Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка и совершенствование методов трансфекции экзогенной ДНК в эмбриональные клетки кур

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка и совершенствование методов трансфекции экзогенной ДНК в эмбриональные клетки кур"

На правах рукописи №

САМОЙЛОВ Артем Владимирович

РАЗРАБОТКА И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ТРАНСФЕКЦИИ ЭКЗОГЕННОЙ ДНК В ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ КУР

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2010

4856587

Работа выполнена в лаборатории трансгенеза отдела «Биотехцентр» ГНУ Научно-исследовательский институт пушного звероводства и кролиководства имени В.А. Афанасьева РАСХН (ГНУ НИИПЗК)

Научный руководитель: доктор биологических наук,

Сураева Наталья Михайловна

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

Бессарабов Борис Филиппович; доктор биологических наук, профессор Савченкова Ирина Петровна

Ведущая организация: ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт птицеводства» РАСХН

Защита состоится «_»_2011 г. в_ч. на заседании диссертационного совета Д.220.042.01 при ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина», по адресу: 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, 23. Тел. (495) 377-93-83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина».

Автореферат разослан «_»_2010 года и размещен

на сайте http://mgavm.ru.

Ученый секретарь диссертационного совета, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Введение чужеродных генов животным, с использованием рекомбинантных конструкций, позволяет получить трансгенных особей, у которых введенные гены могут улучшать породные свойства животных, повышать устойчивость их организма к различным инфекционным заболеваниям, или получать животных-продуцентов физиологически активных продуктов, необходимых в медицине, ветеринарии, животноводстве.

Впервые использование белков в качестве фармацевтического препарата было апробировано в 20-е годы прошлого столетия на инсулине, выделенного из поджелудочной железы свиньи. Через 60 лет был получен человеческий инсулин с помощью рекомбинантных бактерий. Этот инсулин оказался качественным и был адаптирован для всех групп пациентов, страдающих диабетом.

В конце 20-го столетия в мире широко развернулись исследования по получению трансгенных животных. В 1987 Peshon J.J. et al. впервые продемонстрировал возможность получения рекомбинантных белков с молоком транс-гных млекопитающих.

К началу 21-го столетия было получено уже более 100 лекарственных белков с молоком трансгенных животных, а также получен ряд рекомбинантных протеинов из белка яйца трансгенной птицы [Zhu L., van de Lavoir M.C. et al., 2005].

В настоящее время технология получения рекомбинантных протеинов из белка яйца трансгенной птицы является наиболее перспективной в силу объективных преимуществ, таких как значительно более короткого периода получения терапевтических белков в белке яйца куриц от момента трансфекции, возможное использование невирусных плазмид, получение токсичных для млекопитающих препаратов, более приближенный к человеческому профиль глико-зилирования белков, стерильность продукта, сниженная иммуногенность, высокий выход и стабильность экзогенного белка.

Среди наиболее перспективных приемов получения трансгенной птицы в настоящее время выделяют технологии применения эмбриональных клеток и использование сперматозоидов в качестве переносчиков чужеродной ДНК,

однако исследователи сталкиваются с проблемами нестабильности встраивания генов, поэтому разработка новых и совершенствование существующих методов трансфекции экзогенной ДНК является актуальной.

Целью исследований являлась разработка и усовершенствование биотено-логических методов генетической трансформации эмбриональных клеток кур.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Усовершенствовать методы получения трансгенной химерной птицы при использовании первичных эмбриональных половых клеток.

2. Получить долгосрочные культуры эмбриональных примордиальных (ППК) и бластодермальных (ЭСК) клеток кур.

3. Усовершенствовать методы трансфекции геном гранулоцитарного ко-лониестимулирующего фактора (ГКСФ) человека сперматозоидов петуха с помощью липосом.

4. Получить трансгенных кур с встроенным геном ГКСФ человека с использованием сперматозоидов петуха в качестве переносчиков чужеродной ДНК.

5. Изучить характер экспрессии и наследования целевого гена у трансгенной птицы.

Научная новизна работы. Впервые в нашей стране получены трансгенные куры с геном ГКСФ человека, и продемонстрирована экспрессия этого гена. Определены оптимальные режимы трансфекции гена ГКСФ человека в сперматозоиды петуха (количественный состав сперматозоидов, режимы обработки семени, подбор производителей). Продемонстрировано наследование введенного гена у потомков.

Показана возможность успешного культивирования первичных половых клеток (ППК) из гонад ранних эмбрионов птицы на митотически неактивном БТО (мышиные эмбриональные фибробласты) монослое и разработан протокол длительного культивирования ППК, с целью их дальнейшего использования для трансфекции.

Впервые разработан метод получения трансгенных химерных эмбрионов птицы в результате трансплантации трансфецированных первичных ППК гонад в зародышевый диск реципиента, предварительно стерилизованного ульт-

рафиолетовым облучением.

Практическая значимость работы. Результаты исследований, полученные при изучении оптимальных приемов культивирования in vitro эмбриональных клеток птицы, могут быть использованы при разработке технологии производства рекомбинантных белков.

Разработано наставление «Способ получения генетически модифицированной сельскохозяйственной птицы при использовании сперматозоидов петуха в качестве переносчиков чужеродной ДНК», утвержденное на заседании секции «Селекция, генетика и биотехнология сельскохозяйственных животных РАСХН», протокол № 5, от 15 октября 2010 г. Предложенный способ отличается высокой эффективностью, простотой, дешевизной и быстротой исполнения.

Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены, обсуждены и одобрены на ежегодных отчетных сессиях отдела «Биотехцентр» ГНУ НИИПЗК им. Афанасьева В.А. (2007 - 2010), а также на VI симпозиуме «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний» (Москва, 2009); XV11I Международной конференции «СПИД, рак и общественное здоровье» (С.-Петербург, 2009); IX Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Н.Новгород, 2010); заседании секции «Селекция, генетика и биотехнология сельскохозяйственных животных РАСХН» (Дубро-вицы, 2010).

Личный вклад соискателя. Автор принимал непосредственное участие во всех этапах работы, в т.ч. приготовление микроинструментов для выделения и работы с первичными половыми и бластодермальными клетками птицы (изготовление стеклянных пипеток для инъекции трансфецированных клеток в эмбрион), приготовление питательных сред и рабочих растворов; выделение клеток из эмбрионов птицы, их культивирование, окрашивание и криоконсер-вация; получение семени от петухов, ее оценка, проведение трансфекции сперматозоидов и искусственного осеменения куриц; выделение ДНК из крови цыплят и тканей эмбрионов, проведение ПЦР диагностики; получение крови от птицы, приготовление сыворотки и проведение ИФА; анализ и обобщение полученных результатов исследований, написание статей, отчетов и докладов.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в т.ч. 7 - в журналах, рекомендуемых ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 102 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, сведений о практическом использовании результатов исследований, рекомендаций по использованию научных выводов, списка использованной литературы, приложений. Работа иллюстрирована 12 таблицами, 12 рисунками и содержит 8 страниц приложений. Список литературы включает 107 библиографических источника, в т.ч. 91 на иностранном языке.

Основные положения и результаты, выносимые на защиту.

1. Использование препарата «Lipofectamin® 2000» для трансфекции первичных ППК птицы чужеродным геном, с последующим переносом их в зону зародышевого серпа эмбрионов доноров, позволяет получить 25% трансгенных эмбрионов.

2. Смена среды и сворачивание фидерного монослоя стромальных клеток являются лимитирующими факторами, влияющими на процесс пролиферации ППК при культивировании in vitro, при этом выявлена способность фидерных клеток линии STO поддерживать долгосрочную культуру ППК.

3. Максимальная эффективность получения трансгенной птицы с геном ГКСФ человека от числа рожденных потомков продемонстрирована при использовании препарата липосом «Lipofectamin® 2000» и составила 33,3%.Установлена экспрессия гена ГКСФ человека в крови трансгенных кур. Наследование чужеродного гена наблюдалось от 25 до 50% у цыплят первого поколения.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в период с 2007 по 2010 гг. в лаборатории трансгенеза отдела «Биотехцентр» ГНУ НИИПЗК им. В.А. Афанасьева.

В работе было использовано 10 куриц и 3 петуха кросса «Радонеж» и 10 куриц кросса «Птичное».

В качестве вводимой чужеродной ДНК применялась плазмида на основе вектора pIRES EGFP2 (фирма Clontech, США), в которую был проклонирован

ген ГКСФ человека (Городецкий С.И. 2006). Данный плазмидный вектор предназначен для экспрессии в эукариоты и содержит CMV-промотор.

Примордиальные клетки для трансфекции выделяли из гонад 7-суточных эмбрионов. Трансфекцию проводили в зону зародышевого серпа суточных куриных эмбрионов с применением липосом «Lipofectamin 2000» («Invitro-gen», США) и препаратов ДНК плазмид с геном ГКСФ человека, в линеаризированной форме. Проинъецированные куриные эмбрионы инкубировали в инкубаторе ИПХ-10И в течение 5-7 дней.

Для разработки способа стерилизации реципиентов применяли ультрафиолетовое облучение оплодотворенных яиц. Культивирование примор-диальных и бластодермальных клеток проводили в культуральной среде Knockout DMEM (Sigma, США) с различными биологическими добавками.

Бластодермальные клетки выделяли из оплодотворенных яиц кур и культивировали на митотически неактивном STO монослое.

Окраску примордиальных клеток на присутствие гликогена проводили с использованием набора реагентов для определения в лейкоцитах гликогена (полисахаридов) (НПФ Абрис+», Россия, С-Петербург), в основе методики лежит PAS (ШИК) - реакция по методу Me Manus.

Для проведения трансфекции сперматозоидов плазмидой с геном ГКСФ человека применялись липосомальные препараты «Lipofectine®» (Invitrogen, США) и «Lipofectamin® 2000», (Invitrogen, США).

Идентификацию интеграции у трансгенных эмбрионов и птицы осуществляли с помощью ПЦР диагностики с использованием амплификатора «Тер-цик™» (НПО «ДНК-Технология», Россия, Протвино). Праймеры для проведения ПЦР были подобраны с помощью компьютерной программы Vector NTI.

Наличие ГКСФ человека в сыворотке крови трансгенной птицы были проанализированы с помощью тест-системы для иммуноферментного анализа «Human - G - CSF», производства фирмы «Invitrogen» (США)., Kat № КНС2031.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Разработка и совершенствование методов получения трансгенной птицы с использованием первичных половых и стволовых клеток кур

Получение трансгенных эмбрионов кур с использованием первичной культуры примордиальных клеток. Как известно, первые эксперименты по получению трансгенной птицы были проведены с использованием первичных половых клеток кур, однако результаты оказались необнадеживающими, т.к. почти всегда наблюдалось эписомное встраивание плазмид. По нашему мнению, эта технология могла бы быть более успешной в случае более удобного способа стерилизации реципиентов для удаления пула эндогенных ППК, инъекции трансфецированных клеток, не в кровяное русло, а в зону зародышевого серпа и использования нового поколения липосом («Lipofectamin® 2000») -переносчиков ДНК.

По литературным данным, для снижения количества собственных (эндогенных) ППК в организме реципиента используют рентгеновское излучение, химические препараты и хирургическое удаление предшественников ППК.

Нами же впервые для этих целей было применено ультрафиолетовое облучение оплодотворенных яиц, как более экономичный и щадящий способ стерилизации. Стерилизацию яиц проводили в следующих режимах: 1) до закладки в инкубатор на протяжении 1 ч; 2) до закладки на протяжении 2 ч; 3) до закладки в течение 2,5 ч; 4) через сутки после начала инкубации на протяжении 2 ч.

Результаты оценивали по эффективности снижения эндогенных ППК в эмбрионах после 7 суток инкубации, подвергшихся УФ облучению, в указанных режимах. Было показано, что при обработке яиц ультрафиолетовыми лучами в течение 2,5 часов до закладки на инкубацию наблюдалось самое высокое уменьшение эндогенных ППК у реципиентов - до 31%. Этот режим был использован в дальнейших экспериментах по получению трансгенных эмбрионов с использованием трансфецированных экзогенных ППК.

Инъекцию трансфецированных плазмидой с геном ГКСФ человека гонадных клеток впервые проводили в зону зародышевого серпа суточных эмбрионов. После 7 суток инкубации методом ПЦР анализа тотальной ДНК, выделенной из гомогената тканей эмбрионов, определяли интеграцию экзогенной

8

ДНК. В результате проведенных экспериментов было проинъецировано 23 эмбриона, после 7 дней инкубации продолжили развитие 14 эмбрионов. По результатам ПЦР анализа у 3-х эмбрионов из числа развившихся эмбрионов в выделенной ДНК из тканей был зафиксирован ген человеческого ГКСФ. Таким образом, эффективность получения трансгенных химер с использования препарата «Lipofectamin® 2000» составила более 20%. Оказалось, что облучение эмбрионов реципиентов оказало положительное влияние на эффективность получения химер, т.к. эффективность трансфекции у стерилизованных реципиентов увеличилась на 8 %, что превышает аналогичные показатели, полученные зарубежными исследователями [Hong et al., 1998].

Разработка метода получения долгосрочной культуры ППК. Ранее было показано, что ППК, выделенные из гонад 5-5.5 -суточных эмбрионов кур, при долгосрочном культивировании in vitro обладают свойствами эмбриональных половых (EG) клеток млекопитающих, сохраняют морфологические и гистохимические (окраска на гликоген) характеристики первичных клеток и могут быть использованы для получения химер. Очевидно также, что и транс-фекция экзогенным геном будет более результативной, если долгосрочная культура эмбриональных донорских клеток будет трансфецирована in vitro, а затем для инъекции реципиенту будут отобраны клоны с хромосомным встраиванием чужеродного гена.

С этой целью нами была получена долгосрочная культура ППК из гонад эмбрионов после 7 суток инкубации, при этом стромальные клетки гонад были использованы в качестве фидерного слоя (рис. 1).

|

Рис 1. ППК через 10 суток культивирования на монослое стромальных клеток

Максимальная продолжительность культивирования ППК от индивидуальных эмбрионов птицы составила 2 месяца. В течение этого срока ППК сохраняли свои специфические характеристики, а именно, большой размер, наличие многочисленных гранул, и позитивное окрашивание на гликоген (рис. 2). Согласно литературным данным, ППК с данными характеристиками способны дать рост половым химерам после трансплантации реципиенту [Han J. Y., et al., 2002].

Рис 2. ППК кур, окрашенных на гликоген с использованием

ШИК-реакции

Было выявлено два лимитирующих фактора, влияющих на процесс пролиферации ППК: смена среды и сворачивание фидерного монослоя стромальных клеток. Если смена среды только задерживала рост ППК на несколько суток, то сворачивание фидерного слоя вместе с ППК значительно сокращало число не только ППК, но и самих стромальных клеток, концентрация которых была уже недостаточной для эффективного роста ППК.

С целью повышения выхода количества ППК и преодоления указанных выше ограничений, связанных со сворачиванием монослоя стромальных клеток, были проведены эксперименты по замене фетальной эмбриональной телячьей сыворотки крови на куриную сыворотку крови и использование в качестве фидерного слоя клеток 8ТО, соответственно.

Было показано, что в случае, если в культуральной среде присутствовала куриная сыворотка, большая часть ППК не прикреплялись к монослою стромальных клеток, представляя собой суспензионную культуру, тогда как в отсутствии куриной сыворотки ППК образовывали прикрепленные колонии от 58 до 20-30 клеток и больше, что значительно снижало выход ППК.

Для увеличения срока культивирования ППК пассировали на фидерный монослой линии STO до сворачивания стромального монослоя на 5-7 сутки культивирования и после сворачивания. Было показано, что ППК успешно делились на фидерном монослое линии STO и через 3-6 суток, их число увеличивалось в 3-5 раз. Ранее было показано, что ППК, выделенные из гонад, не способны пролиферировать на митотически неактивном слое клеток STO [Park T.S. and Han J.Y., 2000]. Однако согласно нашим данным, деление клеток в этих условиях происходило. Следует отметить, что в последнее время было опубликовано сообщение о получении постоянных линий ППК из крови также с использованием клеток STO [van de Lavoir M.С., et a!., 2006].

Разработка метода получения долгосрочной культуры бластодер-мальных клеток кур. Следующим объектом для долгосрочного культивирования были выбраны ЭСК. Эти клетки легкодоступны, тотипотентны, однако при культивировании возникает опасность их дифференцировки в фибробла-топодобные клетки. Необходимо отметить, что только единичным группам исследователей за рубежом удалось получить долгосрочные культуры ЭСК. При этом предложенные ими методы культивирования отличаются друг от друга, что свидетельствует о больших трудностях в их воспроизведении [Pain В., et al., 1996; Van de Lavoir M.C. and Mather-Love C., 2006; Wang Y., et al., 2006].

В наших экспериментах ЭСК были получены из бластодисков индивидуальных эмбрионов птицы. В отличие от ППК, характер роста ЭСК не зависел от наличия в среде куриной сыворотки (рис. 3).

Рис. 3. ЭСК через 6-суток культивирования

После 6-ти суток культивирования ЭСК представляли собой маленькие клетки с большим ядром и хорошо различимыми ядрышками, росли колониями в виде однослойного монослоя с четко различимыми границами между клетками

ЭСК экспрессировали маркеры плюрипотентности - положительная окраска на щелочную фосфатазу и 88ЕА-1 (рис. 4, 5).

Рис 4. Выявление активности щелочной фосфатазы в культуре ЭСК

(х 200)

Рис 5. Иммунофлуоресцентная детекция 88ЕА -1 антигена в культуре

ЭСК (х 400)

Анализ результатов по влиянию различных ростовых факторов показал, что коммерческий мышиный фактор лейкимии (Ь1Р) поддерживал культуру не более 2-х пассажей, а добав-ление таких факторов, как основной фактор роста фибробластов (ЬРОР) и фактор стволовых клеток (8СР), используемых при культивировании ППК, приводил к остановке трансформации бластодермаль-ных клеток в ЭСК, несмотря на присутствие ЫР. На основании изложенного, можно предположить, что ЫР не являлся определяющим фактором роста, ско-

рее всего сами стволовые клетки были способны нарабатывать факторы регуляции пролиферации. Поэтому снижение количества клеток, смена среды и разрушение трипсином приводило к уменьшению их содержания, и, как следствие, к дифференциации клеток.

В работе, опубликованной в 2006 [Wang Y. et al.] году было показано, что эмбриональный экстракт способен поддерживать пролифирацию бластодер-мальных клеток. Эмбриональный экстракт, полученный из тканей 7-суточных эмбрионов, был использован нами в качестве основной добавки к ростовой среде при культивировании ЭСК, полученных из бластодисков индивидуальных эмбрионов птицы. Морфологические характеристики ЭСК не отличались от клеток, культивируемых с мышиным LIF. С помощью экстракта удалось дважды пассировать бластодермальные клетки. Однако в данном случае деление клеток не зависело от концентрации клеток и было связано с качеством приготовленного экстракта, т.к. отмечался разный рост клеток при применении эмбрионального экстракта от разных партий.

Разработка и совершенствование методов получения трансгенной птицы с использованием сперматозоидов в качестве переносчиков

чужеродной ДНК

Влияние манипуляционных воздействий и индивидуальных особенностей птицы на эффективность оплодотворения. До проведения процедуры трансфекции спермы, с применением липосомальных препаратов, необходимо было удалить семенную жидкость, содержащуюся в эякуляте. Для этого были подобраны оптимальные режимы центрифугирования спермы и концентрация сперматозоидов в дозе спермы.

Согласно полученным данным, центрифугирование при 220g в течение 5 минут было достаточным для удаления семенной жидкости, при этом подобранная концентрация сперматозоидов 500 млн в дозе обеспечивала оплодо-творяемость яиц обработанной спермой, практически не отличающейся от контрольных (82% и 95%, соответственно). При необходимости трехкратного центрифугирования оплодотворяемость яиц обработанной спермой снижалась до 50 %, однако была достаточной для выполнения поставленных целей.

Были изучены индивидуальные различия производителей по эффективности осеменения при применении выбранных манипуляционных воздействий

на сперматозоиды с целью селекции наиболее продуктивных производителей (табл. 1).

Таблица 1. Индивидуальные различия спермы петухов по оплодотворяющей способности

Показатель Номер петуха Смешанная сперма

1 2 3

Количество осеменений 20 16 16 9

Количество полученных яиц 90 86 78 43

Количество оплодотворенных яиц 36±1 31 ±0,8 31±1,2 27±1,6

% оплодотворенных яиц 40,0а 36,0й 40,0" 63,0Г

Ра>г<0,01; Рб,г<0,01; РЕ Г<0,01

У петухов не было выявлено резких различий по оплодотворяющей способности спермы, однако при использовании смешанного семени от трех производителей отмечалась тенденция к увеличению количества оплодотворенных яиц.

Однако оказалось, что такие различия существовали в отношении куриц, т.к. процент оплодотворенных яиц менялся от 19 до 81%, поэтому в дальнейших экспериментах по трансгенезу использовались самки с наилучшими показателями оплодотворяемости.

Разработка и совершенствование методов получения трансгенной птицы с использованием сперматозоидов в качестве переносчиков чужеродной ДНК. Известно, что у мышей, свиней при инкубации экзогенной ДНК со сперматозоидами чаще всего встречается эписомное встраивание, отсутствие встраивания или чужеродный ген не передается следующему поколению. В наших экспериментах на птице также не удалось зафиксировать интеграцию ДНК этим методом, т.к. после осеменения 3 куриц спермой, инкубированной в присутствии плазмидной ДНК, содержащей ген ГКСФ человека без использования липосом, было собрано 18 яиц, получено 12 эмбрионов, ни один из которых не был трансгенным.

Из литературных данных известно, что липосомы значительно повышают эффективность хромосомного встраивания плазмид. Однако сравнение различных комплексов липосом с геном при инъекции в семенники показало, что не любой коммерческий препарат способен встраивать экзогенную ДНК [Уо-пегаша Т., е1 а!., 2001]. В целях повышения эффективности встраивания плаз-

мидной ДНК были изучены два препарата на основе липосом - «[лроГесйпе®» (1пукгс^еп) и «ЫроГе^агшп® 2000», (1пуиго£еп).

Препарат «ЫроГесйп®» продемонстрировал возможность получения трансгенных особей, но процент эмбрионов с интегрированной чужеродной ДНК по результатам ПЦР анализа оказался невысоким и составил 3,4%.

В следующей серии экспериментов нами был использован препарат Ыро-Гес1атт® 2000. Было проведено осеменение куриц спермой трансфецирован-ной плазмидной ДНК с геном ГКСФ человека с применением данного препарата, с целью получения после 7-ти суточной инкубации эмбрионов для тестирования их на присутствие чужеродного гена. Было собрано 20 яиц, получено 9 эмбрионов, 3 из которых оказались трансгенными. Эффективность транс-генеза с использованием данного препарата увеличилась в 10 раз по сравнению с использованием ироГесйпе® и составила 33,3% (табл. 2).

Таблица 2. Влияние различных препаратов липосом на получение трансгенных эмбрионов кур

Препарат Число полученных яиц Число полученных эмбрионов Из них трансгенных

п % от числа эмбрионов

ЫроГесйпе® 51 29 1 3,4а

1лроГес1атт® 2000 20 9 3 33,3°

Ра,б<0,01

Аналогичный эксперимент с использованием УроГе^атш® 2000 был проведен при получении трансгенных цыплят с геном ГКСФ человека (табл. 3).

Таблица 3. Получение трансгенных цыплят после осеменения кур спермой петухов, трансфецированной геном ГКСФ человека

Показатель Общее число Процент от числа

снесенных яиц полученных цыплят

Получено яиц 20 100,0

Получено цыплят 6 30,0 100,0

Из них трансгенных 2 10,0 33,3

Интеграция гена методом ПЦР была продемонстрирована у двух цыплят. Вновь эффективность трансгенеза, как и в опытах по получению трансгенных эмбрионов, составила 33,3%, что подтверждает стабильность полученных ре-

зультатов.

Экспрессия ГКСФ человека в крови трансгенной птицы и наследование чужеродного гена в поколении С целью проверки экспрессии введенного гена сыворотка крови полученной трансгенной птицы анализировалась иммуноферментным методом на присутствие ГКСФ человека (табл. 4).

Таблица 4. Динамика продукции ГКСФ человека у трансгенных цыплят

Номер цыпленка Концентрация ГКСФ человека в крови цыплят (пкг/мл) в возрасте (дни)

90 100

А001091 220 70

А001100 70 50

Контроль 0 0

Оказалось, концентрация ГКСФ человека в крови трансгенных куриц не была постоянной и менялась в зависимости от возраста птицы. Концентрация человеческого белка в сыворотке крови была у одной курицы от 70 до 220 пкг/мл, а у другой 50 - 70 пкг/мл. Данные показатели соответствовали и даже превышали физиологические концентрации ГКСФ в крови человека. Подобная динамика экспрессии характерна для трансгенных животных.

Характер наследования экзогенного гена был изучен в экспериментах по искусственному осеменению спермой от нетрансгенных петухов трансгенных куриц в возрасте шести месяцев и началом их яйцекладки. От каждой курицы было собрано по 9 яиц, яйца инкубировались в течение 21 дня. Было получено 8 цыплят, от каждой курицы по 4 цыпленка. Из крови цыплят была выделена ДНК, и проведен ПЦР анализ на наличие гена ГКСФ человека (табл. 5).

Таблица 5. Получение первого поколения трансгенных потомков от

трансгенных кур

Номер курицы Получено потомков Число проанализированных потомков Из них трансгенных

п % от полученных п %

2174 4 4 100,0 2 50,0

2182 4 4 100,0 1 25,0

Всего: 8 8 100,0 3 37,5

Было установлено, что обе трансгенные курицы передали плазмидную

ДНК своим потомкам.

Таким образом, было продемонстрировано хромосомное встраивание чужеродного гена при проведении опосредованного переноса ДНК сперматозоидами с помощью липосом, что позволяет в дальнейшем разработать высокоэффективную технологию получения терапевтических рекомбинантных белков в яйце сельскохозяйственной птицы.

ВЫВОДЫ

1. Определены параметры для эффективной трансфекции первичных половых клеток птицы геном ГКСФ человека, включая стерилизацию реципиентов УФ облучением в течение 2,5 часов, инъекции в зародышевый серп и использование нового поколения препарата на основе липосом - «Lipofectamin® 2000». Процент трансгенных эмбрионов составил 25%.

2. Смена среды и сворачивание фидерного монослоя стромальных клеток являются лимитирующими факторами, влияющими на процесс пролиферации ППК при культивировании in vitro.

3. Фидерный монослой линии STO способен поддерживать долгосрочную культуру ППК. Добавление в среду культивирования куриной сыворотки крови в 2-3 раза увеличивает выход ППК.

4. Наиболее оптимальным способом отделения сперматозоидов петуха от семенной жидкости является центрифугирование эякулята при 220g в течение 5 минут. Оптимальное число сперматозоидов, используемых для трансфекции чужеродным геном, составляет 500 млн на дозу.

5. Получена трансгенная птица с геном ГКСФ человека методом искусственного осеменения трансфецированной спермой с применением препарата для трансфекции - «Lipofectamin® 2000». Выход полученных трансгенных цыплят с геном ГКСФ человека птицы составил 33.3%.

6. Продемонстрирована экспрессия гена ГКСФ человека в крови трансгенных кур на уровне 50 - 220 пкг/мл. Концентрация ГКСФ человека в крови трансгенных кур различается у разных животных и зависит от их возраста.

7. В результате осеменения трансгенных куриц (с геном ГКСФ человека) спермой нетрансгенных петухов получено первое поколение трансгенной птицы. При этом наследование чужеродного гена варьировалось от 25 до 50%.

СВЕДЕНИЯ О ПРАКТИЧЕСКОМ ИСПОЛЬЗОВАНИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Результаты проведенных экспериментов вошли в состав 4 отчетов лаборатории трансгенеза отдела «Биотехцентр» ГНУ НИИПЗК: «Разработка условий трансфекции спермы петухов чужеродным геном и получение трансгенных плодов кур» (2007), «Изучить возможность применения генных конструкций, способствующих переносу и интеграции чужеродного гена со спермой петухов для получения трансгенных кур» (2008), «Изучить возможность применения генных конструкций с репортерными генами, способствующими детекции чужеродных генов в ДНК эмбрионов кур» (2009), «Изучить возможность получения цыплят с подтвержденной интеграцией экзогенных генетических вставок при использовании сперматозоидов петуха в качестве переносчиков чужеродной ДНК» (2010).

2. Результаты экспериментов вошли в наставление «Способ получения генетически модифицированной сельскохозяйственной птицы при использовании сперматозоидов петуха в качестве переносчиков чужеродной ДНК», утвержденное 15.10.2010 г. на заседании секции «Селекция, генетика и биотехнология сельскохозяйственных животных РАСХН» (пр. № 5), и предназначенное для научных сотрудников, аспирантов и специалистов НИИ.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Разработанные методы получения трансгенной птицы рекомендуются для использования в биотехнологии и клеточной инженерии.

2. Для стерилизации реципиентов при проведении инъекции трансфециро-ванных ППК в зону зародышевого серпа рекомендуется облучение оплодотворенных яиц ультрафиолетом в течение 2,5 часов.

3. При проведении долгосрочного культивирования ППК в качестве фидерного монослоя рекомендуется использовать митотически неактивные клетки линии STO.

4. Для отделения сперматозоидов петуха от семенной жидкости, рекомендуется центрифугирование эякулята при 220g в течение 5 минут, при этом оптимальное число сперматозоидов, используемых для трансфекции чужерод-

ным геном, составляет 500 млн на дозу.

5. Для трансфекции ППК и для получения трансгенной птицы методом опосредованного переноса чужеродой ДНК сперматозоидами рекомендуется использование препарата на основе липосом - «Lipofectamin® 2000».

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сураева Н.М., Барышников А.Ю., Самойлов A.B. Трансфекция in vitro гонадных клеток кур бактериальным геном ß - галактозидазы //Российский биотерапевтический журнал. - 2007. - Т. 6. - № 1. - С. 7.

2. Получение, характеристика и долгосрочное культивирование примор-диальных половых клеток кур /Сураева Н.М., Воротеляк Е.А., Прокофьев М.И., Васильев A.B., Самойлов A.B., Барышников А.Ю. //Российский биотерапевтический журнал. - 2008. - Т. 7. - № 1. - С. 7.

3. Получение, характеристика и долгосрочное культивирование примор-диальных и бластодермальных клеток кур /Сураева Н.М., Воротеляк Е.А., Прокофьев М.И., Васильев A.B., Самойлов A.B., Барышников А.Ю. //Доклады РАН. - 2008. - Т. 423. - № 3. - С. 408 - 410.

4. Характеристика и долгосрочное культивирование эмбриональных стволовых клеток кур /Сураева Н.М., Воротеляк Е.А., Васильев A.B., Самойлов A.B., Барышников А.Ю. //Онкогематология. - 2008. - № 4. - С. 73.

5. Перспективы развития технологий получения рекомбинантных белков для терапии онкологических заболеваний /Сураева Н.М., Воротеляк Е.А., Васильев A.B., Самойлов A.B., Барышников А.Ю. //Русский журнал «СПИД, рак и общественное здоровье». - 2009. - Т. 13. - № 2 (27). - С. 43.

6. Сураева Н.М., Самойлов A.B. Получение фармацевтических белков с помощью трансгенной птицы //Вестник РОНЦ им. Блохина H.H. РАМН. -2009. - Т. 20. - № 4. - С. 19 - 25.

7. Трансфекция экзогенной ДНК эмбриональных клеток птицы /Сураева Н.М., Мартиросян В.В,. Кесян А.З, Самойлов A.B., Барышников А.Ю. //Российский биотерапевтический журнал. - 2010. - № 2. - Т. 9. - С. 59.

8. Получение трансгенных кур и геном гранулоцитарного колоние-стимулирующего фактора человека / Сураева Н.М., Мартиросян В.В,. Кесян А.З., Самойлов A.B., Барышников А.Ю. //Российский биотерапевтический журнал. - 2010. - № 2. - Т. 9. - С. 60.

Подписано в печать 17.12.2010 г. Тираж 100 экз. Усл. печ. л. 1. Заказ № 3239 Отпечатано в типографии «АллА Принт» Тел. (495) 621-86-07, факс (495) 621-70-09 www.allaprint.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Самойлов, Артем Владимирович

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Продуценты белков фармацевтического назначения.

1.2. Генные конструкции.

1.3. Трансгенная птица.

1.3.1. Получение трансгенных кур с помощью первичных эмбринальных клеток.

1.3.2. Получение трансгенных кур с помощью долгосрочных линий эмбриональных клеток.

1.3.3. Трансфекция с помощью сперматозоидов как переносчиков чужеродной ДНК.

1.4. Методы определениея интеграции и экспрессии чужеродной ДНК.

2. Материалы и методы.

2.1. Биологический материал.

2.1.1. Содержание экспериментальной птицы.

2.1.2. Получение спермы и проведение искусственного осеменения.

2.1.3. Плазмиды, использованные в работе.

2.2. Проведение трансфекции сперматозоидов.

2.3. Определение интеграции чужеродной ДНК.

2.3.1. Выделение ДНК из тканей эмбрионов.

2.3.2. Выделение ДНК из цельной крови.

2.3.3. Определение интеграции методом ПЦР.

2.4. Методы определения экспрессии встроенного гена.

2.5. Культивирование зародышевых клеток.

2.5.1. Приготовление ЭТО клеток.

2.5.2. Приготовление эмбрионального экстракта.

2.5.3. Выделение и культивирование гонадных примордиальных и бластодермальных зародышевых клеток.

2.6. Гистохимическое и иммуногистохимическое окрашивание эмбриональных клеток.

2.7. Трансфекция первичных примордиальныхклеток и инъекция их в зародышевый серп.

2.7.1. Стерилизация реципиентов.

2.7.2. Проведение трансфекции первичных гонадных клеток с помощью липофекции.

2.7.3. Инъекция трансфецированных гонадных клеток.

3. Результаты исследований.

3.1. Разработка и совершенствование методов получения трансгеной птицы с использованием первичных половыхи стволовых клеток кур.

3.1.1. Получение трансгенных эмбрионов кур с использованием первичной культуры примордиальных клеток.

3.1.2. Разработка метода получения линии первичных половых клеток.

3.1.3 Разработка метода получения бластодермальных клеток кур.

3.1.3.1 Культивирование бластодермальных клеток с использованием мышиного ЫБ.

3.1.3.2 Разработка метода культивирования бластодермальных клеток с эмбриональным экстрактом.

3.2. Разработка и совершенствование методов получения трансгенной ' птицы с использованием сперматозоидов в качестве переносчиков чужеродной ДНК.

3.2.1. Влияние манипуляционных воздействий и индивидуальных особенностей птицы на эффективность оплодотворения.

3.2.2 Изучение оптимальных режимов подготовки образцов тканей и условий для проведения ПЦР — анализа.

3.2.3 Получение трансгенной птицы с геном ГКСФ человека методом опосредованного переноса с помощью сперматозоидов.

3.2.4 Экспрессия чГКСФ в крови трансгенной птицы.

3.2.5 Наследование чужеродного гена в поколении Б].

4. Обсуждение результатов исследования.

5. Выводы.

6. Сведения о практическом использовании результатов исследования.

7. Рекомендации по использованию научных выводов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка и совершенствование методов трансфекции экзогенной ДНК в эмбриональные клетки кур"

Актуальность работы. В настоящее время биотехнология стремительно занимает передовые рубежи научно-технического прогресса. Этому способствовало два обстоятельства. С одной стороны, бурное развитие современной молекулярной биологии и генетики, благодаря которым можно широко использовать потенциал живых организмов. С другой стороны, большая практическая потребность в новейших технологиях, необходимых для преодоления все возрастающих потребностей в продовольственных товарах и фармацевтических препаратах. Особенно выдающиеся достижения были сделаны после открытия молекулярной структуры генома человека, а также возникновение в результате этого открытия молекулярной генетики, клеточной и генной инженерии.

В относительно небольшой период учеными были разработаны принципы и методики выделения из генома отдельных генов и их искусственного синтеза на базе функционирующих генных конструкций. Немного позже были разработаны методы внедрения чужеродных генов в геном организмов. Впервые подобная технология была продемонстрирована на бактериях Escherichia coli более тридцати лет назад [Cohen G.N., et al., 1973]. С тех пор технология генетической манипуляции организмов достигла поразительного прогресса и на сегодняшний день воспроизводится на бактериях, грибах, простейших, растениях и животных.

Введение чужеродных генов животным, с использованием рекомби-нантных конструкций, позволяет получить трансгенных особей, у которых введенные гены могут улучшать породные свойства животных, повышать устойчивость их организма к различным инфекционным заболеваниям, или получать животных-продуцентов физиологически активных продуктов, необходимых в медицине, ветеринарии, животноводстве.

Важнейшим приоритетом создания трансгенных организмов остается получение рекомбинантных белков на их основе. Использование белков в качестве лекарственных средств (инсулин, выделенный из поджелудочной ж: лезы свиньи) впервые было апробировано в 20-е годы прошлого столетиззи^ц. Через 60 лет был получен человеческий инсулин с помощью рекомбинантг^— ных бактерий. Этот инсулин оказался качественным и был адоптирован дгг »—-всех групп пациентов, страдающих диабетом.

В конце 20-го столетия в мире широко развернулись исследования неполучению трансгенных животных. В 1987 году впервые была продемонс рирована возможность получения рекомбинантных белков с молоком тран: генных млекопитающих [Peshon, J.J., et al., 1987].

К началу 21-го столетия было получено уже более 100 лекарственны белков с молоком трансгенных животных. А также получен ряд рекомб нантных протеинов из белка яйца трансгенной птицы [Zhu L., van de Lav M.C. et al., 2005].

Онкология остро нуждается в гематопоэтических факторах роста, ких, как гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, эритропоэтин: тому подобных, так как доказана^ эффективность использования гранулощ;.«^^^ тарного колония стимулирующего фактора (ГКСФ)? человека против разлиг^=^ ных форм лейкопении, вызванной химио- и радиотерапией, при лечении кологических заболеваний. ПССФ восстанавливает иммунную систему обеспечивает возможность применения боле высоких доз препаратов химиотерапии, что повышает эффективность лечения онкологических заболеваний. Технологии получения рекомбинантных белков открывают нош более эффективный путь производства белковых фармацевтических препа^ь-^^а.-тов.

Целью исследований являлась разработка и усовершенствование битзо. технологических методов генетической трансформации эмбриональных ьез-зг;.«^-ток кур.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следу^&«о щие задачи:

1. Усовершенствовать методы получения трансгенной химерной птицы при использовании первичных эмбриональных половых клеток.

2. Получить долгосрочные культуры эмбриональных примордиальных (ППК) и бластодермальных (ЭСК) клеток кур.

3. Усовершенствовать методы трансфекции геном гранулоцитарного ко-лониестимулирующего фактора (ГКСФ) человека сперматозоидов петуха с помощью липосом.

4. Получить трансгенных кур с встроенным геном ГКСФ человека с использованием сперматозоидов петуха в качестве переносчиков чужеродной ДНК.

5. Изучить характер экспрессии и наследования целевого гена у трансгенной птицы.

Научная новизна работы. Впервые в нашей стране получены трансгенные куры с геном ГКСФ человека, и продемонстрирована экспрессия этого гена. Определены оптимальные режимы трансфекции гена ГКСФ человека в сперматозоиды петуха-(количественный состав сперматозоидов, режимы обt работки семени, подбор производителей). Продемонстрировано наследование введенного гена у потомков.

Показана возможность успешного культивирования первичных половых клеток (ППК) из гонад ранних эмбрионов птицы на митотически неактивном STO (мышиные эмбриональные фибробласты) монослое и разработан протокол длительного культивирования ППК, с целью их дальнейшего использования для трансфекции.

Впервые разработан метод получения трансгенных химерных эмбрионов птицы в результате трансплантации трансфецированных первичных ППК гонад в зародышевый диск реципиента, предварительно стерилизованного ультрафиолетовым облучением.

Практическая значимость работы. Результаты исследований, полученные при изучении оптимальных приемов культивирования in vitro эмбриональных клеток птицы, могут быть использованы при разработке технологии производства рекомбинантных белков.

Разработано наставление «Способ получения генетически модифицированной сельскохозяйственной птицы при использовании сперматозоидов петуха в качестве переносчиков чужеродной ДНК», утвержденное на заседании секции «Селекция, генетика и биотехнология сельскохозяйственных животных РАСХН», протокол № 5, от 15 октября 2010 г. Предложенный способ отличается высокой эффективностью, простотой, дешевизной и быстротой исполнения.

Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены, обсуждены и одобрены на ежегодных отчетных сессиях отдела «Биотехцентр» ГНУ НИИПЗК им. Афанасьева В.А. (2007 - 2010), а также на VI симпозиуме «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний» (Москва, 2009); XVIII Международной конференции «СПИД, рак и общественное здоровье» (С.-Петербург, 2009); IX Всероссийской научно-практической конференции с международным участием- «Отечественные про-тивоопухолевые препараты» (Н.Новгород, 2010); заседании секции «Селекция, генетика и биотехнология сельскохозяйственных животных РАСХН» (Дубровицы, 2010).

Личный вклад соискателя. Автор принимал непосредственное участие во всех этапах работы, в т.ч. приготовление микроинструментов для выделения и работы с первичными половыми и бластодермальными клетками птицы (изготовление стеклянных пипеток для инъекции трансфецированных клеток в эмбрион), приготовление питательных сред и рабочих растворов; выделение клеток из эмбрионов птиць1, их культивирование, окрашивание и криоконсервация; получение семени от петухов, ее оценка, проведение трансфекции сперматозоидов и искусственного осеменения куриц; выделение ДНК из крови цыплят и тканей эмбрионов, проведение ПЦР диагностики; получение крови от птицы, приготовление сыворотки и проведение ИФА; анализ и обобщение полученных результатов исследований, написание статей, отчетов и докладов.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в т.ч. 7 — в журналах, рекомендуемых ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 102 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, сведений о практическом использовании результатов исследований, рекомендаций по использованию научных выводов, списка использованной литературы, приложений. Работа иллюстрирована 12 таблицами, 12 рисунками и содержит 8 страниц приложений. Список литературы включает 107 библиографических источника, в т.ч. 91 на иностранном языке.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Самойлов, Артем Владимирович

ВЫВОДОВ

1. Разработанные методы получения трансгенной птицы рекомендуются для использования в биотехнологии и клеточной инженерии.

2. Для стерилизации реципиентов при проведении инъекции трансфе-цированных ППК в зону зародышевого серпа рекомендуется облу-чение оплодотворенных яиц ультрафиолетом в течение 2,5 часов.

3. При проведении долгосрочного культивирования ППК в качестве фидерного монослоя рекомендуется использовать митотически неактивные клетки линии STO.

4. Для отделения сперматозоидов петуха от семенной жидкости, рекомендуется центрифугирование эякулята при 220g в течение 5 минут, при этом оптимальное число сперматозоидов, используемых для трансфекции чужеродным геном, составляет 500 млн на дозу.

5. Для трансфекции ППК и для получения трансгенной птицы методом опосредованного переноса чужеродой ДНК сперматозоидами, рекомендуется использование препарата на основе липосом - «Lipofectamin® 2000».

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Самойлов, Артем Владимирович, п. Родники, Московская обл.

1. Белоусов Л.В. 1993. Основы общей эмбриологии / Белоусов Л.В. // М.: Издательство Московского университета. 1993. 149 С.

2. Давтян, А.Д. Воспроизводство и искусственное осеменение сельскохозяйственной птицы / А.Д. Давтян // ВНИТИП, 1999 — 240 С.

3. Кузнецов, A.B. Трансгенные животные. Приемы конструирования / Кузнецов A.B. // Биотехнология. 1995. - № 3-4. — С. 3-6.

4. Лакин, Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин // М.: Высшая школа. — 1980. — 293 С.

5. Ожин, Ф.В. Справочник по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных / Ф.В. Ожин, Г.В. Паршутин, И.И. Родин, А.Н. и др. // М.: Россельхозиздат. 1977. - 243 С.

6. Прокофьев, М.И. Изучение интеграции, наследования и экспрессии:--:рекомбинантных генов с молоком кроликов / М.И. Прокофьев, В.В. Елагин // Сельскохозяйственная Биотехнология. 2002. - №6. — С. 49-54.

7. Прокофьев, М.И. Методы получения биоинженерных сельскохозяйственных животных / М.И. Прокофьев, В.И. Захарченко Н.М. Сураева // С-х: биология. 1994. - № 4. - С. 12-25.

8. Прокофьев, М.И. Создание трансгенных кроликов, продуцирующих: с молоком человеческий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор / М.И. Прокофьев, С.И. Городецкий, М.Н. Мезина и др. // Сельскохозяйственная биология. — 2003. — № 6. — С. 49-54.

9. Рольник В.В. Биология эмбрионального развития птиц /Л.: Издательство «Наука» 1968. — 145 С.

10. Рыбакова Г.А. Техника взятия крови у птиц / Г.А. Рыбакова // Птицеводство. 1960. - №8. - С. 42-43.

11. Сураева, Н.М. Выделение и характеристика первичных половых: клеток из гонад 6-9- дневных эмбрионов кур с целью совершенствования:метода получения трансгенных птиц / Н.М: Сураева, А.Г. Толмазова // ДЦок-лады РАСХН. 2004. - №2 - С. 29-32.

12. Сураева, Н.М. Изучение эффективности различных способов фекции репортерного гена в эмбриональные клетки кур / Н.М. Сур^ева А.Ю. Барышников, В.И. Фисинин и др. // Известия РАН. — 2008. — №. 1. -—. q 18-23.

13. Сураева, Н.М. Получение, характеристика и долгосрочна культивирование примордиальных и бластодермальных клеток: Кур /Н.М.Сураева, Е.А. Воротеляк, М.И. Прокофьев и др. //Доклады РАН. — 2008- Т. 423. № 3. - С. 408 - 410.

14. Сураева, Н.М., Самойлов А.В: Получение фармацевтических белков с помощью трансгенной птицы //Вестник РОНЦ им. Блохина Н.Н. PAjyiH 2009. Т. 20. - № 4. - С. 19 - 25.

15. Сураева, Н.М. Трансфекция экзогенной ДНК эмбриональных Клеток птицы / Н.М. Сураева. В.В. Мартиросян, А.З. Кесян и др. //Российски^, биотерапевтический журнал. 2010. - № 2. - Т. 9. - С. 59.

16. Сураева, Н.М. Получение трансгенных кур и геном гранулоцлТарНО го колоние-стимулирующего фактора,человека / Н.М. Сураева, В.В. 1У1арти-росян, А.З. Кесян и др. //Российский биотерапевтический журнал. — 20ю jsjo 2.-Т. 9.-С. 60.

17. Arnosti, D.N. Analysis and function of transcriptional regulatory elements: Insights from Drosophila / D.N. Arnosti // Annu. Rev. Ent. — 2003 — Vol. 48.-P. 579-602.

18. Arnosti, D.N. Design and function of transcriptional switches in Drosophila / D.N. Arnosti // Insect Biochem. Mol. Biol. 2002. - Vol. 32(Ю) p 1257-1273.

19. Arnosti, D.N. The eve stripe 2 enhancer employs multiple modes of transcriptional synergy / D.N. Arnosti, S. Barolo, M. Levine, et al. // Development- 1996. Vol. 122. - P. 205-214.

20. Bon, Chul Koo. Production of germline transgenic chickens expressing enhanced green fluorescent protein using a MoMLV-based retrovirus vector / Bon Chul Koo, Mo Sun Kwon, Bok Ryul Choi // The FASEB Journal. 2006. - Vol.20.-P. 2251-2260.

21. Bosselman, R.A. Germline transmission of exogenous genes in the chicken / R.A. Bosselman, R.Y. Hsu, T. Boggs, et al. // Science. 1989, Vol. 243. -P. 533-535.

22. Brackett, B.G. Uptake of heterologous genom by mammalian spermatozoa and its transfer to ova through fertilization / B.G. Brackett, W. Baranska, W. Sawicki, et al.// proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1971. - Vol. 68. - P. 353-355.

23. Chang, I.K. Simple method for isolation of primordial germ cells from chick embryos / I.K. Chang, A. Tajima; Y. Yasuda, et al. //Cell Biol. Int. Rep. -1992.- Vol. 16.-P. 853-857.

24. Chang, K. Effective generation of transgenic pigs and mice by linker based sperm-mediated gene transfer / K. Chang, J. Qian, M.S. Jiang, et al. //BMC Biotechnol. -2002. Vol. 2. - P. 5-10.

25. Chen, T.T. "Gene-spliced" fish experiments / T.T. Chen, D.A. Powers, RA. Dunham // Science. 1991% - Vol. 8. - P. 779.

26. Clark, A.J. Gene targeting in livestock: a preview / A.J. Clark, S. Burl, C. Denning, et al. // Transgenic Research. 2000. - Vol. 9. - P. 263-275.

27. Cohen, G.N. Remplacement total de la methionine par la selenomethionine dans les proteines d'E. coli. / G.N. Cohen, and D.B. Cowie // C. R. Acad. Sci. 1973. - Vol. 244. - P. 680-683.

28. Current Protocols in molecular biology / Ed. Ausdel F. M., Brent R. // Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, 1987.

29. Dyck, M.K. Making recombinant proteins in animals—different systems, different applications / M.K. Dyck, D. Lacroix, F. Porhier, et al. // Trends Biotechnol. -2003-Vol. 21.-P. 394-399.

30. Ebara, F. Reproductive characteristics of transgenic (TG) chickens carrying an exogenous gene / F. Ebara and N. Fujihara // Asian J. Androl. 1999. -Vol. l.-P. 139-144.

31. Eguma, K. In Vivo transfer of foreigen DNA into primordial germ cells (PGCs) of chicken embryos / K. Eguma, T. Soh, M. Hattori, et al. // Transgenic Research 1999. - Vol. 7. - P. 520-523.

32. Evans, M. G. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos / M. G.Evans, M. H. Kaufman // Nature. 1981. - Vol. 292. - P. 154156.

33. Eyal-Giladi, H. From cleavage to primitive steak formation: a complementary normal table and a new look at the first stages of the development of the chick / H. Eyal-Giladi and S. Kochav // I. General morphology. Dev. Biol. -1976.-Vol. 49.-P. 321-337.

34. Fraser, R.A. Efficient incorporation of transfected blastodermal cells into chimeric chiken embryos / R.A. Fraser, R.S. Carsience, M.F. Clark, et al. // Int. J. Dev. Biol. 1993. - Vol. 37. - P. 381.

35. Frumkin, A. A chicken caudal homologue, CHox-cad, is expressed in the epiblast with posterior localization and in the early endodermal lineage / A. Frumkin, Z. Rangini, A. Ben-Yehuda, et al. // Development. 1991. - Vol. 112(1). -P. 207-219.

36. Fuijmoto, T. The origin, migration and morphology of the primordial germ cells in the chick embryo / T. Fuijmoto, A. Ukeshima and R. Kiyofaji // Anat. Rec. 1976. - Vol. 185 - P. 139.

37. Gagne, M. The use of electroporated bovine spermatozoa to transfer fo DNA into oocytes / M. Gagne, F. Pothier, M.A. // Sirard Methods Mol. Biol. -1995.-Vol. 48.-P. 161-166.

38. Gagné, M.B. Electroporation of bovine spermatozoa to carry foreign DNA in oocytes / M.B. Gagné, F. Pothier, M.A. Sirard // Mol Reprod Dev. -1991.-Vol. 29.-P. 6-15.

39. Gandolfi, F. Sperm-mediated transgenesis / F. Gandolfi // Theriogenol. -1989-Vol.53.-P. 127-137.

40. Gandolfi, F. Stimulation of early embryonic development in the sheep by co-culture with oviduct cells / F. Gandolfi and R.M. Moor // J.Reprod. Fertil. -2000.-Vol. 81.-P. 23-28.

41. Gordon, J.W. Genetic transformation of mouse embryos by microinjections of purified DNA / J.W. Gordon, G.A. Scangos, D.J. Plotkin, et al. // Proc. Natl. Acad. USA. 1980. - Vol. 77. - P. 7380-7384.

42. Han, J.Y. Production of germline chimeras by transfer of chicken gonadal primordial germ cells maintained in vitro for an extended period / J.Y. Han, T.S. Park, Y.H. Hong, et al. // Theriogenology. 2002. - Vol. 58. - P. 15311539.

43. Han, J.Y. Gene transfer by manipulation of primordial germ cells (PGCs)iin the chicken / J.Y. Han, R.N. Shoffner and K.S. Guise // As.-Aus. J. Anim. Sci. -1994. Vol. 7. - P. 427-434.

44. Harel-Markowitz, E. Use of Sperm Plasmid DNA Lipofection Combined with REMI (Restriction Enzyme-Mediated Insertion) for Production of TransgenicJi; Chickens Expressing eGFP (Enhanced* Green Fluorescent Protein) or Human

45. Follicle-Stimulating Hormone/ E. Harel-Markowitz, M. Gurevich, L.S. Shore, et al. // Biology of Reproduction. 2009. - Vol. 80. - P. 1046-1052.

46. Hong, Y.H. Improved transfection efficiency^ of chicken gonadal primordial germ cells for the production of transgenic poultry / Y.H.Hong, Y.K. Moon, D.K. Jeong, et al. // Transgenic Research. 1998. - Vol. 7. - P. 247-252.

47. Houdebine, L.M. The methods to generate transgenic animals and to control transgene expression / L.M. Houdebine // J. Biotechnol. — 2002—Vol. 98 -P. 145-160.

48. Ivarie, R. Avian transgenesis: progress toward the promise / R. Ivarie // Trends in Biotechnol. 2003. - Vol. 21. - P. 14-19.

49. Jefferies, H. B. Elongation factor-1 alpha mRNA is selectively translatedfol-lowing mitogenic stimulation / H. B. Jefferies, and G. Thomas // J. Biol. Chem. 1994. - Vol. 269. - P. 4367-4372.

50. Jonak, J. Sperm-mediated preparation of transgenic Xenopus laevis and transgenic DNA to the next generation / J. Jonak // Mol. Repr. Dev. — 2000. — Vol. 56.-P. 298-300.

51. Khoo, Y.W. Sperm-mediated gene transfer studies on zebrafish in Singapore / Y.W. Khoo // Mol. Reprod. Dev. 2000. - Vol. 75. - P. 278 - 280.

52. Lavitrano, M. Sperm cells as vectors for introducing foreign DNA into eggs Genetic transformation of mice / M. Lavitrano, A. Camaioni, V.M. Fazio, et al. // Cell. 1989. - Vol. 57. - P. 717-723.

53. Lavitrano, M. Sperm-mediated gene transfer: Production of pigs transgenic for a human regulator of complement activation / M. Lavitrano, M. Forni, V. Varzi, et-al. // Transplant. Proc. 1997. - Vol. 29. - P. 3508 - 3509.

54. Lis, J T. New heat shock puffs and p-galactosidase activity resulting form transformation of Drosophila with, an hsp 70-lacZ hybrid gene / J T. Lis, J. A. Simon, and C. A. Sutton // Cell. 1983. - Vol. 35. - P. 403^10.

55. Ma S Jevnikar, A.M. Transgenic rise for allergy immunotherapy / A.M. Ma S. Jevnikar // Proc. Natl Acad Sci. 2003. - Vol. 23. - P. 559-65.

56. Maione, B. Sperm-mediated' gene transfer in mice / B. Maione, M. Lavitrano, C. Spadafora, et al. // Mol. Reprod. Dev. 1998. - Vol. 50. - P. 406409.

57. Markaki, M. Stable expression of human Growth Hormone over 50 generation in transgenic insect larvae / M. Markaki, D. Drabek, I. Livadaras, et al. // Transgenic Res. 2007.- Vol. 16. - P. 99 - 107.

58. Martin, G. R. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro / G. R. Martin, M. J. Evans // Proc Natl Acad Sci USA. 1975. V. 72. № 4. P. 1441-1445.

59. Mather-Love, C. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expressions in early chicken embryo in ovo / C. Mather-Love, B.S.

60. Heyer, R. Bradshaw, et al. // Spring Harbor, New York. 1972. - P. 352-355.

61. Mozdziak, P.E. Development of transgenic chickens expressing bacterial P-galactosidase / P.E. Mozdziak, S. Borwornpinyo, D.W. McCoy, et al. // Developmental Dynamics. — 2003 — Vol. 226. — P. 439 — 445.

62. Muller, F. Introducing foreign genes into fish eggs with electroporated sperm as a carrier / F. Muller, Z. Ivies, F. Erdelyi, et al. // Mol Mar Biol Biotechnol. 1992. - Vol. Aug-Oct; 1(4-5). - P. 276-81.

63. Naito, M. Embryonic expression of beta-actin-lacz domestic chicken / M. Naito, K. Agata, K. Otsuka, et al. // Theriogenology. — 1993. — Vol. 40. — P. 509 -519.

64. Naito, M. Introduction of exogenous DNA into somatic and germ cells of chickens by microinjection into the germinal disc of fertilized ova / M. Naito, E. Sasaki, M. Ohtaki, et al.// Mob Reprod: Dev. 1994. - Vol. 37. - P. 167-171.

65. Naito, M. Production of germline chimeric chickens, with high transmission rate of donor-derived gametes, produced by transfer of primordial germ cells / M. Naito, A. Tajima and T. Kuwana // Mol. Reprod. Dev. 1994. -Vol. 39.-P. 153-161.

66. Naito, M. Efficient transfection of chicken blastoderms in vivo by lipofection and electroporation using green fluorescent protein- gene as a marker / M. Naito, A. Sano, T. Tagami, et al. // Anim. Sci. J. 2000. - Vol. 71(4). - P. 377 -385.

67. Naito, M. Effect of soft X-ray irradiation on the migratory ability of primordial germ cells in chickens / M. Naito, T. Harumi, T. Minematsu, et al. // British Poultry Science. 2007. - Vol. 48. - P. 121-126.

68. Nakanishi, A. Gene transfer in the chicken by sperm-mediated methods /

69. A. Nakanishi and A. Iritani // Mol. Repr. Dev. 1993. - Vol. 36. - P. 258 - 261.

70. Nieukoop, P.D. Primordial germ cells in the chordates: embryogenesis and phylogenesis / P.D. Nieukoop and L.A. Sutasurya // Cambridge University Press. 1979.

71. Ono, T. Transfer of male or female primordial germ cells of quail into chicks embryonic gonads / T. Ono, R. Yokoi and H. Aoyama // Exp. Anim. -1996. Vol. 45. - P. 347 - 352.

72. Pain, B. Chicken embryonic stem cells and transgenic strategies / B. Pain, P. Chenevier, J. Samarut // Cells Tissues Organs. 1999. - Vol. 165(3-4) - P. 212-219.

73. Paldi, A. cisEffect of lacZ sequences in transgenic mice / A. Paldi, L. Deltour and J. Jami // Transgenic Res. 1993. - Vol. 2. - P. 325-329.

74. Palmiter, R.D. Heterologous introns can enchance expression of transgenes in mice / R.D. Palmiter, E.P. Sandgren, M.R. Avarbock, et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991. - Vol. 88. - P. 478-482.

75. Park, T.S. Derivation and characterization of pluripotent embryonic germ cells in chicken / T.S. Park and J.Y. Han // Molecular Reproduction and development. 2000. - Vol. 56. - P. 475-482.

76. Peshon, J J., Spermatid-specific expression of protamine 1 in transgenic mice / J.J. Peshon, R.R. Behringer // Proc. Acad. Sci. 1987. - USA. - Vol. 84. -P. 5316-5319.

77. Peltola, H. The elimination of indigenous measles, mumps and rubella from Finland by a 12-year, two-dose vaccination program / H. Peltola, O.P. Heinonen, M. Valle, et al. //New Engl J Med. 1994. - Vol. 331. -P. 1397-402.

78. Petitte, J.N. Producing of somatic and germline chimeras in the chicken by transfer of early blastodermal cells / J.N. Petitte, M.E. Clark, G. Liu, et al. // Development. 1990. - Vol. 12. - P. 185-189.

79. Petitte, J.N. Accessing the genome of the chicken using germline chimeras. In Manipulation of the Avian Genome / J.N. Petitte, C.L. Brazolot, M.E.

80. Clark, et al. // CRC Press Inc. 1993. - P. 81-102.

81. Pettite, J.N. Growth factors during early event in avian embryo development / J.N. Petitte // J.Poult. Sci. 2002. - Vol.39, №4. - P. 205-228.

82. Petitte, J.N. Avian pluripotent stem cells / J.N. Petitte, G. Liu, Z. Yang // Mechanisms of Development. 2004. - Vol. 121. - P. 1159-1168.

83. Prasher, D.C. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein / D.C. Prasher, V.C. Eckenrode, W.W. Ward // Gene. 1992. -Vol. 111.-P.229-233.

84. Prasher, D.C. Nucleoside phosphotransferase from barley. Characterization and evidence for ping pong kinetics involving phosphoryl enzyme / D.C. Prasher, M.C. Carr, D.H. Ives, et al. // J. Biol. Chem. 1982. - Vol. 257(9).-P. 4931-4939.

85. Resnick, J: L. Long-term proliferation of mouse primordial germ cells in culture / J.L. Resnick, L.S. Bixler, L. Cheng, et al. // Nature. 1992. - Vol. 292. -P. 550-551.

86. Rieth, A. Electroporation of bovine spermatozoa to carry DNA containing highly repetitive sequences into oocytes and detection of homologous recombination events / A. Rieth, F. Pothier, M.A. Sirard.// Mol. Reprod. Dev. -2000. Vol. 57(4). - P. 338-345.

87. Rottmann, O.J. Liposome mediated gene transfer via spermatozoa into avian egg cells / O.J. Rottmann, R. Antes, P. Hoefer, et al.// J. Anim. Breed. Gen. -1992.-Vol. 109.-P. 64-70.

88. Royer, C. Biosynthesis and cocoonexport of recombinant globular protein in transgenic silkworms / C. Royer, A. Jalabert, M. Da Rocha, et al. // Transgenic Res. 2005. - Vol. 14. — P. 463 - 472.

89. Salter, D.W. Gene insertion into the chick germline by retroviruses / D.W. Salter, EJ. Smith, S.H. Hughes, et al. // Polt. Sei. 1986. - Vol. 65. - P. 1445-1458.

90. Shemesh, M. Gene integration into bovine sperm genome and its expression in transgenic offspring / M. Shemesh, M. Gurevich, E. Harel-Markowitz, et al. // Mol. Reprod. Dev. 2000. - Vol. 56. - P. 306-308.

91. Shyu, A.B. The double lives of shuttling mRNA binding proteins / A.B. Shyu and M.F. Wilkinson // Cell. 2000. - Vol. 102. - P. 135-138.

92. Simkiss, K. Transfer of primordial germ cell DNA between embryos / K. Simkiss, K. Rowlett, N. Bumstead, et al.// Protoplasma. 1989. - Vol. 151. - P. 164-166.

93. Simon, G. Lillico. Transgenic chickens as bioreactors for protein-based drugs / Simon G. Lillico., Michael J. McGrew., Adrian Sherman, et al.// Drug discovery today. 2005. - Vol.10. - P. 191 - 196.

94. Tang, X. Effects of dehydroepiandrosterone (DHEA) on hepatic lipid metabolism parameters and lipogenic gene mRNA expression in broiler chickens / X. Tang, H. Ma, S. Zou, W. Chen. // Lipids. 2007. - Vol. 42. - P. 1025-1033.

95. Tajima, A. Study on the concentration of circulating primordial germ cells (cPGS) in early chick embryos / A. Tajima, H. Hayashi, A. Kamizumi, et al. // J. Exp. Zool. 1999. - Vol. 280. - P. 265-267.

96. Tajima, A. Producing of germline chimeras by transferof primordial germ cells in the domestic chicken (Gallus domesticus) / A. Tajima, M. Naito, Y. Yasuda, et al. // Theriogenology. 1993. - Vol.40(3). - P. 509-19.

97. Vick, L.E. Transgenic birds from transformed primordial germ cells / L.E. Vick, L. Ying and K. Simkiss // Proc. R. Soc. Lond. S.B. 1993. - Vol. 251. -P. 179-182.

98. Wang, Y. Progress toward the culture and transformation of chicken blastodermal cells / Y. Wang, C.F. Brooks, S.A. Jones, et al. // Stem Cells. — 2006. -Vol. 24.-P. 1638-1645.

99. West, A.G Insulators: many functions, many mechanisms / A.G. West, M. Gaszner, G. Felsenfeld // Genes Dev. 2002: - Vol. 16. - P. 271-288.

100. Wu, Z. Transient transgene* transmission to piglets by intrauterine insemination of spermatozoa incubated with DNA fragments / Z. Wu, Z. Li, J. Yang // Mol Reprod Dev. 2008. - Vol: 75(1). - P. 26-32.

101. Yasuda, Y. A method to obtain avian germline chimeras using isolated primordial germ cells / Y. Yasuda; A. Tajima, T. Fujimoto, et al. // J. Repr. Fert. — 1992. Vol. 96. - P. 521-528.

102. Yonezawa, T. Detection of transgene in progeny at different developmental stages following testis-mediated gene transfer / T. Yonezawa, Y. Furuhata, K. Hirabayashi, et al. // Mol Reprod Dev. 2001. - Vol. 60(2). - P. 196201.

103. Young, W.S. In situ hybridization and Northen analyses of the expression of protein kinase C genes oligodeoxyribonucleotide probes / W.S. Young // Focus. -1991.-Vol. 13.-P. 46-49.

104. Zhan, Y. Predominant transgene expression in exocrine pancreas directedby the CMV promoter / Y. Zhan, J.L. Brady, A. M. Johnston, et al. II DNA Cell. Biol. 2000. - Vol. 19. - P. 639-645.

105. Zhu, L. Production of monoclonal antibody in eggs of chimeric chicken / L. Zhu, van de M.C. Lavoir, P. Leighton, et al.// Nat. Biotechnol. — 2005. — Vol. 23.-P. 1159-1169.