии. Показано, что полиреактивность аутоантител при РС может реализовываться за счет сочетания двух цепей - тяжелой и легкой, при этом каждая из которых в большей степени отвечает за связывание своего антигена. С помощью широкомасштабного секвенирования библиотек, предобогащенных на различные антигены, определены гены зародышевой линии, характерные для аутореактивных антител, специфичных к ОБМ (ЮНУ1-69, ЮНУ6-1, ЮНУ5-51, ЮЬУЗ-19, ЮКУ1-39), вирусному белку ЬМР1 (ЮНУ1-18, ЮНУ1-3, ЮЬУ10-54, ЮЬУ1-47), а также полиреактивных антител (ЮНУ4-59 и ЮНУ1-8).

Полученные результаты вносят существенный вклад в прояснение этиологии и патогенеза рассеянного склероза. Детальное изучение данной проблемы позволит в дальнейшем использовать полученные данные для создания новых методов диагностики рассеянного склероза и создания лекарственных препаратов, направленных на элиминацию именно патогенных клеток иммунной системы.

ПУБЛИКАЦИЯ И АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

По теме диссертации опубликовано 3 статьи. Результаты диссертации были представлены на 5 международных российских и зарубежных конференциях.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 119 страницах и содержит 33 рисунка и 8 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Скрининг библиотеки на ОБМ и получение моноклональных одноцепо-чечных антител, связывающих ОБМ.

Для исследования структурно-функциональных характеристик ОБМ-связывающих антител ранее в нашей лаборатории была сконструирована фаг-дисплейная библиотека одноцепочечных рекомбинантных антител. В качестве источника генетического материала использовали лимфоциты, выделенные из периферической крови 8 доноров — больных рассеянным склерозом (ремитти-рующий-рецидивирующий тип течения).

В качестве потенциального антигена для поиска патогенных антител нами был выбран ОБМ. В литературе в течение двух последних десятилетий дебатируется вопрос о значении анти-ОБМ антител в развитии РС. По нашему мнению данный аспект требует прояснения на структурно-молекулярном уровне, в этой связи мы решили отобрать ОБМ-специфичные антитела из библиотеки больных РС, и в дальнейшем исследовать их специфичность и структурные особенности. Одной из основных трудностей при работе с ОБМ является его чрезвычайно высокий поверхностный положительный заряд. В настоящей работе для уменьшения неспецифического связывания при скрининге фаг-дисплейной библиотеки на ОБМ мы решили использовать следующие способы (рис.1 А): (1) ограниченный трипсинолиз ОБМ для понижения плотности положительного поверхностного заряда молекулы, (и) отбор на полноразмерную молекулу ОБМ с нейтрализацией положительного заряда белка добавлением гепарина, (111) и отбором в присутствии буфера с высокой ионной силой (0.5 М №С1).

Для осуществления первого подхода был проведен ограниченный трипсинолиз ОБМ. Лимитированное расщепление молекулы ОБМ после остатков лизина и аргинина понижает плотность сетки положительных зарядов молекулы и, соответственно, уменьшает уровень неспецифической сорбции. Экспериментально был подобран необходимый уровень гидролиза, при котором связывание мышиных поликлональных анти-ОБМ антител (положительный контроль) с гидролизатом ОБМ было сопоставимо со связыванием с полноразмерной молекулой ОБМ, а неспецифическое связывание с бактериофагом М13К07 - минимально. Для этого мы варьировали концентрацию трипсина от 10 мкг до 0.001 мкг на мг ОБМ (время гидролиза составляло 1 час при 37°С). На рисунке 1 Б представлены результаты ИФА связывания поликлональных антител и бакте-

риофагов М13К07 с гидролизатами ОБМ и электрофоретическое разделение этих гидролизатов. По соотношению специфического связывания к уровню фона была выбрана точка «5», соответствующая обработке ОБМ трипсином в концентрации 0.12 мкг на мг ОБМ в течение 1 часа.

Рисунок 1. А. Различные схемы биопэннинга. Б. Для дальнейшего обогащения библиотеки была подобрана степень гидролиза ОБМ трипсином. Гидролизаты ОБМ (показаны во врезке) гибридизовали с по-ликлональными ан-ти-ОБМ антителами (черная кривая) и с фагом М13К07 (серая столбчатая диаграмма). Оптимальная концентрация трипсина составила 0,12 мкг энзима на 1 мг белка (точка 5).

0001 001 0.1 1 10 Трипсин/ОБМ соотношение цд/тд

Далее каждая схема обогащения была использована для проведения 5 раундов селекции, что позволило в итоге отобрать 13 клонов одноцепочечных антител, связывающих ОБМ.

Анализ одноцепочечных антител в индивидуальном виде.

Силу связывания scFv с ОБМ оценивали методом ИФА. Все одноцепочеч-ные антитела показали достоверное связывание и специфичность по сравнению с отрицательным контролем (одноцепочечным антителом к тиреоглобулину, проэкспрессированным и очищенным в тех же условиях). Так же мы охарактеризовали количественно силу связывания отобранных антител с ОБМ методом поверхностного плазмонного резонанса (ППР). Клоны Е2 и Fl 1 связывали ОБМ с K.D близкими к наномолярным значениям (3.9-10"9 и 4.0-10"9 М, соответствен-

Специфическое взаимодействие

B5B5V6D1 D12FI1

Разрушение "сетки »житепьных заряд он"

«Ь

1Й. ,mf+

—ЩК.-**

Отобранные клоны А10Е2 E6NT5.1 WT56

NTS NT12 NT18

Высокая иная сила

Неспецифическое взаимодействие

Ба

-40БМ

но), a B5V6 с KD-1.2-10"8 М (Рис.2 Б). При этом для одноцепочечных антител D1 и Е6 KD оценить не удалось вследствие недостаточной силы связывания.

Следующей задачей было определение сайтов связывания ОБМ отобранными антителами. Для этого использовалась ранее созданная в нашей лаборатории эпитопная библиотека ОБМ, в которой молекула ОБМ была разделена на 12 перекрывающихся фрагментов длиной около 25 аминокислотных остатков. Пептиды ОБМ были интегрированы в состав слитного белка, состоящего из тиоредоксина, двух 6-гистидиновых кластеров для аффинной очистки белка и сшус-эпитопа для детекции моноклональными антителами (см. рис.2 В). В качестве отрицательного контроля была создана генетическая конструкция, не содержащая в своем составе фрагментов ОБМ, а состоящая только из элементов белка-носителя (Тгх-носитель - тиоредокин+линкер). Нам не удалось обнаружить какой-либо определенный эпитоп для антител Е2 и Fl 1, в то время как D1 и Е6 специфично взаимодействовали с фрагментами ОБМ 65—92 и 130-156 (см. рис.2 В). Анализ последовательности ОБМ выявил возможные супермотивы внутри этих эпитопов (рис.2 Г). На основе полученных данных можно предпо-

Рисунок 2. А. Связывание отобранных scFv с ОБМ, И ФА. Б. Связывание отобранных scFv с ОБМ, метод поверхностного плазменного резонанса. В. Связывание отобранных scFv с фрагментами библиотеки ОБМ, ИФА. Г. Схема эпитопной библиотеки ОБМ. Супермотив, при-сутсвующий в пептидах 6 и 11.

Е2 KD= 3.9-10"9 М

F11 KD = 4.0-10"5M 0.0

B5V6 KD = 1.2 10"8 М

"1 В

ЛV е иг* »- »* о> f j> £

эпитопная библиотека ОБМ ау Еб ND (Тгх -носитель) ИлипмЛ^^Щ

250 500 750 сек

65 rtahygslpqkshg 78 130 rasdyksahkgfkg 143

дожить, что антитела D1 и Е6 узнают линейные эпитопы ОБМ, а Е2 и Fl 1 скорее всего конформационные. Антитело B5V6 занимает промежуточное положение, взаимодействуя и с полноразмерной молекулой ОБМ и с фрагментом 130156.

Анализ пространственной модели ОБМ выявил, что найденные мотивы находятся на двух подвижных петлях 65-85 и 130-148. Таким образом предсказанный эпитоп для B5V6 так же находится в этой внешней петле. Отрицательно заряженный и в большой степени гидрофобный желобок scFv B5V6 может взаимодействовать с петлей ОБМ 136-145, выступающей на поверхности и несущей частично положительный заряд. Интересно заметить, что наши данные совпадают с результатами, описывающими распределение связывания поликло-нальных антител из сыворотки больных PC с ОБМ, где фрагменты 65-92 и 130156 были определены как иммуннодоминантные. Определение гомологии зародышевых линий

Использование фаг-дисплейной библиотеки генов иммуноглобулинов позволило не только идентифицировать индивидуальные клоны, но и охарактеризовать их структуру. Последовательности 11 полных scFv и 2 отдельных тяжелых цепей были проанализированы с помощью программы Ig BLAST для

Таблица 1. Гомология тяжелых и лёгких цепей отобранных одноцепо-чечных антител с антителами (по литературным данным) из ЦСЖ больных PC и антителами отобранными на связывание LMP1 из фаг-дисплейной библиотеки Гриффина 1. Антитела специфичные к LMP1, отобранные ранее из фаг-дисплейной библиотеки Гриффина 1 помечены курсивом. Антитела из ЦСЖ больных PC отмечены жирным шрифтом.

зародышевая зародышевая

отобранные линия гомологичные линия родственные

scFv тяжелой цепи антитела тяжелой цепи зародышевые линии

Е2 IIV3-11* MS2 HV3-11* IIV3-48*

NT12 А10 HV4-61* HV4-59* KRVHl HV7-l>*-01 HV7 -61*/-39*/-59*/-28»

Е6 HV5-51

В5 HV1-8*

NT56 HV1-18* ЕВУ CS ИМ 2-114 ИМ -4б*/-8"/-3"/-18"

B5V6 HV1-8"

NT5 HV3-23*

D1 D12 HV3-23* HV3-23* ЕВУ FS HV3-23* HV3 -43*/-64*/-53*/-48*

NT IS HV3-53*

NT5.1 IIV3-48*

Fll HV1-69* MSI HV1-69*

отобранные scFv зародышевая линия лёгкой цепи гомологичные антитела зародышевая линия лёткой цепи родственные зародьзшевыс лннззи

NT12 Е6 LV3-19* LV3-19- EBV_G5 LV3-19--01

B5V6 LV6-57*

В5 Е2 LV2-14" LV2-14* ЕВУ A4 MS2 LV2-14*-01 LV2-11* LV2 -23*/-8*/-11*

NTS KV-1-6*

Fll D12 LV1-44* LV1-44* EBI FS, B8,E2 LVl-47*-01 LV1-44*

1)1 KV3-20*

NT5.1 KV1-12* ЕВУ ИЗ lvVl-39*-01 К VI 12»/-8»Л16*

NT56 LV4-69" MSI LV4-69*

NT18 нет

Aid нет

определения ближайших зародышевых семейств для VH и VL регионов (Таблица 1). Для тяжелых цепей преобладали семейства HV1 и HV3 (соответственно 4 и 6 клонов из 13). Так же мы сравнили полученные антитела с охарактеризованными ранее из базы данных с использованием программы Protein BLAST.

В результате нами была обнаружена высокая гомология аминокислотной последовательности (до 95%) между отобранными scFv и вариабельными регионами анти-LMPl антител, отобранными ранее из библиотеки Griffin 1, и патогенных аутоантител из ЦСЖ больных PC (Рис.3). 10 тяжелых и 7 лёгких цепей из 13 отобранных scFv были схожи с анти-LMPl антителами (Таблица 1, рис.3). Обе цепи scFv D12 принадлежали тому же зародышевому семейству, что и ан-ти-LMPl антитело F5. ScFv NT5.1, NT12 и В5 состояли из комбинаций тяжелых и лёгких цепей, гомологичных к различным анти-LMPl антителам. Любопытно, что scFv NT56 содержало тяжелую цепь, гомологичную таковой для анти-LMPl антитела, и лёгкую цепь, гомологичную легкой цепи природного антитела при PC. ScFv Fil наоборот содержало цепи, гомологичные лёгкой цепи анти-LMPl антитела и тяжелой цепь антитела при PC. Наконец, scFv Е2 было гомологично антителу при PC по обеим цепям, при этом лёгкая цепь относилась к тому же зародышевому семейству, что и анти-LMPl антитело A4.

Перекрытие паттернов узнавания между отобранными scFv и существующими природными антителами, а также данные по их структурной схожести свидетельствует в пользу того, что отобранные комбинации тяжелых и лёгких цепей могут существовать у пациентов с PC, и, следовательно, скринируемая нами библиотека отражает реальную ситуацию иммунологического репертуара больных PC.

Тяжелые цепи Лёгкие цепи Рисунок 3. Гомология отобранных

scFv с ранее опубликованными антителами: жирным шрифтом отмечены антитела из ЦСЖ больных PC; курсивом отмечены антитела, связывающие LMP1 вируса Эпштейн-Барр (EBV).

— г II

— РС1

— B5/B5V6

— NT56

_I EBVJ35

~~1 EBVB8 —EBV_A4

— EBV Е2

г I I —

EBV F5 EBV 88 EBV E2 D12

i-

B5V6

a

B5

EBVA4

PC 2 ■ ©-1

NT12a EBV_G5 E6 NT5.1 NT5 EBV_H3 D1 NT56 —i PCI

Доказательсво in vitro кроссреактивности между аутоантигеном ОБМ и белком вируса Эпштейна-Барра LMP1

Структурная гомология отобранных одноцепочечных антител одновременно с антителами из ЦСЖ больных PC, и с антителами, специфичными к LMP1, привела нас к мысли проверить, возможна ли подобная кроссреактив-ность in vitro. Для этого методом Вестерн-блоттинга мы проанализировали связывание одноцепочечных антител с белками ОБМ и LMP1 (Рис.4 А). В качестве препарата LMP1 мы использовали эукариотические клетки НЕК293, экспресси-рующие рекомбинантный LMP1, нетрансфицированную линию клеток использовали в качестве отрицательного контроля. Нам удалось показать, что scFv Е2 взаимодействует и с LMP1, и с ОБМ. Для доказательства того, что детектируемое связывание scFv с ОБМ не является результатом неправильного фолдинга, необходимо было воспроизвести эксперимент на полноразмерных IgG.

scFv Е2

а-ОБМ a-LMP1

мышиное a-LMP1

tf? ^ jt БСА ОБМ LMP1- LMP1H

/

лО

LMP1- LMP1+ LMP1- LMPH

■4LMP1

►<«Лц

О^М ^ Проскок Элюат

Рисунок 4. (А) Вестерн-блот анализ связывания всРу Е2 с ОБМ и ЬМР1. Реком-бинантное человеческое антитело Е2 специфично связывает ОБМ (В) и иммун-ноприцепитирует ЬМР1 из раствора(В).

В случае полноразмерного антитела Е2 методом вестерн-блоттинга нам так же удалось показать одновременное связывание ОБМ (рис.4 В) и осаждение ЬМР1 этим антителом из раствора (рис.4 Б). Таким образом, нами впервые было показано кроссреактивное связывание вирусного и эндогенного антигенов монокло-

нальным аутоантителом из больного PC. Полученные данные являются важным шагом в прояснении патологической роли В-клеток при PC, так как ранее крос-среактивность наблюдалась в основном на поликлональных сыворотках крови больных PC. Наши данные подтверждают гипотезу о молекулярной мимикрии в основе механизма развития PC. Возможно предположить, что антитела, первично образованные на LMP1 во время инфекции EBV, потенциально кроссреак-тивны к ОБМ и тем самым могут служить триггерами развития заболевания. Рациональный анализ комбинаций тяжелых и легких цепей анти-ОБМ антител, полученных комбинаторным подходом.

Несмотря на то, что мы проверили и доказали функциональность отобранных scFv в виде полноразмерных антител, существует достаточно большая вероятность того, что в организме больного конкретно таких комбинаций тяжелой и лёгкой цепи может не встречаться. Это связано со способом получения комбинаторных библиотек, когда VH и VL репертуары пациентов с PC случайным образом объединяется, создавая при этом вероятно новые комбинации антител, не существующие в организме больного. В связи с этим нами была поставлена задача проверить, как изменятся характеристики рациональных комбинаций отобранных VH и VL. Для комбинаторного анализа мы выбрали антитела А10, В5, B5V6, Е2, Fl 1, из которых у антител В5 и B5V6 одинаковые тяжелые цепи, а у антитела А10 присутствует только тяжелая цепь, всего 16 вариантов. Дополнительно мы добавили несколько контрольных комбинаций с цепями антител другой специфичности (А 17 и ТГ антитела из библиотеки Griffin 1 специфичные к фосфонату и тиреоглобулину, соответственно). Описанные выше комбинированные антитела были получены путем котрансфекции плазмид, кодирующие соответствующие тяжелые и легкие цепи, в эукариотические клетки линии СНО К-1. Далее препараты антител очищали с помощью аффинной хроматографии на смоле protein G.

Изучение изменения уровня кроссреактивности в зависимости от комбинации цепей с использованием технологии Luminex

Существует значительное количество работ, постулирующих, что различные пептиды, в большинстве своем вирусной или бактериальной природы, могут потенциально мимикрировать под эпитопы ОБМ. В этой связи нам представлялось интересным охарактеризовать профиль кроссреактивности комбинированных антител к ОБМ. Для этого мы использовали технологию Luminex. На магнитные микросферы был иммобилизован ряд аутоантигенов при PC

(ОБМ, МОГ, РЬР1, ДНК), пептидная библиотека ОБМ, потенциальные аутоан-тигены при глаукоме (ЕЫО-1, ОЯТ, а-фодрин, актин, а-криеталлин, ОАРОН, тимозин Р4, ЬЕОР), некоторые вирусные белки (ЕВУ 1шр1, HBsAg, СМУрР38, Н8У-1 §С1), а так же лизоцим и гистон Н1. Результаты, представленные на Рисунке 5, свидетельствуют, что профиль кроссреактивности большинства исследуемых аутоантител в основном характеризуется связыванием основных белков и пептидов. Более 70% всех комбинаций связывают лизоцим (р1 9.4) и РЬР1 (р1 8.7). Сравнение комбинаций с одинаковой тяжелой цепью выявило, что крос-среактивность антитела довольно сильно зависела от спаренной лёгкой цепи, в то время как связывание ОБМ в основном определялось тяжелой цепью. Например, ни одна тяжелая иррелевантная цепь в комбинации с лёгкой цепью анти-ОБМ антитела (ТН-Е2 и А17-Е2) не имела способности связывать ОБМ, с другой стороны, тяжелая цепь, специфичная к ОБМ, в паре с иррелевантной лёгкой цепью показывала высокую аффинность к ОБМ 1-Й1 и 1-А17).

из т гч ш т гч ;

Г

8 _ i

* Г-, м -О X « о §

Т-9-? а* $ х — — — О

и.и.и.РР<шшшшшшшоэттт£т х

1 рер!

рер2

о рерЗ

£ рер4

о

рерб

1 рер7

т рер8

X рер9

5 £ рер 10

с рер) 1

рер 12

1тх носитель

Р|_Р|

МОГ

НВ^Ад

1.МР1

а-РаЬ

биотин

ОБМ

стрептаеидин

ЕВУ пептццы

ББОНА

актин

а-кристалпин

(ЗАРОН

а-форрин

65Т

ЬЕбР

тимозин р4

СМУрРЗв

Н5У-) дС

лиюцим

пугсые течки

БСА

гистон Н1

Рисунок 5. Профиль кросс-реактивности аутоантител к ОБМ. Исследовали изменения профиля кроссреактивности от замены лёгких цепей по связыванию с эпи-топной библиотекой ОБМ и с 23 канди-датными аутоантиге-нами с помощью технологии Ьипнпех. Изменение цвета от зеленого до красного соответствует увеличению силы связывания. Заглавными и строчными буквы обозначены УН и УЬ соответственно.

Изучения изменения аффиности к антигену (ОБМ) путем измерения констант диссоциации с использованием метода поверхностного плазменного резонанса

Для более точной и достоверной характеризации силы связывания исследуемых антител мы использовали технику поверхностного плазмонного резонанса (ППР). Для этого препарат ОБМ был ковалентно иммобилизован за аминогруппы на поверхности соответствующего чипа. Образцы антител наносили в потоке при различных концентрациях в произвольном порядке для подтверждения независимости последовательных экспериментов друг от друга. На одном чипе проводили не более 10 экспериментов, так как при большем числе последовательных регенераций поверхности чипа результаты становились недостоверными, возможно из-за нарушения фолдинга ОБМ. А

к„, 1/4 5-10 "3 -

изменение легких цепей N п тяжепая цепь_ легкая цепь К о, М

10 5 106 10 7 108

5-102 5-103 5-10" 5*105 k,l/Ms

F11

О О (DO О

В 5 \

о о ♦

А10

к,, уровень флуктуации

kd, i/s 5-10 3

изменение тяжелых цепей Nn тяжепая цель _пегная цепь [)'

10s 10-® 10"'

FU 95% С! оооо

А10

о©а> оо о

Е2

S

п, "X Ó

5-10' 5-102 5-10J S-10"5 5.10* |< l/Ms 0.01 0.1 1 10 100

kd .уровень флуктуации

Рисунок 6. Изменение аффиности к ОБМ при варьировании тяжелых и лёгких цепей согласно результатам ППР (BIACORE).

При расчете динамических констант связывания (Ыкл) мы учитывали сенсо-граммы полной раститровки, так как значения, полученные при обработке одной кривой, могут на порядок отличиться от реальных констант связывания и диссоциации. Для более наглядной визуализации результатов мы построили графики (Рис.6 А), в координатах кл - кл где дополнительно проведены линии фиксированных значениий КО, соответсвующие частному к-., и кл. Из рисунка 6 очевидно, что (1) в целом диапазон изменения ка больше, чем таковой для кл\ (2) для кластеров, образованных иммуноглобулинами с одинаковыми УН, но разными УЬ характерен меньший разброс значений ка и к а, чем для вариантов с разными УН и одинаковыми УЬ. Данный факт приводит к тому, что в случае одинаковых тяжелых цепей кластеры пролегают вдоль линий фиксированных КО, а не перпендикулярно им. Это свидетельствует о существенно меньшем разбросе результирующей КБ у комбинаций антител с одинаковой тяжелой цепью, а значит, более стабильной аффинностью по отношению к ОБМ. Важно, что диапазон колебания кв явно уменьшается при увеличении длины Н-СОЮ Биоинформатический анализ аутореактивных ТйС

Для более полного понимания природы образования патогенных антител к ОБМ мы хотели прояснить, являются ли отобранные антитела продуктом ан-тиген-обусловленного созревания или всего лишь результатом рандомного мутагенеза. Для этого последовательности тяжёлых цепей антител, отобранных к ОБМ, и контрольных антител (А 17, ТГ) были проанализированы для определения вероятности именно соматических гипермутаций, а не случайных мутаций до встречи В-клеток с патогеном. На Рисунке 7 показана частота соматических мутаций на каждые 1000 п.о. и собственно сама вероятность антиген-обусловленного созревания. Для ее оценки учитывалось отношение замен в Н-СОЯ1 и Н-СОЯ2 (ЯСОЯ) к общему числу мутаций в вариабельном регионе (МУ). Коричневая и серая области соответствуют 90% и 95% доверительными интервалами области случайных мутаций. Таким образом, точки, выходящие за эти области, имеют повышенное содержание направленных замен гипервариабельных участках, что можно считать результатом взаимодействия с антигеном. Результаты анализа свидетельствуют о том, что два (А10 и 1) из четырех исследованных клона стали специфически связывать ОБМ после встречи с антигеном, которым вероятно мог служить белок вирусной или бактериальной природы, что подтверждает теорию молекулярной мимикрии.

антиген-обусловленное созревание 95% CI случайных мутаций 90% CI случайных мутаций

Рисунок 7. Частота соматических мутаций на 1000 п.о. (левый рисунок) и анализ антиген-обусловленного созревания антител (правый рисунок). Отношение мутационных замен в H-CDR1 и Н-CDR2 (RCDR) к общему числу мутаций в ва-20 зо 40 риабельном ре-

количество всех мутаций (Mv) гионе (MV) относительно MV. Серая и коричневая области соответствуют 95% и 90% вероятности случайной мутации. Расположение точки над верхней границей доверительного интервала, является признаком антиген-обусловленного созревания.

В ходе данной работы мы так же проанализировали представленность и структуру антител, отобранных на основные аутоантигены PC - ОБМ и МОГ, а также на вирусный белок LMP-1. С этой целью мы дополнительно провели по два раунда обогащения на МОГ и LMP-1 (на ОБМ обогащение проведено ранее), а для поиска кроссреактивных антител - последовательно два раунда биопэннинга на LMP-1, а затем два раунда на ОБМ. Все обогащения проводили под контролем поликлонального ИФА. После процедуры селекции мы проанализировали полученные одноцепочечные антитела в составе фаговых частиц методом моноклонального ИФА. Клон считали положительным, если его сигнал на связывание с одним или двумя антигенами в ИФА превышал минимум в 3 раза сигнал бактерифага М13К07, используемого в качестве отрицательного контроля (в титре 1013 фаговых частиц/лунку). Способность конкретных фаговых клонов связывать оба антигена подтверждена путем проведения не менее трех независимых ИФА.В результате было отобрано несколько фаговых клонов, несущих одноцепочечные антитела, которые наиболее эффективно связывали LMP-1 или LMP-1/OEM. Их аминокислотные последовательности гипервариабельных участков (CDR3) и принадлежность к генам зародышевой линии представлены в таблице 2.

Таблица2. Одноцепочечные антитела, отобранные после двух раундов фагового дисплея на соответсвующие антигены. IX в названии клона обозначает, что клон отобран на ЬМР-1.

Отбор na L-MP1/ OEM ___ г I Ml' I с обм

имя клоня Vh Dli Jh &CDR3 4L JL L-CDR3

Ь7 IGHYl-2*04 icaroi-26*oi 10114*02 YRGSTYSPSGYTOr' BKY5 2*01 IGKJ2*01 LQHDNFP + ++

¡¡10 rcsvi-3*oi IGIIM 13*01 IGTO4*02 AMTEGLSGIAAPÍBY IGKV4-1*01 IGKJ4*01 QQYFSSPLI + ±

hi IGHVI 8*01 IGHD4 17*01 IGHJ6*03 AREVSDKDYGm Y1MDY ICKY3 20*01 IGKJS'Ol QQYCCSPrr ± ±

fil IGHV1-S*01 IGHD4-17*01 ГСШб*03 AHEYSDYSDYG3D\-raiDY IGIVM4*01 IGU3*02 AAWDGSLNGP ± ±

lili IGHYl 18*04 1GHD3 3*02 1(ЛШ*01 ARRŒGJ-YnSPGlTCY IGLY3 21*03 1GU7*02 R\AVDKQIYSRSG ± +

el! icmi 46*01 ICHD4-ll*0l K3U6*02 AHRGfDY IGKY1-33*01 raaroi LQFYEFPYT ± ±

cil IGHYl 46*03 ICMD5 12*01 iau6*03 AKDLRPRDIGDMDV IGKY1-39*01 IGKJ5*01 OOSYSSP ± +

rl2 IGHY1-69*06 IGHI)1-26*01 KHI6*02 ARfratRSHYFYCMDY Ш1 47*01 IGU7*01 AAWDDSLSG ± +

:l!. ГСИ'З 7*01 IGHD4 11*01 1GHJ6*02 YRGGLGAGADY IGLY4 69*01 I(U7*01 OTWGTCJ + ++

c3 icm'4-b*oi ГСЯШ 21*01 ICH75*01 AGLTOSSHNDAN IGKY2-30*01 tGKTl'Ol »IQATmYP £ +

ni(=clLL) IGLV1 47*01 IGU3*02 YAWDDNLSG ±

c2 K3LV3-1*01 IGLI7*01 AAWDDSLNGPY ± ±

di IGLY6-57*01 IGJJ7*01 OSYNTSUI ± ±

il IGLV10-54*01 ICLJ3*02 SYWDSSLSA ±

отбор на LMP 1

h4LL IGHY3-23*01 IGHD6 13*01 IGH12*01 AKDIAAAATIPEY IGKY3-11*01 IGKJ5*01 QQRSMVPPT +++ na

cl 2 LL IGHY5 51*01 IGHD417*01 IGTO4*03 ARFYDS TGS CDY IGKY1IL33*01 1GKJ2*02 SUQXKFPLXC +++ tto.

iHLLg3 LL, bj UL - IGLY147*01 I0j7*01 AAWDDSLSG +++ ao.

elLL(=fll) KLV1 47*01 IGLJ3*02 YAWDDNLSG +++ И.О.

d2 LL (=al) IGLV10-54*01 IGLI3*02 SYVUJSSLSA +++ H.O.

Широкомасштабное секвенирование.

Параллельно с анализом функционально отобранных антител, для расширения панели исследуемых моноклонов и лучшей статистической достоверности мы использовали метод широкомасштабного секвенирования. С использованием оборудования Illumina MiSeq определено около 100 ООО последовательностей из исходной библиотеки и из каждой пре-селектированной суб-библиотеи (по 50000 для тяжелых и легких цепей). Для них была проведена идентификация генотипа IgV, IgHD и IgJ локусов. IgV и CDR3 тяжелой или лёгкой цепи были обнаружены практически во всех клонах. Последовательности без CDR3 исключались из дальнейшего анализа. Всего из пяти библиотек получили 44357 последовательностей для тяжелых цепей иммуноглобулинов и 49001 последовательностей для лёгких цепей, включая 24476 для каппа и 24525 для лямбда цепей. После исключения повторностей осталось 20674 уникальных

VH и 26242 уникальных VL. Количество уникальных последовательностей для каждой отдельной библиотеки варьировалось от 2499 до 10074 для VH и от 857 до 8466 для VL.

изначальная фаг-дисплейная библиотека одноцепочечных антител больных PC

Тяжелые цепи

scFv

бактериофаг

LMP1-ОБМ-специфичные

^ i-04

2 раунда

2 раунда

(GHVI-e'Ol #

IGHV4—59*07 K3HV4-59*07 ^ KSHVl-S-Ol IGHVl-l 8*04 ^

/Г

ОБМ-специфичные

-3*01

Лёгкие цепи

LMPI-OBM-специфичные

Анализ широкомасштабным секвенированием

j полиреактивный

Х IGHV1—8*01

IGHV1 —69*01 ./'/ IGHV6—1*01 С/ IGHV5—51 *01

тж °

IGLV10-54*01 IG LV1-47*01

IGHV4—59*07

ОБМ-специфичные

л*

IS

Рисунок 8. Описание фаг-дисплейных библиотек одноцепочечных антител, обогащенных на ОБМ, ЬМР-1 и МОГ, с помощью метода широкомасштабного се-квенирования. (А) Схема обогащения фаг-дисплейной библиотеки РС одноцепочечных антител. (Б) Преобладание специфических зародышевых семейств в отдельных библиотеках по сравнению с остальными для УН (верхняя диаграмма) и УЬ (нижняя диаграмма). Здесь и на рис (В) подписанны зародышевые семейства, являющиеся аутлайнерами при попарном сравнении библиотек. (В) Выявление из исходной библиотеки РС специфических зародышевых семейств, для которых намечена тенденция к взаимодействию с различными антигенами. Здесь и на рисунке обогащенные библиотеки на ОБМ выделены розовым, на ЬМР-1 салатовым, а одновременно на ОБМ и ЬМР-1сиреневым цветом.

Полученные в результате широкомасштабного секвенирования последовательности были выровнены с последовательностями антител из базы данных 1МОТ с помощью программы ШСТ/У-ОиЕЗТ, а затем результаты выравнива-

ний были отфильтрованы для избавления от артефактов (процент гомологии с предсказанным зародышевым семейством должен был составлять не менее 70%, функциональность последовательности и критерий «одна аллель — для одного гипервариабельного участка»). В дальнейшем анализировали только отфильтрованные результаты секвенирования. Для анализа эффективности отбора были проведены 8 сравнений: каждая обогащенная библиотека против исходной библиотеки PC, LMP1/OBM против ОБМ и LMP1 библиотек, МОГ против ОБМ и LMP1 против ОБМ библиотеки. Для каждой пары библиотек применяли линейный анализ для сравнения представленности всех аллелей в этих двух библиотеках. В результате (рис.8 Б, В) зародышевые семейства IGHV 1-3*01, IGHV1-18*04, IGLV 10-54*01, IGLV1-47*01 были определены как LMP1-реактивные; IGHV1-69*01, IGHV5-51*01, IGHV6-1*01 и IGLV3-19*01, IGKV1-39*01 как ОБМ-реактивные; IGHV4-59*07 показал кроссреактивные характеристики, а для IGHV1—8*01 были обнаружены полиреактивные свойства, так как это семейство было обнаружено во всех обогащенных библиотеках.

Итоговое количество обнаруженных IgHV варьируется от 36 до 54, включая 4 псевдогена и 12 непрофильных генов (noncore genes), т.е. гены, которые встречаются только у некоторых, а не у всех индивидуумов. Значимое увеличение встречаемости по сравнению с предыдущими данными по здоровым донорам было обнаружено для IGHV1-24, IGHV1-69, IGHV1-8, IGHV5-51, и IGHV6-1. Сравнительный анализ показал, что в случае ОБМ и LMP1 спектр зародышевых семейств для VH примерно совпадает с распределением начальной библиотеки РС, особенно для сегментов VH4. В случае антител к МОГ наиболее распространены зародышевые семейства VH IGHV1-69, IGHV1-8 и IGHV3-30. Необходимо заметить, что IGHV4-39 и IGHV4-59 преобладают в библиотеке LMP-1/OBM. Сравнительный количественный анализ показал, что клоны, ам-плифицированные на МОГ, в основном представлены IGHV1-8 и IGHV1-69 сегментами, а клоны, амплифицированные на ОБМ и LMP-1 в основном относятся к IGHV4-59, IGHV5-51, IGHV3-23 и IGHV4-59 сегментам.

Далее был проведен анализ отобранных антител по встречаемости CDR3 для тяжелых и легких цепей, а также определены абсолютные заряды наиболее эффективно отобранных CDR3. Сравнительному анализу подвергали представленность различных CDR3 в обогащенных библиотеках по сравнению с начальной библиотекой РС, считая мерой представленности CDR3 общее число последовательностей, несущих этот CDR3. На рисунке 9 приведена представленность

СОЯЗ-антител, полученных с помощью функционального отбора (таблица 2). Точки выброса, находящиеся выше регрессионной линии, соответствуют положительному отбору на данный С1ЖЗ (он значительно преобладает в этом отборе по сравнению с остальными СОЯЗ), а точки выброса ниже этой линии - отрицательному отбору на них. Нас, в первую очередь, интересовали положительные выбросы, так как они были первыми кандидатами на функционально значимые С О КЗ в каждом отборе. Как и ожидалось, среди распространенных (по количеству встречаемости) С1ЖЗ преобладает большая часть клонов, выбранных после функционального отбора с помощью моноклонального фагового ИФА. Причем видно, что клоны Ы и е11 имеют СТЖЗ тяжелой цепи, обладающий повышенной полиреактивностью, так как частота его встречаемости увеличена во всех четырех обогащенных библиотеках по сравнению с исходной. СБЯЗ клона Ы1 амплифицировался в библиотеках ОБМ, ЬМР-1, ЬМР-1/ОБМ, что может характеризовать его как часть кроссреактивного паратопа для двух общих эпитопов именно у ОБМ и ЬМР-1. С другой стороны, довольно интерес

О 100 200 300 ,00 6М О 1М> 2Ю 300 «0 И0 0 <00 2Ш ЭМ 4Ш 500 О ТОО 200 300 «0 МО

Рисунок 9. Сравнение встречаемости СО!*3 тяжелых цепей в обогащенных библиотеках по сравнению с исходной библиотекой РС. На представленных точечных диаграммах каждая точка обозначает СБИЗ с определенной последовательностью; по оси X отложено количество прочтений для этого С О КЗ в библиотеке РС, а по оси У - в соответствующей обогащенной библиотеке.

ной представляется ситуация, когда согласно анализу встречаемости H-CDR3 явный отбор по связыванию ОБМ и LMP-1 прошла последовательность ARGATSTRLLSRRGHAFDV, но методом моноклонапьного фагового ИФА мы не получили ни одного антитела с таким CDR3. Возможным объяснением может служить ограниченное число клонов, анализируемое при фаговом ИФА вручную. Подобная ситуация может возникнуть и в результате невысокой аффинности конкретного фагового клона к двум антигенам в формате монокло-нального ИФА (низкий сигнал при ИФА), в результате чего данный клон не был выбран для дальнейшего анализа. Среди легких цепей потенциальной повышенной кроссреактивностью между ОБМ и МОГ обладал CDR3 клона е12. При этом он был эффективно отобран и в библиотеке ЬМР-1/ОБМ после обогащения на ОБМ, хотя при одиночном обогащении на LMP-1 не наблюдалось эффективного отбора на данный CDR3.

Дополнительно мы проанализировали, как изменяется длина CDR3 в процессе обогащения по сравнению с исходной библиотекой. При этом мы учитывали частоту встречаемости каждого уникального клона. Для тяжелых цепей при обогащение на МОГ характерно увеличения числа антител с CDR3 длиной 18 а.а., а для кросс-реактивных клонов к ОБМ и LMP1 увеличение CDR3 с длиной 7 или 19 а.о.. Интересно, что по отдельности для LMP1 характерно увеличение CDR3 с длиной 7 а.о., а для ОБМ - с 19 а.о., то есть кроссреактивные клоны объединили эти характеристики.

Взаимодействие двух белков во многом обусловлено наличием заряда в области их соприкосновения. Так как у антитела наибольшую роль в формировании сайта связывания играет CDR3, мы решили оценить вклад электростатических взаимодействий данного региона в специфичность связывания при отборе на разные антигены, а также в отборе кроссреактивных клонов. С этой целью мы определили частоту встречаемости CDR3 с разными зарядами для тяжелых и легких цепей (рис.10), учитывая количество прочтений для каждой последовательности. Можно отметить, что в библиотеке, обогащенной на МОГ, практически на треть уменьшилось количество нейтрально заряженных CDR3 тяжелых цепей и в 7 раз увеличилось количество CDR3 с суммарным высоким отрицательным зарядом (-4 и больше) во многом за счет сокращения положительного заряда (+1). В отборе на остальные антигены наблюдается смещение суммарного заряда в высокозаряженные области как положительные (+4), так и отрицательные (-4). Для легких цепей, в основном, наблюдается уменьшение количе-

ства нейтрально заряженных и увеличение слабоотрицательных СБЯЗ (-1 - у ОБМ, МОГ, двойного обогащения ЬМР-1/ОБМ и -1-2 у ЬМР-1). Из этих данных можно сделать вывод, что хотя изначально в библиотеке антител больных РС (РС на рис. 10), в некоторой степени отражающей распределение антител в организме больного, преобладают и иммуноглобулины с нейтральными СБЯЗ, тенденцию к проявлению аутореактивности в основном имеют антитела с заряженными остатками в антигенсвязывающих центрах. Причем у тяжелых цепей по сравнению с легкими наблюдается большее смещение заряда в крайние области по модулю - как в положительную, так и в отрицательную стороны. Это может свидетельствовать о более активном участии тяжелой цепи в формировании сайта связывания.

Рисунок 10. Распределение суммарного заряда CDR3 в библиотеках, обогащенных на разные антигены для тяжелых (А) и легких (Б) цепей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

На наш взгляд, высокая гомология антител, способных связывать ОБМ, с противовирусными антителами потенциально указывает на то, что первичной мишенью для подобных антител может служить ряд вирусных белков. Необходимо отметить, что наряду с потенциально патогенными кроссреактивными клетками активируются и нормальные клетки имунной системы, направленные только на элиминацию вируса. Таким образом, далеко не все клетки, активированные вирусом, при попадании в ЦНС могут инициировать разрушение мие-линовой оболочки. В результате работы нами определены гены зародышевой

линии, для которой характерна продукции именно патогенных кроссреактивных антител. На наш взгляд, для возникновения РС и активации патогенных В-клеток, наряду с генетическими и экологическими факторами, необходимо наличие не какого-либо определенного экзогенного патогена, а его способность, проникая в ЦНС, увлекать за собой клетки иммунной системы, что в итоге приводит к их «множественной и беспорядочной» активации.

Рисунок 11. Предполагаемый механизм развития РС на основании полученных результатов и литературных данных.

выводы.

1. В результате проведенной работы был отобран ряд одноцепочечных антител к ОБМ из фаг-дисплейной библиотеки больных PC. Впервые продемонстрирована in vitro кросс-реактивность полученного аутореактивного моноклонального IgG Е2 по отношению к ОБМ и вирусному белку LMP1.

2. С использованием технологии Luminex показана полиреактивная природа ряда отобранных анти-ОБМ антител. Полученные данные, подтверждаемые структурной гомологией отобранных антител, свидетельствуют в поддержку непосредственного участия различных вирусов в индукции PC путем механизма молекулярной мимикрии.

3. Показано, что полиреактивность аутоантител при PC может реализовываться за счет сочетания двух цепей — тяжелой и легкой, при этом каждая из которых в большей степени отвечает за связывание своего антигена.

4. С помощью широкомасштабного секвенирования библиотек, предобогащен-ных на различные антигены, определены гены зародышевой линии, характерные для аутореактивных антител, специфичных к ОБМ (IGHV1-69, IGHV6-1, IGHV5-51, IGLV3-19, IGKV1-39), вирусному белку - LMP1 (IGHV1-18, IGHV1-3, IGLV10-54, IGLV1-47), а также полиреактивных антител (IGHV4-59 и IGHV1-8).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Статьи:

1. Gabibov A.G., Belogurov A.A. Jr, Lomakin Y.A., Zakharova M.Y., Avakyan M.E., Dubrovskaya V.V., Smirnov I.V., Ivanov A.S., Molnar A.A., Gurtsevitch V.E., Diduk S.V., Smirnova K.V., Avalle В., Sharanova S.N., Tramontano A., Friboulet A., Boyko A.N., Ponomarenko N.A., Tikunova N.V.. Combinatorial antibody library from multiple sclerosis patients reveals antibodies that cross-react with myelin basic protein and EBV antigen. FASEB J. 2011 Dec;25(12):4211-21. Epub 2011 Aug 22. '

2. Я.А. Ломакин, М.Ю. Захарова, A.A. Белогуров, H.A. Быкова, M.A. Дронина, A.E. Тупикин, В.Д. Кнорре, А.Н. Бойко, А.В. Фаворов, М.Р. Кабилов, Н.А. По-номаренко, А.Г. Габибов. Полиреактивные аутоантитела при рассеянном склерозе: функциональный отбор из фаг-дисплейной библиотеки в сочетании с методом широкомасштабного секвенирования. ACTA NATURAE, том 5, №4 (19) 2013,104-115.

3. Y.A. Lomakin, M.Y. Zakharova, A.V. Stepanov, M.A. Dronina, I.V. Smirnov, T.V. Bobik, A.Y. Pyrkov, N.V. Tikunova, S.N. Sharanova, V.M. Boitsov, S.Y. Vyazmin, M.R. Kabilov, A.E. Tupikin, A.N. Krasnov, N.A. Bykova, Y.A. Medvedeva, M.V. Fridman, A.V. Favorov, N.A. Ponomarenko, M.V. Dubina, A.N. Boyko, V.V. Vlassov, A.A. Belogurov Jr. and A.G. Gabibov. Heavy-light chain interrelations of MS-associated immunoglobulins probed by deep sequencing and rational variation. Mol. Immunol. 2014 Feb 14 (In Press, Corrected Proof pii: S0161-5890(14)00023-6. doi: 10.1016/j.molimm.2014.01.013.).

Опубликованные тезисы конференций и доклады:

1. Yakov A. Lomakin, Alexey A. Belogurov Jr., Maria Yu. Zakharova, Natalia A. Ponomarenko, Nina V. Tikunova, A.G. Gabibov. Human anti-MBP monoclonal antibodies crossreact with LMP1 (EBV protein). Late Abstracts FEBS Journal, Volume 279, Issue si, September 2012, Pages: 600-608.

2. Lomakin Y.A Zaharova M.Y., Belogurov A.A. Jr., Avakyan M.E., Ponomarenko N.A.,Gabibov A.G. Anti-myelin basic protein antibodies selected from ScFv phage display library based on lymphocytes derived from Multiple Sclerosis patients have structural homology with MS-associated natural autoantibodies. Poster presentation. Biocatalysis 2009: Fundamentals & Applications, June 19-24, 2009, Arkhangelsk, Russian Federation.

3. Ломакин Я.А., Захарова М.Ю., Белогуров A.A., Быкова Н.А., Фаворов А.В., Кабилов М.Р., Поиомаренко Н.А., Габибов А.Г. Изучение зависимости свойств иммуноглобулинов от длины CDR3 тяжелой цепи на примере больных рассеянным склерозом. Доклад. XXVI зимняя молодежная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», 10-14 февраля (2014), Москва, Российская Федерация.

4. Ломакин Я.А., Захарова М.Ю., Белогуров А.А., Тикунова Н.В., Пономаренко Н.А., Габибов А.Г .Кросс-реактивность антител, отобранных из фаг-дисплейной библиотеки больных рассеянным склерозом на основной белок миелина с lmpl вируса эпштейна-барр Постер. Научная конференция «X чтения памяти академика Ю.А.Овчинникова», 14-17 ноября (2011), Москва - Пущино, Российская Федерация.

5. Ломакин Я.А., Захарова М.Ю., Белогуров А.А., Авакян М.Э., Дубровская В.В., Пономаренко Н.А., Тикунова Н.В., Габибов А.Г. Кроссреактивность антител, отобранных из фаг-дисплейной библиотеки больных рассеянным склерозом на основной белок миелина с LMP1 вируса Эпштейн-Барр Постерная презентация. V Российский симпозиум «Белки и пептиды» Петрозаводск, 8-12 августа 2011 г.

Заказ № 77-Р/03/2014 Подписано в печать 19.03.14 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76 www.cfr.ru; е-тай: info@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ломакин, Яков Анатольевич, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

04201457494

На правах рукописи

Ломакин Яков Анатольевич

«Структурно-функциональный анализ моноклональных антител, кроссреактивных к вирусным антигенам, при рассеянном склерозе»

Специальность

03.01.03 Молекулярная биология

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: к.х.н. Белогуров A.A.

Москва-2014

Оглавление

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ...........................................................................................................3

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ..................................................................................................4

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................................................7

1. Рассеянный склероз........................................................................................................7

1.1 Роль Т-клеток в развитии и патологии рассеянного склероза....................................9

1.2 Роль В-клеток в развитии и патологии рассеянного склероза..................................14

1.3 Структурные особенности CDR и проблема кроссреактивности антител..............18

1.4 Этиология рассеянного склероза.................................................................................22

1.5 Вирусное влияние на развитие Рассеянного Склероза (Инфекционные факторы окружающей среды)............................................................................................................24

1.5.1 Вирус Эпштейн-Барр.............................................................................................27

1.5.2 Человеческий вирус герпеса 6...............................................................................31

1.5.3 Вирус ветряной оспы.............................................................................................32

1.5.4 Вирус Торке Тено...................................................................................................32

1.5.5 Цитомегаловирус....................................................................................................33

1.5.6 Вирус простого герпеса.........................................................................................34

1.5.7 Человеческий эндогенный ретровирус (HERV)..................................................34

2. Комбинаторные библиотеки.......................................................................................36

2.1 Комбинаторные фаговые библиотеки антител человека...........................................36

2.2 Конструирование иммунных библиотек.....................................................................41

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ...........................................................................................44

1. Проверка функциональности фаг-дисплейной библиотеки репертуара одноцепочечных антител больных рассеянным склерозом............................................44

2. Скрининг библиотеки на ОБМ и получение моноклональных одноцепочечных антител, связывающих ОБМ..............................................................................................46

3. Анализ полученных одноцепочечных антител, связывающих ОБМ.........................49

3.1 Анализ одноцепочечных анти-ОБМ антител, экспонированных на бактериофаге....................................................................................................................49

3.2 Анализ одноцепочечных антител в индивидуальном виде...................................50

3.3 Определение гомологии зародышевых линий........................................................54

4. Получение полноразмерных человеческих антител на основе одноцепочечных антител, связывающих ОБМ..............................................................................................58

4.1 Доказательство in vitro кроссреактивности между аутоантигеном ОБМ и белком вируса Эпштейна-Барр LMP1.........................................................................................58

5. Рациональный анализ комбинаций тяжелых и легких цепей анти-ОБМ антител, полученных комбинаторным подходом............................................................................60

5.1 Изучение изменения уровня кроссреактивности в зависимости от комбинации цепей с использованием технологии Luminex..............................................................61

5.2 Изучения изменения аффиности к антигену (ОБМ) путем измерения констант диссоциации с использованием метода поверхностного плазмонного резонанса ...64

6. Биоинформатический анализ аутореактивных IgG......................................................67

7. Широкомасштабное секвенирование............................................................................73

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.......................................................................................................86

Работа с нуклеиновыми кислотами...................................................................................86

Амплификация фрагментов ДНК методом полимеразной цепной реакции.............86

Рестрикция.......................................................................................................................86

Лигирование.....................................................................................................................86

Выделение плазмидной ДНК................^......................................................................87

П

Электрофорез ДНК в агарозном геле............................................................................88

Электрофорез ДНК в полиакриламидном геле............................................................88

Электроэлюция................................................................................................................89

Секвенирование плазмидной ДНК................................................................................89

Широкомасштабное секвенирование генов вариабельных участков Vh/Vl из фаг-дисплейных библиотек...................................................................................................89

Параметры фильтров для анализа встречаемости гипервариабельных участков.....90

Создание генетических конструкций для экспрессии рекомбинантных одноцепочечных антител................................................................................................90

Создание генетических конструкций для экспрессии рекомбинантных полноразмерных антител................................................................................................91

РАБОТА С БЕЛКАМИ.......................................................................................................92

Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле.......................................92

Окрашивание ПААГ........................................................................................................93

Иммуноблоттинг..............................................................................................................93

Иммуноферментный анализ...........................................................................................94

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ ПРОЦЕДУРЫ.....................................................................95

Выделение и очистка рекомбинантных антител..........................................................95

Очистка рекомбинантных одноцепочечных антител (scFv).......................................95

Выделение и очистка рекомбинантных фьюжн-белков trx-обм пептидов................96

Обращенно-фазовая хроматография.............................................................................97

Молекулярное моделирование.......................................................................................97

Метод поверхностного плазмонного резонанса...........................................................98

Анализ кроссреактивности антител с использованием технологии Luminex...........98

МЕТОДЫ РАБОТЫ С БАКТЕРИЯМИ ESCHERICHIA COLI........................................99

Получение электрокомпетентных клеток.....................................................................99

Трансформация клеток E.coli методом электропорации.............................................99

ПЦР с колоний...............................................................................................................100

Ночная культура............................................................................................................101

Приготовление музейного штамма..............................................................................101

Экспрессия рекомбинантных белков МОГ, пептидов ОБМ в клетках Е. Coli........101

РАБОТА С ФАГАМИ.......................................................................................................101

Амплификация библиотеки..........................................................................................101

Обогащение библиотеки фаговыми антителами.......................................................102

МЕТОДЫ РАБОТЫ С ЭУКАРИОТИЧЕСКИМИ КЛЕТКАМИ..................................103

Ведение культуры эукариотических клеток линии СНО и НЕК-293 ......................103

Приготовление музея эукариотических клеток..........................................................104

Выведение линии эукариотических клеток из заморозки.........................................104

Трансфицирование эукариотических клеток методом липофекции........................104

ВЫВОДЫ...................................................................................................................................106

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................107

ПРИЛОЖЕНИЕ.........................................................................................................................119

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

At - антитело

АПК - антигенпредставляющая клетка ВЭБ - вирус Эпштейн-Барр

ГКГС (МНС) - главный комплекс гистосовместимости

ГЭБ - гематоэнцефалический барьер

ГЦ - герминативный центр

ДМСО - диметилсульфоксид

ДНК - дезокси-рибонуклеиновая кислота

ДСН - додецилсульфат натрия

ЭАЭ - экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит

ИЛ - интерлейкин

ИМ - инфекционный мононуклеоз

ИФА - иммунно-ферментный анализ

ИФНб - интерферон-бета

кДа - килодальтон

МОГ - миелин-олигодендроцитарный гликопротеин

ОБМ - основный белок миелина

ПААГ - полиакриламидный гель

ПДРФ - полиморфизм длин рестриктовых фрагментов

ПК - плазматическая клетка

ПЛП - протеолипидный протеин

111 IP - поверхностно-плазмонный резонанс

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ЦНС - центральная нервная система

ЦСЖ - цереброспинальная жидкость

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

PC - рассеянный склероз

CDR - англ. complementarity determining region

EBNA-1 - англ. Epstein Barr nuclear antigen 1

IgG - иммуноглобулины класса G

IPTG - изопропил-p-D-1 -тиогалактопиранозид

LMP1- англ. latent membrane protein 1

scFv - одноцепочечное антитело {англ. single chain fragment variable) Th - Т-хелперы

Tr, Treg - Т-регуляторные клетки

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Рассеянный склероз (PC) - одно из наиболее социально и экономически значимых неврологических заболеваний современности. Особенностью PC является возникновение заболевания в основном у лиц среднего возраста, то есть молодой и трудоспособной части населения, ведущей активную социальную жизнь. Последствия заболевания за 10-15 лет приводят практически к полной потере трудоспособности, а при недостаточно эффективном и своевременном лечении - и к летальному исходу. Патогенез заболевания обусловлен разрушением миелиновой оболочки нервных волокон. При этом наблюдается активация иммунных клеток и увеличение их количества в центральной нервной системе (ЦНС), что в дальнейшем приводит к демиелинизации, аксональному/нейрональному повреждению и гибели олигодендроцитов, клинически проявляющемся в уменьшении нервной проводимости. Несмотря на огромное количество молекулярно-биологических данных и клинических наблюдений, к настоящему времени не удалось составить полную и однозначную картину механизма индукции рассеянного склероза. В качестве факторов, влияющих на его возникновение, называются как наследственная генетическая предрасположенность, гормональный статус организма и даже климатические условия местности, так и бактериальные или вирусные инфекции, к которым относятся вирус Эпштейн-Барр (EBV), вирус герпеса человека 6 типа (HHV6), вирус простого герпеса первого типа (HSV1), Варицелла зостер вирус (VZV), вирус TT (Torque Teno virus) и другие.

К сожалению, пробелы в знании этиологии PC приводят к отсутствию эффективной терапии данного заболевания. Современные лекарственные средства, оказывая супрессирующее влияние на иммунные клетки и процессы воспаления, уменьшают частоту обострений и в целом лишь замедляют развитие заболевания. Наиболее широко применяемые методы лечения основаны на введении пациентам с PC противовоспалительного дитокина бета-интерферона. Хорошо известен препарат Копаксон (глатимер ацетата) -

конкурирующий с собственными антигенами за связывание с антиген-презентирующими клетками (АПК), или Новантрон, подавляющий пролиферацию Т, В-кпеток и макрофагов путем ингибирования синтеза ДНК и РНК. В последнее время перспективной выглядит терапия моноклонапьными антителами, в том числе направленная и на элиминацию В-клеток. Стоит отметить, что подобные моноклональные антитела нацелены на уменьшение иммунных и воспалительных процессов путем тотального уничтожения или подавления функций целых популяций иммунных клеток, что приводит к негативному влиянию на иммунную систему в целом. В последнее время становится очевидным, что для направленной элиминации именно патогенных аутореактивных клеток необходимо знание специфических маркеров, характерных для этих клеток.

На начальных этапах изучения РС основную роль в развитии заболевания отводили Т-лимфоцитам. Но в последнее десятилетие В-клеточный ответ приобретает все большее значение в понимании этиологии и патогенеза не только РС, но и аутоиммунных заболеваний в целом. Было установлено, что наряду с продукцией патологических аутореактивных антител, участвующих в процессе демиелинизации нервного волокна, В-клетки могут способствовать как развитию воспалительного ответа, так и его подавлению путем продукции различных цитокинов. Ещё одной из основных функций В-клеток является презентация антигена, а следовательно, и активация Т-клеток. Таким образом, на сегодняшний день можно с уверенностью сказать, что для развития патологии необходима активация и В-клеточного звена. Выявление конкретного вирусного антигена, способного индуцировать выработку аутоантител к компонентам миелиновой оболочки, возможно играющих роль в деградации нервных волокон в центральной нервной системе при РС, может оказаться весьма перспективным с точки зрения понимания механизмов развития заболевания, разработки новых подходов к терапии и диагностике данного заболевания.

В качестве основных аутоантигенов выделяют четыре белка миелиновой

оболочки: основной белок миелина (ОБМ), миелин-олигодендроцитарный

5

гликопротеин (МОГ), протеолипидный протеин 1 (ПЛП1) и миелин-ассоциированный гликопротеин. На сегодняшний день существует целый ряд работ, демонстрирующих повышение титра антител в сыворотке крови или цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) к данным аутоантигенам при РС. Однако, последовательность этих антител и соответствующие им В-клеточные рецепторы изучены недостаточно полно, для многих из них не установлена даже конкретная специфичность. В связи с вышеизложенным выявление и анализ структур таких антител может прояснить механизм развития заболевания, а взаимно-однозначное соответствие «структура-функция» может способствовать появлению улучшенных методов диагностики и направленной терапии РС.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Рассеянный склероз

Рассеянный склероз - хроническое воспалительное демиелинизирующее заболевание центральной нервной системы, поражающее в основном людей молодого и среднего возраста [1]. При частоте 3 случая на 10000 человек населения РС является наиболее широко распространённым демиелинизирующим нейровоспалительным

заболеванием, при котором по пока непонятным причинам иммунная система организма начинает разрушать собственные миелиновые оболочки [2]. В мире насчитывается более 2.5 млн людей, страдающих от этого недуга [1]. Рассеянный склероз является одним из самых дорогостоящих неврологических заболеваний. Например, в США средние затраты на лечение одного больного РС в год составляют около 30 тысяч долларов.

Различают четыре типа развития заболевания - ремитирующий, рецидивно-ремиттирующий, вторичный прогрессирующий и первичный прогрессирующий рассеянный склероз. В 80% случаев развитие заболевания начинается с рецидивно-ремитирующего течения, для которого характерно чередование периодов обострения и восстановления. Высокая частота обострений (42-57%) не позволяет полностью восстановить функции нейрорегуляции, что приводит к перманентным нарушениям. Со временем в течение 6-10 лет у 30-40% пациентов РС переходит во вторично-прогрессирующее течение [3]. Значительно реже, в 20% случаев, РС сразу же принимает первично-прогрессирующую форму [4].

Как уже упоминалось, на сегодняшний день не существует способа полного излечения от РС. Чаще всего в терапии РС применяют иммуномодуляторный подход, чтобы предотвратить инфильтрацию лейкоцитов и тем самым образование новых бляшек. Тем не менее, способа восстановления уже существующих бляшек на настоящий момент не найдено [5]. Несколько препаратов бета-интерферонов (Бетаферон, Ребиф, Авонекс, Экставиа) были одобрены ББА и ЕМЕА, однако они могут вызывать побочные

7

эффекты, вынуждая до 20% пациентов прекратить лечение или даже приводя к заболеваниям мозга[6]. С успехом в клиническую практику вводят глюкокортикоиды для подавления обострений и препарат мидантан (амантадин) для уменьшения апатии. Разработаны и другие противовоспалительные препараты, замедляющие развитие РС, такие как Новантрон (синтетическое производное антрацендиона), который, встраиваясь в молекулы ДНК, блокирует процессы репликации и транскрипции и, тем самым, подавляет пролиферацию Т, В-клеток и макрофагов или Копаксон (глатимер ацетата) - чей механизм действия до конца не известен, но предполагается, что он конкурирует с ОБМ за связывание с главным комплексом гистосовместимости II класса (ГКГС), тем самым изменяя баланс ТЬ1-ТЬ2 ответа в сторону ТЫ, что приводит к уменьшению воспаления, опосредованного Т-клетками. Стоит отметить, что терапия моноклональными антителами в практике имеет ряд преимуществ из-за специфичности узнаваемых мишеней и непревзойденной стабильности полноразмерных антител в кровотоке, уменьшая тем самым побочные эффекты и частоту применения за счет продления времени действия препарата (до нескольких недель или даже месяцев). Создаются вакцины, направленные на элиминацию аутореактивных В-клеток, среди которых наиболее известен уже зарегистрированный препарат - р�