Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение ES-подобных эмбриональных клеток сельскохозяйственных животных

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Получение ES-подобных эмбриональных клеток сельскохозяйственных животных"

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЖИВОТНОВОДСТВА (ВИЖ)

На правах рукописи УДК 573.086.83.

Васильева Светлана Геннадиевна

ПОЛУЧЕНИЕ ЕБ-ПОДОБНЫХ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ КЛЕТОК СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

03.00.13. Физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

п. Дубрсвицы Московской области 1993

Работа выполнена в отделе биотехнологии Всероссийского научно-исследовательского института животноводства.

Научный руководитель : академик РАСХК Л.К. Эрнст

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Заслуженный деятель науки

Российской Федерации; Л.П. Дьяконов

доктор биологических наук, профессор Н.И. Сергеев

Ведущее учреждение - Московская ветеринарная академия им. К.И. Скрябина

Защита состоится "."Р^.^ 1993 г. в часо]

на заседании Специализированного совета Д.020.16.02. пр1 Всероссийском научно-исследовательском институте

животноводства.

Адрес института: Московская обл.. Подольский р-н, п. Дубровиць С диссертацией моено ознакомиться в библиотеке ВИЙа.

Автореферат разослан

-1993 г. '

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат биологических наук

И.И, Шмыгин

- 1 -

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность теми. Эмбриональные стволовые ( ES ) клетки млекопитающих - это полученные из эмбрионов млекопитающих недетерминированные плюрипотентные клетки. ES клетки могут быть получены из эмбрионов на стадии бластоцисты. На этой стадии эмбрион представлен двумя типами клеток - клетками трофэктодермы, обладающими ограниченными способностями к развитию, и плюрипотентными клетками внутренней клеточной массы ( ВКМ ), дающими кс^лэ всем типам дифференцированных клеток взрослого организма, включая клетки зародышевого пути. Клетки ВКМ и являются источником получения ES клеток. ES-клетки обладает способностью нормально пролиферировать при соединении с клетками эмбриобласта нормального эмбриона при создании агрегационных или инъекционных химер. При этом полученные химеры проявляют следующие черты: а) деля полученных химер является очень высокой; б) степень участия ES клеток в формировании химерного организма часто превышает 50%; в) химеризм обычно.является экстенсивным и обычно затрагивает все органы химерных животных.. Еще одним существенным свойством ES-клеток является их высокая дифференцировоч-иая активность в условиях In vivo и in vitro. .

В течение более чем десятилетия ES клетки лабораторных иивотных ( мышей ) чрезвычайно широко использовали в качестве модели изучения эмбриогенеза. В последние несколько лет был опубликован ряд работ по генетической трансформации мышиных ES клеткок и получению химерных■трансгенных животных. Оказалось, что инъецированные в полость бластоцигты генетически трансформированные клетки колонизируют половые валики, а введенные гены стабильно передаются от клеточной линии з

химерные ткани и через клетки зародьшевого пути следующему

поколению ( Gossler et al., 19В9; Robertson. 1991;

»

Schwartzberg et al., 1989; Thompson et al., 1989 ). Последнее обстоятельство открывает перспективу разработки новых подходов к получению трансгенных сельскохозяйственных животных. Перенос генов, опосредованный генетически трансформированными ES клетками имеет ряд преимуществ, особенно в отне-ыении сельскохозяйственных животных. Генетически трансформированные ES клетки мокно подвергать скринингу по критериям, ' наилучшим способом удовлетворяющим требованиям изучаемой экспериментальной проблемы. Целостность конструкции, введенной в ES клетки, всегда может быть проверена перед инъекцией клеток в бластоцисту. Использование ES-клеточных линий создает возможность воспроизведения условий эксперимента, что не монет быть достигнуто при использовании других метода: трансгенеза.

Все выше изложенное пробудило интерес к получению ES клеток сельскохозяйственных нивотных. Однако вплоть до настоящего времени не удалось■получить ES клетки сельскохозяйственных животных.

Цель и задачи исследований. Целью нашей работы являлось выделение, идентификация и поддераание в культуре эмбриональных стволовых клеток из эмбрионов сельскохозяйственных животных. '

В соответствии с этим" решались следующие задачи:

1. определить стадию предимплантационного развития эмб-

рионов каядогс из используемых видов сельскохозяйственных

животных, наилучшим образом способствующую достижение» указанной цели;

2. подобрать такие условия культивирования in vitro эмбрионов сельскохозяйственных животных, которые сделали бы

4 возможным получение и поддержание в культуре ES клеток;

3. отработать различные методы получения ES клеток;

4. идентифицировать полученные эмбриональные клетки сельскохозяйственных животных.

Научная новизна. Научная новизна работы заключается в том, что впервые в России были получены ES-подобные клетки коров, поддерживаемые в культуре в течение 3-х пассажей. Показана возможность использования фидерного слоя клеток гра-

нулезы для получения и поддержания в культуре ЕЗ-подобных

»

клеток коров. Получены данные, подтверждающие наличие в раннем эмбриональном предимплантационном развитии свиней периода покоящегося эмбрионального диска, в течение которого клетки змбриобласта находятся в метаболически неактивном состоянии.

Практическая значимость работы. Практическая значимость работы состоит в том, что в процессе экспериментов были разработаны методические рекомендации по выбору условий культивирования In vitro эмбрионов коров и свиней, необходимых для получения эмбриональных стволовых клеток, и по выбору стадий раннего развития эмбрионов коров и свиней. Кроме того, был апробирован иммунохирургический способ ( Solter и Knowles, 1975 ) выделения эмбриобластов у эмбрионов свиней.

Реализация результатов исследований. Полученные результ-таты будут использованы при составлении методики получения ES клеток сельскохозяйственных животных.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и получили положительную оценку:

- на III Всесоюзном совещании "Культивирование клеток животных и человека". Пущино. - февраль 1990 г.

- на Всесоюзном совещании "Проблема развития биотехнологии в животноводстве". - Дубровицы. - ВИЖ. - август 1990г.

- На Всепольской конференции "Genetyka 2000". Краков ( Польша ). - сентябрь 1992 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы, одна из которых на английском языке.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 94 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц, 21 рисунок. Список литературы включает 113 названий, в том числе 109 иностранных авторов.

II; Материалы и методы.

Научные исследования были проведены в 1988-1989- гг. в лаборатории клеточной инженерии отдела биотехнологии ВИШа. В исследованиях были использованы интактные, замороженные-от-таяные эмбрионы коров, эмбрионы коров после оплодотворения и развития In vitro, эмбрионы свиней ( порода Крупная Белая ) и эмбрионы мышей ( линия BALB/c ) на разных стадиях предимп-лантационного развития ( Табл. И 1 ).

2.1. Источники эмбрионов.

Свежие интактные и замороженные ( 1,4 М глицерин ) эмбрионы коров в возрасте 5-7 дней после осеменения были предоставлены центром трансплантации эмбрионов.ВНИИ животноводства ( Дубровицы ) и Украинским НИИ лесостепи и полесья (Харьков ). Экспандированные бластоцисты коров, развивающие-

Табл. N 1.

Стадии развития эмбрионов, использовавшихся в экспериментах

Стадия развития ) коровы j СВИНЬИ i I мыши ! всего

поздняя морула 101 23 15 124

ранняя бластоциста 5 IT - 22

средняя бластоциста 10 15 12 ЗТ

поздняя бластоциста 18 13 16 47

экспандированная

бластоциста 15 9 . - 24

вылупившаяся

бластоциста 10 ~ — 10

Всего: 1 TT 43 ' 27S

ся в течение 13 дней условиях in vitro после In vitro дозревания и оплодотворения, были предоставлены ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии ( Москва ).

Эмбрионы свиней вымывали из рогов матдп естественно спаренных или искуственно осемененных не сулеровулмрованных маток на 5-8 день после спаривания ( день 1 - день искусственного осеменения или остестгенного спаривания в день обнаружения охоты ). Вымывание эмбрионов проводили в экспериментальном хозяйстве ВИЖа Кленово-Чегодаево. Для извлечения и отмывания эмбрионов свиней использовали фосфатно-солевой буфер в модификации Дульбекко (PBS, Flow lab., England ), обогащенный \% плодной сывороткой теленка (FCS, Flow lab., England ) и 1% р-ром антибиотик/снтимикоткк ( Signa, USA ).

Беременных самок мышей, полученных из Института Медицинской генетики ( Москва ), забивали на 3-3,5 день после спаривания. Рога матки индивидуально вырезали в местах уте-ро-тубального соединения бифуркации. Отселарированные рога матки промывали средой шш ( Flow lab., England ), обогащенной 5% сывороткой новорожденного теленка ( HCS, Flow

lab., England)

' 2.2. Культуральные среды.

« •

Для тканевых культур, а также культивирования интактных эмбрионов, эмбриобластов или кластеров эмбриобластных клеток и ES-подобных клеток в ¿зависимости от вида животных использовали следующие среды: PBS, обогащенный FCS; ШИЛ с добавлением FCS и NCS; альфа-МЕМ и альфа-МЕМ с добавлением среды, кондиционированной BRL-клетками. Основной средой для культивирования эмбрионального материала служила среда альфа-МЕМ ( Gibco, England ) с высоким содержанием глюкозы ( 4500 мг/л).

о

Перед использованием жидкую, среду обогащали 10% FCS, 10% NCS, 1 мМ 1-глютамином ( Gibco, England ), 1 мМ несущественными аминокислотами ( Serva, Germany ), 0,1 мМ 2-меркап-тоэтанолом ( Serva, Germany ), пенициллином ( 50 ед./мл ), стрептомицином ( 50мкг/мл .) и амфотерицином В ( 2 мкг/мл, Gibco, England ).

В некоторых случаях культивирование эмбрионального материала проводили в среде альфа-МЕМ с добавлением среды аль-фа-МЕМ, кондиционированной. BRI-клетками. Среда альфа-МЕМ, кондиционированная BRI-клетками, была использована для получения ES-клеток мышей и готовилась по прописи, предложенной Gossler ( 1989 ). Клетки BRL были получены из Institut íur Tierzucht und Tierverhalten ( Marlensee, Germany ).

2.3." Манипуляции с эмбрионами свиней.

2-3.1. Иммунохирургическое выделение и культивирование эмбриобластов эмбрионов свиней.

Использованные для культивирования ВКМ эмбрионов свиней были получены иммунохирургическим методом ( Solter and

Knowles. '975 ).

Лнтисыворотка била приготовлена посредством иммунизации кроликов клетками селезенки свиньи. Б качестве источника комплемента использовали лиофилизированную сыворотку морской свинки ( Институт вакцин и сывороток, Пермь ). Для приготовления комплемента в сдну ампулу лиофилизироваииой снворотки добавляли 1 мл р-ра PBS.

Денудированные эмбрионы помецали в капли разбавленной средой ( 1:8 ) кнактивирср.тчой антисыворотки на Г час при 37 С. После чего отмытые эмбрионы на 1 час помещали в отдельные капли комплемента, разбавленого в отношении 1:3 культуральной средой. Удаление лизированних клеток трсфоб-ласта проводили посредством аккуратного пипетнрования. ЭчО-риобласты свиней индивидуально помечали в .капли р-па С,кС% трипсин - 0,04% ЭДТА для того, чтобы дисагрегироззть эмбрно-налышэ клетки. После чего клетки культивировали в чайках Петри, покрытых 0,1% желатином, на разных типах фидеров.

2.3.2. Культивирование интактных эмбрионов свиней.

Интактиые эмбрионы свиней на стадии иорулы или бласто-цисты культивировали в средах альфа-MEM, альфа-МЕМ + 50% ERL кондиционированной среды или PBS +. 20% FCS. Эмбрионы культивировали на' фидерном слое клеток гранулезы или фидерном слое клеток NIH ЗТЗ.-

2.3.4. Выделение и культивирование кластеров окбрио-нальных клеток свиней.

Эмбрионы после ферментативного удаления zona psiluclda в течение 10-15 мин дериали в р-ре 0,25% р-ра трипсина ( Dlico ), после чего их подвергали механическому разделению

- Б -

ка кластеры эмбриональных клеток посредством пипетирования их через пипетку малого диаметра (20-30 мкм ). Эмбриональные кластеры, полученные таким образом, культивировали в среде альфа-MEM или альфа-MEM + 50% BKL кондиционированной среды на фидере клеток гранудезы или NIH ЗТЗ клеток.

" 2.4. Манипуляции с эмбрионами коров.

Интактные или оттаянные эмбрионы коров на различных стадиях развития культивировали в культуральной среде в течение 24-72 часов в зависимости от стадии развития до спонтанного вылупления из zona pelluclda. Спонтанно вышедшим из прозрачной оболочки эм&рионам позволяли прикрепляться на дно чашек

' - о

Петри с различными типами фидерных.слоев. Вылупившиеся блас-тоцисты прикреплялись к фидерному слою в течение 72-96 часов посредством разрастания трофобласта (trophoMast outgrowth). Разрастания бластоцист оставляли ненарушенными в течение 4-5 дней продолжительного культивирования.

Кластеры клеток эмбриобластного происхождения .изолировали, осторожно соскабливая ;ИХ: с бластоцистных разрастаний, дисагрегировали, пипетируя их в р-ре 0,25% трипсин-ЭДТА с помощью пипетки малого диаметра с оплавленным кончиком. Отдельные клетки, полученные после трипсинизации, переносили в чашки Петри - содержащие.свежую культуральную среду и фидерный слой ( пассаж 0 ). -

Колонии клеток, образовавшиеся в течение 10-14 дней после- первичной дисагрегации, селектировали, и последующей дисагрегации подвергали только те колсь.ш клеток, которые имели ES-подобную морфологию клеток. Дисагрегированные клетки помещали на свежий фидерный слой.

2.5. Манипуляции с эмбрионами мышей.

Интактные эмбрионы мышей на стадии морулы или бласто-циеты культивировали в среде ВШ.1 или альфа-МЕМ. Спонтанно вылупившиеся в течение 24-36 часов бластоцнсты прикреплялись к фидерному слою путем разрастания трофобласта. Разрастания благтоцист оставляли ненарушенными в течение 5 дней культивирования.

Сгустки клеток эмбриобластного происхождения аккуратно отделили от слоя клеток ггофобласта и поел» трипсииизации 0,25% р-ром трипсин-ЭДТА полученные клетки переносили на свежий фидерный слой и культивировали. Последующие операции проводили также как описано в разделе 2.4.

III. Результаты исследовании.

Все эмбрионы после одного дня культивирования подвергали оценке на качество эмбрионов, и в дальнейших экспериментах по получению ES клеток были использованы эмбрионы, проявившие хорошее или отличное качество.

Фидерные слои готовили из первичных культур эпителия яйцеводов и матки свиней, фибробластов матки свиней, клеток гранулезы свиней, а также из первичной культуры эмбриональных фибробластов мыши и клеток NIH ЗТЗ.

Клетки фидерного слоя были использованы двояко: а) для совместного культивирования с эмбрионами на ранних стадиях развития; б) для культивирования эмбриональных клеток и эмбриональных стволовых клеток.

3.1. Манипуляции с эмбрионами коров.

Все замороженные-оттаянные эмбрионы, большинство из которых были на стадии поздней морулы и все in vitro развивав-

««иегя эмбрионы не имели хорошего или от личного качества ,после одного дня культивирования и были исключены из дальнейших экспериментов.

' Свежие кнтактные In vivo развивающиеся эмбрионы на различных стадиях развития»культивировали в присутствии различных типов фидерных.клеток. Приблизительно половина из культивируемых эмбрионов ( 46% ) развивалась в культуре до стадии экспандированной бластоцисты в течение 2-3 дней и спонтанно вылуплялась из zona pelluclda { Табл. N 2 ). Уровень бластоцист, развивающихся до стадии экспандированной бластоцисты и спонтанно вылупляющихся из zona pelluclda, варьировал в зависимости от стадии развития, на которой начинали культивирование, и составлял около 27% для эмбрионов на стадии поздней морулы и 75% для эмбрионов на стадии поздней бластоцисты.

Значительная часть - спонтанно вылупившихся эмбрионов ( 75% ) прикреплялась к фидерным слоям в течение 1-2 дней после вылупления (,табл. N 2.'). Тип фидерного слоя не оказывая существенного влияния На долю прикрепившихся эмбрионов за исключением того случая когда в качестве фидерного слоя использовали фидер NIH ЗТЗ клеток ( табл. N-3 ).

Практически все иа прикрепившихся эмбрионов образовывали эмбриональные разрастания, состоящие из отдельных скоплений клеток ВКМ, окруженных гигантскими клетками трофобласта.

Прсле развития • эмбриональных разрастаний в культуре в течение 3-6 дней ВКМ-сколления, состоящие аз кластеров округлых клеток, локализованных по периферии эксплантов( рис. 6..), осторожно изолировали и пассировали на свежие фидерные слои того же типа. ВКИ-скопления, происходящие из каждого

Табл. N 2.

Колонии ES-подобных клеток, полученные из свежих ln vivo развивающихся

эмбрионов коров

¡поздняя i i ¡морула i. бластоцисты

¡ ранняя | средняя ¡ поздняя ! экспандиро-¡ ! ванная ¡ вылупившаяся » i

Число вылупившихся эмбрионов 12 (44) 2 (5) 5 <Ю) 12 (16) 10 (14) 7 (?)

Число прикрепленных эмбрионов 5 (11,3%) 1 (20%) 4 (40%) 12 (75%) 8 (57,1») 6 (85,7%)

Число эмбрионов, образовавших

эмбриональные разрастания 5 (11,3%) 1 (20%) 4 (40%) 10 5%) 6 (42,9%) б (85,7%)

Число эмбрионов, образовавших

первичные ЕБ-подобные колонии

клеток 0 0 0 1 (6,3%) 2 (14,3%) 3 (42,9%)

Число эмбрионов, ЕБ -подобные

колонии которых культивировали в 0 (42,9%)

течение 3 пассажей 0 0 0 0 3

.Табл. N 3; • Влияние фидерного' слоя на получение /коровьих ЕБ-подобных колоний клоток ':

Тип фидерного слоя ' " ¡к-во внлу-|К-во прик-|К-во эмбрио-!К-во эмбрио- ; ■ |К-во эмбрионрв, ЕБ-

|пившихся ¡реплённых ¡нов. образо-!нов, образовав-' колонии которых ¡эмбрионов ¡эмбрионов ¡вавших раз- ¡пих первичные- культивировали до 3 ■ | 'I •. ¡разрастания ¡колонии Е8 клеток¡пассата

0.1% желатин " 8 -.6 ~ ИГ° ' : : С .0 ! ' ' •

клетки гранулезы 10 . 9 ■••■• 9 - 4 • 3 (30*)

клетки эпителия яйцевода • . , ' ' ' ' ' :

свиньи б ':." - ' 4 V - з. о 0 " " >..■'■.-

клетки эпителия матки свиньи 5 1 4 ' 4 . О • - О.

кл»тки фибробластов матки .. V ' '••' . , ,

свиньи 5 '. 4 ' 4 • .0 0 •*., .

ШН ЗТЗ клетки . 6 2 . О О 'I' 0 ■

клетки эмбриональных фиб- ' , .'■

робластов мыши -8 7 7 ' •. 2.'•.. "■■" .•■'О '

эмбрионя пассировали в индивидуальные чашки. Некоторые из пассированных производных ВКМ-скоп."ений прикреплялись к фидерному слою и продолжали продиферировать, давая начало маленьким' колониям клеток, становящимися различимыми после 10-14 дней культивирования. В среднем в каждой чашке появлялось от 30 до 45 отдельных колоний -:леток.

Колонш: клеток на основе их морфологии классифицировали на несколько типов. Преимущественным типом колоний были колонии клеток трофобластного типа. Колонии, состоящие из круглых плотно упакованных клеток с больпим ядром, относительно малым количеством цитоплазмы м четко видимыми ядрышками, и растущие как отдельные колонии плоских эпителиально-подобных клеток, которые имели тенденцию .к образован«, монослоя, были идентифицированы нами как колонии КЗ-подобных клеток. В среднем в каждой чашке быйб идентифицировано о: 6 до 10 колоний КЗ-подобных клеток.

Тип фидерного слоя оказызал существенное влияние на развитие ВКМ-производных при культивировании. ЕБ-подобные колонии были получены только при использовании в .качестве фидерного слоя клеток гранулезы свиней или эмбриональных фибробластов мыши.

При пассировании коровьих ЕБ-подобных клеток на свежий фидер клеток гранулезы имело место поддержание их в культуре, в течение 3 пассажей без потери фенотипа ( табл. КЗ ).

После каждого пассажа некоторая.часть клеток спонтанно дифференцировала. Мы наблюдали колонии эпителиально-подобных и фибробластно-подобных ' клеток, ' колонии клеток4 дифференцировавшиеся - в гигантские клетки 'трофобласта и агрегаты эпителиально-подобных клеток, культивировавшиеся

в суспензии. Эти клеточные агрегаты, часто, формировали эмбриоидные тельца, не прикрепляющиеся к субстрату.

3.2. Манипуляции с эмбрионами свиней.

В экспериментах с эмбрионами свиней было использовано 77 эмбрионов на различ«ых стадиях предимплантационного развития. Тридцать три эмбриона из этих 77 культивировали в ин-тактной форме при различных условиях культивирования, 8 эмбрионов были использованы с целью изолировать и культивировать эмбриональные кластеры клеток и 36 эмбрионов были использованы для выделения и культивирования ВКМ.

Интактные эмбрионы свиней на различных стадиях предимп-

о

лантационного развития культивировали в среде альфа-МЕМ, альфа-МЕМ + 50% BRL-кондиционированной среды или PBS + 20% FCS. Культивирование проводили в присутствии фидерного слоя клеток гранулезы или NIH ЗТЗ клеток.

Все культивировавшиеся эмбрионы оказались не в состоянии развиваться при этих условиях. Ни один из них ае развивался до стадии экспандированной бластоцисты, вылуплялся из zona pellucida и прикреплялся к фидерному слою. Более того, при культивировании в среде альфа-МЕМ или альфа-МЕМ + 50% BRL-кондиционированной среды эмбрионы подвергались коллапсу. Это позволяет нам предположить, что используемые условия культивирования не подходят не только для становления ES клеток, но и для культивирования эмбрионов. Дсновным фактором, не способствующим развитию эмбрионов в этих условиях, мы считаем неудачный выбор среды культивирования. Другим фактором, не способствующим получению ES клеток, может быть оказаться неудачно выбранная стадия развития эмбрионов. Весьма вероятно, что для получения ES.клеток свиней необхо-

димо использовать эмбрионы на стадиях, существенно более поздних, чем стадии развития, используемые в наших экспериментах. Косвенным образом наши предположения подтверждаются исследованиями Evans et al. ( 1?90 ) и S^rojek ( 1990 ). В этих исследованиях для получения колоний ES-подобнцх клеток использовали среду ШЕМ и эмбрионы свиней в возрасте 10-12 дней развития ( день 0 - день проявления охоты и покрытия ).

Культивирование кластеров эмбриональных клеток свиней не привело к образованию 'Ел-'содобных колоний клеток. Некоторые из кластеров прикреплялись к фидерному слою, но формировали колонии дифференцированных клеток. Мы были не в состоянии идентифицировать тип клеточной дифференцирозки, но предполагаем, что это были колонии трофобласт-подобного типа.

Для выделения свиных эмбриобластов использовали 36 эмбрионов на различных стадиях развития С табл. N 4 ).

Как можно видеть .из табл. N 4., эмбриобласт ранних бластоцист состоит из 4-5 клеток, средних бластоцист - из 8-10 клеток, поздних бластоцист - из 12-15 клеток и экспан-дированных бластоцист - из 16-18 клеток. Это позволяет нам предположить, что ' клетки эмбриобласта пролифилируют очень медленно. Полученные результаты опосредованно подтверждают существование периода, когда эмбриональный диск является метаболически неактивным. Культивирование выделенных эмбриобластов не привело к получению ES-подобных клеток.

3.3. Манипуляции с эмбрионами мышей.

Для получения ES клеток мышей использовали 43 эмбрионов на различных стадиях развития. Тридцать семь .эмбрионов культивировали в интактной форме, а 6 эмбрионов на стадии позд- , ней бластоцисты культивировали после ферментативного удале-

Табл. N 4.

Число клеток эмбриобласта в эмбрионах свиней на различных стадиях предимплантационного развития

стадия развития | К-во Еибрионов ! К-во клеток

ранняя бластоциста 17 4-5

средняя бластоциста 13 В-10

поздняя бластоциста .4 12-15

экспандированная

бластоциста 2 16-18

ния zona pelluclda. Культивирование проводили в среде альфа-МЕМ, альфа-МЕМ + 60% BRL-кондиционированной среды или альфа-МЕМ + 20% BRL-кондиционированной среды на фидерном слое эмбриональных фибрсбластов мыши, фидерном слое NIH ЗТЗ клеток или без фидерного слоя. В последнем случае дно куль-туральных чашек покрывали 0,1% р-ром желатина.

Все интактные эмбрионы на стадии средней или поздней

бластоцисты спонтанно вылуплялись из zona pelluclda в течение. 4 дней культивирования, в то время как только 80% интак-тных эмбрионов на стадии поздней морулы спонтанно .-вылуплялись из оболочки ( табл. N 5 j.

В среднем 75% интактных эмбрионов и все денудированные эмбрионы прикреплялись к фидерному слою. Ни тип фидерного слоя, ни тип используемой культуральной среды не оказывали влияния на уровень прикрепления ( табл. И 6. и табл. N 7 ).

Практически все из прикрепленных эмбрионов ( как спонтанно вылупившихся, так и ферментативно денудированных ), культивировавшихся со стадии средней или поздней бластоцисты, образовывали эмбриональные разрастания, в то врет как только половина прикрепленных эмбрионов, культивировавшихся со стадии поздней морулы, образовывали такие структуры. На образование эмбриональных разрастаний ни тиа фидерного слоя

Табл. N 5.

Колонии ЕБ-подобных клеток, полученные от спонтанно вылупившихся эмбрионов мышей.

¡поздняя¡средняя¡поздняя ¡морула ¡бластоциста|бластоциста

О Ой) -9 (90%)

К-во вылупившихся эмбрионов 12 (15) 12 (12) К-во прикрепленных эмбрионов 8 (53,3%) 10 (83,3%) К-во эмбрионов, образовавших эмбриональные разрастания 4 (26,6%) 8 (66,6%) 8 (80%) К-во эмбрионов, образовавших первичные колонии КЗ-подобных клеток О К-во эмбрионов, образовавших колонии КЗ-подобных клеток, культиви-вавшиеся в течение 4-х пассажей О

2 (16,6%) 3 (30%)

О

2 (20%)

Табл. N 6.

Влияние фидерного слоя на получение мышиних'ЕБ-подобных клеточных колоний.

Тип фидерного слоя хТ

1

Число прикрепленных эмбрионов Число эмбрионов, образозовавших эмбриональные разрастания Число эмбрионов, прошедших пассаж

Число эмбрионов, Ев-колонии которых культивировали до I пассажа

Число эмбрионов, ЕБ-колонии которых культивировали до IV пассажа

12

8 6 6

3

2

х) 1 -0.1% желатин; 2 - клетки эмбриональных фибробластов мыши; 3 - И1Н ЗТЗ клетки

ни тип культуральнои среды не оказывали влияния.

В течение 2-3 дней развития эмбриональных разрастаний.в культуре ВКМ-компсненты разрастаний пролиферировали и формировали многослойные структуры, подобные яйцевому цилиндру

9

8

О

Табл. N 7.

Влияние культуральной среды на получение мышиных ЕЭ-по-. • добных колоний клеток.

1 Тип культуральной » среды х7

112 13

Число эмбрионов, прошедших

пассак 0 8 6 5

Число эмбрирнов, ЕБ-колонпи

которых культивировали до

I пассажа 5 0 0

Число эмбрионов, ЕБ-колонии

которых культивировали до 2

IV пассажа 0 0

х) 1 - альфа-МЕМ; 2 - alpha-MEM + 60% BRL-кондициониро-ванной среды; 3 - alpha-MEM + 20% BRL-кондиционированной среды

Эти структуры были окружены гигантскими клетками трофобласта. На этой стадии развития разрастаний ВКМ-ком-поненты аккуратно изолировали и пассировали ( после дезагрегации трипсином ) на свежий фидер того же типа. Каждый ВКМ-компонент пассировали в отдельную чашку,- Некоторые из ВКМ производных прикреплялись к фидерному'слою, продолжали делиться и давали начало маленьким колониям клеток, которые становились видимыми через 2 дня культивирования. В среднем на каждую чашку образовывалось от 15 до 18 колоний клеток.

Колонии клеток на основе их морфологии классифицировали на несколько типов. Большинство колоний были определены как состоящие из дифференцированных клеток. Колонии, состоящие из малого числа круглых клеток с большим ядром и минимальным количеством цитоплазмы, были охарактеризованы как колонии ЕБ-подобных клеток.

Колонии ЕБ-подобных клеток мышей пассировали на свежие фидерные слои. Часть из них сохраняла стабильный фенотип и росла без видимых признаков дифференцировки. Такие колонии

поддерживали в культуре. Часть кслоний уходили в дифференци-ровку и формировали эмбрисидные тельца.

Ни один из ферментативно денудированных эмбрионов мышей или интактных эмбрионов на стадии поздней морулы не дали начало образованию ES-подобных колоний и только ограниченное число эмбрионов на стадии средней и поздней бластоцисты (15,6% и 30% соответственно ) были способны генерировать колонии ES-подобных клеток.

Тип фидерного слоя тактически не оказывал влияния на образование первичных колоний ES-подобных клеток, но тип культуральной среды оказывал заметное влияние на их образование. Все из ES-подобных колоний были получены при культивировании в среде альфа-МЕМ без добавления J} каком-либо соотношении BRL-кондиционированной среды.

IV. Обсуждение результатов исследований.

Результаты исследований, проведенных нами в выше указанный период времени, позволяют сделать заключение о том, что . методические подходы, разработанные для получения мышиных ES клеток, мало применимы для получения ES клеток с.-х. животных, в особенности свиней. Основной причиной этого является, по-видимому, различия в раннем эмбриональном развитии мышей и копытных животных ( в частности коров и свиней ).

По мнению Evans and Moore ( 1990 ) первое отличие вира-''' жается во времени и характере имплантации. У мышей процесс имплантации - это быстрый и инвазивный процесс, протекающий в течение полусуток с момента выхода эмбриона из zona' pelluclda. У копытных животных имплантация происходит по истечении значительного времени после выхода эмбриона из zona

pelluclüa и тогда, когда уже начался процесс гаструляции. Второе отличие выражается в характере развития ВКМ. У (лышеи ВКМ представлена в виде компактной плотной массы клеток. У копытных же животных клетки ВКМ распологаются упорядочение в несколько слоев, образуя так называемый эмбриональный диск ( Карлсон," 1933 ). Третье отличие может выражаться в разной метаболической активности и динамике дробления клеток ВКМ у эмбрионов мышей и эмбрионов копытных животных, в частности свиней. У копытных животных клетки ВКМ образуют эмбриональный диск, отличающийся низкой метаболической активностью и находящийся в покоящемся состоянии, продолжающемся до начала гаструляции ( Evans and Moore 1990, Evans et al., 1990 ). При выделении ВКМ из эмбрионов свиней нами ( Васильева и др., 1990; Vasllieva et al., 1992 ) были получены эмбриологические данные, косвенным образом подтверждающие наличие облигаторного периода у клеток ВКМ. Оказалось, что в течение 4 суток развития in vivo со стадии ранней бластоцисты ( вымывание эмбрионов на 5 день после искусственного осеменения или естественного спаривания ) до стадии экспандированной бластоцисты ( вымывание эмбрионов на 8 день после искусственного осеменения или естественного спаривания) количество клеток ВКМ увеличилось лишь в-4 раза ( табл. N 4., рис. К '1 ), причем в период развития со стадии средней бластоцисты до стадии экспандированной. бластоцисты число клеток ВКМ увеличилось менее чем в 2 раза. Сравнение теоретически возможного числа клеток ВКМ свиней, исчисленного на основе скорости дробления, характерной для клеток ВКМ мышей ( удвоение клеток происходит каждые 11-13 часов ), с фактически имеющимся числом клеток (• рис. N 1 ) позволяет охарактеризовать

скорость дробления клеток ВКМ свиней как очень низкую. Это, по нашему мнению, является следствием покоящегося состояния ВКМ свиней.

Таким образом, анализ результатов, полученных в наших экспериментах с эмбрионами свиней, позволяет сделать вывод о том, что 1) нами использовались эмбрионы на стадиях, неподходящих для получения ЕБ клеток; 2) ориентация на стадии развития эмбрионов, использующиеся для получения ЕБ- клеток мышей, оказалась неопрпр.панной. Для эмбрионов каждого вида с.-х. животных должна быть найдена своя стадия эмбрионального развития, на которой становится возможным получение ЕБ клеток.

При культивировании эмбрионов коров на более поздних стадиях развития были получены следующие результаты. Только 14,3% эмбрионов коров, культивировавшихся со стадии экспан-дированной бластоцисты, давали начало первичным колониям ЕЗ-подобных клеток ( рис. 2 ), которые, однако, не удавалось поддерживать в культуре. Вместе с тем 42,9% эмбрионов, культивировавшихся со стадии, вылупившейся бластоцисты, давали начало первичным колониям ЕЗ-подобных клеток ( рис. 2 ), большая часть которых поддерживалась в культуре в течение 3 пассажей без потери фенотипа.

Анализ эффективности получения колоний ЕЗ-подобных клеток позволяет высказать предположение о том, что для получения колоний ЕЗ-подобных клеток коров предпочтительно использовать эмбрионы на стадии вылупившейся бластоцисты или на более поздней стадии.

Результаты наших исследований ( Васильева и др., 1990; УаэШеуа е1 а1., 1992 ) по получению ЕЗ-подобных клеток ко-

ров с использованием фидерных слоев различных видов показывают возможность использования фидерного слоя клеток грану-лезы фолликулов свиньи для получения с высокой степенью эффективности коровьих ES-подобных клеток и поддержания их в культуре по крайней мере в течение 3 пассажей.

В наших исследованиях мы не имели возможности провести эксперименты по получению химерных животных с использованием полученных нами ES-подобных клеток коров и мышей с целью подтверждения их плюрипотентности. Однако характеристики полученных нами колоний мышиных и коровьих клеток ( сохранение фенотипа ES клеток в течение 3-4 пассажей и их способность образовывать эмбриоидные тельца'( что, по мнению Robertson and Bradley ( 1986 ) и Evans et al., ( 1990 ), является одной из характерных черт колоний ES клеток ) позволяет нам рассматривать колонии клеток, полученные в нашем исследовании, колониями клеток, обладающими характеристиками колоний плюрипотентных клеток.

V. .Выводы.

1. Были получены мышиные и коровьи колонии клеток, обладающие характеристиками плюрипотентных клеток и поддерживаемые в культуре в течение 3-4 пассажей..

2. Для получения ES-подобных клеток коров целесообразно использовать эмбрионы на стадии вылупившейся бластоцисты.

3. Фидерный слой клеток гранулезы фолликулов свиней можно использовать для получения и поддержания в культуре коровьих ES-подобных клеток.

. 4. Получены данные, подтверждающие существование в развитии эмбрионов свиней периода покоящегося эмбрионального

Pjc. 1. uíjeMCKjc 'cvj^ecmfo ►•лете PKW Ь

b»ocn »«ист ь Ь— « е jrrin итч. сцтчц,

Pv.c. 2. пел w► »j л n^fbosH-* * юло-rjp

еггколо^х кл«г.г-о'. когоЬ 6 зсЬисимосгпи ОСП cmoóju pO'.¿jmus

ГЮС^кЛД fwT4 WCMMic-^GM»«« « ■ > te A yr, u6cj Q PC *

■ блостсиистс • блсстсииспо • -блеетоц уста

диска, продолжающегося вплоть до начала гаструляции.

5. Для получения ES-подобных клеток свиней необходимо, видимо, использовать эмбрионы на стадиях, соответствующих 11—12 дню эмбрионального развития.

По теме диссертации опубликована следующие работы:

1. Васильева С.Г., Стрельченко Н.С., Шуть '.Е. // Культивирование клеток эпителия матки и яйцевода, фибробластов иатки и фолликулярных клеток свиней. В: "Культивирование клеток человека и животных". Тезисы докладов III Всесоюзного совещания, 13-15 февраля 1990, Пущино, с. 77

2. Васильева С.Г., Стрельченко Н.С., Шуть '.Е., Васильев И.И. // Культивирование внутренней клеточной массы пре-димплантационных эмбрионов свиней". В: "Культиви рование клеток человека и животных", Тезисы докладов III Всесоюзного совещания, 13-15 февраля 1990, Пущино, с. 78

3. Васильева С.Г., Стрельченко Н.С., Шуть '.Е.л Васильев И.К. // Выделение и культивирование внутренней клеточной массы предимплантационных эмбрионов с.-х. животных". В: "Проблемы' развития биотехнологии в животноводстве". Тезисы докладов Всесоюзного научно-технического совещания, .9-10 октября 1990 г., сс. 74-76.

4. Vasllleva S.G., Vaslllev I.M., Strelchenko N.S. // The establishment of pig and bovine embryonic stem cells". In: "Genetyka 2Ö00". . Materlaly konierencjl, XI Walny zjazd PTG, Krakow, 10-11 wrzeslen 1992, p. 34.