Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ПОЛУЧЕНИЕ ES -ПОДОБНЫХ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ КЛЕТОК СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "ПОЛУЧЕНИЕ ES -ПОДОБНЫХ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ КЛЕТОК СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ"



ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЖИВОТНОВОДСТВА (ВИЖ)

На правах рукописи УДК 573.086.83.

Васильева Светлана Геннадиевна

ПОЛУЧЕНИЕ ЕЯ -ПОДОБНЫХ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ КЛЕТОК СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИЗОТНЫХ

03.00.13. Физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кавднцата биологических наук

п. Дубрсиицы Московской области 1993

Работа выполнена в отделе биотехнологии Всероссийского научно-исследовательского института животноводства.

Научный руководитель : академик РАСХН Л.К. Эрнст

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Заслуженный деятель науки

Российской Федерации * Д.П. Дьяконов

доктор биологических наук, профессор Я.И. Сергеев

Ведущее учреждение - Московская ветеринарная академия им. К.И. Скрябина

Защита состоится "JC^." 1993 г. в часо?

на заседании Специализированного совета Д.020.16.02, - т?-Всероссийском . научно-исследовательском института

вивотноводства.

Адрес института; Московская обл.. Подольский р-н, п. Дубровину С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЖа.

Автореферат разослан " —^осп г.

Учекцй секретарь Специализированного Совета кандидат биологических наук

И.И. Шмыгин

- 1 -

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность тзмы. Эмбриональные стволовые ( 12 ) клетки млекопитаюднх - это полученные из эмбрионов млекопитающие недетерминированные п.чюрипотентные клеткк. ЕЕ клетки могут бить получены иг эмбрионов на стадам бластоцисти. На этой

трофэктодермы, обладающими ограниченными способностями к развитию, к плюрипотентнымн клетками внутренней клеточной массы ( БКН ), дающими F: " :¡ :> всем типам дифференцированных клеток взрослого организма, включая клетки зародиневого пути, Клетки ВКМ и являются источником получения ES клеток. ES-клетки обладает способностью нормально пролиферировать при соединении с клетками эмбриобласта норнэ^ьного эмбриона ори создании агрегационных или инъекционных -химер. При этом полученные химеры проявляют следующие черты: а) деля полученных химер является очень высокой; б) степень участия ES клеток в формировании химерного организма часто превышает 50%; в) химеризм обычно.является экстенсивных и обычно затрагивает все органы химерных животных. Еще одним существенным свойством ES-клеток является их высокая дифференцировоч-нал активность в условиях,in vivo и in vit.ro.

Р течение более'чем десятилетия ES клетки лабораторных животных ( иывей ) чрезвычайно широко использовали в качестве модели изучения эмбриогенеза. В последние несколько лет бал опубликован ряд работ по генетической трансформации мы-еиных ES клеткок и получению хикерных'Трансгенных животных. Оказалось, что инъецированные в полость бласгоцисты гедети-чески трансформированные клетки колонизируют половые валики,

стадии эмбрион представлен двумя типами клеток - клетками

tacx. '.VtaA—I

химерные ткани и через клетки зародышевого пути следующему поколений ( Согз1ег ег а1.. 1989; ЙоЬеггзоп, 1991; БсГшаг^Ьегй ег а1., 1939; ТЬошрзоп ег а1., 1909 ). Последнее обстоятельство открывает перспективу разработки новых подходов к получению трансгенных сельскохозяйственных живот-кьсс. Перенос генов,, опосредованный генетически трансформированными Ей клетками имеет ряд преимуществ, особенно в отношении сельскохозяйственных животных. Генетически трансформированные ЕБ клетки мояно подвергать скринингу по критериям, наилучшим способом удовлетворяющим требованиям изучаемой экспериментальной проблемы. Целостность конструкции, введенной б ЕЗ клетки, всегда может быть проверена перед инъекцией клеток в бластоцнсту. Использование Е5-клеточных линий соз-. дает возмовность воспроизведения условий эксперимента, что не может быть достигнуто при использовании других методов трансгенеза.

Все выше изложенное, пробудило интерес к получении ЕЗ клеток сельскохозяйственных животных. Однако вплоть до настоящего времени не удалось получить ЕЕ клетки сельскохозяйственных животных.

Цель н задачи исследований. Целью нашей работы являлось выделение, идентификация и поддержание в культуре эмбриональных стволовых клеток из эмбрионов сельскохозяйственных

«квотных. "

В соответствии с этим'решались следующие задачи;

1. определить стадию предимплантационного развития эмбрионов кандого из используемых видов сельскохозяйственных

животных, наилучшим образом способствуй^» Дсстяженнп ука-занвой цели;

■ . 2. подобрать такие условия культивирования in vitro эмбрионов сельскохозяйственных «квотных, которые сделали бы возможным получение и поддержание в культуре ES клеток;

3. отработать различные методы получения ES клеток;

4. идентифицировать полученные эмбриональные клетки сельскохозяйственных животных.

Научная новизна. Научная новизна работы заключается в том, что впервые в России били получены ES-подобные клетки коров, поддерживаемые в культуре в течение 3-х пассажей. Показана возможность использования фидерного, глоя клеток г рануле зы для получения и поддержания в культуре ЕЗ-подобных клеток коров. Получены данные, подтверждающие наличие в раннем эмбриональном предимплавтацвонном развитии свиней периода покоящегося эмбрионального диска, в течение которого клетки змбрнобласта находятся в метаболически неактивном состоянии.

Практическая значимость работы. Практическая значимость работы состоит в том, что в процессе экспериментов были разработаны методические рекомендация по выбору условий культа-ьирования in vitro эмбрионов коров и свиней, необходимых для получения эмбриональных стволовых клеток, и по выбору стадий раннего развития эмбрионов коров и свиней; Кроме того, был апробирован иммунохирургнческий способ ( Sorter и Knowles, 1975 ) выделения эмбриобластов у эмбрионов свиней.

Реализация результатов исследований. Полученные резульг таты будут использованы при составлении методики получения' ЕВ клеток сельскохозяйственных ЖЯЕО'.'НЫХ.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и получили положительную оценку:

- на III Всесоюзном совещании "Культивирование клеток животных и человека". Пущино. - февраль 19S0 г.

- на Всесоюзном совещании "Проблема развития биотехнологии в животноводстве". - Дубровицы. - Bill, - август 1990г.

- На Всепольской конференции "Genetyka 2000". Краков ( Польша ). - сентябрь 1992 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы, одна из которых на английском языке.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 94'страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц, 21 рисунок. Список литературы включает 113 названий, в том числе 109 иностранных авторов.

И,' Материалы и методы.

Научные исследования были проведены в 1988-1989' гг. в лаборатории клеточной инженерии отдела биотехнологии ВИЖа, В исследованиях были использованы интакгные, замороженные-от-таяные эмбрионы коров, эмбрионы коров после оплодотворения и развития In vitro, эмбрионы свиней ( порода Крупная Белая ) к эмбрионы мышей ( линия BALB/c ) на разных стадиях предимп-лантационного развития ( Табл. Ц 1 ).

2.1. Источники эмбрионов.

Свежие интактные и замороженные ( 1,4 М глицерин ) эмбрионы коров в возрасте 5-7 дней Тюсле осеменения были предоставлены центром трансплантации эмбрионов ВНИИ животноводства ( Дубровицы ) и Украинским НИИ лесостепи и полесья (Харьков ). Экспандированные бластоцисты коров, развивающие-

Стадии развития эмбрионов, использовавшихся і) зкслгрїіні-ніах

.Стадия развития ; коровы 1 свиньи ! I кшк і BCtfro

поздняя корула tot 15 (¿4

ранняя бластоциста 5 17 - С/

. средняя бластоциста 10 15 ■ " 12 ' 37

лосдняя бластоциста IS " ■ 13 16 47

экспедированная ■

бластоциста 15 " "9 , - ■э*

Еылупиьшаяся

бластоциста Ю ■ — - 1D

Всего; ■«гл ■ 77 .' ' ■' 43"' ¿79

ся в течение 13 дней условиях in vitro после In vitro дсзрс-

*

вания и оплодотворения, были прсдоставлсны Е!І!Ш селъекслс-зяйствєннсі; биотехнологии ( Косива ),

Экбриони свиной ванывали нз рогов катк:г естественно cnapsiiKux или искуствекно осгкевенниу ке суперосул:'роаанкі;>: маток на 5-Э день после сг.араванкя ( день.1 - день искусственного осеменения или сстйстеєиного сяарквазия в день Обнаружения ОХОТЫ ). ВыННВаИНе'' ЭНбрИОИОЬ ПрО ВОДІЇВ ¡і Е ЗКСПЄрН1.*Є!;-

тальком хозяйстве БИйа Кленово-Чегодаево, Для извлечении отмывания эмбрионов свиней использовали'фосфатно-солевоа буфер в модификации Дульбекко (FBS, Flow lab., England ), обогащенный is плодной сывороткой', теленка (PCS, FIov; lab., England ) и 1%-р-рон антв&иотик/снтимикоти.ч ( Slgra,' USA )..

BiipEKeriHLOi самок мшей, полуденних из Института Медицинской генетик;) (Москва >, забивали на 3-3,5 ■■ день ' после ■ спаривания.. Рога катки индивидуально виреаали в кьстях утг-ро-тубального соединения бифуркации. Отсепаркровакике рога матки промывала средой ESI ( Flow lab., England ), обогащенной 5% сывороткой новорожденного теленка ( . KCS,. . Flcv:

lab,, England) . . ,r i. . " .

/,,.■' ' 2.2. Культуральные среда. ... .

• '. ' s "V • *

. •" Для тканевых культур/, а также культивирования интактпых эмбрионов, энбрнобластов алк кластеров эмбриобластных клеток и ES-водобвых клеток в «зависимости от вида животных ; использовали следующие среды: ÎBS, обогащенный FCS: ШНЗй" с добавлением FCS и KCS ; а льф а-МЩ ; и альфа-MEM с добавлением .среды, кондиционированной.BRI-клеткакн. Основной средой для культивирования эмбрионального материала служила, среда альфаЧ£Ш ( Glbco,' England j с высоким содержанием глюкозы ( 4500 кг/л), ''i- ^''"'---^ .' ■.'..- , : . ■' ■■'■■■■■'■.■.'■

"Перед использованием: кидкув.. среду обогащали 10% FCS, 103» WCS, t мН 1-глютаикиом'<;. Glbco, England ), 1 мК несущественными аминокислотами.( Serva. Germany ), 0,1 ыН 2-меркап-тозтаколом ( Serva,.Germany пенициллином { 50 ед./мл ), стрептомицином. { 50мкг/нл.») и амфотерицином В ( 2 нкг/мл, Glbco. England ). . •• "V

■В некоторых случаях культивирование эмбрионального материала проводили в среде альфа-НЕЙ с добавлением среды альфа-НЕМ, кондиционированнойBKL-клегкаки. Среда альфа-КЕМ, кондиционированная ERL-клетками,: была использована для получения ES-клеток мышей и готовилась по прописи, предложенной Gossler ( 1989 ). Клетки BRL были получены из Institut íur Tiersucht"und Tlerverhalten ( Marlensee, Germany К i

2.3. Яанипуляции с эмбрионами свиней. . 2.3,1, Иммунохнрургическое выделение и культивирование.. эмбриобластов эмбрионов свиней. Использованные для культивирования 8КМ эмбрионов свиней были получены иммунохирургическим методом С Solter and

г.*' i- ; .■ •"-л -

Knowles, "975 }.

Лнтисыворотка била приготовлена посредством иниушізгции кроликов клетками селсзенки свиньи. В качестве источника комплемента использовали лиофилизированную сиворотку морской свинки ( Институт вакцин и сывороток, Пермь ), Для приготовления комплемента в одну ампулу лиофнлизированной сиворотки добавляли 1 мл р-ра P5S.

Денудированные эмбрионы помещали б капли разбавленнсії средой ( 1:8 ) 1Шактивирс.р^!>;ой антиеыьсротки на 1' час при 37 С, После чего отмытые эмбрионы на 1 час помещали в отдельные капли комплемента, разбавленого в отношении 1:8 культуральной средой. Удаление лизнрованнш: клеток трофоб-ласта проводили посредством аккуратного пилотирования. '-."'.о-риобласты свиней индивидуально помешали е.капли р-рэ трипсин - 0,04л ЭДТА для того, чтобы дисагреглрэвзть эмбриональный клетки. После чего клетки культивировали ь ча^нах Петри, покрытых.О,1Ж »елатином, на разных типах фидеров.

2.3,2. Культивирование интактных эмбрионов свиней. Интактные эмбриону свиней на стадии морулы или бластоцисти культивировали в средах альфа-MEM, альфа-MEM +.50% ERL кондиционированной среди или PBS +. 20% FCS. Эмбрионы культивировали на фидерном слое клеток гранулезы или фидерном слое клегок НІН ЗТЗ.;

2.3.4. Выделение и культивирование кластерсь '¿кбрио-

. нальных клеток свиней. Эмбрионы после ферментативного удаления zona psilucida в течение 10-15 мии дерналн в р-ре 0.25S р-ра трипсина ( Dlico ), после чего их подвергали механическому разделения

па кластеры .эмбриональных клеток посредством пикетирования их через пинетку малого диаметра (20-30 мкм J." Эмбриональные кластер«, полученные таких образом, культивировали в среде , альфа-НЕМ или альфа-НЕК + 50% BR1 кондиционированной среды на фидере клеток гранулезы или ЖШ ЗТЗ клеток. ,

* 2.4. Ианипуляции с эмбрионами коров, ' Иитактные или оттаянные эмбрионы коров на различных стадиях развития культивировал« в культуральной среде в течение 24-72 часов в зависимости от стадии развития до спонтанного вылуплеиия из zona pellucida. Спонтанно выведшим изпрозрач-' ной оболочки эмбрионам позволяли прикрепляться на дно чашек Петрис различными типами фидерных.слоев. Вылупившиеся блас-тоцисты прикреплялись к фкдеркому слою в течение 72-96 часов посредством разрастания трофобласта (trophoblast outgrowth). Разрастания бласгоцнст оставляли ненарушенными в течение 4-5 дней продолжительного культивирования.

Кластеры клеток эмбр'иобластного происхокдения изолировали, осторожно соскабливая :их: с бластоцистных разрастаний, ; двеагрегировали, пипетируя ихв р-ре 0,25* трнпсий-ЭДТА с помочью "пипетки малого диаметра с оплавленным кончиком. От-, дельные клетки, полученные после трипсинизацни, переносили в чашки Петри содержащие. свежую кулътуральную среду в фидерный слой ( пассаж 0 ). . - ■.

Колонии клеток, образовавшиеся в течение 10-14 дней после- первичной' дисагрегацкн, селектировали,'и последующей , дмсагрегадвн подвергали только те коло^ш клеток, которые имелм ES-подобкую морфологию клеток. Десегрегированные клет-■ ки помещали на свежий фидерный слой.

2.Í-. Млч1;пул,чши: с: м;;:^;"!.

Инташний -jküphühü v.vi^tiii на стгд'дл корулг- или Олзг.тс-цисти культи и üpo а ал и и сред;; XAS.! 'или а.'и4а-Ш1, Спок т;лп; с : вылупившиеся в течение 2-i-35 . чассв crt'/

прикрькяились к фидерному. елок; нутом разрастаная. троф^&ласта. Разрастании й^лггсцист оста^л/мн им^рупон^к;: е течение 5 дней культ1!гиров?яив. .

Сгустки клеток ькйрко&ластнпг!".' "ирснс/ожлг^ыя аккурат 4L-отделили от слоя клеток rrvl'oúласта', л i:л>: 0.25S р-рс-м трилс^'-ЭДТЛ родученние клет;^: . переносил;: ;.s cbcküíí фидерный ¿íoü и хул tusé:: ревьлн.. Яосло,иу?1з:ко оггорсци;: проводили также как о:!;;сано в разделе .2..

III. Ре^улыйты исслелопи!»!!;.

Бее "DííQpiiCHu по с.но одного дня культи ti1 пока ü п ч ноль f:f?rr¿-

■1

лиоцекко к а нечестие зкОрисиов, ' к а дзльней^их ' ^нс^.с^кме-!-тах по получеш:« LS клеток были аспсш.-.омс:-! ¡rjva.K-

ЕИБШИС хорошее ]!л'.{ отличное качество.

Фидерные ело;: готовили первичннх культур. si¡ител¡¡я яйцеводов к натки свиней, фибробламов матки с^икей, клеток гранул sais свиней, а так^е из первпчней аультурц jJ.l-

hüx фкбрзбластсп ' к.клеток lili! ЗТЗ.

Клетки фндерпаго cjiuíl бил;:. лепользозаш-: дамка; а; ' лл.ч сСБместкого . культ)! ¡¡¡¡poi:aiiü,7 с з;;бр;:о;;аы! на 'рант;!!:-: '¡:t¡í¡!,-::-: развития; ^) для культи ьнрсааш-.'-; лlííejx rwirrov

г

р i: о 11 а л г, i¡ i,: к' l't Li о j i d ь: li kjü'tok . '.

3.1. ¡■'¡ii;n¡¡y*ji¡tiijs с э^Срлонам ксф1л;.

■ Все з аморс-:« е л к; ig - отт ая к ü г,:е эмйрионн,' L)c!j;bí;i:s;cir-: ¡:з которых. были не стадии гоздкеа* корули и все i л vítro

і»иегя элбрионы'не им«ли хорошего или от личного качества после одного дня:f культивирования ' и- били .исключены из

дальнейших экспериментов.

. " ь ♦. і

' СвежйеннтактныеЩ vivo' развивающиеся экбрионы на различных стадиях развития«культивировали в присутствии различных ткпов фкдернйх.клеток. Приблизніельно половина из культивируемых эмбрионов ( 46S ) развивалась в культуре до ста-' дик . экспедированной1 бластоцисту в течение 2-3 дней и спонтанно вылуплялась из zona pelluciúa Í Табл. її 2 ■:). Уровень 'бластоцист, развивающихся до стадии экспандированной бласто- ■ 'цисты и спонтанно вылупляющихся из sona pelluclüa, варьиро-'вад в зависимости от стадии развития, на которой начинали культивирование, и составлял около 27% для эмбрионов на стадии поздней корулы и 75% для эмбрионов на стадии поздней бластоцисти. ; . л

:Значительная часть' спонтанно вылупившихся эмбрионов (-75%. j' прикреплялась к фидерным слоям в течение ... , 1-2 дней после вилупленпя С,табл. К 2.'*).- Тип фидерного слоя не оказывал1, существенного влияний в а дода прикрепи ей и лея эм-Срвонов'за- исключением того случая когда;В качестве фидерного слоя использовали фидер NTH ЗТЗ клеток ( табл. U-3 ).

Практически все из прикрепившихся эмбрионов' образовывали эмбриональные разрастания, состоящие из отдэлышх скопле--ний клеток ВКИ, окруйенных гигантскими клетками трофобласта.

После' .развития^эмбриональных разрастаний в культуре в течение'3-б'дней ВКК-сколления, состояние ні кластеров округлых клеток, локализованных по периферии эксплангов( рис. 6.jj, осторожно изолировали и пассировали на свеаие фидерные слон того же типа. БКЙ-скоп.чекия, происходящие из каждого

Табл. ¡í 2.

Колонии Е3-подо5ных клеток, нолучгнние из cceaifx ln vivo разбивающихся ■ эмбрионов коров , .

. {поздняя Í бластоинсты

■ ■■ . ¡морула ' ' 1 ¡ ранняя Í средняя ! поздняя ¡ экспандиро- ¡ силупивзаяся ! ■ ¡ ! ванная ¡

Число вылупившихся эмбрионов Число прикрепленных эмбрионов Число эмбрионов, образовавших эмбриональные разрастался Число эмбрионов, образовавших первичные Е5-подобные колони» клеток ■

Число эмбрионов, ЕЭ -подобные колонки которых культивировали и течение 3 пассаве)!

1ТТ34) 2 (5) 5 ("Ю)

5 (U.3ÍÍ) I (20^) 4 (W)

5 (ti,Эй) I (205) 4 (40%) 0. . О О О О О

12 (15)

10 (7Т) О (57,1S)

12 (755)

10 f5») 6 (42,9%)

1 (6,33) 2 (14.3%)

О О

ТТ7)

6 (Б5,7а,) 6 (85,73)

3 (42.55)

3 (4?, V,)

...,,„ ■. . .....■ ; / Табл. К Зі

'Влияние фидерного'слоя на получение.коровьих Е5гЛ0Д0бНЫХ КОЛОНИЙ КЛеТОК

. Тип .фидерного слоя , • -„.. ¡к-ао вылу-іК-во прик-[Н-во эмйрио-!К-во экбрио- ; • |К-во эмйриоядв» щ- . :. : ■* - •■■■■; ¡пившихся ¡репле'нных: -Інор,' образо-[нов,: образовав- г колонии которая ; : ': . ¡эмбрионов ¡эмбрионов ¡вавших раз- |ших первичнае V ¡культивировали до. 3 ;

... , :' ' .. ! • • ,' {разрастания ¡колонии ЕЭ клеток!п^ссоча

■0.1» келатин - ■ 6 ■ - -.6 ■ ■'■;■ ГИГ" ~ ~ 0 • • ; О - ■ - ■ .■■ :■ ■■•

■ клетки'гранулезы . -10 . ' '9 ' "-'У.---''-'■■■ 9 У-У'-У'-'Л- . . '4 . 3 (ЗОЯ) .'.' ■клетки эпителия яйцевода Г''. ■ - -1-' . ,■ "■"' ' "'V'' - і-4; ■- -*.;.-Ч *■"-"■■■ . 'г''' . свиньи ■ ■■■■ . .. • • '••/*•." -" 4. ; • ;• \/;У-г О' ■■■■'.■■■• . клетки эпителия матки, свиньи 5 4 ■ і '' -У-.4■ .'"'О.1ОУУУ'-- ■

■ кд°ткк фнбробластов матки .' ':.'■'■*■,': г...' ■ ;■"■•'-. ■.' '■.-■■" V

свиньи ■ ■'■:■...■■■'■'.■..■ '5 • • . • 4 ' ■■'-■.■". , '4 "У-У,-; ■" . о ■-'?■■■:■ О , ■■ ■ ■' .

ПІН ЗТЗ клетки 6 • 2 ■ ■ - '6 ; , • 0 . ' ' о .••;.•. •

к четки знбрионалышх фиб- ■. . "У:;. ■ - ■■'..■/: -У'^У "-л^Уу. - ■ '¿■У ■'../■'

робластов ньнаи . .* ■ 0 • 7 ' '.■;■:;,л 7 У. У. ■У.У-УУ-'І ''-¿У У О

V А

эибрионч " пассировала в тшюкдурдыше чапк:Г. Искоюрке из: папсированныхироизводных ВНЙ-скоплений прикреплялись к Фу-/ дерному слои к продолаалм пролйферировать, давая начали мэ-леньким"колониям клеток, становящимися'' разл^тмшн после 10-14 дней.кулмиви.р08анхя...В;среднем в каждой чайке появлялось от 30 до 45 отдельных колонки члеток.

■ Колоти: клеток на основе/кх морфологии классифицировали ,на несколько типов; Преимущественным типом колонии были колонии клеток трофобласткоггь типа."Колонии, . состоящие из круглых плотно "упакованных клеток с большим ядром, относительно магам количеством цитоплазмы и четко видимыми ядрьш-* камн, и растущие как отдельные колония плоских эпителкаль-в0-подобних клеток, которые - имели тенденции образовачнг! иоиос-лоя.:была"идентифицированы ваий как колрнни ЕБ-псдоСних: кЛйток.* В среднем в каздой чайке;бш15 идентифицировано о; - 5 до 10 колоний 52-подобкых клеток. :*. ■-'.':

Тип фидерного слоя окаэыяал существенное- влияние ;ка' развитие ВКМ-лроизводных 'при, культивирований. ЕЗ-подобные колонии были получены'только при ' использовании . в ".качестве ■фидерного ' слоя клеток гранулезы свиней или-эмбриональных фкбробластов КЫ2Я. . . ; :='-;'

' .При ■ пассировании коровьих ЕБ-подобных клеток 'на- свекий фидер клеток гранулезы ямело .место .поддергакие':ях в культур^ в течение 3 пассйяей без пртери фенотипа ('табл.'II 3 }. ■, , Послекаждого пассака некоторая.часть клзток спонтанно дифференцировала; Мы наблпдалн колони» эпхгелкально^юдобкых и' ■ фиброблас'тно-подобных '■■ ' клеток, ,"" колония . клегск^-дяфференцировавшиеся . в гигантские - клетки ■ "трофобласта.-; и ■агрегаты эпнтелиалъш-подсбиых клеток,' " культивирогавакеся

.V - 14 -

в суспензии. Эти клеточное агрегаты часто формировали змбриоидные тельца, не прикрепляющиеся к субстрату : . ' 3.2. Манипуляции с эмбрионами свиней.

,В экспериментах с эмбрионами свиней било использовано 77 эмбрионов на различных стадиях предимплантацконного раз. вития. Тридцать три эмбриона из этих 77 культивировали в ик-тактной форме при различных условиях культивирования, 8 эмб-' рионов были использованы с целью изолировать и культивировать эмбриональные кластеры клеток и 36 змбрионов были использованы для выделения и культивирования ВКМ. " ■ Интактные эмбрионысвиней на различных стадиях предимп-: лактационного развития культивировали в среде альфа-КЕМ, " альфа-МЕН + 50Х ШЬ-кондициониро ванной среды или P3S + 203= FCS. Культивирование-проводили в присутствии фидерного слоя клеток гранулезы или KIH ЗТЗ клеток."

Все культивировавшиеся эмбрионы оказались не в состоянии развиваться при этих условиях. Ни один из. них,«е развивался до стадии экспандированной бластоцисты, вылуплялся из zona peUucida и прикреплялся к фидерному слою. Более того, при культивировании в среде'альфа-ЙЕК.или ■ глъфа-КЕМ + 50К BRL-конднцконироганной среды эмбрионы падвгргались коллапсу. Эго- позволяет нам предположить, что используемые условия культивирования не подходят не только для становления ES клеток, 'но к для культивирования эмбрионов. Основным фактором, не способствующим развитию знбриоков б этих условиях, мы считаем неудачный выбор среды культквирозания, Другим фактором, не способствующим получении ЕЗ клеток, может быть оказаться неудачно выбранная стадия развития эмбрионов, Весьма вероятно, что для получения ES клеток свиней необхо-

д-jho испохьзонать ?кЬрноки на стадиях, существенно'более. ■'ясзденх, чей стадии: развптнп,; используема идваевх экспериментах, КосвЬнкш образся"пази сргдпслоаепяя.подтверждается иеследованвяки Evans et al. ( 1090 ) к Strojeli (1950 ). ' В этих : доследованиях.для получения колоний ЕЙ-лодобпих клеток испояъзогали среду ШЕМ и эибриокы сепией а еозрйстг .10-12 дней развития ( день 0 - день проявления охотна шжрцткя ).

Культивирование кластеров эиб рн о и а^ ь «н:?;. kji Si oir: лс в ;ш е ,1. ■не привело, к образованию ^--1:пдобнйх кслокиЗ.клето;:.- Яехото-. rue из кластеров прикреплялись к фидорхоку слоя,; ио'Ч'орнзрз^ вали колонии дифференцированных клеток. Сыл:>.не в состоя-яки идентифицировать тип клзточной д;{$фарекц-.:рсек:(, ко пред-• полагаем, что зто били колонии трофобяаст^подобисго типа.

. Для выделении сгнннх эмбриобластоз нсаол^зоеали; ЗЗ.'.зкб-. ■ pitOHOB на различных стадиях развития С'табл. Ji 4 ).

Как можно видеть .из табл. К 4.i энбрпоблаез' ргяних бластоцист состой! из 4-5 клеток, средних блгстоцист яз 8-10 ¿слеток, поздякх бластоцист ¡;з 12-15 клеток' и'зиспан-дпрованшх бластеЦкст - из 16-18 клеток. Это позеолягт нам' пргдпологить, что ' клетки эибриобласта пролйфеткрувточзкь медленно. Полученные результаты опосредованно ''подтверждает существование периода, когда'зибраоиалькый дкек яз^язтея не-:' таболичеекп1 кеактивным. Культивирование' ккдалевгля'; г;;5ру.аб-ластоа ве привело к;получеиио ЕЗ-псзяобкьк ийсус:-:.- •'" .".'.■' ■■ 3.3. Наншзуляции с змбркояаии шзей^ ' Для получения ES клеток мыаей сспользосалв.43 эмбрионов на различна* стадиях развития. Тридцать' семь'.гмбрнинов нулъ-;' тивировали в яитакткой форме, а.6 'эмбрионовнастадил поздней блгстоцистьг культивировали после фзрязнтатлвкого удивзг"

Табл. Н 4.

Число клеток эмЭриобласта в эмбрионах свннсії на различных стадиях прединплантациоиного развития

стадия развития ' | К-во їяоріюнов і К-во клеток

ранняя оластоциста ' Г? ' ~ 4^5 ~

средняя бластоциста 1 13 8-10

поздняя бластоциста 4 12-15,'

экспаидированная *-

бластоциста .-. 2 . 16-18

тмія £ona pelluolda. Культивирование проводили в среде аль-фа-М£й, альфа-МЕМ + 60% BRL-кондициопировалной среды или альфа-MEM + 20%' BRL-конд иц и он и р о в ан ко й среды на фидерном

-г . v - ■ ,

слое эмбриональных фибрсбластоа мьми, фидерном.слое ЦІН ЗТЗ клеток или без фидерного слоя. Б последнем случае дно куль-туральных чашек покрывали 0,1% р-ром иела'тина.

Все интактные эмбрионы на стадии средней или поздней

бластоцисти спонтанно вылуплялись из zona pellucid?, а течение,4 дней культивирования, в то зремя как только ЗОЙ кнтак-тнеи.эмбрионов на стадии поздней морулы спонтанно .вылуплялись из оболочки ( табл. В 5 ).

В среднем 75Х интактшх эмбрионов и все денуднрованные эмбрионы прикреплялись к фидерному слов. Ни тип фидерного слоя, ' ни .тип используемой культуральной средине сказывали влияния на уровень прикрепления ( габл, її 6. и табл. к 7 ).

Практически все из" прикрепленных эхбрионсв ; как оно!; — танно вылупившихся, так и ферментативно денудированних .)■, культивировавшихся со стадии средней или поздней бластоцисти, образовывали эмбриональные разрастания, в то sptjui кал только половина прикрепленных эмбрионов, к ул ь т и в ир о в а ва и хс я со стадии поздней морулы, образовывали такие структуры. На образование эмбриональных разрастаний ки "иа фидерного слоя

Табл. ЇГ 5.

Колония ЕЙ-подоБних клеток, полученные от спонтанно вылупиввихся эмбрионов мышей.

~ т~' ■ . . . і поздняя! средняя .¡поздняя

¡морула І бластоциста|бластоциста

К-во вылулнввихся эмбрионов 12 (15) 12 (12) ¡0 (10) • К-во прикрепленных эмбрионов 6 (53,3*) 10 (63,3*) , 9 (90%) К-во эмбрионов, образовавших

эмбриональные разрастания 4(26,6*) 8 (бб.бХ) 8 (80*) К-во эмбрионов, образовавших аервячные колонии ЕБ-подобных клеток О . 2 (16.6Х) З (30Х) К-во эмбрионов, образовавших колония ЕЗ-аодо- . •

бных клеток, культиви- і

ваввнеся в течение 4-х

пассажей О 0 2 <20%)

. Табл. К б.

Влияние фидерного слоя на получение мышиних"ЕЗ-подобных

клеточных колодой. -

* • * ' '

. . ■ ■ ■■ . ~~ Г "тип фидерного слоя 5ГГ

\ т-ч-г- 1 Ь . » 3

Число прикрепленных эмбрионов .12 : - 8 7

Число эмбрионов.образозовавших

эмбриональные разрастания • ,9 6 ■5'

Число эмбрионов, проведжих

пассаж 8 б 5

Число эмбрионов, ЕЭ-колонии

которых культивировали до

I пассажа 0 ■з . 2

Число эмбрионов, ЕЭ-колоыии

которых культивировали до

IV пассажа 0 г 0

X) 1 - 0.1* желатин; 2 - клетки эмбриональных фибробластов мыши; з - ВІН ЗТЗ клетки ■

ни тип культуральной среды не оказывали влияния,

В течение 2-3 дней развития эмбриональных разрастаний,в культуре ВКК-компоненты разрастаний пролнфернроваля в формировали многослойные структуры, подобные яйцевому цилиндру

Табл. ?.

Влияние культуральной среды на получение мышиных ЕБ-по-добних колоний клеток.

| Тип культуральнои«среди . х)

. ; 2 І 3

Число эмбрионов, прошедших ~~ пассаж 0 ' 8

Число эмбрионов, ЕЭ-колонги которых культивировали до I пассажа' 5

Число эмбрионов, Е5-'солонии которых культивировали до iv пассажа 2

х) 1 - альфа-ШЛ; 2 - а1р!"іа-МЕМ + -60% БКЬ-кондициониро-ванкой среды; 3 - alph3.-t.Svt + 20% ВКЬ-кондиционированной среды

Эти структуры были ° окружены гигантскими клетками трофобласта. На этой стадии развития разрастаний ВКМ-ком-поненты аккуратно изолировали и пассировали ( после дезагрегации трипсином ) на свежий фидер того же типа. Каждый ВКМ-компонент пассировали в отдельную чашку. Некоторые из ВКН производных прикреплялись к фидерному слою, продолжали делиться и давали начало маленьким колониям клеток, которые становились видимыми через 2 дня культивирования. В среднем на каждую чашку образовывалось от 15 до Ш колоний клеток.

Колонии клеток на основе их морфологии классифицировали на несколько типов. Большинство колоний были определены как состоящие из дифференцированных клеток. Колонии, состоящие из малого числа круглых клеток с большим ядром и минимальным количеством цитоплазмы, были охарактеризованы как колонии ЕЭ-подобных клеток.

Колонии ЕБ-подобных клеток мышей пассировали на свежие фидерные слои. Часть из них сохраняла стабильный фенотип и росла без видимых признаков дифференцировки. Такие колонии

6 5

О О

О О

поддерживали в.культуре. Часть колоний уходили в дифферанцн-ровку и формировали эмбриоидные-тельца. .'.■■ '■;".'■

.. Ни один из феркентативко деиудированиых эмбрионов «шей или интактиых энбрионов_на стадии поздней норулу не дали па' чало образовании ES-подобнах колоний и только'ограниченно? •число эмбрионов на' стадии средней 'и : поздней 'бластоциоть: .{16,6% и 30% соответственно ) бшш способны-генерировать колония ES-подобных клеток. -

Тип .фидерного слоя -рскгически не оказывал влияния на образование первичных колоний- ES-подобных, " клеток, ; но ' тип культуральной среды оказывал заметное 'влияние на их об раз о-', вавие. Все из ES-подобных колоний били получеки при культивировании в среде альфа-КЕМ без добавления j}„каком-либо со-отнодении BRL-кондиционированной среды,

: IV. Обсуждение результатов исследований, ■ Результаты исследований, проведенных нашг в вше указанный период времени, позволяют сделать заключение о том, что кетодические подходи, разработанные для.получения мышиных' ES клеток, мало, применимы для получения ES'клеток с.-х. ■ siieot-нцх, в .особенности свиней. Основной причиной этого является, по-видимому, различия в раннем эмбриональном развитии киоей и копытных животных .( в' частности коров и свикёй ), -'.

По мнении Evans and Moore ( 1990.) первое-отличие сыра-жаетс4 во времени ¡и характере:имплантации. У мышей процесс имплантации г'это быстрый и ннвазивкый процесс,„ протеканий в течение, полусуток ,с .момента . выхода ¡эмбриона из. zona pellucida. У копытных дивотных имплантация происходит по: истечении значительного времени после евходз экбриона из гопа

.pelluclda н тогда, когда уже начался процесс гаструллшш. , Второе отличие выражается в характере развития Б I'M. У мышей БКЙ представлена в виде компактной плотной кассы клеток. У копытных же животных клетки ВН.' расположатся упорядочение в несколько слоев, образуя так называемый эмбриональный диск ( Карлсон," 1933 ). Третье отличие моиет выракатъся в разной метаболической активности и динамике дробления клеток ВК!<! у эмбрионов мышей и эмбрионов копытных животных, в частности ; свиней. У копытных животных клетки ВКЯ образуют эмбриональ-. ный ^ диск, отличающийся низкой метаболической активностью и ...находящийся в покоящемся.состоянии, продолжающемся до начала гаструляции ( Evans and Moore 1990, Evans et ab, 1990 ). При выделении ВКЙ: из эмбрион о е свиней нами ( Васильєва и др., .1990; Vasllleva et al,, 1992 ) были получены эмбриологические данные, .косвенным .образом подтверждающие наличие облнгаторного периода у клеток ВКИ, Оказалось, что в течение 4,суток развития in VlVO со стадии ранней бластоцисти ( вы-;.'иывание эмбрионов на 5 день после искусственного осеменения

или естественного спаривания. ) . до стадии экспакдированной

- - ■ f ' бластоцисти ■( вымываниеjэмбрионов на 8 день после искусственного осеменения или естественного спаривания) количество клеток ВКИ увеличилось -лишь в-4 раза ( табл. ,114,, рис. Н '!,), аричем в период развития со стадии средней бластоцисти до стадии экспаеднровакной бластоцисти число .клеток Bffl.f увеличилось . менее "чем в 2.раза. Сравнение теоретически возможного числа.клеток ВКМ свиней, исчисленного на осноае скорости дробления, характерной для клеток БНМ нишей ( удвоение клеток . происходит каждые 11-13 часов ), с'фактически имеющимся числом клеток (■ рис.- Н .1 ) позволяет охарактеризовать

скорость дробления клеток ВКМ свиней как очень низку». Это, по напеку мнению, является следствием покоящегося состояния ВКЫ свиней.

Таким образом, анализ результатов, полученных в наших экспериментах с эмбрионами свиней, позволяет сделать вывод о том, что 1) нами использовались эмбрионы на стадиях, неподходящих для получения Е5 клеток; 2) ориентация на стадии развития эмбрионов, использующиеся для получения Еь клеток мышей, оказалась неопрошенной. Для эмбрионов каждого вида с.-х. животных должна быть найдена своя стадия эмбрионального развития, на которой становится возможным получение Е5 клеток.

При культивировании эмбрионов коров на более поздних стадиях развития были получены следующие результаты. Только 14,ЗЖ эмбрионов коров, культивировавшихся со стадии экспаи-дировавной бластоцисты, давали начало первичным колониям ЕЭ-подобных клеток ( рис. 2 ), которые, однако, не удавалось поддерживать в культуре. Вместе с тем 42,9& эмбрионов, культивировавшихся со стадии, вылупившейся бластоцисты, давали начало первичным' колониям ЕБ-подобных клеток ( рис. 2 ), большая часть которых поддерживалась в культуре в течение 3 пассажей без потери фенотипа.

Анализ эффективности получения колоний ЕЭ-подобных клеток позволяет высказать предположение о том, что для получения колоний Е5-подобных клеток коров предпочтительно использовать зкйриовы на. стадии вилу пи ввейся бяастоцисш или на более поздней стадии.

Результаты наших исследований ( Васильева и др., 1990; УааШеуа е1 а!., 1992 ) по получению ЕЗ-подобных клеток ко-

ров с использование* фидерных слоев различных видов показы-вант возможность использования фидерного слоя клеток грану-лезы фолликулов свиньи для получения с высокой стелены» эффективности коровьих ES-подобных клеток и поддержания их в культуре по крайней мере в течение 3 пассажей,

Б наших исследованиях мы не имели возможности провести эксперименты по получению химерных животных с использованием полученных нами ES-подобных клеток коров и иьгаей с целью подтверждения их плюрипотентности, Однако характеристики полученных нами колоний мышиных и коровьих клеток ( сохранение фенотипа ES клеток в течение 3-4 пассажей и их способность образовывать эмбриоидные тельца'( что, по мнению Robertson and Bradley С 1986 ) и Evans et al., { 1990 >, является одной из характерных черт колоний ES клеток ) позволяет вам рассматривать колонии клеток, полученные в нашем исследовании, колониями клеток, обладающими характеристиками колоний плюрвпотептных клеток.'

V. .Выводы.

К Били получены мямнше и коровьи колонии клеток, обладающие характеристиками плюрипотентвых клеток и поддерживаемые в культуре в течение 3-4 пассажей.

2. Для получения ES-подобных клеток коров целесообразно использовать эмбрионы на стадии вылупившейся бластоцисты.

3. Фидерный слой клеток . гранулеза фолликулов свиней можно использовать для получения и поддер«ания, в культуре коровьих ES-подобных клеток.

,4; Получены данные, подтверждающие существование в развитии эмбрионов свиней периода покоящегося эмбрионального

ЛдиОм^^О MUR »ACffiÇf ÇiKW t

К-Ьо

Î

-........ - ■ ...............

і f L ' te-I з

»i 11 «мешать

Pu". 2. "■JnutHÇ.çmt. получении колони?

стЬоло^* кл^то ^ç-pob Ь за&исЬыости от crnc&ju розбития

ияа roftim лугцДтоРСЯ-

■ - * ouvert в - ' '''

диска, продолжавшегося вплоть до начала гаструляции.

5. Для получения ES-подобных клеток свиней необходимо, видимо, использовать эмбрионы на стадиях,.соответствующих

11-12 дни эмбрионального развития. ^ «

По теме диссертации опубликована следующие работы:

1. Васильева С.Г., Стрельченко Н.С., Путь '.Е. // Культивирование клеток эпителия матки и яйцевода, фибробластов матки и фолликулярных клеток свиней. В: "Культивирование клеток человека и животных", Тезисы докладов III Всесоюзного совещания, 13-15 февраля 1990, Яущино, с, 77

2. Васильева С.Г., Стрельченко Н.С., Еуть '.Е., Васильев И.М. // Культивирование внутренней клеточной массы пре-дякплантационнкх эмбрионов свиней". В; "Культиви рование клеток человека и животных", Тезисы докладов III Всесоюзного совещания, 13-15 февраля 1990, Пущино, с. 78

3. Васильева С.Г., Стрельченко К,С., Путь '.Е,, Васильев И.К. // Выделение и культивирование внутренней клеточной массы предимплантациовкнх эмбрионов с.-х. животных". В: "Проблемы' развития биотехнологии в животноводстве". Тезиса докладов Всесоюзного научно-технического совещания, .9-10 октября 1990 г., сс. 74-76. • '

4. Vasllieva S.G., Vasiliev I.H., Strelcheriko N.S. // Tiis establishment oi pig and bovine embryonic st an cells". In: "Genetyka 2Ö00"..Materlaly konierencji, XI Walny zjazd PTG, Krakow, 10-11 wrzeslen 1992, p. 34.

■Подписано к печати 15.03.1993 г. Заказ 762.

л Тираж 75 экз. Объем 1,0 уч.-идо. «т.

ПАШ ВИЖа