Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Природные антитела, реагирующие с гистонами

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Абакушин, Дмитрий Николаевич, Обнинск

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК МЕДИЦИНСКИЙ РАДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи

Абакушин Дмитрий Николаевич

ПРИРОДНЫЕ АНТИТЕЛА, РЕАГИРУЮЩИЕ С ГИСТОНАМИ: ВЕРОЯТНАЯ РОЛЬ В ПАТОГЕНЕЗЕ РАДИАЦИОННЫХ НАРУШЕНИЙ.

03.00.01 - Радиобиология ДИССЕРТАЦИЯ

соискание ученой степени кандидата биологических наук

на

Научный руководитель: доктор биологических наук профессор Поверенный А. М.

Обнинск, 1999

Список использованных сокращений

БСА - бычий сывороточный альбумин

Гр -Грей

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

лпс - липополисахариды

РНК - рибонуклеиновая кислота

Трис - трисгидроксиметиламинометан

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ФИТЦ - флуоресцеинизотиоцианат

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 5

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Интерфазная клеточная гибель вызванная

радиацией........................................................................................................... 9

1.2 Природные антитела.....................................................................................17

1.3 Антигистоновые антитела_______________________________________25

Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Оборудование и принадлежности...........................................................34

2.2 Препараты и реактивы..................................................................................34

2.3 Определение концентрации белка..........................................................36

2.4 Фракционирование комплексов гистон-иммуноглобулин

с помощью гель-фильтрации на Сефакрил 8-200____________________________36

2.5 Электрофорез....................................................................................................37

2.6 Приготовление меченой тритием нативной ДНК____________________________37

2.7 Определение связывания белок-ДНК радиоиммунологическим методом (тест Фарра).............................. 38

2.8 Определение антигистоновых антител методом твердофазного иммуноферментного анализа .................................... 39

2.9 Идиотипирование препаратов иммуноглобулинов .........................40

2.10 Определение связывания иммуноглобулинов с ДНК

методом твердофазного иммуноферментного анализа.................41

2.11 Определение связывания иммуноглобулинов с фосфолипидами методом твердофазного

иммуноферментного анализа....................................................................43

2.12 Действие природных антител и их комплексов с гистонами

на систему свёртываемости крови..........................................................44

2.13 Выделение тимоцитов, их инкубация и окрашивание...................44

2.14 Проточная цитофлуориметрия.................................................................45

Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Антигистоновая активность препаратов нормальных иммуноглобулинов и сывороток

крови здоровых индивидуумов................................................................47

3.2 Действие ионизирующей радиации на изменение антигистоновой, анти-ДЕЖ и антилипополисахаридной активности сывороток крови животных..............................................52

3.3 Добавление гистонов к препаратам нормальных иммуноглобулинов и сывороткам крови здоровых доноров придает им новые антигенсвязывающие

свойства..............................................................................................................54

3.4 Выделение комплексов иммуноглобулинов с

гистонами и определение их свойств....................................................59

3.5 Цитотоксичность гистонов и защитная роль

природных антител, реагирующих с гистонами...............................65

3.6 Влияние комплексов гистонов с природными

антителами на систему свертываемости крови in vitro................. 71

Глава IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 73

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 81

ВЫВОДЫ 85

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 86

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

В последние годы уделяется значительное внимание природным антителам. Природными называются антитела, циркулирующие в крови здоровых индивидуумов и продуцируемые в отсутствии открытой специфической антигенной стимуляции (Coutinho et al., 1995). Как известно, до 55% всех иммортализованных В-клеток вырабатывают природные антитела (Nakamura et al., 1988). Характерная черта природных антител - их полиспецифичность и способность взаимодействовать с различными заряженными клеточными структурами (Avrameas, Ternynck, 1995). На долю таких полиспецифичных природных антител, способных реагировать с собственными антигенами, приходится до 66% всех IgG, присутствующих в индивидуальных сыворотках крови (Avrameas, Ternynck, 1993). В нормальных физиологических условиях природные антитела связываются с рядом патогенных агентов. Связывание облегчается тем, что поверхность этих агентов, в основном, отрицательно заряжена и несет повторяющиеся антигенные мотивы. Активные сайты природных антител также положительно или отрицательно заряжены. Как правило, природные антитела реагируют с такими антигенами, как ДНК, кардиолипин, белки цитоскелета, ядерные белки. Природные антитела связываются с патогенными агентами, определяя опсонизацию последних и фагоцитоз (Navin et al., 1989). Действительно, по мнению Пьера Грабаря (Grabar, 1975), основной функцией природных антител является освобождение организма от продуктов катаболизма и антигенов, высвобождаемых вследствие клеточной гибели. Это предположение было экспериментально подтверждено в ряде работ (Witz et al., 1984; Chow, Bennet, 1989; Lutz,

1990). С этой точки зрения представляет особый интерес роль природных антител в патогенезе радиационных нарушений, отличительными чертами которых являются клеточный распад, эндотоксинемия. Особый интерес представляют гистоны, являющиеся продуктом распада клеток и обладающие выраженной биологической активностью (Voll et al., 1997). Неисследованным остается вопрос о способах элиминации их из биологических жидкостей. Наряду с этим известно, что имеются природные антитела способные реагировать с гистонами.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы является исследование эффектов природных антител, реагирующих с гистонами, на патогенез радиационных нарушений.

В задачи исследования входили:

■ Разработка методов детекции антигистоновых антител, а также метода выделения их искусственных комплексов с гистонами, изучение роли таких комплексов в формировании полиспецифичности природных антител;

■ определение спектра перекрестных реакций антител в комплексе с гистонами и их свойств; влияние на изменения в процессах свертываемости крови;

■ изучение действия ионизирующего излучения на уровень природных антител, реагирующих с гистонами, в сыворотках крови животных;

■ влияние природных антител, реагирующих с гистонами, на цитотоксические свойства гистонов.

Научная новизна.

■ Впервые показано, что природные антитела, реагирующие с гистонами, широко распространены и их можно обнаружить в пуле нормальных человеческих иммуноглобулинов и сыворотках крови здоровых индивидуумов;

■ впервые получены данные о том, что гистон может выполнять роль кофактора и принимать участие в формировании полиспецифичности антител, был выделен искусственный комплекс иммуноглобулинов с гистонами и исследованы его антигенсвязывающие свойства и влияние на систему гемостаза;

■ показано, что после действия ионизирующего излучения происходит уменьшение содержания природных антител, реагирующих с гистонами, в сыворотках крови облученных животных; рассмотрено значение этого феномена в патогенезе радиационных нарушений;

■ показана способность природных антител, реагирующих с гистонами, уменьшать цитотоксические свойства гистонов.

Практическая и теоретическая значимость работы.

Приводимые данные имеют важное значение для понимании механизма регуляции активности природных аутоантител и расширяют представления о способах регуляции гуморального иммунитета, так как показывают возможность кофакторного, опосредованного через гистон, взаимодействия иммуноглобулинов с лигандами и ставят вопрос о роли такого взаимодействия в генезе ряда проявлений радиационных синдромов и патогенезе аутоиммунных заболеваний.

Модификация метода определения антигистоновых антител в человеческих сыворотках крови, разработанная в ходе выполнения работы, применяется в лаборатории радиационной биохимии Медицинского Радиологического Научного Центра РАМН.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В препаратах нормальных иммуноглобулинов и сыворотках крови здоровых индивидуумов присутствуют природные антитела, реагирующие с гистонами.

2. Гистон, связываясь с иммуноглобулинами, может выступать в роли кофактора, определяющего способность природных антител реагировать с ДНК, фосфолипидами и пр. Таким образом, можно объяснить полиспецифичность некоторых природных антител.

3. Природные антитела, реагирующие с гистонами, уменьшают цитотоксичность гистонов, которые могут попадать в биологические жидкости вследствие клеточной деструкции, вызванной ионизирующим излучением.

4. Комплексы природных антител с гистонами могут быть причиной нарушения гемостаза и некоторых других проявлений радиационных нарушений.

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Интерфазная клеточная гибель вызванная радиацией.

Начальное повреждение молекул, вызванное действием радиации, во всех типах клеток, по-видимому, сходно. Однако клеточная гибель может быть подразделена на два основных типа, интерфазную и репродуктивную. Типичным проявлением действия на организм сравнительно небольших доз ионизирующей радиации является интерфазная клеточная гибель. Особенно важно понимание механизмов и биологического значения интерфазной гибели, определяющей костномозговой синдром. Именно с радиационными изменениями в системе кроветворения чаще всего приходится встречаться на практике, так как при облучении в дозах до 10 Гр в организме развивается типичный костно-мозговой синдром. Опустошение костного мозга начинается тотчас после облучения и неуклонно продолжается, достигая минимума, что соответствует его регенерации у выживших особей.

Интерфазная гибель характерна для неделящихся клеток, таких как малые лимфоциты, молодые ооциты; и медленно делящихся клеток, таких как клетки печени, нервные клетки, ретикулоэндотелиальные клетки в составе лимфатических узлов и тимуса. Интерфазная гибель некоторых клеточных популяций наступает от воздействия небольших доз радиации в течение нескольких часов, для нее характерна несигмоидальная кривая выживания, и она не связана с клеточным делением.

Интерфазная гибель также известна под другими названиями, такими как немитотическая гибель, гибель без деления, и немедленная гибель (Тго\уе11, 1966). Различают три типа интерфазной гибели. Первый тип - интерфазная гибель неделящихся клеток и/или клеток с

ограниченной способностью к делению, таких как малые лимфоциты и тимоциты. Такая гибель встречается после облучения клеток малыми дозами радиации (несколько десятков Рад). Второй тип - интерфазная гибель неделящихся клеток, таких как зрелых нервных или мышечных клеток, и медленно делящихся клеток, таких как клетки печени. Гибель этих клеток встречается только после облучения большими дозами радиации (от нескольких до нескольких десятков КРад). Третий тип, который, возможно, подобен второму типу, является интерфазной гибелью делящихся клеток, таких как, например, культивируемых клеток млекопитающих, после облучения большими дозами радиации. Иногда выделяют четвертый тип, при котором делящиеся клетки погибают в интерфазе через несколько часов после облучения в дозах в несколько сотен Рад, то есть, перед первым митозом и после одного или несколько митозов. Несмотря на гибель в интерфазе, этот четвертый тип все же не относят к интерфазной гибели и рассматривают как один из типов репродуктивной клеточной гибели.

Понимание механизмов интерфазной гибели очень важно для радиобиологии, так как эта форма гибели имеет определяющее значение в радиационно-индуцированной гибели животных. Так опустошение костного мозга при развитии костно-мозгового синдрома вызвано интерфазной гибелью малых лимфоцитов и тимоцитов, а другой тип гибели, известный как "гибель центральной нервной системы", прежде всего вызван интерфазной гибелью нервных клеток.

Большинство лимфоцитов гибнет в интерфазе при малых дозах радиации и их гибель сопровождается различными биохимическими изменениями, в том числе высвобождением ядерных компонентов: хроматина, нуклеосом, гистонов. Так, при облучении крыс общей дозой 10 Гр, максимальное уменьшения содержания гистонов, а также ДНК и глобулинов в ядрах тимоцитов и клеток селезенки наблюдается через 24

часа после воздействия радиации.

В тимоцитах in vitro и in vivo после облучения дозами от 5 до 15 Гр происходят следующие биохимические изменения (Okada, 1970).

Через 0-1 час наблюдаются следующие изменения: потеря клеточного и ядерного К, высвобождение гистонов из ядра, уменьшение клеточного и ядерного NAD (никатинамидадениндинуклеотид), снижение ядерного фосфорилирования, вязкости ДНК, митохондриального окислительного фосфорилирования, уменьшение лабильного фосфата или АТФ в клетках и ядре; увеличение вязкости белков ДНК, увеличение ядерного белкового синтеза, увеличение экстрагируемой или растворимой ДНК, ядерных групп SH, лактации, а также появление пикнотических ядер.

Через 1-2 часа происходит снижение ядерного белкового синтеза, уменьшение количества внутриклеточных рибонуклеозидов и дезоксирибозидов, внутриклеточных и ядерных ферментов.

Через 2-4 часа можно зафиксировать уменьшение скорости потребления кислорода.

Одним из важных проявлений интерфазной гибели клетки наблюдаемых в этот период времени является нарушение проницаемости ее мембран. Клеточные, ядерные, и митохондриальные мембраны, и т.д., разделяют клетку и играют важная роль в регулировании клеточных функций. Нарушение проницаемости любой мембраны может приводить к смещению молекул от одного компартмента к другому, таким образом нарушая различные метаболические процессы. Серьезные повреждения такого типа могли бы вызывать интерфазную гибель.

Биохимические изменения, которые происходят в клетке после облучения ведут к повреждениям трех основных мембранных системах - (1) в ядерных мембранах - к потере К+ и высвобождению гистонов и

других ферментов из ядра; (2) в митохондриальных мембранах - к подавлению окислительного фосфорилирования; и (3) в клеточных мембранах - к уменьшению клеточного К+, и нуклеозидов.

В 1952 году появились сведения о том, что общее облучение тела крыс подавляло митохондриальное окислительное фосфорилирование в клетках селезенки. В 1957 появились данные о том, что низкие дозы радиации быстро подавляли фосфорилирование в ядрах клеток тимуса и селезенки. Депрессия ядерного фосфорилирования является важной причиной гибели клетки: В эту пользу свидетельствует то, что ядерное фосфорилирование подавляется при облучении только в радиочувствительных клетках, в которых наблюдается интерфазная клеточная гибель, но не в радиорезистентных клетках, таких как клетки печени, почек и некоторых лимфосарком (Klouwen et al., 1966); лучевое подавление ядерного фосфорилирования можно обнаружить раньше чем любое другое биохимическое изменение, включая снижение уровня NAD и депрессии митохондриального окислительного фосфорилирования (Klouwen et al., 1966).

Установлено, что все биохимические повреждения в облученных лимфоцитах являются до некоторой степени связанными, и формируют дефектный цикл, который дезорганизует структуру и функцию клеток и вызывает их гибель.

Однако, необходимо подчеркнуть, что некоторые из наиболее важных вопросов, связанных с механизмом интерфазной гибели все еще ждут ответа. Производство облученным лимфоцитом меньшего количества АТФ, чем необходимо для его потребности, или уменьшение фосфорилирование в ядрах и митохондриях in vitro являются ли действительно причинами или только признаками интерфазной гибели? Вызывается ли немедленная депрессия инкорпорации радиоактивных предшественников уменьшением скорости синтеза ДНК, изменениями в

метаболизме предшественников, или деградацией ДНК, разбавляющей пулы предшественника? Являются ли повреждения, которые нарушают синтез ДНК в клетках находящихся не в Б-фазе такими же как в клетках, находящихся в Б-фазе? Каково значение таких повреждений во многих малых лимфоцитах, которые находятся не в Б-фазе и представляют большую часть клеток, гибнущих в интерфазе в лимфоидных органах? Как репарация ДНК связана с интерфазной гибелью? Почему лимфоциты чаще гибнут в интерфазе, чем другие неделящиеся клетки, например, клетки печени? Можно ли объяснить эти различия меньшим количеством митохондрий и меньшим количеством цитоплазмы в лимфоцитах?

За гибелью лимфоцитов следуют промежуточные и отдаленные последствия действия радиации. Лизосомальные ферменты в клетках ретикулярной ткани и макрофагах остаются активизированными и разрушают нуклеиновые кислоты и белки лимфоцитов. Погибшие лимфоциты удаляются с помощью фагоцитоза и затем исчезают полностью. Таким образом, клеточный состав лимфоидного органа сильно изменяется, что связано с действием различных факторов.

Остае�