Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Аномалии ядер и кариотическая стабильность клеток млекопитающих

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Кравцов, Вячеслав Юрьевич, Санкт-Петербург-Пушкин

сззднум BAU Po ci:

•iL.- М.Л9&..Ш

sub ct

7Л. уч:

„ .

'ii?;aBACz:z;x ВАК ?•

<:- '{. -...'У

ВСЕРОССИЙСКИ! НАУЧНО-ИООЛЕДОВАТЕЛЬОКИИ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ

И РАЗВЕДЕНИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ РАСХН ВСЕРОССИЙСКИЙ ЦЕНТР ЭКСТРЕННОЙ И РАДИАЦИОННОЙ МЕДИЦИНЫ

МЧС РОССИИ

На правах рукописи

КРАВ Ц О В Вячеслав Юрьевич

>

УДК 575:616-008 , 086.3.576.358.599.

АНОМАЛИИ ЯДЕР И КАРИОТИПИЧЕСКАЯ СТАБИЛЬНОСТЬ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ

Специальность 03.00.15 - Генетика

Д и с с е р т а ц и я на соискание ученой степени доктора биологических наук

КОНСУЛЬТАНТЫ: Доктор биологиче ских наук, профе с с ор, За служенный де ятель науки РФ А.ф. -Яковлев Доктор медицинских наук, профе с с ор А.М.Никифоров

Санкт-Петероург - Пушкин 1998

ООДЕРШАНИЕ

зтр,

р, р тг тт 17 п и тг в

и и ¡¿Ц ¿-г АХ лгХ иляявяаввввявваявяяяваавввввваввяаявваяаввваяаявввв*-*

X х ЖАЕХ АХ^ ваяяв=**»в8ЯВЯ8яввяввяаввяввяя*аваааяяя:к»в = вяХ'-4-:

1.1. Аномалии ядер клеток как возможный показатель кариотипической гетерогености в клеточных

по гт.у А в»вяяявяв»»ввяаввяааав»я*вяяяв = »вяя**в«звпявв11Е_-1

1.1.1. Морфология и биохимия микроядер, Механизмы образования микроядер

5 КЛ8 ТгС ей X вяявавввахяавяавявввяяавяяввваваяяаяХТ'

1.1.2. К вопросу о судьбе микроядер в клетках.......26

1.1.3. Микроядерный тест в клеточных популяциях.____29

1.1.4. Хромосомные мосты в клеточных популяциях. =,. * .35

1.1.5. Морфологические аномалии ядер типа

а«вавввв8вяв»ваавваввввяввяв*вавваяв Г

1.1.6. Аномалии интерфазных ядер опухолевых

■ы 11Й'Т'П1-г 39

ЛЬ^ЛЬ-* Л- их!: .....я... ................ ........ ...... -I—Г

1.2. Кариотшическая гетерогенностьть, кариотипичвекая

нестабильность и злокачественность

популяций опухолевых клеток.............................42

1.3. Морфологические изменения ядер клеток, индуцированные ионизирующей радиацией...................54

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДУ.

3, РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ......................................85

3.1. Клетки с микроядрами в клеточных

популяциях in vivo клонов рабдомиосаркомы РА-2 крыс и внутрибрюшиныых узлов миеломы sp 2^0 мышей........... 85

3.2. Мешклональные различия in vivo в клеточных популяциях субштаммов рабдомиосаркомы РА-2 крыс по признаку "частота клеток с микроядрами"......................=89

3.3. Отбор в клеточных популяциях рабдомиосаркомы РА-2

крыс по признаку "частот клеток с микро ядрами"-......... 99

3.3.1. Отбор клонов рабдомиосаркомы субштамма РА-23 крыс на повышение частоты встречаемости в них клеток с мшроядрами. ....................................99

3.3.2. Отбор клонов рабдомиосаркомы субштамма РА-23 крыс на понижение частоты встречаемости в них клеток с микроядрами............................106

3.3.3. Коэффициент реализованной наследуемости признака "частота клеток с микроядрами" в клеточных популяциях рабдомиосаркомы крыс субштамма РА-23.................................111

3.4. Сравнительный анализ показателей кариотипической нестабильности в клеточных популяциях клонов РА-23 с повышенными и с пониженными в результате отбора частотами клеток с микроядрами.........................114

3.5. ИнтерФазные клетки с хромосомными мостами В клеточных популяциях in vivo клонов

рабдомиосаркомы РА-2 крыс............................. 125

3.6. Отбор в клеточных популяциях рабдомиосаркомы РА-2 крыс по признаку

"частот клеток с хромосомными мостами".................127

3.6.1= Внутриклональная вариабельность признака "частота клеток с хромосомными мостами" и межклональные различия по этому признаку в клеточных популяциях рабдомиосаркомы

РД—9, тшын

X лГХ л/ 2. V ■и-'вииявваааааввавававаааввавввввававв

3.6.3. Отбор клонов рабдомиосаркомы субштамма РА-23 крыс на повышение частоты встречаемости в них клеток с хромосомными мостами................

■1 оп

•1 "О

3.6.3. Отбор клонов рабдомиосаркомы субштамма РА-23 крыс на понижение частоты встречаемости в них клеток с хромосомными мостами.................

3.6.4. Коэффициент реализованной наследуемости п" признака "-частота клеток с хромосомными мостами" в клеточных популяциях рабдомиосаркомы

субштамма РА-23.................................. 142

3.7. Сравнительный анализ показателей кариотипической

нестабильности в клеточных популяциях клонов РА-23 с повышенными и с пониженными в результате отбора

частотами клеток с хромосомными мостами.............

3.Метастатический потенциал и частота клеток с аномальными ядрами в клеточных популяциях рабдомиосаркомы РА-2 крыс...........................

3.8.1. Метастатический потенциал клеток клонов субштамма РА-23 при отборе на повышение и при отборе на понижение частоты клеток с микроядрами.....................................хи/

3.8.2. Метастатический потенциал клонов субштамма РА-22 с высокими и низкими частотами клеток с микроядрами...............

л л г~

14ьО

1 Р7/

3,8=3. Метастатический потенциал клеток клонов

субштамма РА-23, при отборе на повышение и при отборе на понижение частоты клеток с хромосомными мостами............................164

3.9. "Yt»

■.хвостатые" ядра в клеточных популяциях субштамма РА-23.................166

3.10. Отбор внутрибрюшинных узлов перевивной миеломы sp zso мышей по признаку "частота клеток с микроядрами".......175

3.11. Сравнительный анализ показателей кариотипической нестабильности в клеточных популяциях внутрибрюшинных узлов миеломы sp а^о после отбора на повышение и

на понижение частоты клеток с микроядрами..............182

3.12. Исследуемые морфологические аномалии ядер

ело i uk крови ««»»вяяяяяяяяяяявяяяяявяявяяяяяввввяьяиваоз!. о _1_

3.13. Исследование состояния хроматина "хвостатых" ядер лимфоцитов периферической крови........................206

3.14. "Хвостатые" ядра в популяциях лимфоцитов после культивирования in vitro...............................218

3.15. Частоты встречаемости лимфоцитов и эритробластов с аномалиями ядер in vivo мышей после Х-облучения различными дозами .............................................222

3.16. Аномалии ядер клеток периферической крови in vivo у здоровых доноров и облученных пациентов____...........229

3.16.1. Частота встречаемости эритроцитов с микроядрами в периферической крови у облученных пациентов и

здоровых доноров.............................229

3.16.2. Частота встречаемости лимфоцитов с "хвостатыми" ядрами в периферической крови у

о ОС

облученных пациентов и здоровых доноров... 3,16.3. Частота встречаемости лимфоцитов периферической крови с микроядрами в популяциях облученных пациентов и здоровых доноров...

3.17. Частоты лимфоцитов с дицентрическими хромосомами

у облученных пациентов.........................................................244

3.18. Аномалии ядер клеток периферической крови у крупного рогатого скота в норме и при лейкозе................... 248

3.18.1. Частота встречаемости эритроцитов

с микроядрами в периферической крови у крупного рогатого скота СКРО)....____......248

3.18.2. Частота встречаемости эритроцитов

с микроядрами в костном мозге коров........... 251

3.13.3. Частоты встречаемости лимфоцитов

с аномалиями ядер в периферической крови РИД-позитивных коров, коров с гематологической стадией лейкоза

т* Хк ТТП"ПМй О ЦО

лЗь ¿3 Ди • ввааааявваввавяваяя&жваяяааваавааав*

, УБ |М ,¿.{,1^ 1 .ц^И-ЕЛ аавяаавяаяаввяяяаяяваяяааввваяяявяяяяяваяввяяяяавяя ЬЛЪ^К-?

п и р, П ТТ Ц ОПрз

Ат*? 1_-1 X—- V ¡¿-^ 1Л ваваяаавяявваавязвваяявавяахваваяаваавяввяваавааяввяя '_--__-*„-'

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРИЛОЖЕНИЯ.____..............................307

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..........................................308

БЛАГОДАРНОСТИ.

окр.,

ВВЕДЕНИЕ

К настоящему времени подавляющее большинство цитогенети-ческих исследований, направленных на выявление частот встречаемости хромосомных аберраций в клеточных популяциях, проводится с использованием методов» требующих предварительного культивирования клеток в условиях m vitro. Однако, частоты хромосомных аберраций» выявленные одним и тем же методом в клеточных популяциях in vitro и in vivo не совпадают (Бочков, 1971). Накопление знании о динамике возникновения кариотипических нарушений и распространения аберрантных клонов в клеточных популяциях in vivo (на Фоне несоизмеримо большего объема информации, накопленного с использованием методов in vitro) представляется на настоящем этапе развития биологии принципиально важным. Такая информация может быть получена путем изучения частот встречаемости клеток с определенными видами морфологических аномалий ядер, поскольку установлено, что значительная часть спектра хромосомных аберраций после завершения деления клеток приводит к Формированию морфологически измененных ядер (Алов, 1972). Наличие клеток с аномальными ядрами может указывать на тот Факт, что клетки, в которых возникли хромосомные аберрации, делятся и изменяют кариотипический профиль популяций. Следует сразу признать, что цитогенетические тесты m vivo, основанные на учете определенных морфологических изменений ядер, совсем не исключают классический метаФазный метод учета хромосомных аберраций, а наоборот могут дополнять его, облегчая выявление случаев с повышенными частотами хромосомных аберраций.

К наиболее информативным показателям, характеризующим

морфологические аномалии ядер, которые возникают в результате кариотипиче ских нарушений, могут быть отнесены микроядра, хромосомные мосты и "хвостатые" ядра. Микроядра в клетках образуются в процессе деления из хромосомного материала, потерявшего контакт с веретеном митотического аппарата. Они включают в себя хроматин либо ацентрических Фрагментов, либо целых хромосом (хроматид). Частота встречаемости клеток с микроядрами свидетельствует о частоте возникновения клеток с измененными кариотипами и является базовым показателем в микроядерном тесте с Muíier, streffer, 1995}. Хромосомные аберрации дицентрического типа приводят к Формированию клеток с хромосомными мостами (Алов, 1972). Известно также, что дицентрические хромосомы, являясь маркерами радиационных воздействий, часто образуют хромосомные мосты, после разрыва которых в интерфазе Формируются клетки с полумостами или, говоря иначе, с "хвостатыми" ядрами (ПрокоФьева-Бельговская, 1981).

Для изучения аномалий ядер и установления их взаимосвязи с цитогенетическим гомеостазом в клеточных популяциях in vivo представляются интересными и перспективными программы селекции, направленные как на повышение, так и на понижение частот спонтанного образования клеток с аномальными ядрами. В ходе реализации таких селекционных программ должны проявиться причинно-следственные связи между кариотипической изменчивостью и Формированием аномальных ядер в клеточных популяциях, а данные о динамике отбора позволят определить вклад наследственных и средовых Факторов, обусловливающих кариотипиче скую изменчивость. Метод отбора на генетическую стабилизацию и дестабилизацию клеточных популяций имеет как

практическое значение для биотехнологии, так и научный интерес , поскольку полученные в результате такой селекции сублинии, контрастные по признаку "частота клеток с аномальными ядрами", могут оказаться удобной моделью для Фундаментальных исследований мутационного процесса.

Изучение аномалий ядер в клеточных популяциях ±n vivo может представлять интерес в радиобиологических исследованиях, поскольку известно, что воздействие ионизирующей радиации на клеточные популяции приводит к появлению в них клеток с аномально измененными ядрами с Лаптева-Попова и др., 1959; Dienstbier et al . » 1964; ГдуЗМЭН И Др. , 1992). К НЗС~ тоящему времени известен достаточно широкий спектр морфологических типов ядерных аномалий, однако их классификация и полные сведения об их генезе отсутствуют. Большой интерес, на наш взгляд, вызывает такой вид аномалии, при которой ядро имеет достаточно длинный хроматиновый вырост в пространство цитоплазмы и выглядит внешне как "хвостатое" ядро. Возможно, что появление "хвостатых" ядер связано с возникновением дшдентрических хромосом и поэтому метод, основанный на определении частоты встречаемости клеток с "хвостатыми" ядрами, в перспективе может быть использован в радиационно-эпидемиологических исследованиях, так как опыт ликвидации последствий радиационных аварий показал необходимость разработки и внедрения краткосрочных информативных методов для обследования облученного контингента с Г.уськова, 1996э. Однако, для внедрения такого метода в практику требуется детальное изучение аномалий типа "хвостатых" ядер, включающее исследования возможных цитогенетических механизмов их образования, морфологических особенностей, а также определе-

ние фоновых частот встречаемости клеток с "хвостатыми" ядрами в популяциях человека и животных.

Исходя из сказанного выше, изучение аномальных ядер в клеточных популяциях m vivo представляется актуальным. Новые знания о мутационном процессе могут быть получены путем проведения клонального анализа и селекции по признакам, маниФестирующим аномалии ядер. Вместе с тем, очевидно, что наряду с общепризнанным методом учета аномалий ядер -микроядерным тестом, существует перспектива для развития новых методов, основанных на учете других Форм аномалий ядра.

Поэтому целью настоящей работы явилось изучение морфологических аномалий ядер, указывающих на сдвиги цитогенети-ческого гомеостаза в популяциях нормальных и злокачественных клеток млекопитающих. Основное внимание предполагалось уделить селекции клеточных популяций m vivo по признаку "частота встречаемости клеток с аномальными ядрами" и разработке нового метода, основанного на определении "хвостатых" ядер

В КЛеТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ ir» vivo.

При этом были поставлены следующие задачи:

1. Изучить Фенотипическую и наследственную гетерогенность клонов перевивной рабдомиосаркомы РА-2 крыс по признакам "частота клеток с микроядрами" и "частота клеток с хромосомными мостами".

2. Провести искусственный отбор клонов клеток перевивной рабдомиосаркомы РА-2 крыс и оцухолевых узлов миеломы sp г/о мышей с повышенными и с пониженными частотами встречаемости клеток с микроядрами и с хромосомными мостами. Опреде-

лить коэффициент реализованной наследуемости признаков "частота клеток с микроядрами" и "частота клеток с хромосомными мостами" в исследованных клеточных популяциях.

3. Провести сравнительный анализ показателей кариотипи-ческой изменчивости в клеточных популяциях, отселектирован-ных как на повышенную, так и на пониженую частоту клеток с микроядрами и с хромосомными мостами.

4. Определить степень злокачественности по показателю "метастатический потенциал" популяций клеток с повышенной и с пониженной в результате отбора частотами клеток с микроядрами и с хромосомными мостами.

8. Определить основные морфологические типы "хвостатых" ядер лимфоцитов человека и животных и предложить их классификацию. Изучить гетерохроматин и ядрышки в "хвостатых" ядрах. Установить радиочувствительность показателя "частота клеток с "хвостатыми" ядрами" и выяснить характер дозовой зависимости.

?. Определить связь между частотой встречаемости клеток с "хвостатыми" ядрами и частотами дицентриков, ана-и телоФаз с хромосомными мостами, интерфазных клеток с хромосомными мостами, клеток с микроядрами в клеточных популяциях 1п

VI УО .

8. Определить частоты встречаемости лимфоцитов с "хвостатыми" ядрами, микроядрами и хромосомными мостами, а также эритроцитов с микро ядрами в периферической крови у здоровых доноров и у облученных пациентов.

9. Определить частоты встречаемости эритроцитов с микроядрами в периферической крови в популяциях крупного рогатого скота.

10. Изучить частоты встречаемости лимфоцитов с аномальными ядрами у больных лейкозом коров.

Научная_новиз^

Продемонстрирована Фенотипическая и наследственная гетерогенность клонов опухолевых клеток m vivo по признакам, указывающим на ядерные аномалии.

Впервые проведены искусственные отборы в популяциях соматических клеток in vivo, направленные на повышение и на снижение частот встречаемости клеток с аномальными ядрами. Показано, что спонтанная нестабильность кариотипа клеток в значительной степени зависит от Факторов внешней среды при несомненной роли наследственных Факторов. В результате проведенной селекции установлена взаимосвязь между различными видами аномалий ядер и показателями, характеризующими кариотипическую нестабильность.

Зарегистрирована отрицательная корреляция между показателями, характеризующими кариотипическую нестабильность опухолевых клеток и их злокачественность. Показано, что искусственный отбор на повышение спонтанной частоты клеток с микроядрами и искусственный отбор на повышение спонтанной частоты клеток с хромомосомными мостами приводит в конце концов к репродуктивной гибели популяций клеток.

Представлена классификация основных морфологических типов "хвостатых" ядер и показана их видовая специфичность. Изучены свойства хроматина "хвостов" ядер лимфоцитов.

Определены Фоновые показатели частот встречаемости лимфоцитов с "хвостатыми" ядрами в периферической крови у мужчин, женщин и детей. Выявлены повышенные частоты встречав-

мости клеток с аномальными ядрами в периферической крови у пациентов, облученных 8-10 лет назад. Показатель "частота встречаемости лимфоцитов с "хвостатыми" ядрами" впервые был использован в цитогенетическом прескрининге.

В