Выделение и характеристика примордиальных половых зародышевых клеток свиньи

Приданцева, Татьяна Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Выделение и характеристика примордиальных половых зародышевых клеток свиньи
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Выделение и характеристика примордиальных половых зародышевых клеток свиньи"

-й-ъш/

На правах рукописи

ИРНДАНЦЕВА ТАТЬЯНА АЛЕКСАНДРОВНА

ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ПРИМОРДИАЛЬНЫХ ПОЛОВЫХ ЗАРОДЫШЕВЫХ КЛЕТОК СВИНЬИ

03.00.23. - БИОТЕХНОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических пате

ДуСротшы, 2001

Работа выполнена в лаборатории клеточной инженерии отдела б потех пологи и Всероссийского пхуларствс иного научно-исследовательского института

ж и еотноводства

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ - доктор биологических наук

И.П, Савченкова

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор биологических наук,

профессор Л.1Т, Дьяконов; доктор биологических наук H.A. Попов

Ведущее учреждение - Всероссийский научно-нсследояатсльскнй

институт свиноводства

Защита диссертации состоится « ^ я ^^^^^ 2001 года и 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.013.01. во Всероссийском государственном науч!Iонес.педов ател ьеком институту ¡«^ - 1

1 1 : 1 ! Ад рос и н ст нт у та: 1421 з Москб^ч-:;. ч ■■■ - ""^очьский р-н,

п. Дуброва » » ; М

С диссертацией можно ознакомит 1.ея jlo и б л и от-Автореферат разослан <■: £ ъ /CüXxPiL^

Ученый секретарь диссертационного Совета, кандилат биологических у

_, .il- Губанова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Интенсивное развитие биологии и сельскохозяйственной биотехнологии за последние годы явилось результатом разработки новых подходов получения животных со стабильной интеграцией и экспрессией рскомбинантной ДНК в геноме [Brem G. et al., 1995; Эрнст Л.К., 1998]. Перенос генов в геном животных возможен на различных стадиях эмбрионального и постнаталыюго роста организма. В связи с этим особую актуальность для создания трансгенных животных в мировой практике приобрели методы клеточной инженерии, позволяющие получать культуры стволовых клеток, которые обладают уникальной характеристикой, — тотипотеитностью. Такие клетки имеют неограниченные потенции к дифференцировкс и способны реализовать генетическую информацию ядер вплоть до развития целого организма. Данное свойство характерно для иримордиапьиых или первичных половых клеток зародышей млекопитающих (ППЗК), которые являются предшественниками высоко дифференцированных половых клеток (гамет),

В настоящее время во многих ведущих научно-исследовательских институтах различных стран мнра (Великобритания, Германия, Италия, Канада, США, Южная Корея, Япония) изучается множество аспектов проблемы, связанной с исследованием ППЗК млекопитающих in vitro и in vivo [De Felici M. et al., 1995; Holtz W., 1999; Kato Y., 1999 и др.]. Выделение ПГ13К из зачатков гонад зародышей с целью получения из них культур стволовых зародышевых (слеток представляет собой одно из перспективных направлений клеточной биологии, поскольку позволяет создать удобные экспериментальные модели для изучения механизмов таметогенеза и цитодифференцировки в развитии млекопитающих [McLaren А., 1994; WakaharaM., 1996; Buehr М„ 1997, Савинкова И.П., 1999]. Достижения клеточной инженерии показали, что особую ценность приобретает использование ППЗК в качестве неиссякаемого источника тотипотентпых ядер при создании новых клеточных типов в процессе клонирования [Shim Н. et al, 1997; Strelchcnko N.S., 1997; Shamblott M. J. et al., 1998].

Стволовые зародышевые клетки млекопитающих также могут использоваться как вектор для переноса рекомбикантных ДНК в организм животных. Генетически трансформированные в культуре эти клетки остаются способными передавать свои изменения, будучи введенными в гонады химерных плодов, и поэтому являются удобным материалом для проведения геномных манипуляций у млекопитающих [Piedrahita J.-A. et al., 1998]. Преимущество ППЗК перед клетками, выделенными из эмбриобласта зародышей (ЭСК - эмбриональные стволовые клетки), состоит в том, что они представляют собой единственные клетки, у которых стерты родительские отпечатки (геномный имприитинг) [Савченкова И.П.", 1999].

Таким образом, изучение ППЗК млекопитающих на сегодняшний день является важным и многообещающим направлением биотехиологии, так как позволяет использовать их в качестве альтернативного инструмента для решения научных и практических задач-кдегояной. и генетической инженерии, на которых базируется биотехнологиитакже'биолоНгя развития животных.

| МССГ. счj.' ; ; ;

Кроме того, необходимо подчеркнуть, что редкость проведения экспериментов по исследованию ПЩК млекопитающих (мышь, крыса, человек) в нашей стране (Семенова-Тянь-Шанская А. Г., 1969-1978; Дыбан А. П., 198S; Пиня-ев В.И., 1989) определяет несомненную актуальность настоящей работы.

Цель и задачи исследований. Цель работы заключалась в выделении ППЗК из зародышей свиньи к их характеристике. Для реализации указанной цели необходимым условием явилось решение следующих задач:

• разработать на лабораторных животных (мышь) методические приемы, позволяющие изолировать ППЗК из зачатков гонад зародышей свиньи;

• выделить ППЗК свиньи;

• изучить факторы, влияющие на выделение ППЗК свиньи;

• подобрать оптимальные условия, влияющие на получение культуры ППЗК;

• охарактеризовать ППЗК свиньи в культуре.

Научная новизна. Впервые разработан простой, недорогой и эффективный метод выделения ППЗК из дорсального мезентерия и зачатков гонад плодов мыши и свиньи и их очистки от других клеточных типов, основанной на разных адгезивных способностях клеток. Обнаружено, что первичные половые клетки млекопитающих (мышь и свинья) характеризуются низкой адгезивной способ-костью.

Предпринята попытка подобрать оптимальные условия для культивирования ППЗК свиньи. Получены колонии стволовых зародышевых клеток из ППЗК. Охарактеризованы морфологические, биохимические и ростовые особенности данных клеток in vitro.

Впервые показано влияние пола и возраста плода на выделение ГГПЗК свиньи и получение из них колоний стволовых зародышевых клеток с фенотипом ЭСК.

Изучена роль и проведен сравнительный анализ использования различных монослоев соматических клеток для культивирования ППЗК свиньи и получения колоний стволовых зародышевых клеток с морфологией, подобной ЭСК.

Практическая ценность работы. Экспериментальные данные по получению чистой популяции ППЗК свиньи могут представлять интерес для решения практических задач клеточной инженерии в современных условиях, что обусловлено низкой стоимостью разработанного методического подхода в сочетании с высокой эффективностью.

Показано, что использование, в качестве подложки, монослоев соматических клеток способствует увеличению продолжительности жизни ППЗК свиньи in vitro.

Полученные данные о влиянии таких факторов, как возраст и пол плода, на выделение ППЗК свиньи и получение колоний стволовых зародышевых клеток, позволяют более эффективно использовать данные клетки в прикладном аспекте, в качестве доноров при трансплантации ядер и получении животных с выдающимися хозяйственно-полезными признакам и.

Основные положения, выносимые на защиту:

- метод выделения и очистки приморднальиых половых клеток мыши и свиньи;

- влияние возраста и пола плодов свиньи на выделение ППЗК и получение колоний стволовых половых клеток;

- влияние монослоев фидерных клеток на поддержание ППЗК свиньи в культуре и получение колоний стволовых половых клеток;

- характеристика ППЗК свиньи и колоний стволовых зародышевых клеток.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены: на

научно-практической конференции по проблеме «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения», РАМЖ, п.Быково, июнь 2000г.; на 49-ой научно-методической конференции «Достижения молодых ученых в области животноводства», В1ШИЖ, пДубровицы, июль 2000г.; на научной конференции, посвященной 60-летию ВНИИ генетики и разведения сельскохозяйственных животных, «Селекционно-генетические методы повышения продуктов кости сельскохозяйственных животных», ВНИИРПЖ, г.Санкт-Петербург, октябрь 2000г,; на П-ОЙ Международной научной конференции «БнотехЕЮлогия в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», ВНИ-ИСХБ, г.Москва, октябрь 2000г; на VI[-ом Международном конгрессе андроло-гов «Лид рол огня в ХХ1-ом веке», г.Монреаль, Канада, июнь 2001г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ.

Структура н объем работы. Диссертация изложена на 110 стр., содержит 12 табл., 24 рис. (в т.ч. 14 фотографий, 3 диаграммы), состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты, обсуждение, выводы, список литературы. Список литературы включает 155 библиографических источников, в т.ч. 83 на иностранном языке.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена по плану научно-исследовательских работ в лаборатории клеточной инженерии отдела биотехнологии ВНИИ животноводства. На рисунках 1 и 2 представлены комплексные схемы проведения экспериментов.

В качестве модели для разработки новых и оптимизации существующих методов выделения ППЗК из гонад зародышей млекопитающих были использованы лабораторные животные - мышк линий Balb/c и С57В1-В6 на 10,5 и 11,5 сутки после коитуса.

ППЗК выделяли из плодов свиней на 23, 26, 31 и 33-и сутки супоросности. Плоды были получены от естественно осемененных помесных свиноматок (крупная белая х лацдрас).

Жизнеспособность клеток в суспензии, полученной при выделении ППЗК из зачатков гонад зародышей мыши, определяли с помощью витального красителя - 0,5%-иого водного раствора трипанового синего. Процент жизнеспособности клеток в суспензии определяли по стандартной формуле [Дьяконов Л.П., 20001.

Идентификацию ППЗК мыши и свиньи in vitro осуществляли на основании морфологических и биохимических особенностей гоноцитов. Морфологическую оценку проводили визуально с использованием таких критериев, как размер и форма клеток, ядерно-нитоплаэматичсское соотношение, вакуолизация и наличие псевдоподий. В качестве подтверждения природы происхождения клеток применяли цитохимический тест на специфическую активность эндогенной

щелочной фосфатазы (ЩФ, биохимический маркер). Окрашивание производили с помощью набора реактивов фирмы «Sigma» (США). Для этого предметные стекла предварительно покрывали поли-Д-лизшюм (Serva, Germany; 0,1% раствор). Перед фиксацией суспензию клеток слегка подсушивали, поскольку ППЗК имеют тенденцию открепляться даже от стекол, покрытых поли-Д-л из ином. Клетки фиксировали в растворе цитрат-ацетон-формальдегада и затем инкубировали в свежеприготовленном растворе красителя (прочный синий ВВ и субстрат AS-B1 фосфат) по рекомендации фирмы «Sigma».

В экспериментах использовали стандартные питательные среды и растворы отечественного и зарубежного производства.

Культивирование ППЗК мыши проводили в жидкой среде DMEM (ЛанЭт, Россия) с высоким содержанием глюкозы (4,5 г/л). Перед использованием в среду добавляли 10% сыворотки плода крупного рогатого скота (ФСК), альфа-глутамин (2 шМ), 2-меркаптоэтанол (10^ mM) (Serva), гентамицин (конечная концентрация 50 мкг/мл) (ПапЭко). Ростовой средой для культивирования ППЗК свиньи также служила среда DMEM со всеми указанными выше добавками, но с содержанием 15% ФСК.

Культивирование клеток проводили в инкубаторе, обеспечивающим 95%-ную относительную влажность воздуха, температуру +37°С н содержание 5% COi в воздухе (Sanyo, Япония).

Длительное храпение ППЗК осуществляли при -70°С в рефрижераторе Ultra low (Sanyo) и при -196°С в сосудах Дьюара с жидким азотом (Франция). В качестве компонентов криозащитной среды были использованы: 50% среды DMEM, 40% ФСК и 10% криопротектора (DMSO или глицерина).

ППЗК культивировали на монослоях митотически блокированных фидерных клеток, в качестве которых использовали перевиваемые эмбриональные фибробласты мыши линии STO и первичные клетки Сертолк свиней. Данные клетки были взяты из коллекции клеточных, культур лаборатории клеточной инженерии ВИЖа. Первичные клетки Сертоли свиней были получены ранее Савченковой И.П. и заморожены. Митотическую активность клеток подавляли, обрабатывая их раствором митомицина С фирмы «Sigma» (конечная концентрация 10 мкг/мл). Пересев клеток, определение их концентрации и жизнеспособности, а также криоконсервирование н хранение проводили по стандартным методикам [Адаме Р., 1983; Дьяконов Л.П., 2000].

Оценку колоний предполагаемых стволовых зародышевых клеток, полученных при культивировании ППЗК на фидерных слоях, осуществляли визуально по морфологии в динамике культивирования. Критерия оценки колоний с ЭСК-подобной морфологией базировались на опыте работы с ЭСК [Савченкова И.П.. 1999]. Для подсчета общего количества колоний и колоний стволовых зародышевых клеток с фенотипом ЭСК, часть колоний в чашках Петри фиксировали холодным метанолом (-20°С) и окрашивали по методу Романовского-Гнмза.

При клонировании колоний клеток с ЭСК-подобным фенотипом использовали удлиненную пипетку Пастера, удерживаемую ртом.

Результаты экспериментов документированы фото!рафиями.

Рис. 1. Схема эксперимента по выделению и очистке ПШК мыши

? X

истин. !-1л^ив1жи1№и.аж1

Убой беременных самок и получение зародышей

щефроса I

Изолирование половых валиков и дорсального мезонефроса

шшшжяншпн

Выделение ППЗК

Очистка ПГВК от соматических клеток

Помор- | Поактивно-фологиче- I ста щелоч-ским оси- в ной фосфа-бснностям 3 тазы

Получение чистов популяции

ппзк

II II шгг |1ГЛ " Г7

ЫЗШг

Рис. 2. Схема эксперимента по выделению и культивированию ППЗК

Получение колоний стволовых зародышевых клеток

Характеристик а

Клонирование стволовых зародышевых клеток ва фидерных слоях

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Выделение при морд нал ьных половых клеток ш плодов мышей и их очистка.

3.1.1. Сравнительный анализ эффективности механического и ферментативного способов обработки зачатков гонад плодов мышей.

Выбор лабораторного животного был обусловлен тем, что мышь является удобным модельным животным для изучения закономерностей развития на ранних стадиях эмбриогенеза с хорошо отработанными условиями спаривания и коротким периодом беременности (19-22 суток). Временной ход эмбриогенеза у мыши хорошо документирован; первая фаза развития - до окончания гаст-руляции — занимает около 7 суток (с момента оплодотворения), период органогенеза, когда формируются все важнейшие органы, длится с 7-х по 14-ые сутки развития. В этот период происходит формирование зачатков гонад и колонизация их гоноцитами (10,5-13,5 сутки развития). В связи е этим использованные нами в эксперименте 10,5 и 11,5-суточиые стадии развития мыши, при которых наиболее высок пул постмигрирующих гоноцитов в половых гребнях, являются наиболее оптимальными для выделения ППЗК.

Сравнивали два метода выделения клеток из тканей и органов млекопитающих: механический и ферментативный. Для этого мышей спаривали естественным путем и умерщвляли на 10,5-11,5 сутки беременности путем дислокации шейных позвонков. Протирали кожу живота 70° этанолом, хирургические инструменты перед использованием также обрабатывали спиртом и обжигали. Проводили лапаротомию брюшной полости по белой линии и переносили матку в стерильный стаканчик, содержащий физиологический раствор с антибиотиками. Вскрывали маточные стенки, плоды изолировали из матки, освобождали от плодных оболочек и переносили в физиологический раствор, дополненный антибиотиками. В стерильных условиях удаляли голову, хвост, конечности, все центрально расположенные красные ткани (печень, сердде, почки, селезенку и др.) и под аналитической лупой (10-60х) проводили идентификацию развивающихся гонад. Зачатки гонад и дорсальный мезентерий переносили в пластиковые чашки Петри с раствором ФСБ (физиологический раствор, ззбу-ференный фосфатами) без ионов Са и М02+. В данном буфере материал промывали 3 раза и тщательно измельчали с помощью тонких хирургических инструментов. Полученную смесь последовательно разбивали с помощью белых, синих и желтых наконечников, соответственно.

Ферментативную обработку тканей осуществляли после удаления ФСБ, путем добавления раствора коллагеназы в ЬМЕМ (конечная концентрация 1 мг/мл) н инкубировали в течение 5 минут при +37°С. Клетки осаждали ннзко-скоростным центрифугированием (100 & 5минуг) в ОМЕМ без сыворотки, сливали супернатант, а к осадку добавляли раствор трипсина (0,25%). Клетки энергично пипетнровали и продолжали инкубировать 7-10 минут при +37°С, помешивая. После нейтрализации трипсина средой с сывороткой, клетки снова осаждали и образовавшийся осадок пипетнровали в ростовой среде.

Полученные суспензии клеток сравнивали под микроскопом визуально. В качестве оценки популяции клеток были взяты следующие критерии: ксшичест-

во клеток в суспензии, количество отдельных клеток, количество клеток, объединенных в группы, количество живых и мертвых клеток (табл. 1),

Таблица 1

Сравнительный анализ эффективности изоляции клеток посредством механической и ферментативной обработки зачатков гонад ¡0,3- суточного

зарод ышамыши

Показатели Механическая диссоциация Ферментативная обработка

Общее количество клеток в суспензии (в 5 мл) 5600 5860

Из них: количество отдельных клеток 3864 5860

Количество групп из 5 клеток 280 (1400 клеток, 25%) 0

Количество групп из 10 клеток 34 (340 клеток, 6%) 0

Количество мертвых клеток 56(1%) 527 (9%)

Количество живых клеток 5544 (99%) 5333 (91%)

* Примечание: данные представлены по результатам 3-х повторов.

Согласно результатам, представленным в таблице 1, при ферментативной обработке зачатков гонад 10,5-суточното зародыша мыши было получено в 1,5 раза большее, по сравнению с механической обработкой, количество отдельных (соматических и половых) клеток в суспензии. При этом мы не наблюдали наличия клеточных агрегатов, все клетки были разобщены, что позволило нам вести поиск и идентификацию ППЗК по морфологии.

Однако следует отметить, что, несмотря на высокий процент выхода живых клеток при ферментативном методе обработки зачатков гонад, он был незначительно (на 9%) ниже, чем при механической диссоциации тканей, что мы связываем с токсическим влиянием ферментов (коллагеназы и трипсина) на клетки.

Таким образом, исходя из несомненного преимущества ферментативной дезагрет-ации тканей, которая способствовала получению суспензии, представленной на 100% разобщенными клетками, в дальнейшем мы взяли ее за основу при выделении ППЗК из зачатков гонад плодов свиньи.

3.1.2. Разработка метода очистки ППЗК мышей от других клеточных типов.

Анализ предварительных данных показал, что при выделении клеток, особенно когда использовались не только зачатки гонад, но и дорсальный мезентерий, любым из выше изученных методов полученная клеточная популяция была неоднородна. В суспензии были обнаружены другие клеточные типы.

Б связи с этим несомненный интерес, в качестве альтернативного подхода, для нас представлял метод разделения клеток по адгезивностн, который позволяет получить максимально чистую популяцию ППЗК мыши. Данный метод применяется для изоляции макрофагов н дендритных клеток. Однако его ис-

пользование часто ограничено, из-за сложности сделать какие-либо обобщения относительно межклеточных различий в адгезивности. Опыт работы с ЭСК [Савченкова И.П., 1999] позволил нам сделать такие обобщения и распределить клетки в порядке возрастания адгезивности: примордиальные половые зародышевые клетки, эмбриональные стволовые клетки, другие эмбриональные клеточные типы (в том числе фибробласты).

Полученную смесь клеток разливали в чашки Петри (¿=10 см) и ставили в инкубатор для культивирования при +37°С в увлажненной атмосфере в присутствии 5% С02 на протяжение 2-х часов. Затем чашки доставали из инкубатора н не прикрепившиеся клетки, представленные П113К, осторожно переносили в новые предварительно желатинизированные чашки Петри для дальнейшего культивирования.

Из каждого экспериментального образца (смесь клеток до разделения; клетки, оставшиеся в чашке после 2-х часов культивирования; очищенные клетки) готовили препараты для окраски на 1ЦФ. Анализ результатов проводили после нескольких повторов наоснове подсчета 1000 клеток в каждом образце. Всего было осуществлено 7 серий эксперимента, в 3-х из которых ППЗК выделяли из 24 зародышей в возрасте 10,5 суток, в 4-х опытах использовали 31 плод в возрасте 11,5 суток.

В результате проведенных исследований были выделены популяции ПГОК мыши в следующем количестве: 748 клеток в среднем на 10,5-суточныЙ зародыш (использовано 24 зародыша), 1527 клеток на 11,5-сугочный плод (суммарное количество плодов-31). Популяции клеток, полученных из плодов до разделения, состояли из 10 и 30% клеток, позитивных по ЩФ, для 10,5 и Посуточных плодов, соответственно.

Как видно нз результатов, представленных в таблице 2, популяция изолированных клеток после разделения их по адгезивным способностям достигала 82 и 85,8% для ППЗК, соответственно у 10,5 и 11,5-суточных плодов

Таблица 2

Очистка мышиных ППЗК с помощью дифференциальной адгезии к поверхности

Возраст плода Количество Количество выделен- Чистота клеточной по-

(сутки) плодов ных ППЗК на 1 плод пуляции ППЗК(%)

8 930 83

10,5 6 840 87

10 475 76

7 1700 86

9 2100 90

11,5

9 1340 71

6 970 96

Следует отмстить, что количество гоноцнтову 11,5-суточных плодов значительно возрастало (более чем в 2 раза) по сравнению с предшествующей стадией развития.

Полученные нами клетки имели шарообразную форму и характеризовались высоким ядерноцитоплазматическим соотношением при крупном ядре и небольшом ободке цитоплазмы, средний диаметр клеток достигал приблизительно 13 мкм. Кроме того, было отмечено наличие псевдоподий у данных клеток, что характерно для ППЗК, мигрирующих в зачатки гонад (10,5 сутки после оплодотворения). Интересным оказался факт, что в популяции ППЗК, выделенных на более поздней стадии развития зародыша (11,5 сутки), обнаруживалось частичное (до 70%) исчезновение псевдоподий содержащих клеток, что характерно для ППЗК, колонизировавших зачатки гонад. ППЗК мыши имели положительную реакцию при окрашивании на ЩФ.

Наши экспериментальные исследования убедительно показали, что ППЗК мыши обладают низкой адгезивной способностью по сравнению с другими клетками, и поэтому инкубация изолированных клеток в ростовой срсде в течение 2-х часов с последующим разделением позволяет сформировать популяцию клеток, на 80-85% представленную ППЗК.

Таким образом, нами был впервые предложен эффективный метод выделения ППЗК нз дорсального мезентерия и зачатков гонад плодов мыши и их очистки от других клеточных типов, основанной на разных адгезивных способностях клеток. Представляло интерес исследовать возможность использования данного метода при создании культур стволовых зародышевых клеток млекопитающих, в том числе сельскохозяйственных животных.

3.2. Изучение факторов, влияющих на выделение при морд нал ьных половых клеток из плодов свиней.

3.2.1. Изоляция ППЗК из зачатков гонад плодов свиней.

Существующие сходства в раннем эмбриональном развитии млекопитающих при небольшом разнообразии частных особенностей, несомненно, должны определять значительные совпадения в ростовых характеристиках к морфологии первичных патовых клеток мыши и сельскохозяйственных животных. Поэтому мы изначально предположили, что метод выделения и очистки ППЗК мыши может быть перенесен на опыты по получению клеточной популяции ППЗК свиньи.

ППЗК выделяли поэтапно из плодов, взятых от свиноматок, которых забивали в различные сроки супоросности: на 23-и сутки беременности (14 плодов), на 26-е сутки беременности (16 плодов), на 31-е сутки беременности (15 плодов), на 33-и сутки беременности (6 плодов). Так как плоды свиней имели достаточно крупный размер (1,4 - 1,8 см; рис. 3), то представляло трудность провести идентификацию развивающихся гонад с использованием аналитической лупы.

Рис. 3. Плод свиньи в возрасте $3-х суток развития. Нас интересовала конкретно каудальная части, плодов, где происходит формирование половых желез. В связи с этим плоды каждой стадии развития подвергали частичной дефрагментацин (отссченне головы, шеи, конечностей, кончика хвоста, всех расположенных центрально красных тканей). Оставшуюся от плодов каудальную часть туловища в свою очередь подвергали ферментно-механичсской обработке, описанной выше, что позволило нам выделить популяции разобщенных клеток, среди которых легко идентифицировались ППЗК свиньи, имеющие морфологическое сходство с мышиными ППЗК. Популяции клеток, полученные из плодов до разделения, состояли на 12,15,20 и 34% клеток, позитивных по ЩФ, для 23,26,31 и 33-х суточных плодов, соответственно.

После этапа разделения клеток популяции очищенных ППЗК переносили на монослои инактнвированных митомицином С фидерных клеток для дальнейшего культивирования и в чашки Петри, предварительно покрытые желатином, без фидера. В результате серии экспериментов были получены популяции клеток, принятые нами за ППЗК (табл. 3),

Как видно из данных, представленных в таблице 3, популяция изолированных клеток после разделения их по адгезивным способностям достигала 30, 38, 63 и 77% для ППЗК, соответственно у 23, 26, 31 и 33-х суточных плодов. Было установлено, что яримордиальные половые клетки свиней, как и ППЗК мышей, обладают низкой адгезивной способностью. Поэтому метод разделения гоноцнтов от примеси соматических клеток позволил сформировать популяцию клеток, в среднем на 52% представленную ППЗК свиньи.

Таким образом, суммарные сведения серии экспериментов дают основание считать, что метод выделения и очистки ППЗК мышей позволяет изолировать ППЗК из зачатков гонад плодов свиньи и получить совокупность клеток, имеющих одинаковое происхождение.

Таблица 3

Очистка свиных ППЗК с помощью дифференциальной адгезии к поверхности

Возраст плода (сутки) Количество плодов Общее количество выделенных клеток на 1 плод Количество ППЗК на 1 плод Чистота клеточной популяции ППЗК (%)

23 14 2475000 737428 30

26 16 3359362 1269524 38

31 15 5792876 3674279 63

33 6 5918444 4537000 77

3.2.2. Влияние возраста плодов свиньи на выделение ППЗК.

Наряду с влиянием пола плодов свиньи на выделение ППЗК из зачатков гонад, одна из основных проблем, с которой сталкиваются исследователи при получении этих клеток, заключается в оптималыюм подборе возраста зародыша. Использование зародышей на ранних стадиях беременности позволяет легко идентифицировать ППЗК по морфологии, но популяция клеток при этом очень мала. Зачатки гонад, полученные из плодов на более поздних стациях развития, содержат большое количество ППЗК. Однако их сложно выделить из-за частичной потери морфологических признаков, характеризующих гоношты, что, очевидно, соответствует процессам дифференцировки клеток в организме животных.

Как видно из таблицы 3, в результате анализа полученных данных было установлено, что с увеличением возраста плода возрастает количество гоноци-тов. Так, если сравнить количество ППЗК, выделенных из зачатков гонад одного плода 23-х и 33-х суточного возраста, то необходимо отметить, что за интервал времени, равный 10 суткам, количество гопоцитов у плода свиньи возрастает почти в 6 раз.

3.2.3, Влияние пола плодов свиньи на получение ППЗК.

Для определения пола зачатков гонад проводили их визуальную оценку с использованием ручной лупы (Юх), часть ткани зачатков отсекали и осуществляли их идентификацию под микроскопом.

Установлено, что на ранних стадиях развития плодов (23, 2б-е сутки) у свиней определить пол по зачаткам гонад невозможно, т.к. они не имеют каких-либо отличительных морфологических особенностей и представляют собой компактные одинаковые органы, имеющие однородную структуру. Необходимо отметить, что исследованные нами ранее зародыши мыши также находились в том возрасте (10,5 и 11,5 сутки), когда зачатки гонад еще не могут быть идентифицированы ки как мужские, ни как женские, т.к. соматическая дифференцн-ровка гонад начинается только на 12-е сутки развития зародыша.

Известно, что у 31-сугочпых плодов возможна частичная дифференци-ровка половых желез, но мы не смогли идентифицировать ее визуально. У плодов в возрасте 33-х суток развития мы наблюдали диффсрелцнровку соматических элементов гонад, что дало нам возможность различить их пол. Мужские зачатки гонад характеризовались наличием бороздок, в то время как зачатки гонад женского пола выглядели гомогенными и имели слегка пятнистую (крапчатую) структуру ткани. Кроме того, у мужских гонад оболочка была плотной, у женских гонад - более прозрачной, тонкой.

Результаты проведенного нами сравнительного анализа влияния пола плодов свиньи местной породы на получение ППЗК показали, что гоноциты можно выделить только из зачатков гонад плодов, у которых еще невозможно определить пол по морфологии (индифферентная стадия развития). Поэтому использованные нами в эксперименте плоды в возрасте 23,26 и 31-х суток развития являются наиболее оптимальными для выделения ППЗК из зачатков гонад, так как позволяют получить популяции этих клеток, недифференцированных по полу (табл. 4).

Клетки, выделенные из 33-суточных плодов женского пола, в отличие от мужских плод")р. не пролиферировали в культуре и сохраняли жизнеспособность не более ¿4-х часов. Только ППЗК, полученные из мужских гонад, давали начало колониям предполагаемых стволовых зародышевых клеток с ЭСК-подобным фенотипом. Очевидно, объяснение данного факта, связано с различиями между сперматогенезом и оогенезом у млекопитающих. Известно, что у особей женского пола первое деление мейоза начинается еще у зародыша, в то время как сперматогенез начинается только по достижении половой зрелости. Оказавшись в половом гребне мужских зародышей, первичные половые клетки млеко-.íктающих включаются в состав половых тяжей зачатков гонад, где они остаются до созревания. В соответствии с последними анатомическими и экспериментальными данными считают, что зародышевая ге/е-система секретиру-ет диффундирующий фактор, который действует как триггер мейоза. Предполагается, что rete testis (сеть семенника), как и rele ovarii (сеть яичника) ранних гонад выделяют мейоз-активирующий фактор, но ранняя изоляция мужских половых клеток в семенных тяжах предохраняет нх от действия этого фактора и, следовательно, препятствует возникновению мейотических делений. Однако у зародышей женского пола этот фактор стимулирует профазу первого деления мейоза и начало дифференцировки ППЗК в зрелые гаметы.

Таблица 4

Сравнительный анализ влияния пола плодов мыши и свиньи разных сроков развития на выделение ППЗК

Вид животного Мышь Свинья

Средняя продолжительность беременности (сутки) 21 115

Возраст плода (сутки) 10,5 11,5 12 23 26 31 33

Отношение возраста плода к средней продолжительности беременности (%) 50 54,8 59,5 20 22,6 26,9 28,6

Возможность тестирования пола плода по морфологии зачатков гонад - - + - - - +

Получение ППЗК + + только из мужских гонад + + + только из мужских гонад

33. Характеристика спеженчолированных ППЗК свиньи.

Существенным моментом, который необходимо учитывать при анализе полученной популяции ППЗК, является идентификация этих клеток. Основными критериями, на которых базировался отбор предполагаемых ППЗК, были их морфологические особенности и наличие фермента ЩФ. Следует отметить, что внешний вид свежеизолированных гоноцитов саиней был похож на таковой у мышей (табл. 5; рис. 4 и рис. 5).

Для ППЗК свиней также были характерны шарообразная форма и наличие крупного ядра, окруженного узким ободком цитоплазмы, имеющей гомогенную структуру. Размер клеток достигал в среднем приблизительно 13 мкм в диаметре. Кроме того, мы наблюдали наличие псевдоподий у ППЗК, мигрирующих в зачатки гонад (выделенные из 10,5 и 23-суточных зародышей мыши и свиньи, соответственно). Гоноциты показывали положительную реакцию на эндогенную ЩФ.

Таблица 5

Сравнительный анализ морфологических особенностей ППЗКмыши и

свиньи

Вид животного Форма клеток Наличие псевдоподий Клеточный диаметр (мкм) Расположение ядра Ядерно-цитоплазма-тическое соотношение

мышь шарообразная + 13 центральное высокое

свинья шарообразная + 13 центральное высокое

Рис. 4. Смесь клеток, выделенных из зачатков гонад 23-суточных зародышей свиньи до очистки, * Примечание-, стрелками указаны ПГОК.

Рис. 5. ППЗК свиньи, окрашенные на щелочную фосфатазу.

3.4. Оценка выживаемости ППЗК свиньи после криоконсервацин.

Анализ эффективности использования разных методов хранения ППЗК свиньи показал, что потеря жизнеспособности у клеток, находящихся в жидком азоте, существенно ниже по сравнению с таковой у клеток, хранящихся при -70°С. Мы не наблюдали каких-либо морфологических изменений ППЗК после оттаивания. Однако размороженные ППЗК выживали только в течение 24-х часов культивирования на питательных слоях (табл. 6).

Сравнительная оценка влияния криопротекгоров на жизнеспособность ППЗК, проведенная с помощью 0,5%-еюро раствора трипанового синего, показала, что БМЭО является наиболее предпочтительным защитным агентом в отличие от глицерина.

Кроме того, установлена связь между уровнем дифференцировки зародышей и степенью чувствительности ППЗК свиньи к действию низких температур. По мере продвижения дифференцировки сопротивляемость ППЗК к влиянию гипотермии снижается. Мы склонны считать, что объяснение данного факта требует комплексного подхода к изучению влияния различного рода стрессовых факторов в эмбриогенезе на молекулярном уровне.

Таблица 6

Выживаемость ППЗК свиньи после криоконсервации

Время после размораживания клеток (час) Количество жизнеспособных ППЗК после оттаивания

ПМБО глицерин

сразу после оттаивания 82 65

через 24 часа культивирования 53 38

через 48 часов культивирования 12 2

через 72 часа культивирования 0 0

3.5. Культивирование ППЗК свиньи.

3.5.1. Влияние ргаличных монослоев соматических клеток на поддержание ППЗК свиньи в культуре.

После прикрепления ППЗК, очищенных от примеси соматических клеток, к поверхности фидерных слоев ежедневно следили за ростом клеток н их морфологией и проводили смену ростовой среды каждые 2-е суток.

Показано, что использование фидерных слоев, в качестве подложки, является необходимым условием при культивировании ППЗК свиньи. Мы обнаружили, что когда ППЗК культивировались в отсутствие питательного слоя, то они сохраняли жизнеспособность только на протяжение 18-24-х часов.

Нам удалось осуществить длительное культивирование гоноцитов, что позволило получить на 6-е сутки (на клетках Сертоли) и на 8-е сутки (на клетках 5ТО) колонии предполагаемых стволовых зародышевых клеток с различной морфологией, в том числе с фенотипом, типичным для ЭСК. При этом мы не обнаружили существенной разницы между использованием данных видов соматических клеток в качестве фидера, что отражено в таблице 7. Так, при использовании клеток 8ТО было получено 90 колоний с ЭСК-подобным фенотипом, что на 15 колоний больше, по Сравнению с теми, которые были получены на фидере из клеток Сертоли.

Можно предположить, что изученные нами монослои соматических клеток продуцируют схожие субстраты и субстанции, в частности внеклеточный матрикс (ВМ), который представляет сложную упорядоченную сеть связанных между собой макромолекул (белки и полисахариды). Роль ВМ в эмбриональном развитии и механизмы, лежащие в основе регуляции клеточных ответов к ВМ, не окончательно ясны и требуют дальнейшего изучения. В настоящее время убедительно доказано, что ок играет более активную роль в регуляции поведения контактирующих с ним клеток - влияет на их развитие, миграцию, пролиферацию, форму и метаболизм.

Таблица 7

Влияние различных монослоев соматических клеток на получение колоний стволовых половых клеток с морфологией ЭСК

Показатели ЗТО-клетки Клетки Сертоли свиней

Количество плодов 28 23

Количество ППЗК (на 1 плод), посеянных на фидерный слой «182029 4036202

Общее количество колоний, полученных из ППЗК, на чашку Петри (1=6 см 216 196

Количество колоний с морфологией ЭСК 90 (42%) 75 (38%)

Известно, что ВМ является источником коллагена, фибронектина и комплексного мнтрикса. Свойства фибронектина сводятся, в частности, к тому, чтобы способствовать адгезии между клеткой и субстратом, а также разрастанию клеток. Предполагают, что биохимические компоненты, специальные комплексы и механические свойства матрикса влияют на процессы дифференци-ровки и на ответ клеток к некоторым сигнализирующим молекулам, например, факторам роста.

Кроме того, некоторые авторы [Ое Ре!1а М„ 1997] допускают возможность, что ПГОК, выделенные из мужских половых зачатков, обладают определенным сродством, т.е. устанавливают контакты с клетками Сертоли при их со-

вмести ом культивировании, благодаря взаимодействиям между рецептором ППЗК Sky и лигандом Gas 6. Это стимулирует продолжительную пролиферацию ППЗК в культуре, что согласуется с результатами пашей работы.

3,5.2. Влияние возраста плодов на получение колоний стволовых половых клеток с морфологией ЭСК.

В результате проведенной серии экспериментов было обнаружено, что ППЗК свиньи, изолированные из зачатков гонад зародышей, соответствующих более ранней стадии развития, дают начало большему количеству колоний с морфологией, характерной для ЭСК (табл. 8).

Таблица 8

Влияние возраста плодов свиньи на получение колоний стволовых половых клеток с ЭСК-подобным фенотипам

Возраст плода (сутки) Количество плодов Количество ППЗК на 1 плод Общее количество колоний на чашку Петри d =6 см Количество колоний с морфологией ЭСК

23 14 737428 148 93 (63%)

26 16 1269524 121 53 (44%)

31 15 3674279 75 11(14%)

33 6 4537000 68 8(11%)

Анализ данных, представленных в таблице 8, показал, что ППЗК, выделенные из зародышей 23-х суточного возраста, образуют почти в 2 раза большее количество колоний предполагаемых стволовых зародышевых клеток с различной морфологией, чем ППЗК, полученные из гонад 33-х суточных плодов свиньи. В то же время потенциал ППЗК ранних плодов (23 сутки развития) давать начало росту колоний клеток с ЭСК-подобным фенотипом приблизительно в 12 раз превосходит таковой по сравнению с ППЗК плодов старшего возраста (33 сутки).

Можно предположить, что этот факт связан со становлением морфологических признаков соматического пола гонад. ППЗК, выделенные из женских плодов старшего возраста, претерпевают начало первого мейотического деления и становятся неспособными давать начало колониям стволовых половых клеток, которые формируются только за счет популяции мужских ППЗК. У 31-суточных плодов возможна частичная дифференцировка половых желез, хотя мы не смогли идентифицировать ее визуально. Вероятно, на данном этапе эмбриогенеза свиньи еще можно выделить популяции ППЗК, недифференцированные по полу. 3.5.3, Влияние ростовых факторов на культивирование ППЗК свиньи.

Базируясь на анализе собственных результатов, мы пришли к заключению, что для длительного сохранения жизнеспособности ППЗК свиньи в куль-г-*ре и получения колоний стволовых зародышевых клеток важны такие параметры, как ростовая среда (применяемая при культивировании ЭСК) с высоким содержанием сыворотки плода коровы (15 %) и глюкозы (4,5 г/л), а также с до-

бавлением альфа-глутамнна (2 шМ), 2-меркаптоэтано ла (10^ шМ). Очевидно, представленные концентрации сыворотки плода коровы, глюкозы и глутамина являются предпочтительными для обеспечения ППЗК питательными веществами и удовлетворения энергетических потребностей клеточного метаболизма гоноцитов. Присутствие 2-меркатштанола необходимо для лучшей адгезии ППЗК к клеткам фидерных слоев. Антибиотик гентамицнн, содержащийся в ростовой среде в концентрации 50 мкгУмл, не является токсичным для ППЗК.

Кроме того, установлено, что культивирование ППЗК свиньи требует наличия таких инкубационных факторов, как присутствие 5% СО! в атмосфере инкубатора при 95%-ной относительной влажности воздуха и температуре +ЗГС.

3.6. Характеристика колоний предполагаемы! стволовых зародышевых клеток, полученных при культивировании ППЗК свиньи.

Нам удалось поддерживать жизнеспособность ППЗК на фидерных слоях на протяжение максимум 8-н суток. В течение этого времени клетки жили в условиях культуры и сохраняли свой недифференцированный фенотип. При этом наблюдалась явная тенденция единичных ППЗК образовывать группы и давать начало росту колоний стволовых зародышевых клеток. Так, на 3-4-е сутки культивирования мы отмечали появление маленьких колоний клеток на фидерных слоях. Колонии отличались друг от друга по морфологии. На 5-6-е сутки можно было точно идентифицировать колонии клеток с фенотипом, свойственным ЭСК.

Следует заметить, что среди полученных колоний было много колоний эпителиоподобных клеток. Часть из них имела смешанную морфологию, такие колонии мы выбраковывали и не использовали для пересева. На фоне колоний эпителиоподобных клеток выделялись колонии компактных клеток с типичным ЭСК-подобиым фенотипом; мы предположили, что именно они представляют собой стволовые зародышевые клетки (рис. 6). Размер и форма колоний незначительно варьировали, в то время как морфология клеток в колониях была одинаковой. Большинство таких колоний имело округлую или овальную форму, четко ограниченные края и состояло из мелких плотно упакованных округлых клеток с большим сферическим ядром и небольшой, почти незаметной цитоплазмой, имеющей гомогенную структуру. Различить отдельные компоненты клеток было трудно, некоторые клетки легче всего можно было увидеть у краев колоний. Данные клетки не содержали жировых вакуолей и каких-либо других включений в цитоплазме, но каждая из них характеризовалась наличием ядрышка в ядре. Размер клеток в колониях достигал от 10 до 13 мкм в диаметре. При окраске таких колоний на ЩФ была отмечена позитивная реакция.

В последующем (9-10 сутки), следя за развитием колоний, мы не выявили заметного увеличения их роста. Однако наблюдалась частичная потеря морфологических особенностей некоторых клеток в колониях, а именно конденсация и фрагментация клеток.

Рис. 6. Колония стволовых зародышевых клеток с ЭСК-подобпой морфологией, полученная на 8-е сутки культивирования ППЗК.

Анализируя причины, вызывающие торможение пролиферирующей активности стволовых зародышевых клеток и утрату их феногипа, необходимо учитывать, что среда, окружающая клетки in vivo, существенно отличается от условий их культивирования in vitro по пространственной организации, внеклеточным факторам и даже действующим на клетки механическим силам- Изменения состава среды, температуры, рН неизбежно возникают вследствие роста и жизнедеятельности самнх клеток, даже если условия роста поддерживаются постоянными. Иными словами, условия in vitro менее стабильны, чем в организме, и само это непостоянство при длительном культивировании клеток может способствовать изменениям морфологических и ростовых особенностей ППЗК млекопитающих. Что, в свою очередь, также может быть обусловлено процессами дифференцировкн клеток в организме животных.

3.7, Получение клеточной линии предполагаемых стволовых половых клеток.

С целью получения клеточной линии стволовых патовых клеток мы попытались провести клонирование колоний на фидерных слоях на 8-е сутки культивирования ППЗК, Для этого осторожно сливали с культуральных чашек кондиционированную среду с целью удаления мертвых клеток и лучшей визуализации колоний, добавляли свежую ростовую среду, и помещали чашки под объектив аналитической лупы. Под контролем зрения, используя различное освещение и увеличение лупы, часть колоний локализовали на нижней поверхности чашек. С помощью тонкого стеклянного капилляра отделяли каждую колонию от фидерных клеток. Затем, используя удлиненную пипетку Пастера, удерживаемую ртом, засасывали за один раз по 2-3 колонии и последовательно переносили по трем каплям раствора ФСБ без ионов Са2+ и Mg1+, нанесенного на поверхность чашки Петри. Давление в системе создавалось ртом. Далее собирали пипеткой частично дезагрегированные клетки, осторожно выдували их в каплю раствора трипсина и помещали чашку в термостат (+37® С) на 10 ми-it. По истечении этого времени доставали чашку и ресуспендировали клетки в .рипсине, избегая образования пузырей воздуха. Полученную суспензию пред-

полагаемых стволовых половых клеток переносили в два четырехлуиоч н ых планшета с диаметром лунки 1,5 см на свежие фидерные слои, представленные ЗТО-клетками к клетками Сертоли свиней. В каждую лунку были посеяны клетки, полученные из 2-3 колоний. Разобщенные клетки культивировали в среде ЭМЕМ со всеми указанными выше добавками. На протяжение 7-и суток следили за пролиферацией клеток и формированием клонов, проводя ежедневную смену среды.

В результате были получены клоны стволовых половых клеток на питательных слоях, представленных вТО-клетками. Так, в одной из лунок на 6-е сутки культивирования мы наблюдали образование 3-х новых колоний, которые сохраняли фенотип, характерный для ЭСК, после перенесенных манипуляций. Однако наши попытки субклонировать стволовые зародышевые клетки оказались безуспешными.

ВЫВОДЫ:

1) Впервые разработан и предложен эффективный метод очистки ППЗК, основанный на разных адгезивных способностях клеток, который показал, что инкубация клеток, выделенных из зачатков гонад и прилегающего дорсального мезентерия, в ростовой среде в течение 2-х часов с последующим разделением, позволяет сформировать популяцию клеток, на 80-85% и 52% представленную ППЗК, у мыши и свиньи, соответственно.

2) Установлено, что у свиней, в качестве источника ППЗК, могут служить зачатки гонад 23, 26 и 31-суточных плодов. У 33-суточных плодов свиньи наблюдается соматическая диффереццировка гонад, которая дает возможность получить ППЗК только из плодов мужского пола.

3) Впервые выявлено влияние возраста плода на выделение ППЗК свиньи и получение колоний стволовых зародышевых клеток с фенотипом ЭСК. Показано, что потенциал ППЗК, изолированных из ранних плодов (23 сутки), давать начало росту колоний клеток с ЭСК-подобным фенотипом, почти в 12 раз превосходит таковой у ППЗК плодов старшего возраста (33 сутки).

4) ППЗК свиньи характеризуются определенными морфологическими признаками и представляют собой небольшие (<1=13 мкм), шарообразные клетки с большим сферическим ядром и узким ободком цитоплазмы, имеющей гомогенную структуру и высокую активность щелочной фосфатазы. Показано, что ППЗК, мигрирующие в зачатки гонад, имеют псевдоподии.

5) Наличие фидерных слоев является одним из основных и необходимых факторов при культивировании ППЗК свиньи более 24-х часов и получении колоний стволовых половых клеток с ЭСК-подобным фенотипом, В качестве питательного слоя можно использовать как перевиваемые эмбриональные фиброб-ласты мыши (8ТО-клетки), так и первичные клетки Сертоли свиней.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Научным организациям, занимающимся проблемами клеточной инженерии и экспериментальной эмбриологии, рекомендуем использовать новый, нетрудоемкий, эффективный метод выделения ППЗК из зачатков гонад плодов мыши и свиньи, а также их очистки от примеси соматических клеток, основанной на дифференциальной адгезии клеток к поверхности.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Савченкова И.П., Приданцсва Т.А., Сергеев Н.И., Эрнст J1.K. Выделение примордиальных половых клеток из зародышей мышей и их очистка И Сельскохозяйственная биология. - 2000. -№2. - С. 119-122.

2. Приданцсва Т.А., Савченкова И.П., Абдрахманов И.К., Жирков Г.Ф., Эрнст JI.K. Влияние возраста плодов свиньи на выделение из них примордиальных подовых зародышевых клеток // Материалы научно-практической конференции по проблеме «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения». - РАМЖ - п. Быково, Московская область. -2000.-С. 84.

3. Приданцева ТА., Савченкова И.П., Абдрахманов И.К., Жирков Г.Ф., Эрнст Л.К. Влияние возраста плодов свиньи на выделение из них примордиальных половых зародышевых клеток и получение колоний с морфологией эмбриональных стволовых клеток // Тезисы докладов научной конференции, посвященной 60-летию ВНИИ генетики и разведения сельскохозяйственных животных, «Селекционно-генетические методы повышения продуктивности сельскохозяйственных животных». - ВНИИРГЖ - Санкт- Петербург. - 2000. - С. 64-65.

4. Приданцева ТА., Савченкова И.П., Абдрахманов И.К., Жирков Г.Ф., Эрнст Л.К. Выделение примордиальных половых зародышевых клеток из плодов свиньи // Тезисы докладов 11-ой Международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», -ВНИИСХБ - Москва. - 2000. - С. 44-46.

5. Pridantseva Т., Savchenkova I., Abdrakhmanov I. Isolation of primordial genii cells from pig fetuses // Proceedings of the VII1'1 International Congress of An-drology «Andrology in the 21rt Century». - Montreal, Quebec, Canada. - 2001. — P. 143-148. ^

Издательство РУЦ ЭГ>ТЖ 142132, Московская обл., Подольский р-н, п. Дубровины Тел (8 - 27) 65-14-24, (8 - 27) 65-14-07

Лниензня ЛР№ 021248 от 21,12,97

Сдано в набор 31.10 2001. Подписано б печать 1.11.2001 _Заказ К? 26. Печ. л. 1,1. Тираж 100 зо._

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Приданцева, Татьяна Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Возникновение половых клеток у млекопитающих

1.2. Локализация, идентификация, миграция и пролиферация

ППЗК у млекопитающих

1.3. Механизмы миграции ППЗК к зачаткам гонад

1.4. Половые клетки в индифферентной закладке гонады

1.5. Смещенные зародышевые клетки (половые клетки, развивающиеся вне гонад) ^ *

1.6. Морфологические особенности ППЗК

1.7. Гены, экспрессируемые ППЗК

1.8. Выделение ППЗК млекопитающих и культивирование in vitro

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выделение и характеристика примордиальных половых зародышевых клеток свиньи"

Быстрое развитие биологии и сельскохозяйственной биотехнологии за последние годы явилось результатом разработки новых современных подходов получения животных со стабильной интеграцией и экспрессией ре комб и пани юй ДНК в геноме (трансгенные животные). Трансгенные животные могут использоваться как модели для изучения болезней человека и животных, в генной терапии, для улучшения физиологических свойств и признаков продуктивности домашних животных (животные, обладающие информационным иммунитетом к возбудителям основных эпизоотии, общей генетической устойчивостью к различным заболеваниям и неблагоприятным факторам внешней среды, стресс - устойчивостью и т.д.), а также в качестве источников необходимых человеку фармакологических (альбумин, факторы свертывания крови, эритропоэтин, инсулин, интерферон и др.) и технических (химозин и др.) белков [8,10,19,59].

Перенос генов в геном животных возможен на различных стадиях эмбрионального и поетнатального роста организма [24,25]. Для создания трансгенных животных широкое применение нашли несколько методических приемов: ретровирусная трансфекция эмбрионов, микроинъекция ДНК в пронуклеус, использование трансгенной спермы в качестве вектора и получение эмбриональных химер с помощью эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) [13,47,54,56,66,139]. Особую актуальность в настоящее время приобрели методы клеточной инженерии, которые позволяют получать культуры стволовых клеток, обладающих уникальной характеристикой, -тотипотентностью [142,151]. Такие клетки имеют неограниченные потенции к дифференцировке и способны реализовать генетическую информацию ядер клеток, обеспечивая их дифференцировку, а также развитие до целого организма [12,49]. Данным свойством обладают ЭСК. Одним из типов ЭСК считаются примордиальные или первичные половые клетки зародышей млекопитающих (ППЗК, гоноциты), которые являются предшественниками высоко дифференцировашвдх половых клеток (гамет) [56].

Согласно принятому определению, стволовые клетки, которые дают начало двум видам специализированных клеток в пределах одного тканевого типа, называют бипотентными [7,70]. Следует заметить, что конечным итогом дифференцировки ППЗК в гонаде является наличие спермия или ооцита II-порядка с гаплоидным набором хромосом. Слившись при оплодотворении, они образуют зиготу, которая имеет диплоидный набор хромосом, и обладает неограниченными потенциями к дифференцировке. Таким образом, можно заключить, что ППЗК, как и клетки, выделенные из эмбриобласта предымплантационных зародышей, обладают тотипотентностью [56].

Половые клетки обеспечивают непрерывность поколений, т.к. они обладают способностью передавать информацию от родителя потомку, что представляет большой интерес дня биологов всего мира в течение многих лет. ППЗК интересны не только из-за их роли в наследственности и воспроизводстве, но и потому, что их собственная история развития сама по себе является уникальной и увлекательной. Поразительное принципиальное сходство в поведении первичных половых клеток, которое существует между разными видами млекопитающих при небольшом разнообразии частных особенностей, подчеркивает ценность проведения сравнительных исследований с самыми различными видами животных и дает возможность оценивать те или иные факты, касающиеся изучения ППЗК, в свете эволюционной теории [9].

В настоящее время в ведущих научно-исследовательских институтах различных стран мира изучается множество аспектов проблемы, связанной с исследованием ППЗК млекопитающих, в том числе и человека [92]. Актуальность этой проблемы отражается не только в теоретических дискуссиях, но и в постановке таких важных практических задач, как необходимость увеличения продуктивности животных, лечение бесплодия, регулирование рождаемости у людей и др. [52,53].

Выделение ППЗК из зачатков гонад млекопитающих с целью получения из них культур стволовых зародышевых клеток представляет собой одно из перспективных направлений в клеточной биологии, поскольку позволяет создать экспериментальные модели для изучения механизмов гаметогенеза у млекопитающих. Так как ШТЗК являются тотипотентными клетками, то они также могут быть использованы как удобная модель in vitro для изучения процессов цитодифференцировки в развитии млекопитающих [38].

Достижения мировой и отечественной клеточной инженерии показали, что открывается возможность массового получения генетически идентичных особей сельскохозяйственных животных с выдающимися продуктивными качествами путем клонирования. Это даст возможность на порядок увеличить темпы генетического совершенствования племенных и товарных стад, создать товарные стада, животные в которых характеризуются меньшей изменчивостью продуктивных признаков, что дает возможность при нцип и ал ьно по-новому решать сложнейшие взаимодействия организмов и механизмов, создать эффективные автоматизированные технологии производства [72]. В связи с этим, альтернативным к перспективным подходом является использование ППЗК млекопитающих в качестве неиссякаемого источника тотклотектных ядер при создании новых клеточных типов в процессе клонирования.

В конце 80-х годов целому ряду исследовательских институтов удалось выполнить клонирование животных путем пересадки ядер. При этом исходным материалом всегда служил 4-64-х клеточный эмбрион. Возможность клонирования млекопитающих путем трансплантации ядер бластомеров в энуклеированные ооциты была показана у крупного рогатого скота, овец и кроликов [41]. Следует отметить, что степень успеха при клонировании всегда оставалась довольно низкой, и, кроме того, реюгонирование (повторное клонирование эмбриона, полученного посредством пересадки ядер) представляло собой большую трудность [72]. Ядра бластомеров эмбрионов были до недавнего времени единственным источником доноров в процессе клонирования. В настоящее время ведутся успешные попытки использования ШОК в качестве доноров ядер [73].

В 1997 году в лаборатории фирмы «Американская служба разведения» (ABS, США) под руководством Bishop впервые удалось получить клонированного теленка по кличке «Ген» [143]. Исходным материалом для клонирования послужили ядра ГШЗК крупного рогатого скота, полученные из закладок женских гонад плода теленка в возрасте 30 суток. По сравнению с опубликованным ранее сообщением Яна Вильмута и Кейта Кемпбелла [148] из Иститута Рослин в Шотландии о рождении овцы Долли, полученной из клеток эпителия молочной железы уже взрослой овцы, эффективность клонирования ППЗК по всей вероятности значительно выше. В данном случае авторы сообщают о высокой эффективности нового методического подхода. Из 15-ти пересадок ядер в энуклеированные яйцеклетки крупного рогатого скота была получена одна стельность, которая закончилась благополучно.

Стволовые зародышевые клетки млекопитающих также могут использоваться как вектор для переноса рекомбинантной ДНК в организм животных. После введения ППЗК в гонады зародыша они способны принимать участие в формировании всех органов и тканей химерного организма, и поэтому являются удобным материалом для проведения геномных манипуляций у млекопитающих [123,128]. Преимущество ППЗК перед клетками, выделенными из эмбриобласта зародышей млекопитающих, состоит в том, что они представляют собой единственные клетки, у которых стерты родительские отпечатки (геномный импринтинг). Считается, что геномный импринтинг оказывает влияние на потенции ЭСК в формировании эмбриональных и внеэмбриональных структур зародышей млекопитающих [91].

Решение поставленных вопросов зависит от дальнейшего усовершенствования методов выделения и культивирования in vitro ППЗК млекопитающих и от результатов опытов, в которых при помощи различных подходов будут непосредственно исследоваться свойства ППЗК и изменения их i Д V У * V I И /bVÍ/AV V/H-J1 «1 I i Я А ГI S Vi JA<4 ij-X .

Таким образом, ППЗК млекопитающих представляют собой новый инструмент для решения задач биотехнологии, их изучение является актуальным и многообещающим для клеточной и генетической инженерии, на которых базируется сельскохозяйственная биотехнология, а также биология развития млекопитающих.

Цель и задачи исследований. В соответствии с выше изложенным, цель нашей работы заключалась в выделении ППЗК из зародышей свиньи и их характеристике. Для достижения намеченной цели необходимым условием явилось решение следующих задач!

- разработать на лабораторных животных (мышь) методические приемы, позволяющие изолировать ППЗК из зачатков гонад зародышей свиньи;

- выделить ППЗК свиньи;

- изучить факторы, влияющие на выделение ППЗК свиньи;

- подобрать оптимальные условия, влияющие на получение культуры ППЗК;

- охарактеризовать ППЗК свиньи в культуре.

Научная новизна. Впервые разработан простой, недорогой и эффективный метод выделения ППЗК из дорсального мезентерия и зачатков гонад плодов мыши и свиньи и их очистки от других клеточных типов, основанный на разных адгезивных способностях клеток. Обнаружено, что первичные половые клетки млекопитающих (мышь и свинья) характеризуются ить-лн апгронвнпп ^ПЛГЛКНПРТЬТА

I ■ I ".ÍÍVV t < I Lili V Л1 vilVVK/UllVVlUlV.

Впервые показано влияние пола и возраста плода на выделение ГН 13 К свиньи и получение из них колоний стволовых зародышевых клеток с фенотипом ЭСК.

Изучена роль и проведен сравнительный анализ использования различных монослоев соматических клеток для культивирования 11113К свиньи и получения колоний стволовых зародышевых клеток с морфологией, подобной

ОьГ-ТУ

Практическая ценность работы. Экспериментальные данные по получению чистой популяции ППЗК свиньи могут представлять практический коммерческий интерес в современных условиях, что обусловлено низкой стоимостью разработанного методического подхода в сочетании с высокой эффективностью.

Показано, что использование, в качестве подложки, монослоев соматических клеток способствует увеличению продолжительности жизни п ЮТУ л^тТЯт„

111 и!\ СПШВИ 1/1 VII/и.

Основные положения, выносимые на защиту:

- метод выделения и очистки примордмальных половых клеток мыши и свиньи;

- влияние возраста и пола плодов свиньи на выделение ППЗК и получение колоний стволовых половых клеток;

- характеристика ППЗК свиньи и колоний стволовых зародышевых клеток. лп

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены: на научно-практической конференции по проблеме «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения», РАМЖ, п.Быково, июнь 2000г.; на 49-ой научно-методической конференции «Достижения молодых ученых в области животноводства», ВНЙИЖ, п.Дубровицы, июль 2000г.; на научной конференции «Селекционно-генетические методы повышения продуктивности сельскохозяйственных животных», ВНИИРГЖ, ¡.Санкт-Петербург, октябрь 2000г.; на Л-ой Международной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», ВНИИСХБ, г.Москва, октябрь 2000г; на VII-ом Международном конгрессе андрологов, г.Монреаль, Канада, июнь 2001г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на ПО стр., содержит 12 табл., 24 рис. (в т.ч. 14 фотографий, 3 диаграммы), состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты, обсуждение, выводы, список литературы. Список литературы включает 155 библиографических источников, в т.ч. 83 на иностранном языке.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Приданцева, Татьяна Александровна

5. ВЫВОДЫ:

1) Впервые разработан и предложен эффективный метод очистки ПГОК, основанный на разных адгезивных способностях клеток, который показал, что инкубация клеток, выделенных из зачатков гонад и прилегающего дорсального мезентерия, в ростовой среде в течение 2-х часов с последующим разделением, позволяет сформировать популяцию клеток, на 80-85% и 52% представленную ППЗК, у мыши и свиньи, соответственно.

2) Установлено, что у свиней, в качестве источника ППЗК, могут служить зачатки гонад 23, 26 и 31-суточных плодов. У 33-суточных плодов свиньи наблюдается соматическая дифференцировка гонад, которая дает возможность получить ППЗК только из плодов мужского пола.

5) Наличие фидерных слоев является одним из основных и необходимых факторов при культивировании ППЗК свиньи более 24-х часов и получении колоний стволовых половых клеток с ЭСК-подобным фенотипом. В качестве питательного слоя можно использовать как перевиваемые эмбриональные фибробласты мыши (БТО-клетки), так и первичные клетки Сертоли свиней.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Приданцева, Татьяна Александровна, п. Дубровицы

1. Адаме Р. Методы культуры клеток для биохимиков. М.: Мир. -1983. - 263 с.

2. Айзенштадт Т.Б. Цитология оогенеза. М.: Наука. -1984. - 247 с.

3. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж. Молекулярная биология клетки: В 5-ти т. М.:1. Мир. -1987.

4. Александровская О.В., Радостна Т.А., Козлов Н.А. Цитология, гистология,эмбриология. М.: Агропромиздат. -1987. - 448 с.

5. Бакулина Э.Д., Баранов B.C., Белоусов Л.В. Объекты биологии развития. М.:1. Наука. 1975. -579 с.

6. Белинцев Б. Н. Самоорганизация в развитии зародыша // Природа. 1989.- №2882..-С. 81-89.

7. Белоусов Л.В. Биологический морфогенез. М.: Изд-во МГУ. -1987. -190 с.

8. Биотехнология клеток животных: В 2-х т. / Под ред. Спиера Р.Е., Гриффитса

9. Дж. Б. М.: Агропромиздат. - 1989. - С. 480-503.

10. Бочаров Ю.С. Эволюционная эмбриология позвоночных. М.: Изд-во МГУ.1988. 232 с.

11. Брем Г., Зиновьева Н.А., Эрнст Л.К. "Генные фермы"- новый путьпроизводства биологически активных протеинов трансгенными животными // Сельскохозяйственная биология. 1993. - №6. - С. 3-27.

12. Бриндак О.Н. Пренатальный морфогенез мужских половых клеток человека.

13. Автореф. дис. канд. мед. наук. М.,1979. -18 с.

14. Бродский В.Я., Урываева И.В. Клеточная полиплоидия, пролиферация идифференцировка. М. -1981. - 257 с.

15. Газарян К.Г. Микроиньекция генов в зиготы и эмбрионы // Успехисовременной генетики. 1985. - Т 13. - С. 75-88.

16. Газарян К.Г., Белоусов Л.В. Биология индивидуального развития животных.

17. М.: Высшая школа. 1983. - 287 с.

18. Гайар Ж.А. Линия половых клеток и половые эмбрионы у человека //

19. Происхождение и развитие половых клеток в онтогенезе позвоночных и некоторых беспозвоночных / Ред. Э. Вольф. М. - 1961. - С. 272-296.

20. Гапиенко Е.Ф. Развитие в органной культуре гонад 7-11-недельных плодовчеловека // Бкш. экспер. биол. и мед, 1975. - Т. 79. - №5. - С. 103-106.

21. Гапиенко Е.Ф. Развитие герминативных клеток в яичниках плодов человекаранних сроков // Арх. анатомии, гистологии и эмбриологии. 1975. - Т. 68. -№6.-С. 85-91.

22. Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. М.: Мир. - 1995.

23. Гоголевский П. А. Совершенствование биотехнологических приемовполучения трансгенных сельскохозяйственных животных. Автореф. дис. канд. биол. наук. - М., 1992. -20 с.

24. Грунц X. Роль индуцирующих факторов в раннем эмбриональном развитии //

25. Онтогенез. -1990. Т. 21. - № 3. - С. 229-241.

26. Дыбан А.П. Раннее развитие млекопитающих. Л.: Наука., Лен. отд. - 1988.228 с.

27. Дыбан А.П. Цитогенетические аспекты нормального и патологическогоэмбриогенеза млекопитающих // Проблемы генетики развития. М. - 1972. -С. 62-85.

28. Дыбан А.П., Баранов В.С. Цитогенетика развития млекопитающих. М.1978.-215 с.

29. Дыбан А.П., Городецкий С.И. Генетическая трансформация млекопитающих //

30. Молекулярные механизмы генетических процессов. М. - 1985. - С. 84-93.

31. Дыбан А.П., Городецкий С.И. Молекулярные и клеточные аспектыбиотехнологии. Л.: Наука. - 1985. - С. 84-93.

32. Животная клетка в культуре (Методы и применение в биотехнологии) / Подред. проф. Дьяконова Л.П., проф. Ситькова В.й. М.: Компания Срутник+. -2000. - 400 с.

33. Игнатьева E.JI. Критерии оценки развития женских половых клетокмлекопитающих (экспериментальное исследование) // Дис. канд. биол. наук. -NL-1986. -116 с.

34. Карлсон Б. Основы эмбриологии по Пэтгену: В 2-х т. М: Мир. -1983.

35. Клишов A.A. О взаимодействии закономерностей гистогенеза и органогенеза /

36. Функциональная морфология эмбрионального развития человека и млекопитающих: Труды IIМОЛМИ. Вып. 2. - 1984. - Т. 164. - С. 108-113.

37. Кнорре А.Г. Краткий очерк эмбриологии человека с элементамисравнительной, экспериментальной и патологической эмбриологии. Л.: Медицина, Лен. отд. -1967. - 268 с.

38. Кожухарь В.Г. Дифференцировка целомического эпителия гонад зародышейчеловека. Автореф. дис. канд. биол. наук. - Л., 1980. - 20 с.

39. Корженевская М.А. Молекулярно-генетические основы развития зародышаживотных. СП-б. - 1997. - 61 с,

40. Корочкнн Л.И. Взаимодействие генов в развитии. М. -1977. - 290 с.

41. Культура животных клеток. Методы / Конки Д., Эрба Э., Фремни Р. и др. М.:1. Мир. 1989. - С. 81-90.

42. Культура клеток и тканей животных / Дьяконов Л.П., Глухов В.Ф., Поздняков

43. A.A. и др. // Методические рекомендации. Ставрополь. - 1980.

44. Курило Л.Ф. Морфофункциональная характеристика оогенезамлекопитающих и человека. Автореф. дис. канд. биол. наук. - М., 1985. -35 с.

45. Лабораторные млекопитающие / Дыбан А.Г., Пучков В.Ф., Баранов B.C. и др.

46. Объекты биологии развития. М.: Наука. - 1975. - С. 505-523.

47. Лукина H.A. Клеточное размножение и процессы дифференциации. Л.:1. Наука, Лен отд. -1983.

48. Мак Ларен А. Детерминация пола у млекопитающих // Онтогенез. 1993. - Т.24.-№ 3. С.5-30.

49. Миталипов IH M. Сравнительный анализ плюрипотентных свойствэмбриональных стволовых клеточных линий мыши in vitro и in vivo. Дис. канд. биол. наук. - М., 1994. -114 с.

50. Миталипова М.М. Факторы, влияющие на развитие эмбриональных стволовьжклеток крупного рогатого скота и мыши в системе in vitro и in vivo. Дис. канд. биол. наук. - Дубровицы., 1995. - 127с.

51. Невзгодина М.В. Формирование половых желез в эмбриогенезе свиней //

52. Сельскохозяйственная биология. 1971. - Т. 6. - № 6. - С. 887-894.

53. Нейфах A.A., Тимофеева М.Я. Проблемы регуляции в молекулярной биологииразвития. М. -1978. - 336 с.

54. Ньют Д. Рост и развитие животных. М.: Мир. - 1973. - 88 с.

55. Пиняев В.И. Влияние низкотемпературного консервирования на первичныеполовые клетки ранних зародышей человека // Дис. канд. мед. наук. -Харьков, 1989. -117 с.

56. Пожидаев Е.А. Оогенез млекопитающих. JL: Медицина, Лен. отд. - 1967.-170с.

57. Полежаева НА. Получение, генетическая трансформация и использованиеэмбриональных стволовых клеточных линий. Автореф. дис. канд. биол. наук. - М., 1993.-25 с.

58. Происхождение и развитие половых клеток в онтогенезе позвоночных инекоторых групп беспозвоночных / Под ред. Э. Вольф. Л. -1968. - 348 с.

59. Райцина С.С. Идентификация стволовых клеток в некоторых системахклеточных дифференцировок у млекопитающих // Успехи современной биологии. 1980. - Т. 90. - № 1(4). - С. 123-137.

60. Райцина С.С. Происхождение и развитие половых клеток // Современныепроблемы сперматогенеза. М.: Наука. -1982. - С. 5-25.

61. Райцина С.С. Сперматогенез и структурные основы его регуляции. М.:1. Наука. 1985. - 207 с.

62. Репин B.C., Сухих Г.Т. Медицинская клеточная биология. М.: БЭБиМ.1998. 200 с.

63. Роит А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. М.: Мир. - 2000. - 592 с.

64. Савченкова И., Фляйшманн М., Булла Й., Брэм Г. Использованиеэмбриональных стволовых клеток (ЭСК) мыши для получения химерных животных // Цитология. 1996. - №> 38. - С 1118-1123.

65. Савченкова И.П. Создание модельных систем культур клеток млекопитающихдля решения проблем биологии и биотехнологии. Дис. д-ра. биол. наук. -Дубровицы, 1997. - 279 с.

66. Савченкова И.П. Эмбриональные стволовые клетки в биологии: настоящее ибудущее. Дубровицы. - 1999. - 95с.

67. Савченкова И.П., Сергеев Н.И. Получение плюрипотентных эмбриональныхклеточных линий из бластоцист кролика // Тезисы докладов. Новые направления биотехнологии. Пущино. - 1994. - С. 143.

68. Савченкова И.П., Сергеев Н.И., Айтбаев Н.Е. Сравнительный анализ развитияпредимплантационных эмбрионов кролика на различных монослоях соматических клеток // Цитология. 1994. - № 9/10. - С. 156-161.

69. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды. М.: Мир. - 1987. - 412 с.

70. Семенова-Тянь-Шанская А.Г. Изменение ядер гоноцитов на ранних этапах ихдифференцировки у ранних зародышей человека // Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. 1978. - Т. 74. - № 1. - С. 91-97.

71. Семенова-Тянь-Шанская А.Г. Первичные половые клетки зародышей высшихпозвоночных и человека ранних стадий развития // Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. 1971. - Т. 60. - №6. - С. 106-116.

72. Семенова-Тянь-Шанская А.Г. Первичные половые клетки зародышей человекав период миграции к зачаткам гонад // Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. 1969. - Т. 56. - №6. - С. 3-8.

73. Семенова-Тянь-Шанская А.Г. Происхождение, дифференцировка и миграциягоноцитов у ранних зародышей человека. Дис. канд. биол. наук. - Л., 1972. -146 с.

74. Семенова-Тянь-Шанская А.Г. Цитологические особенности гоноцитов в ходеих миграции у ранних эмбрионов крыс // Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. 1976. - Т. 71. - №2. - С. 52-58.

75. Семенова-Тянь-Шанская А.Г., Кнорре А.Г. Половой зачаток (гонобласт), егопроисхождение и эволюция // Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. -1972. -Т. 8, -№1. -С. 29-40.

76. Серов O.JI. Перенос генов в соматические и половые клетки. Новосибирск.1985.- 120 с.

77. Соколов П.А. Развитие половых органов у плодов свиней / Доклады ТСХА.

78. Вып. 178. -1972. С. 171-178.

79. Терци М. Генетика и животная клетка. М.: Мир. - 1977. - 291 с.

80. Фалин Л.И. Развитие половых желез и происхождение половых клеток вэмбриогенезе человека // Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. 1968. -Т. 54.-№2.-С. 3-29.

81. Чертков И.Л., Гуревич O.A. Стволовая клетка и ее микроокружение. М.:1. Медицина. -1984. 237 с.

82. Эмбриональные стволовые клетки, их генетическое изменение путемгомологичной рекомбинации и использование в получении трансгенных животных / Савченкова И.П., Зиновьева H.A., Булла Й., Брэм Г. // Успехи современной биологии. 1996. - № 116. - С. 78-92.

83. Эрнст Л.К. Животноводство XXI век / Информационный бюллетень. Новое в животноводстве. -1998. - № 1. - С. 6-7.

84. Advances in the generation of transgenic pigs via embryo-derived and primordialgerm cell-derived cells / Piedrahita J.-A., Moor K., Lee C. et al. // J. Reprod. Fértil. Suppl. -1997. V. 180. - P.245-254.

85. Baker T.G. Primordial germ cells // In reproduction in mammals. 1970. - V.l.

86. Germ cells and Fertilization Cambridge University Press, Cambridg. P. 1-13.

87. Baxter R. Alkaline phosphatase in the primordial germ cells of a 10 mm humanembiyo // Int. Anat. Cong. Oxford. 1952. - P. 17-18.

88. Black G.L., Erickson B.H. Oogenesis and ovarian development in the prenatal pig //

89. Anat. Rec. -1963. V.5. - P. 45-56.

90. Blandau R.J., White B.J., Rumery R.E. Observation on the movements of the livingprimordial germ cells in the mouse // Fértil. Steril. 1963. - V.14. - P. 482-489.

91. Buehr M. The primordial germ cells of mammals: some current perspectives // Exp.

92. Cell Res. -1997. V. 232. - P. 194-207.

93. Buehr M., McLaren A. Isolation and culture of primordial germ cells // Methods

94. Enzymol. -1993. V. 225. - P. 58-77.

95. Byskov A.G. Primordial germ cells in regulation of meiosis // Reproduction ofmammals. V. I. Germ cells and fertilization / Eds C. Austin, R. Short. Cambridge. -1982. - P. 1-17.

96. Byskov A.G. Regulation of meiosis in mammals // Ann. Biol. Anim. Biochim.

97. Biophys. 1970. - V. 19. - P. 1251-1262.

98. Cooke JE. Culture and manipulation of primordial germ cells // Methods Enzymol.- 1993. -V. 225.-P. 37-58.

99. De Felici M., Dolci S. Leukemia inhibitory factor sustains the survival of mouseprimordial germ cells cultured on TM4 feeder layers // Dev. Biol. 1991. - V. 147. -P. 281-284.

100. De Felici M., Dolci S., Pesce M. Cellular and molecular aspects of mouseprimordial germ cell migration and proliferation in culture // Int. J. Dev. Biol. -1992.-V. 36.-P. 205-213.

101. De Felici M., Dolci S., Pesce M. Proliferation of mouse primordial germ cell invitro: a key role for cAMP // Dev. Biol -1993. V. 157. - P. 277-280.

102. De Felici M., McLaren A. In vitro culture of mouse primordial germ cells // Exp.

103. Cell Res. 1983. - V. 142. - P. 417427.

104. De Felici M., McLaren A. Isolation of mouse primordial germ cells I I Exp. Cell Res.- 1982. V. 142. - P. 476-482.

105. De Felici M., Pesce M. Growth factors in mouse primordial germ cell migration andproliferation // Prog. Growth Factor Res. 1994. - V. 5. - P 135-143.

106. De Felici M., Pesce M. Immunoaffinity purification of migratory mouse primordialgerm cells // Exp. Cell Res. 1995. - V. 216. - P. 277-279.

107. De Felici M., Siracusa G. Adhesiveness of mouse primordial germ cells to follicularand Sertoli cell monolayers // J. Embiyol. exp. Morphol. 1985. - V. 87. - P. 8797.

108. Derivation of embryonic stem (ES) cell like cells from rabbit blastocyses /

109. Savchenkova I., Sergeev N., Bulla J., Brem G. / The 1995 Annual Meeting of Europen Embryo Transfer Association ( A.E.T.E.). 1995. - P. 238.

110. Derivation of pluripotent stem cells from cultured human primordial germ cells /

111. Shamblott M. J., Axelman J., Wang S., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A -1998. V. 95. -P. 13726-13731.

112. Developmental potential of mouse primordial germ cells / Kato Y., William M. Rideout HI, Hilton K. et al. // Development. 1999. - V. 126(9). - P. 1823-1832.

113. Dolci S., Pesce M., De Felici M. Combined action of stem cell factor, leukemiainhibitory factor and cAMP on in vitro proliferation of mouse primordial germ cells // Mol. Reprod. Dev. 1993. - V. 35. - P. 134-139.

114. Eddy E.M. Germ plasm and the differentiation of the germ cell line // Lutern. Rev.

115. Cytol. 1975. - V. 43. - P. 229-280.

116. Eddy E.M., Clark J.M., Gong D. Origin and migration of primordial germ cells inmammals // Gamete Res. -1981. V. 4. - P. 333-362.

117. Effects of the steel gene product on mouse primordial germ cells in culture / Godin1., Deed R, Cooke J. et al. // Nature. -1991. V. 352. - P. 807-809.

118. Evidence for substrate guidance of primordial germ cells / Wylie C., Heasman S.,

119. Swan A.P. et al. // Exp. Cell. Res. -1979. V. 121. - P. 315-324.

120. Generation of transgenic porcine chimeras using primordial germ cell-derived colonies / Piedrahita J. -A., Moor K., Oetama B. et al. // Biol, of reprod. 1998. -V. 58.-P. 1321-1329.

121. Germline regulatory element of Oct-4 specific for the totipotent cycle of embryonal cells / Young II Yeom, Fuhrmann G., Catherine E. Ovitt et al. // J. of Cell Science. 1996. - V. 122 (3). - P. 881-894.

122. Godin I., Wylie C. TGF|3i inhibits proliferation and has a chemotropic effect on mouse primordial germ cells in culture // Development 1991. - V.113. - P. 1451-1457.

123. Godin I., Wylie C., Heasman J. Genital ridges exert long-range effects on mouse primordial germ cell numbers and direction of migration in culture // Development. 1990. - V. 108. - P. 357-363.

124. Hardisty M.W. The numbers of vertebrate primordial germ cells // Biol. Rev. -1977.-V. 42.-P. 265-287.

125. Heasman J. Primordial germ cells of Xenopus embryos: The role of fibronectin in their adhesion during migration // Cell. -1981. V. 27. - P. 437-447.

126. Heasman J., Muhun T., Wylie C.C. Studies on the locomotion of primordial germ cells from Xenopus laevis in vitro // J. Embryol. exp. Morphol. 1977. - V. 42. - P. 149-161.

127. Hogg H., McLaren A. Absence of a sex vesicle in meiotic foetal germ cells is consistent with an XY chromosome constitution // J. Embryol. exp. Morphol. 1985. V. 88.-P. 327-332.

128. Holtz W., Mahabir E. Migration of primordial germ cells during embiyonic development in pigs // Reprod. Domest. Anim. 1999. - V. 34. - P. 35.

129. Interactions between primordial germ cells playa role in their migration in mouse embryos / Gomperts M., Garcia-Castro M,, Wylie C., Heasman J. // Development. 1994. - V. 120(1).-P. 135-141.

130. Isolation of pluripotent stem cells from cultured porcine primordial germ cells / Shim H., Gutierrez-Adan A., Chen L.-R. et al. // Biol, of reprod. 1997. - V. 57. -P. 1089-1095.

131. Jianchi Ding, Hahnel A.C., Keith J.B. Isolation of germ cells from rabbit fetal gonads // Theriogenology. 1995. - V. 25. - P. 196.

132. Kawase E. Tumor necrosis factor-a (TNF- a) stimulates proliferation of mouse primordial germ cells in culture // Dev. Biol. 1994. - V. 161. - P. 91-95.

133. Koshimizu U. Retinoic acid is a potent growth activator of mouse primordial germ cells in vitro // Dev. Biol. 1995. - V. 168. - P. 683-685.

134. Lavoir M. -C., Basrur P.K., Betteridge K.J. Isolation and identification of bovine fetal germ cells // Mol. Reprod. Dev. 1994. - V. 37. - P. 413-424.

135. Leichthammer F, Brem G. In vitro culture and cry ©preservation of farm animal's primordial germ cells // Theriogenology. 1990. - V. 33 (1). - P. 272.

136. Leichthammer F., Baunack E., Brem G. Behavoir of living primordial germ cells of livestock in vitro // Theriogenology. 1990. - V. 33. - P. 1221-1230.

137. Matsubara N., Takahashi Y., Nishina Y. A receptor tyrosine kinase, Sky, and its ligand Gas 6 are expressed in gonads and support primordial germ cell growth or survival in culture // Dev. Biol. -1996. V. 180. - P. 499-510.

138. McCarrey J.R., Hsu K.C., Eddy E.M. Isolation of viable mouse primordial germ cells by antibody-directed flow sorting // J. Exp. Zool. 1987. - V. 242. - P. 107111.

139. McLaren A. Development of primordial germ cells in the mouse It Andrologia.1992.-V. 24.-P. 243-247.

140. McLaren A. Germ cells and soma. A new look at an old problem. -New Haven, L. 1981.- 140 p.

141. McLaren A. Germ line and soma: interactions during early mouse development // Sem. Dev. Biol. -1994. V. 5. - P. 43-49.

142. McLaren A. Mammalian Chimaeras. Cambridge. - 1976. - 180 p.

143. McLaren A. Primordial germ cells in mice // Biblioteca Anatómica. Basel. -1983a.-V. 24.-P. 56-66.

144. McLaren A. The embiyo // Reproduction in mammals/ Eds C. Austin, R. Short. -Cambridge. 1982. - P. 1-25.

145. Migratory and postmigratory mouse primordial germ cells behave differently in culture / Donovan P. J., Stott D., Caims L.A. et al. // Cell. 1986. - V. 44. - P. 831838.

146. Mossman H. W., Duke K.L. Comparative morphology of the mammalian ovary. -Wisconsin.-1973.-300 p.

147. Ohno S, Gropp A. Embryological bases for germ cell chimerism in mammals // Cytogenetics. 1965. - V. 4. - P. 251-261.

148. Papaioaimou V.E. Ontogeny, pathology, oncology // Int. J. Dev. Biol. 1993. - V. 37. - P. 33-37.

149. Pesce M. Stem cell factor and leukemia inhibitory factor promote primordial germ cells survival by suppressing programmed cell death (apoptosis) // Development.1993.-V. 118.-P. 989-1094.

150. Pesce M., De Felici M. Purification of mouse primordial germ cells by MiniMACS magnetic separation system // Dev. Biol. -1995. V. 170. - P. 722-725.

151. Pesce M., Di Cario A., De Felici M. The c-kit receptor is involved in the adhesion of mouse primordial germ cells to somatic cells in culture // Mech. Dev. 1997. -V. 180.-P. 37-44.

152. Piedrahita J.-A., Anderson G.B., BonDurant R.H. Influence of feeder layer type on the efficiency of isolation of porcine embryo-derived cell lines // Theriogenology. 1990. -V. 34. - P. 856-877.

153. Pituitary adenylate cyclase polypeptide (PACAP) stimulates adenylate cyclase and promotes / Pesce M., Campari R., Ferri G-L. et al. // Development 1996. - V.122 (l).-P. 215-221.

154. Requirement for mast cell growth factor for primordial germ cell survival in culture / Doici S., Williams D., Ernst M.K. et al. // Nature. 1991. - V. 352. - P. 809-811.

155. Resnick J. Long-term proliferation of mouse primordial germ cells in culture // Nature. 1992. - V. 359. - P. 550-551.

156. Robertson E.J. Derivation and maintenance of embryonic stem cell cultures // Methods. Mol. Biol. -1997. V. 75. - P. 173-184.

157. Robertson E.J. Pluripotent stem cells lines as a route into the mouse germ line // Trends. Genet. 1986. - V. 2. - P. 9-13.

158. Robertson E.J. Using embryonic stem cell to introduce mutations into the mouse germ line // Biol. Reprod. -1991. V. 44. - P. 238-245.

159. Role of leukemia inhibitory factor and its receptor in mouse primordial germ cell growth / Cheng L., Gearing D. P., White L.S. et al. // Development. 1994. - V. 120.-P. 3145-3153.

160. Snow M.H.L., Monk M. Emergence and migration of mouse primordial germ cells // In: McLaren A. and Wylie C.C. Current Problems in Germ Cell Differentiation. Cambrige University Press. Cambrige. 1983. - P. 115-135.

161. Stewart CL. Stem cells from primordial germ cells can reenter the germ line // Dev. Biol. 1994. - V. 161. - P. 626-628.

162. Strelchenko N.S. Die Osnabrucker Schwaizbuntzucht. -1997. -V. 3. P. 42.

163. Talbot NC. Alkaline phosphatase staining of pig and sheep epiblast cells in culture // Mol. Reprod. Dev. -1993. V. 40. - P. 344-352.

164. Tam P., Show M. Proliferation and migration of primordial germ cells during compensatory growth in mouse embryos // J. Embryol. Exp. Morphol. 1981. - V. 64. - P. 133-147.

165. The role of interleucin-4 in the regulation of mouse primordial germ cell numbers / Matsubara N„ Takahashi Y., Nishina Y. et al. // Dev. Biol. 1996. - V. 180. - P. 14-21.

166. The role of the mesonephros in the development of mammalian ovary / Zamboni L., Upadhyay S., Bezard J. et al. // Endocrine Physiopathology of the ovary (Eds P. Torrini, G. Reeves, R. Pineda). Amsterdam. 1980. - P. 3-42.

167. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells / Wilmut I., Schnieke A.E., McWhir J. et al. // Nature. -1997. V. 385. - P. 810-813.

168. Wabik-Sliz B., McLaren A. Culture of mouse primordial germ cells isolated from fetal gonads // Exp. Cell. Res. -1984. V. 154. - P. 530-536.

169. Wakahara M. Primordial germ cell development: is the urodele pattern closer to mammals than anurans? // Int. J. Dev. Biol. 1996. - V. 40. - P. 653-659.

170. Wheeler M.B. Development and validation of swine embryonic stem cells: a review // Reprod. Fertil. Dev. -1994. V. 6. - P. 563-568.

171. Wrobel K.H., Seuss F. Identification and temporospatial distribution of bovin primordial germ cells prior to gonadal sexual differentiation // Anat. Embryol (Berl). 1998. - V. 180. - P. 451-467.

172. Wyle C.C., Stott D., Donovan P.J. Primordial germ cell migration // In: Broder L, (ed.). Developmental Biology: A Comprehensive Synthesis. V. 2. The Cellullar Basis of Morphogenesis. Plenum Press. New York. 1985. - P. 433-448.

173. Wylie C. The biology of primordial germ cells // Eur. Urol. 1993. - V. 23. - P. 62-67.

174. Wylie C., Heasman J. Miration, proliferation and potency of primordial germ cells // Sem. Dev. Biol. 1993. - V. 4. - P. 161-170.

Информация о работе

Приданцева, Татьяна Александровна
кандидата биологических наук
п. Дубровицы, 2001
ВАК 03.00.23

Диссертация

Выделение и характеристика примордиальных половых зародышевых клеток свиньи - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы