Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Кариотипическая дестабилизация и активность эстераз у рыб Каспийского моря в местах добычи нефти и газа

ВАК РФ 03.00.10, Ихтиология

Автореферат диссертации по теме "Кариотипическая дестабилизация и активность эстераз у рыб Каспийского моря в местах добычи нефти и газа"

На правах рукописи

ЕСАУЛЕНКО АННА ВЛАДИМИРОВНА

КАРИОТИПИЧЕСКАЯ ДЕСТАБИЛИЗАЦИЯ И АКТИВНОСТЬ ЭСТЕРАЗ У РЫБ КАСПИЙСКОГО МОРЯ В МЕСТАХ ДОБЫЧИ

НЕФТИ И ГАЗА

Специальность 03.00.10 - ихтиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

&&1

Астрахань, 2004

Работа выполнена в Астраханском государственном техническом университете (АГРУ)

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор ЯКУБОВ Шамас Абдурахманович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

МОСКУЛ Георгий Алексеевич

кандидат биологических наук, доцент ПОЛЯРУШ Вячеслав Петрович

Ведущая организация: Краснодарский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства (КрасНИИРХ)

диссертационного совета К307.011.01 при Азовском научно-исследовательском институте рыбного хозяйства (АзНИИРХ) по адресу: 344007, г.Ростов-на-Дону, ул. Береговая, 21/2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке АзНИИРХа.

Автореферат разослан 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

Защита состоится « 23 » июля

часов на заседании

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Проблема сохранения биоразнообразия гид-робионтов, в том числе рыб, в связи с загрязнением акватории Каспийского моря в настоящее время приобретает особую остроту из-за предстоящего освоения углеводородных запасов и ведущимся пробным разбуриванием скважин в его северной части. Подобная ситуация побуждает к исследованию и оценке биологических эффектов комплексного загрязнения на популяции ценных промысловых рыб.

Решение многих задач ихтиологии связано не только с вопросами сохранения популяций рыб в естественных водоемах, искусственного воспроизводства и совершенствования технологии ведения аквакультуры, но и с проблемами изучения закономерностей и особенности жизнедеятельности рыб. На современном этапе развития ихтиологии важную роль приобретают биохимические, гематологические и генетические методы, позволяющие объяснить глубинные процессы, происходящие в организме рыб, и понять их механизмы.

Продукты антропогенного воздействия помимо общих токсических эффектов (анемия, подавление роста, смертность) могут вести к увеличению уровня генетических повреждений в кроветворных клетках рыб, занимающих различные экологические ниши (Lahdetie, 1983; Jaylet et.al., 1986; Zoll et.al., 1988; Al-Sabti, 1992). Накопление мутаций, как правило, приводит к повышению нестабильности генотипа и изменению биохимического статуса организма. Поэтому важную прогностическую и информативную ценность имеет контроль состояния механизмов, обеспечивающих стабильность генома и ферментативную активность органов рыб. Поскольку кариотипы рыб весьма сложны для анализа, возникает необходимость в применении быстрых и простых методов оценки структурной нестабильности генома.

Таким образом, существует необходимость в проведении исследований, разработке и внедрении в практику соответствующих тестов, предназначенных для определения влияния внешних факторов на функциональное состояние рыб. Проведение мониторингов с диагнс "'¿'¿'¿¡"ндцйо+^А^Ш!^|'еСК°^ целью

является не только необходимым средством для оценки состояния популяций ихтиофауны, но и способствует получению широкой достоверной информации, одинаково полезной как для прикладной, так и для фундаментальной ихтиологии.

Цели и задачи исследований. Цель нашей работы заключалась в изучении степени дестабилизации генома, экспрессии рибосомных цистронов и ферментативного статуса рыб Северного Каспия в районах пробного разбури-вания нефтяных и газовых скважин с дальнейшим использованием этих показателей и методов в качестве тестов ихтиологического мониторинга.

В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:

1. Определить частоты встречаемости в эритроцитах крови осетровых, карповых, бычковых рыб северной части Каспия аномалий ядер, в частности микроядер и «хвостатых» ядер в зависимости от возраста, пола и районов

пробного разбуривания нефтяных и газовых скважин;

2. Исследовать величину частоты встречаемости ядрышек и фибриллярных центров в эритроцитах крови осетровых и карповых рыб в зависимости от пола;

3. Определить степень холинэстеразной активности печени рыб различных систематических групп, возраста, пола и районов пробного разбуривания нефтяных и газовых скважин;

Научная новизна. Впервые определены видовые показатели частоты встречаемости микроядер в эритроцитах отдельных представителей осетровых, карповых, бычковых рыб.

Обнаружено увеличение частоты встречаемости микроядер и «хвостатых» ядер эритроцитов с возрастом рыб, а также половые различия по показателям дестабилизации генома. Определено число ядрышек в эритроцитах изучаемых видов рыб.

Отмечено, что индекс фибриллярных центров осетровых выше, чем у карповых. Установлено"; что у'самок осетровых индекс фибриллярных центров

превышает аналогичный индекс у самцов.

Определены фоновые показатели активности холинэстеразы у объектов исследований.

Практическая значимость. Показана возможность использования регистрации частоты встречаемости микроядер и «хвостатых» ядер, а также активности холинэстераз для экспресс-мониторинга популяций рыб на предмет степени негативного антропологического воздействия.

Фоновые показатели видовых, возрастных и половых особенностей дестабилизации генома и активности холинэстеразы печени рыб в перспективе могут быть использованы в аквакультуре при формировании ремонтно-маточных стад и получении жизнестойкого потомства.

Положения, выносимые на защиту:

- кариотипическая нестабильность осетровых, карповых и бычковых рыб различного возраста, пола и в районах отлова Северного Каспия;

- холинэстеразная активность печени осетровых, карповых и бычковых рыб различного возраста, пола и в районах отлова Северного Каспия;

Апробация работы и публикация материалов исследований. Материалы диссертационной работы доложены на заседаниях кафедры «Водные биоресурсы и аквакультура» АГТУ, на Всероссийской конференции "Проблемы морфологии (теоретические и клинические аспекты)" (Сочи, 2002); на 2-й конференции Московского общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова "Актуальные проблемы генетики" (Москва, 2003).

Основные положения отражены в 5 публикациях.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 108 листах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения и выводов, практических предложений, включает 10 таблиц и 11 рисунков, в том числе 4 фотографии. Список цитированной литературы содержит 192 источника, в том числе 108 на иностранных языках.

Глава 1. КРИТЕРИИ ИХТИОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА ПО ПОКАЗАТЕЛЯМ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКОГО, ГЕНЕТИЧЕСКОГО И БИОХИМИЧЕСКОГО ГОМЕОСТАЗА (литературный обзор)

Представлен обзор литературных данных о влиянии нефти и нефтепродуктов на гидробиотов, критериях оценки состояния рыб по гематологическим показателям и генетического гомеостаза у растений, животных и человека.

Даны современные представления об оценке степени кариотипической гетерогенности клеточных популяций по показателям морфологических аномалий клеток - микроядер и «хвостатых» ядер. Показаны особенности морфологии и физиологические функции ядрышек и ядрышкообразующих районов хромосом в транскрипции и процессинге р-РНК и р-ДНК. Дан анализ методов определения морфологических аномалий клеток.

Обсуждены сведения о функциональной роли эстераз у. рыб и других животных. Представлены сведения о использовании микроядерного теста, как экспресс-метода для обнаружения генотоксических соединений у рыб.

Отмечена фрагментарность этих исследований, которые до настоящего времени ограничены работами с представителями семейства сиговых (Захидов и др., 1996), карликовой евдошкой (Hooftman, Raat, 1996), теляпией (Гриша-нин, 1993), белугой и бестером (Тюкачева, 1996).

Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследований были 6 видов рыб, представители 3 семейств: Acipenseridae - русский осетр Acipenser guldenstadti Brand., персидский осетр Acipenserguldenstadtipersicus Borodin, севрюга Acipenser stellatus Pallas, и белуга Huso huso L., Cyprinidae - восточный лещ Abramis brama orientalis и вобла Rutilusrutilus caspicus Jak., Gobiidae - бычок-головач Neogobiuskessleri.

Отлов рыб проводили в плановых экспедициях Каспийского научно-исследовательского института рыбного хозяйства (КаспНИИРХ) с 10 октября по 20 октября 2001 года и с 16 октября по 6 ноября 2002 года.

При отборе рыб в осенних рейсах мы руководствовались физиологиче-

скими особенностями и особенностью поведения рыб, в частности сезонными миграциями в прибрежную зону или на более глубокие участки моря, активным питанием или угасанием пищевого рефлекса.

Согласно поставленной задаче отлов рыб осуществляли на полигонах «КНК», «Широтная», «Ракушечная», «Сарматская» и «Хвалынская», расположенных на российской территории северного Каспия (рисунок 1).

Интерес к данным полигонам был обусловлен тем, что на них проводилось пробное разбуривание нефтяных и газовых скважин: на полигонах «КНК» и «Хвалынская» - до 2000 года, «Широтная» - в 2000 году, «Ракушечная» - в 2001 году и «Сарматская» - в 2002 году.

Для изучения цитогенетических и биохимических показателей рыб с различных полигонов Северного Каспия использовали мазки крови и печень. Одновременно определяли пол и возраст особей.

Гематологические препараты периферической крови приготовляли общепринятым методом: фиксировали 96° этиловым спиртом, затем окрашивали по Романовскому-Гимза и, дополнительно, флюорохромом DAPI.

Частоту встречаемости эритроцитов с микроядрами и «хвостатыми» ядрами, определяли на гематологических препаратах под иммерсией при увеличении об.ЮОХ и ок.10Х на микроскопе «Olympus» (Япония), применяя зеленый светофильтр. Объем исследованных эритроцитов у каждой рыбы составлял 10000 клеток. Частоту встречаемости микроядер и аномалий ядер выражали в промиллях (%о).

Ядрышки в клетках окрашивали коллоидным раствором нитрата серебра по методике Н.Н. Мамаева (1998). Учитывали число ядрышек на клетку и число фибриллярных центров на клетку.

В экспериментах по изучению холинэстеразной активности печени были использованы замороженные образцы печени и субстраты - ацетилтиохолин бромид (АТХ), пропионилтиохолин иодид (ПТХ), бутирилтиохолин иодид (БТХ), реактив Эллмана, аптечный 0,05%-ный раствор прозерина.

Гомогенаты готовили в стекляном гомогенезаторе с пришлифованным

1»

• •

кнк

Широтная

Сар м!тс км •

о «

о «

• - точки отбора проб

ф • район I ф район 2 0 -рвАонЗ ^ •район4

Рисунок 1 - Схема отбора проб: а — по полигонам разбуривания, б — по районам загрязнений

пестиком, охлаждаемым водой со льдом, на дистиллированной воде в концентрации 1:49 (вес/объем). Затем центрифугировали в течение 15 минут при 10000 g на центрифуге К-24 (Германия) и использовали надосадочную жидкость в качестве источника фермента. Холинэстеразную активность определяли по методу Эллмана.

Расчет индекса фибриллярных центров проводили по формуле: 1ф = £ФЦ/п, где

1ф - индекс фибрилярных центров;

- сумма найденных в клетках фибрилярных центров; п - количество проанализированных клеток.

Статистическую достоверность оценивали с помощью непараметрического U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни и ^критерия Стьюдента. (Ла-кин,1973). Коэффициент корреляции определяли по Спирмену.

Основной материал получен при исследовании двух видов рыб - русского осетра и каспийской воблы, где количество изученных особей было не менее 50 экземпляров.

Всего обработано и проанализировано проб:

ихтиологических - 422, в том числе определение пола и возраста;

гематологических (цитогенетических) - 200, в том числе определение аномалий ядер эритроцитов крови и фибриллярных центров в интерфазных клетках;

биохимических - 99, в том числе определение специфической холинэ-стеразы и активности холинэстеразы в печени рыб.

3. ГИДРОЛОГИЧЕСКИЕ И КЛИМАТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ КАСПИЙСКОГО МОРЯ

Дана характеристика основных гидрологических и климатических параметров, наиболее влияющих на распространение и седиментацию нефти и нефтепродуктов в естественных водоемах: течения, ветры, глубины, температуры, ледообразование, особенности минерального состава, соленость и взве-

шенные вещества,

4. КРАТКАЯ БИОЛОГИЯ ОБЪЕКТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

Представлены некоторые особенности биологии объектов исследований (распространение, распределение по районам, в том числе глубинам, сезонные миграции и активность, питание и пищевые объекты), по которым можно судить о характере, возможности и степени влияния на них нефтяного загрязнения.

Глава 5. КАРИОТИПИЧЕСКАЯ НЕСТАБИЛЬНОСТЬ ЭРИТРОЦИТОВ КРОВИ ОСЕТРОВЫХ, КАРПОВЫХ И БЫЧКОВЫХ РЫБ КАСПИЙСКОГО МОРЯ 5.1. Морфологические аномалии ядер эритроцитов крови и частота

встречаемости у рыб Известно, что клетки постоянно подвергаются цитогенетическим эффектам агентов, повреждающих ДНК (Norbury. Hickson. 2001). Эти агенты могут быть экзогенными либо эндогенными. В ответ на повреждения ДНК в клетках возникают различные реакции. Начальный этап к формированию аберраций клеток - разрывы ДНК.

Образование микроядер в клетках (тельца Хоуэлла-Жолли) служит внешним проявлением аберраций, а высокий уровень частоты встречаемости микроядер отражает общую нестабильность генома.

К ядерным аномалиям < относят также «хвостатые» ядра. эритроцитов, уровень которых также оценивается по частоте встречаемости. Образованные дицентрическими хромасомами (хроматидами) мосты могут разрываться и формировать ядра с морфологическими аномалиями типа «хроматических хвостов», не втягивающихся в ядро, что приводит к появлению клеток с «хвостатыми» ядрами.

Эритроциты крови представителей осетровых, карповых и бычковых рыб по морфометрическому строению не отличались. Все они овальной формы, многоядерные, как и у других рыб.

Из аномалий выявлены микроядра, как правило, по одному в клетке и

«хвостатые» эритроциты.

Микроядра в эритроцитах представляли собой округлые, содержащие хроматин образования, размером 1,5-2 мкм (рис. 2).

После окрашивания по Гимза микроядра имели оттенки от темно-синего до фиолетового цвета. Чаще всего они были овальной формы и располагались эксцентрично или в центре клетки.

Аномалии ядер типа «хвостов» представляли собой тонкие выросты, отходящие от ядра, не более 1 выроста на ядро (рис. 3).

Толщина их не превышала 0,1 мкм, длина составляла 1,5-2 мкм. В некоторых случаях вырост завершался терминальным расширением тела в форме каплевидного микроядра. Каплевидное терминальное расширение «хвостов» окрашивалось чаще всего неоднородно: интенсивность окраски усиливалась от центра к краям. Иногда в цитоплазме эритроцитов вместе с «хвостами» встречались мелкие микроядра. Часто встречались «хвосты» в виде толстых выпячиваний.

Наблюдаемые и регистрируемые нами типы аномалий ядер клеток соответствовали всем принятым морфологическим критериям микроядер и «хвостатых» ядер в эритроцитах (Прокофьева-Бельговская,1961; Ми11ег, 81гейег, 1995).

В процессе синтеза прерибосом образование ядрышек идет только на активных ядрышкообразующих районах хромосом. Плотный фибриллярный компонент считается центральной структурой ядрышка, отражающей процессы транскрипции р-ДНК и процессинга р-РНК ^сИ'Л'акасЬег, 2001).

Для изучения степени устойчивости генома мы оценивали индексы интерфазных ядрышек и фибриллярные центры рибосомных цистронов эритроцитов крови (рис. 4).

* *

I____ • « Л ■ -Мг ч _.

Рисунок 5 - Фибриллярные центры рибосомных цистронов эритроцитов крови рыбы. Окраска методом серебрения. ОбЛООх; ок.1 Ох

В научной литературе отмечается перспектива использования ядрышко-вых организаторов для оперативной обработки больших выборок особей на предмет изменения транскрипционной и пролиферативной активности, а также информативность и простоту методов (Мамаев, 1998).

Сравнительный микроядерный анализ спонтанной хромосомной нестабильности у осетровых, карповых и бычковых рыб выявил достоверные различия по частоте встречаемости микроядер и «хвостатых» ядер между исследуемыми рыбами (таблица 1).

Таблица 1 ■ Частоты встречаемости аномалий ядер _эритроцитов крови рыб, %о_

Год Семейство Частота встречаемости эритроцитов с "хвостатыми" ядрами

X ± т СУ Х±т Су

2001 Осетровые 1,45±0,16 55,8 0,23±0,04 73,9

Карповые 1,22±0,07 59,8 0,27±0,02 70,3

2002 Осетровые 0,88±0,096 53,1 0,21 ±0,025 53,3

Карповые 0,63±0,116 49,2 0,18±0,037 46,5

Бычковые 0,37±0,111 59,1 0,10±0,041 81

Согласно результатам двухгодичных исследований (2001-2002 гг.) частота встречаемости микроядер в эритроцитах крови наибольшая у представителей семейства осетровых и превышает аналогичный показатель для карповых рыб более чем на 16%. Частота встречаемости эритроцитов с «хвостатыми» ядрами выше у карповых - более чем на 14% по сравнению с осетровыми.

Самые низкие показатели аномалий ядер эритроцитов наблюдали у бычковых - в 1,7-2,3 раза по микроядерному тесту и в 1,8-2,1 раза по частоте встречаемости «хвостатых» ядер.

Следует отметить нестабильность отмеченных аномалий по годам, что, вероятно, обусловлено изменяющимися условиями обитания рыб. Так, частота встречаемости микроядер в эритроцитах у представителей осетровых в 2001 г. была выше на 16%, а в 2002 г. - на 28% по сравнению с карповыми рыбами. Частота встречаемости «хвостатых» ядер в 2001 г. у карповых превышала данный показатель для осетровых на 17%, а в 2002 г. - была ниже на 14%.

Несмотря на выявленные аномалии и их количественные различия в зависимости от принадлежности к определенному семейству и по годам, стабильность генома исследованных рыб можно оценить как удовлетворительную.

5.2. Частота встречаемости аномалий ядер эритроцитов крови рыб в зависимости от района пробного разбуривания нефтяных и газовых скважин

С целью количественной оценки аномалий ядер эритроцитов крови рыб в зависимости от мест распределения в море в связи с возможным загрязнением некоторых участков водного пространства мы исследовали частоту встречаемости микроядер и эритроцитов с «хвостатыми» ядрами в отдельных районах Северного Каспия, где проводились пробные разбуривания нефтяных и газовых скважин. По показателям микроядерного теста и частоте встречаемости «хвостатых» ядер эритроцитов каких либо существенных различий в зависимости от района и времени разработки скважин не отмечено'. Наши результаты подтверждаются 30-летними исследованиями экологических последствий разведочного бурения, согласно которым все основные параметры морской среды остаются неизменными, так как происходит быстрое разбавление буровых растворов на водной основе. Практически невозможно обнаружить какие-либо устойчивые необратимые биологические эффекты в толще морской воды и в случае нефтесодержащих отходов бурения (Патин, 1997).

Иные результаты были получены у районах, которые по данным АНИ-ПИГаз характеризуются различным уровнем загрязнения.

Так, самый высокий уровень микроядер и «хвостатых» ядер в эритроцитах рыб наблюдали в 1 - загрязненном районе. Самое низкое количество микроядер и «хвостатых» ядер - в 3 - условно чистом (таблица 2). .

Таблица 2 - Частота встречаемости аномалий ядер эритроцитов крови у рыб из различных районов Северного Каспия

Район• Частота встречаемости микроядер в эритроцитах Частота встречаемости эритроцитов с «хвостатыми» ядрами

X ± т, %о Лимиты СУ Х±ш,%о Лимиты Су

1-условно загрязненный 1,64 ±0,3 0,9-3,0 48,6 0,41 ± 0,12 0,1-0,8 75,6

2-относительно чистый 1,16 ±0,09 0,3-3,4 56,8 0,25 ±0,02 0,1-0,8 56

3-условно чистый 0,98 ±0,10 0,5-1,7 35,7 0,22 ±0,04 0,1-0,5 59

4 — относительно чистый • 1,29 ±0,16 0,2-3,5 67,4 0,26 ±0,04 0,1-0,7 73

Условно загрязненные районы 2 и 4 по показателям числа аномалий ядер эритроцитов занимало промежуточное положение. При этом коэффициент вариабельности частоты встречаемости «хвостатых» ядер превышал данный показатель для микроядер более чем в 1,3 раза.

Следует отметить, что уровень встречаемости «хвостатых» ядер эритроцитов у рыб в 1 районе более чем в 1,5 раза выше, чем в других исследуемых нами участках моря. Однако различия по частоте встречаемости микроядер в эритроцитах крови рыб на данном участке не превышали 1,3 раза.

Отсюда возможен вывод о наибольшем экологическом благополучии для рыб 3, а затем 2 и 4 районов. Возможно, 1 район имеет стабильный или привнесенный источник загрязнения, что служит причиной повышенного уровня кариотипических нарушений у рыб, отловленных в этом районе.

53. Частота встречаемости аномалий ядер эритроцитов крови карповых рыб в зависимости от возраста

С целью определения уровня генетических повреждений в клеточных популяциях в связи с возрастом, мы изучали количество аномалий ядер

эритроцитов у карповых рыб (воблы, леща) в возрасте около 2 лет и половозрелых и неполовозрелых в возрасте более 4 лет (таблица 3).

Таблица 3 - Частота встречаемости аномалий ядер эритроцитов крови карповых рыб в зависимости от возраста и половозрелости

Возраст, лет Частота встречаемости микроядер в эритроцитах Частота встречаемости эритроцитов с «хвостатыми» ядрами

X ± т, %о Лимиты Су X ± Ш, %о Лимиты Су

4+ половозрелые 1,25 ±0,16 0,3-3,5 65,6 0,29 ± 0,05 0,1-0,8 75,8

А* неполовозрелые 1,08 ±0,14 0,3-3,3 62,9 0,26 ± 0,04 0,1-0,8 61,5

2 1,26 ±0,11 0,2-3,4 53,9 0,25 ± 0,03 0,1-0,7 72

Согласно данным таблицы 3, количество аномалий ядер эритроцитов крови у исследованных карповых рыб не зависит от их возраста и половозре-лости. Максимальные и минимальные величины аномалий (лимиты) были достаточно близкими при высокой вариабельности данных показателей, что и определило недостоверность различий средних значений частоты встречаемости микроядер и «хвостатых» ядер в эритроцитах воблы и леща, которые составляли 11-17%.

5.4. Частота встречаемости аномалий ядер эритроцитов крови осетровых и карповых рыб в зависимости от пола

В связи с поставленной задачей изучали наличие количественной взаимосвязи между генетически аберрантных эритроцитов крови и полом карповых и осетровых рыб. Результаты этих исследований в 2001 г. представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Частота встречаемости микроядер в эритроцитах рыб

в зависимости от пола (2001 г.), %о

Пол Карповые Осетровые

Частота Лимиты Су Частота Лимиты Су

Самки 1,24±0,11 0,3-3,5 62,0 1,55±0,19 0,1-2,6 46,4

Самцы 1,19±0,11 0,2-3,3 56,3 0,97±0,08 0,7-1,4 23,7

Согласно данным таблицы 4, частота встречаемости микроядер в эритроцитах крови самок осетровых рыб в 2001 г. было достоверно больше почти в 1,7 раза по сравнению с самцами. В отношении аномалий у самок и самцов карповых рыб существенных отличий не отмечено Наблюдается лишь незначительная тенденция к увеличению частоты встречаемости микроядер эритроцитов у самцов.

Существенные различия между количественными показателями аномалий эритроцитов у самок и самцов осетровых рыб подтвердилось результатами исследований 2002 г. (таблица 5).

Таблица 5 - Частота встречаемости аномалий ядер в эритроцитах в

зависимости от пола осетровых рыб (2002 г.), %о 1

Пол Частота встречаемости _ микроядер в эритроцитах Частота встречаемости эритроцитов с «хвостатыми» ядрами

Частота Лимиты СУ Частота Лимиты Су

Самки 1,11±0,112 1,8-0,4 39" 0,21 ±0,03 0,4-0 51,3

Самцы 0,53±0,099 0,9-0 49,7 0,18±0,06 0,4-0 72.4

Так, у самок осетровых частота встречаемости микроядер в эритроцитах крови в 2 раза, а частота встречаемости «хвостатых» ядер на 16% было выше по сравнению с самцами при достоверных различиях.

Следовательно, кариотипическая дестабильность наиболее характерна для самок осетровых рыб.

5.5. Индексы интерфазных ядрышек рибосомных цистронов

крови рыб

Для определения степени устойчивости генома мы оценивали индексы интерфазных ядрышек в эритроцитах осетровых, карповых и бычковых рыб.

Ядрышки образуются особыми участками хромосомной ДНК, называемых районами ядрышковых организаторов или ядрышками рибосомных цистронов крови. Участки эти кодируют и синтезируют рибосомную РНК (Репу, 1967). Отвечают ядрышки за регуляцию уровня транскрипции р-ДНК, процес-

сы клеточного роста, синтез белка и т.д.

Сравнительный анализ интерфазных ядрышек рибосомных цистронов крови рыб выявил наибольшую величину индекса фибриллярных центров у осетровых рыб, который на 10,4 и 12,5% превышал данный показатель у карповых и бычковых хотя и без достоверных отличий (таблица 6).

Таблица 6 - Индекс интерфазных ядрышек эритроцитов рыб

Семейство рыб ИИЯЭ* Лимиты Cv

Осетровые 7,13±0,19 8,92-5,58 13,3

Карповые 6,34±0,26 7,32-5,06 11,0

Бычковые 6,46±0,24 6,85-5,80 7,4

индекс интерфазных ядрышек эритроцитов

У осетровых рыб отмечена тенденция увеличения индекса фибриллярных центров у самцов по сравнению с самками. Причем различия достигали почти 18% (таблица 7).

Таблица 7 - Индекс интерфазных ядрышек эритроцитов осетровых рыб в зависимости от пола

Пол рыб ИИЯЭ* Лимиты Cv

Самки 7,58±0,18 8,92-6,42 9,2

Самцы 6,23±0,20 7,36-5,58 9,2

*- индекс интерфазных ядрышек эритроцитов

Глава 6. АКТИВНОСТЬ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ ПЕЧЕНИ РЫБ

Первым этапом проведения исследования была оценка гомогенности хо-линэстеразной активности печени. С этой целью мы изучали влияние различных концентраций прозерина на скорость гидролиза трех субстратов - ацетил-холинтрансферазы (АТХ), пропионилтиохолина (ПТХ) и бутирилтиохолин иодида (БТХ).

Выявлено, что в печени изучаемых нами видов рыб преобладает только один фермент. Величина кон- центраций прозерина, вызывающая

50%-ное ингибирование холинэстеразы печени, была близка для всех трех субстратов при эксперименте на каждом исследованном виде рыб (таблица 8). Таблица 8 - Концентрации прозерина (Ьо), ингибирующие холинэстеразы печени рыб на 50% (переинкубация 12 минут)

Рыбы Ферменты

АТХ ПТХ БТХ

Вобла 4 10"' 3,8 10"7 4,5 Ю-' 4,7 10"'

Осетр 3,6 10"8 3,4' 10"* 4,5' 10 "

4 10"8 4,5 10'8 4 10"8

2,2' 10"8 2,2 10"8 3,8 108

Белуга 1,8' 10'8 1,8 10 е 2,7 10*

Севрюга' 1,6 10" 2,6 10* 2,2 10"

Однако по субстратной специфичности холинэстераза печени русского осетра и каспийской воблы значительно отличаются друг от друга: у русского осетра преобладает пропионилхолинэстераза (ПХЭ), а у каспийской воблы -своеобразная ацетилхолинэстераза (АХЭ или АЭ), которые классифицируются как псевдохолинэстеразы.

В результате исследований активности холинэстеразы в печени русского осетра и белуги, каспийской воблы и бычка-горбыля отмечены некоторые различия в активности данного фермента в зависимости от вида, пола и возраста.

Так, средние показатели активности холинэстеразы у русского осетра составляли 0,638±0,17 ед., а белуги - 0,234±0,220 ед., что, безусловно, определяется более высокой интенсивностью обмена у белуги по сравнению с осетром (Гершанович и др., 1987). Однако, несмотря на различие в активности фермента почти в 2,7 раза, они статистически не достоверны ввиду индивидуального разброса величин и малой выборки белуги.

Активность холинэстеразы у каспийской воблы наиболее близка данному показателю русского осетра и составляла 0,537±0,12 ед. У бычка-горбыля отмечена самая низкая активность холинэстеразы — 0,058 ед., что на порядок

ниже по сравнению с другими рыбами.

Сравнительный анализ активности холинэстеразы в печени самок и самцов рыб выявил некоторую тенденцию повышения активности данного фермента у самцов. Наиболее она была выражена у каспийской воблы: у самок -0,68±0,22 ед., у самцов - 0,45±0,15 ед. У бычка аналогичные показатели составляли 0,05 и 0,07 ед. соответственно. Минимальные различия отмечали у русского осетра: у самок - 0,61±0,14, у самцов - 0,69±0,16 ед.

Изучая активность холинэстеразы у рыб разного возраста мы отметили определенные отличия данного показателя в зависимости от их физиологического состояния.

Так, у воблы в возрасте менее 3 лет активность холинэстеразы в среднем составила 0,436±0,027 ед., в возрасте 3 лет - 0,696±0,097 ед., а более 4 лет -0,615±0,06ед.

Следовательно, активность ацетилхолинэстеразы с возрастом достоверно повышается (Р<0,05), что обусловлено повышением активности полостного пищеварения и возрастными гормональными перестройками. Однако у половозрелых рыб, готовых к нересту, активность фермента несколько понижалась, что, вероятно, является откликом организма на перестройку обмена веществ с развитием и созреванием гонад.

В отличие от средних величин активности холинэстеразы между самками и самцами вне зависимости от возраста и районов отлова, где различия были незначительны, внутри возрастных групп они достоверны. Так, у самок воблы в возрасте 3 года активность данного фермента составляла 0,836±0,046 ед., а у самцов - 0,507±0,06 ед., т.е. меньше в 1,6 раза при достоверных отличиях (Р<0,01).

Активность холинэстеразы в печени воблы, как наиболее массового объекта, выловленного в районах с различным уровнем загрязнения, выявила определенные различия в активности данного фермента в зависимости от расположения данного района вблизи или отдаленности от береговой зоны, или дельты Волги (рисунок 5).

Районы

Рисунок 5 - Активность холинэстеразы печени воблы по районам

Так, выделенном нами условно чистом районе №3, активность холинэстеразы печени воблы составила 0,79 ед., в 1-м (загрязненном) - меньше на 47,4% при достоверном отличии (Р<0,01), а в 2-м и 4-м (относительно чистых) - меньше на 14,9 и 27,34% соответственно. Различия в активности холинэстеразы печени воблы из относительно чистых районов по сравнению с другими не достоверны.

ВЫВОДЫ

1. Повышенная частота встречаемости микроядер эритроцитов отмечена у представителей осетровых рыб, а частота встречаемости «хвостатых» ядер -у карповых. Более низкий уровень этих показателей - у семейства бычковых.

2. Частоты встречаемости аномалий ядер эритроцитов крови у рыб не зависит от района пробного разбуривания нефтяных и газовых скважин, а определяется географическим расположением основных мест обитания ( приближенность к береговой зоне, течениями и т.д.).

3. Частота встречаемости микроядер и «хвостатых» ядер эритроцитов не зависит от возраста и половозрелости рыб.

4. Показатели дестабилизации генома у самок осетровых выше по сравнению с самцами. Частота встречаемости микроядер в эритроцитах самок на 37-52% больше чем у самцов.

5. У карповых рыб существенных отличий по количеству аномалий ядер эритроцитов между самками и самцами не отмечено. Наблюдается лишь незначительная тенденция к увеличению частоты встречаемости микроядер эритроцитов у самцов.

6. Наибольшая величина индекса фибриллярных центров характерна для осетровых рыб. Данный показатель у них по сравнению с карповыми и бычковыми рыбами был выше на 10,4 и 12,5% соответственно, но без достоверных отличий.

7. У самцов осетровых отмечена тенденция к увеличению индекса фибриллярных центров до 18% по сравнению с самками.

8. В печени изученных нами представителей осетровых и карповых рыб преобладает только один фермент. Однако каталитические свойства холинэ-стеразы печени этих рыб отличаются друг от друга: у русского осетра преобладает пропионилхолинэстераза, а у каспийской воблы - своеобразная ацетил-холинэстераза, которые классифицируются как псевдохолинэстеразы.

9: В активности холинэстеразы печени русского осетра и белуги, каспийской воблы и бычка-горбыля отмечены некоторые различия в зависимости от вида, пола и возраста.

10. Средние показатели активности холинэстеразы у русского осетра составляли 0,638+0,17 ед., а белуги - 0,234+0,220 ед., что, безусловно, определяется более высокой интенсивностью обмена и пищевой активностью осенью у белуги. Несмотря на различие в активности фермента почти в 2,7 раза, они статистически не достоверны.

И. Активность холинэстеразы у каспийской- воблы составляла 0,537+0,12 ед. Самая низкая активность холинэстеразы (0,058 ед.) отмечена у бычка-горбыля.

12. Величина активности холинэстеразы печени самок и самцов рыб вне

зависимости от возраста и районов лова выявил некоторую тенденцию повышения активности данного фермента у самцов. Наиболее она была выражена у каспийской воблы: у самок - 0,68+0,22 ед., у самцов - 0,45+0,15 ед. Минимальные различия были характерны для русского осетра: у самок - 0,61+0,14 ед., у самцов - 0,69 +0,16 ед.

13. С возрастом и физиологическим состоянием изменяется активность холинэстеразы печени. У воблы в возрасте менее 3 лет она в среднем составила 0,435+0,027 ед., а в возрасте 3 года - 0,696+0,097 ед. У половозрелых особей, готовых к нересту, в возрасте более 4 лет активность фермента несколько снижается (0,615+0,06 ед.) что, вероятно, является откликом организма на перестройку обмена веществ в связи с развитием и созреванием гонад.

14. В отличие от средних величин активности холинэстеразы у самок и самцов (вне зависимости от возраста и района отлова) внутри возрастных групп они достоверны. Так, у самок воблы в возрасте 3 года активность данного фермента составляла 0,837+0,046 ед., а у самцов - 0,507+0,06 ед., т.е. меньшее 1,6 раза.

12. Активность холинэстеразы в печени рыб (на примере воблы) из районов пробного бурения не отличалась существенно в зависимости от расположения и сроков бурения. С увеличением удаленности от прибрежной зоны и снижением загрязнения района отлова активность холинэстеразы печени воблы повышалась почти на 45% (с 0,43 до 0,79 ед.).

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Микроядерный тест совместно с анализом активности эстераз можно использовать как экспресс-методы при ихтиомониторинге водных бассейнов.

2. Во время проведения буровых работ в случае аварийного выброса нефти в море значительное повышение количества аберрантных клеток крови, резкое колебание ферментативной активности (ацетилхолинэстеразной) в пе-

чени у рыб может свидетельствовать о загрязнении водных пространств, а также служить реперными точками при расчете возможного ущерба биоресурсам из-за антропогенного давления.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Есауленко А.В., Курапов А.А., Гаврилов Б.А., Косякова Г.П., Яковлев А.Ф. Цитогенетический мониторинг рыб Каспийского бассейна.// Всероссийская конференция "Проблемы морфологии (теоретические и клинические аспекты)'7 Тезисы докладов, 2002, Сочи, 23 с.

2. Есауленко А.В., Косякова Г.П. Цитогенетическое изучение кроветворных клеток рыб Каспийсого бассейна.// Материалы 2-й конференции московского общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова "Актуальные проблемы генетики", 2003, Москва, Т. 1. С.341-342.

3. Яковлев А.Ф., Гаврилов БА, Косякова Г.П., Есауленко А.В., Курапов А.А. Возрастные, межвидовые и половые особенности дестабилизации генома у рыб каспийского бассейна // В кн: Селекционно-генетические методы повышения продуктивности сельскохозяйственных животных. Санкт-Петербург: ВНИИГРЖ, 2003. С.86-92.

4. Моралев С.Н., Есауленко А.В., Курапов А.А., Розенгард Е.В., Хованских А.Е. Исследование холинэстеразной активности рыб Каспийского моряУ/ Доклады РАН, 2003, Т.394. №4. С.427-431.

5. Якубов Ш.А., Есауленко А.В., Суворова Т.Ф., Якубова Д.Ш., Михай-мыченко Д.В., Крючков В.Н., Зайцев В.Ф.Перспективы внедрения новейших медицинских технологий в нефтегазовом комплексе// Проблемы охраны здоровья окружающей среды: Санкт-Петербург: ВНИИГРЖ, 2004, С. 173-177.

Печать цифровая. Бумага офсетная. Гарнитура «Тайме». Формат 60x84/16. Объем 1,0 уч.-изд.-л. Заказ № 196 . Тираж 100 экз. Отпечатано в КМЦ «КОПДЯДЕНТР» 344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Суворова, 19, тел. 47-34-88

И3252