Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Факторы, влияющие на развитие эмбриональных стволовых клеток крупного рогатого скота и мыши в системе IN VITRO и IN VIVO

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Факторы, влияющие на развитие эмбриональных стволовых клеток крупного рогатого скота и мыши в системе IN VITRO и IN VIVO"

РГ6 ' од 1 3 ИЮН

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЯИВОТНОВОДСТВА

(ВИВ)

На правах рукописи

ЫИТАЖЮЕА Май сам Ыузапаровна

ФАКТОРЫ. ВЛИЖЩИЕ НА РАЗВИТЫЕ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА й ИШВ В СИСТЕМЕ IN VITRO Н IH VIVO

03.00.13 - Физиология человек

и животных 03.00.15'-» Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Дубровицы, Московской области 1995

- г -

Работа выполнена по плану научно-исследовательских работ в лаборатории клеточной инженерии ВНИИ животноводства, а такке на базе Института генетики человека МГНЦ РАМН в лаборатории генетики развития и в лаборатории- клонирования научной биотехнолсгической компании "Американская служба разведения" (ABS, США).

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Стрельченко Н.С.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Кононов В.П.; доктор биологических наук Какпаков В. Т.

Ведущее учреждение: Московский Государственный Университет*им. М. В. Ломоносова. .

Защита диссертации состоится " У " ¿^-¿х-'-? 1995 года в '¿(Р часов на заседании диссертационного Созета Д.020.16.02. при Всероссийском научно-исследовательском институте нивотноводс-тва.

Адрес института: 142012, пос. Дубровицы, Подольского района Московской области. - С диссертацией мокко ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан года.

Учен, ый секретарь специализированного Совета доктор биологических наук

П. А. Науменко

- 3 -

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Быстрое развитие биологии и генетик в частности за последние десятилетия явилось результатом разработки новых, современных методов. Получение культуры эмбриональных стволовых (ES) клеток, характеризующихся плврипотентными свойствами, представляет собой новый инструмент для решения задач генетики, биологии развития, молекулярной биологии, медицинской генетики, биотехнологии и др.

ES-клетки сохраняет все свойства ранних эмбриональных клеток, то есть является плврипотентными, и способны дифференцироваться in vitro, повторяя раннее развитие эмбриона после имплантации. Таким образом, они могут быть использованы как удобная модель in vitro для изучения процессов дифференцировки б развитии млекопитающих (Doetschman et al., 1985).

Примечательно, что ES-клетки сохранят- шюрипотентныэ свойства в течении длительного культивирования in vitro и после введения в полость нормальной бластоцисты способны участвовать в формировании всех органов и тканей химерного оргакн;ыа, включая зародышевые клетки (Robertson et al., 1986: Robertson, 1991; Lallonand and Brulet, 1990: Mann, 1990). Это сеойстбо ES-клеток Позволяет использовать их как носителей для введения чужеродных генов и получения трансгенных млекопитающих непрямым способом (Gossler et al., 1986; Robertson et al.. 1986).

Наиболее распространенным видом среди млекопитающих, у которых получены ES-клетки являются пока мыши (Yang and Anderson, 19Э2), Были сделаны попытки изолировать ES-клетки из домашних кивотных, и не безуспешно. Так были получены ES-клетки из эмбриона свиньи (Notariannl et al.. 1990, 1991; Piedrahita et al.,1990). овец (Handyside et al.,1987: Piedrahita et al.,1990), крупного рогатого скота (KPC) (Anderson,1992), . норки (Sukoyan et al.,1993). Эти клетки показали морфологическое и функциональное сходство с мышиными ES-клетками в течении дифференцировки in vitro и in vivo. Но в отличие от ES-клеток мыши для этих клеток было бы правильным применить термин ES-подобный. так как они показали ограниченные возможности в формировании клеточных типов в течении спонтанной или индуцированной дифференцировки и по причине неспособности формирования химер. Поэтому важной остается проблема получения истинных ES-клеток у домашних животных.

Возможность клонирования цлекопитаащих путеы трансплантации ядер бластомеров в знуклеированные ооциты была по!<азача у крупного рогатого скота (Bondioli et al., 13Э0) и кроликов (Slice, 1989). Клонирование представляет собой метод для производства идентичных особей сельскохозяйственных ¡кивотных с выдающимися продуктивными качествами. Ядра бластомеров эмбрионов прегаструля-ционных стадий были до недавнего времени единственным источником доноров в процессе клонирования. В настоящее время ведутся успешные попытки использования ES-клеток сельскохозяйственных животных в качестве доноров ядер (Salto et al., 1992; Strelchenko et al.,1995). ES-клетки сельскохозяйственных еиботных могли бы быть использованы как неиссякаемый источник тотипотентшх ядер. Существует ряд трудностей, ограничивающих коммерческое использование метода трансплантации ядер для клонирования еиботных. Они связаны в основной с неполноценностью развития ES-эмбрионов (эмбрионов, полученных методом трансплантации ядер ES-клеток в энук-леированные ооциты) после имплантации. «Это может объясняться частичной дифференцировкой ES-клеток, а таете кариотипическими изменения!,м недифференцированных клеток в процессе длительного культивирования in vitro.

Неспособность формирования химер из-за кариотипических изменений, происходящих при длительном культивировании in vitro показаны на линии ES-клетои мьши D3 Шиталипов. 1994). В литературе нет сообщений о влиянии условий и длительности культивирования на гиюрипотентные свойства ES-icrieroK сельскохозяйственных животных.

Начало ¡снеточной дифференцировки в раннем эмбриогенезе млеког питавших связано со статусом Х-хрсыосомы. Одна из Х-хроыосом у Ебнских особей ».ыдей инактивируется сначала в клетках трофэкто-дермы, затем в первичной энтодерме и клетках эпибласта (Rastan and Robertson, 1985). Так как Х-инактивация связана с началом процессов дифференцировки, ES-клетки представляют собой удобную модель In vitro, в которой этот механизм может контролироваться экспериментально. Увеличение процента инактивированных Х-хромосом в дифференцированных ES-клетках мышей впервые показали Rastал с соавторами (1985), зате:-,: на ES-клетках другого млекопитающего -норки Сукояи с сотрудниками продемонстрировали то se самое (Suko-yan et al., 1993).

Цель и задачи исследований. В соответствии с вышеизложенным, цель» работы явилось разработка метода получения линий плюрипо-

тентных стволовых клеток KPG и анализ факторов влияющих на их развитие in vivo и in vitro з сравнении с ES-клеткаыи ныши.

Для достияения цели необходимым условием явилось решение следующих задач: '

- разработка метода получения и культивирования ES-клеток КРС;

~ сравнительный анализ морфологических и ростовых характеристик полученных ES-клеток КРС и мыш:

- сравнительный анализ способности ES-клеток КРС и мыш к диф-ференцировке In vitro.

- изучение влияния длительности культивирования ES-клеток КРС и мыши на их способность поддерживать развитие In vivo;

- изучение влияния длительности культивирования in vitro на стабильность кариотипа ES-клеток мши и КРС;

- разработка метода тестирования шюрипотентности ES-клеток КРС in vitro, основанного на анализе инактивации одной Х-хромосо-мы в венских линиях ES-клеток в процессе дифференцировки.

Научная новизна. Впервые разработана методика получения и культивирования эмбриональных стволовых клеток крупного рогатого скота (КРС). Охарактеризованы морфологические и ростовые особенности ES-клеток КРС in vitro. Плярипотентная природа полученных ES-клеточных линий доказана путем ивдукции дифференцировки в различные типы специализированных клеток in vitro и способностью развиваться in vivo вплоть 40-55 дней стельности после трансплантации ядер ES-клеток в знуклеированныэ ооциты. Впервые показано влияние длительности культивирования и происходящих при этом изменений кариотипа на способность ES-клеток КРС формировать плод.■ ■Путем гистохимического окрашивания бензидином дифференцированных производных ES-клеток выявлено присутствие Еысокоспециализирован-кых клеток крови - эритроцитов. Впервые предлохен метод клонирования КРС путем трансплантации ядер КЗ-клеток в энуклеированные ооциты. Впервые предложен новый метод субклонирования ES-клеток КРС.

Практическая значимость. Полученные дашке о влиянии различных факторов на развитие ES-клеток in vitro и vivo позволяют, более эффективно использовать ES-клэтки в научных целях и клонировать животных с выдающимися хозяйственно-полезны!.® признаками.

Зкпериментальныэ данныэ по получений и культивировании ES-кле-ток КРС, а также использование их в качестве доноров в технике трансплантации ядер является новыми в мировой практике и могут

>

w _ e -

представлять практический интерес в методической аспекте.

Апробация диссертации. Основные положения диссертации были представлены на международной научной конференции по проблемам эмбриологии (Калгари. Канада. 19Р5), на научном семинаре лаборатории генетики развития Института генетики человека МГНЦ РАМН, состоявшемся в ноябре 1994 года, на объединенной научной конференции отдела биотехнологии и лаборатории биохимии ВНИИ аивотно-водства.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 1 экспериментальная научная статья, 4 тезиса.

Обгем и структура работы. Диссертация изложена на 118 страницах машинописного текста, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и метода, результаты, обсуждений выводы, список литературы. Указатель литературы содержит 14 отечественных и 152 иностранных библиографических источника. Диссертация иллюстрирована 1 схемой, 8 таблицами, 2 рисунками, 19 фотографиями и 3 гистограммами.

СОДЕРШШЕ РАБОТЫ.

Работа выполнена по плану научно-исследовательских работ в лаборатории клеточной инзенерии ВНИИ животноводства, а также на базе Института генетики человека МГНЦ РАМН в лаборатории генетики развития, и в лаборатории клонирования животных научной биотехнологической компании "Американская служба разведения". На рисунке 1 представлена комплексная схема проведения экспериментов, в результате которых были получены данные по характеристике ES-клеток КРС in vitro, их кариологии и способности формировать плод.

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Линии ES клеток использованные в работе. Линии ES-клеток КРС ES-i, 2,3,4,5. а таксе первичная культура клеток легкого и печени ES-эмбриона КРС 40-дневного срока развития получены б наших экспериментах по методике описанной ниже.

Два клона D3M и D3W ES-клеток мыши линии D3 (Döetschaan et al..1985) любезно предоставлены Dr.G.Brem из университета Людвига Максимилиана (Мюнхен, Германия) и Dr.R.Kemler из института иммунобиологии Общества Макса Планка (Фрайбург, Германия). ES-D3 клетки являются ыуяской линией и получены из бластоцисты мкзей линии 129/Ter Sv »(генотип по окрасу шерсти А" А*, ВЗ, СС)

СХЕМА ЭКСПЕРИМЕНТА

I Вымывание | ооцитсв

Энуклеация ооцитов

■гвенция > клетки

дектро лияние

Оплодотворение

ооцитов •"х^го

Изоляция ВКМ бластоцисты

Еэ клетки .. Дкффетэенцировка э культуре ЕЗ клеток

Кариотипический анализ Еэ клеток

Трансплантация

ложно-беременной

самке

Развитие

до бластоцисты з.п vitro

Развитие плода до ЭД-55 дней

Рис. I . Схема эксперимента

Линия ES-клэток STR предоставлена к. б. к. Н. С. Стрвльченко (Institut îur Tierzucht und Tierverbalten, Марнензее, Германия). ES-STR клетки получены из бласгоцксты шшей линии 14 COS/Glw.

Культиаирование ES-клеток шш проводили в среде ДНЕМ, содер-хащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки, 0,1 мМ 2-иеркалтоэта-нола и lf.il ¿-глзтамжа.

Для получения и культизирозания ES-клеток КРС использовали гладкую среду Апьфа-ШМ, содержащую 102 эмбриональной сыворотки. Uli! Ь-пззтамша, 0,1ыМ 2-ыэркаптоэтанола.

В качестве фидерных клеток использовали первичную культуру эмбриональных фибробластов (EF) шши. пролиферация которых была блокирована штоыициком С <10 ыкг/мл).

Получение Е8-;шеток КРС. Для получения ES-клеток КРС использовал]'! 8-10-дневнкз бластоцисты. спонтанно освободившиеся из блестящей оболоч1си, шбо удаляли оболочку раствороы проназы (Зиг/ыл). Затем вибрионы по- одному переносили в чаши с ионослаем кнаюгкви-ровакных Фадерцых клеток со средой Апьфа-ЫЕ?.'. Смену среды прово-дили.каЕдке 2"дня. ;

Послэ прикрепления клеток внутренней клеточной массы (BIffl) ' к поверхности фидерных клеток ежедневно следили за их ростдц и морфологией. Первый пассак проводили при достижении ¡слетками ВКМ ыо-нослоя диаметром 5 мм. Пересев проводили при помощи пастеровской -гашетки..

Поддержание ES-клеток КРС в культуре In vitro. Поддернание ES клеток в недифференцированном состоянии осуществлялось перио-дчческим пересевом ка свежий слой инактивированных эмбриональных фибробластоо ши. Пересев клзток проводим через кагдые 2-3 дня' механическим способом.

Препараты метафазных пластинок-ES-клеток КРС готовили по методу Канда (Kanda, 1973), ES-клэток мыши - согласно методике, изло-генной Робертсон (Robertson, 1987).

Гистохимическое окрашивание на присутствие эритроцитов после индукции дифферекиировки ES-клэток. Для индукции дифференцировки ES-клеток с формированием эритроцитов, вырабатывающих гемоглобин добавляли в среду ДЖС в разной концентрации (1% и 2%) и культивировали в течении 6 дней. Затец клетки окрашивали бензидиноы:

- добазляли О, Î ыл красителя на i ил ростовой среды и инкубировали в течении 10 мин при комнатной температуре:

- препарата наблюдали под инвертированным микроскопом.

Цитохимический тест на специфическую активность щелочной fcoc-фатазы ES клеток. ES клетки высевали на покровные стекла с блокированным слоем фидерных клеток. Через сутки клетки фиксировали "охлаздеиным ацетоном (+4° С) е течение 1 пин, затем инкубировали в свеаеприготовленном растворе красителя прочный синий ВВ и субстрата AS-BI фосфат в течение 1 часа при 37° С. Раствор красителя и субстрата готовили согласно методике изложенной Лондон (Лойда и др.1982).

Статистическая обработка результатов. Для оценки значимости различий по частоте формирования хиыер разными клонани ES-D3 клеток мыши использовали критерий согласия а (см. Кг>шнский, 1958) , а для оценки значимости раз/амий кариотипических аюмалий в ES-клетках КРС использовали критерий Фишера. Достоверность качественных различий в сравниваемых группах определяли с поноць» метода углового преобразования Фишера. Достоверность качественных различий по степени химеризма мышей в сравниваемых группах определяли с помощь» точного метода Фивера. При этом оценивали разницу в частоте появления хиыер с содержанием агути окраса в перс-тнон покрове 50л и более (см. Рублэр, 1978). Достоверными считали различия при Р<0,05,

2. Результаты исследований и их обсуздение

Получение линий шюрнпотентных стволовых клеток КРС. В нашем эксперименте мы использовали 26 эмбрионов КРС голятинофризской породы на стадии бластоцисты (8-10-й день после оплодотворения) (табл.1). Бластоцисты были получены путей оплодотворения ооцитов . In vitro в лаборатории клонирования кивогных.

Из таблицы i видно, что формирование ES-подобннх колоний не зависело от использования LIF в качестве ингибитора дифференци-ровки. Видимо, LIF является видоспецифичным фактором и оказывает ннгибирующее действие лишь на диффереицировку ES-клеток кши. По данным таблицы, наблюдался активный рост клеток ВКМ у эмбрионов . оплодотворенных семенем быка Imperial, независимо от использования LIF, что составило 100% от числа изначально посаженных эмбрионов. Менее активный рост ВКМ наблюдался у эмбрионов быка Marauder, что составило 87% без использования LIF и 7555 - с использованием.

В отличии от ES-клеток мыши, ЕЗ-клетга КРС ке образует многослойные колонии клеток, а образуют монослой эпителиоподобных кле-

ток. ЕЭ-клетки КРС имели больший диаметр (20-30 кош) чем ЕЗ-клет-ки ыыдш (8-15 мкм), с четко выраженным крупным ядром и небольшим количеством цитоплазмы. В цитоплазме ЕБ-клеток КРС, в отличие от мыши, наблюдали большое количество липидных включений. Общим морфологическим критерием ЕБ-клеток мыши и КРС можно считать относи-

Таблица 1

Влияние фактора Ыр на эффективность выхода ЕБ-подобных линий КРС (пояснения в тексте)

Доноры эмбрионов-быки

(голштино-

фризской

породы)

Фидерные системы

Количество эмбрионов

Рост колоний ВКМ

(в % от перво-начально-посаженных эмбрионов)

Получено

ES-подобных

линий

(в 5» от первоначально-посаженных эмбрионов)

I Первичные

I фибробласты

I ыьши 5 5 (100%) . 1 (20%)

Imperl- I_]_

al I Первичные

I фибробласты 5 5 (100%) 1 (20%)

I мыши +LIF

I Первичные I фибробласты

I мыши 8 7 (87,5%) 2 (25%)

Мага- I______

uder 1 Первичные I фибробласты

I мыши +LIF 8 6 (75%) 1(12,5%)

тельно большое расстояние между клетками по сравнению с клетками эпителиальных тканей.

Дифферениировка ES-кпегок КРС и мыши In vitro. ES-клетки обладают способностью быстро дифференцироваться. Способность ES-клеток!' формировать при дифференцировке эмбриоидные тела, по

- и

мнению ряда авторов, является основным тестон на плюрипотентность в условиях in vitro (Robertson, Bradley, 1S86; Evans et al.,1990a; Baribault, Kenler, 1989). Для сравнительного анализа - дифференцировки ES-клеток КРС и мыши, мы использовали линию D3 ES-клеток мыши. ES-клетки мьши и КРС спонтанно дифференцировались в культуре in vitro при продолжительном (5-6 дней) культивировании без пересева их на свежий слой фидерных клеток.

ES-клетки КРС образовывали эмбриондные тела различной сложности и размеров в зависимости от продолжительности культивирования (10 дней и более). Крупные эмбриоидные тела составляли 8-12 ш в диаметре и имели морфологическое сходство с 8-Ю-дневнкш бласто-цистами с той лишь разницей, что ВКЫ-подобные структуры находились снаружи.

При длительном культивировании ES-клеток КРС (253 дня) наряду с пролиферацией недифференцированных ES-клеток наблюдали такте спонтанную дифференцировку стволовых клеток с образованней клеток с нейроноподобной. энтодерыоподобнэй и фибробластоподобной морфологией.

Предварительно, мы выявили специфическую активность щелочной фосфатазы (ALP) стволовых клеток эмбриобласта 4-дневной, бласто-цисты мьши, используя цитохимическое окрашивание субстратом AS-BI фосфат и красителем прочный синий ВВ (результаты . не представлены). Мы предположили, что и ES- клетки КРС и мыши также должны обладать такой особенностью. ES-клетки мыши линии STR и D3 дали одинаковую положительную реакции на цитохимическое окрашивание. Использованный нами метод выявлен!« ALP ES-клеток мог бы быть ис--.пользован как тест на плюрипотентность ES-клеток в системе in vitro, однако попытки окрашивания недифференцированных ES-клеток КРС не дали положительной реакции. Не наблюдали положительного окрашивания при выявлении ALP и у интактных эмбрионов КРС, включая морулу и бластсцисту. Для объяснения этого факта ыонно сделать два предположения: либо использованный метод окрашивания ALP по каким-либо причинам "не срабатывает" по отношению к КРС, либо ранние эмбриональные клетки КРС не обладают, в отличие от мыши, высокой активностью данного фермента.

Для оценки способности ES-клеток КРС к дифференцнровке с образованием высокоспециализированных клеток использовали метод окрашивания дифференцированных производных клеток бензидином на присутствие эритроцитарных клеток, продуцирующих гемоглобин. Резуль-

таты окрашивания показали присутствие геыоглобин-содержащих клеток в дифференцированных участках культуры и в эибриоидных телах Положительное окрашивание отсутствовало в недифференцированных ES-клетках и соматических клетках КРС (первичные фибробласты печени. полученные от ES-плода КРС). Этот тест может служить наглядным доказательство» гиюрипотентности ES-клеток In vitro.

Дифферениировка ES-клеток КРС In vivo. Плврипотентные свойства ES-клеток КРС, полученных в навих экспериментах были изучены такие в системе in vivo по сравнению с ES-клетками ыыши линии" D3. Для оценки потенций ES-клеток КРС к развитие In vivo был выбран метод трансплантации ядер ES-клеток в энуклеированные ооциты.

Этот метод был разработан в лаборатории клонирования животных биотехнологической сельскохозяйственной компании ABS для клониро-

Таблица 2

Эффективность развития зигот при трансплантации ядер ES-клеток КРС с различной длительностью культивирования in vitro

Длительность культивирования ES-клеток in vitro

Трансплан Развилось тировано до бласто-ядер ES-клеток циста в энуклеиро- <%) ванные ооциты

Трансплантировано в матку коров-реципиентов

Выявлено стельностей • (%)

Ранние пассажи

(до трех 249 63 (25.3%) 10 4 (40%)

месяцев в культуре)

Поздние поссази (более

трех ые- 24Ö 75 (30.5%) 10

сяцев в культуре)

0

!

вания эмбрионов КРС путей трансплантации' ядер бластоиеров в энук-леирозакные ооциты. Совместно с сотрудниками этой лаборатории данный ыетод был нами адаптирован для ES-клеток.

4 Развитие зигот с трансплантированными ядрами ES-клеток КРС. В эксперименте мы использовали ядра ES-клеток КРС. в качестве доноров ядер, на разных этапах культивирования. Клетки ранних пассажей находились в культуре In vitro до трех месяцев (67 дней), клетки же поздних пассажей находились в культуре, соответственно, свыше трех месяцев (253 дня).

Данные таблицы 2 наглядно демонстрирует разницу между потенциями к развитию пересаженных ядер ES-клеток КРС с различной продолжительность!) культивирования в условиях in vitro. При трансплантации в матку коров-реципиентов бластоцист. развившихся из ядер ES-клеток, прошедших большее число пассажей нами не было зарегистрировано стельности у реципиентов. В экспериментах с ES-клетками ранних пассажей стельность составила 402 от числа трансплантированных бластоцист. Хотя следует отметить, что в обоих случаях мы не наблюдали разницы в развитии ES-зиготы до стадии бластоцисты. Напротив, эффективность развития зигот до бластоцис-ты была выше при трансплантации ядер ES-клеток поздних пассажей (что составило 30.5% от общего числа прооперированных оститов) по сравнению с ES-клетками ранних пассажей (25.3%).

Вероятной причиной неспособности развития ES-бластоцист поздних- пассажей »южно считать возникающие изменения в каристипе ES-клеток в процессе длительного культивирования In vitro.

Изучение пренатального развития BS-плода КРС. Стельность коров-реципиентов определяли ультразвуковым методом и регистрировали еженедельно. Развитие плода шло нормально до 55 дней после чего регистрировали гибель плода. К этому сроку у эмбрионов, в основном. была сформирована и функционировала кровеносная, выделительная и пищеварительная системы. Ультразвуковым методом было зарегистрировано четкое биение сердца плода. По прекращению биения сердца регистрировали гибель, после чего происходила резорбция и аборт.

Гистологические препараты различных органов и тканей плода показали присутствие всех основных тканей, являющихся производными трех зародышевых листков. Тщательный анализ гистологических препаратов, проведенный профессиональными гистологами из Мадисонско-го Университета, не выявил каких-либо аномалий в развитии клеток

и тканей легкого . почек, келудка и костной ткани ЕБ-плода. Вс,; органы морфологически соотзетстзовали нормальному развитию органов обычного плода этого ее возраста. При изучении экстраэмбриональных тканей было выявлено недоразвитие плаценты, которое выражалось наличием меньжего числа котиледонов у ЕБ-плода, чем у нормального зародыша соответствующего срока развития (данные не приводятся). Это. вероятно, может служить еще одной из причин гибели плода.

Изучение потенций к развитию ЕЭ-клеток мыши путем получения инъекционных химер. С целью изучения потенций двух клонов ЕБ-ОЗ-клеток БЗМ и ОЗМ, прошедших различное число пассажей с момента субклонирования, проведен эксперимент по получению химерных мышей с использованием этих клонов.

Таблица 3

Частота формирования химер клонами БЗИ и БЗМ ЕЭ клеток

мышей

Клон Число Линия Транс- Родилось из них % агутч в

пасса- бласто планти- мышей химер каретном покрова

жей цисты ровано «) (самцов)

С57ВЬ/6 51 29 14 (8) 90,80.3x70,2x60.

3x50,40.2x30,20

БЗИ 17 ВАЬВ/с 43 11 4 (3) 50.2x40,20

СВУА 32 13 5 (4) 70,60,30,2x104*

Итого 126*** 53(42%) 23«(15)

С57ВЬ/6 31 9 0

БЗМ 42 ВАЬВ/с 55 24 5 (3) 40.30.20,10,5

(ЖА 28 11 4 (2) 50,40,10,5**

Итого 114*** 44(392) 9* (5)

* Р(Хг)<0,02

** РТМф " 0.°22

«»« Учитывали только те эмбрионы, после трансплантации которых самка становилась беременной и рожала живое потомство. Примечание: Ртмф рассчитан по разнице частоты встречаемости хи-

о

мер, полученных от 2-х клонов ES-D3 клеток, с содержанием окраса агути в шерстном покрове 50% и более.

В качестве реципиентньж при инъекции были использованы бласто-цисты линий C57BL/6, BALB/c и тетрагибридов СВЙА. В таблице 3 показаны результаты этого эксперимента. Клетками D3W и D3M было проинъецировано 126 и 114 бластоцист соответственно. Из 53 родившихся мышей после трансплантации эыбриснов с участием клеток D3W, 23 (43%) оказались химерами, которые были выявлены по содераанио агути окраса в шерстном покрове. После трансплантации эмбрионов, в которые были инъецированы клетки D3M, родилось 44 мышонка, из которых 9 (20%) были химерами. Все химеры были проанализированы по степени колонизации тканей ES-клеткаыи (% окраса агути в шерстном покрове). Содержание окраса агути в шерсти химер, полученных при участии клона D3W колебалось от 10 до 90%, тогда как степень колонизации тканей клоном D3M не превышала 50%.

Статистический анализ данных этого эксперимента показал, что клон D3W, более раннего пассажа, достоверно превосходит клон D3M как по числу химер среди потомства (43 и 9%% соответственно, Р<0,02), так и по процентному содержании ёгути в шерстном покрове (10-90%% и 5-40%% соответственно, Р=0,022)!

Результаты кариотипического анализа ES-клеток КРС. Для выявления кариотипических изменений плюрипотентных стволозых клеток крупного рогатого скота в зависимости от длительностй культивирования мы провели ¡сариотипический анализ одной женской линии ES-1, из которой было получено 9 субклонов. Субклонирование проводилось с использованием метода трансплантации ядер.

Мы использовали несколько субклонов одной женской линии и кась-отипировали их на ранних пассажах (67 дней в культуре, условие л: трех месяцев в культуре) и на поздних пассажах (253 дня, свыше трех месяцев в культуре, соответственно). Было исследовано 384 метафазные пластинки ES-клеток КРС, и в качестве контроля была получена культура фибробластов печени и легкого из ES-эыбриона крупного рогатого скота 40-50-дневного срока развития, полученного методом трансплантации ядер с использованием стволовых клеток в качестве доноров ядер.

Нами было исследовано 9 субклонов данной женской линии, но мы объединили их по длительности существования в культуре in vitro условно как ранние пассажи (ЕР) и поздние пассази (LP) по ряду причин: во-первых это субклоны одной женской линии, культивиро-

Таблица 4

Частота встречаемости полиплоидии в популяции ЕЭ-клеток КРС на разных сроках культивирования

Срок Диплоиды Полиплоиды Общее число Достовер-

культивирования кол. метафаз кол. метафаз метафаз ность раз-

клеток (% от общего (% от общего личий m6s-

числа) числа) ду ранними

и позд-

ними

пассатами

Ранние

пассажи (ЕР)

(до трех меся- 42(91,3%) 4 (8,7%) 46 (100%)

цев в культуре)

Р<0,01

Поздние пассаги

<ЬР)

(свыше трех меся-

цев в культуре) 200(59,34%) 137(40,66%) 338 (100%)

Контрольная "

группа 34 (100%) 34 (100%)

(фибробласты

плода)

вавншеся в одинаковых условиях и, во-вторых, мезгду клетками разных клонов кариотшических различий не обнаружено (данные не приводятся). Таблица 4' наглядно демонстрируют уровень плоидности культуры. По данным таблицы мы видим, что на ранних пассажах 91. IX клеток имели преимущественно диплоидный' кариотип. В-этот промежуток 1сультявирования кариотип клеток оставался более стабильным, и число полиплоидных клеток составило 8,9 %. Другая картина наблюдается на поздних пассанах: так, диплоидные клетки составили лишь 59,3л от общего количества метафазных пластинок и заметно повысился в процессе культивирования In vitro процент полиплоидных »••лоток, ¡¡соторый составил 40, 635 (различия мезду числом полиплоид-

ных клеток на раем и поздних пассатах достоверны. р<0,01). В контрольной группе соматических клэтск лгпюго полиплоидных клеток не обнаругено.

Кроме того , было проведено сравнение частоты встречаемости анеуплоидии на ранних н поздних пассагах. На поздних пгссаках среди неполиплоидных клеток этот показатель составил 81,52 от общего количества да- и анеуплоидных клеток, тогда кгк на ранних пассатах он составил 35,7% (р<0>001)(табл. 5).

Модальное число хромосом на ранних пассагах составило 60, количество клеток содержащих такое коль-честпо хрогасоц равнялось

Таблща 5

Частота встречаемости анеушюидии среди дшяоиднпх ЕЗ клеток КРС на разных сроках культивировали

Срок культи- Диплоидные Анеуплоиды Общее колнч. Достсзер-вировашя клетки кол.(%) клеток кость раз-

клеток кол. (55) личнй

Ранние

пассаги (ЕР)

Поздние пассаги (1,Р)

64,3?, остальные клетки содержали снеуплондннй кариотип. Разброс количества хромосом в клетках ранних пассазей варьировал от 52 до 117 хромосом. Модальное число хромосом на поздних пассагах составило такяе 60. но процент клеток содерзагщх такое количество хромосом уменьшился и составил 18,5%. Разброс количества хромосом в клетках поздних пассазей варьировал от 46 до 239 хромосом, то есть вариабельность этого признака по ыере !сультивкрования увеличилась.

Уровень дифференцировашости клеток в раннем эмбриогенезе моз-мо охарактеризовать статусом Х-хромосомы (Викоуап et а1., 1993). Половые хромосомы КРС представлены субметацентрическими хромосомами н легко отличимы от аутосом. Гакш образом, неактивнуп Х-хромосому можно отличить по меньшему размеру и более темному

27(61,3%) 15(35,7%) . 42(100%)

Р<0,001

37(18.5») 163(81,5%) 200(100")

окрашиванию при приготовлении препаратов по методу Канда. Таблица 6 показывает, что процент клеток содержащих темноокраиеннув, значительно меньшую по размеру (позднореплицированную. генетически инактизщюванную) Х-хромосому составил 11% на ранних пассажах и 53« на поздних naccasax от общего количества диплоидных клеток (РС0.001).-

Для нагушдности сравним Х-инактивацию в клетках контрольной линии эмбриональных фибробластов и ES-клетках КРС. Так, клетки эмбриональных фибробластов представлены, в основном, инактивирован-ной Х-хромосоыой (91%)

Таблица 6

Количественный анализ позднореплицированных Х-хромосом в женской линии ES-клеток и эмбриональных фибробластов КРС

Срок Число Метафазы с Метафазы с Достовер-

культи- диплоидных активной инаетициро- ность (\ я н н ou

вирова- клеток Х-хроыосомой Х-хромосомой различий

ния с двумя кол. (%) кол. (%)

Х-хромосомами

Ранние

пассажи (ЕР) ÍZ 5 (11,9%) 37 (88,1%)

Р< 0,001

Поздние

пассам (ЬР) 82 35 (42,7%) 47 (57.3%)

Контроль- - Р< 0,001

ная группа

(фибробласты 34 3 (9%) 31 (91%)

плода)

Результаты кариотипического анализа ES-клеток мыши. Для сравнительного анализа кариотипических изменений ES-клеток и дальнейшего развития их In vitro и in vivo мы использовали линии ES-кле-ток мши STR и два клона линии D3: D3W и D3M.

Для выявления кариотипических измэнений ES-клеток, прошедших различное число пассаяей с момента введения в культуру (STR), либо с момента субклонирования (D3W.D3M), проведен 1сариотипический анализ двух клонов ES-клеточной линии D3 и линии STR. Отбор мета-фазных пластинок, пригодных для подсчета числа хромосом, проводи-

ли по критериям, предложенным Н. П. Бочкоеым с соавторами (1972). Было исследовано по 50 метафазных пластинок каждого образца.

Как видно из таблицы 7, с связи с длительностью культивирования in vitro меняется и распределение числа хромосом в сторону увеличения доли клеток с ачеуплоидным набором. У клона D3M, прошедшего 42 пассажа с момента субклоннрования, только 58% клеток имели нормальный зуплоиднкй (2п = 40) набор хромосом, в то время как у клона D3W (17-й пассаж) 82% клеток имели нормальное число хромосом.

У линии ES-клеток STR, прошедших к моменту анализа более 20 пассажей, модальный класс хромосом был 39 (G6%). Попытки субкло-

Габлица 7

Частота встречаемости анеуплоидии в популяции ES-гслеток мыши на разных сроках культивирования

Линия I Пол I Число I Модальный I Диплоиды I Анеуплсиды ES клетск ! ! пассатей! класс {%) ' !

ОЗя иош XY XY 4 " 1 , 42 40 40 (82>") (58%) < 4 • П'! 1 < iüC/:, 29 (53?.' л ; t г, а \ Ö \ 1 О/. 2! (¿Л,

STR П 20-24 39 (66-:) С Г. М Г\г, 1 • yju Ui",1.-

чировать лини» STR, для того чтобы отселектировать и размпс*;:ть клетки с нормальны!.? эуплоидным набором хромосом, оказались 6c-evr-пбшнкми. Очевидно утеря хромосомы произошла еще на ранних па"~>-жах клеток STR при получении.

Таким образом, тачке как и у ES-клеток КРС, в популяции ES клеток мыши мы наблюдали уменьшение процента клеток с диплоидным набором хромосом по мере культивирования in vitro с 82% до 58?.

Субклонирование ES-клеток КРС с использованием метода трансплантации ядер. Для того чтобы отселектировать клетки с нормальным эуплоидным кариотипом нами был проведем эксперимент по субк-локированию ES-клеток КРС. Суть метода заключалась в следующем; б знуклекрованныг ооциты инъецировали ES-клетку KFC с последующей активацией ядра к делению. По достижении стадии бластоцисты ES-эыбрионы вводили вновь в культуру .

Таким образом, было инъецировано 46 ядер ES-клеток КРС в энук-леированные ооциты, 15 из них развились до стадии оластоцйсты (32,6%). После введения в культуру 15 бластоцист, были получены 8 субклонов ES-клеток, которые кариотипировались как описано вьппе.

3. ВЫВОДЫ

1. Впервые разработан метод получения ES-клеток КРС и предложены оптимальные условия их культивирования in vitro. Охарактеризованы морфологические и постовые особенности ES-клеток КРС в сравнении с хорошо изученными ранее ES-клетками мыши, отмечены различия и сходства между ними.

' 2. Плврипотентные свойства ES-клеток КРС подтверждены б условиях in vitro способностью образовывать эмбокоидные тела и спонтанной дифференцировкой в различные типы клеток. Впервые проведен тест на присутствие в дифференцированных производных ES-клеток КРС предшественников эритроцитов путем окрашивания бензидином, что подтверждает плюриг.отентность пол ученных нами ES-клеток КРС.

3. Проведен сравнительный анализ пгаркштентных свойств ES-клеток КРС и мьшн in vivo в зависимости от длительности культивирования in vitro. Изучение потенций ES-клаток КРС и мыши in vivo показало, что клетки ранних пассажей по сравнению с клетками поздних пассажей обладают большей способностью участвовать в развитии ES-плсда и формировании химерного организма. Развитие ES-плода КРС наблюдалось здпоть до 40-55-ти дней стельности. До гибели эмбриона морфологических и гистологических аномалий в развитии не обнаружено, за исключением экстраэмбриональной ткани (плаценты).

4. В целях поиска причин неспособности к полному внутриутробному развитию ES-эмбрионов и неспособности имплантации ES-бласто-цист, полученных из ES-клеток поздних пассакей. был проведен ка-риотипический анализ ES-клеток КРС и мши в зависимости от длительности культивирования in vitro. Клетки поздних пассажей характеризовались больниц процентом анеуплоидных (71,64%) и полиплоидных (40,53%) клеток, чем клетки ранних пассажей (33,33% и 8,'!% соответственно). Преобладание в клетках поздних пассажей клеток с аномальным кариотипом явилось, несомненно, одной из причин неспособности формирования ими плода.

5. Разработан метод предварительного тестирования плхзрипотент-кости ES-клеток КРС, основанный на изучении инактивации одной из

Х-хромосом в венских линиях. Показана обратная корреляция между процентом инактивированных Х-хромосом в женских ES-клетках КРС и способность?) к развитие поел? трансплантации ядер.

6. Предложен метод суб^юнирования £S-клеток КРС для гюддераа-ния эуплоидного кариотипа в системе культивирования In vitro.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Миталипов Ш. К., Митапипова М.М., Федоров Л.М. Изучение плв-рипотентных свойств эмбриональных стволовых клеток мыши in vitro и in vivo. // Тез. дскъ 5-ой конференции по генетике соматических клеток в культуре. 22-24 ноября 1993 г. Черноголовка. С.42.

2. Неверова М. Е., Петрова Т. В., Мамаеза Т. В., Мкталипов Ш.Н., Миталипова М. М., Иванов В. И. Калинин В. Н. Разработка модельной системы гемотерапии на основе синтетического "гена" биологически активного пептида брадикикина. // Тез. докл. 4-ой научной конференций1 "Геном человека-94", 9-11 марта 1994 г. Черноголовка. С. 64.

3. Миталипов Ш. М., Миталипова М. И , Иванов В. И. Влияние длительности культивирования на плврипотентность эмбриональных стволовых (ES) клеток мыши in vitro и in vivo. // Онтогенез. 1994. Т. 25. N6. С. 19-27.

4. Миталипов Ш. И., Миталипова М.М. Влияние генотипа бластоцис-ты-репипиента на частоту Формирования химер с ES клетками ши. U Тез.докл. 1-го съезда ВОГИС, 20-25 декабря 1S94 г. Саратов. С. 101.

5. Strelchenko N.. Mltalipova М., Stice S. Further characterization of bovine pluripotent stem cells. /7 Theriogenology. 19Э5. Vol. 43. N0.1. P.327.