Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Аномалии ядер и кариотипическая стабильность клеток млекопитающих

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Аномалии ядер и кариотипическая стабильность клеток млекопитающих"

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И РАЗВЕДЕНИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ РАСХН

ВСЕРОССИЙСКИЙ ЦЕНТР ЭКСТРЕННОЙ И РАДИАЦИОННОЙ МЕДИЦИНЫ МЧС РОССИИ

На правах рукописи

УДК 575: С16-006,080.3.576.358.599

0:1

/ 6 шол

КРАВЦОВ Вячеслав Юрьевич

аномалии ядер

и кариотипическая стабильность

клеток млекопитающих

Специальность 03.00.15— генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ — ПУШКИН 1998

Работа выполнена в отделе генетики и биотехнологии Всероссийского научно-исследовательского института генетики и разведения сельскохозяйственных животных РАСХН, Всероссийское центре экстренной и радиационной медицины МЧС России и в Институте цитологии РАН.

Консультанты — доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ А. Ф. Яковлев; доктор медицинских паук, профессор А. АГ. Никифоров.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В. С. Баранов; доктор биологических наук, профессор Т. И. Кузьмина; доктор медицинских наук Н. Н. Мамаев.

Ведущее учреждение — НИИ Онкологии ни. проф. Н. Н. Петрова МЗ РФ.

Защита состоится „-^—"--- 19ЭЗ г. в ^— ч

на заседании диссертационного совета Д 020.07.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте генетики и разведения сельскохозяйственных животных РАСХН по адресу: 189520, Санкт-Петербург—Пушкин, Московское шоссе, 55а.

С диссертацией можно ознакомиться d библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института генетики и разведения сельскохозяйственных животных РАСХН.

£~ CeS-OMdL

Автореферат разослан , -' -1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор сельскохозяйственных наук, профессор

В. И. Волгин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТУ

Актуальность_темы. К настоящему времени подавляющее большинство цигогенетических исследовании, направленных на выявление частот встречаемости хромосомных аберраций в клеточных популяциях, проводится с использованием методов, требующих предварительного культивирования клеток в условиях m vitro. Однако, частоты хромосомных аберраций, выявленные одним и тем же методом в клеточных популяциях in vitro и in vivo не совпадают (Бочков, 1971). Накопление знания о динамике возникновения кариотипических нарушении и распространения аберрантных клонов в клеточных популяциях m vivo (на Фоне несоизмеримо большего объема информации, накопленного с использованием методов in vitro) представляется на настоящем этапе развития биологии принципиально важным. Такая информация может быть получена путем изучения частот встречаемости клеток с определенными видами морфологических аномалий ядер, поскольку установлено, что значительная часть спектра хромосомных аберрации после завершения деления клеток приводит к Формированию морфологически измененных ядер (Алов, 1972). Наличие клеток с аномальными ядрами может указывать на тот Факт, что клетки, в которых возникли хромосомные аберрации, делятся и изменяют кзриотипическии профиль популяции. Следует сразу признать, что цитогенетические тесты in vivo, основанные нз учете определенных морфологических изменении ядер, совсем ае исключают классический метаФазныи метод учета хромосомных аберрации, а наоборот могут дополнять его, облегчая выявление случаев с повышенными частотами хромосомных аберраций.

К наиболее информативным показателям, характеризующим морфологические аномалии ядер, которые возникают в результате кариотипических нарушений, могут быть отнесены микроядра, хромосомные мосты и "хвостатые" ядра. Микроядра в клетках образуются в процессе деления из хромосомного материала, потерявшего контакт с веретеном митотического аппарата. Они включают в себя хроматин либо ацентрических Фрагментов, либо целых хромосом (хроматид). Частота встречаемости клеток с микроядрами свидетельствует о частоте возникновения клеток с измененными яариотипами и является базовым показателем в микроядерном тесте сминег. streffer, 19955. Хромосомиые аберрации дицентрического типа приводят к Формированию клеток с хромосомными мостами (Алов, 1972). Известно также, что дицевтри-ческие хромосомы, являясь маркерами радиационных воздействии, час-

то образуют хромосомные мосты, после разрыва которых в интерфазе Формируются клетки с полумостами или, говоря иначе, с "хвостзтыми" ядрами (ПрокоФьева-Еельговская, 1961).

Для изучения аномэлии ядер и установления их взаимосвязи с цигогенетическим гомеостззом в клеточных популяциях m vivo представляются интересными и перспективными программы селекции, направленные как на повышение, так и на понижение частот спонтанного образования клеток с аномальными ядрами. В ходе реализации таких селекционных программ должны проявиться причинно-следственные связи между кариотипическои изменчивостью и Формированием аномальных ядер в клеточных популяциях, а данные о динамике отбора позволят определить вклад наследственных и средовых Факторов, обусловливающих кариотипическую изменчивость. Метод отбора на генетическую стабилизацию и дестабилизацию клеточных популяции имеет как практическое значение для биотехнологии, так и научный интерес, поскольку полученные в результате такой селекции сублинии, контрастные по признаку "частота клеток с аномальными ядрами", могут оказаться удобной моделью для Фундаментальных исследовании мутационного процесса.

Изучение аномалий ядер в клеточных популяциях in vivo может представлять интерес в радиобиологических исследованиях, поскольку известно, .что воздействие ионизирующей радиации на клеточные популяции приводит к появлению в них клеток с аномально измененными ядрами с Лаптева-Попова И др., 1959; Dienstbier et ai., 1964; Глуз-ман и др., 1992). К настоящему времени известен достаточно широкий спектр морфологических типов ядерных аномалий, однако их классификация и полные сведения об их генезе отсутствуют. Большой интерес, на наш взгляд, вызывает такой вид аномалии, при которой ядро имеет достаточно длинный хроматиновыи вырост в пространство цитоплазмы и выглядит внешне как "хвостатое" ядро. Возможно, что появление "хвостатых" ядер связано с возникновением дицентрических хромосом и поэтому метод, основанный на определении частоты встречаемости клеток с "хвостатыми" ядрами, в перспективе может быть использован в радиационно-эпидемиологических исследованиях, так как опыт ликвидации последствий радиационных аварии показал необходимость разработки и внедрения краткосрочных информативных методов для обследования облученного контингента с Гуськова, 1996:». Однако, для внедрения такого метода в практику требуется детальное изучение

otinuo тгтдтг ттлто "Ton/iTQTLrv" оттоп qv тлт.тоимттоо тяпп по ттпооттга опоилитиу

цитогенетических механизмов их образования, морфологических особенностей, а также определение фоновых частот встречаемости клеток с "хвостатыми" ядрами в популяциях человека и животных.

Исходя из сказанного выше, изучение аномальных ядер в клеточных популяциях in vivo представляете я актуальным. Новые знания о мутационном процессе могут быть получены путём проведения клональ-ного анализа и селекции по признакам, манифестирующим аномалии ядер. Еместе с тем, очевидно, что наряду с общепризнанным методом учета аномалии ядер - микроядерным тестом, существует перспектива для развития новых методов, основанных на учете других Форм аномалии ядра.

Поэтому целью настоящей работы явилось изучение морфологических аномалий ядер, указывающих нз сдвиги патогенетического го-меостаза в популяциях нормальных и злокачественных клеток млекопитающих. Основное внимание предполагалось уделить селекции клеточных популяции i" vivo по признаку "частота встречаемости клеток с аномальными ядрами" и разработке нового метода, основанного на определении "хвостатых" ядер в клеточных популяциях m vivo.

При этом были поставлены следующие задачи:

1. Изучить Фенотипическую и наследственную гетерогенность клонов перевивнои рабдомиосаркомы РА-2 крыс по признакам "частота клеток с микроядрами" и "частота клеток с хромосомными мостами".

2. Провести искусственный отбор клонов клеток перевивной рабдомиосаркомы РА-2 крыс и опухолевых узлов миеломы sp г/о мышеи с повышенными и с пониженными частотами встречаемости клеток с микроядрами и с хромосомными мостами. Определить коэффициент реализованной наследуемости ьг признаков "частота клеток с микроядрами" и "частота клеток с хромосомными мостами" в исследованных клеточных популяциях.

3. Провести сравнительный анализ показателей кариотипической изменчивости в клеточных популяциях, отселектированных как на повышенную, так и на пониженую частоту клеток с микроядрами и с хромосомными мостами.

4. Определить степень злокачественности по показателю "метастатический потенциал" популяция клеток с повышенной и с пониженной в результате отбора частотами клеток с микроядрами и с хромосомными мостами.

6. Определить основные морфологические типы "хвостатых" ядер

тгл/тлтгтггпта ТТЛ irrmova гж итпэпттп.пг т* гтпо тт ттпчллтт. тгг V тгол/чл^тдтгатттлтл

■ишкгиц.и UU tWl^l^^iU tí IIUU/U illtUA IJ ' ' 1 . Г......." ' ' ' Jiu iwiU WV.tfflllUUIWI

Изучить гетерохроматин и ядрышки в "хвостатых" ядрах. Установить радиочувствительность показателя "частота клеток с "хвостатыми" ядрами" и выяснить характер дозовои зависимости.

7. Определить связь между частотой встречаемости клеток с "хвостатый:;" ядрами и частотами дицентриков, ана-и телоФаз с хромосомными мостами, интер<разных клеток с хромосомными мостами, клеток С МИКрОЯДраМИ В КЛеТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ in vivo.

8. Определить частоты встречаемости лимфоцитов с "хвостатыми" ядрами, микроядрами и хромосомными мостами, а также эритроцитов с микроядрами в периферической крови у здоровых доноров и у облученных пациентов".

9. Определить частоты встречаемости эритроцитов с микроядрами в периферической крови в популяциях крупного рогатого скота.

10. Изучить частоты встречаемости лимфоцитов с аномальными ядрами у больньпс лейкозом коров.

Научная новизна и теоретическая значимость:

Продемонстрирована Фенотипическая и наследственная гетерогенность клонов опухолевых клеток in vivo по признакам, указывающим на ядерные аномалии.

Впервые проведены искусственные отборы в популяциях соматических клеток in vivo, направленные на повышение и на снижение частот встречаемости клеток с аномальными ядрами. Показано, что спонтанная нестабильность кариотипа клеток в значительной степени зависит от Факторов внешней среды при несомненной роли наследственных Факторов. В результате проведенной селекции установлена взаимосвязь между различными видами аномалий ядер и показателями, характеризующими кариотипическуга нестабильность.

Зарегистрирована отрицательная корреляция между показателями, характеризующими кариотипическую нестабильность опухолевых клеток и их злокачественность. Показано, что искусственный отбор .на повышение спонтанной частоты клеток с микроядрами и искусственный отбор на повышение спонтанной частоты клеток с хромомосомными мостами приводит в конце концов к репродуктивной гибели популяций клеток.

Представлена классификация основных морфологических типов "хвостатых" ядер и показана их видовая специфичность. Изучены свойства хроматина "хвостов" ядер лимфоцитов.

Определены Фоновые показатели частот встречаемости лимфоцитов

с "хвостатыми" ядрами в периферической крови у мужчин, женщин и детей. Выявлены повышенные частоты встречаемости клеток с аномальными ядрами в периферической крови у пациентов, облученных 6-10 лет назад. Показатель "частота встречаемости лимфоцитов с "хвостатыми" ядрами" впервые был использован з цитогенетическом прескрининге.

В популяциях крупного рогатого скота определены частоты встречаемости эритроцитов с микроядрами и выявлено повышение частоты встречаемости лимфоцитов с "хвостатыми" ядрами в периферической крови in vivo У коров больных л6йк030м.

Практическая ценность работы. Разработанные и апробированные способы селекции клеточных популяций на стабильность генома могут быть использованы в промышленной биотехнологии (Госпатент РФ su 1806}95 аз cía nis^-oo 5/оо, 1992; по заявке n 95111988 от 11.07. 1995 принято положительное решение о выдаче патента). Количественный и качественный учет исследованных Форм аномалий ядер в клеточных популяциях in vivo может в перспектива использоваться для экспресс-оценки цигогенетического гомеостаза в онкологической практике и в цитогенетическом прескрининге облученного контингента (получена приоритетная справка cía м 5/оо s/об в 1997 г). Метод учета аномалии ядер в соматических клетках может использоваться в популяциях сельскохозяйственных животных в экспертизе экологической чистоты сельхозпродукции.

Апвдбация_рзбота. Материалы диссертационной работы были представлены на 1-м Всесоюзном съезде радиобиологов (Москва, 1989), Всесоюзной конференции "Генетика соматических клеток" (Звенигород, 1989), на Международной конференции "Митоз и расхождение хромосом" (Ленинград, 1990), Международной конференции "Биотехнология-1994" (С-Петербург, 1994), Международном симпозиуме по молекулярной генетике и биотехнологии в оценке и изменении геномов сельскохозяйственных животных с С.-Петербург, Пушкин, 19943, 16-м Международном конгрессе по проблемам канцерогенеза (Нью-Дели, 1994), Международной конференции "Актуальные проблемы биологии в животноводстве (Боровск, 1995), 3-м Международном симпозиуме по хромосомным аберрациям (Эссен, 1995), Конференции по детской гематологии "От науки к практике" (Санкт-Петербург, 1995), Меэдуизродной конференции ВОЗ "Последствия для здоровья после Чернобыльской катастрофы (Женева, 1995), Конференции ЕАЖ (Лилиехаммер, 1996), 24-м съезде Международного гематологического общества (Дюссельдорф, 1996), Международном конгрессе по клиническая химии (Лондон, 1996), Международ-

нои конференции "Радиация и здоровье" {Вир Шива, Израиль, 1996), 1-ом Европейском цитогеветическом конгрессе (Афины, 1997), 3-м съезде по радиационным исследованиям (Москва, 1997), Международной конференции "Малые дозы радиации: биологические эффекты и контроль регуляции" с Севилья, 1997э, Международной конференции "Стратегия экологической безопасности" с С.-Петербург, 1997э, Научно-практической конференции "Медино-социальные аспекты проблем ветеранов-атомщиков и пути их решения" (С.-Петербург, 1997), Международном конгрессе по проблемам метастазирования (Хьюстон, 1997), 8-й и 9-й конференциях германского общества медицинских генетиков сГеттин-ген, 1996, Инсбрук, 1997).

Публикации. По результатам исследований опубликовано 45 печатных работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В экспериментах использовали белых беспородных крыс и мышеи линии BALB/e разводки питомника РАМН "Рапполово", а также свиней порода ландрас. выращенных во ВНИИФиБПЖ с г. Боровсю.

Группу облученных пациентов составили 160 мужчин в возрасте от 30 до 72 лет, подвергшихся воздействию ионизирующей радиации 6-10 лет назад. По данным истории болезни 154 человека из этой группы получили малые дозы облучения с до 0,25 еуз и 6 человек получили большие дозы облучения с более 1,5 eyj. Также была исследована выборка детей (n=B4), проживавших на территории, подвергшейся загрязнению радионуклидами, или эвакуированных с таковой в возрасте от "1 до 13 лет. Контрольные группы составили 89 здоровых мужчин в возрасте от 19 до 60 лет, 50 женщин в возрасте от 20 до 60 лет и 94 ребенка в возрасте от 3 до 6 лет, не подвергавшихся ранее с по анкетным данными радиационному воздействию.

Исследуемые выборки крупного рогатого скота включали коров и быков из различных рэгинов России и ближнего зарубежья. В таблице 1 приведены пол, порода и хозяйства, в которых выращивались обследованные животные. В исследованиях влияния лейкозного процесса на аномалии ядер клеток периферической крови были изучены следующие три выборки. Первая выборка включала 25 коров, у которых РИД-методом выявлено носительство вируса вич и гематологическим методом выявлена гематологическая стадия лейкоза. Вторую выборку составили 25 РИД-положительЕых животных, в периферической крови которых не

Таблица !.• Изученные выборки крупного рогатого скота.

Номер выборки Число ЖИЕОТНЬК Порода Пол Регион

гз Черно-пестрая Коровы ' Каунаский район, Литва

г. 36 Черно-пестрая Коровы ПО "Лесное" совхоз "Пригородный" Ленинграде кая область

3. £7 Голштино-Фризская Коровы КантскиЛ район Кыргызстан

4. 15 Айрширсхая х холмогорская Коровы ПО "Ладожское" Волховский район

3. 22 Айрширсхая х черно- пестрая КсрОЗЬ! ПО "Ладожское" Волховский район

е. 35 Черно-пестрая Быки ПО "Лесное" Ленинградская область

7. гз Черно-пестрая Быки Ивановская область

наблюдалось увеличения числа лимфоцитов. Контрольная выборка была представлена 25 здоровыми животными со стабильной РИД-отрицательной реакцией на протяжении • нескольких лет (данные ветеринарной станции г. С.-Петербурга). Без коровы содержались в одинаковых условиях (совхоз "Красная славянка" Ленинградской обл.). Всего было изучено 58 быков и 227 коров.

В работе использованы субштаммы перевивной рабдомиоезркомы РА-2 крыс: РА-23 (высокий метастатический потенциал клеток (Каминская, Бахтин, 1989)), РА-24 (низкий метастатический потенциал (Гужова, Бахтин, 1988 )) и РА-22 ( повышенная терморезистентность клеток (Федорова и др, 1989 )). Клетки зсех субштаммов после внутривенного введения образует экспериментальные метастазы только в легких привитых животных. Свыше 95Х экспериментальных метастазов РА-2 имекут ушщеллкхлярное происхождение (СтепаЕьян, Бахтин, 1980; Каминская, 1986), т.е. являются клоками^ Экспериментальные мета-

стазы (клоны) РА-2 получали введением суспензий одиночных опухолевых клеток в хвостовую вену крысам. После прививки клеток животных, предварительно усыпив ЭФироМ, декапитировали, вычленяли легкие и отпрепаровывали клоны. Для получения внутрибрюшинных (в^б) узлов миеломы sp гго мышеи 1 млн. .клеток вводили внутрибрюшинно.

Частоту встречаемости клеток с микроядрами (ЧКМ) и частоту встречаемости клеток с хромосомными мостами (ЧКМс) в клеточных популяциях исследуемых опухолей определяли в мазках-отпечатках, для чего отпрепэрованные клоны рабдомиосаркомы РА-2 крыс и в/б узлы миеломы sp 2/0 мышей разрезали пополам и получали от них отпечатки на предметных стеклах. Мазки-отпечатки Фиксировали 96%-ым этиловым спиртом, высушивали и окрашивали красителем Гимзы или Флуорохромом Хехст 33258. В каадом мазке-отпечатке анализировали по 200 - 1000 целых'клеток. Поврежденные клетки не учитывали. ЧКМ и ЧКМс выражали в процентах. Частоты патологических митозов определяли на препаратах, приготовленных таким же способом.

Схема, по которой проводили искусственные отборы по признаку "ЧКМ" ( РА-2 и s?a/a ) и признаку "ЧКМс" ( РА-2 ), представлена на рис. 1. Огпрепарованные клоны <в/б узлы) разрезали надвое, одну половину использовали для приготовления мазка, а другую помещали во Флакон со средой 199. В мазках от каждого клона (в/б узла) подсчитывали по 200-500 целых клеток. После определения ЧКМ (ЧКМс) отбирали клоны (в/б узлы) с минимальными и с максимальными для данной выборки показателями, получали из них суспензии клеток и взодили их внутривенно крысам (внутрибрюшинно мышам).

Рис.1. Схема проведения искусственного отбора по признакам "частота клеток с микраядрами" и "частота клеток с хромосомными мостами"

min шах

Частоты микроклеток в мазках-отпечатках в^б узлов миеломы sp 2^0 мышеи определяли на 10 ООО целых клеток в 3 ООО полях зрения.

Содержание ДНК в популяциях клеток определяли методой проточной Цита метрик. суспензии клеток (1 млн. клеток в 1 мл) после окрашивания их бромистым этидием и оливомицином (Розанов, 1988) совместно с Ю.М. Розановым и Н.В. Бычковой.

Для получения препэратов метаФазных хромосом приготовленную из опухолевых узлов клеточную суспензию инкубировали с колхицином при 37°С, после чего готовили препараты стандартным способом. Для подсчета хромосом отбирали окрашенные по Гимза метаФазные пластинки округлой Формы, сохранившие ореол цитоплазмы.

Кинетохоры в микроядрах клеток рабдомиосарксмы РА-2 крыс и миеломы sp г/о мышеи определяли методом непрямой иммуноФлуоресцен-

ЦШ ( Henning et al. . 1Э89),

Для оценки метастатического потенциала использовали величину КОЕ ( колонеобразующие единицы ) - число опухолевых узлов в легких привитых животных в пересчете на 100 тыс. внутривенно введенных жизнеспособных клеток ( Пелевина и др., 1978 ).

Коэффициент реализованной наследуемости ь2 признаков "ЧКМ" и "ЧКМс" определяли по отношению селекционного ответа <R) к селекционному дифференциалу (s) по П.Ф. Рокицкому ( 1978 ) в модификации для клеточных популяций, предложенной Ю.Б. Бахтиным { 1980 ).

Мышей и венозную гепаринизированную кровь облучали на установке РУМ-17 (ВМедА, С.-Петербург) тормозными Х-лучами в дозах 0,5; 1,0;1,5; 2,0 Gy, при мощности дозы 0,65 еу/мкн, во вращающихся кассетах, по 8 особей на дозу и пенициллиновых Флаконах, соответственно.

Гематологические препараты периферической крови и костного мозга (из бедренной кости мышей и грудины коров) получали обычным способом. Мазки высушивали. Фиксировали 96% этиловым спиртом и окрашивали красителем Гимзы.

Частоты встречаемости лимфоцитов с "хвостатыми" ядрами, микроядрами и хромосомными мостами определяли в выборках из 500 лимфоцитов. Не учитывали малые лимфоциты и клетки с признаками дегенерации и повреждений.

Препараты метаФазных хромосом человека получали путем культивирования ФГА-стамулированЕых лимфоцитов через 48 ч. Дифференциальное окрашивание метаФазных хромосом проводили по g-методу с использованием трипсина (Маягрегор, Взрли, 1986). Препараты

двуядерных лимфоцитов в цитохзлазшовом блоке получали по методу, описаному Анкинои и соавторами (Анкина и др., 1991).

Ядрышки в ядрах лимфоцитов выявляли окрашиванием ядрышковых организаторов нитратом серебра (Мамаев, 1980).

Блоки гетерохроматина определяли в свежеприготовленных мазках периферической крови, окрашенных по Романовскому, а блоки гетерохроматина в культивированных in vitro лимфоцитах - методом С-окра-шивания с использованием гидроксида бария (Sumner et al. . 1971).

Локализацию центромерных сигналов, выявленных triтс, и тело-мерных сигналов, выявленных fxтс, в ядрах лимфоцитов человека проводили совместно с ¡O.A.Логиновои с использованием неизотопнаго варианта двухцветной Флуоресцентной гибридизации m situ (Lichter et

al . . 1992).

Для статистической обработки данных использовали программы

ДЛЯ IBM PC Microstat И Statgraph, МвТОДЫ ПарЗМеТрИЧеСКОЙ И

непараметрической статистики.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ

Клетки с микроядрами в щеточных популяциях__in__vivo__клонов

E€ÖS2™gcagKO№_PA-2j{gHc^ Наблю-

даемые и регистрируемые нами микроядра полностью соответствовали всем морфологическим критериям микроядра. Процент микроядер с ки-нетохорами в клетках в/б узлов миеломы sp 2/0 мышей составил 88%, а в клетках клонов рзбдомиосаркомы крыс субштамма РА-23 - 87%.

_Менгаона^ные_различм_1п_^1уо__в_клеточных__популяциях__с^б-

Ш1эШ°§_Е§55дшосаркд^_РА;2_^ыс_по_пргонакх__"частота__клеток__с

мищзо^ами"_ХЧКМ2л Анализ выборки клонов РА-23 обнаружил наличие отрицательных корреляции между ЧКМ и возрастом клонов сг = - о.es. р < о.os } и меящу ЧКМ и размером клонов сг = - о.во, р < 0.055.

Гистограмма распределения 223 клонов субштамма РА-23 по признаку "ЧКМ" представлена на рис. 2,а. Среда исследованных клонов наблюдались как клоны, в которых метки с микроядрами не были встречены, так и клоны с ЧКМ до 9% и более. Средняя ЧКМ в популяции клонов РА-23 составила 2,96 i ОДЗХ. В выборке клонов субштамма РА-24 (рис. 2,6) средняя ЧКМ составила 5,94-0,24%. Здесь также важно отметить значительный размах изменчивости клонов РА-24 по величине ЧКМ- от 1,6% до 14,5%. Гистограмма распределения 128 ионов субштамма РА-22 изображена на рис. 2,з. Около 20% клонов

15 10 5

Ю 5

20-15 _ 10 -5 -

.||||«1...........

т-г

т-1-1-1-1-1-1-1-г

...1м1|||||1.....

I I-1 I-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-г

II ||,

||

1В

—I-11 I-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-Г"

О 1 2 3 4 3 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Рис. 2. Частота клеток с микроядрами в клонах перевивной рабдомио-саркомы РА-2 крыс субштамма РА-23 (а), РА-24 (б) и РА-22 (в).

По горизонтали - частота клеток с микроядрами ( ЧКМ ), %; по вертикали - число клонов, %.

представленной выборки имеют ЧКМ, не превышающие 1,0%, модальный класс составляют клоны с ЧКМ от 1,0% до 1,5%, а средняя ЧКМ составила 1,89 - 0,12%. Представленные данные свидетельствуют о высокой степени гетерогенности популяции клонов по признаку "ЧКМ" всех субиггаммов РА-2. Следует подчеркнуть, что различия клонов РА-2 з пределах популяции могут быть более чем 10 кратными.

Частота всех исследованных типов патологических ана- и тело-Фаз в субштзмме РА-24 составила 56-5%, аз субштэмме РА-22 -17,0 - 3,7%; величина этого параметра у субштамма РА-23•занимала промежуточное положение (24 - «),

в

Отбор по признаку "частота клеток с микроядрами" в клеточных популяциях рабдомиосаркомы РА-2 крыс. Отбор индивидуальных клонов РА-23 на повышение в них ЧКМ был эффективным: средняя ЧКМ повысилась с 1,3% до 7,8%. Популяции клонов-потомков, полученные в результате такого отбора оказались гетерогенными по признаку "ЧКМ": среди них встречались как клоны с ЧКМ большей, так и клоны с ЧКМ меньшей, чем в родительском клоне. Среда клонов-потомков, полученных от родительского клона с ЧКМ 15%, значения ЧКМ не превышали 15%. Несмотря на увеличение прививочной дозы в 10 раз, перевивка клонов с ЧКМ 15% не позволила из-за утраты их репродуктивных способностей сохранить полученный субштамм. Результаты повторного эксперимента по отбору клонов РА-23 на повышение ЧКМ (данные 4 циклов).представлены в табл. 2. За 4 цикла отбора клонов РА-23 с повышеными ЧКМ .средняя ЧКМ повысилась с 3,3% до 6,9%, а выборка клонов 0-го цикла отличалась достоверно от выборок клонов, полученных в результате всех последующих циклов <р < 0.01).

Отбор клонов рабдомиосаркомы субштамма РА-23 крыс на понижение ЧКМ за 4 цикла привел к изменению средней ЧКМ с 3,3% до 1,6Ж и достоверному снижению ЧКМ в ходе такого отбора (р < 0.01).

Коэффициент реализованной наследуемости ь признака "ЧКМ" в клеточных популяциях рабдомиосаркомы субштамма РА-23 варьировал от 0,24 до 0.40 (см. табл. 2).

Сравнш2^шй_аналш_показателей_кариот

в клеточных популяциях клонов__РА-23 с повышенными и с пониженными

в результате отбора частотами клеток с микроядрами. Клоны РА-23 с пониженной ЧКМ отличались от клонов с повышенной ЧКМ достоверно меньшей частотой анафаз и телофаз с мостами и достоверно меньшей частотой анафаз и телофаз с отставаниями хромосом и Фрагментов (р <0,005). Клоны с пониженной ЧКМ, отличались также значительно меньшими частотами метаФаз с разбросанными хромосомами (к-метаФа-зами) по сравнению с кланами с повышенными ЧКМ (р < 0,001); различия по частотам метаФаз с отставшими хромосомами между исследуемыми выборками клонов с повышенной и с пониженной ЧКМ выявлены не были (р > 0,05).

По данным проточной цитометрии, вариабельность содержания ДНК в е-1 периоде в популяции клеток РА-23, отселектированной на повышение ЧКМ, была выше, чем в популяции, отселектированной на понижение ЧКМ: коэффициент вариации признака в первом случае был равен 4,14 %, а во втором - 3,12 % (различие достоверно, р < 0,01).

Таблица 2. Изменение частоты клеток с микроядрами (ЧКМ) в

клонах рабдомиосаркомы РА-23 крыс в результате отбора клонов на повышение и отбора на понижение ЧКМ.

Направ- Шаг Число Средняя Пределы ЧКМ Ко заиление от- желе- ЧКМ в варьиро- отобран- цент ре-отбора бо- дован- выборке вания ных „ ализова-ра ных ЧКМ,Ж клонов, ннои на-

клонов % следу- 2 емости(к )

П 0 61 3,3*0,2 0,9-9,3 7,3 (3) -

в ы ш е н и е 1 49 4,5*0,3 1,5-12,0 9,5 (3) 0,3

2 50 5,7*0,3 2,7-11,5 12,9(4) 0,24

3 48 8,1*0,5 2,5-16,0 14,7(3) 0,33

4 47 6,9*0,6 0,5-17,0 14,5 -

П 0 61 3,3*0,2 0,9-9,3 1.2 (4) -

н и ж е н и е 1 50 2,5*0,2 0-5,5 1.7 (4) 0,40

2 19 3.1*0,5 0-8,0 3,0 (3) -

3 37 2,3*0,2 0-6,5 0,7 (3) -

4 46 1,6*0,2 0-8,0 0,3 -

*В скобках указано число отобранных клонов.

Клоны, отселеетированные на повышение ЧКМ, имели резко повышенные частоты клеток с хромосомными мостами в отличие от клонов с низкими ЧКМ (р < 0,0001).

Хромосомные мосты в интерфазных клетках__1п у! уо {слонов рабдомиосаркомы РА-23 крыс соответствовали всем морфологическим критериям, установленным для хромосомных мостов.

Отбор по признаку "частота клеток__с__хромосомными__мостами"

(ЧКМс) в клеточных популяциях рабдомиосаркомы РА-2 крыс. Характер внутриклональнои и межклональной вариабельности признака "частота клеток с мостами" позволил при просчете в каждом клоне 200-500 клеток выявлять межклональные различия по ЧКМс в исследуемых выборках клонов РА-23. Результаты отбора клонов по признаку "ЧКМс" представлены в табл. 3. За 5 циклов отбора, направленного на повышение ЧКМс средняя ЧКМс, повысилась с 0,6% до 10,0%, а различия

Таблица 3. Изменение частоты клеток с хромосомными мостами (ЧКМс)

в клонах рабдомиосаркомы РА-23 крыс в результате отбора клонов на повышение и отбора на понижение ЧКМс.

Направ- Шзг Число Средняя Пределы ЧКМс Козффици-

ление . от- иссле- ЧКМс в варьи- отобран- ент реа-

отбора бо- дован- выбор- рования ныххкло- лизованной

ра ных ке, * ЧКМс, V. нов. и наследуе-?

клонов мости с п

п

0 о 48 о.е О. о-г. о 1.1 сзэ

в

ы 1 50 0.8 о. 0-3. 0 2. 5 сзэ 0. 5

ш е г 52 1. 7 о. 0-3. 8 1.8 С13 0. 5

н 3 48 1. 6 о. 0-3. 2 3. 0 С13

и 4 47 4. 3 1. 0-13. 0 11. 7 С 23 0. 8

е 5 21 10. 0 3. 0-18. 2 - -

П

0 0 33 о. 8 0. 0-3.0 о. г С1Э о.о

н 1 47 0. 6 0. 0-1.8 о.г С1Э 0. 3

и г 47 0. 5 0. 0-1.8 0.1 сгз О. 23

ж 3 43 О. 6 0. 0-2. о 0.0 С1Э -

е 4 31 0.3 0. о-г. г о.о со о. 23

н

и 3 46 0. 3 "о. 0-1.2 - -

е .

¡"скобках указано число отобранных клонов.

по ЧКМс между выборкой О-го и выборками всех последующих циклов, начиная со 2-го, были высоко достоверными (р <0,001). Отбор, направленный на понижение ЧКМс в клонах РА-23, также оказался эффективным: средняя за пять циклов снизилась с 0.8% до 0,3%.

После отбора на повышение ЧКМс стало заметным появление клеток, в которых наблюдалось сразу несколько хромосомных мостов. В результате проведенного регрессионного анализа подучено уравнение ввда: усх) = -о. ю+о. гз*х, т.е. изменение ЧКМс на вызывает изменение частоты мостов на клетку на 1^.

Важно отметить, что первая попытка проведения отбора клонов на повышение ЧКМс закончилась тем, что клоны с ЧКМс выше Ъ% резко теряли способность перевиваться и оказались репродуктивно стерильными. Увеличив дозу перевиваемых клеток в следующей попытке, ЧКМс удалось повысить только ^о определенного уровня ( 16-18% ). В по-

томствах клонов с высокими ЧКМс постогашо возникали варианты с пониженными (относительно родительских клонов) ЧКМс и с ЧКМс базового (исходного) уровня.

Эффективность проведенных отборов как Еа повышение, так и на понижение ЧКМс указывает на то, что признак "ЧКМ" обусловлен не только средовыми, но и наследственными Факторами. Полученные величины ьг показывают, что вклад наследственных Факторов не всегда может иметь определяющее влияние на вариабельность клонов по ЧКМс.

Сравнительный анализ показателей кариотипическои нестабильности после селекции клонов РА-23 ва повышение и на понижение образования клеток с хромосомными мостами. Клоны с повышенной ЧКМс отличались от клонов с пониженной ЧКМс достоверно большими частотами ана- и телоФаз с .мостами (р <00.1) и ана- и телоФаз. с мостами и отставаниями хромосом и их фрагментов (р <00.1), частотами метаФаз с разбросанными хромосомами (р <0.1) и метаФаз с отставаниями хромосом и их Фрагментов (р <00.1), а также частотой многополюсных ана- и телоФаз (р <00.1>. Б популяции с повышенной ЧКМс доля трех-полюсных ана- и телоФаз от общего числа многополюсных ана- и телоФаз составила 61% и при этом 90,7% трехполюсных ана- и телоФаз были с мостами. Клоны с высокими ЧКМс- резко отличались • по частоте встречаемости клеток с микроядрами от клонов с низкими ЧКМс (р <0,001).

Проточная цитометрия ДНК показала, что клоны, отселектирован-ные на повышенную и на пониженную ЧКМс, различались по профилю ДНК кэк между собой, так и от исходной популяции. Популяции клеток после отбора на понижение и отбора на повышение ЧКМс заметно различались между собой по количеству опухолевых' клеток с индексом ДНК 1,7. В популяции с повышенными ЧКМс присутствовало около 20х таких анеухыоидаых клеток, а в популяции с пониженной ЧКМс - 7«. Присутствовавшая в исходной популяции Фракция гексаплоидных клеток соколо 4'о, не обнаружилась на ДНК-цитограмме опухолевых клеток, отсе-лектированных на снижение ЧКМс. Напротив, на ДНК-цитограмме клеток с высокой ЧКМс, количество гексаплоидных клеток возросло до 20*.

После отбора клонов РА-23 на понижение ЧКМс в 123 исследованных метаФазах модальный класс представлен мета^азами с 56 хромосомами (40Х), а метаФазы с более чем 60 хромосомами составили менее 5я. Во всех 123 исследованных метзФазах дицентрические хромосомы обнаружены не были. Модальный класс (203!) в исходной популяции субштамма РА-23 находился в области 60-70 хромосом.

Метастатический потенциал и частота клеток__с__мжроядрами__в

щеточных,популяциях рабдомиосаркомы'РА-2 крыс. В процессе отбора клонов РА-23 на повышенную ЧКМ метастатический потенциал клеток, используемых для проведения очередных циклов отбора, снизился с 409-168 до 13-6. После проведения 4 циклов отбора на повышение и 4 циклов отбора на понижение ЧКМ популяции РА-23 были протестированы на метастатический потенциал (рис. 2). При всех исследованных при-

10

10'

10' -

10"

ю

(1)

1—

14

гв

56

112

Х103

Рис. 2. Метастатический потенциал клеток РА-23 после 4 циклов отбора на повышение (1) и 4 циклов отбора на снижение (г) частоты встречаемости клеток с микроядрами.

По горизонтали - доза в^в введенных клеток; по вертикали -■ число клонов в легких крыс в расчете на 100 ООО введенных клеток (метастатический потенциал).

вивочных дозах популяция клеток с повышенной ЧКМ имела достоверно меньший метастатический потенциал, чем популяция клеток с пониженной ЧКМ (во всех случаях р <0,001). Причем различия по величине метастатического потенциала в каждом исследованном случае были более чем 50-кратными. Среднее значение метастатического потенциала клеточной популяции с пониженной ЧКМ в субштамме РА-23 составило 11 - 3, а значение метастатического потенциала клеточной популяции этого субштамма с пониженной ЧКМ составило 635-154. Метастатический потенциал клеточной популяции с пониженной ЧКМ в результате отбора не изменился и соответствовал метастатическому потенциалу исходного субштамма РА-23 ( различия не достоверны, р > 0,05), По-видимому, высокая мутабельность клеток РА-2, достигнутая отбором на повышение ЧКМ, приводит к снижению жизнеспособности клеток и, как следствие этого, к снижению злокачественности.

Метзстатэтескм_по;гекциа^^ отбд£а_на_повышеже_и_отбо2э^^

сомными гмостами. При всех исследованных прививочных дозах популяция клеток с повышенной ЧКМс имела достоверно меньший метастатический потенпизл, чем популяция клеток с пониженной ЧКМс с во всех случаях р < 0.05з (рис. 3). Различие по величине метастастатичес-кого потенциала между сублиниями с высокой и низкой ЧКМс оказалось более, чем двадцатикратным. Среднее" знэчение метастатического потенциала клеточной популяции с повышенной ЧКМс составило 1.4;0.43, а Таковое в клеточной популяции с пониженной ЧКМс - 33.6 - 7.4.

Рис. 3. Метастатический потенциал клеток РА-23 после 5 циклов отбора на повышение (1) и 5 циклов отбора на снижение (г) частоты встречаемости клеток с хромосомными мостами.

По горизонтали - доза в^в введенных клеток; по вертикали -число клонов в легких крыс в расчете на 100 ООО введенных клеток (метастатический потенциал).

"Хвостатые" ядра в клеточных популяциях субштамма РА-23. В процессе отбора клонов РА-23 на повышение ;КМс при микроскошрова-нии штологоческих препаратов наряду с хромосомными мостами в интерФазных метках стали встречаться морфологические образования, напоминающие разорванные мосты, для которых мы выбрали название "хвостатые" ядра. Они наблюдались чаще в одноядерных и реже в многоядерных клетках, находящихся в стадии интерфазы, и представляли собой тонкие хроматиновые тяжи, в большинстве случаев оканчивающиеся утолщением на конце в виде микроядрэ.

После отбора клонов РА-23 на пониженную и на повышенную ЧКМс было выявлено, что клоны с повышенной ЧКМс характеризуются также и

высокой частотой клеток с "хвостатыми" ядрами, тогда как в клонах с пониженной ЧКМс величины этого показателя значительно ниже. Средняя частота клеток с "хвостатыми" ядрами в выборке клонов после отбора на повышение ЧКМс составила 9,0%, а средняя частота клеток с "хвостатыми" ядрами в выборке клонов после отбора на понижение ЧКМс составила 0,Ъ% ср < 0.001). В выборке из 135 клонов, объединившей клоны, полученные в результате 1-го, 2-го и 4-го циклов отбора на повышение ЧКМс, был проведен регрессионный анализ. В результате этого анализа получено уравнение вида-лсхэ=о. 49+0. бб*х, указывающее на то, что изменение частоты клеток с мостами на 4.5х вызывает изменение частоты клеток с "хвостатыми" ядрами на 3«. Коэффициент корреляции между показателями "ЧКМс" и "частота клеток с "хвостатыми" ядрами" в этой выборке (п=1зз) составил 0.85 спо t -критерию Стьюдента, р < О.ОЬ.

Отбор__внутрибрюшинных узлов • перевивной миеломы бр 2/0 мышеи

Ш_ПВ^наку_"частота_1Жтдк_с_щ^оя®аш"^ Результаты 4 циклов отбора в/б узлов шеломы ер г/о мышей на повышение и на понижение в них ЧКМ приведены в табл. 4. Средняя ЧКМ достоверно снизилась с 2.1% до 0,6% (р < о,о1); отбор на повышение ЧКМ к достоверному увеличению ЧКМ в в/б узлах не привел. КоэФФИценты реализованной наследуемости ь2 признака "ЧКМ" при этом составили от 0,04 до 0,6.

В целом, представленные данные об эффективности отбора клеточных популяции рабдомиосаркомы РА-2 крыс и миеломы ир г/о мышеи по признаку "ЧКМ" и о величинах ьг свидетельствуют о генетической детерминированности этого признака, а также о наследственной гетерогенности популяции клоногенных клеток по этому признаку в исследованных перевивных опухолях. По-видимому, признак "ЧКМ" является количественным, полигенно обусловленным признаком, о чем свидетельствует постепеннное изменение ЧКМ в популяциях в процессе отбора, а также характер варьирования этого признака в популяциях.

Сравнительный анализ показателей кариотипической изменчивости в клеточных популяциях внутрибрюшииных узлов миеломы £Р а/о__после

микроядрами^ В клеточных популяциях в/б узлов шеломы зр а/о мышей, после отбора на повышенную ЧКМ, процент всех исследованных типов патологических митозов был достоверна выше <р <о,ог ), чем в популяциях после отбора на пониженную ЧКМ.

Отбор ез понижение и отбор на повышение частоты клеток с микроядрзми в з/б углах привел к резким изменениям распределения

Таблица_4л Изменение частоты клеток с микроядрами (ЧКМ) в

в^б узлах миеломы бр г/о мышея в результате отбора в^б узлов на повышение и отбора на понижение ЧКМ.

Направ- Шаг Число Средняя ЧКМ Козффи-ление от- иссле- ЧКМ в отобран- цент ре-отбора бо- дован- выборке ных ализова-ра ных в/б ннай на-

з/б x-s узлов следу- 2 узлов емости к

П о н и ж е н и е

п 0 в ы ш 0- 40 2.1 3,6(4) -

1 30 2,0 3,1(4) 0,04

2 25 2,5 3,8(4) 0,06

н и е 3 30 2,4 4,6(4) -

4 23 2,3 - -

*В скобках указано число отобранных вл5 узлов

клеток по числу хромосом в отселектированных популяциях (рис. 4). В попухяциях клеток, где поддерживалась повышенная ЧКМ, выраженный модальный класс по числу хромосом отсутствует, а клетки с числом хромосом 81-62 составляют всего 15%. Размах изменчивости по числу хромосом значителен - от 35 до более чем 220. Клетки с числом хромосом 35 -55 составляют около 50% всей популяции (рис. 4, б). Напротив, в популяции, прошедшей отбор на снижение ЧКМ, преобладают метки модальных классов ( рис. 4,а), а размах изменчивости хромосом уменьшен.

При изучении клеток в/б узлоз миеломы sp г/о мы встречали микроклетки, которые по всем морфологическим признакам соответствуют индуцированным микроклеткам, описанным ранее Johnson (1976). Следует отметить, что мы обнаружили микроклетки, которые образова-

1) 40 2 ,1 0,57(7) 0,5

1 20 1 .1 0,22(5) 0,6

2 26 0,89 0,12(5) 0,24

3 33 0 .75 0(6) 0,18

4 25 0 .6 _ 0,20

п ■

ц_1_ 1- /

■ п птгП

пш

.к^л.

л-/г/

Л М & & Я

-IV-

Рис. 4. Распределение клеток в/б узлов шеломы эр г/о по числу хромосом после 4 циклов отбора на снижение (а) и 4 циклов отбора на повышение (б) частоты клеток с микроядрами. По горизонтали - число хромосом; по вертикали - число метаФаз.

лись спонтанно. Частота встречаемости микроклеток в клеточной популяции с пониженной ЧКМ (4-й цикл отбора) составила 0,26 ¿0.05Ж, а в клеточной популяции, в которой поддерживалась повышенная ЧКМ,

- 0,68 - 0,08. Полученные результаты свидетельствуют о том, что

»

частоты образования клеток с микроядрами и частоты образования микроклеток существенно влияют на кариотипическую структуру популяции и могут быть основной из причин появления субпопуляции клеток с гипомодальным числом хромосом. Вероятно, вслед за образованием микроядер происходит юс элиминация путем Формирования микроклеток, а клетки, утратившие.хромосомы, участвуют в воспроизведении кариотипической структуры популяций.

Исследуемые морфологические аномалии ядер клеток крови: микроядра в эротроцитах и лимфоцитах, хромосомные мосты в лимфогитзх соответствовали всем установленным для этих видов аномалии ядер критериям. "Хвосты" ядер лимфоцитов в наших наблюдениях представляли собой морфологические аномалии интер?>азных ядер, которые выражались в том, что ядро имело тонкий вырост в пространство цитоплазмы. Часто такой вырост завершался расширением тела "хвоста" на конце в виде овального или круглого микроядра. Длина "хвостов" варьировала от 2 мкм до 7 мкм. Цвет, хроматиновая структура и интенсивность окрашивания "хвостов", как правило, соответствовали таковым признакам ядер лимфоцитов, в которых они наблюдались. Ре-

зультаты изучении более чем 1000 "хвостатых" ядер позволили нам классифицировать "хвосты" разных морфологических Фенотипов в лимфоцитах периферической крови человека и животных. Основные 16 типов "хвостов" представлены на рис. 5 <схема).

Рис. 5 (схема). Морфологические типы "хвостатых" ядер лимфоцитов периферической крови человека и животных.

У человека в норме (без каких-либо предшествующих мутагенных воздействии) наблюдаются преимущественно "хвостатые" ядра типов 6-8, у мышей - 4 и 8, у коров - 3 и 4, а у свиней - 5 и 8. Радиационный Фактор индуцирует Фенотипическое разнообразие "хвостов" ядер. У облученных пациентов и мышей в острый период увеличивается доля "хвостов" типов 1-3. Средняя частота встречаемости ядер с

zz

двумя "хвостами" в груше здоровых доноров составила 3,0%, в то • время как в группе облученных пациентов их было почти в два раза больше - 5,9%. У облученных мышей в отличие от мышей необлученных появились "хвостатые" ядра 5, 9, 14 и 16 типов.

Следует обратить внимание на то, что во всех случаях "хвосты" ядер представляли собой один или два хроматиновых тяжа.

лимФдуигов_

периФврическря крови. Выявлена общая закономерность в распределении блоков гетерохроматина в "хвостах" ядер лимфоцитов человека

in vivo И in vitro (рис.6).

a s ^

Рис. 6. Схемы локализации гетерохроматиновых блоков in vivo, выявленных окрашиванием по Романовскому (а), С-блоков in vitro, выявленных С-окрэшиванием (б), и цзнтромерных сигналов, выявленных fish-методом (в), в "хвостах" ядер лимфоцитов периферической крови человека.

После реакции серебрения ядрышковых организаторов на мазках периферической крови были исследованы 122 лимфоцита с "хвостатыми" ядрами, из них 26,2% в "хвосте" содержали ядрышко. В "хвостатых" ядрах по сравнению с морфологически нормальными ядрами обнаружено увеличенное содержание числа ядрышек на ядро (р <o,ooi).

Клетки с "хвостатыми" ядрами обнаруживались на стадии профазы (в культуре ФГА-стимулированных лимфоцитов, 44-46 ч). Во всех случаях "хвосты" в проФазных ядрах представляли собой хроматиновые тяжи состоящие не более чем из двух нитей хроматина, при этом все они заканчивались слепо, ее возвращаясь обратно в ядро.

Исследование теломерных и прицентромерных нуклеотидных последовательностей в "хвостах" ядер лимфоцитов человека, проведенное методом двухцветной Флуоресцентной гибридизации m situ, показало, что центромеры располагаются преимущественно в основании "хвостов" и (или) в области терминального расширения, а теломеры - в области терминального расширения.

ния in vitro.Частоты лимфоцитов с "хвостатыми" ядрами в популяциях дзуядерных лимфоцитов <после цигохалазинового блока) в облученных культурах (1,5 ву) составила - 1,30 - 0,25%, а в несблученнои 0,40 - 0,12% (различие достоверно (р <0,05)). Данные исследования 1000 двуядерных лимфоцитов с "хвостатыми" ядрами указывают на то, что в большинстве случаев одно ядро имеет "хвост", з второе его не имеет (табл. 5). По-видимому, в основном "хвосты" ядер не образуются путем простого разрыва хромосомных мостов пополам и, следовательно, не являются полумостами.

1аблицэ_5^. Частота встречаемости (%) типов разрывов хромосомных мостов в дзуядерных лимфоцитах после цитохалазинового блока.

Гш_разрыва

Частоты_встречаемдсти_меток_с_знома меетального_Х-обл£Щ Мы исследовали аномалии

ядер типа "хвостатых" ядер в лимфоцитах периферической крови и зритробластах костного мозга мышеи линии ваьв/с после их общего облучения дозами О ву, 0,5 еу\ 1,0 еу; 1,5 оу и 2,0 оу.

Признак "частота встречаемости клеток с "хвостатыми" ядрами" оказался радиочувствительным, т.е. зависал от дозы облучения и в том же эксперименте коррелировал положительно с частотой энэ— и тэдсфзз с хромосомными мостами.

доноров и облученных: пациентов.

Средняя частота встречаемости эритроцитов с микроядрами (ЧЭМ) в контрольной взрослой выборке (5Q мужчин) составила 0,0034 промилля, при размахе изменчивости от 0 до 0,02 промиллей, в то время как в выборке облученных пациентов (101 участник ликвидации последствий аварии на Чернобыльской АЭС) вариабельность этого признака была существенней - от 0 до 0,2? промиллей, а средняя ЧЭМ составила 0,035 промилля. Достоверное различив между выборкой здоровых доноров и выборкой облученных пациентов по изучаемому показателю было аргументировано и-критерием Вилкоксона - Манна - Уигни (р < 0,001). Исследования ЧЭМ проводились также в детских выборках (совместно с И.Е. Воробцовой и О.В. Беляковым). У не облучавшихся ранее здоровых детей <г> = 4i) из С.Петербурга модэльеый класс'составили дети, у которых микроядра не были встречены, размах изменчивости в этой выборке был от 0 промиллей до 0,17 промилля, а среднее значение - 0,017 промилля. У здоровых детей из г. Сосновый Бор (г: =зз) максимальное значение ЧЭМ составило 0,1 промилля, а среднее значение - 0,008 промилля. У более чем 20% из 54 детей, находившихся на территории загрязненной, вследствие аврии нэ ЧАЭС радионуклидами, ЧЭМ превысила 0,1 промилля, а средняя ЧЭМ в этой группе составила 0,19 промилля. Выборка детей, находившихся на загрязненной радионуклидами территории вследствии аврии на ЧАЭС, достоверно отличалась по показателю "ЧЭМ" от контрольных детских групп (р <0,05 в обоих случаях).

Гистограммы распределений груш здоровых доноров и облученных пациентов по частоте встречаемости лимфоцитов с "хвостатыми" ядрами в периферической крови представлены на рис. 7. Во всех контрольных группах модальный класс представлен лицами, у которых "хвостатые" ядра в лимфоцитах не были встречены, а сам признак варьировал 0% до 0,6®. По-видимому, условной верхней границей нормы для показателя "частота встречаемости лимфоцитов с "хвостатыми" ядрами в периФеририческои крови" для человека можно считать 0,8%. Средняя частота лимфоцитов с "хвостатыми" ядрами в контрольной мужской выборке составила 0,14%, в контрольной женской - 0,13%, а в контрольной детской - 0,04%. "Хвостатые" ядра в лимфоцитах были встречены у большинства облученных пациентов. Максимальная величина в этой выборке составила 3,2%, а средняя - 0,56%. Различия между группой облученных пациентов и контрольными груп-

О 0.2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1.4 1,6 1,8 з.г

Рис. 7. Гистограммы распределении лиц контрольной группы и облученных пациентов по признаку "частота встречаемости лимфоцитов с "хвостатыми" ядрами в периферической крови". По горизонтали - частота встречаемости лимфоцитов с ^'хвостатыми" ядрами {%); По вертикали - число обследованных лиц (%);

пами по исследованному показателю, были достоверными (р <0,001, во всех случаях). В груше облученных пациентов наблюдались и дву-ядерные лимфоциты с хромосомными мостами (в среднем 0,07%), а в крови здоровых доноров (мужская группа) аналогичные клетки встречались с частотой 0,005%.

Различия меаду группой* облученных пациентов и группами здоровых доноров по частоте встречаемости лимфоцитов с микроядрами т

vivo были достоверными (р < 0,01 во всех случаях). Средняя частотз лимфоцитов с микроядрами в выборке ликвидаторов составила 0,21%, а таковой показатель в выборках лиц контрольных груш составил 0,07% у мужчин, 0,06% у женщин и 0,05% у детей. В выборке облученных пациентов признак "частота лимфоцитов с микроядрами" коррелировал положительно с признаком "частота лимфоцитов с "хвостатыми" ядрами. Коэффициент корреляции составил 0,4 (п = 160, р <0,001).

3§5ТО1ьи!®{ф01Ш0в_2_®Ш51ЕШв5ШИ_1ВОйосойамз были определены у 47 облученных пациентов с различными частотами встречаемости лимфоцитов с "хвостатыми" ядрами. Положительная корреляция между показателями "частота лимфоцитов а "хвостатыми" ядрами в периферической крови in vivo" и "частота ФГА-стимулированных лимфоцитов с дицентриками в культуре in vitro" в этой выборке оказалась статистически значимой (р<0,001), а коэффициент корреляции, вычисленный по Спирмену, составил 0,73. Повышенные частоты дицентричес-ких хромосом в лимфоцитэх (выше 0,1%) были выявлены у 17 из 22 пациентов, у которых частота лимфоцитов с "хвостатыми" ядрами была от 0,8Ж и выше.

Были обследованы несколько облученных пациентов с повышенным содержанием "хвостатых" ядер и дицентрических хромосом. Маркерные хромосомы с аномально удлиненными длинными плечами у этих пациентов обнаружены не были, а полученные данные указывали на повышенную частоту аберраций не только нестабильного, но и стабильного типа.

Аномалии ядер клеток периферической крови у крупного__рогатого

скота_в^орме_и_п2И_лейкозе. Средние значения ЧЭМ у коров (выборки 1-5, см. таблицу) составили 0.032, 0.036, 0.029, 0.037 и 0.034 промиллеи, соответственно. Между этими выборками достоверные различия по ЧЭМ выявлены не были (р > 0,05), несмотря на принадлежность этих выборок животных к разным породам и регионам. Средние величины ЧЭМ у быков (выборки 6 и 7) составили 0,015 и 0,010 промиллеи, соответственно. В выборке быков отмечается меньший размах изменчивости признака "ЧЭМ", чем у коров. Среднее значение ЧЭМ в объединенной выборке коров составило 0,033 промилля, а в выборке быков - 0,013 промилля . Выборки быков достоверно отличались от всех исследованных выборок коров (р < 0,01).

Сопоставление частот встречаемости эритроцитов с микроядрами в костном мозге и в периферической крови коров показало, что

лтуатттгсег гэлтт-иэттолипл'гт* ттп тл-^по^о'гп^т/'тгт.г^гу' ортлпчг>птптт,пп г»

и^/ДиЛЛ T.G w i U i d ¿Jw i £/ч/ VIA i^wwuui^uutu л у/Ои w

микроядрзми з костном мозге составила 0,61 промилля, в то время как в периферической крови средняя частота встречаемости ортохром-кых эритроцитов с микроядрзми составила 0,033 промилля.

О 0,2 0,6 0,8% . О 0,2 0,6 0,8%

¿ж.8.Гистограммы распределения коров контрольной группы (а), ?Ид-полсжитэльных '(б) и с гематологической стадией лейкоза (в) по признаку "частота встречаемости лимфоцитов с "хвостатыми" ядрами".

По горизонтали - частота лимфоцитов с "хвостами" {%)•, по вертикали - число ссобеи (%),

"Хвостатые" ядра в лимфоцитах наблюдали у большинства леякоз-ных коров (рис. 8,з), з з контрольной группе лимфоциты с "хвостатыми" ядрами встретились только у 7 из 25 коров (рис.8,а). Средняя

частота встречаемости лимфоцитов с "хвостатыми" ядрами в выборке коров с гематологической стадией лейкоза составила 0,22 %, а в контрольной - 0,09% (различия между выборками достоверны р < 0,05). Выборка РЯД-положительных коров не отличалась достоверно от выборок контрольной группы и коров с гематологической стадией лейкоза (р > 0,05, в обоих случаях) при среднем значении 0,11 % (рис.8,б). В периферической крови у животных с гематологической стадией лейкоза мы наблюдали двуядерные лимфоциты. Из 12 500 исследованных лимфоцитов 136 (1%) были двуядерными. Среди таких клеток 27,6% имели хромосомные мосты, а 3,7% - "хвостатые" ядра. Исследованные группы коров не различались между собой достоверно по показателю "частота встречаемости лимфоцитов с минроядрами" (р > 0,05 во всех случаях).

выводы

1. Популяции кланогенных клеток рабдомиосэркомы РА-2 крыс и миеломы эр 2/о мышей наследственно и Фенотипически гетерогенны по признаку "частота клеток с ядерными аномалиями", а искусственный отбор по признакам "частота клеток с микроядрами" и "частота клеток с хромосомными мостами" в этих популяциях оказался эффективным. Коэффициенты реализованой наследуемости этих признаков варьируют в популяциях в пределах от 0,01 до величин, близких к единице, что указывает на влияние- средовых, наследственных и мутационных Факторов в их вариабельности.

2. Искусственный отбор в популяциях клеток по признаку "частота встречаемости клеток с аномальными ядрами" выявил взаимосвязь между процессами возникновения структурных хромосомных аберрации и геномных мутации.

. 3. Между признаками "частота клеток с микроядрами" и "частота клеток с хромосомными мостами", характеризующими кэриотипическую нестабильность, и признаком "метастатический потенциал", характеризующим пролиФеративньи потенциал, выявлена отрицательная корреляция. С помощью искусственного отбора можно повысить частоты спонтанных кариотипических нарушений до таких значений, при которых начинается репродуктивная гибель клеточных популяций.

4. Аномалии ядер типа "хвостов" представлены определенным числом морфологических типов, "Хвосты" ядер лимфоцитов человека и

животных сохраняют свойства хроматина ядер. Блоки гетерохроматикэ и, в частности, прицентромерного гетерохроматина локализованы в терминальном расширении "хвоста" и в области соединения ядра с "хвостом". "Хвосты" ядер могут содержать теломерные куклеотидные последовательности. В "хвостах" ядер встречаются ядрышки, а сами "хвостатые" ядра имеют достоверно больше ядрышек, чем морфологически нормальные ядра. "Хвостатые" ядра могут вструпать в митоз.

5. Частота встречаемости клеток с "хвостатыми" ядрами (лимфоцитов и эритроблзстов) in vivo является радиочувствительным показателем и положительно зависит от дозы общего облучения.

6. В клеточных популяциях m vivo выявлена положительная связь между показателем "частота встречаемости клеток с "хвостатыми" ядрами и показателями "частота дицентрикоз", "частота анз- и телоФаз с хромосомными мостами", "частота интерФазных клеток с хромосомными мостами", "частота клеток с мккроядрзми".

7. Определены Фоновые спонтанные частоты встречаемости лимфоцитов периферической крови in vivo с "хвостатыми" ядрами и микроядрами у людей. Выборка облученных пациентов (ликвидаторов) достоверно отличается по этим показателям от выборок здоровых доноров (р <0,01). Выборки облученных в следствии аварии на ЧАЭС пациентов Достоверно отличаются от выборок практически здоровых доноров по показателю "частота встречаемости эритроцитов периферической крови с микроядрами" (р <0,01).

8. Определены частоты встречаемости эритроцитов с микроядрами периферической крови в популяциях крупного рогатого скота различных пород и из разных регионов России и ближнего зарубежья. Установлено достоверное различи© по признаку "частота встречаемости эритроцитов в периферической крови с,микроядрами" между коровами и быками (р < 0,05).

9. Коровы с гематологической стадией лейкоза достоверно отличаются от здоровых коров по показателю "частота встречаемости лимфоцитов периферической крови с "хвостатыми" ядрами" (р < 0,05).

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖИМ

1.Разработаны и апробированы способы селекции клеточных популяций перевивных опухолей, с помощью которых можно получать суб-поцуляции клеток с повышенными частотами спонтзеных кариотипичес-ких нарушений и субпопуляции клеток с пониженными частотами спон-

танных кариотипических нарушении. Рекомендуется использовать метод отбора по признакам "частота встречаемости клеток с микроядрами" и "частота встречаемости клеток с хромосомными мостами" в популяциях клеток, представляющих биотехнологический интерес.

2. Рекомендуется проводить количественный учет аномалии ядер клеток (микроядер, хромосомных мостов и "хвостатых" ядер) в диагностике и терапии онкологических заболевании.

3. Рекомендуется использование показателей, характеризующих аномалии ядер (микроядер, хромосомных мостов и "хвостатых" ядер), в клеточных популяциях in vivo при проведении цигогенетического прескрининга.

4. Рекомендуется создание протоколов для проведения нового цигогенетического экспресс-теста, основанного на выявлении клеток С "ХВОСТаТЫМИ" ЯДраМИ В раЗЛИЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ in vivo И in vitro.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Кравцов В.Ю., Ильинских Н.Н, Гужова И.В., Каминская Е.В., Бахтин Ю.Б. Отрицательная корреляция мевду частотой клеток с микроядрами и метастатическим потенциалом в популяциях клеток рабдомиосаркомы РА-2 крыс // В кн.: Тез докл. Всесоюзной конференции по генетике соматических клеток в культуре, М., 1989, С.20.

2. Нургалиева К.П., Исмзилов Б.И. Кравцов В.Ю., Ильинских H.H., Бахтин Ю.Б. Частота клеток с микроядрами в клеточных популяциях рабдомиосаркомы РА-2 крыс в отдаленные сроки после облучения. // В кн.: Тез. докл. "1-й Всесоюзный радиобиологический съезд", Пуашо, 1989. Том 5, С.1192.

3. Кравцов В.Ю., Медведев С.Ю., Козикова Л.В., Яковлез А.Ф. Повышенная частота клеток с микроядрами у кроликов, полученных из зигот после инъекции гена рилизинг-«актора гормона роста человека. // Бюллетень научных работ ВНИИГШ, Л. 1989. Вып. 112. С.24-28.

4. Kozikova L. V. , Kravtsov V. Yu. . Medvedev S. Yu. , Yakovlev A. F. Micronuclei test on rabbits obtained after microinjection with hMT-GRF to zygotes. Abstr. of 4-th Ffanco-C=echosiovak meeting "Through the oocyte to the emryo" Prague. 1990. P. 91.

5. Кравцов В.Ю., Гужова И.В., Каминская Е.В., Ильинских Н.Н, Бахтин Ю.Б. Нестабильность генома и метастэтический потенциал клеток рабдомиосаркомы РА-2 крыс// Доклада АН СССР, 1990, Том 310, н.5, С.1239-1241.

6. Кравцов В.Ю., Гужоза И.В., Каминская Е.В., Ильинских Н.й, Бахтин Ю.Б. Клокальньга анализ кариотшической нестабильности и метастатического потенциала в популяциях опухолевых клеток // Генетика, 1990, Том 28, N.9, С.1584-1589.

7. Кравцов В.Ю., Яковлев А.Ф., Федорова Е.В., Бахтин Ю.Б. Отбор на снижение и повышение спонтанной нестабильности кариотипа в клеточных популяциях перевивной миеломы sp г/о мышей // Доклады АН СССР, 1991, Том 320, N.4, С.1000-1003.

8. Proshin S.U., Kravtsov V. Yu. , Novitsky V. V. , Ilinskikh N.N. The study of micronuclei level in humans normal and tumor cells. Abstr. of Int. Congress of Human Genetics, Washington. 19Эг. N 324.

9. Кравцов В.Ю., Горохов C.B., Каминская E.B., Ильинских H.H., Бахтин Ю.Б. Зависимость частоты встречаемости клеток с микроядрами в экспериментальных метастазах рабдомиосаркомы крыс от длительности роста и размеров этих метастазов // Цитология, 1992, Том 34, N.3, С.28-30.

10. Кравцов В.Ю., Яковлев А.Ф., Каминская Е.В., Бахтин Ю.Б. Частота клеток с мостами при отборе клонов перевивной рабдомиосаркомы РА-2 крыс на повышение и снижение частоты клеток с микроядрами // Доклады РАН, 1992, Том 234, N.2, С.440-444.

11. Кравцов В.Ю., Федорова Е.В., Яковлев А.Ф., Бахтин Ю.Б. Описание к патенту "Способ селекции клеток in vivo" Госпатент РФ SU 18061S5 A3 С 12 N 15/00 5/00, 1992.

12. Кравцов В.Ю., Розанов Ю.М., Каминская Е.В., Яковлев А.Ф., Бахтин Ю.Б. Изменение частоты клеток с микроядрзми в клеточных популяциях перевивной рабдомиосаркомы РА-2 крыс в результате отбора на повышенную и пониженную частоту таких клеток // Цитология, 1992, Том 34, м.7, С.91-96.

13. Кравцов В.Ю., Федорова Е.В., Каминская Е.З., Гужовэ К.В., Яковлев А.Ф., Бахтин Ю.Б. Межклональные и межпспуляционныэ разлитая по частоте микроядер з популяциях клеток перевивной рабдомиосаркомы крыс // Вопросы онкологии, 1992, Т.38, n ю. С. 1228-1235.

14. Кравцов В.Ю., Каминская Е.В., Яковлев А.Ф., Бахтин Ю.Б. Патологические митозы з клонах сублиний перевивной рабдомиосаркомы крыс РА-2, отселекгирозанных на повышенную и на пониженную частоту Формирования спонтанных микроядер // Цитология, 1994, Том 38, N4, С.

i ^ ITnvnovAqQ М Тч ^тиатзттптэ к "-Л Qvnu тгогз Д ib Г)тт<=»1Гс/о vr-inví г>_

-¡.».<1 i.r.'-f •-1-V.*^.«'.» .'Ii L' I I i-vr-"-»—«-l-*-- ^ i-' S IV I > ittlvi^ivw »•«•*•» J,»*—

сомнои нестабильности в популяциях эритроцитов^ коров. ^ В кн.: "Материалы Международного симпозиума "Молекулярная генетика и биотехнология в оценке и изменении геномов сельскохозяйственных животных"". 1994, С.- Петербург, С.58-60.

16. Прошин С.Н., Кравцов В.Ю. Субклонирование по признаку "частота клеток с хромосомными мостами" в клеточных популяциях перевивной рабдомиосаркомы крыс РА-23. Там же, С.90-91.

17. Fiodorova E.V. , Trusova V. G. , Vakhtin Yu. В. , Kravtsov ' V. Yu. Thermal resistant experimental lung metastases of. rat transplantable rhabdomyosarcoma. Abstr of 16-th Internat. Cancer Congress UICC, 1994, Vol. 1. New Dehli. P. 356.

18. Медведев С.Ю., Кравцов В.Ю., Козинова Л.В., Яковлев А.ф. Нестабильность генома кроликов и свиней, полученных из . зигот, в которые инъецировали ген рилизишхрактора гормона роста // В кн.: Тез. 1-й Международной конференции "Молекулярно-генетические маркеры животных" Киев, 1994. С.

19. Kravtsov V. Yu. , Fiodorova Е. V. , Yakovlev A. F. . Vakhtin Yu. В. Artificial selection for karyotipic stability in mice myeloma cell populations. Abstr. of Internat. Conference "Biotechnology - 1994". S.-Petersburg, 1994, P. 89-30.

20. Fedortseva R. F. . Slozina N. M. Neronova E.G., Kharchenko T. V. , Kravtsov V. Yu. . Nikif-orov A.M. Late results of the exposure to small dose radiation Ccytogenetical research!). Abstr. Int. Symp. "Current problems of childhood panmyelopathies: focus on rr.ye 1 cdysplastic syndrome". Moscow, 1994, P.35-3S.

21. Прусзкова M.В., Кравцов В.Ю., Медведев С.Ю., Янушаускас К.Т., Яковлев А.Ф. Половые различия по признаку "частота эритроцитов с микроядрами в периферической крови" у крупного рогатого скота (Bos taurus и. )Вторая Межд. конф. "Актуальные проблемы биологии в животноводстве". 1995. Боровск, С. 31.

22. Федорцева Р.Ф., Кравцов В.Ю., Прусакова М.В., Треус В.В., Ярцева Н.М., Яковлев А.Ф., Никифоров A.M. Перспективы изучения стабильности кариотилз с использованием метода учета аномалии ядер лимфоцитов. В.кн.: Тез докл. Рос. Конф. по детской гематологии "От науки к практике". 1995, С.-Петербург, С.25.

23. Fedortseva R.F. , Kravtsov V. Yu. , Treus V. V. . Yartseva N.M. , Nikiforov A.M. Increased frequency of lymphocytes with tailed nuclei in irradiated patients ss Experimental Hematology. 1993. Vol. 33. N8. P. 943.

24. Дудак M.Г., Прошин С.H., Крззцсз В.Ю., Красноз А.И., Мельников В.П. Исследование частоты микроядер з клетках костного мозга и эритроцитах периферической крови у детей с ортопедической патологией.''/ 3 кн.! Гез докл. ■ Всероссийской научно—практической конференции детских ортопедов-травматологов. 1995, С-Петербург, С.293-294.

25. Тюкзчева М.В., Кравцов Б.Ю., Старожилова Т.П., Яковлев А.Ф. Аномалии ядер лимфоцитов у больных лейкозом коров // Доклады РАСХН. 1996. N.4. С.48-49.

26. TJukacheva M. V. . Kravtsov V. Yu. , Staro=hilova T. P. . ïakovlev A. F. Frequencies of mlcronucieated erytrocytes in peripheral blood In Bos taurus L. relation with sex and leucenlc process. 47th Annual Meeting of the EAAP. 1995. Lillehammer. Norway. P. 202.

27. Старкова E.B., Кравцоз В.Ю., Федорцеза Р.Ф. Аномалии интерфазных ядер лимфсцитоз з периферической крови у ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС. "Еопросы трансФузиологии и клинической медицины". Материалы 5-й научной конференции молодых ученья. '1996, Киров, С.46.

28. Fedcrtseva R. F. . Kravtsov V. Yu. , Nikiforov A.M. Cytogenetic approach in the appreciate of genome instability in liquidators of the Chernobyl nuclear power station accident // Medizinische Genetik. 1996, Vol. S. N1. P 73.

29. Fedortseva P.. F. . Zybina N.M., Katashkova G. D. , Kravtsov V. Yu. , Nikiforov A.M. Evaluation of clastogenic effects of the oxidative stress. Proceedings 16th Ir.t. Congress of Clinical Chemistry. 19S8. London, P. 112.

30. Прошин С.H., Кравцов В.Ю., Яковлев А.ф. 0 возможности селекции на стабильность генома ¡стонов эукзриотических клеток. В кн.: Тез. докл. 40-й научно-практической конференции Астрзхзнского технологического университета. 1996, Астрахань, С.45.

31. Кравцов В.Ю., Прошин С.Н., Федорцева Р.ф., Треус В.Б., Никифоров A.M., Яковлев А.Ф., Бахтин Ю.Б. Частота встречаемости клеток с полумостами з клеточных популяциях in vivo// Доклады РАН, 1996, т.350, N з, С.831-833.

32. Кравцоз В.Ю., Прошин С.Н., Каминская Е.В., Яковлев А.Ф., Федорцеза Р.Ф., Бычкова Н.В., Бахтин Ю.Б., Никифоров A.M. Описание изобсетения "Способ селекции клеток in vivo" (Ззязкз на изобретение м 95111Qss от 11.07.1995.)

33. Fedor tssva R. F. , Kravtsov V. Yu. . Starkova Ye. V, Mikiforov A.M. New biological approach® in the estimation oi* chrcrr.oscrr.e instability in Chernobyl accident recovery workers. Abstr. Ir.t. Ccnf. on Radiation and Health. Beer Sheva, Israel. 1996. P. S3.

34. Федорцевз ?.Ф., Кравцоз В.Ю., Старкова Е.Б., Тюкзчевз М.В., Никифоров A.M.. Перспективы выявления хромосомных аберрации у облученных пациентов путем исследования интерФззных ядер в лимфоцитах периферической крови in vivo. Материалы научно-прзктичес-кои конференции "Медико-социальные аспекты проблем ветеранов-атомщиков и пути их решения". 1997, С.-Петербург, с. 110.

35. Кравцов В.Ю., Федовцева Р.Ф., Старкова Е.В., Твкэчевз М.В., Яковлев А.ф., Никифоров A.M.. "Хвостатые" ядра - возможный маркер радиационных воздействии в клеточных популяциях. // В кн.: Тез. докл. на 3-м съезде по радиационным исследованиям. 1997, Москва. Т.2, С.16.

36. Старкова Е.В., Логинова О.А., Кравцов В.Ю., Федорцева Р.Ф.. Локализация гетерохромэтинз и ядрышек в "хвостатых" ядрах лимфоцитов облученных пациентов. Там же, С.34.

37. Федорцевз Р.Ф., Кравцов В.Ю., Старкова Е.В., Тюкзчезз М.В., Яковлев А.Ф., Никифоров A.M. Частота встречаемости лимфоцитов с аномальными ядрами в периферической крови m vivo у облученных пациентов. Там же, С.35.

38. Кравцов В.Ю., Федорцева Р.ф., Логинова Ю.А., Старкова Е.В., .Тюкачева М.В., Яковлев А.Ф., НикиФороз A.M. Морфологические аномалии ядер типа "хвостов" в лимфоцитах и их связь с дицентри-ческими хромосомами у облученных пациентов " Генетика. 1997. Т.33. N 12. С.1675-1680.

39. Fedortseva R. F. . Kravtsov V. Yu. , Beiyakov О. V. . Vorobtso-Va X. Ye. . Nekrasov V.N. , Nikiferov A.M. Late cytogenetics consequences of Chernobyl accident in child International Journal of Pediatric Hematology a Oncology, 1997. Vol. 4. N3. P. 293-299.

40. Кравцов В.Ю., Прошин C.H., Яковлев А.Ф., Каминская Е.Б., Бахтин Ю.Б. Мосты и многополюсные митозы в популяциях клеток РА-23 крыс ^ Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1997, I.

!123, С.569-572.

41. Kravtsov V. Yu. , Starkova Е. V. , Loginova Yu. A. , Yakovlev A. F. , Nikiforov A.M. , Fedortseva R. F. ."Tailed nuclei are a

1 ^1 Ь' c^1 1 mir-^e*' о** ^ * 1 — О.

International Cenfsrenсе on "Low doses of ionising radiation: biological effects and regulatory control ". Book of Papers. 1ЛЕА-CM-67/117. p. 372-375.

42. Kravtsov V. Yu. . Fedortseva R. F. , Starkova Ye.V. , Loginiva Yu. A. . Tyukacheva M. V. . Yakovlev A. F. . Mikiforov A.M. Tailed shape of nucleus as a possible indicator of chromosome aberrations Cytoger.et Cell Genet. 1997. Vol. 77, N 1-2. P. 7.

43. Fedortseva R. F. . Eravtsov V. Yu. . Starkova Ye.V.. Tyuka-cheva M. V. , Yakovlev A. F. . Nikiforov A.M. Tailed shape of nucleus as a possible indicator of chromosome aberrations // Cytogenet Cell C-enet., 1997. Vol. 77, N 1-2, P. 69.

44. Пронин G.H., Крзвцсв В.й., Ольнев М.Г., Яковлев А.Ф., Бахтин Ю.Б. Хромосомные мосты и "хвостатые" ядра в популяциях злокачественных клеток // Генетика. 1998. Г.34. n 1. С.61-64.

45. Кравцов В.Ю. Радиоспецифические аномалии ядер интерФзз-ных клеток в прескрининге хромосомных аберрация у ликвидаторов. В сб: "Социально-психологические последствия Чернобыльской катастрофы". 1998. С 261-262.

ПЛД й 69-12 от 24.03.94

Ротапринт. Подписано к печ.29.05.98. Формат бум.60x84 1/16 Объем 2 уч.-изд.л. Тираж 100 экз. Заказ 262

АООТ "НПО ЦКГИ", 194021, Санкт-Петербург,Политехническая ул,,д.24