Влияние условий культивирования на поддержание сперматогоний хряка in vitro

Полякова, Мария Вячеславовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние условий культивирования на поддержание сперматогоний хряка in vitro
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Влияние условий культивирования на поддержание сперматогоний хряка in vitro"

На правах рукописи

ПОЛЯКОВА МАРИЯ ВЯЧЕСЛАВОВНА

ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА ПОД ДЕРЖАНИЕ СПЕРМАТОГОНИЙ ХРЯКА IN VITRO

03.01.06. Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 7 !::;■:! LU13

Москва-2013

005530971

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я. Р. Коваленко Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВИЭВ Россель-хозакадемии)

Официальные оппоненты:

Верховский Олег Анатольевич, доктор биологических наук, профессор, AHO «Научно-исследовательский институт диагностики и профилактики болезней человека и животных», президент

Маленко Галина Петровна, доктор биологических наук, профессор, ГНУ Центр экспериментальной эмбриологии и репродуктивных биотехнологий Россельхоза-кадемии, заведующая отделом

Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Россельхозакадемии

7 У О ^ °

Защита состоится « » £/2013 года в час. на заседании диссерта-

ционного совета Д 006.003.01 при Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я. Р. Коваленко Российской академии сельскохозяйственных наук по адресу: 109428, г. Москва, Рязанский проспект, 24, к.1, ВИЭВ, тел. (495) 970-03-67

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВИЭВ Россельхозакаде-

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Савченкова Ирина Петровна

мии

Автореферат разослан « » /і/l.¿Х^Р_2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

Ездакова И. Ю.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ:

СпСК - сперматогониальные стволовые клетки СпК - сперматогониальные клетки GS - линии половых стволовых клеток LIF - фактор, ингибирующий лейкемию DIA - фактор, ингибирующий активность дифференцировки GDNF - глиальный нейротрофический фактор КС - клетки Сертоли BRL - клетки печени крысы Buffalo СПК - сыворотка плода крупного рогатого скота ММСК - мультипотентные мезенхимные стволовые клетки STO — перевиваемая линия клеток эмбриональных фибробластов мыши ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени

ППК - первичные [примордиальные] половые клетки

ЭПК - эмбриональные половые клетки

ЭСК - эмбриональные стволовые клетки

ЩФ - щелочная фосфатаза

ДМСО - диметилсульфоксид

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Создание новых клеточных моделей для использования в медицине, в том числе в ветеринарии, является одним из перспективных направлений развития современной науки. В настоящее время лаборатории многих стран занимаются изучением вопросов, связанных с использованием клеток гонад животных в качестве новых клеточных систем для применения их в биотехнологической и фармацевтической промышленности при разработке, тестировании и производстве новых медицинских препаратов.

На сегодняшний день при изучении сперматогониальных клеток (СпК) млекопитающих, в основном, используются лабораторные животные: мыши (Hamra et al., 2004; Kanatsu-Shinohara et al., 2005b), крысы (Hamra et al., 2005; Ryu et al., 2005), хомяки (Kanatsu-Shinohara et al., 2008), а также собаки (Yeunhee Kim et al., 2008). В последнее время появились публикации, в которых объектами исследований являются СпК сельскохозяйственных животных, таких как: крупный рогатый скот (Izadyar F. et al., 2003; Aponte et al., 2008), мелкий рогатый скот (Hona-ramooz et al., 2003; Rodriguez-Sosa et al., 2006), свиньи (Dirami et al., 1999; Коржи-кова, 2002; Савченкова и др., 2006; Goel et al., 2007; Han Su Young et al., 2009). Проводятся работы по выделению и изучению клеток этого типа у человека (Sadri-Ardekani et al., 2009; Lim et al., 2010).

Культуры клеток, полученные в результате длительного культивирования сперматогоний грызунов, были названы линиями половых стволовых (GS) клеток. Получение линий GS-клеток актуально для ветеринарной биотехнологии при изучении инфекционных болезней. Известно, что многие вирусы обладают тропизмом к половым клеткам. В связи с этим сперматогонии хряка представляют собой новую клеточную систему для вирусологических исследований. Однако, несмотря на заметные успехи в данной области, культура СпК хряка еще не создана. Одной из причин этого является недостаточное знание условий культивирования сперматогоний типа А хряка, и влияния различных факторов роста на половые клетки in vitro.

В настоящее время установлено, что факторы роста и цитокины играют важную роль как в поддержании СпК in vitro, так и в индукции их полипотентного статуса (de Rooij and Mizrak, 2008). Среди них выделяют глиальный нейротрофи-ческий фактор (GDNF), фактор, ингибирующий лейкемию (LIF), идентичный фактору, ингибирующему активность дифференцировки (DLA) (Smith et al., 1988; Williams et al., 1988). Некоторые из этих факторов продуцируют клетки, которые присутствуют в семеннике: клетки Сертоли (КС), Лейдинга, миоидные, стромаль-ные и гематопоэтические клетки, а также некоторые стабильные клеточные линии, используемые для культивирования ЭСК. Влияние экстраклеточных факторов на СпК является результатом их динамичного взаимодействия с внутриклеточными транскрипционными регуляторами. Такими внутриклеточными маркерами недифференцированного состояния являются три гена транскрипционных факторов, необходимые для поддержания полипотентного статуса стволовых клеток: POU5F1 (Oct3/4), Nanog, Sox-2.

В связи с тем, что сведений по влиянию различных факторов роста на половые клетки in vitro недостаточно, а в отношении СпК хряка они только начинают формироваться, данное направление исследований является перспективным для развития как биомедицинских технологий, так и сельскохозяйственной биотехнологии.

Цель и задачи исследований. Цель данного исследования: изучение влияния условий культивирования на поддержание сперматогоний хряка in vitro.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

■ выделить из тестикул и подобрать условия поддержания в культуре сперматогоний типа А хряка;

в изучить влияние клеток Сертоли на сперматогониальные клетки хряка in vitro;

■ определить роль микроокружения (фидерных слоев) в культивировании спер-матогониальных клеток хряка;

ш оценить роль фактора, ингибирующего активность дифференцировки DIA/LIF, в поддержании сперматогониальных клеток хряка in vitro;

■ провести сравнительный анализ экспрессии генов-маркеров в полученных клетках in vitro;

■ оптимизировать условия криоконсервации сперматогоний хряка.

Научная новизна. В ходе выполнения диссертационной работы впервые была исследована возможность длительного (до 100 сут включительно) культивирования сперматогоний типа А хряка.

Впервые изучены факторы, влияющие на эффективность выделения сперматогоний типа А хряка. Исследовано влияние очистки, основанной на адгезивных свойствах клеток, на эффективность получения чистой культуры сперматогоний хряка.

Впервые установлено, что КС, продуценты GDNF, при совместном культивировании способствуют как процессу одновременного размножения и получения клонов сперматогониев хряка, так и их дифференцировке в направлении сперматогенеза, о чем свидетельствует обнаружение в них продуктов экспрессии генов PLZF, Nanog и VASA.

Впервые определено, что использование фидерного слоя, представленного клетками STO, и добавление в культуру кондиционированной среды из клеток BRL (клетки печени крысы Buffalo), которая содержит фактор, ингибирующий активность дифференцировки, позволяет поддерживать сперматогонии хряка в культуре длительное время.

Работа имеет как фундаментальную (новые возможности для моделирования развития половых клеток in vitro с целью изучения молекулярных механизмов и биологической основы этого процесса), так и практическую направленность.

Практическая ценность работы. Разработаны условия для длительного поддержания сперматогоний типа А хряка в культуре. Исследованы факторы, влияющие на эффективность выделения сперматогоний.

Применение КС на начальных этапах культивирования сперматогоний типа А хряка позволяет получать половые клеточные культуры свиньи, а добавление DIA в культуру способствует длительному культивированию сперматогониаль-ных клеток хряка и созданию полипотентных клеточных линий.

Разработан эффективный метод сохранения половых клеток из семенников хряков. Учитывая доступность материала и эффективность данного метода, разработанные условия сохранения сперматогоний хряка будут полезны для других видов животных.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на:

■ IV-ой Всероссийской научной школе-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина», Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, факультет фундаментальной медицины, 2011г.; ■ на школе-конференции для молодых ученых «Клеточные технологии для регенеративной медицины», Санкт-Петербург, Институт цитологии РАН, 2011г.; ■ на Международной виртуальной Интернет - конференции "Биотехнология. Взгляд в будущее", Казань, ФГАОУ ВПО "Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казанская академия ветеринарной медицины им. Н.Э.Баумана, 2012г., а также неоднократно обсуждались и получили одобрение на Методической комиссии и Ученом совете ГНУ ВИЭВ Россельхозакаде-мии.

Личный вклад соискателя. Автор принимал непосредственное участие во всех этапах работы. Участие соавторов отражено в совместных публикациях. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе 4 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК. Структура и объем работы. Диссертация изложена на 123 стр., содержит 3 табл., 36 рис. (в т.ч. 26 фотографий, 5 диаграмм), состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований, обсуждение, выводы, список литературы. Список литературы включает 210 источников, в т.ч. 194 на иностранном языке. Основные положения, выносимые на защиту:

■ влияние ростовых факторов и микроокружения на поддержание сперматогоний хряка в культуре;

■ изучение изменений экспрессии генов Nanog, POU5F1, VASA, PLZF и SSEA-1 в зависимости от условий культивирования сперматогоний типа А хряка.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 10-04-01471-а в секторе стволовой клетки ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии в 2010-2013 г.г. В экспериментах были использованы хряки (помесь ландрас х крупная белая), выращенные на ферме Воскресенского района Московской области. Семенники были получены от здоровых животных путем кастрации. В лабораторию материал был доставлен в термосе на льду при +4°С. Максимальное время транспортировки составляло 4 часа.

Выделение культур клеток из семенников и манипуляции с ними проводили в ламинарном боксе биологической защиты ESCO класса II серии АС2, который подает горизонтальный стерильный поток воздуха, производства фирмы «ESCO», Сингапур.

Культивирование клеток проводили в открытой системе, в инкубаторе производства фирмы «Sanyo» (Япония), обеспечивающим определенную влажность воздуха, температуру (+37° С) и содержание СОг (5%) в воздухе. Основной средой для культивирования клеток фидерных слоев и сперматогониевых клеток была среда ДМЕМ с высоким содержанием глюкозы (4,5% г/л) фирм «Биолот» и «ПанЭко» (Россия), с добавлением 10% СПК фирмы «HyClone» (США) и антибиотиков (пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 50 мкг/мл).

Основной средой для культивирования СпК служила среда ДМЕМ с высоким содержанием глюкозы (4,5% г/л), с добавлением 15% сыворотки плодов коровы (СПК), 0,1 мМ меркаптоэтанола, 2 мМ альфа-глутамина, 0,1 мМ заменимых аминокислот, 100 Ед/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина.

Основной средой для культивирования мультипотентных мезенхимных стволовых клеток (ММСК) крупного рогатого скота (КРС) служила среда ДМЕМ с низким содержанием глюкозы (1% г/л), с добавлением 10% СПК, 0,1 мМ заменимых аминокислот, 100 Ед/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина.

В работе использовали перевиваемую линию эмбриональных фибробластов мыши (STO), культуру клеток ММСК, выделенную из жировой ткани (ЖТ) КРС,

клетки печени крысы BRL, которые были взяты из коллекции клеточных культур Криобанка сектора стволовой клетки ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии.

КС выделяли из тестикул хряков 40-60 сут возрастов по методике, описанной ранее (Коржикова, 2002). Первое пассирование клеток проводили после формирования ими монослоя в соотношении 1:2. После первого пассажа клетки наращивали в большом количестве и использовали в качестве фидерного слоя для изучения влияния GDNF.

Кондиционированную среду из клеток BRL, которые продуцируют фактор DIA, готовили следующим образом. Клетки печени крысы размораживали, ресус-пендировали в ростовой среде и культивировали в СОг-инкубаторе. На 3-й сутки пассировали из расчете 1:5. После достижения клетками полного монослоя ростовую среду (кондиционированную) сливали в стерильные флаконы, замораживали и хранили при -20°С. Непосредственно перед применением размораживали. Добавляли во флаконы 25% кондиционированной среды от общего объема ростовой среды (Коржикова, 2002).

Перед использованием вышеперечисленных клеток в качестве фидерных слоев их подвергали обработке митомицином С («Sigma», США) с целью блокировки митоза по методике, описанной ранее (Савченкова, 1999).

Морфологическую оценку выделенных клеток проводили визуально под фа-зово-контрастным микроскопом производства фирмы «Carl Zeise» (Германия), оборудованном встроенной камерой, с объективами 10х, 20х, 40х, 63х, с помощью программы Software Release 4.8.2., учитывая такие показатели, как форма и размер клеток, ядерно-цитоплазматическое соотношение, а также посредством приготовления нативных препаратов клеток, окрашенных с помощью азур II - эозина по Романовскому (окраска по методу Романовского-Гимза).

Для подтверждения морфологической оценки клеток проводили их окрашивание с помощью красителя жирового красного Oil Red О (производства фирмы «Bio Optica», Италия) по рекомендациям фирмы.

Выявление специфической активности эндогенной щелочной фосфатазы (ЩФ) в клетках производили с помощью коммерческого набора «Sigma-Aldrich

Alkaline Phoshatase kits» (США) по прилагаемой инструкции. В качестве субстратов использовали хромоген прочный синий RR и нафтол AS-MX.

С помощью непрямой реакции поверхностной иммунофлюоресценции выявляли экспрессию SSEA-1 и PLZF. Для этого использовали первичные антитела (AT) против SSEA-1 («eBioscience», Inc., USA) и PLZF (D-9) («Canta Cruz», USA). В качестве вторичных AT использовали козьи AT против Ig мыши/HPD, меченные пероксидазой хрена («БиоЛайн», Россия). Используемыми субстратами для пероксидазы были 3,3-диаминобензидин тетрахлорид и 3,3',5,5'- тетраметилбен-зидин.

Наличие продуктов экспрессии генов Nanog, POU5F1, VASA, PLZF выявляли в ПЦР-РВ с помощью подобранных праймеров и зондов. В качестве контрольного гена использовали ген GAPDH, кодирующий белок глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназу (gliceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase).

Уровень мРНК и количество копий генов оценивали в режиме относительных измерений с использованием сравнительного AACt метода (руководство Applied Biosystems). Праймеры и зонды приведены в таблице 1.

Криоконсервацию клеток проводили в криозащитной среде, состоящей из среды ДМЕМ, СПК и криопротектора диметилсульфоксида (ДМСО). Замораживание клеток проводили по двухступенчатому режиму понижения температуры: от 0°С до -40°С - со скоростью 1°С/мин, от —40°С до -80°С - со скоростью 4-6°С/мин. Охлажденные до -80°С криопробирки с клеточной суспензией помещали в сосуд Дьюара с жидким азотом при -196°С.

Для восстановления культуры клеток криопробирки извлекали из сосуда Дьюара и быстро размораживали при температуре + 37°С. После размораживания суспензии определяли жизнеспособность клеток с помощью окраски 0,1% - м раствором трипанового синего и подсчета в счетной камере Горяева. В культураль-ный флакон наливали ростовую среду и помещали в него клеточную суспензию, слегка помешивали. Через 24 ч культивирования производили смену среды с целью удаления криопротектора. Для исследования жизнеспособности СпК после криоконсервации, клетки высевали для культивирования во флаконы объемом

25 см2, на фидерные слои, представленные клетками STO.

Все эксперименты имели 3-5 кратную повторность. При подсчете числа клеток, в которых экспрессируются АГ, использовали не менее 1000 клеток. Статистическую обработку проводили с использованием программы Microsoft ® Office Excel 2010(©Microsoft Corporation, USA).

Таблица 1

Праймеры и зонды, используемые для амплификации

Мишень Название оли го-нуклео-тидов Направление 5'-3' Номер рефе-ренсной после-довате-льности РНК (GenBank) Длина ампли-кона, п.о.

GAPDH GH_F TCG-GAG-TGA-ACG-GAT-TTG-GC AF017079.1 215

GH_R GGA-AGA-TGG-TGA-TGG-GAT-TTC-C

GH_Z FAM-CGC-CTG-GTC-ACC-AGG-GCT-G-RTQ1

Nanog NG_F ACA-ATC-CAG-CTC-TTT-GGT-GGT-TT NM001129971.1 174

NG_R TGA-CAT-CTG-CAA-GGA-GGC-ATA-ATT-T

NG_Z FAM-TGG-AAA-TGG-ATG-CTT-CGG-GGC-A-RTQ1

POU5F1 PF_F GGG-TTC-TCT-TTG-GGA-AGG-TG NM001113060.1 154

PF_R TGC-CTT-GCA-TAT-CTC-CTG-CA

PF_Z FAM-TCA-GCT-TCC-TCC-ACC-CAC-TTC-RTQ1

VASA VS_F CCA-CCA-GCA-ATT-CTG-ACT-TTT-GAA-G NM001001910.1 179

VS_R GAG-AAA-AGC-CGC-AGT-CTT-CC

VS_Z FAM-ACC-CTG-TTT-GAG-CGC-AAG-CCA-RTQ1

PLZF PL_F AAA-GCG-GTT-CCT-GGA-TAG-TTT-G АК350495.1 132

PL_R GGT-CTG-CCT-GTG-TGT-CTC

PL_Z FAM-CTC-ATT-CAG-CGG-GTG-CCA-AAG-C-RTQ1

Примечание: F- прямой праймер, R- обратный праймер, Z- зонд.

2.2. Результаты собственных исследований 2.2.1. Влияние возраста хряка на получение культур клеток, обогащенных сперматогониями типа А

В опытах использовали семенники хряков 40 - 60 сут возраста после рождения. Перед выделением семенники вместе с придатком (эпидидимисом) взвеши-

вали. В возрасте животных 40-42 сут вес семенников практически не изменялся, тогда как начиная с 48 сут и до 60 сут за короткий промежуток времени наблюдали значительное увеличение как веса, так и размеров этих органов. Так, вес семенников в возрасте 40 сут составлял 8-9 г, 48 сут - 15-16 г, 60 сут - 26-27 г, соответственно. После процедуры выделения основными типами клеток в суспензии являлись сперматогонии типа А и КС (Рис. 1 А).

2.2.2. Влияние очистки на эффективность получения культур клеток, обогащенных сперматогониями типа А хряка Исследования по изучению СпК именно в культуре ведутся уже на протяжении ряда лет, однако до сих пор существует необходимость в разработке наиболее оптимального метода очистки сперматогоний. Для отделения половых от соматических клеток семенника используются разные методы, такие как флуоресцентно- и магнитно-активированная клеточная селекция (Негпё ег а1., 2009), разделение клеток в градиенте РегсоИ (1гас1уаг й а1., 2002а), центрифугирование в градиенте плотности (Нетс! е1 а!, 2009). Однако эти методы позволяют получать клеточную популяцию, только на 75% обогащенную СпК.

Мы для получения максимально чистой популяции СпК использовали метод, основанный на различных адгезивных способностях клеток (Савченкова и др., 2000). Для этого смесь клеток, полученную в результате механической и ферментативной обработок ткани семенника, заливали ростовой средой и культивировали в СОг-инкубаторе в увлажненной атмосфере в течение 2 ч. Затем культураль-ные флаконы извлекали из инкубатора и не прикрепившиеся клетки, представленные в основном СпК, осторожно переносили в новые культуральные флаконы, предварительно покрытые 0,1 % раствором желатина для дальнейшей селекции в течение 2-3 ч.

В результате такой двухкратной очистки нами была получена клеточная популяция, на 99% представленная сперматогониями хряка типа А (Рис. 1Б). Данные приведены на рисунке 2 при расчете 1000 клеток в пяти повторах.

Рис. 1. А - Суспензия клеток, выделенных из тестикул хряка 55 сут возраста (на-тивный препарат), стрелками указаны сперматогонии. Ув.: (Об. 40х, ок.1 Ох); Б -Сперматогонии хряка после двойной очистки (нативный препарат). Ув.: (Об. 40х, ок.1 Ох)

без очистки, 0 ч первый этап, 2 ч второй этап, 3 ч Продолжительность очистки, ч

□ Другие клетки

■ клетки Сертоли

® Сперматогонии

Рис. 2. Влияние этапов очистки, основанной на разных адгезивных свойствах клеток, на эффективность получения чистой культуры сперматогоний хряка

После очистки клетки были исследованы в отношении ЩФ, БЗЕА-1 и РЬ2Р. Выявлено, что среди клеток, выделенных из семенников хряков 40-48 сут возраста, были обнаружены клетки, положительные в отношении ЩФ (около 5%) и РЬ2Р, по ББЕА-1 они были отрицательны. В 60 сут образцах клетки были положительны только в отношении РЬХБ.

2.2.3. Влияние микроокружения и факторов роста на поддержание сперматогоний типа А хряка в культуре 2.2.3.1. Характеристика КС хряка

Для получения КС использовали семенники хряков 40-60 сут возраста. Морфологический анализ выделенных КС хряка выявил характерную особен-

ность данного типа клеток - наличие липидного пузырька в цитоплазме. Представляло интерес изучить КС в процессе культивирования и заморозки. Для этого в опытах по изучению КС сначала их замораживали. Сразу после оттаивания проводили окрашивание с помощью окраски Oil Red О, а также через 4, 48 ч и 7, 21 сут после начала культивирования. При необходимости проводили докраску гематоксилином. Количество клеток с содержанием липидов и без них рассчитывали при анализе 1000 клеток в пяти повторах. Было выявлено, что КС, подвергнутые заморозке, сохраняют липидный пузырек после оттаивания (Рис. 3 А). Клетки быстро прикреплялись и распластывались на подложке. Содержание липидов в КС значительно уменьшалось в ходе культивирования (Рис. 3 Б). Кроме того, в процессе культивирования менялась и морфология КС, к 21 сут они приобретали более удлиненную, фибробласто-подобную форму.

Рис. 3. КС, окрашенные Oil Red О: А - после размораживания; Б - на 7 сут культивирования. Ув.: (Об. 20х, ок.Юх)

2.2.3.2. Культивирование сперматогоний хряка на фидерном слое, представленном КС - влияние GDNF.

Роль КС в поддержании в культуре СпК изучена недостаточно. Считается, что КС продуцируют в норме GDNF в семенных канальцах. Было показано, что недифференцированные сперматогонии грызунов экспрессируют á-1 (GFRál) рецептор для GDNF. На сегодняшний день имеются два противоречивых сообщения о влиянии GDNF на культивирование СпК быков (Aponte et al., 2008) и хряков (Kuijk et al., 2009).

Представляло интерес изучить влияние КС при культивировании на сперма-тогонии хряка в течение 35 сут (полный цикл сперматогенеза у хряка in vivo). Для этого очищенную популяцию половых клеток высевали на фидерный слой, представленный КС. В результате было установлено, что культивирование спермато-гоний хряка в присутствии КС приводит к одновременной пролиферации сперма-тогоний и их дифференцировке, как в естественных условиях. На 7 сут наблюдали объединение клеток в группы, формирование цепочек (Рис. 4 А) и суспензионных кластеров сперматогенных клеток, представленных предположительно спермато-цитами 1-го порядка. Те клетки, которые меняли морфологию (более овальные) и размножались в виде цепочек, были негативны по ЩФ.

На этом этапе одну часть формируемых суспензионных кластеров сперматогенных клеток переносили на пластик. При переносе СпК, находящихся в суспензии, в чашки Петри, и культивировании их в ростовой среде на пластике в течение 3-5 сут, наблюдали формирование жгутика у всех клеток, что могло свидетельствовать об их дифференцировке в удлиненные сперматиды (Рис, 4 Б), но на 7- сут процесс формирования спермиев останавливался.

Вторую часть мы продолжали культивировать в присутствии КС без смены среды. В результате было установлено, что при более длительном культивировании этих клеток на КС, происходит процесс дифференцировки половых клеток и формирование на 30-33 сут единичных подвижных спермиев хряка (Рис. 4 В). Клеточная популяция на этом этапе характеризовалась гетерогенностью. Наряду с формированием суспензионных кластеров и дифференцировкой в течение 10-14 сут наблюдали формирование небольших, округлых по форме, приплюснутых клеточных колоний, которые были прочно прикреплены к фидерному слою (Рис. 4 Г). Дальнейшая окраска этих колоний на ЩФ показала, что клетки, находящиеся в колониях, её не экспрессируют. Однако при этом были выявлены отдельные округлые клетки, в которых этот фермент обнаруживался. Иммуноцитохимический анализ полученных колоний выявил в них экспрессию PLZF. Анализ полученной популяции в ПЦР-РВ выявил наличие мРНК генов PLZF, Nanog и VASA.

,+у

о, о-

- &

И11й111«*

НН1

* ■ Ишшиям

• 1

■

||||||||

, н Чч».' .^г • а

►ЯРс • &

11Щ

......штам

Рис. 4. А - Формирование вытянутых цепочкой клонов клеток на КС на 7 сут. Ув.: (Об. 20х, ок.10); Б - Формирование жгутика у клеток при культивировании на пластике в течение 7 сут. Ув.: (Об. 40х, ок.Юх); В - Образование подвижных спермиев на КС на 30 сут. Указано стрелкой. Ув.: (Об. 20х, ок.Юх); Г - Образование клонов на КС на 14 сут. Указано стрелками. Ув.: (Об. 20х, ок.Юх)

Анализ данных, полученных в результате проведенных нами экспериментов, убедительно продемонстрировал важность присутствия КС в культуре для поддержания сперматогенеза хряка in vitro. С одной стороны эти результаты могут свидетельствовать в пользу того, что КС способны in vitro продуцировать факторы, в том числе GDNF, без стимуляции их гормонами. С другой стороны нельзя исключить факт, что в культуре могут в незначительном количестве (до 3-х %) присутствовать и другие соматические клетки, например клетки Лейдига или миоидные клетки, которые являются этим индуктором для КС.

2.2.3.3. Культивирование снерматогоний хряка на фидерных слоях, представленных монослоем клеток STO и ММСК КРС

Следующая серия экспериментов включала культивирование выделенных СпК хряка, максимально очищенных от соматических клеток, на фидерных слоях, представленных клетками STO, которые используются для культивирования ЭСК, а также ММСК, которые были выделены из ЖТ КРС.

В результате при краткосрочном культивировании на фидерном слое, представленном клетками STO, на 10-14 сут мы наблюдали формирование клеточных колоний, которые были небольшие, слегка приплюснуты и имели четко очерченные границы. По форме полученные колонии были гетерогенны, однако в них можно было видеть мелкие, плотно упакованные клетки, отрицательные в отношении по экспрессии ЩФ и SSEA-1. Однако в них была обнаружена экспрессия гена PLZF.

При культивировании на ММСК сперматогонии удавалось поддерживать без признаков дифференцировки в течение 7-8 сут. Образование клонов не было отмечено даже на 14 сут культивирования, на 9-10 сут наблюдали формирование суспензионных кластеров.

На всех видах фидерных слоев нам удавалось поддерживать культуру спер-матогоний в недифференцированном виде в течение 7-8 сут, однако, только на фидерном слое, представленном клетками STO, были получены колонии СпК.

Данные по культивированию СпК хряка на фидерных слоях отражены в таблице 2.

Таблица 2

Влияние фидерных слоев на поддержание фенотипа сперматогоний хряка

in vitro, сут

Культураль-ный пластик Фидерные слои

Среда STO ММСККРС

ДМЕМ+ 10% СПК 1 5 4

ДМЕМ для ЭСК мыши 2 10- 14, формирование колоний с фенотипом, подобным ЭСК 7-8, появление суспензионных кластеров

2.2.3.4. Влияние фактора, ингибирующего активность дифференцировки (DIA) на сперматогониальные клетки хряка в культуре

Считается, что сперматогониальные стволовые клетки (СпСК) происходят от первичных половых клеток (ППК) эмбриона, которые имеют внегонадное происхождение и вступают в процесс дифференцировки после миграции в гонады. В культуре ППК мыши и человека погибают в течение 24 час. Однако, если ППК поместить в условия характерные для культивирования ЭСК (наличие фидерного слоя, добавление DLA или LIF), они формируют колонии эмбриональных половых клеток (ЭПК), которые имеют свойства и признаки, сходные с эмбриональными стволовыми клетками (ЭСК). В связи с этим вполне обосновано использование на определенных этапах культивирования СпСК факторов DIA/LIF. Имея в Крио-банке клетки BRL, которые продуцируют DIA, представляло интерес изучить его роль в под держании в культуре СпК хряка.

В экспериментах по краткосрочному культивированию сперматогоний хряка типа А, как на монослое КС, так и на STO были получены небольшие клоны, представленные мелкими плотно упакованными клетками, негативными по ЩФ и

SSEA-1. Клетки клонов разобщали и переносили на новые фидерные слои (STO), а в основную среду добавляли кондиционированную из клеток BRL.

В результате клонирования колоний, полученных ранее на фидерном слое STO, наблюдали формирование в течение 3-4 недель клеточных колоний с разной морфологией. Среди клонов, схожих по морфологии с исходными, были выявлены единичные клеточные колонии, которые имели морфологию, подобную ЭСК. Они имели более правильную округлую форму с четко ограниченными краями и хорошо видимыми мелкими клетками с большим ядром и тонким ободком цитоплазмы (Рис. 5 А). Окраска на ЩФ выявила в них высокую активность данного фермента (Рис. 5 Б). Полученные клеточные клоны поддерживали в культуре в течение 3 мес. Клетки, культивируемые ранее на фидерных слоях, представленных КС хряка, сохраняли свою морфологию в течение 3-4 нед культивирования в этих же условиях и не окрашивались на ЩФ.

Таким образом, в результате подбора комбинаций фидерных слоев и кондиционированных сред нами были получены клеточные колонии, имеющие разные свойства. Считается, что влияние экстраклеточных факторов на сперматогониаль-ные клетки является результатом их динамичного взаимодействия с внутриклеточными транскрипционными регуляторами.

В связи с этим следующим этапом нашей работы было исследование клеточных клонов, полученных ранее в двух экспериментальных группах, по экспрессии генов PLZF, Nanog, VASA и POU5F1 в ПЦР-РВ. Для сравнения использовали свежеизолированные половые клетки, выделенные из тестикул хряков 60 сут возраста той же породы, из которой были получены культуры клеток сперматогоний. Уровень мРНК и количество копий генов оценивали в режиме относительных измерений (AACt метод).

Продукт экспрессии гена PLZF был обнаружен в свежеизолированных половых клетках и клонах, которые были изначально получены при культивировании сперматогоний хряка на монослое КС (Рис. 5 В). В этих же клонах были выявлены продукты экспрессии генов Nanog и VASA. Экспрессия гена Nanog в экспериментальных клеточных клонах превышала экспрессию этого гена в свежеизоли-

рованных половых клетках в 200 раз. Также в этих клонах был выявлен продукт экспрессии гена VASA, который превышал контроль в 350 раз. Данные продемонстрированы на рисунке 6 А.

В клонах, полученных изначально на STO, и далее культивируемых в присутствии DIA, продукты экспрессии этих генов не были выявлены. Однако в отличие от вышеперечисленных клонов, в клонах, полученных изначально на STO, культивируемых далее в условиях, характерных для ЭСК и имеющих фенотип, подобный этим клеткам, был обнаружен продукт экспрессии гена POU5F1. Результаты отражены на рисунке 6 Б. В наших экспериментах продукт экспрессии этого гена был обнаружен только в клонах, которые имели фенотип подобный ЭСК, культивируемых в условиях, характерных для этих клеток.

В связи с этим мы дополнительно окрасили полученные клоны АТ против АГ SSEA-1. Результаты показали, что SSEA-1 АГ экспрессируется на поверхности этих клеточных клонов (Рис. 5 Г). В клонах, полученных при культивировании сперматогоний изначально на фидерных слоях, представленных КС, экспрессия этого АГ не была обнаружена.

Таким образом, в клонах с ЭСК морфологией, полученных в результате длительного культивирования сперматогоний хряка в ростовой среде для ЭСК, дополненной DIA на фидерном слое STO, была выявлена щелочная фосфатаза, экспрессия SSEA-1 и POU5F1, что могло свидетельствовать о частичной реактивации транскрипционных факторов полипотентности.

Следовательно, наличие фидерного слоя и добавление DIA/LIF в среду способствует поддержанию культуры СпСК хряка в течение длительного времени. Возможно, данный фактор является ключевым в изменении поведения сперматогоний хряка в культуре [Савченкова, Полякова и др., 2011, 2012 а, б; Savchenkova, Polyakova et al., 2012].

Рис. 5. Клеточные клоны, полученные ранее на STO и далее культивируемые в присутствии DIA. А - Нативный препарат. Указано стрелкой; Б - Окрашенные на выявление щелочной фосфатазы. Указано стрелкой; В - Окрашенные АТ против PLZF-, Г - Окрашенные АТ против SSEA-1. Ув.: (А,Б,В,Г- Об. 40х, ок.1 Ох)

400 350 300 250 200 150 100 50 0

■п LJ 1 1 ! в 1 1 i

53 Экспериментальные

клоны □ Свежеизолированные

GAPDH NANOG POU5F1 PLZF

VASA

12 10

—¡ЯИЦ-CLJ П , ГЛ , Г1

ЭЭхспери ментальные

клоны □С веже изолированные

GAPDH NANOG POU5F1 PLZF

VASA

Рис. 6. Сравнительный анализ уровня экспрессии продуктов мРНК в клеточных клонах, которые культивировали длительное время на фидерном слое БТО в ростовой среде для ЭСК, содержащей 25% кондиционированной среды ВБ1Ь: А -клоны, полученные в результате краткосрочного (10-14 сут) культивирования сперматогоний хряка в присутствии КС; Б - клоны, полученные в результате краткосрочного (10-14 сут) культивирования сперматогоний хряка на фидерном слое 8ТО и свежеизолированных клетках

2.2.4. Криоконсервация сперматогоний хряка

Применяемые в настоящее время криозащитные среды позволяют сохранять спермин in vitro при положительных температурах и в глубокозамороженном состоянии без утраты основной функции - оплодотворяющей способности (Bwanga, 1991). Но поиск эффективных криозащитных сред продолжается, так как до сих пор не удается успешно криоконсервировать сперматогонии многих видов сельскохозяйственных животных, в том числе хряков.

В связи с этим, вызывал интерес подбор оптимальной по составу криозащит-ной среды и анализ жизнеспособности сперматогоний хряка после криоконсерва-ции.

В серии опытов было установлено, что криопротекторная среда, содержащая 15% ДМСО и 40% СПК, обеспечивает наиболее высокий выход живых половых клеток (86%) по сравнению с другими комбинациями, которые использовались в наших экспериментах. Однако при переносе сперматогоний на фидерные слои наблюдали их остановку в росте. Увеличение концентрации ДМСО в криозащит-ной среде, содержащей 20% СПК, от 5% до 15% не значительно влияет на выживаемость клеток после замораживания и оттаивания. Увеличение же концентрации СПК в среде для заморозки способствовало увеличению числа жизнеспособных сперматогоний. В качестве контроля клетки замораживали без использования питательных сред, сыворотки и криопротектора. Результаты указаны на рисунке 7.

Наилучшие результаты были получены при замораживании клеток в криос-реде, которая содержала 50% ДМЕМ, 40% СПК и 10% ДМСО. Число жизнеспособных клеток от общего числа составляло 68% сразу после оттаивания, а при посеве их на фидерный слой STO, эти клетки сохраняли способность к размножению. Подсчет количества клеток проводили после размораживания при анализе 1000 клеток на поле зрения (Об. 20х, ок. 10х) в 3-х повторах. Средой для культивирования была ДМЕМ, дополненная 10%-ми СПК [Полякова и Савченкова, 2011], [Полякова, 2012].

■ контроль

Ш 20%СПК+5%ДМСО

И20%СПК+10%ДМС О

■ 20%СПК+15%ДМС О

□ 40%СПК+5%ДМСО

□ 40%СПК+10%ДМС О

Ш 40%СПК+15%ДМС О

Рис.7. Влияние состава криозащитной среды на жизнеспособность половых клеток

3. ВЫВОДЫ

1. Установлено, что последовательная краткосрочная двукратная очистка, основанная на разных адгезивных свойствах половых и соматических клеток, способствует получению культуры, на 99 % представленной сперматогониями хряка.

2. Использование КС, продуцентов GDNF, для совместного культивирования, способствует как процессу одновременного размножения и получения клонов сперматогониев хряка, так и их дифференцировке в направлении сперматогенеза, о чем свидетельствует обнаружение в них продуктов экспрессии генов PLZF, Nanog и VASA.

3. Экспрессия гена Nanog в экспериментальных клеточных клонах, полученных при краткосрочном (до 14 сут включительно) культивировании сперматогоний в присутствии КС и далее культивированных на STO в присутствии DIA, превышала экспрессию этого гена в свежеизолированных половых клетках в 200 раз, а гена VASA в 350 раз.

4. Использование фидерного слоя, представленного клетками STO и добавление в культуру кондиционированной среды из клеток BRL, которая содержит фактор, ингибирующий активность дифференцировки, позволяет поддерживать спермато-гонии хряка в культуре длительное время (до 100 сут включительно).

100

& 80 -

л 60 ■

с о 40 -

1 20 -

ё а 0 -

Сертоли

Вид клеток

5. Установлено, что фактор DIA является ключевым в изменении потенций СпК хряка и способствует получению клонов, у которых происходит частичная активация гена POU5F1, наблюдается экспрессия SSEA-I и ЩФ.

6. Применение КС на начальных этапах культивирования сперматогоний типа А позволяет получать половые клеточные культуры хряка. Добавление DIA в культуру способствует длительному культивированию сперматогониевых клеток хряка и созданию полипотентных клеточных линий.

7. Криоконсервация сперматогоний типа А хряка в криосреде, которая содержит 50% ДМЕМ, 40% СПК и 10% ДМСО, способствует сохранению жизнеспособности у 68 % половых клеток после размораживания.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Материалы диссертации расширяют знания о молекулярных механизмах перехода половых клеток хряка к полипотентному состоянию. Разработаны условия для длительного культивирования сперматогоний типа А хряка.

Полученные нами в ходе анализа данные по экспрессии мРНК генов, свидетельствующие о том, что изменение условий культивирования влияет на пролиферацию сперматогоний хряка in vitro и их дальнейшую дифференцировку, предлагаем использовать при изучении половых клеток других видов животных.

Разработан эффективный метод сохранения половых клеток из семенников хряков. Криоконсервация сперматогоний хряка в криосреде, содержащей 50% ДМЕМ, 40% СПК и 10% ДМСО, способствует сохранению жизнеспособности у 68 % половых клеток после размораживания. Учитывая доступность материала и эффективность данного метода, разработанные условия сохранения сперматогоний хряка будут полезны для других видов животных

5. СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ:

1. Полякова М.В. Криоконсервация сперматогоний типа А хряка / М.В. Полякова, И.П. Савченкова // Цитология, 53 (9), 2011, с.742-743.

2. Савченкова И.П. Культура сперматогоний типа А хряка: влияние очистки половых клеток на их размножение / И.П. Савченкова, М.В. Полякова // Цитология, 53(9), 2011, с.747.

3. Савченкова И.П. Влияние условий культивирования сперматогоний хряка на экспрессию генов маркеров полипотентности / И.П. Савченкова, М.В. Полякова, Е.В. Викторова, К.В. Кулешов // Стволовые клетки и регенеративная медицина: Сборник тезисов. -М.: МАКС Пресс, 2011, с.67-68.

4. Полякова М.В. Криоконсервация половых клеток хряка / М.В. Полякова // Биотехнология. Взгляд в будущее. Сборник трудов международной Интернет -конференции. -Казань: Изд-во "Казанский университет", 2012, с.204-205.

5. Савченкова И.П. Влияние условий культивирования сперматогоний хряка на экспрессию генов маркеров полипотентности / И.П. Савченкова, М.В. Полякова, Е.В. Викторова, К.В. Кулешов // Стволовые клетки и регенеративная медицина: Сборник статей / Под ред. Ткачука В.А. -М.: МАКС Пресс, 2012а, с. 237-250.

6. Савченкова И.П. Длительное культивирование сперматогоний типа А хряка / И.П. Савченкова, М.В. Полякова, Е.В. Викторова, К.В. Кулешов // Доклады РАСХН, 20126, № 5, с. 46 - 49.

7. Дополнительная информация к каталогу Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при ГНУ ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко (СХЖ РАСХН)/ И.П. Савченкова, И.М. Волкова, Е.В. Викторова, М.В. Полякова; ГНУ ВИЭВ Россельхозака-демии.-М., 2012. - 6 с. ISBN 978-5-9903649-1-2.

8. Savchenkova I. P. Long - term culturing of boar type A spermatogonia / I.P. Savchenkova, M.V. Polyakova, E.V. Viktorova, K.V. Kuleshov // Russian Agricultural Sciences, 2012, Vol. 38, № 5 - 6. P. 396 - 399.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 10-04-01471-а

Отпечатано в ООО «Издательство Спутник+» ПД № 1-00007 от 26.09.2000 г. Подписано в печать 28.05.2013 г. Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,0 Печать авторефератов (495)730-47-74,778-45-60

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Полякова, Мария Вячеславовна, Москва

ГОСУДАРСТВЕННОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

ВСЕРОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ ИМЕНИ Я. Р. КОВАЛЕНКО Российской академии сельскохозяйственных наук

04201358154 На пРавах рукописи

ПОЛЯКОВА МАРИЯ ВЯЧЕСЛАВОВНА

ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА ПОДДЕРЖАНИЕ СПЕРМАТОГОНИЙ ХРЯКА

IN VITRO

03.01.06. Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Савченкова И.П.

Москва - 2013

Содержание:

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ........................................................5

1. ВВЕДЕНИЕ........................................................................6

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................11

2.1. Строение семенника и сперматогенез.....................................11

2.2. Происхождение и развитие первичных половых клеток..............15

2.3. Происхождение и развитие гоноцитов....................................16

2.4. Происхождение и развитие сперматогоний..............................17

2.5. Поддержание и размножение сперматогоний in vitro.

Роль факторов роста и микроокружения.......................................20

2.6. Перспективы получения эмбриональных стволовых клеток

из СпСК сельскохозяйственных животных....................................24

2.7. Выделение и очистка сперматогоний in vitro............................29

2.8. Способы очистки сперматогоний..........................................30

2.9. Криоконсервация половых клеток сперматогенной линии............33

2.10. Состояние проблемы.........................................................38

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ........................................40

3.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ........................40

3.1.1. Подготовка животных.......................................................40

3.1.2. Приборы и оборудование...................................................40

3.1.3. Культуральные среды, растворы и реактивы............................42

3.1.3.1. Ростовые среды..............................................................42

3.1.3.2. Специальные среды и растворы.........................................43

3.1.4. Культуральная посуда......................................................43

3.1.5. Приготовление фидерных слоев для культивирования СпК.........44

3.1.5.1. Культивирование клеток STO...........................................44

3.1.5.2. Культивирование клеток Сертоли свиней.............................45

3.1.5.3. Культивирование ММСК.................................................45

3.1.5.4. Приготовление митотически инактивированных

фидерных слоев, используя митомицин С......................................45

3.1.6. Выделение культур клеток из семенника хряка.........................46

3.1.6.1. Механический метод выделения........................................46

3.1.6.2. Ферментативный метод выделения.....................................46

3.1.7. Идентификация сперматогоний типа А хряка in vitro..................48

3.1.7.1. Идентификация СпК в культуре.........................................48

3.1.7.2. Окраска на щелочную фосфатазу........................................48

3.1.7.3. Окраска клеток Сертоли....................................................49

3.1.8. Сравнительный анализ экспрессии генов - маркеров.................49

3.1.8.1. Иммуноцитохимический метод..........................................49

3.1.8.2. Полимеразная цепная реакция с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени....................50

3.1.9. Криоконсервирование и хранение клеток................................52

3.1.10. Определение доли жизнеспособных клеток............................53

3.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ..........................................55

3.2.1. Выделение сперматогоний из семенников хряков......................55

3.2.2. Влияние очистки на эффективность получения культур клеток, обогащенных сперматогониями типа А хряка..................................58

3.2.3. Влияние микроокружения и факторов роста на поддержание сперматогоний типа А хряка в культуре.........................................61

3.2.3.1. Характеристика КС хряка.................................................61

3.2.3.2. Культивирование сперматогоний хряка на фидерном слое, представленном КС - влияние GDNF.............................................64

3.2.3.3. Культивирование сперматогоний хряка на фидерных слоях, представленных монослоем клеток STO и ММСК КРС.......................70

3.2.3.4. Влияние фактора, ингибирующего активность дифференцировки (DIA) на СпК хряка в культуре.....................................................73

3.2.4. Криоконсервация сперматогоний хряка...................................82

4. ОБСУЖДЕНИЕ.....................................................................84

5. ВЫВОДЫ.............................................................................99

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ...........................................101

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ:

СпК - сперматогониальные клетки

СпСК - сперматогониальные стволовые клетки

GS — линии половых стволовых клеток

КС - клетки Сертоли

ЭГЖ - эмбриональные половые клетки

ЭСК - эмбриональные стволовые клетки

STO - перевиваемая линия клеток эмбриональных фибробластов мыши ММСК - мультипотентные мезенхимные стволовые клетки ЩФ - щелочная фосфатаза LIF - фактор, ингибирующий лейкемию DIA - фактор, ингибирующий активность дифференцировки GDNF - глиальный нейротрофический фактор БСА - бычий сывороточный альбумин ФСБ-1 - полный фосфатно-солевой буфер Дюльбекко ФСБ-2 - неполный фосфатно-солевой буфер Дюльбекко без ионов Са и Mg2+

СПК - сыворотка плода крупного рогатого скота дпс - день после спаривания дпр - день после рождения

ППК - первичные [примордиальные] половые клетки ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени РНК - рибонуклеиновая кислота мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ВКМ - внутренняя клеточная масса

Работа выполнена при поддержке гранта Российского фонда фундаментальных исследований (РФФИ) 10-04-01471-а

1. Введение

Создание новых клеточных моделей для использования в медицине, в том числе в ветеринарии, является одним из перспективных направлений развития современной науки. В настоящее время лаборатории многих стран занимаются изучением вопросов, связанных с использованием клеток гонад животных в качестве новых клеточных систем для применения их в биотехнологической и фармацевтической промышленности при разработке, тестировании и производстве новых медицинских препаратов.

На сегодняшний день при изучении сперматогониальных клеток (СпК) млекопитающих, в основном, используются лабораторные животные: мыши (Hamra et al., 2004; Kanatsu-Shinohara et al., 2005b), крысы (Hamra et al., 2005; Ryu et al., 2005), хомяки (Kanatsu-Shinohara et al., 2008), а также собаки (Yeunhee Kim et al., 2008). В последнее время появились публикации, в которых объектами исследований являются СпК сельскохозяйственных животных, таких как: крупный рогатый скот (Izadyar F. et al., 2003; Aponte et al., 2008), мелкий рогатый скот (Honaramooz et al., 2003; Rodriguez-Sosa et al., 2006), свиньи (Dirami et al., 1999; Коржикова, 2002; Савченкова и др., 2006; Goel et al., 2007; Han Su Young et al., 2009). Проводятся работы по выделению и изучению клеток этого типа у человека (Sadri-Ardekani et al., 2009; Lim et al., 2010).

сперматогоний типа А хряка, и влияния различных факторов роста на половые клетки in vitro.

В настоящее время установлено, что факторы роста и цитокины играют важную роль как в поддержании СпК in vitro, так и в индукции их полипотентного статуса (de Rooij and Mizrak, 2008). Среди них выделяют глиальный нейротрофический фактор (GDNF), фактор, ингибирующий лейкемию (LIF), идентичный фактору, ингибирующему активность дифференцировки (DIA) (Smith et al., 1988; Williams et al., 1988). Некоторые из этих факторов продуцируют клетки, которые присутствуют в семеннике: клетки Сертоли (КС), Лейдига, миоидные, стромальные и гематопоэтические клетки, а также некоторые стабильные клеточные линии, используемые для культивирования ЭСК. Влияние экстраклеточных факторов на СпК является результатом их динамичного взаимодействия с внутриклеточными транскрипционными регуляторами. Такими внутриклеточными маркерами недифференцированного состояния являются три гена транскрипционных факторов, необходимые для поддержания полипотентного статуса стволовых клеток: POU5F1 (Oct3/4), Nanog, Sox-2.

Цель н задачи исследований. Цель данного исследования: изучение влияния условий культивирования на поддержание сперматогоний хряка in vitro.

В связи с этим были поставлены следующие задачи: щ выделить из тестикул и подобрать условия поддержания в культуре сперматогоний типа А хряка;

■ изучить влияние клеток Сертоли на сперматогониальные клетки хряка in vitro;

■ определить роль микроокружения (фидерных слоев) в культивировании сперматогониальных клеток хряка;

■ оценить роль фактора, ингибирующего активность дифференцировки DIA/LIF, в поддержании сперматогониальных клеток хряка in vitro;

■ провести сравнительный анализ экспрессии генов-маркеров в полученных клетках in vitro;

■ оптимизировать условия криоконсервации сперматогоний хряка.

Практическая ценность работы. Разработаны условия для длительного поддержания сперматогоний типа А хряка в культуре.

Исследованы факторы, влияющие на эффективность выделения сперматогоний.

Применение КС на начальных этапах культивирования сперматогоний типа А хряка позволяет получать половые клеточные культуры свиньи, а добавление DIA в культуру способствует длительному культивированию сперматогониальных клеток хряка и созданию полипотентных клеточных линий.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на:

■ на школе-конференции для молодых ученых «Клеточные технологии для регенеративной медицины», Санкт-Петербург, Институт цитологии РАН, 2011г.;

■ на Международной виртуальной Интернет - конференции "Биотехнология. Взгляд в будущее", Казань, ФГАОУ ВПО "Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казанская академия ветеринарной медицины им. Н.Э.Баумана, 2012г., а также неоднократно обсуждались и получили одобрение на Методической комиссии и Ученом совете ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии.

разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований, обсуждение, выводы, список литературы. Список литературы включает 210 источников, в т.ч. 194 на иностранном языке. Основные положения, выносимые на защиту:

■ влияние ростовых факторов и микроокружения на поддержание сперматогоний хряка в культуре;

■ изучение изменений экспрессии генов Nanog) РОи5П, УАЗА, РЬ2Р и 5Ж4-7 в зависимости от условий культивирования сперматогоний типа А хряка.

2. Обзор литературы 2.1. Строение семенника и сперматогенез

В качестве репродуктивных органов у самцов, зрелые семенники производят спермии и андрогены. Находящиеся в мошонке семенники покрыты несколькими слоями ткани, включая висцеральную вагинальную и белочную оболочки. Соединительная ткань отходит от белочной оболочки в паренхиму семенника, разделяя ее на несколько долек. Каждая долька состоит из семявыносящих канальцев и интерстициальной ткани. Клетки Лейдига в интерстициальной ткани продуцируют андрогены, в то время как спермии развиваются в семявыносящих канальцах. Семявыносящие канальцы открыты с обоих концов в сеть семенника, через которую спермии транспортируются из семенника в эпидидимис, где они созревают и хранятся до эякуляции [Hafez and Hafez, 2000; Almeida et al., 2006].

На эффективность сперматогенеза влияют КС, единственные соматические клетки, непосредственно связанные с половыми, и клетки Лейдига [Захидов С.Т. и др., 2010], а также число погибших на разных стадиях генераций зародышевых клеток. Также эффективность сперматогенеза зависит от начального количества зародышевых клеток, от половой зрелости, от времени года, процесса развития [старения] организма и др. За эффективность сперматогенеза принимается количество спермиев, образующихся за 1 сут в 1 г тестикулярной ткани [т. е. не зависит от размера тестикул у различных видов животных]. На рисунке 1 показана схема сперматогенеза млекопитающих in vivo, на которой представлены отношения между КС и развивающимися половыми клетками, которые по мере созревания смещаются к просвету семенного канальца.

Каждый второй хряк может генерировать примерно 100 000 спермий в результате сперматогенеза в семявыносящих канальцах в зрелом семеннике [Kemp et al. 1988; Almeida et al. 2006]. Высокоэффективное и непрерывное производство спермиев поддерживается сперматогониальными стволовыми клетками (СпСК).

LUMEN

ELONGATE SPERMATID

ft Г .RÓUÑD -V i I . *SPEgMAT4D J 1

S¥RTOL[ CELL

i SffiRhffiTOCrTI

BASAL LAMINA

MYOID CELL

Рис. 1. Сперматогенез млекопитающих in vivo [Desjardins and Ewing, 1993], где SERTOLI CELL- КС, GONIA-спематогоний, SPERMATOCYTE-сперматоцит, ROUND SPERMATID-круглая сперматида, ELONGATE SPERMATID-продолговатая сперматида, LUMEN-просвет семенного канальца, MYOID CELL-миоидная клетка, BASAL LAMINA-базальная мембрана

КС, путем формирования тесных контактов, находятся на базальном и адлюминальном компартментах, главным образом для защиты половых клеток от иммунной системы, выполнения опорных и трофических функций [Hafez and Hafez 2000; Almeida et al., 2006]. В современной номеклатуре сперматогонии млекопитающих подразделены на недифференцированные сперматогонии типа А одиночные (As) или СпСК, А спаренные (Apr), А групповые (Aal), и дифференцированные сперматогонии типов Al, А2, A3,

А4, промежуточные (I) и Б (В). Более детально динамика развития мужских половых клеток на примере грызунов описана Захидовым С.Т. и соавторами [2010]. Сперматогенез млекопитающих подразделяется на три этапа: сперматоцитогенез, когда происходит размножение сперматогоний и каждая следующая генерация клеток оказывается более дифференцированной, чем предыдущая; мейоз, составляющий центральное событие в сперматогенезе, и спермиогенез, во время которого происходит образование спермий [Райцина, 1985]. Диаграмма сперматогенеза млекопитающих показана на рисунке 2. Все три этапа происходят в определенной последовательности. На протяжении сперматогенеза КС остаются в тесном контакте с различными видами половых клеток.

0 Primordial Germ Cell

i "«a> . Spermatogonia (As) M«

(4»y Spermatogonia (Apr)

M.j

( ie.. Spermatogonia (Aal)

Mrt

Qm>, Spermatogonia (Al)

¿Mib

"¿j. Spermatogonia (A2)

XL M.. JX

< o> i«»; Spermatoeoma (A3)

/Т мл

<»><«►•• Spermatogonia (A4)

Spermatogonia (I)

s e»' ^as ~ia> Spermatogonia (B)

„

_ Mfc _

®X®' ^""»У spermatocytes

Мсо^Ц?^ \

ф .« s ® ® « ® ® ® ® л ® -® ®

1ЛлЛллЛлЛЛЛлЛЛЛ1

\ \ \ t \ \ \ \ \ I I I I l I

хччччччччччччччч

Spermatids

Рис. 2. Диаграмма сперматогенеза млекопитающих [Senger, 1997], где Primordial Germ Cell- ППК , Spermatogonia (As, Apr, Aal, Al- A4, I, B)-сперматогонии типа As (одиночные), Apr (спаренны

Информация о работе

Полякова, Мария Вячеславовна
кандидата биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.01.06

Диссертация

Влияние условий культивирования на поддержание сперматогоний хряка in vitro - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы