Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА РАЗВИТИЕ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И МЫШИ В СИСТЕМЕ IN VITRO И IN VIVO

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА РАЗВИТИЕ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И МЫШИ В СИСТЕМЕ IN VITRO И IN VIVO"

А- ТИШ

ВСЕРСШШШЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ШСТШТ ЮВОТНОВОДСТВ*

(ВИЮ

На правах рукописи

ШХШПОВА Ыайсаи Иузаларовна

«АКТОРЫ. ВЛИЯЭДНЕ НА РАЗВИТИЕ ЗЮРНОНАЛЪНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА К КЛЕН В СИСТЕМЕ IH VITR0 В I* VIVO

03.00.13 - Физиология человек

н животных 03.00.15 Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических каук

ДуСровжда, Московской области 1995

Работу выполнена по плану научно-исследовательских работ в лаборатории клеточной инженерии ВНИИ животноводства, а также на базе Института генетики человека МГНЦ РАМН в лаборатории генетики развития и в лаборатории клонирования научной бнотехнолсгической компании "Американская служба разведения" (АВ$, США).

Научный руководитель; кандидат биологических наук

Стрельченко Н.С.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Кононов В.П.; доктор биологических наук Каклаков В. Т.

Ведущее учреждение: Московский Государственный Университет"им. й. 8. Ломоносова.

Защита диссертации состоится " ^ * 1995 года в

Лр часов на заседании диссертационного Совета Д.020.16.02. при Всероссийском научно-исследовательском институте животноводства. I

Адрес института: 142012, лос. Дубровицы, Подольского района Московской области.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан года.

Учен,нй секретарь' специализированного Совета доктор биологических каук

П. А. Наушзнко

- з -ВВЕДЕНИЕ

.Актуальность проблеми. Быстрое развитие биологии и генетики в частности за последние десятилетия явилось результатом разработки новых, современных методов. Получение культуры эмбриональных стволовых (ES) клеток, характеризующихся ллюркпотентньаш свойствами, представляет собой новый инструмент для решения задач генетики, биологии развития, молекулярной биологии, ЫеД!И[ИНСКОЙ генетики, биотехнологии и др.

ES-клетки сохраняют все свойства ражих эмбриональных клеток, то есть являются плюрнпотентными. и способны дифференцироваться in vitro, повторяя раннее развитие эмбриона после имплантации. Таким образом, они могут быть использованы как удобная модель in vitro для изучения процессов дифференцировки в развитии млекопитающих (DoetSchaan et al., 1985).

Примечательно, что ES-клетки сохраняют плюрипотентные свойства в течении длительного культивирования in vitro и после введения в полость нормальной бластоцисти способны участвовать в формировании всех органов и тканей химерного организма, включая зародышевые клетки (Robertson et al,. 1986; Robertson, 1391; Lalleroand artí Brulet, 1990; Hann, 1990). Это свойство ES-клеток позволяет использовать их как носителей для введения чукеродных генов и получения трансгенных млекопитающих непрямым способом (Gossler et al., 1986; Robertson et al.. 1986).

Наиболее распространенным видом среди млекопитающих, у которых получены ES-клетки являются пока ыьши (Yang and Anderson, 1992), Были сделаны попытки изолировать ES-клетки из домаїних животных, її не безуспешно. Так были получены ES-клетки из эмбриона свиньи (Notarlanni et al.. 1990. 1991; Pledraiiita et al. ,1990). овец (Handyside et al.,1987; Pledrahlta et al.,1990), крупного рогатого скота ÍKPC) (Anderson,1992), . норки (Sukoyan et al,,1993). Эти клетки показали морфологическое и функциональное сходство с мышиными ES-клетками в течении дифференцировки in vitro и in vivo. Но в отличие от ES-клеток мыши для этих клеток было бы правильным применить термин ES-подобный, так как они показали ограниченные возможности в формировании клеточных типов в течении спонтанной или индуцированной дифференцировки и по причине неспособности формирования химер. Поэтому важной остается проблема получения истинных ES-клеток > "ДЬмацедр^ ^i^gjjjj^-

нлуч-ідн библиотека

ЬЖ-х. .вльскохоз ачадвмии и í, к. д '¡ имир/

Инш. Nt Az3-

Возможность клонирования млекопитающих путем трансплантации ядер бластомеров в энуклеировакные ооциты бала показана у крупного рогатого скота (E-ondioli et al., 1990) и кроликов (Sties, 1989). Клонирование представляет собой метод для производства идентичных особей сельскохозяйственных животных с выдающимися продуктивными качествами. Ядра бластомеров эмбрионов прегаструля-ционных стадий были до недавнего времени единственным источником доноров в процессе клонирования. В настоящее время ведутся успешные попытки использования ES-клеток сельскохозяйственных животных в качестве доноров ядер (Salto et al., 1992; Streichend et al., 1995). ES-клетки сельскохозяйственных животных могли бы быть использованы как неиссякаемый источник тотипотентных ядер. Существует ряд трудностей, ограничивающих коммерческое использование метода трансплантации ядер для клонирования животных. Они связаны в основном с неполноценностью развития ES-эмбрионов (эмбрионов, полученных методом трансплантации ядер ES-клеток в энук-леированные ооциты) после имплантации. Это может объясняться частичной дифференцкровкой ES-клеток, а также кариотипическими изменениями недифференцкрованшг. клеток в процессе длительного культивирования In vitro.

Неспособность формирования химер из-за кариотипических изменений, происходящих при длительной культивировавши In vitro показаны на линии ES-клеток мыши D3 (Ыиталипов. 1994). В литературе нет сообщений о влиянии условий и длительности культивирования на плюрипотентные свойства ES-ioieroK сельскохозяйственных животных.

Начало клеточной дифферешировкн в раннем эмбриогенезе млекопитающих связано со статусом Х-хрсмосомы. Одна из Х-хромосом у женских особей мышей инактивируется сначала в клетках трофэкто-дермы. затем в первичной энтодерме и клетках зпибласта (Rastan and Robertson. 1985). Так как Х-инактивация связана с началом процессов дифференцировки, ES-клетки представляют собой удобную модель in vitro, в которой этот механизм может контролироваться экспериментально. Увеличение процента ннактивированных Х-хромосом в дифференцированных ES-клетках мышей впервые показали Rastan с соавторами (1985). затек на ES-клетках другого млекопитающего -норки Сукоян с сотрудникам продемонстрировав то se самое (Suko-yari et al., 1993).

Цель и задачи исследований. В соответствии с вышеизложенным, целью работы явилось разработка метода получения линий шгорипо-

тентиых стволовых клеток КРС и анаша факторов влияющих на их развитие In vivo и in vitro з сравнении с ES-клеткаии юти.

Для достижения цели необходишм условием явилось решение сле-дущих задач:

- разработка метода получения к культивирования ES-клеток КРС;

- сравнительный анализ морфологических и ростовых характеристик полученных ES-клеток КРС и мыии;

- сравнительный анализ способности ES-клеток КРС и мыши к диф-ференцировке In vitro.

- изучение влиянии длительности культивирования ES-клеток КРС и мыши на их способность поддерживать развитие In vivo;

- изучение влияния длительности культивирования in vitro на стабильность кариотчпа ES-клеток мши и КРС;

- разработка метода тестирования плюрипотенткости ES-клеток KFC in vitro, основанного на анализе инактивации одной Х-хроиосо-мы в женских линиях ES-клеток з процессе дифференцировки.

Научная новизна, первые разработана методика получения и культивирования эмбриональных стволовых клеток крупного рогатого скота (КРС). Охарактеризованы морфологические и ростовые особенности ES-клеток КРС in vitro, Плврипотентная природа полученных ES-клеточиых линий доказана путем индукции дифференцировки в различные типа отециализированкых клеток in vitro и способность!) развиваться in vivo вплоть Í 0-5-5 дней стельности после трансплантации ядер ES-клетпк в энуклеирсеанные оэциты. Впервые показано влияние длительности культивирования и происходящих при этой изменений кариотипа на способность ES-клеток КРС формировать плод.• ■Путем гистохимического окрашивания бензидином дифференцированных производных ES-клеток выявлет присутствие высокоспециализированных клеток крови - эритроцитов. Впервые предложен иеюд клонирования КРС путем трансплантации ядер ES-клеток в энукпеированные ооциты. первые предложен новый метод субклонирования ES-клеток КРС.

Практическая значимость. Полученные данные о влиянии различных Факторов на развитие ES-клеток in vitro и vivo позволяют более эффективно использовать ЕЗ-кгзтки в научных целях и клонировать животных с выдающимися хозяйственно-полезными признаками.

Экпериментальныэ данкыз по получению и культивировании ES-клеток КРС, а такае использование их а качестве доноров в технике трансплантации ядер являются новыми в мировой практике и могут

с- - 6 -

представлять практический интерес в иетодическш аспекте.

Апробация диссертации. Основные положения диссертации были представлены на международной научной конференции по проблемам эмбриологии (Калгари, Канада, 19?5), на научном семинаре лаборатории генетики развития Института генетики человека МГЩ РАМН, состоявшемся в ноябре 1994 года, на объедженной научной конференции отдела биотехнологии и лаборатории биохимии ВНИИ животноводства.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 1 экспериментальная научная статья, 4 тезиса.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 118 страницах машинописного текста, состоит из следующих разделе®: введение. обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждений выводы, список литературы. Указатель литературы содержит 14 отечественных и 152 иностранных библиографических источника. Диссертация илгахлрированг. 1 схемой, 8 таблицами, 2 рисунками, 19 фотографиями н 3 гистограммами.

: V ^ СОЛЕРКАНИБ РАБОТЫ.

Работа выполнена по плану научно-исследовательских работ в лаборатории клеточной инженерии ВНИИ животноводства, а также на базе Института генетики человека МГКЦ РАМН в лаборатории генетики развитие, и в лаборатории клонирования животных научной биотехнологической компании "Американская служба разведения". lía рисунке : Í представлена комплексная схема проведения экспериментов, в результате которых были получены данные по характеристике ES-клеток КРС In vitro, их кариологии и способности формировать плод.

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Линии ES клеток использованные в работе. Линии ES-клеток КРС ES-1,2,3.4,5, а также первичная культура клеток легкого и печени ES-эмбриона КРС 40-дневного срока развития получены в наших экспериментах по методике описанной ниже.

Два клона D3M и D3W ES-клеток мыши линии DO (Dóetschman et al.,1965) любезно предоставлены Dr.G.Brem из университета Людвига Максимилиана (Мюнхен,Германия) и Dr.R. Remter из института кммуно-биологии Общества Макса Планка (Фрайбург. Германия). ES-D3 клетки являются мужской линией и получены из бластоцисты мышей линии 129/Ter Sv »(генотип по окрас/ шерсти А*А*,ВЗ,СС)

СХЕМА ЭКСПЕРИМЕНТА

Вымывание ооцигов

"^ЛГ Энуклеация то ооцитов

\

/

. „.Оплодотворение

ооцитов "1іго

Изоляций ВКМ бластоцисты

ч

И секция Es клетки

Электро слияние

Es клетки „ ¿кффереНЦИрО в К â . культуре : £3 клеток

\

Кариотипический аналиэ Es клеток

Развитие

до бластоцисти in vitro

Трансплантация ,

ложно-беременной I самке г

Yrî

Развитие плода до ЭД-55 дней

РИС. .І - Схема

эксперимента

- в -

Линия ES-клеток SIR предоставлена к.б.н. Н.С.Стрельченко (instituí fur Tierzucht und Tierverhalten. Иариенэве. Германия). ES-STR клетки получены из бласпофюта швей тш 14 C0S/G1».

Культивирование SS-клеток или проводом в среде ДЮ(, содер-ззцей 15% эмбриональной телячьей сьщоротки, 0.1 Ш 2-неркаптоэта-нола и 1мМ ¿.-глптамуиа. • Для получения и культивирования ES-клеток КРС использовали жидкую среду Альфа-ИЕМ, содержащую iOSt эмбриональной сыворотки, luit L-ггогамвда. 0.1МИ 2-меркалтоэтадала.

В качестве фидерных клеток, использовали первичную культуру эмбриональных фибробластов (Ш шш, прол^ерация которых была блокирована митомицином С (10 мкт/мл).

Получение ES-клеток КРС. Для получения ES-клетсж КРС использовали в-10-дневные бластоцисгш, спонтанно освободдашиеся из блестящей оболочки*; либо удаляли оболочку растворш проназы (Змг/мл). Затеи эибрданы по одному переносили в чаики с монослоеы »активированных фидерных клеток со средой Альфа-MEM. смену среды проводили каждые 2 дня. ^

: После прикрепления клеток внутренней клеточной кассы (НИ) ' к , поверхности фидерных клеток ежедневно следили за их ростоц и морфологией. Первый naccas проводили при достижении клетками ШШ мо-носпоя диаметром 5 m Пересев проводили при помощи пастеровской пипетки. . "V:.,..

Поддержание ES-клэток КРС в культуре In vitro. Подщжанне "ES клеток в недифференцированном состоянии осуществлялось перио-дчческим пересевом на свежий слой инактгаированных эмбриональных фибробластоз шши. Пересев клетс« проводили через каждые 2-3 дая' механически« способом.

Препараты метафазных пластинок ES-клеток КРС готовили по методу Канда (Kanda, 1973). ES-клеток мши - согласно методике, изложенной Робертсон (Robertson, 1987).

Гистохимическое окрашивание на присутствие эритроцитов. после индунши диФФерениировки ES-клеток. Для индукции дифференцировки ES-клеток с формированием эритроцитов, вырабатывающих гемоглобин добавляли в среду ДМСС в разной концентрации (IX и 2Ï) и культи-вировалив течении ô дней. Затем клетки окашивали бензидююм:

- добавляли 0,1ы1 красителя на 1 мл ростовой среды и инкубировали в течении 10"мин при комнатной температуре:

препараты.наблюдали под инвертированным микроскопом.

- 9 - ( ■

Цитохимический тест на специфическую активность мелочной toe-Фатазы ES клеток. ES клетки высевали на покровные стекла с блокированным слови фидерных клеток. Через сутки клетки фиксировали Ъхлажденньы ацетоном С) в течение 1 пин, зате« инкубировали б свежеприготовленно« растворе красителя прочный синий ВВи субстрата AS-BX фосфат в течение 1 часа при 37s С, Раствор красителя и субстрата готовили согласно методике изложенной Лойдом (Лойда и др. і 982).

Статистическая обработка результатов. Для оценки значимости различий по частоте Формирования химер разгеыи клонами ES-D3 клеток шши использовали критерий согласия Х£( см. Каминский, 1959). а для оценки значимости различий кариотипическнх аномалий в BS-клетках КРС использовали критерий Фишера. Достоверность качественных различий в сравниваемых грушах определяли с помощью метода углового преобразования Фишера. Достоверность качественных различий по степени химеризма мышей в сравниваемых группах определяли с помощью точного метода Фишера. Гіри этом оценивали разницу в частоте появлення химер с содержанием агути окраса в верстном покрове 503 и более (см. Гублер. 1976}. Достоверней считали различия при Р<0,05.

2. Результаты исследований и их обсуждение

Получение лийий плюрипотентных стволовых клеток КРС. В нашем эксперименте мы использовали 26 эмбрионов КРС голнтинофризской порода на стадии бластоциста (8-10-й день после оплодотворения) (табл. 1). Бластоциста были получены путем оплодотворения ооцитов in vitro в лаборатории клонирования животных.

Из таблицы 1 видно, что формирование ES-голобкых колоний не зависело от использования LÍF в качестве ингибитора дифференци-ровки. Видимо, LIF является видоспецифивділі фактором и оказывает иигибирующее действие лишь на дифференцировку ES-клеток мыжи. По данньм таблицы, наблюдался активный рост клеток ВКМ у эмбрионов , оплодотвореншх семенем быка Imperial, независимо от использовании LIF, что составило 100Х от вдела изначально посаженных эмбрионов. Менее активный рост ОД1 наблюдался у эмбрионов быка Marauder, что составило 87J5 без использования LIF н 1Ь% - с использованием,

В отличии от ЁЗ-клеток мыши, BS-клетки КРС не образует многослойные колонии клеток, а образуют монослой эпителиоподобных кле-

ток. К-клетки КРС имели больший диаметр (20-30 мки) чем Е8-клет-кн ьши (8-15 ыкм), с четко выраженным крупшш ядром и кебольшм количеством цитоплазмы. В цитоплазме ЕЗ-клеток КРС, в отличие от мыши, наблюдали большое количество липидных включений. Обцны морфологическим критерием ЕЭ-клеток шеи к КРС можно считать относи-

Таблица 1

Влияние фактора И*7 на эффективность выхода ЕБ-подобнык линий КРС (пояснения в тексте)

Доноры эмбрионов-быки

(гавдтино-

фризской

порода)

Фидерные системы

Количество эмбрионов

Рост колоний вкы

(в ЗЕ от гтерво-начально-по-сажедаых эмбрионов)

Получено

ЁЗ-годобных

линий

(в Я от первоначально-посаженных эмбрионов)

Imperial

Первичные

фибробласты

шши

Первичные фибробласты 'мыши +LIF

5 Ü00X)

5 (lOOi)

1 (20®)

t (ZOil

Marauder

Первичные

фибробласты

мыши

Первичные фибробласты мыши +UF

7 (87,5SS)

6 (75*i

2 (25S)

1(12.5%)

телько больше расстояние между клетками по сравнению с клетками эпителиальных тканей.

Дифференцжювка Е5~кдеток КРС и шши Ш .уНго.. Е£-клетки обладают способностью быстро дифференцироваться. Способность Е5-клеток? формировать при дифференцировка эмбриоидные тела, по

мнению ряда авторов, является основным тесто« на гиюрипотентностъ в условиях 1л vitro (Robertson, Bradley, 1386; Evans et al.,1990a; Baribault. Kenler, 1989). Для сравнительного анализа - дифференцировки ES-клеток КРС и мши. мы использовали линию СЗ ES-клеток шши. ES-клетки шши и ИРС спонтанно дифференцировались в культуре in vitro при продолжительной (5-6 дней) культивировании без пересева их на свежий слой фидерных клеток.

ES-клетки КРС образовывали эмбриоадние тела различней сложности и размеров в зависимости от продолжительности культивирования (10 дней и более). Крупные эыбриоидные тела составляли 8-12 ш в диаметре и имели морфологическое сходство с 8-10-дневными бласто-цистами с той лишь разницей, что ВКЫ-лодобные структуры находились снаружи.

При длительной культивировании ES-клеток КРС (253 дня) наряду с пролиферацией недифференцированных ES-клетон наблюдали также спонтанную дифференцировку стволовых клеток с образованием клеток с нейроноподобной, энтодердаподобнэй и фибробластоподобной морфологией.

Предварительно, мы выявили специфическую активность щелочной фосфатазы (ALP) стволовых клеток эмбркобласта 4-дневной, бласто-цисты мши, используя цитохимическое окрашвание субстратом AS-BI фосфат и красителем прочный синий ВВ (результаты не представлены). Мы предположили, что и ES- клетки КРС и ыьши также должны обладать такой особенностью. ES-клетки мыши линии STR и 03 вали одинаковую положительную реакцию на цитохимическое окрашивание. Использованный нами метод выявления ALP ES-клеток мог бы быть ис--.пользован как тест на шаорипотентность ES-клеток в системе in vitro, однако попытки окрашивания недифференцированных ES-клеток КРС не дали положительной реакции. Не наблюдали положительного окраливания при выявлении ALP и у иктактных эмбрионов КРС, вклв-чая морулу и бластоцнсту. Для объяснения этого факта можно сделать два предположения: либо использованный метод окрашивания ALP по каким-либо причинам "не срабатывает" по отношению к КРС, либо ранние эмбриональные клетки КРС не обладает, в отличие от шши, высокой активностью данного Фермента.

Для оценки способности ES-клеток КРС к дифференцировке с образованием высокоспециализированных клеток использовали метод окрашивания дифференцированных производных клеток бензидином на присутствие эритроцитаркых клеток, продуцирующих гемоглобин, Резуль-

тати окраяивания показали присутствие гемоглобин-совержащю клеток в дифференцированных учалках культуры и в зыбриокдосс телах Положительное окрашивание отсутствовало в невифференвдювамаа ES-клетках и соматических клетках КРС (первичные Фибробласты печени. полученные от ES-плода КРС). Этот тест ноют служить наглядным доказательством плвртотетности ES-клеток in vitro.

ДиФФеренцировка Е$-удеток КРС In vivo. Плормготегпее свойства ES-клеток КРС, полученных в наша экспериментах были изучены.также в системе In vivo по сравнению с ES-клеткаыи ш линт D3. Для оценки потенций SS-клеток КРС к развитие in vivo был выбран метод трансплантации ядер ES-клеток а энуклеированные ооцита.

Этот метод был разработан в лаборатории клонирования животных биотехнологической сельскохозяйствежой кошании ABS для клониро-

Таблица 2

Эффективность развития зигот при трансплантации ядер ES-клеток КРС с различной длительность» культивирования In vitro

Длительность культивирования ES-клеток In vitro

Трансплан Развилось тировано до бласто-ядер ES-клеток цисты в энуклеиро- (X) ванные ооциты

Трансплантировано в матку коров-реципиентов

Выявлено стельностей - (*)

Ранние пассажи

(до трех 249 63 (25,3%) 10 4 (40«)

месяцев в культуре)

Поздние поссажи (более

Трех ые- 246 75 (30.5« 10

сяцев в культуре)

-1-i—

- 13 - J

вания эмбрионов КРС путем трансплантацж*ядер бластомере® в знук-ланраважые ооцига Совместно с сотрудника»« этой лаборатории данный метод был каш адаптирован для ES-клеток.

« Развитие знгот с транспвантироватам ядрами BS-кяеток КРС. 6 эксперименте ш исюпзовали ядра ES-клеток КРС, в качестве доноров ядер, на разных этапах культивирования. Клетки ранних пассажей находились в культуре in vitro до трех месяцев (67 дней), клетки же поздних пассажей нахопились в культуре, ооответствето, свыае трех месяцев (253 юя).

Да№ше тайлшда 2 наглядно демонстрирует разницу между потенци-дан к развитие пересажежых ядер ES-клеток КРС с различной продолжительностью культивирования в условиях In vitro. При трансплантации в матку коров-реципиентов бластоцист. развивкихся из ядер ES-клеток, проведших больяее число пассажей наш не было зарегистрировано стельности у реципиентов, в экспериментах с ES-клетками ранних пассажей стельность составила 40% от числа трансплантироваюшх бластоцист. Хотя следует отметить, что в обоих случаях мы не наблшали разницы в развитии ES-зиготы до стадии бластоцист Напротив, эффективность развития зигот до бластоцис-; ты бьша выше при трансплантации ядер ES-клеток поздних пассажей ■ (что составило 30.5* от общего числа прооперированных оститов) по сравнению с ES-клетками ранних пассажей <25,3X1.

Вероятной причиной неспособности развития ES-бластоцист поздних пассажей можне считать возникающие изменения в каристипе ES-клеток в процессе длительного культивирования in vitro.

Изучение пренатального развития ES-плода КРС. Стельность коров-реципиентов определяли ультразвуковым методой и регистрировали еженедельно. Развитие плода вло нормально до 55 дней после чего регистрировали гибель плода. К этому сроку у эмбрионов, в основном. была сформирована и функционировала кровеносная, выделительная и пищеварительная системі- Ультразвуковім методом било зарегистрировано четкое биение сердца плода. По прекращению биения сердца регистрировал) гибель, после чего происходила резорбция и аборт.

Гистологические препараты различных органов и тканей плода показали присутствие всех основшх тканей, являющихся производными трех зародышевых листков. ТщательюА анализ гистологических препаратов. проведений профессиональными гистологами из Мадисонско-го Университета, не выявил каких-либо аномалий в развитии клеток

и тканей легкого . почек, желудка и костной ткани ES-плода. Вс= органы морфологически соответствовали нормальному развитие органов обычного плода этого же возраста. При изучении экстраэмбриональных тканей было выявлено недоразвитие плаценты, которое выражалось наличием меньшего числа котиледонов у ES-плода, чем у нормального зародыиа соответствующего срока развития (данные не приводятся). Это, вероятна, может служить еще одной из причин гибели плода.

Изучение потенций к развитию ES-клеток мьди путем получения инъекционных химер. С целью изучения потенций двух клонов ES-03-клеток D3W и D3M, проведших различное число пассажей с момента субклонирования, проведен эксперимент по получению химержх мышей с использованием этих клонов.

Таблица 3

Частота формирования химер клонами D3W к D3H ES клеток

швей

Клон Число Линия . Транс- Родилось из них % згутч п

пасса- бласто планти- мыоей химер KSpCTHOü ГСйфСВЗ

жей цисты ровано (55) (самцов)

C57BL/6 51 29 14 (8) 90,80,3x70,2x60,

3x50,40,2x30,20

03« 17 BALB/c 43 11 4 (3) 50.2x¿0,20

CBWA 32 13 5 Ш 70,60,30,2x1 Оз я

Итого 126»»» 53 az%i 23»(15)

C57BL/6 31 9 0

D3M 42 BALB/c 55 24 5 (3) 40,30.20,10,5

CBWA 28 11 4 (2) 50.40.10.5«

Итого 114*«« 44(39SS) 9« (5)

« Р(Х2) < 0,02 ** РтиФ ■ 0,022

*»* Учитывали только те эмбрионы, после трансплантации которых самка становилась беременной и рожала живое потомство. Примечание; Рт„ф рассчитан по разнице частоты встречаемости хи-

о

мер, полученных от 2-х клонов ES-D3 клеток, с содержание« окраса агути в верстном покрове 50Х и более.

В качестве рецдаиенпшх гри инъекции были использованы бласто-" цисте люой C57BL/8, BALB/C и тетрагибридов CBWA. В таблице 3 показаны результата этого эксперимента. Клетками D3W и D3* было проннъецировано 126 и Ш бластоцист соответственно. Из 53 радившихся ыыяей после трансплантации эмбрионов с участием клеток D3W, 23 (43*) оказались химерами. которые были выявлены по содержанш агути окраса в шерстном покрове. После трансплантации эмбрионов, в которые были тгьецироэаш клетки D3M. родилось 44 мывонка, из которых 9 (20%) били химерами. Все химеры были проанализированы по степени колонизации тканей ES-клеткаии (Ї окраса агути в верстном покрове). Содержание окраса агути в шерсти химер, полученных при участии клона D3W колебалось от 10 до 90%. тогда как степень • колонизации тканей клоном D3H не превшала 5055.

Статистический анализ данных этого эксперимента показал, что клен D3V, белее раннего пассажа, достоверно превосходит клон ВЗМ как по числу химер среди потомства (43 и 9%% соответственно, Р<0,02), гак и г» процентному содержании'йгути в верстной покрове (10-90*% и Ь-Ш% соответственно. Р-0.022К -

Результаты кариотигтического. анализа ES-клеток KPG. Для выявления кариотипических изменений плюрипотешшх стволовых клеток крупного рогатого скота в зависимости от длительности культивирования ж провели кариотипический анализ одной женской линия ES-í, из которой было получено 9 субклонов. Субклонироеакие проводилось с использованием метода трансплантации ядер. ■ № использовали несколько субклонов одной женской линии и кар;;-оттировали юс на ранних пассажах Í67 дней s культуре. условно трех месяцев в культуре) и на поздних пассажах (253 дня. сбь^: трех месяцев s культуре, соответственно). Было исследовано 384 метафазные пластинки ES-клеток КРС, и в качестве контроля бьша получена культура фибробластов печени к легкого из ÊS-эибриона крупного рогатого скота 40-30-дневного срока развития, полученного методом трансплантации ядер с использованием стволовых клеток в качестве доноров ядер.

Нами было исследовано 9 субклонов датой женской линии, но мы объединили их по длительности существования в культуре In vitro условно как ранние пассажи (ЕР) и поздние пассажи (LP) по ряду причин: во-первых это субклоны одной женской линии, культнвиро-

Таблица 4

Частота встречаемости полиплоидии в популяции ES-клеток КРС на разных сроках культивирования

Срок Диплоида Полиплоида Общее число достовер-

культивирования кол.метафаз кол.метафаз метафаз ность раз-

клеток (X от лбщегс (5Е от общего личий меж-

числа) числа) ду ранними

и позд-

ними

пассажами

Раяние

пассажи (ЕР)

(до трех меся- 42(91,3%) 4 <8,?& 46 (100Ї)

цев в культуре)

Р<0,01

Поздние пассажи

(ЬР)

(свыше трех меся-

цев в культуре) 200(59,345» 137(40,66%) 338 (100%)

Контрольная

группа 34 (1005Е) 34 (100»)

(фибробласты

плода)

еавкнеся в одинаковых условиях и, во-вторцх, между клетками разных клонов кариотипических различий не обнаружено (данные не приводятся). Таблица I' наглядно демонстрируют уровень шшднссги культуры. По данным таблицы мы видим, что на ранних пассажах 91,15Е клеток имели преимущественно диплоидный кариотип. В.этот промежуток (сультквирования кариотип клеток оставался более стабильным, и число полиплоидных клеток составило 8,9 Ж. Другая картина наблюдается на поздних пассажах: так, диплоидные ¡слетки составили лишь 59,32 от общего количества метафазшх пластинок и заметно повысился в процессе культивирования In vitro процент полиплоидных "«31ST0K, который составил 40,61 (различия между числом полиплоид-

- 17 - .

них клеток на рашнх и поздних пассажах достоверны. р<0.01). В контрольной группе соматических клеток легкого гкишшшдных клеток не обнаружено.

Кроне того , было проведено сравншда часготы встречаемостн анеуплондии на ранюа и поздних пассажах. На поадаих пассажах среди нело/иплоиджк клеток этот показатель составил 81,6* от общего количества да- ианеуплзндамх клеток, тогда как на ранних пассажах о« составил 35,7* (р<0,001)(табл.5).

Модальное число хромосом на рамшх пассажах составило 60, количество клеток оадержэцнх такое количество хромосом равнялось

Таблица 5

Частота встречаемости анеуплондии среди дшиюндшх ЕЗ клеток КРС на разнос сроках культивирования

Срок культи- дишюидные Анеушшды Общее коли. Достовер-вирова»« клетки кол. (X) клеток ность раз-

клеток кол. (XV лтнй "■'■■"

Ранние

пассажи (ЕР) 27(64. ЗЖ) Поздние

пассажи ОР) 37(18, БЖ)

&4.ЭХ, остальные клетки содержали анеуплоидный каржзтип. Разброс количества хромосом в клетках ранних пассажей варьировал от 52 до 117 хромосом. Модальное число хромосом на поздних пассажах составило также 60. но процент клеток содержащих такое количество хромосом уменьшился и составил 18,5*. Разброс количества хромосом в клетках поздних пассажей варьировал от 16 до 239 хромосом, то есть вариабельность этого признака по мере культивирования увеличилась.

Уровень дифференцированное™ клеток в раннем эмбриогенезе можно охарактеризовать статусом Х-хроиосомы (Бикоуап еъ а1.. 1993). Половые хромосомы КРС представлены субметацентрическими хромосомами н легко отличим от аутосоы." Таким образом, неактивную Х-хромосому можно отличить поменьшему размеру н более теыноыу

■ ■ . . ■ '■ 15(35.7%) . 42(100%)

Р<0.001

163(61.5Х) 200(100Х)

окрашиванию при приготовлении препаратов по методу Канда. Таблица 6 показывает, что процент клеток содержащих темноокрашенную, значительно меньшую по размеру (позднореплицированиую, генетически инактивцрованную) Х-хромосому составил 11% на ранних пассажах и 53% на поздних пассажах от общего количества диплоидных клеток (Р(0,001).-

Для наглядности сравню« Х-инактивацию в клетках контрольной линии эмбриональных фибробластоз и ES-клетках КРС. Так, клетки эмбриональных фибробластов представлены, в основном, инактивирован-ной Х-хромосомой (91Ж)

Таблица 6

Количественный анализ позднореплицированных Х-хромосом в женской линии ES-клеток и эмбриональных фибробластов КРС

Срок Число Ыетафазы с Ыетафазы с Достовер-

культи- ¿ипловдкых активной инжгишро- ность

вирова- клеток Х-хромосомой Х-хромосомой различий

ния с двумя Х-хромосомами кол. (X) кол. (SS) •

Ранние

пассажи (ЕР) 4 г 5 (11, ЭХ) 37 (88,15t) Р< 0.001

Поздние

пассажи (ЬР) 82 35 (42,1%) 47 (57.ЗЖ)

Контроль- Р< 0.001

ная группа

(фибробласты 34 3 (9%) 31 (91Х)

плода)

Результаты каоиотипического анализа ES-клеток мыши. Для сравнительного анализа карнотипических изменений ES-клеток и дальней-' шего развития их In vitro и in vivo мы использовали, линии ES-клеток мыши STR и два клана линии D3: D3W и D3M.

Для выявления кариотилических изменений ES-клеток, прошедших различное число пассажей с момента введения в культуру (STR), либо с момента субклонирования (D3W, D3M). проведен 1сариотипический анализ двух клонов ES-клеточной линии D3 и линии STR. Отбор мета-фазных пл&стинок. пригодных для подсчета числа хромосом, проводи-

- 19 - .

ли по критериям, предложенным Н.П.Бочковым с соавторами (1972). Еьио исследовано по 50 метафазных пластинок каждого образца.

Как видно из таблицы 7, с связи с длительностью культивирований In vitro меняется и распределение числа хромосом в сторону увеличения дели клеток с анеуллоидным набором. У клона D3M. прошедшего 42 пассажа с момента субклонирования, только 58% клеток имели нормальный зуплоидный (2п » 40) набор хромосом, б то время как у клона D3W (17-й пассаж) 82% клеток имели нормальное число хромосом.

У линии ES-клеток STR. проведших к моменту анализа более 20 пассажей, модальный масс хромосом был 39 (66%). Попытки субкло-

Таблнца 7

Частота встречаемости анеуплоидии в популяции ES-клеток мыши на разных сроках культивирования

Линия I Пол 1 Число I Модальный I Дипломы I Анеуплсидь* Е5 клеток I ! пассажей! класс (Ж) 1 I

D3W XY 17 40 (82Х) 41 (£2:0 0 4iV1 a ab*/

D3M XY 12 40 (58« 29 (58Äi 21 i-ifcÄ;

STR f> 20-24 39 (66?) 50 (100-:'

пировать линию STR, для того чтобы отселектировать и разілно-.кть клетки с нормальным эуплоидным набором хромосом, оказались 6i;v:-пєїкши. Очевидно утеря яромосоны произошла еще на ранню: пассажах клеток STR при получении.

Таким образом, также как и у ES-клеток КРС, в популяции ES клеток мыши мы наблодали уменьшение процента клеток с диплоидным набором хромосом по мере культивирования in vitro с 82* до 58?.

Субклонирование ES-клеток КРС с использованием метода трансплантации ядер. Для того чтобы отселектировать клетки с нормальным эуплоидным карнотипом нами был проведен эксперимент по субклонированию ES-клеток КРС. Суть метода заключалась в следущем: в энуклеированные ооциты инъецировали ES-iwieтку КРС с последующей активацией ядра к делению. По достижении стадии бластоциста ES-эмбрионы ввозили вновь в культуру ,

Таким образом, было инъецировано 40 ядер ES-¡теток КРС в энун-лекровашые зоиить;, 15 из кик развилась до стадии бластоцйсты (32,6%). После введения в культуру 15 бласт-цист, были получены S субклонов ES-клеток, которые кариотипирозались как описано вше.

3. ВЫВОДЫ

1. Впервые разработан метод получения ES-jcneroK КРС я предложены оптимальные условие их культивирования in vitro. Охарактеризованы морфологические и ростовые особенности ES-клеток КРС в сравнении с хорошо изученными ранее ES-:'.летками пызи, отмечены различия и сходства межлу инми.

' 2. Плюрипотентные свойства ES-клеток КРС подтверждена б условиях in vitro способностью образовывать эмб~>шидные тела и спонтанной дифференцировкой в различные типы клеток. Впервые проведен тест на присутствие в дифференцированных производных ЕЗ-клеток КРС прелшественников эритроцитов путем скразизания бекзининон, что подтверждает плкркг.отзктмость полученных нами ES-клеток КРС.

3. Проведен сравнительный анализ шюрипотентных свойств ES-клеток КРС и шли in vivo в зависимости от длительности культивирования in vitro. Изучение потенций ES-клеток КРС и мьяли in vivo погсазало, что тетки ранних пассажей по сравнению с клеткам поздних пассажей обладают 6о;(ъе£й способностью участвовать в развитии ES-плед а и Формировании химерного организма. Развитие ES-плода КРС наблюдалось энлоть до 40-55-ти дней стельности. До

■' гибели эмбриона морфологических и гистологических аномалий б развитии не обнаружено, за исключением экстраэмбриональной ткани (плаценты),

4. В целях поиска причин неспособности к полному внутриутробному развитию ES-эмбрионов и неспособности имплантации ES-бласто-цист, полученных из ES-клэток поздних пассахей, был проведен ка-риотипический анализ ES-клеток КРС и шши в зависимости от длительности культивирования in vitro. Клет;ш поздних пассажей ха-рангеризовались большим процент,! снеушюндж" Í7.Í, 64%) и полиплоидных (40,63%) клеток, чем клетки ранних пассахей (33,33% и 3,755 соответственно), Преобладание и клетках поздних пассажей клеток с акомальккм кариотипом явилось, несоьзнзнко, одной из причин неспособности формирования ими плода.

5. Разработан метод предварительного тестирования плюрнпотент-ности ES-клеток КРС, основанный на изучении инактивации одной из

Х-хроыосом в женских линиях. Показана обратная корреляция между процентом инактивированных Х-хромосом в женских ES-клетках КРС и способности! к развитие пасло трансплантации ядер.

6. Предложен метод суб ^тонирования ES-клеток КРС для поддержания эуплэидного кариотипа в системе культивирования 1п vltrc.

' crmCGK РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Миталипов Ш. М., Миталипова М. М., Федоров Л.Ы. Изучение плю-рипотентных свойств эмбриональных стволовых клеток мыши In vitro и in vivo. // Тез. докл. 5-ой конференции по генетике соматических клеток в культуре. 22-24 ноября 1993 г. Черноголовка. С.42.

2. Неверова М.Е., Петрова Т.В., Мамаева Т.В.. Миталипов Ш.М., Миталипова К. М.. Иванов В. И. Калинин В. Н. Разработка модельной системы генотерапии на основе синтетического "гена" биологически активного пептида брадикинина. // Тез. докл. 4-ой научной конференции "Геном человека-94\ 9-11 марта 1994 г. Черноголовка. С. 64.

3. Миталипов Ш. И., Миталипова М. V , Иванов В.И. Влияние длительности культивирования на шюрипотентйость эмбриональных стволовых (ES) клеток мыши In vitro и In vivo. // Онтогенез. 1994. Т. 25. N6. С. 19-27.

4. Миталипов Ш.!.!., Миталипова М.М. Влияние генотипа бластоцис-ты-реципиента на частоту формирования химер с ES клетками мыши. // Тез.докл. 1-го съезда ВОГИС. 20-25 декабря 1994 г. Саратов. С. 101.

5. Streichend П., Mltalipova М.. Stice S. Further characterization of bovine pluripotent stem cells. // Theriogenology. 19Э5. Vol.43. NO. 1. P.327.

Подписано к печати 27,04.1995 г. Заказ 852

Тираж 75 экг. Объем 0,9 уч.-изз. л.

ПМП ВИЖа