Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение ES-подобных эмбриональных клеток сельскохозяйственных животных

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Получение ES-подобных эмбриональных клеток сельскохозяйственных животных"

б им

- Г) ДПР ШЗ

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЖИВОТНОВОДСТВА (ВИЖ)

На правах рукописи УДК 573.086.83.

Васильева Светлана Геннадиевна

ПОЛУЧЕНИЕ Е5-ПОДОБНЫХ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ КЛЕТОК СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

03.00.13. Физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

п. Дубрсвшш Московской области . 1993

Работа выполнена в отделе биотехнологии Всероссийского научно-исследовательского института животноводства.

Научный руководитель : академик РАСХК Л.К. Эрнст

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Заслуженный деятель науки

Российской Федерации ; Л.П. Дьяконов

доктор биологических наук, профессор Н.И. Сергеев

Ведущее учреждение - Московская ветеринарная академия им. К.И. Скрябина , ,

Защита состоится " Ж-т» ИИ^Яи 1993 г> в часов

на заседании Специализированного совета Д.020.16.02. при Всероссийском научно-исследовательском институте

животноводства.

/

Адрес института: Московская обл.. Подольский р-н, п. Дубровицы С диссертацией мояно ознакомиться в библиотеке ВИИа.

Автореферат разослан "... " г-1993 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат биологических наук

И.И. Шмыгин

- 1 -

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ,

Актуальность теми. Эмбриональные стволовые ( ES ) клетки млекопитающих - это полученные из эмбрионов млекопитающих недетерминированные п.чюрипотентиые клетки. ES клетки могут быть получены из эмбрионов на стадли бластоцисты. На этой стадии эмбрион представлен двумя типами клеток - клетками трофэктодермы, обладающими ограниченными способностями к развитию, и плюрипотентными клетками внутренней клеточной массы ( ВКМ ), дающими кг^лэ всем типам дифференцированных клеток взрослого организма, включая клетки зародышевого пути. Клетки ВКМ и являются источником получения ES клеток. ES-клетки обладают способностью нормально пролиферировать при соединении с клетками эмбриобласта нормального эмбриона при создании агрегационных или инъекционных химер. При этом полученные химеры проявляют следующие черты: а) деля полученных химер является очень высокой; б) степень участия ES клеток в формировании химерного организма часто превышает 50%; в) химеризм обычно.является экстенсивным и обычно затрагивает все органы химерных животных. Еще одним существенным свойством ES-клеток является их высокая дифференцирозоч-ная активность в условиях In vivo и in vitro.

В течение более чем десятилетия ES клетки лабораторных аивотных ( мышей ) чрезвычайно широко использовали в качестве модели изучения эмбриогенеза. В последние несколько лет был опубликован ряд работ по генетической трансформации мышиных ES клеткок и получению химерных трансгенных животных. Оказалось, что инъецированные в полость бластоцисты генетически трансформированные клетки колонизируют половые валики, а введенные гены стабильно передаются от клеточной линии з

химерные ткани и через клетки зародышевого пути следующему поколению г GoEsler et al., 1989; Robertson. 1991; Schwartzberg et al., 1939; Thompson et al., 1939 ). Последнее обстоятельство открывает перспективу разработки новых подходов к получению трансгенных сельскохозяйственных кивот-ных. Перенос генов,, опосредованный генетически трансформированными ES клетками имеет ряд преимуществ, особенно в отношении сельскохозяйственных животных. Генетически трансформированные ES клетки мокно подвергать скринингу по критериям, наилучшим способом удовлетворяющим требованиям изучаемой экспериментальной проблемы. Целостность конструкции, введенной в ES клетки, всегда, может быть проверена перед инъекцией клеток в бластоцисту. Использование ES-клеточных линий создает возможность воспроизведения условий эксперимента, что не мояег быть достигнуто при использовании других мотидсг. трансгенеза.

Все выше излояенное пробудило интерес к получению ES клеток сельскохозяйственных нивотных. Однако вплоть до настоящего времени ие удалось■получить ES клетки сельскохозяйственных животных.

Цель и задачи исследований. Целью нашей работы являлось выделение, идентификация и поддержание в культуре эмбриональных стволовых клеток из эмбрионов сельскохозяйственных нивотных. "

Б соответствии с этим решались следующие задачи:

1. определить стадию предимплантационного развития эмб-

рионов кандого ид используемых ' видов сельскохозяйственных

животных, наилучшим образом способствующую достижении указанной цели;

2. подобрать такие условия культивирования 1г. vitro эмбрионов сельскохозяйственных животных, которые сделали бы возможным получен« и поддержание в культуре ES клеток;

3. отработать различные метода получения ES клеток;

4. идентифицировать полученные эмбриональные клетки сельскохозяйственных животных.

Научная новизна. Научная новизна работы заключается в том, что впервые в России были получены ES-подобные клетки коров, поддерживаемые в культуре в течение 3-х пассажей. Показана возможность использования фидерного, слоя клеток гра-нулезы для получения и поддержания в культуре ЕЗ-подобных клеток коров. Получены данные, подтверждающие наличие в раннем эмбриональном предимплантационном развитии свиней периода покоящегося эмбрионального диска, в течение которого клетки эмбриобласта находятся в метаболически неактивном состоянии.

Практическая значимость работы. Практическая значимость-работы состоит в том, что в процессе экспериментов были разработаны методические рекомендации по выбору условий культивирования In vitro эмбрионов коров и свиней, необходимых для получения эмбриональных стволовых клеток, и по выбору стадия раннего развития эмбрионов коров и свиней. Кроме того, был апробирован иммунохирургический способ ( Solter и Knowles, 1975 ) выделения эмбриобластов у эмбрионов свиней.

Реализация результатов исследований. Полученные результаты будут использованы при составлении методики получения = ES клеток сельскохозяйственных животных.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и получили положительную оценку:

- на III Всесоюзном совещании "Культивирование клеток животных и человека". Пущино. - февраль 1990 г.

- на Всесоюзном совещании "Проблема развития биотехнологии в вивогноводстве". - Дубровнцы. - ВИЙ. - август 1990г.

- На Всепольской конференции "Genetyka 2000". Краков ( Польша ). - сентябрь 1992 г,

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы, одна из которых на английском языке.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена не. 94 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц, 21 рисунок. Список литературы включает 113 названий, в том числе 109 иностранных авторов.

II; Материалы и методы.

Научные исследования были проведены в 19B8-198S- гг. в лаборатории клеточной инженерии отдела биотехнологии ВИЙа. В исследованиях были использованы интактные, заморокенные-от-таяные эмбрионы коров, эмбрионы коров после оплодотворения и развития in vitro, эмбрионы свиней ( порода Крупная Белая ) и эмбрионы мышей (. линия BALB/C ) на разных стадиях предимп-лантационного развития ( Табл. В 1 ).

2.1. Источники эмбрионов.

Свежие интактные и замороженные ( 1,4 й глицерин ) эмбрионы коров в возрасте 5-7 дней после осеменения были предоставлены центром трансплантации эмбрионов ВНИИ животноводства ( Дубровицы ) и Украинским НИИ лесостепи и полесья (Харьков ). Экспандированные бластоцисты коров, развивающие-

Табл. N 1.

Стадии развития эмбрионов, использовавшихся в экспериментах

Стадия развития I коровы 1 свиньи ! мыши ! всего

поздняя морула 101 23 15 124

ранняя бластоциста 5 17 - 22

средняя бластоциста 10 15 12 37

поздняя бластоциста 18 13 16 47

экспандированная

бластоциста 15 9 . - 24

вылупившаяся

бластоциста 10 — 10

Всего: < ГО 77 43 ■ 279

ся в течение 13 дней условиях In vitro после m vitro дозревания и оплодотворения, были предоставлены ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии ( Москва ).

Эмбрионы свиней вымывали из рогов матки- естественно спаренных или искуственно осемененные не суперовулнрованных маток на 5-8 день после спаривания ( день 1 - день искусственного осеменения или естественного спаривания в день обнаружения охоты ). Вымывание эмбрионов проводили в экспериментальном хозяйстве ВИЖа Кленово-Чегодаево. Для извлечения и отмывания эмбрионов свиней использовали фосфатно-солевой буфер в модификации Дульбекко (PBS, Flow lab., England ), обогащенный \% плодной сывороткой теленка (FCS, Flow lab., England ) и \% р-ром антибиотик/гнтимикотик ( Signa, USA ).

Беременных самок мышей, полученных из Института Медицинской генетики ( Москва ), забивали на 3-3,5 день после спаривания.. Рога матки индивидуально вырезали в местах уте-ро-тубального соединения бифуркации. Отсепарированные рога матки промывали средой ШЕМ ( Flow lab., England ), обогащенной 5% сывороткой новорожденного теленка ( ÎÎCS, Flow

lab., England)

2.2. Культуральные среды.

Для тканевых культур, а также культивирования интактных эмбрионов, эмбриобластов или кластеров эмбриобластных клеток и ES-подобных клеток в ¿зависимости от вида животных использовали следующие среды: PBS, обогащенный FCS; DMEM с добавлением FCS и MCS; альфа-ЩЛ и альфа-МШ с добавлением среды, кондиционированной BRL-клетками. Основной средой для культивирования эмбрионального материала служила среда альфа-МШ ( Glbco, England ) с высоким содержанием глюкозы ( 4500 мг/л).

о

Перед использованием жидкую среду обогащали 10% FCS, 10% NCS, 1 мМ 1-глютамиком ( Glbco, England ), 1 мМ несущественными аминокислотами ( Serva, Germany ), 0,1 мМ 2-меркап-тоэтанолом ( Serva, Germany ), пенициллином ( 50 ед./мл ), стрептомицином ( 50мкг/мл .) и амфотерицином В ( 2 мкг/мл, Glbco, England ). ■ -■

В некоторых случаях культивирование эмбрионального материала проводили в среде альфа-MEM с добавлением среды аль-фа-МЕМ, кондиционированной. BRL-клетками. Среда альфа-МЕМ, кондиционированная BRL-клетками, была использована для получения ES-клеток мышей и готовилась по прописи, предложенной Gossler .( 1989 ). Клетки BEL были получены из Institut íur Tierzucht'und Tierverhalten ( Marlensee, Germany ).

2.3." Манипуляции с эмбрионами свиней.

2.3.1. Иммунохирургическое выделение и культивирование эмбриобластов эмбрионов свиней.

Использованные для культивирования ВКМ эмбрионов свиней были получены иммунохирургическим методом ( Solter and

Knowles, 1975 ).

Лнтисыворотка била приготовлена посредством иммунизации кроликов клетками селезенки свиньи. В качестве источника комплемента использовали лиофилизированную сыворотку морской свинки ( Институт вакцин и сывороток, Пермь ). Для приготовления комплемента в одну ампулу лиоЛшлизированной сыворотки добавляли 1 мл р-ра PBS.

Денудированные эмбрионы помещали в капля разбавленной средой (1:8) кнактивирсрппчой антисыворотки на Г час при 37 С, После чего отмытые эмбрионы на 1 час помещали в отдельные капли комплемента, разбавленого в отношении 1:8 культуральной средой. Удаление лизированных клеток трофоб-ласта проводили посредством аккуратного пилотирования. 2:<б-риобласты свиней индивидуально помещали в .капли р-ра С, трипсин - 0,04% ЭДТА для того, чтобы дисагрегкровать эмбриональные клетки. После чего клетки культивировали в чашках Петри, покрытых 0,1% желатином, на разных типах фидеров.

2.3.2..Культивирование интактных эмбрионов свиней.

Интактные эмбрионы свиней на стадии иорулы или бласто-цисты культивировали в средах альфа-ИЕМ, альфа-МЕМ +• 50% BRL кондиционированной среды или PBS +. 20% FCS. Эмбрионы культивировали на фидерном слое клеток гранулезы или фидерном слое клеток ШН ЗТЗ.'.

2.3.4/ Выделение и культивирование кластеров зкбрио-. нальных клеток свиней.

Эмбрионы после ферментативного удаления zona pelluclda в течение 10-15 мин дерзали в р-ре 0,25% р-ра трипсина ( Dllco ), после чего их подвергали механическому разделению

па кластеры эмбриональных клеток посредством пипетирования их через пипетку малого диаметра (20-30 мкм ). Эмбриональные кластеры, полученные таким образом, культивировали в среде альфа-MEM или альфа-MEM -t- 50% BEL кондиционированной среды на фидере клеток гранулезы или NIH ЗТЗ клеток.

* 2.4. Манипуляции с эмбрионами коров.

Интактные или оттаянные эмбрионы коров на различных стадиях развития культивировали в культуральной среде в течение 24-72 часов в зависимости от стадии развития до спонтанного вылупления из zona pelluclda. Спонтанно вышедшим из прозрачной оболочки эмбрионам позволяли прикрепляться на дно чашек

а

Петри с различными типами фидерных слоев. Вылупившиеся блас-тоцисты прикреплялись к фидерному слою в течение 72-96 часов посредством разрастания трофобласта (trophoblast outgrowth). Разрастания бласгодисг оставляли ненарушенными в течение 4-5 дней продолжительного культивирования.

-. ■ Кластеры клеток эмбриобластного происхождения .изолировали, осторожно соскабливая;ИХ;с бласгоцистных разрастаний, дисагрегировали, пипетируя их в р-ре 0,25% трипсин-ЭДТА с помощью пипетки малого диаметра с оплавленным кончиком. Отдельные клетки, полученные после трипсинизации, переносили в чашки Петри содержащие.свежую кульгуральную среду и фидерный слой ( пассаж 0 ). -

Колонии клеток, образовавшиеся в течение 10-14 дней после- первичной' дисагрегации, селектировали, и последующей дисагрегации подвергали только те колсь.ги клеток, которые имели ES-подобнз® морфологию клеток. Дисагрегированные клетки помещали на свежий фидерный слой.

- 9 -

2.5. Манипуляции с эмбрионами мыирй.

Интактные эмбрионы мышей на стадии морулы или бласто-цисты культивировали в среде DKEM или альфа-MEM. Спонтанно вылупившиеся в течение 24-36 часов бластонисты прикреплялись к фидерному слою путем разрастания трофобласта. Разрастания благтоцнсг оставляли ненарушенными в течение 5 дней культивирования.

Сгустки клеток эмбриобластного происхождения аккуратно отделили от слоя клеток трофобласта и после триленнизацин 0,25% р-ром трнпсин-ЭДТЛ полученные плетки переносили на свежий фидерный слой и культивировали. Последующие операции проводили также как описано в разделе 2Л.

III. Результаты исследовании.

Все эмбрионы после одного дня культивирования подвергали оценке на качество эмбрионов, и в дальнейших экспериментах по получению ES клеток были использованы эмбрионы, проявившие хорошее или отличное качество.

Фидерные слои готовили из первичных культур эпителия яйцеводов и матки свиней, фибробласгов матки свиней, клеток гранулезы свиней, а также из первичной культуры эмбриональных фибробластов мыши и клеток HIH ЗТЗ.

Клетки фидерного слоя были использованы двояко: а) для совместного культивирования с эмбрионами на ранних стадиях развития; б) для культивирования эмбриональных клеток и эмбриональных стволовых клеток,

3.1. Манипуляции с эмбрионами корон.

Все заморокеннне-оттаяшше эмбрионы, сюлышнстьс из которых были на стадии поздней корулч и все in vitro развивав-

шиегя эмбрионы не имели хорошего или от личного качества после одного дня культивирования и были исключены из дальнейших экспериментов.

Свекле кнтактные In vivo развивающиеся эмбрионы на различных стадиях развития»культивировали в присутствии различных типов фидерных.клеток. Приблизительно половина из культивируемых эмбрионов ( 463» ) развивалась в культуре до стадии экспандированной бластоцисты в течение 2-3 дней и спонтанно вылуплялась из zona pelluclda С Табл. К 2 ). Уровень бластоцист, развивающихся до стадии экспандированной бластоцисты и спонтанно вылупляющихся из zona pelluclda, варьировал в зависимости от стадии развития, на которой начинали культивирование, и составлял около 27% для эмбрионов на стадии поздней морулы и 75% для эмбрионов на стадии поздней бластоцисты.

Значительная часть - спонтанно вылупившихся эмбрионов ( 75% ) прикреплялась к фидерным слоям в течение 1-2 дней после вылупления (,табл. Н 2. ). Тип фидерного слоя не оказывал" существенного влияния 5ва долю прикрепившихся эмбрионов за исключением того случая когда в качестве фидерного слоя использовали фидер NIH ЗТЗ клеток ( табл. fí-З ).

Практически все из прикрепившихся эмбрионов образовывали эмбриональные разрастания, состоящие из отдельных скоплений клеток ВКМ, окруженных гигантскими клетками трофобласта.

После" развития ■ эмбриональных разрастаний в культуре в течение 3-6 дней ВКМ-скопления, состоящие из кластеров округлых клеток, локализованных по периферии эксплантов( рис. 6. .), осторожно изолировали, и пассировали на свежие фидерные слои .того же типа. ВКМ-скопления, происходящие из каждого

Табл. N 2.

Колонии ES-подобных клеток, полученные из свежих ln vivo развивающихся

эмбрионов коров

¡поздняя ¡ бластоцисты i i

¡морула ¡ ранняя ¡ средняя ! поздняя ¡ экспандиро-! ! ! ванная вылупившаяся

Число вылупившихся эмбрионов Число прикрепленных эмбрионов Число эмбрионов, образовавших эмбриональные разрастания Число эмбрионов, образовавших первичные ЕБ-Подобные колонии клеток

Число эмбрионов, -подобные колонии которых культивировали в течение 3 пассавей

12 (44) FT5T 5 (10) 5 (11,3%) 1 (20%) 4 (40%)

5 <11,3%) 1 (20%) 4 (40%)

12 (16) 10 (14) ТТЛ

12 (75%) 8 (57,IX) 6 (85,7%)

10 '•■.>2,5«) 6 (42.9%) б (85,7%)

1 (6,3%) 2 (14,3%) 3 (42,9%)

0 0 3 (42,9%)

О О

О О

; Табл. N 3;

Влияние фидерного'слоя на получение коровьих ЕЗ-Иодобиых колоний клеток

Тип фидерного слоя К-во вылупившихся эмбрионов К-во прикрепленных эмбрионов ¡к-во эмбрионов, образо-|ваввих раз-разрастания !К-во эмбрио- , ¡К-во эмбрионов, ЁБ-¡нов, образовав-- ¡колонии которых ¡них первичные ¡культивировали до 3 ¡колонии ЕБ клеток!пзссажа

0.1* желатин 8 4 •6 .5" 0 0

клетки' гранулезы 10, - 9 • - 9 • ' . , 4 з сзох)

клетки эпителия яйцевода ." • '•

свиньи . 6' ■ " - " '4 , - з. " •- о' '■'.-•. •

клетки эпителия натки свиньи • 5 V \ ; 4. ■'•: о - 0. ,

клетки фибробластов матки

свиньи .5 . 4 ' 4 : ' • 0 . ' о . .'" ""

К1Н ЗТЗ клетки 6 л 2 0 0 •о

клетки эмбриональных фиб-

робластов мыши .•Э 7 7 2

эмбрионч пассировали в индивидуальные чавки. Некоторые из пассированных производных ВКИ-скоплений прикреплялись к фидерному слою и продолжали пролиферировать, давая начало маленьким колониям клеток, становящимися различимыми после 10-14 дней культивирования. В среднем в каждой чайке появлялось от 30 до 45 отдельных колоний -{леток.

Колонии клеток на основе их морфологии классифицировали на несколько типов. Преимущественным типом колоний были колонии клеток трофобластного типа, Колонии, состоящие из круглых плотно упакованных клеток с большим ядром, относительно малым количеством цитоплазмы и четко видимыми ядрып-ками, и растущие как отдельные колонии плоских эпителиально-подобных клеток, которые имели тенденции • к оОразопачиь монослоя, были" идентифицирована нами как колонии ЕБ-псдобных клеток, В среднем в каждой чашке былб идентифицировано о: б до 10 колоний ЕБ-подобных клеток.

Тип фидерного слоя оказывал существенное влияние на развитие ВКМ-производных при культивирований. КЗ-подобные колонии были получены только при использовании в .качестве • фидерного слоя клеток гранулезы свиней или эмбриональных фибробластов мыши.

При пассировании коровьих ЕБ-подобных клеток на свежий фидер клеток гранулезы имело место поддержание их в культуре в течение 3 пассажей без потери фенотипа { табл. КЗ ).

После каждого пассажа некоторая часть клеток спонтанно дифференцировала. Мы наблюдали колонии эпителиально-подобных и фибробластно-подобных клеток, : хсяонии клыок1 дифференцировавшиеся - в гигантские клетки • "трофобласта и агрегаты эпителиально-подобных клеток, культивиросавшиеся

в суспензии. Эти клеточные агрегаты часто формировали эмбриоидные тельца, не прикрепляющиеся к субстрату.

3.2. Манипуляции с эмбрионами свиней.

В экспериментах с эмбрионами свиней было использовано 77 эмбрионов на различных стадиях предимплантациониого развития. Тридцать три эмбриона из этих 77 культивировали в ин-тактной форме при различных условиях культивирования, 8 эмбрионов были использованы с целью изолировать и культивировать эмбриональные кластеры клеток и 36 эмбрионов были использованы для выделения и культивирования ВКМ.

Интактные эмбрионы свиней на различных стадиях предимп-

о

лантационного развития культивировали в среде альфа-МЕМ, альфа-МЕМ + 50% BRL-кондиционированной среды или PBS + 20% FCS. Культивирование проводили в присутствии фидерного слоя клеток, гранулезы или NIH ЗТЗ клеток.

Все культивировавшиеся эмбрионы оказались не в состоянии развиваться при этих условиях. Ни один из них ае развивался до стадии экспандированной бластоцисты, вылуплялся из zona pellucida и прикреплялся к фидерному слою. Более того, при культивировании в среде альфа-МЕМ или альфа-МЕМ + 50% BRL-кондиционированной среды эмбрионы подвергались коллапсу. Это позволяет нам предположить, что используемые условия культивирования не подходят не только для становления ES клеток, "но и для культивирования эмбрионов. .Основным фактором, не способствующим развитию эмбрионов в этих условиях, мы считаем неудачный выбор среды культивирования. Другим фактором, не способствующим получению ES клеток, может быть оказаться неудачно выбранная стадия развития эмбрионов. Весьма вероятно, что для получения ES клеток свиней необхо-

димо использовать эмбрионы на стадиях, существенно более поздних, чей стадии развития, используемые в наших экспериментах. Косвенным образом ваши предположения подтверждаются исследованиями Evans et al. ( 1090 ) и S+roJeK ( 1990 ). В этих исследованиях для получения колоний ES-подобных клеток использовали среду Ш£М и эмбрионы свиней в возрасте 10-12 дней развития ( день 0 - день проявления охоты и покрытия ).

Культивирование кластеров эмбриональных .клеток 'свиней не привело к образованию £~>:т.т)добных колоний клеток". Яекото-рые из мастеров прикреплялись к фидерному слою,, но формировали колонии дифференцированных клеток. Мы были.не в состоя-' нии идентифицировать тип клеточной дифференцирован,', яо пред- . полагаем, что это были колонии трофобласт-подобного типа.

Для выделения свиных эмбриобластов использовали 36 эмбрионов на различных стадиях развития (" Табл. N 4 ).

Как можно видеть .из табл. N4., эмбриобласт ранних бластоцист состоит из 4-5 клеток, средних бластоцист - из 8-10 клеток, поздних бластоцист - из 12-15 клеток и экспан-дированных бластоцист - из 16-18 клеток. Это позволяет нам предположить, что клетки эмбриобласта пролифилируюг очень медленно. Полученные результаты опосредованно подтверждают существование периода, когда эмбриональный диск явчяется метаболически неактивным. Культивирование выделенных эмбриобластов не привело к получению ES-подобных клеток.

3.3. Манипуляции с эмбрионами мышей.

Для получения ES клеток мыией использовали 43 эмбрионов на различных стадиях развития. Тридцать семь.эмбрионов культивировали в интактной форме, а б эмбрионов на стадии позд- , ней бластоцисты культивировали после ферментативного удале-

Табл. N 4.

Число клеток эмбриобласта в эмбрионах свиней на различных стадиях предимплантационного развития

стадия развития j К-во габрионов ] К-во клеток

ранняя бластоциста средняя бластоциста поздняя бластоциста экспзндированная

17 13 4

12-15

8-10

4-5

бластоциста

2

16-18

ния zona pelluclda. Культивирование проводили в среде аль-фа-МЕМ, альфа-MEM + 60% BRL-кондиционированной среды или альфа-MEM + 20% BBL-кондиционированной среды на фидерном слое эмбриональных фибрсбластов мыши, фидерном слое NIH ЗТЗ клеток или без фидерного слоя. В последнем случае дно куль-туральных чашек покрывали 0,1% р-ром желатина.

Все иктактные эмбрионы на стадии средней или поздней

бластоцисты спонтанно вылуплялись из zona pelluclda в течение. 4 дней культивирования, в то время как только 80% интак-тных эмбрионов на стадии поздней морулы спонтанно .вылуплялись из оболочки ( табл. К 5 ).

В среднем 75% интактных эмбрионов и все денудированные эмбрионы прикреплялись к фидерному слою. Ни тип фидерного слоя, ни тип используемой культуральной среды не оказывали влияния на уровень прикрепления ( табл. К 6. и табл. If 7 ).

Практически все из' прикрепленных эмбрионов ( как спонтанно вылупившихся, так и ферментативно денудированных ), культивировавшихся со стадии средней или поздней бластоцисты, образовывали эмбриональные разрастания, в то времт как только половина прикрепленных эмбрионов, культивировавиихся со стадии поздней морулы, образовывали такие структуры. На образование эмбриональных разрастаний ни тип фидерного слоя

Табл. И 5.

Колонии ЕЭ-псдобных клеток, полученные от спонтанно вылупившихся эмбрионов мышей.

¡поздняя¡средняя ¡поздняя ¡морула ¡бластоциста!бластоциста

О (10) • 9 (90%)

К-во вылупившихся эмбрионов 12 (15)12 (12) К-во прикрепленных эмбрионов 8 (53,3%) 10 (83,3%) К-во эмбрионов, образовавших эмбриональные разрастания 4 (26,6%) 8 (66,6%) 8 (80%) К-во эмбрионов, образовавших лервичные колонии ЕБ-подо бных клеток

К-во эмбрионов, образовавших колонии ЕЗ-подо-бных клеток, культиви-вавшиеся в течение 4-х пассажей

О

2 (16,6%) 3 (30%)

О

О

2 (20%)

Табл. N 6.

Влияние фидерного слоя на получение мышинах'ЕБ-подобных клеточных колоний.

Тип фидерного слоя хГ

1

Число прикрепленных эмбрионов Число эмбрионов, образозовавших эмбриональные разрастания • Число эмбрионов, прошедших пассаж

Число эмбрионов, ЕБ-колонии которых культивировали до I пассажа

Число эмбрионов, ЕБ-колонии которых культивировали до IV пассажа

12

8 6 б

3

2

7 5 5

2

О

х) 1 - 0.1% желатин; 2 - клетки эмбриональных фибробластов мыши; 3 - ЮТ ЗТЗ клетки

ни тип культуральной среды не оказывали влияния.

В течение 2-3 дней развития эмбриональных разрастаний в культуре ВКМ-компоненты разрастаний пролиферировали и формировали многослойные структуры, подобные яйцевому цилиндру

8

О

Табл. К ?.

Влияние культуральной среды на получение мышиных Е5-по-.■ добных колоний клеток.

| Тип культуральной»среди х)

! 1 | 2 ! 5

Число эмбрионов, проведших ' : '

пассаж 0 * 8 6 5

Число эмбрирнов, ES-колонпи которых культивировали до

I пассажа 5 0 0

Число эмбрионов, ES-колонии которых культивировали до

IV пассажа 2 0-0

х) 1 - альфа-МЕМ; 2 - alpha-MEM + 60% BRL-кондициониро-ванной среды; 3 - alpha-MEM + 20% BRL-кондиционированной среды

Эти структуры были ° окружены гигантскими клетками трофобласта. На этой стадии развития разрастаний ВКМ-ком-поненты аккуратно изолировали и пассировали ( после дезагрегации трипсином )' на свежий фидер того же типа. Каждый ВКМ-компонент пассировали в' отдельную чашку. Некоторые из ВКМ производных прикреплялись к фидерному слою, продолжали делиться и давали начало маленьким колониям клеток, которые становились видимыми через 2 дня культивирования. В среднем на каждую.чашку образовывалось от 15 до 18 колоний клеток.

Колонии клеток на основе их морфологии классифицировали на несколько типов. Большинство колоний были определены как состоящие из дифференцированных клеток. Колонии, состоящие из малого числа круглых клеток с большим ядром и минимальным количеством цитоплазмы, были охарактеризованы как колонии ЕБ-подобных. клеток.

Колонии КЗ-подобных клеток мышей пассировали на свежие фидерные слои. Часть из них сохраняла стабильный фенотип и росла без видимых признаков дифференцировки. Такие колонии

поддерживзли в культуре. Часть колоний уходили в дифференци-ровку и формировали эмбрисидные тельца.

Ни один из ферментативно денудированных эмбрионов мышей или иктактных эмбрионов на стадии поздней морулы не дали начало образованию ES-подобных колоний и только ограниченное число эмбрионов на стадии средней и поздней бластоцисты (13,6% и 30% соответственно ) были способны генерировать колонии ES-подобных клеток.

Тип фидерного сло.ч практически не оказывал влияния на образование первичных колоний ES-подобных клеток, но тип культуральной среды оказывал заметное влияние на их образование. Все из ES-подобных колоний были получены при культивировании в среде альфа-MEM без добавление $ каком-либо соотношении BRL-кондиционированной среды.

IY. Обсуждение результатов исследований.

Результаты исследований, проведенных нами в выше указанный период времени, позволяют сделать заключение о том, что методические подходы, разработанные для получения мышиных ES клеток, мало применимы для получения ES клеток с.-х. вивот-ных, в особенности свиней. Основной причиной этого является, по-видимому, различия в раннем эмбриональном развитии мышей и копытных животных ( в частности коров и свиней ).

По мнению Evans and Moore ( 1990 ) первое отличие выражается во времени и характере имплантации. У мышей процесс имплантации - это быстрый и инвазивный процесс, протекающий в течение полусуток с момента выхода эмбриона из zona pellucida. У копытных животных имплантация происходит по истечении значительного времени после выхода эмбриона из zona

pellucida и тогда, когда ужо начался процесс гаструляции.

Второе отличие выракается в характере развития ВКМ. У №шей

t

ВКМ представлена в виде компактной плотной массы клеток. У копытных же кивотных клетки ВКМ распологаются упорядоченно в несколько слоев, образуя так называемый эмбриональный диск ( Карлсон," 1933 ). Третье отличие монет выражаться в разной метаболической активности и динамике дробления клеток ВКМ у эмбрионов мышей и эмбрионов копытных кивотных, в частности свиней. У копытных животных клетки ВК.Ч образуют эмбриональный диск, отличающийся низкой метаболической активностью и находящийся в покоящемся состоянии, продолжающемся до начала гаструляции ( Evans and Moore 1990, Evans et al., 1990 ). При выделении ВКМ из эмбрионов свиней нами ( Васильева и др., 1990; Vasllieva et al., 1992 ) были получены эмбриологические данные, косвенным образом подтверждающие наличие облигаторного периода у клеток ВКМ. Оказалось, что в течение 4 суток развития In vivo со стадии ранней бластоцисты ( вымывание эмбрионов на 5 день после искусственного осеменения или естественного спаривания ) до стадии экспандированной бластоцисты ( вымывание эмбрионов на 8 день после искусственного осеменения или естественного спаривания) количество клеток ВКМ увеличилось лишь в 4 раза ( табл. И 4., рис. И 1 ), причем в период развития со стадии средней бластоцисты до стадии экспандированной бластоцисты число клеток ВКМ увеличилось менее чем в 2 раза. Сравнение теоретически возможного числа клеток ВКМ свиней, исчисленного на основе скорости дробления, характерной для клеток ВКМ мышей ( удвоение клеток происходит каждые 11-13 часов ), с фактически имеющимся числом клеток (рис. N 1 ) позволяет охарактеризовать

скорость дробления клеток ВКМ свиней как очень низкую. Это, по напему мнению, является следствием покоящегося состояния ВКМ свиней.

Таким образом, анализ результатов, полученных в наших экспериментах с эмбрионами свиней, позволяет сделать вывод о том, что 1) наки использовались эмбрионы на стадиях, неподходящих для получения ЕБ клеток; 2) ориентация на стадии развития эмбрионов, использующиеся для получения ЕБ клеток июлей, оказалась неолр1 ручной. Для эмбрионов каждого вила с.-х. животных долкна бить найдена своя стадия эмбрионального развития, на которой становится возмогшим получение ЕБ клеток.

При культивировании эмбрионов коров на более поздних стадиях развития были получены следующие результаты. Только 14,3% эмбрионов коров, культивировавшихся со стадии зкепан-днрованной бласгоцпсти, давали начало первичным колония» ЕЗ-подобнцх клеток ( рис. 2 ), которые, однако, не удавалось поддерживать в культуре. Вместе с теи 42,9% эмбрионов, культивировавшихся со стадии, вылупившейся бластоцисты, давали начало первичным колониям ЕБ-подобных клеток ( рис. 2 ), большая часть которых поддерживалась в культуре в течение 3 пассажей без потерн фенотипа.

Анализ эффективности получения колоний ЕБ-подобных клеток позволяет высказать предположение о том, что для получения колоний ЕБ-подобных клеток коров предпочтительно использовать эмбрионы на стадии вылупившейся бластоцисты или на более поздней стадии.

Результаты наших исследований ( Васильева и др., 1990; УаэШеуа а!.. 1992 ) по получению ЕБ-подобних клеток ко-

ров с использованием фидерных слоев различных видов показывают возможность использования фидерного слоя клеток грану-лезы фолликулов свиньи для получения с высокой степенью эффективности коровьих ES-подобных клеток и поддержания их в культуре по крайней мере в течение 3 пассажей.

В наших исследованиях мы не имели возможности провести эксперименты по получению химерных животных с использованием полученных нами ES-подобных клеток коров и мышей с целью подтверждения их плюрипотентности. Однако характеристики полученных нами колоний мышиных и коровьих клеток { сохранение фенотипа ES клеток в течение 3-4 пассажей и их способность образовывать эмбриоидные тельца'( что, по мнению Robertson and Bradley ( 1986 ) и Evans et al., ( 1990 ), является одной из характерных черт колоний ES клеток ) позволяет нам рассматривать колонии клеток, полученные в нашем исследовании, колониями клеток, обладающими характеристиками колоний плюрипотентных клеток.

V. .Выводы.

1. Вяли получены мышиные и коровьи колонии клеток, обладающие характеристиками плюрипотентных клеток и поддерживаемые в культуре в течение 3-4 пассажей.

2. Для получения ES-подобных клеток коров целесообразно использовать эмбрионы на стадии вылупившейся бластоцисты.

3. Фидерный слой клеток гранулезы фолликулов свиней можно использовать для получения и поддержания в культуре коровьих ES-подобных клеток.

. 4-, Получены данные, подтверждающие существование в развитии эмбрионов свиней периода покоящегося эмбрионального

Р-с. 1. ► o'.'j'-rc гп?»о f-íKM b

¿mí.p-jo-nж сЬинбС

Рис. 2. KiTlutcCCrnb HOAVMfMja riOr^WH'.iX KOAC'í.'Cl

СпЬолсЛм* клг ГТ!Лк t-'.-.pcb fJ 3^G'JCUM^^mU ccri СГП С.? iU

• блостou и cmс >Л1Д . блсстмиств • I—■' -¿Аостоцуст^

диска, продолжающегося вплоть до начала гаструляции.

5. Для получения ES-подобных клеток свиней необходимо, видимо, использовать эмбрионы на стадиях, соответствующих Í(-12 дню эмбрионального развития.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Васильева С.Г., Стрельченко Н.С., Шуть '.Е. // Культивирование клеток эпителия матки и яйцевода, фибробластов матки и фолликулярных клеток свиней. В: "Культивирование клеток человека и животных", Тезисы докладов III Всесоюзного совещания, 13-15 февраля 1990, Пущино, с. 77

2. Васильева С.Г., бтрельченко Н.С., Шуть '.Е., Васильев И.М. // Культивирование внутренней клеточной массы пре-димплантационных эмбрионов свиней". В: "Культиви рование клеток человека и животных", Тезисы докладов III Всесоюзного совещания, 13-15 февраля 1990, Пущино, с. 78

3. Васильева С.Г., Стрельченко Н.С., Шуть '.Е.3 Васильев И.К. // Выделение и культивирование внутренней клеточной массы предимплактационных эмбрионов с.-х. животных". В: "Проблемы' развития биотехнологии в животноводстве". Тезисы докладов Всесоюзного научно-технического совещания, .9-10 октября 1990 г., сс. 74-76.

4. Vasllieva S.G., Vaslliev I.M., Strelchénko N.S. // The establlsment oí pig.and bovlne embryonlc stsm cells". In: "Genetyka 2000".. Material/ konferencjl, XI Walny zjazd PTG, Krakow, 10-11 wrzesien 1992, p. 34.