Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Оценка влияния нефтегазодобычи на кариотипическую дестабилизацию и активность эстераз у рыб Каспийского моря

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Оценка влияния нефтегазодобычи на кариотипическую дестабилизацию и активность эстераз у рыб Каспийского моря"

На правах рукописи

ЕСАУЛЕНКО АННА ВЛАДИМИРОВНА

ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ НЕФТЕГАЗОДОБЫЧИ НА КАРИОТИПИЧЕСКУЮ ДЕСТАБИЛИЗАЦИЮ И АКТИВНОСТЬ ЭСТЕРАЗ У РЫБ КАСПИЙСКОГО МОРЯ

Специальность 03.00.16 - экология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ростов-на-Дону, 2004

Работа выполнена в Астраханском государственном техническом университете (АГТУ)

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

ЯКУБОВ Шамас Абдурахманович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

БАКАЕВА Елена Николаевна

Ведущая организация: Краснодарский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства (КрасНИИРХ)

диссертационного совета K307.0U.01 при Азовском научно-исследовательском институте рыбного хозяйства (АзННИИРХ) по адресу: 344007, г.Ростов-на-Дону, ул. Береговая, 21/2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке АзНИИРХа.

кандидат биологических наук, доцент ПОЛЯРУШ Вячеслав Петрович

Защита состоится декабря 2004 г. в /5"

часов на заседании

Автореферат разослан

2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Зинчук О.А.

дах-г

^/г

2 [£Ь\П

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема сохранения биоразнообразия гидробионтов, в том числе рыб, в связи с загрязнением акватории Каспийского моря в настоящее время приобретает особую остроту из-за предстоящего освоения углеводородных запасов и ведущимся поисковым бурением скважин в его северной части. Подобная ситуация побуждает к исследованию и оценке биологических эффектов комплексного загрязнения на популяции ценных промысловых рыб.

Решение многих задач ихтиологии связано не только с вопросами сохранения популяций рыб в естественных водоемах, искусственного воспроизводства и совершенствования технологии ведения аквакультуры, но и с проблемами изучения закономерностей и особенности жизнедеятельности рыб. На современном этапе развития ихтиологии важную роль приобретают биохимические, гематологические и генетические методы, позволяющие объяснить глубинные процессы, происходящие в организме рыб, и понять их механизмы.

Продукты антропогенного воздействия помимо общих токсических эффектов (анемия, подавление роста, смертность) могут вести к увеличению уровня генетических повреждений в кроветворных клетках рыб, занимающих различные экологические ниши (ЬаЬс1еие,1983;.1ау1е1 е1.а1.,1986;2о11 е1.а1.,1988; А1-8аЬп,1992). Накопление мутаций, как правило, приводит к повышению нестабильности генотипа и изменению биохимического статуса организма. Поэтому важную прогностическую и информативную ценность имеет контроль за состоянием механизмов, обеспечивающих стабильность генома и ферментативную активность органов рыб. Поскольку кариотипы рыб весьма сложны для анализа, возникает необходимость в применении быстрых и простых методов оценки структурной нестабильности генома.

Таким образом, существует необходимость в проведении исследований, разработке и внедрении в практику соответствующих тестов, предназначенных для определения влияния внешних факторов на функциональное состояние

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ* БИЬ ПСКА С.Игтероург гообрк

рыб. Проведение мониторингов с диагностической и прогностической целью является не только необходимым средством для оценки состояния популяций ихтиофауны, но и способствует получению широкой достоверной информации, одинаково полезной как для прикладной, так и для фундаментальной ихтиологии.

Цели и задачи исследований. Цель нашей работы заключалась в изучении степени дестабилизации генома, экспрессии рибосомных цистронов и ферментативного статуса рыб Северного Каспия в районах поискового бурения нефтяных и газовых скважин с дальнейшим использованием этих показателей и методов в качестве тестов экологического и ихтиологического мониторинга.

В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:

1. Определить частоты встречаемости в эритроцитах крови осетровых, карповых, бычковых рыб северной части Каспия аномалий ядер, в частности микроядер и «хвостатых» ядер в зависимости от возраста, пола и районов поискового бурения нефтяных и газовых скважин;

2. Исследовать величину частоты встречаемости ядрышек и фибриллярных центров в эритроцитах крови осетровых и карповых рыб в зависимости от пола;

3. Определить степень холинэстеразной активности печени рыб различных систематических групп, возраста и пола в районах поискового бурения нефтяных и газовых скважин;

Научная новизна. Впервые определены видовые показатели частоты встречаемости микроядер в эритроцитах отдельных представителей осетровых, карповых, бычковых рыб.

Обнаружено увеличение частоты встречаемости микроядер и «хвостатых» ядер эритроцитов у самок и снижение этих показателей у самцов рыб. Определено число ядрышек в эритроцитах изучаемых видов рыб.

Отмечено, что индекс фибриллярных центров осетровых выше, чем у

карповых. Установлено, что у самок осетровых индекс фибриллярных центров превышает аналогичный индекс у самцов.

Определены фоновые показатели активности холинэстеразы у рыб.

Отмечена взаимосвязь между уровнем мутационных клеток, активностью холинэстеразы и экологической обстановкой в районах отбора проб.

Практическая значимость. Показана возможность использования регистрации частоты встречаемости микроядер и «хвостатых» ядер, а также активности холинэстераз для экспресс-мониторинга популяций рыб на предмет степени негативного антропогенного воздействия.

Фоновые показатели видовых, возрастных и половых особенностей дестабилизации генома и активности холинэстеразы печени рыб в перспективе могут быть использованы в аквакультуре при формировании ремонтно-маточных стад и получении жизнестойкого потомства.

Положения, выносимые на защиту:

- кариотипическая нестабильность осетровых, карповых и бычковых рыб различного возраста и пола в районах отлова в Северном Каспии;

- холинэстеразная активность печени осетровых, карповых и бычковых рыб различного возраста и пола в районах отлова в Северном Каспии;

-оценка влияния неблагоприятной экологической обстановки на кариотипическую дестабилизацию и активность холинэстеразы у рыб в Северном Каспии;

Апробация работы и публикация материалов исследований.

Материалы диссертационной работы доложены на заседаниях кафедры «Водные биоресурсы и аквакультура» АГТУ, на Всероссийской конференции "Проблемы морфологии (теоретические и клинические аспекты)" (Сочи, 2002); на 2-й конференции Московского общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова "Актуальные проблемы генетики" (Москва, 2003).

Основные положения отражены в 5 публикациях.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 109 листах

машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, исследований и их обсуждения, заключения и выводов, практических предложений, включает 10 таблиц и 16 рисунков. Список цитированной литературы содержит 192 источника, в том числе 108 на иностранных языках.

Глава 1. КРИТЕРИИ ИХТИОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА ПО ПОКАЗАТЕЛЯМ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКОГО, ГЕНЕТИЧЕСКОГО

И БИОХИМИЧЕСКОГО ГОМЕОСТАЗА (литературный обзор)

Представлен обзор литературных данных о влиянии нефти и нефтепродуктов на гидробионтов, критериях экологической и ихтиологической оценки состояния рыб по гематологическим показателям и генетического гомеостаза у растений, животных и человека.

Даны современные представления об оценке степени кариотипической гетерогенности клеточных популяций по показателям морфологических аномалий клеток - микроядер и «хвостатых» ядер. Показаны особенности морфологии и физиологические функции ядрышек и ядрышкообразующих районов хромосом в транскрипции и процессинге р-РНК и р-ДНК. Дан анализ методов определения морфологических аномалий клеток.

Обсуждены сведения о функциональной роли эстераз у рыб и других животных. Представлены сведения об использовании микроядерного теста, как экспресс-метода для обнаружения генотоксических соединений у рыб.

Отмечена фрагментарность этих исследований, которые до настоящего времени ограничены работами с представителями семейства сиговых (Захидов и др., 1996), карликовой евдошкой (Hooftman, Raat, 1996), тиляпией (Гришанин, 1993), белугой и бестером (Тюкачева, 1996).

Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследований были 7 видов рыб, представители 3 семейств: Acipenseridae - русский осетр Acipenser guldenstadti Brand, персидский осетр Acipenser guldenstadti persicus Borodin, севрюга Acipenser stellatus Pallas и

белуга Huso huso L., Cyprinidae - восточный лещ Abramis brama orientalis и вобла Rutilus rutilus caspicus Jak., Gobiidae - бычок-головач Neogobius kessleri.

Отлов рыб проводили в плановых экспедициях Каспийского научно-исследовательского института рыбного хозяйства (КаспНИИРХ) с 10 октября по 20 октября 2001 года и с 16 октября по 6 ноября 2002 года. При отборе рыб в осенних рейсах мы руководствовались физиологическими особенностями и особенностью поведения рыб, в частности сезонными миграциями в прибрежную зону или на более глубокие участки моря, активным питанием или угасанием пищевого рефлекса. Согласно поставленной задаче отлов рыб осуществляли на полигонах «KHK», «Широтная», «Ракушечная», «Сарматская» и «Хвалынская», расположенных на российской территории Северного Каспия (рис. 1). Интерес к данным полигонам был обусловлен тем, что на них проводилось поисковое бурение нефтяных и газовых скважин: на полигонах «КПК» и «Хвалынская» - до 2000 года, «Широтная» - в 2000 году, «Ракушечная» - в 2001 году и «Сарматская» - в 2002 году.

Для изучения цитогенетических и биохимических показателей рыб с различных полигонов Северного Каспия использовали мазки крови и печень. Одновременно определяли пол и возраст особей.

Гематологические препараты периферической крови приготовляли общепринятым методом: фиксировали 96° этиловым спиртом, затем окрашивали по Романовскому-Гимза и, дополнительно, флюорохромом DAPI. Частоту встречаемости эритроцитов с микроядрами и «хвостатыми» ядрами, определяли на гематологических препаратах под иммерсией при увеличении об.ЮОХ и ок.ЮХ на микроскопе «Olympus» (Япония), применяя зеленый светофильтр. Число исследованных эритроцитов у каждой рыбы составлял 10000 клеток. Частоту встречаемости микроядер и аномалий ядер выражали в промиллях (%о).

Ядрышки в клетках окрашивали коллоидным раствором нитрата серебра по методике Н Н. Мамаева (1998). Учитывали число ядрышек на клетку и число фибриллярных центров на клетку. Расчет индекса фибриллярных

Рис.1. Схема отбора проб и расположения пробуренных скважин

Условные обозначения:

курс корабля в первой экспедиции (2001г.) курс корабля во второй экспедиции (2002г ) нефтяные и газовые скважины станции отбора проб

Рис.2. Распределение частоты встречаемости микроядер (вверху) и «хвостатых» ядер (внизу) в районе исследований

центров проводили по формуле:

1ф=1ФЦ/п,где 1ф - индекс фибрилярных центров;

£ФЦ - сумма найденных в клетках фибрилярных центров; п - количество проанализированных клеток.

В экспериментах по изучению холинэстеразной активности печени были использованы замороженные образцы печени и субстраты - ацетилтиохолин бромид (АТХ), пропионилтиохолин иодид (ПТХ), бутирилтиохолин иодид (БТХ), реактив Эллмана, аптечный 0,05%-ный раствор прозерина. Гомогенаты готовили в стекляном гомогенезаторе с пришлифованным пестиком, охлаждаемым водой со льдом, на дистиллированной воде в концентрации 1:49 (вес/объем). Затем центрифугировали в течение 15 минут при 10000 g на центрифуге К-24 (Германия) и использовали надосадочную жидкость в качестве источника фермента. Холинэстеразную активность определяли по методу Эллмана.

Статистическую достоверность оценивали с помощью непараметрического U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни и t-критерия Стьюдента. (Лакин,1973). Коэффициент корреляции определяли по Спирмену.

Основной материал получен при исследовании двух видов рыб -русского осетра и каспийской воблы. Всего обработано и проанализировано проб: ихтиологических - 422, в том числе определение пола и возраста; гематологических (цитогенетических) - 422, в том числе определение аномалий ядер эритроцитов крови и фибриллярных центров в интерфазных клетках; биохимических - 99, в том числе определение специфической холинэстеразы и активности холинэстеразы в печени рыб.

3. ГИДРОЛОГИЧЕСКИЕ И КЛИМАТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ КАСПИЙСКОГО МОРЯ

Дана характеристика основных гидрологических и климатических параметров, наиболее влияющих на распространение и седиментацию нефти и

нефтепродуктов в естественных водоемах: течения, ветры, глубины, температуры, ледообразование, особенности минерального состава, соленость и взвешенные вещества.

4. КРАТКАЯ БИОЛОГИЯ ОБЪЕКТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ Представлены некоторые особенности биологии объектов исследований (распространение, распределение по районам, в том числе глубинам, сезонные миграции и активность, питание и пищевые объекты), по которым можно судить о характере, возможности и степени влияния на них нефтяного загрязнения.

Глава 5. КАРИОТИПИЧЕСКАЯ НЕСТАБИЛЬНОСТЬ ЭРИТРОЦИТОВ КРОВИ ОСЕТРОВЫХ, КАРПОВЫХ И БЫЧКОВЫХ РЫБ КАСПИЙСКОГО МОРЯ 5.1. Морфологические аномалии ядер эритроцитов крови и частота

встречаемости у рыб Одним из наиболее опасных следствий загрязнения водной среды является накопление в компонентах экосистем веществ, способных повреждать генетический аппарат клетки - генотоксинов. Опасность этих соединений в том, что последствия вызываемых ими генетических изменений могут проявляться в ряду поколений. Разрывы ДНК ведут к формированию аберраций клеток (ЫогЬигу. Н1скБоп. 2001). Образование микроядер в клетках (тельца Хоуэлла-Жолли) служит внешним проявлением аберраций, а высокий уровень частоты встречаемости микроядер отражает общую нестабильность генома. К ядерным аномалиям относят также «хвостатые» ядра эритроцитов, уровень которых также оценивается по частоте встречаемости. Образованные дицентрическими хромосомами (хроматидами) мосты могут разрываться и формировать ядра с морфологическими аномалиями типа «хроматических хвостов», не втягивающихся в ядро, что приводит к появлению клеток с «хвостатыми» ядрами.

Эритроциты крови представителей осетровых, карповых и бычковых рыб по морфометрическому строению не отличались. Все они овальной

формы, многоядерные, как и у других рыб.

Из аномалий выявлены микроядра, как правило, по одному в клетке и «хвостатые» эритроциты. Микроядра в эритроцитах представляли собой округлые, содержащие хроматин образования, размером 1,5-2 мкм (рис. 3)

Рисунок 3 - Микроядро в эритроците рыбы. Окраска флуоресцентным красителем. Об.ЮОх; ок.1 Ох После окрашивания по Гимза микроядра имели оттенки от темно-синего

до фиолетового цвета. Чаще всего они были овальной формы и располагались

эксцентрично или в центре клетки.

Аномалии ядер типа «хвостов» представляли собой тонкие выросты,

отходящие от ядра, не более 1 выроста на ядро (рис. 4).

Рисунок 4 - «Хвостатое» ядро в эритроците рыбы. Окраска флуоресцентным красителем. Об.ЮОх; ок.1 Ох

Толщина их не превышала 0,1 мкм, длина составляла 1,5-2 мкм. В некоторых случаях вырост завершался терминальным расширением тела в форме каплевидного микроядра. Каплевидное терминальное расширение «хвостов» окрашивалось чаще всего неоднородно: интенсивность окраски усиливалась от центра к краям. Иногда в цитоплазме эритроцитов вместе с «хвостами» встречались мелкие микроядра. Часто встречались «хвосты» в виде толстых выпячиваний.

Наблюдаемые и регистрируемые нами типы аномалий ядер клеток соответствовали всем принятым морфологическим критериям микроядер и «хвостатых» ядер в эритроцитах (Прокофьева-Бельговская,1961; Muller, Streffer, 1995).

В процессе синтеза прерибосом образование ядрышек идет только на активных ядрышкообразующих районах хромосом. Плотный фибриллярный компонент считается центральной структурой ядрышка, отражающей процессы транскрипции р-ДНК и процессинга р-РНК (Schwarzacher, 2001). Для изучения степени устойчивости генома мы оценивали индексы интерфазных ядрышек и фибриллярные центры рибосомных цистронов эритроцитов крови (рис. 5).

* Ф

У

Рисунок 5 - Фибриллярные центры рибосомных цистронов эритроцитов крови рыбы. Окраска методом серебрения. Об.ЮОх; ок.Юх

В научной литературе отмечается перспектива использования ядрышковых организаторов для оперативной обработки больших выборок особей на предмет изменения транскрипционной и пролиферативной активности, а также информативность и простоту методов (Мамаев, 1998).

Сравнительный микроядерный анализ спонтанной хромосомной нестабильности у осетровых, карповых и бычковых рыб выявил достоверные различия по частоте встречаемости микроядер и «хвостатых» ядер между исследуемыми рыбами (таблица 1).

Таблица 1 - Частоты встречаемости аномалий ядер _эритроцитов крови рыб, %о_

Год Семейство Частота встречаемости эритроцитов с "хвостатыми" ядрами

X ± ш СУ X ± т Су

2001 Осетровые 1,45±0,16 55,8 0,23±0,04 73,9

Карповые 1,22±0,07 59,8 0,27±0,02 70,3

2002 Осетровые 0,88±0,096 53,1 0,21±0,025 53,3

Карповые 0,63±0,116 49,2 0,18±0,037 46,5

Бычковые 0,37±0,111 59,1 0,10±0,041 81

Согласно результатам двухгодичных исследований (2001-2002 гг.) частота встречаемости микроядер в эритроцитах крови наибольшая у представителей семейства осетровых и превышает аналогичный показатель для карповых рыб более чем на 16%. Частота встречаемости эритроцитов с «хвостатыми» ядрами выше у карповых - более чем на 14% по сравнению с осетровыми. Самые низкие показатели аномалий ядер эритроцитов наблюдали у бычковых - в 1,7-2,3 раза по микроядерному тесту и в 1,8-2,1 раза по частоте встречаемости «хвостатых» ядер.

Следует отметить нестабильность отмеченных аномалий по годам, что, вероятно, обусловлено изменяющимися условиями обитания рыб. Так, частота встречаемости микроядер в эритроцитах у представителей осетровых в 2001 г. была выше на 16%, а в 2002 г. - на 28% по сравнению с карповыми рыбами. Частота встречаемости «хвостатых» ядер в 2001 г. у карповых превышала данный показатель для осетровых на 17%, а в 2002 г. - была ниже на 14%.

Несмотря на выявленные аномалии и их количественные различия в зависимости от принадлежности к определенному семейству и по годам, стабильность генома исследованных рыб можно оценить как удовлетворител ьну ю.

5.2. Частота встречаемости аномалий ядер эритроцитов крови рыб (осетровых, карповых, бычковых) в зависимости от района разведочного бурения нефтяных и газовых скважин Основные источники загрязнения вод Каспийского моря - речной сток, стационарные стоки промышленных и хозяйственно-бытовых объектов, деятельность флота и предприятий по добыче и переработке нефти и газа.

С целью количественной оценки аномалий ядер эритроцитов крови рыб в зависимости от мест распределения в море в связи с возможным загрязнением некоторых участков водного пространства мы исследовали частоту встречаемости микроядер и эритроцитов с «хвостатыми» ядрами в отдельных районах Северного Каспия, где проводились поисковое разбуривание нефтяных и газовых скважин. По показателям микроядерного теста и частоте встречаемости «хвостатых» ядер эритроцитов каких либо существенных различий в зависимости от района и времени разработки скважин не отмечено. Наши результаты подтверждаются 30-летними исследованиями экологических последствий разведочного бурения, согласно которым все основные параметры морской среды остаются неизменными, так как происходит быстрое разбавление буровых растворов на водной основе Практически невозможно обнаружить какие-либо устойчивые необратимые биологические эффекты в толще морской воды и в случае нефтесодержащих отходов бурения (Патин, 1997).

Иные результаты были получены в районах, которые по данным КаспНИИРХ характеризуются различным уровнем загрязнения.

Так, самый высокий уровень микроядер и «хвостатых» ядер в эритроцитах рыб наблюдали в 1 - западном районе. Самое низкое количество микроядер и «хвостатых» ядер во 2 - фоновом (таблица 2).

Таблица 2 - Частота встречаемости аномалий ядер эритроцитов крови у рыб из различных районов Северного Каспия

Район Частота встречаемости микроядер в эритроцитах Частота встречаемости эритроцитов с «хвостатыми» ядрами

X ± Ш, %о Лимиты СУ X ± т, %о Лимиты СУ

1 - западный 1,64 ±0,3 0,9-3,0 48,6 0,41 ±0,12 0,1-0,8 75,6

2- фоновый 0,98+0,10 0,5-1,7 35,7 0,22 ± 0,04 0,1-0,5 59

3 1,16±0,09 0,3-3,4 56,8 0,25 ± 0,02 0,1-0,8 56

4 - восточный 1,29 ±0,16 0,2-3,5 67,4 0,26 ± 0,04 0,1-0,7 73

Районы 3 и 4-восточный с повышенными показателями числа аномалий ядер эритроцитов занимали промежуточное положение. При этом коэффициент вариабельности частоты встречаемости «хвостатых» ядер превышал данный показатель для микроядер более чем в 1,3 раза.

Следует отметить, что уровень встречаемости «хвостатых» ядер эритроцитов у рыб в 1-западном районе более чем в 1,5 раза выше, чем в других исследуемых нами участках моря. Однако различия по частоте встречаемости микроядер в эритроцитах крови рыб на данном участке не превышали 1,3 раза.

Отсюда возможен вывод о наибольшем экологическом благополучии для рыб во 2-фоновом районе. Повышенное содержание микроядер и «хвостатых» ядер в 3-м и 4-м восточном районах можно объяснить наличием на их территории нефтегазовых скважин (рис. 1,2), и следовательно складывающейся там неблагоприятной экологической обстановкой. Первый западный район приближен к береговой зоне, что служит причиной повышенного уровня кариотипических нарушений у рыб, отловленных в этом районе. Прибрежные зоны крупных водоемов давно выделяются как особые объекты, которым свойственны высокая плотность населения, сложное сочетание различных видов хозяйственной деятельности, специфические природные условия и

повышенный уровень нагрузки на природную экосистему.

5.3. Частота встречаемости аномалий ядер эритроцитов крови карповых рыб в зависимости от возраста

С целью определения уровня генетических повреждений в клеточных популяциях в связи с возрастом, мы изучали количество аномалий ядер эритроцитов у карповых рыб (воблы, леща) в возрасте около 2 лег и половозрелых и неполовозрелых в возрасте более 4 лет (таблица 3).

Таблица 3 - Частота встречаемости аномалий ядер эритроцитов крови

карповых рыб в зависимости от возраста и полово зрелости

Возраст, лет Частота встречаемости микроядер в эритроцитах Частота встречаемости эритроцитов с «хвостатыми» ядрами

X ± ш, %о Лимиты СУ X ± ГП, %о Лимиты Су

4+ половозрелые 1,25 ±0,16 0,3-3,5 65,6 0,29 ± 0,05 0,1-0,8 75,8

4+ неполовозрелые 1,08 ±0,14 0,3-3,3 62,9 0,26 ± 0,04 0,1-0,8 61,5

2 1,26 ±0,11 0,2-3,4 53,9 0,25 ± 0,03 0,1-0,7 72

Согласно данным таблицы 3, количество аномалий ядер эритроцитов крови у исследованных карповых рыб не зависит от их возраста и половозрелости. Максимальные и минимальные величины аномалий (лимиты) были достаточно близкими при высокой вариабельности данных показателей, что и определило недостоверность различий средних значений частоты встречаемости микроядер и «хвостатых» ядер в эритроцитах воблы и леща, которые составляли 11- 17%.

5.4. Частота встречаемости аномалий ядер эри1роцитов крови

осетровых и карповых рыб в зависимости от пола В связи с поставленной задачей изучали наличие количеавенной взаимосвязи между генетически аберрантными эритроцитами крови и полом карповых и осетровых рыб. Результаты этих исследований в 2001 г. представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Частота встречаемости микроядер в эритроцитах рыб

в зависимости от пола (2001 г.), %о

Пол Карповые Осетровые

Частота Лимиты СУ Частота Лимиты Су

Самки 1,24±0,11 0,3-3,5 62,0 1,55±0,19 0,1-2,6 46,4

Самцы 1,19±0,11 0,2-3,3 56,3 0,97±0,08 0,7-1,4 23,7

Согласно данным таблицы 4, частота встречаемости микроядер в эритроцитах крови самок осетровых рыб в 2001 г. была достоверно больше почти в 1,7 раза по сравнению с самцами. В отношении аномалий у самок и самцов карповых рыб существенных отличий не отмечено. Наблюдается незначительная тенденция к увеличению частоты встречаемости микроядер эритроцитов у самок.

Существенные различия между количественными показателями аномалий эритроцитов у самок и самцов осетровых рыб подтвердились результатами исследований 2002 г. (таблица 5).

Таблица 5 - Частота встречаемости аномалий ядер в эритроцитах в

зависимости от пола осетровых рыб (2002 г.), %о

Пол Частота встречаемости микроядер в эритроцитах Частота встречаемости эритроцитов с «хвостатыми» ядрами

Частота Лимиты Су Частота Лимиты Су

Самки 1,11±0,112 1,8-0,4 39 0,21 ±0,03 0,4-0 51,3

Самцы 0,53±0,099 0,9-0 49,7 0,18±0,06 0,4-0 72.4

Так, у самок осетровых частота встречаемости микроядер в эритроцитах крови в 2 раза, а частота встречаемости «хвостатых» ядер на 16% было выше по сравнению с самцами при достоверных различиях.

Кариотипическая дестабильность наиболее характерна для самок рыб в сравнении с самцами, вероятно, это связано с изменениями гормонального статуса и различиями в физиологической нагрузке при созревании гонад.

5.5. Индексы интерфазных ядрышек рибосомных цистронов крови рыб

Для определения степени устойчивости генома мы оценивали индексы интерфазных ядрышек в эритроцитах осетровых, карповых и бычковых рыб. Ядрышки образуются особыми участками хромосомной ДНК, называемых районами ядрышковых организаторов или ядрышками рибосомных цистронов крови. Участки эти'кодируют и синтезируют рибосомную РНК (Perry, 1967) Отвечают ядрышки за регуляцию уровня транскрипции р-ДНК, процессы клеточного роста, синтез белка и т.д.

Сравнительный анализ интерфазных ядрышек рибосомных цистронов крови рыб выявил наибольшую величину индекса фибриллярных центров у осетровых рыб, который на 10,4 и 12,5% превышал данный показатель у карповых и бычковых хотя и без достоверных отличий (таблица 6).

Таблица 6 - Индекс интерфазных ядрышек эритроцитов рыб

Семейство рыб ИИЯЭ* Лимиты Cv

Осетровые 7,13±0,19 8,92-5,58 13,3

Карповые 6,34±0,26 7,32-5,06 11,0

Бычковые 6,46±0,24 6,85-5,80 7,4

*- индекс интерфазных ядрышек эритроцитов У осетровых рыб отмечена тенденция увеличения индекса фибриллярных центров у самок по сравнению с самцами. Причем различия достигали почти 18% (таблица 7).

Таблица 7 - Индекс интерфазных ядрышек эритроцитов осетровых рыб в зависимости от пола

Пол рыб ИИЯЭ* Лимиты Cv

Самки 7,58±0,18 8,92-6,42 9,2

Самцы 6,23±0,20 7,36-5,58 9,2

*- индекс интерфазных ядрышек эритроцитов

Глава 6. АКТИВНОСТЬ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ ПЕЧЕНИ РЫБ

Первым этапом проведения исследования была оценка гомогенности холинэстеразной активности печени. С этой целью мы изучали влияние различных концентраций прозерина на скорость гидролиза трех субстратов -ацетилхолинтрансферазы (АТХ), пропионилтиохолина (ПТХ) и бутирилтиохолин иодида (БТХ). Выявлено, что в печени изучаемых нами видов рыб из группы холинэстераз преобладает один фермент. Величина концентраций прозерина, вызывающая 50%-ное ингибирование холинэстеразы печени, была близка для всех трех субстратов при эксперименте на каждом исследованном виде рыб (таблица 8).

Таблица 8 - Концентрации прозерина (150), ингибирующие холинэстеразы печени рыб на 50% (преинкубация 12 минут)

Рыбы Ферменты

АТХ ПТХ БТХ

Вобла 4 Ю-' 3,8 10"7 4,5 Ю-7 4,7 Ю-'

Осетр 3,6 10'* 3,4 10'* 4,5 10'8

4 10'8 4,5 10'8 4 10'8

2,2 10"8 2,2 10'8 3,8 10'"

Белуга 1,8 10 s 1,8 10'8 2,7 10"8

Севрюга 1,6 10"8 2,6 10'8 2,2 10"8

Однако по субстратной специфичности холинэстераза печени русского осетра и каспийской воблы значительно отличаются друг от друга: у русского осетра преобладает пропионилхолинэстераза (ПХЭ), а у каспийской воблы -своеобразная ацетилхолинэстераза (АХЭ или АЭ), которые классифицируются как псевдохолинэстеразы.

В результате исследований активности холинэстеразы в печени русского осетра и белуги, каспийской воблы и бычка-головача отмечены некоторые различия в активности данного фермента в зависимости от вида, пола и

возраста. Так, средние показатели активности холинэстеразы у русского осетра составляли 0,638±0,17 ед., а белуги - 0,234±0,220 ед., что, безусловно, определяется более высокой интенсивностью обмена у белуги по сравнению с осетром (Гершанович и др., 1987) Однако, несмотря на различие в активности фермента почти в 2,7 раза, они статистически не достоверны в виду индивидуального разброса величин и малой выборки белуги. Активность холинэстеразы у каспийской воблы наиболее близка данному показателю русского осетра и составляла 0,537±0,12 ед. У бычка-головача отмечена самая низкая активность холинэстеразы - 0,058 ед., что на порядок ниже по сравнению с другими рыбами.

Сравнительный анализ активности холинэстеразы в печени самок и самцов рыб выявил некоторую тенденцию повышения активности данного фермента у самцов. Наиболее она была выражена у каспийской воблы: у самцов - 0,68±0,22 ед., у самок - 0,45±0,15 ед. У бычка аналогичные показатели составляли 0,07 и 0,05 ед. соответственно. Минимальные различия отмечали у русского осетра: у самцов - 0,69±0,16, у самок - 0,61±0,14 ед.

Изучая активность холинэстеразы у рыб разного возраста мы отметили определенные отличия данного показателя в зависимости от их физиологического состояния. Так, у воблы в возрасте менее 3 лет активность холинэстеразы в среднем составила 0,436±0,027 ед., в возрасте 3 лет -0,696±0,097 ед., а более 4 лет - 0,615±0,06 ед. Следовательно, активность ацетилхолинэстеразы с возрастом достоверно повышается (Р<0,05), что обусловлено повышением активности полостного пищеварения и возрастными гормональными перестройками. Однако у половозрелых рыб, готовых к нересту, активность фермента несколько понижалась, что, вероятно, является откликом организма на перестройку обмена веществ с развитием и созреванием гонад.

Активность холинэстеразы в печени воблы, как наиболее массового объекта, выловленного в районах с различным уровнем загрязнения, выявила определенные различия в активности данного фермента в зависимости от

расположения данного района вблизи или отдаленности от береговой зоны, или дельты Волги (рис. 6).

0,9 0,8 0,7

3 о-в |

А I & 0,5 ,

в 0,4 !

0,057

°'3|

0,2 , 0,1 0

0,115

11

I

0,047

I Ь

0,064

3

Районы

к Л> £

Рисунок 5 - Активность холинэстеразы печени воблы по районам

Так, в выделенном нами фоновом районе 2, активность холинэстеразы печени воблы составила 0,79 ед., в 1-м западном - меньше на 47,4% при достоверном отличии (Р<0,01), а в 3-м и 4-м восточном - меньше на 14,9 и 27,34% соответственно.

ВЫВОДЫ

1. Повышенная частота встречаемости микроядер эритроцитов отмечена у представителей осетровых рыб, а частота встречаемости «хвостатых» ядер -у карповых Более низкий уровень этих показателей - у семейства бычковых

Выявлена зависимость частоты встречаемости микроядер и аномалий ядер эритроцитов крови у рыб от района разведочного бурения нефтяных и газовых скважин, а также от приближенности к береговой зоне.

2. Не обнаружено зависимости частоты встречаемости микроядер и «хвостатых» ядер эритроцитов от возраста и половозрелости у карповых рыб в возрасте до 4+ лет.

3. Показатели дестабилизации генома у самок осетровых выше по сравнению с самцами. Частота встречаемости микроядер в эритроцитах самок

на 37-52% больше, чем у самцов. У карповых рыб отмечена незначительная тенденция к увеличению частоты встречаемости микроядер эритроцитов у самок.

4. Наибольшая величина индекса фибриллярных центров характерна для осетровых рыб. Данный показатель у осетровых по сравнению с карповыми и бычковыми рыбами был выше на 10,4 и 12,5% соответственно. У самок осетровых отмечена тенденция к увеличению индекса фибриллярных цен Iров до 18% по сравнению с самцами.

5. Каталитические свойства холинэстеразы печени исследованных рыб своеобразны и отличаются друг от друга. В активности холинэстеразы печени русского осетра и белуги, каспийской воблы и бычка-головача отмечены различия в зависимости от вида. Средние показатели активности холинэстеразы у русского осетра составляли 0,638±0,17 ед., а белуги -0,234±0,220ед. Активность холинэстеразы у каспийской воблы составляла 0,537±0,12 ед. Самая низкая активность холинэстеразы (0,058 ед.) отмечена у бычка-головача.

6. Величина активности холинэстеразы печени самок и самцов рыб вне зависимости от возраста и районов лова имеет некоторую тенденцию повышения активности данного фермента у самцов. Наиболее она была выражена у каспийской воблы: у самцов - 0,68±0,22 ед., у самок - 0,45±0,15 ед. У бычка аналогичные показатели составляли 0,07 и 0,05 ед. соответственно. Минимальные различия в активности были характерны для русского осетра: у самцов - 0,69±0,16 ед., у самок - 0,61 ±0,14 ед.

7. С возрастом и физиологическим состоянием изменяется активность холинэстеразы печени. У воблы в возрасте менее 3 лет она в среднем составила 0,435±0,027 ед., а в возрасте 3 года - 0,696±0,097 ед. У половозрелых особей, готовых к нересту, в возрасте более 4 лет активность фермента несколько снижается (0,615±0,06 ед.).

8. Активность холинэстеразы в печени рыб (на примере воблы) из районов разведочного бурения не отличалась существенно в зависимости от

расположения и сроков бурения. С увеличением удаленности от прибрежной зоны и снижением загрязнения района отлова активность холинэстеразы печени воблы повышалась почти на 45% (с 0,43 до 0,79 ед.).

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Микроядерный тест совместно с анализом активности эстераз можно использовать как экспресс-методы при экологическом и ихтиологическом мониторинге водных бассейнов.

2. Во время проведения буровых работ в случае аварийного выброса нефти в море значительное повышение количества аберрантных клеток крови, резкое колебание ферментативной активности (ацетилхолинэстеразной) в печени у рыб может свидетельствовать о загрязнении водных пространств, а также служить реперными точками при расчете возможного ущерба биоресурсам из-за антропогенного давления.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Есауленко A.B., Курапов A.A., Гаврилов Б.А., Косякова Г.П., Яковлев А.Ф. Цитогенетический мониторинг рыб Каспийского бассейна.// Всероссийская конференция "Проблемы морфологии (теоретические и клинические аспекты)"./ Тезисы докладов, 2002, Сочи, 23 с.

2. Есауленко A.B., Косякова Г.П. Цитогснет и чес кое изучение кроветворных клеюк рыб Каспийского бассейна.// Материалы 2-й конференции московского общества генетиков и селекционеров им. Н И. Вавилова "Актуальные проблемы генетики", 2003, Москва, Т. 1. С.341-342.

3. Яковлев А.Ф., Гаврилов Б.А., Косякова Г.П., Есауленко A.B., Курапов А.А Возрастные, межвидовые и половые особенности дестабилизации генома у рыб Каспийского бассейна // В кн: Селекционно-генетические методы повышения продуктивности сельскохозяйственных животных. Санкт-Петербург: ВНИИГРЖ, 2003. С.86-92.

4. Моралев С.Н., Есауленко A.B., Курапов A.A., Розенгард Е.В.,

Хованских А Е. Исследование холинэстеразной активности рыб Каспийского моря.// Доклады РАН, 2003, Т.394. №4. С.427-431.

5. Якубов LIJ.A., Есауленко A.B., Суворова Т.Ф., Якубова Д.Ш, Михайличенко Д.В., Крючков В.Н., Зайцев В.Ф. Перспективы внедрения новейших медицинских технологий в нефтегазовом комплексе// Проблемы охраны здоровья окружающей среды: Санкт-Петербург: ВНИИГРЖ, 2004, С.173-177.

Печать цифровая. Бумага офсетная. Гарнитура «Тайме». Заказ N8 340. Тираж 100 экз. Формат 60x84/16. Объем 1,0 уч.-изд. л. Отпечатано в КМЦ «КОПИЦЕНТР» 344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Суворова, 19, тел. 47-34-88

РНБ Русский фонд

2006-4 7415