Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

О множественности механизмов регуляции Na, K-ATфазы

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "О множественности механизмов регуляции Na, K-ATфазы"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ

На правах рукописи УДК 577.352.4

ПИСАРЕВА Лидия Николаевна

О МНОЖЕСТВЕННОСТИ МЕХАНИЗМОВ РЕГУЛЯЦИИ

N3, К-АТфазы

Специальность: 03.00.25 — Клеточная биология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени доктора биологических наук

в форме научного доклада

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1991

Работа выполнена в Лаборатории физиологии клетки Института цитологии АН СССР.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор А. А. Болдырев; доктор биологических наук, профессор В. И. Воробьев; доктор биологических наук, профессор М. Н. Маслова.

Ведущая организация — Биолого-почвенный факультет С."Петербургского государственного университета.

седании Специализированного совета д-ии2.73.01 Института цитологии АН СССР по адресу: 194064 С.-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии АН СССР.

Защита состоится

1992 года в И

час. на за-

Автореферат разослан

1992 г.

И. о. ученого секретаря Специализированного совета, доктор биологических наук

А. Л. Юдин

(6) — Институт цитологии АН СССР

i

•:.... „J .

т/;. л I I. Общая характеристика работа

"Актуальность проблемы. В настоящее время онергозависимнй противоградиентннй перенос ионов натрия через клеточную мембрану при участии На,К-АТ<Ьазы признан основным механизмом поддержания ионного и осмотического статуса клетки. Исследование природы ионного насоса началось в 1957 году, когда Скоу обнаружил в плазматических мембранах периферических нервов краба зависимую АИазную активность, которая увеличивалась при одновременном добавлении натрия и калия. Это открытие было сразу ке замечено, и в исследование проблемы включился большой отряд биохимиков. В результате Иа,К-АТ5азу обнаружили в разных органах и тканях практически всех еидов животных, а также установили, что уровень ее На,К-зависимой активности коррелирует о уровнем активного транспорта этих ионов и подавляется теми же концентрациями уабаина.

В 60-е годы главным образом на основании данных, полученных в лабораториях Альберса и Поста, была_ разработана поста-дийная схема векторного энергозависимого переноса одновалентных катионов через клеточную мембрану, сопряженного с кон^ор-мационными перестройками фермента. Позднее были предложены более детальные варианты этой схемы (Glynn,1985! Repke,1986, и

др.).

Бурное развитие молекулярной биологии в течение последних десятилетий привело к достаточно полному пониманию структуры и механизма действия if а-помпы. Сейчас известно, что Нп,К-АИаза, являющаяся молекулярной машиной этой системы, состоит из двух субъединиц с*, и р> с М.м. 110.000 и 55.000 соответственно (IOrte, 1971? Creig, Kyte,1980). В 1985-1986 гг.. была определена полная первичная структура обеих Субъединиц На.к-АТЗазы и предложена модель ее трансмембранной организации (см. Модянов и др.,1988). Оказалось, что в своей первичной структуре На,К-АТФаза весьма консервативна и, кроме того, имеет определенное' сходство с рядом транспортных АТФаз позвоночных и некоторыми сходными АЗЧйзаш бактериального и растительного происхождения (МОДЯНОВ И др.,1985; Невве et al.,1984; MoLennan et al.,1985i Addison,1986). ' ' ^

Весьма вероятно, что высокая консервативность первичной структуры ип,к-АТ&зы является результатом постоянства задачи, выполняемой этой ферментной системой в течение длительной эволюции. Будучи нацелена на выведение из клетки избыточного количества натрия, поступающего через мембрану путем движения-по электрохимическому градиенту, Ыа.к-А'Иаза в физиологических условиях активируется при повышении концентрации натрия во . внутренней среде. Предельная активность системы, достигаемая за этот счет, далеко не одинакова, причем разница больше зависит от функции ткани и условий существования животного, чем от ' его положения в филогенетической системе. Указанный способ регуляции позволяет клетке практически мгновенно реагировать на изменение ионннх градиентов, восстанавливая их исходный уровень. Однако вынужденное поддержание работы ферментной системы на уровне, близком к критическому, снижает ее гибкость и способность реагировать на иные изменения окружающих условий, пожатому такой способ регуляции в ряде случаев может оказаться недостаточным.'В результате другой принципиальной проблемой, . исследование которой должно осуществляться параллельно с разрешением структуры Яа-помпы, является выяснение механизмов, ответственных за изменение работы ионных насосов в организме при изменении внешних условий.

Шесте с тем в литературе.неоднократно отмечалось совпадение характеристик очищенных препаратов Иа,К-АТ4азы вне зависимости от источника их ввделения. Вероятно, сложные процедуры, применяемые при очистке фермента,нивелирует регуляторные механизмы, осуществляющие его'модификацию при'биохимической адаптации, что осложняет оценку функциональных возможностей натриевого насоса, __

Очевидно, что при попытках выяснить, каким образом реализуются на клеточном уровне установленные молекулярно-биологи-ческие закономерности, исследователи встречаются со значительными трудностями. Для решения задачи необходимо сравнительное изучение характеристик На.к-АТФезы в зависимости от состояния поверхностной мембраны .и изменения этих характеристик под воздействием различных эндогенных и экзогенных факторов. Решению этого вопроса и посвящено настоящее исследование.

Цель и задачи исследования. Основной целью роботы была сравнительная оценка возможпых механизмов осуществления адаптивной модификации Па.к-АТФэзы при изменении условий ее функционирования .

Для этого следовало:

1. Охарактеризовать взаимодействие Ив,К-АТ5азы с ионами активаторами и субстратами на разных этапах реакции.

2. Оценить степень зависимости этих характеристик от степени деструкции мембраны в результате выделения и очистки препарата фермента.

3. Найти способ обратимой модификации мембран, позволяющий сопоставлять изменения свойств мембраны со сдвигами активности фермента.

4. Произвести сравнительную оценку характера изменений кинетических параметров хга.К-АТОазы под воздействием специфических и

•неспецифлческих для данной ферментной системы внешних воздействий.

Научная новизна. Определены условия образования фосфори-лированного соединения белковой природы, промежуточного в ходе гидролиза АТФ транспортной мембранной АТФазой. С помочью по-тенциометрического определения активности ионов натрия впервые получено прямое доказательство связывания ионов натрия с системой СТа.к-АТФазы в ходе осуществления ею гидролиза АТФ, что указывает на образование временных связей.между комплексом гга,К-АТ£азы и транспортируемыми при ее участии ионами.

Впервые продемонстрировано наличие обмена в системе Ка,к-АТ!еза. Показано, что прямой обмен связан с ^-зависимым фосфатазным этапом реакции и свидетельствует об обрати-' мости этого этапа.

Доказано, что представление об уникальной роли натрия в активации яа,к-АТСезы и низком уровне Иа-Н изоморфизма является результатом нарушения избирательности г?а центра фермента при выделении и очистке. ! .

Показано, что в результате взаимодействия между фосфатными группа™ мембранных препаратов 1Га,к-А?Фази и положительно заряженными группа».® лизиновых и аргининовых остатков ги-стона происходит двуфазное изменение активности ферментной

системы, зависимое от концентрации гистона. Оценка кинетических параметров взаимодействия АТ1ази с ионами натрия и калия в стандартной среде и в присутствие гистона показала, что повышение ферментативной активности обусловлено демаскированием предсуществовавшшс натриевых и калиевых центров за счет кон-формационных изменений, происходящих в результате.электростатического взаимодействия положительных зарядов гистона и отрицательных - клеточной мембраны; тогда как ее снижение - результат конкуренции мелду положительными зарядами гистона и иона!,га натрия на первом этапе реакции и ионами калия - на последнем.

Путем сравнения влияния'гистона на На,К-АТФазу с действием поверхностно-активных веществ разной природы,также оказывающих дьуфазное действие на активность фермента, установ- • лено, что модифицирующее действие гистона не является результатом его поверхностной активности, так как рабочие концентрации гистона на 2-3 порядка ниже, а увеличение концентрации гистона на порядок, которое приводит к перемене знака его модифицирующего действия, в отличие от испытанных ПАВ, практически не изменяет величины поверхностного натяжения содержа- • щей АТйазу суспензии.

Показано, что теплоустойчивость На.К-АТФазы пойкилотерм-. ных организмов, оцениваемая по критерию выше у животных

того ввда, у которого выше оптимальная температура развитие (в наших опытах у озерной лягушки по.сравнению с травяной) или у животных того же ввда, но перенесших тепловой шок. При этом в обоих случаях повышение Тд^ происходит эа счет повышения температуры начала инактивации.

Рассмотрены'варианты адаптивного изменения характеристик системы активного транспорта натрия через клеточные мембраны при изменении условий окружающей среды: а) специфических для данной системы - концентраций транспортируемых ионов и б) не-спёцифических - таких как температура.

Научно-практическое значение работы. Изучение механизмов, регулирующих функционирование систем активного транспорта обеспечивающих неравновесное распределение катионов между . клеткой и средой, является актуальной проблемой современной

клеточной биологии. Получешше в настоящей работе результаты позволяют оттенить диапазон возможных изменений данной системы под воздействием разнообразных внешних и внутренних Факторов, таких как изменение ионного состава среды по обе стороны клеточной мембраны, изменение заряда поверхности клетки, нарушение ее структурной целостности, влияние на активность транспортной АТФазы гормонального статуса организма и температуры окружающей среды. Полученные данные помимо теоретического могут тлеть и практическое значение. Так, установленный в работе принцип однотипного изменения характеристик транспортной ' системы в ходе филогенеза и при внезапном тепловом отборе может быть использован при селекционной работе, а учет сезонных изменений активности На,к-АТ1озн будет полезен для подбора условий и сроков при производственной акклиматизации животных (например в рыборазведении).

Поскольку при выделении и очистке Нп,к-АТФазы, как правило, используются ПАВ разной природы, полученные в работе данные о модифицирующем влиянии этих соединений на свойства исследуемой ферментной системы, необходимо учитывать при дальнейшем использовании получаемых с помощью поверхностно-активных веществ препаратов.

Апробация работа. Полученные в настоящей работе результаты были представлены и обсуждены на Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции мембран" (Пущино,19в7), 2-м и 4-м Всесоюзных биохимических съездах (Ташкент,1979; Ленинград,1979), Всесоюзном симпозиуме "Ионный транспорт через биологические мембраны" (Киев,1970), 4-м и 5-м биофизических конгрессах (Москва,1972; Копенгаген,1975), 1-й конференции экспертов из социалистических стран по проблеме "Физические, химические и биохимические аспекты транспорта ионов через мембраны" (Райн-хардсбрунн, ГДР,1972), Всесоюзной конференции "Молекулярные механизмы проницаемости мембранных структур" (Паланга,1973), Всесоюзном симпозиуме "Физико-хюиические основы функционирования надмолекулярных структур клетки" (Москва,1974), Всесоюзном симпозиуме "Мембранн&ч энзшлология и проницаемость мембран" (Ереван,1977), 6-м коллоквиуме "Ультрафиолетовые лучи в биологии-и медицине" (Кюлундсборн,1ДР,1977), Всесоюзном

совещании "Факторы модификации мембранно-связанных белков" (Пущино,1977); 2-м Советско-американоком симпозиуме по биомембранам (Киев,1978), Советско-финском симпозиуме по проблемам "Биохимические аспекты структуры и функции ядерных и цитоплазматических мембран" (Ленинград,1979), 1-м и 3-м Советско-швейцарских симпозиумах "Биологические мембраны. Структура и функция" (Тбилиси,1979; Ташкент,1983), 6-й конференции биохимиков Прибалтийских республик, Белорусской ССР и Ленинграда (Рига,1981), 6-й Всесоюзной конференции по экологической физиологии (Сыктывкар,1982), 2-м Всесоюзном совещании "Клеточные механизмы адаптации" (Кара-Даг,1985), Всесоюзных совещаниях "Транспортные АИазы" (Москва,1969; Тбилиси,1972,1978; Кара-Даг,1973,1981; Алма-Ата,1976,1983; Тарту,1980; Ташкент,1981; Иркутск,1987),Всесоюзном симпозиуме "Ионный транспорт и регуляция функций клетки" (Ленинград, 1990).

- Объем и структура работы: Для защиты диссертации представляется совокупность работ: - 49 публикаций в отечественных

и международных изданиях. Текст работы составляет 48 стр.,включая 15 рис., 12 табл. '

П. Материал и методы исследования

Основные результаты получены на мембранных препаратах Яа,к~АТ$азы из почек морских свинок, белых крыс линии Вистар-и лягушек 2-х видов (травяной - Rana temporaria L. и озерной - Rana ridibunda Pall.). Использованы препараты разной степени дезинтеграции и очистки: гомогенаты ткани; мембранные препараты," выделенные по методу Поста и Сена (Post,Sen, 1967), тот re препарат.дополнительно очищенный обработкой додецилсульфатом натрия по'Иоргенсену (j/irgeneen, 1974)i срезы ткани, толщиной 10 мкм, позволяющие анализировать фермент в одном слое относительно сохранных клеток, приготовленные Крестинской (Крестинская, Манусова,1969). Специальная сравнительная серия опытов была выполнена на препаратах нервНЫХ ганглиев улитки (Planorbis corneue).

- -г Измерение активности На,К-АТ$азц, К-пНДФази и Mg-АТДозы. Стандартная среда для определения, активности На.к-АТвазы содержала как правило (мМ): АТФ - 2.5; UgCl2 - 3.0; Н^ЭДТА -

25.0; KCl - 4.0,- liaCl - 25.0; "Црис-HCl (pH 7.0) - 4.0. Количество АТФ, гидролизованного неспецифической Mg-AT®G30fl, определяли в среде без натрия и калия, содержащей уабаин; полученную величину внчитали из количества АТФ, гидролизованного в стандартной среде, получая в результате активность ггя,К-АТФ-азы.

Стандартная инкубационная среда для определения активности пНС-Гази содержала как правило (мГЛ): пНФФ - 4.0; MgCl2 -4.0; Н4ЭДТА - 1.0; Трис-HGi (pH 7.0) - 50.0. Количество пНФФ, гидролизованного в ходе неспецифической <Тосфатазвой реакции" определяли в бескалиевой среде и полученную величину внчитали из количества пШФ, гидролизованного в стандартной среде.

Ферментативную активность оценивали по количеству неорганического фосфора (Фд), отщепленного от АТФ или пНФФ при инкубации их с ферментом в течение 20 мин при 44°С и выражали в мк молях Фд на мг белка за 1 час или в % по отношению к активности исходной пробы, принимаемой за 100#.

Реакцию получения промежуточного соединения (Е-Р) в ходе знзиматического гидролиза АТФ препаратами На.К-АТЗозн проводили по методу Бадера, Сена и Поста (Bader et al.,1966), для чего предварительно получали меченую по конечной фосфатной групе АТФ согласно собственной модификации методов Пфлей-дерера (Pfieiderer,1961) и Глинна и Чеппела (aiyon.chappeii, 1964). . '

Потеппиометрическое определение изменения активности ■ ионов натрия в рабочей суспензии в ходе гидролиза АК5 На,К-ATffaaofl проводили с помощью чувствительного к натрию стеклянного электрода (стекло ЛАВЭ25_05_0д) с константой натрий-ка- ' лиевой специфичности 0.18 (БелюстинДев,1965; Никольский и др.,1967; Белюстин и др.,1968).

Интенсивность прямого 180-обмена (П-обмен): HgP1804 ^

Н20 измеряли в среде, содержащей (мМ): Н3Р1804 - 10.0; MgCij-2.5; KCl - 4.0; Н4ЭДТА - 1.0; Трис-шя (рГ1 7.5) - 4.0. Анализ содержания в образцах проводился по методу, описанному Пантелеевой и Скворцевичем (1977).

Для оценки теплоустойчивости (ТУ) исследуемых препаратов ферментов использовали критерий Т^^у (температура, при которой

в результате 30 мин инкубации активность фермента снижается . на 50$).. Опыты как правило проводили в течение декабря-января месяцев. Перед опитом животных выдерживали не менее 4-х недель при температуре 4-6°0. Для достижения состояния теплового шока животных помечали в водяной термостат с температурой Е6°С на срок, необходимый для потери рефлекторной возбудимости, затем немедленно извлекали из термостата и оставляли при комнатной температуре до восстановления двигательной активности (5-10 мин),после чего сразу же использовали для приготовления ферментативного препарата. Контрольные жи- . вотные все время до препаровки находились при температуре 4-6°С.

Полученные результаты обработаны статистически и представлены в тексте и в таблицах в форме £¿3- (п), где х -среднее арифметическое, 3- - ошибка среднего, п - число из- 1 змерений. Различия считались достоверными при уровне'значимости Р не более. 0.05. Коэффициенты корреляции (г) оценивали по методу, описанному Рокицкш (1974). В сериях, выполненных на однородных препаратах, ошибка определения не превышала 5%.

Ш. Взаимодействие кофакторов в ходе гидролиза АТФ На.К-АТДаэой

Разработанная в 60-е годы, постадийная схема противогра-диентного транспорта одновалентных катионов предполагала наличие фосфврилированного промежуточного состояния. Однако к моменту начала настоящего исследования это вещество, очевидно, являющееся существенным элементом ферментативного механизма работы На,К-АТ4азы, еще не было выделено и в достаточной, степени охарактеризовано. Полученное нами (Писарева,Црст,1968) по разработанному Постом й Сеном (Роа1;,Зеп,1967) методу соединение гидролизуется в Трис-буфере с постоянной скоростью и при рН 6 и 31°С за 2 часа отщепляется 60-70$ фосфора (Рис. 1,1). В присутствие гицроксиломина скорость гидролиза резко увеличивается и около 70$ фосфорилировашюго материала гидролизуется за первые 30 мин инкубации; скорость гидролиза ос-• тальных 30$ материала практически не подвержена действию этого агента (Рис. 1,2), что указывает- на возможную негомогенность

Рис.1. Гидролиз посредника при рН 6, ь - 31°С, полученного в разных уело-, виях. По оси ординат - количество иегддролизовапного посредника в % (шкала логарифмическая); но оси абсцисс - время в мин. 1 и 2 - посредник, полученный в нормальных условиях; 3 и 4 - в присутствие уабаина; 1 и 3 - гидролиз в подо, 2 и 4 - гидролиз в гвдроксиламшш.

полученного материала. Могло считать, что чувствительный к гидроксиламину компонент представляет собой промежуточное соединение в ходе гидролиза АТФ изучаемой ферментной системой, которое, как было установлено (Нок1п ег а!.,1965; Нпвапо «г а1. ,1965), представляет собой фосфопротеин, где фосфат присоединен с помощью ацилФосфатной связи. Остальные 30,,» фосфорилированного материала, возмогло, представляют собой результат фосфорилпрования по гадроксильным группам серяна (по<1п1йЬ4 в! а1.,1966), которое может осуществляться в отсутствие натрия и не имеет отношения к механизму его транспорта. Уабаия, вносившийся в рабочую смесь непосредственно перед АГ^Ф,- не оказывал влияния на количество и характер гидролиза образующегося фосфорилированного соединения (Рис. 1,3), что указывает на то, что он не участвует в реакции на первом ее этапе, однако внесенный в среду на 40 мин раньше АГ^Ф, он существенно (на 40$) снижает количество образованного посредника. Гидролиз фосфорилированного материала, полученного в этих условиях, в среде, содержащей гияроксиламин, показал, что уменьшение общего количества фосфорилированного продукта произошло, в основном, за счет его чувствительной к гидроксиламину части (Рис. 1,4). Очевидно, имело место медленное взаимодействие между нефосфоргогарованним энзимом и уабаином, с последующим фосфорилированием за счет присутствующего в среде неорганического фосфора, в результате которого уменьшилась способность ферментной системы реагировать с АТФ. Доказательства возмоя-

ьостл соединения уабакш о нефос^оршыроЕанноа формой энзима и фоофоридпро'вания анзила за счет неорганического фосфата били получены затем рядом авторов (Мпййп.зауег ег а!., 19СВ; Лишко, 19пЭ; МеЕе1 et а1.,19С>3).

Решении 130 обмана также могут служить тестом на образование фосфорилнровашшх интерыидкатов и отражением 'частных реакций в хода гидролиза АТФ мембранной А'йазой. П-обмен или обмен со средой осуществляется со свободным Фн после его отщепления от АТФ или добавленным в 'среду в отсутствие АТФ. Впервые наличие обмена в системе На,К-АТ5азц било продемонстриро-. вано в налей работе (Скворцевнч,Пантелеева и Писарева) в 1972 году. Оказалось, что в среде, содержащей все ионы (Ык++, к+ и На4), необходимые для проявления АТ«ззной активности, наблюдается высокий 1Й0 обмен ( 3 атома на молекулу ®н), который почти полностью (на 992) тормозится при удалении магния или калия ;.тогда как удаление натрия слегка (на 19,1) стимулирует его. Уабаиц в концентрации ЪсЮ'^М, полностью подавляющий в наших препаратах На.к-зависимую АТФазную активность, на 95$ снижал и ьелич.шу обмена; АТФ и АД1> подавляли его на 22 и 37$ соответственно. Механизм обмана можно прел,ставить себе следующим образом:

12 (8 . .0 Е-Р§О+нон- ен+н о-р-о. о щ* ■ ■ о

Такой механизм предполагает обратимость стадия гидролиза АТФ, связанной с распадом фосфорилированного интермедиата. Магний стимулирует обман, способствуя образованию интермедиата, калий - способствуя его распаду. Уабаин подавляет обмен, стабилизируя посредник. Таким образом, результаты исследования обмена в системе На.к-АТФазц подтверждают образование фосфори-лкроваачого посредника, постулируют обратимость•фосфатной часты реакции и показывают, что в случае фосфорилирования фермента при помощи 5 роль ионов калия сводится к стимуляции распада интермедиата.

Гидролиз АТС, осуществляемый Иа,К-АТ4азой плазматических мембран, представляет собой цепь'последовательных реакций,в результата которых происходит перемещение натрия из клетки, а калия в клетку против градиента их концентраций за счет

энергии, освобождающейся при гидролизе. Известно, что количество осшбоздаэдогося ijocilarm, характорпзущее АТ^-азпую активность системы, зависит от соотношения нонол натрия и калпя в среде. Естественно било ожидать, что Ферментная система, регулируемая На+ и к.4 и принимающая участие в их транспорте через мембрану, способна образосигать временные связи с этими нонами в ходе осуществления ферментативной реакции. Действительно, Ярнеаельдт п Стедянгк (Ju-nnfelt.ste-atnitfc,1961,1963), а также Чарнок и Пост (Charnook,Foot,1963) обнаружили зависимоо от ЛТФ я подавляемое уябапном связыва- ' ние ла препаратами Пп,К-ЛТ?ши. Если наряду с ионами натрия в среде присутствовали ионы калия, количество 22но, связанного с осадком, представляющим собой .фосфорилиронанное промежуточное соединение, уменьшалось. Однако, строго говоря, приведенные результаты не позволяют судить о том, ускоряет калий отщепление ранее связанного натрия или препятствует его связывания. Поэтому нами (Lev,Pirmrcvn, 1970) было проведено потенциометрическое определение активности ионов, натрия в оуспензии, содержащей Па,к-ЛТТпзу, при последовательном добавлении компонентов, обеспечивающих протекание АТЧазной реакции. Полученные результаты иллюстрирует таблица 1:

Таблица 1. Изменение активности ионов натрия и АТ1азной активности препарата после добавления K'CL

Вари- Добавление(+) Увеличение активности АИезная аканты или исклаче-__Па4" (мМ)_тивностъ {%

'ние(-)* п м+п р к I варианту)

1 Нет(станд.среда) 30 1.11+0.11 - 100

2 -АТ1аза(контроль) 24 0.68+0.10**' 0.01 0

3 -Па-АГ5 9 0.67+0.14 0.01 0 + ПаСХ(5 мИ)

4 -Па, АТФ ' 4 0.65+0.03 0.01 43 +Ла|№(2.5 мИ)

5 +СаС1,(2.0 мМ) 8 0.67+0.15 0.02 27

6 +уабайн 14 0.92+0.12 0.2 65

(Ю^-Ю-3!.!)

* Вещества добавляли и исключали по отношепгю к стандартной

среде: суспензия Г1а,К-АТ1азы (2-3 мг белка/1 мл); MgOlg -2.0 м!.!; Па^АТФ - 2.5 мМ; KCl - 2.0 tiM. ^ Песпецнфический эффект влияния к+ на Па-чувствителъный электрод.

Сказалось, что в присутствие АТФ, Lig++ и Ыа+добавление к"1 вызывает увеличение активности 17а+ на 0.43 м.М (1.11-0.68). Исключение АТФ или ее замена на АДФ, так же как и добавление Са++ к среде, снимает отмеченное выше увеличение активности • натрия, снижая одновременно АТФазную активность системы. Увеличение активности ?/а+ в среде после добавления к суспензии К+ ш рассматриваем как результат освобождения натрия, связанного на предыдущих этапах реакции.. Кальций является ингибитором активного транспорта натрия и .Ча.К-АТФазы (Jaraefelt, 1S62), при этом предполагалось (Repke,1963).что он занимает, места ионов натрия. Поскольку в наших опытах "введение ионов кальция в рабочую смесь непосредственно перед АТФ резко снижало АТФазнуи активность и снимало увеличение активности натрий в ответ на добавление калия, мы заключили, что связывание натрия в присутствие кальция не происходило. Отсутствие влия-. ния уабаина на освобождение натрия при наличии ингибирования игл АТФазной реакции позволило нам предположить, что уабаин не предотвращает связывания натрия препаратом и его последующего освобождения под влиянием калия, то есть уабаин не включается в АТФазную реакцию на первых ее этапах. Это подтверждают и полученные нами данные (Писарева,Пост,1968) об отсутствии влияния уабаина на образование фосфорилированного посредника (см. рис. 1,3).

1У. Влияние способа обработки материала" и степени дезинтеграции клеточной мембраны на характеристики Иа.к-АТЗази •

Опыт работы с На.к-АТФазой показывает, что характеристики ферментного препарата в значительной степени зависят от •способа его обработки и очистки. Эта зависимость была продемонстрирована нами при'изучении изоморфизма лития и натрия в ходе гидролиза АТФ препаратами'На.к-АТфазы (Скульский и др., 1982,1904; Писарева и др.,1989). Сравнивали способность лития

замещать' натрий в активации Яа.К-АТ&ззы почек крысы и нейронов улитки параллельно в На-К, L1-K и Яа-Ы средах на ткапе-внх срезах, гомогенатах ткани и мембранных препаратах разной степени очистки, тщательно отмытых от эндогенных натрия и калия (рис.2). АТЗазную активность определяли в сходных условиях. При достаточной структурной сохранности исследуемой ткани Ы-К-стимулируемая активность фермента практически равна его Па,К-стимулируемой активности. В таких же условиях его Ы-На активность составляла 50-60$ последней (даже при пятикратном увеличении концентрации лития в среде по сравнению со стандартной концентрацией калия). При дезинтеграции ткани Ы-На изоморфизм нарушается значительно сильнее, чем Ll-К. В результате этого на очищенном ферментном препарате активность, стимулируемая М+к составляет в-8%, а активность, стимулируемая Ll+Na - около 30% его исходной На+К • стимулируемой активности. В гомогенате ткани Ы-К активность обнаружить не удалось, возможно в результате того, что ионы лития значительно сильнее чем ионы натрия ингибируют составляющую до 50£ общей АТФазной активности грубых препаратов неспецифическую Mg-ДТФазу, маскируя малый уабаин-зависимый вклад м,К-АГФазы (рис.3). Зависимость Ы-Яа изоморфизма oí целостности мембран не является исключительным свойством полярных клеток эпителия почки, подобные результаты были получены и на препаратах нервной ткани улитки (рис.4). При умеренном изменении структуры мембраны путем обработки срезов нервной ткани пролранололом, который по данным ряда авторов (Godin et al. .,1976; Portier et al.,1977} Surewioz ,Leyko, 1981) вызывает структурные перестройки клеточной мембраны, реагируя как с белком, так и с фосфолипидами, было установлено, что пропранолол, не снижая достоверно Иа.к-зависимую активность срезов, резко ингибирует их Ы,к активность. Очевидно, что речь идет не о разрушении активируемого натрием . центра фермента пропранололом, а лишь об изменении его избит рательности. Ионная избирательность На центров была охарактеризована нами и по их чувствительности к гуанидиновой грун-тфовке амилорвда, r-nh-C(hh2)2 (рис.5), блокирующего На-ка-налы ионтранспортирующих клеток, равно как и их Яа,к-АТФэзу (Резник, Наточин,1983). Оказалось, что ингибиторная способ-

' - Рис.2. Активность На,К-АТФ-азы грубой мембранной фракции (1), очищенной мембран- . ной фракции (2) и тканевых срезов (3) из почек крысы в Na-K Ш , Li-K á. И Na-Ii И средах.

Рис.3. Na.K(-x-) и Li.K(-o-) активность грубой мембранной фракции из почек крысц . с поправкой на разницу в активности ltg-АТФазы в натрие-• вых (~х~) и литиевых (~о~) средах. По оси абсцисс -. концентрация Na+ или . (М). По оси ординат - активность фермента($). За ис-©ь • ходную точку принята актив-

ность препарата в среде: '

о, (5На+10К) мИ.

I0D] 60 60 40 ¡0

Рис.4.Активность иа,к--АТФ- Рис.5.Влияние амилорвда на ак-

азы'в срезах нейронов улит- тивность Иа,К-АТФагы нативных

ки: нативных (1)'и обрабо- срезов (1), срезов, обработан-

танных яропранололом (5х них'пропранололом (2),и очищен-10"%) (2). Среды обозначе- ного препарата фермента (3) из

ны так же-как на рис.2. нейронов улитки (амилорид 5х

10-4М).

ность амилорцда также является функцией целостности мембраны; так, если в исходных срезах он ингибирует На.к-АТФазу примерно на 80#, то в срезах, обработанных пропранололом, то есть частично трансформированных, - лишь на 40£, а на обогащенной мембранной фракции эта величина становится неразличимой. Таким образом, представление о низком уровне ы-на изоморфизма в активации транспортной АТЯезн и уникальной роли натрия в этом процессе, бытующее до настоящего времени (5кои,19В8), скорее всего является результатом высокой чувствительности На-связнвающих мест к операциям, обычно применяемым при выделении и очистке фермента.

К аналогичному выводу мы пришли и на основании опытов по измерению теплоустойчивости Иа.к-АТЗазы из почек белой крысы, оцениваемой по критерию Те^ (рис.6). Сравнивали ТУ так называемой грубой мембранной фракции и препарата, обработанного по методу Поста, исходная активность которых была 18.0 и 98.0 мкмоль/мг белка/час соответственно. Оказалось, что Т50^ Яа.к-АТФазы в результате очистки снизилась на 4.5°С (с 52.0 до 47.5), тогда как Mg-ATfeзы тех же препаратов не изменилась.

Изложенный материал является иллюстрацией того, как присущие ферменту специфические характеристики изменяются при дезинтеграции клетки, связанной с выделением и очисткой фермента.

Однако, несмотря на все ограничения, исследование На-• помпы на модельных системах показывает, что сравнительная оценка препаратов йа.к-АТЗезы, полученных от разных объектов одним и тем же способом, оказывается весьма продуктивной. Так, Виллис с соавторами (чш.11в а1.,1978), сравнив температурную чувствительность потоков К4-в эритроцитах и клетках почек с чувствительностью соответствующих препаратов 1(а,К-АТ5азы, установили, что меньшая чувствительность почек, отражается в активности изолированного энзима так же, как и| в потоках калия, измеренных на интактных клетках. Известно : много примеров экспериментального изменения активности На,к--АТФазы в результате изменения питания и содержания живот. ных. Еде в 1968 году (Кат1уа,Ш;1сЗа,19б8) было обнаружено пятикратное увеличение активности гта.к-АТФазы в клетках япон-

WQ ' (20 100 80 ЬО

<10 20

~36 ЧЪ ÍT "3b 4Í 48 « °C

Рис.6. Теплоустойчивость препаратов На.К-АТЗ&зы и Mg-АМезы разной степенц очистки. По оси ординат -•остаточная активность-фермента в %, а - На", к-АТЧаза, б — Mg-ATfleaa; по оби ординат - температура предварительного прогрева в %. Удельная активность препаратов: х - 18 й о - 98 мк моль/мг белка/час.

ского угря на SO-й день после перенесения животных из пресной воды в морскую. Характерно, что активность Mg-АТвазы в тех же препаратах оставалась неизменной. За прошедшие с тех пор годы накопился огромный материал, свидетельствующий в пользу адаптивных изменений,активности На,к-АТФазы в зависимости от содержания натрия и калия в. среде; Результаты, этих экспериментов обобщены в большом числе.обзоров и книг (Хоча-чка, Сомеро,1977,1988; Болдырев,Твердислов, 1978;- Болдырев, Мельгунов,1985).'

Адаптивные изменения активности яга.К-АТФазы могут быть направлены как на восстановление нарушенного конного равновесия клетки -.так называемая "срочная" регуляпия, так и на решение проблем перевода системы на другой уровень функционирования в процессе эволюции- так называемая "долговременная" регуляция. Последняя достигается в основном ss счет изменения интенсивности синтеза самого фермента. Этот вопрос

рассматривается молекулярными биологами и биохимиками. Потребности "срочной" регуляции могут, быть удовлетворены как за счет демаскирования предсуществующих молекул (существование в клетке латентной популяции молекул Яа.К-АТФазн было неоднократно показано: Диксон,Уэбб,1982; Еснрев,1S83), так и за счет увеличения скорости обращения уже работающих активных единиц благодаря изменению условий их функционирования. Осуществление обоих указанных способов зависит главным образом от изменения состояния плазматической мембраны, в которую вмонтирована АТФаза,последнее определяет доступность соответствующих центров фермента для таких лигакдов как Na+,K+, Mg++,Ca++ и АТФ, а также эффекты-, осуществляемые регулятор-ными белками и эндогенными биологически активными соединениями. Изучение этой зависимости и.явилось следующим этапом нашей работы.

У. Возможные способы осуществления "срочной" регуляции активности Ha.K-АТФазы при изменении условий ее функционирования - "

1. Выбор модификатора. Для решения поставленной задачи необходимо было найти способ обратимой модификации мембран, позволяющий сопоставлять изменения свойств мембраны со сдвигами активности изучаемой ферментной систем. К моменту начала настоящей работы уже было известно, что гистойн способны образовывать комплексы с мембранными компонентами клеток, несущими при физиологических рН отрицательный заряд. В результате этогр происходит нейтрализация поверхностного заряда мембран, что в срою очередь ведет к изменению их проница- ' емости (Schwartz et al.,1965-1966). Кроме того, было известно, что.обратимая потеря возбудимости нервной тканью при выдерживании ее на холоду сопровождается миграцией гистопов из ядра з цитоплазму, где они связываются преимущественно с t фракцией клеточных мембран (Moilwain,1959,1961). С другой J стороны, оказалось, что гистоны и протамины ингибируют активность На.К-АТФазы (Rendi, tor, 1964; Ioshida et, al.,1965; Schwartz,1965). Эти факты привели нас.к мысли испытать указанные поликатионы в качестве модели эндогенного фактора, контролирующего систему активного транспорта катионов..

Изучение влияния различных фракций гистонов (НрН^.Н^ и Нд), проталина и полилизина на активность мембранных препаратов Ма,К-АТФазы показало, что все фракции гистонов в малых концентрациях (5-10 мкг/ыл) повышают активность фермента на 5-15$, а по мере роста концентрации до 20 мкг/мл и выше снижают ее активность до постоянного уровня, составляющего 50-6С$ от исходной. Протамин и полилизин в сопоставимых с гистонами концентрациях также ингибнруют фермент, однако активации АТФазы этими веществами обнаружить не удалось даже при снижении юс концентраций до 0.05 мкг/мл (рис.7).

Рис.7. Взаимодействие АТФазы с различными поликатионами. По оси ординат -активность На,К-АТ$азы (в %), по оси абсцисс - концентрации поликатнонов (в мкг/мл). А .- действие различных фракций гистонов

II—-5

II—•ь IV—7

(1 - Н^, 2 - Нд, 3 - н.

10 20

<1-

50 120

4 -Н2а).

1'

Б- действие лизина или аргинина - 5, про-тамина - 6, полилизина - 7.

Характерно, что диаминокарбоновые кислоты лизин и аргинин,-входящие в состав испытываемых поликатионов и обусловливающие их основные свойства,в сопоставимых с поликатионами концентрациях не оказывали заметного влияния на активность фермента, и .лишь с помощью концентраций на три порядка более высоких удавалось достигнуть такого же уровня снижения активности АТФазы, однако,при дальнейшем увеличении их концентраций могла бить достигнута, в отличие от поликатионов, более высокая степень инактивации. Сравнение ингибиторного действия группы низкомолекулярных органических оснований, включающей упомянутые аминокислоты, позволило установить корреляцию между способностью этих веществ инактивировать на,к-АТФазу и уровнем их основности (табл.2).

Можно предположить, что в .случае яоликатиояов инактивация достигается не только за-счет непосредственного реагиро-

Таблица 2. Константы основности (1^) и концентрации половинного ингпбирования Пп.К-Л'Кпз»

Соединения К^ § (в М)

Гуанидин 4.0 х Ю-1 0.07

Аргинин 1.1 х Ю-5 0.12

Лизин 8.9 х 10"6 0.30

Ацегамид 3.0 х 10~14 0.95

Мочевина 1.5 х Ю-14 1.05

вания их с мембраной АТЗазой, но-также за счет экранирования поверхности мембранной частицы свободными положительными зарядами катиона, в результате которого ионн натрия не' могут приблизиться к активному центру фермента. Наибольшей величины активации удается достигнуть с помощью гисгонов фракции Н^, в структуре которых наблюдается чередование обширных гидрофильных и гидрофобных' зон по длине молекулы. При сравг-ненип получепных результатов создается впечатление, что для стимуляции ферментативпой активности необходим определенный уровень сложности структуры воздействующего на мембрану поликатиона, тогда как торможение определяется электростатически, наличием у испытуемого агента множественного положительного заряда. Возможность получения с помощью гастонов в 'зависимо-, сти от их концентрации как стимулироваютя, так и торможения активности изучаемой ферментной систем; определила наш дальнейший интерес к этому агенту.

2. Взаимодействие с ионами активаторами. Так как актив- • ность изучаемой нами ферментной системы специфически зависит от концентрации ионов натрия и калия в среде, необходимо было в первую очередь установить, как отражается модификация ги-стоном на основной регуляторной функции, осуществляемой этими ионами. Оказалось, что увеличение концентрации натрия в среде, с 25 до 85 мМ, которое само по себе существенно не влияет на регистрируемую активность, приводит к ослаблению инактивирув-щего действия гистона или даже к полной реактивации препарата (рис.8). При соответствующем увеличении концентрации далия в среде реактивирующего- действия зарегистрировать не удалось.

3 %

ч т

1 т

г

ВО'

25 15 И »5

)

Рис.8. Влияние увеличения концентрации натрия на инги- • бирование активности АТФазы гистонами,. По оси абсцисс -концентрация НаС1 в среде (в мМ); по оси ординат - активность АТФазы (в %). 1,2,3,4 - фракции гистонов Н^.Н^,

'2в'Н3

Рис.9. Влияние изменения концентрации натрия в среде на активность АТЗазы,модифицированной активирующими концентрациями гистона. По оси абсцисс - концентрация Нам в среде (в ыМ); по оси ординат - активность АТ4азы (в %). 1 '-. без. гистона, 2-е гисто-ном.

При модификации На.к-АТФазы малыми, активирующими'количествами гистона оказалось (рис.9), что в случае недостатка натрия в среде (Б мМ) ферментативная активность препарата в присутствие гистона значительно ниже, а при нормальном и повышенном содержании натрия - выше активности, наблюдаемой в отсутствие гистона. При этом, если в отсутствие гистона в среде с 125 м!Л натрия наблюдается тенденция к снижению активности фермента в результате торможения дефосфорилирования посредника избытком' натрия, то в пробах, содержащих гистон, такого снижения не наблюдается. Таким образом, при недостатке натрия возможность активации АТФазы малыми количествами гистона нр реализуется. Сравнение представленных кривых показывает, что в присутствие малых концентраций гистона открываются дополнительные возможности активации препарата ионгши натрия,, в результате чего оптимальное содержание натрия в среде сдвигается в сторону более высоких его концентраций..' Изменений характера зависимости активности фермента от концентрации калия в присутствие гистона замечено не было.

Для решения вопроса о механизме влияния гистона на АТФ-азную реакцию изучали кинетику взаимодействия фермента с ионами активаторами (Na+ и К+) и субстратом реакции (АТФ) в норме и в присутствие гистона (табл.3).

Таблица 3. Кинетические параметры Па,к-ЛТФазы в условиях активации и ингибирования ферментативной активности гистоном

Кон- На.к-АКаза К-пНМаза

О 4.7+0.7 100 1.0+0.3 100 1.8+0.4 100 1.8+0.2 100 5 4.6+0.9 140 1.2+0.4 140 1.2+0.3 200 2.4+0.5 100 30 15.5+0.6 100 2.0+0.8 60 8.5+0.6 100 4.0+0.6 70

Оказалось, что повышение активности фермента гистоном происходит без изменения его сродства к натрию и АТФ, тогда как ингибирование сопровождается увеличением K_g g для натрия от 4.7 до 15.5 мМ, в то же время максимальная скорость реакции остается неизменной, т.к. увеличение концентрации натрия полностью снимает этот эффект, что свидетельствует о наличии конкурентных отношений между гистоном и иона?,та натрия на этапе ингибирования ферментативной активности. Из этогр следует, что связывание гистонов осуществляется в числе прочих функциональными группировками 1Га,к-ЛТ7азн, ответственными за связывание натрия. Увеличение K_q 5 для натрия на этапе ингибирования. сопровождается увеличением К_0 5 для АТФ, однако повышение концентрации АТФ в среде гистонового ингибирования не снимает, что указывает на отсутствие конкурентных отношений между гистонами и АТФ. Поскольку известно (Post et al.,1973), что связывание АТФ в активном центре фермента зависит от сродства фермента к натрию, можно предположить, что наблюдаемое в присутствие ингибирутощей концентрации гпстона повышение ^-0.5 для представляет собой вторичное явление и отражает имеющее место в.этих условиях снижение сродства фермента к ионам натрия. Попытка обнаружить конкуренцию за участки связывания между гистоном и ионами палия на примере гидролиза АТФ Яа,К-АТФазой успехом не увешалась. Восьмикратное увели-

цепт--

рация K_n I-гис- и< тона г!1

шах

мкг/ мл

чение концентрации калия не снижало ингибирования фермента гистоном.

Поскольку принято считать, что К+-зависимая пара-нитро- ■ фенилфосфотазная активность (К-пНМаза) препаратов На.К-АТФазы в полной мере отражает свойства К+-активируемого этапа общей АТФазной реакции, эта система и была нами использована для выяснения характера взаимодействия гистонов и ионов калия. Оказалось (табл.3), что ингибирование К'-пНФФазы гистоном связано с увеличением 5 для калия с 1.8 в норме до 8.5 в присутствие 30 мкг/мл гистона, при этом повышение концентрации калия приводит к полному снятию гистонового ингибирования. Одновременно повышается К_0 5 для пНФФ с 1.8 до 4.0, однако • повышение концентрации субстрата не изменяет глубины ингиби-ровашш. Отсюда следует вывод, что ингибирование 1Га,К-АТФазы гистонами на последнем этапе реакции сопряжено с конкуренцией (между гистонами и ионами калия. По-Бвдимому, в общей АТ&азной реакции конкуренция гистонов с ионами калия маскируется их конкуренцией с ионами натрия на первых этапах реакции и по- ■ этому раньше не была обнаружена нами. Так. как на стадии активации как общей, так и К-пНФФазной реакции малыми концентрациями гистонов не происходит изменения сродства ферментной системы ни к ионам активаторам, ни к субстратам реакции, можно считать, что наблюдаемая активация обусловлена увеличением количества активных центров за счет проявления латентных участков фермента под влиянием гистона. В основе этого явления могут лежать конформационные перестройки мембраны в результате частичной .нейтрализации ее заряда гистонами, однако нельзя исключить также и изменение ее характеристик под влиянием поверхностно-активных свойств белков.

3. Сравнительная оценка поверхностной активности гистонов. Сравнивали влияние гистонов на суммарную АТФазную реакцию, осуществляемую препаратами На,К-АТ$азы и ее К-зависимый этай, который по нашим данным (Скворцевич и др., 1972) может быть охарактеризован- помимо К-зависимой пНФФазной реакции й интенсивностью прямого 180-обмена (П-обмен). с действием поверхностно-активных веществ (ПАВ) разной природы,также оказывающих, в-зависимости от используемой концентрации, двуфазное действие на активность фермента.

Сравнение АТ$азной активности я интенсивности П-оймена, катализируемого тем же препаратом, показало, что соотношение П-обмен/активность практически не меняется от препарата к препарату и составляет в среднем 1.5+0.1 (л=14). Обработка препаратов дезоксиходатом натрия (ДОС), Тритоном Х-100 и ги-стоном СТабл.4) в низких концентрациях приводит к активации, а в высоких - к ингибирования к яте активности Иа,К-АТФазы, так и П-обмена.

Таблица 4. Действие поверхностно-активных веществ на свойства Яа.К-АТЗозн

Активация

Ингибирование

ПАВ

Концентрация % Концент- %

агента во вре- от исходного рация от исходного

мя обработки---агента во -:-

актив- П-об- время об- актив- П-об-ноегь мен паботки ноегь мен

ДОС 0.6-1.2 мг/мл

1.5-3x10"®».! Тритон 0.12-0.16мг/мл Х-100 2.5-ЗхЮ_4Ц

173+10 116+2 1.8 мг/мл 69+7 49+1 5х10_311

.175+10 128+10 0.2 мг/мл 54+19 83+0 5х10~4М

Гиотон 0.01 мг/мл 112+2 121+6 О.Обмг/гял 64+5 86+8

5x10 М

5x10"%

Соотношение мевду величина!.«! активности п П-обмена при обработке препарата активирующими и ингибирующими концентрациями ДОС снижалось до 1.0+0.1 и 0.9+0.2 соответственно, а при обработке активирующими концентрациями Тритона Х-100 -до 1.5+0.1 за счет того, что при активации активность На,К-АИазы увеличивается в большей степени, чем интенсивность П-обмена, а при ингибировашш ДОС наблюдается более значительное снижение П-обмена, чем активности. Гистон ни в том, ни в друтом случае не изменяет указанного соотношения. Исследование влияния рН инкубационной среды на АТФаэную активность и; П-обмен, катализируемые исходными препаратами Иа,к-АТФазы,. ■ показало, что снижение рН до 6.1 увеличивает соотношение П-обмен/активность до 4.5+0.6,- тогда как повышение рН до 9.0 приводит к снижению указанного соотношения до 0.4+0.1. Таким образом, наблюдается некоторое несоответствие мевду рН зави-

симостью активности Па,К-АТ4ази и катализируемого ею ГГ-обме-на; в кислой 'среде меньшей ло абсолютной величине активности соответствует неизменная величина П-обмена; в щелочной - снижение АТФазной активности оказывается менее существенным, чем снижение П-обмена. Следствием этого является рН-зависимое изменение соотношения П-обмен/активность (табл.5). Таблица 5. Отношение П-обмен/активность для исходник и обработанных ПАВ препаратов Ыа.К-АТФази при изменении рН инкубационной среды

Исходный рН препарат

Обработка ДОС

акти- Кнгиби-вация рование акти

Обработка Тритоном Х-100

Обработка гистоном

Ингиби- акти- ингиби-вацня рование вация рование

6.1 4.5+0.6 1.6+0.5 1.4+0.6 3.8+0.6 14.1+4.0 2.0+0.1 1.9+0.0 7.5 1.5+0.1 1.0+0.1 0.9+0.2 1.3+0.1 1.7+0.3 -1.2+0.1 1.5+0.3 «]9.0 0.4+0.1 0.5+0.1 О.бчО.О 0.4+0.1 0.4+0.0 0.3+0.1 0.5+0.0

. Исследование зависимости-скорости гидролиза фосфорилиро-ванного в ходе гидролиза АТФ препаратами На,К-АТФазн посредника от рН среды (рис.10) показало, что при кислом. рН время жизни этого фосфоршгароэашюго интермедиата.на уровне которого протекает П-обмен, наибольшее, тогда как полный цикл' реакций гидролиза АТФ включает в себя состояния с иными рН оптиг иумамн.

■ Рис.10. -Зависимость скорости гидролиза фосфорилированного посредника от рН среды (температура.31°С). По оси абсцисс - количество негвд-. ролизованного посредника (в %, шкала логарифмическая); по оси ординат - продолжительность гидролиза (мин). 1 - рН 2, 2 - рН 4, 3 -рН 6, 4 - рН 8.

Обработка препаратов, на,к-АТ4азы ДОС и гистоном как в активирующих, так и в ингибирующих концентрациях снимает действие низких рН на это отношение и не затрагивает действие

высоких рН. Обработка Тритоном Х-100 на влияет на изменение отношения П~обмен/активность, вызываемое сдвигом рН. Влияние "ДОС и глстона на рН-зависимость Па.К-активируемой Л Казной реакции, отличающее их от Тритона Х-100, инертного в этом отношении, вряд ли можно считать прямым следствием их ионной природы. По-видимому, только совместное влияние ионных и гидрофобных взаимодействий является определяющим в модифицирующем действии этих агентов на систему На,К-АТ£азы.

Таким образом, ДОС и Тритон Х-100 так не, как и гистон, оказывают двуфазное действие как на суммарную АТ1азную реакцию, так и на К-зависимый ее этан. Общей характеристикой действия активирующих концентраций всех трех исследованных агентов является неизменность К_о 5 по натрию. Тогда как при ин-гибировании этой системы указанными веществами во всех случаях наблюдается 3-4-х кратное увеличение этого показателя. Для оценки характера взаимодействия этих агентов о клеточной мембраной измеряли изменение коэффициента поверхностного натяжения суспензий обладающих АТ£аэной активностью мембран в результате введения в.среду модифицирующих ферментативную активность количеств сравниваемых ПАВ (табл.6). Таблица 6. Изменение поверхностного натяжения и активности Иа.К-АТФазы суспензии микросом под- воздействием гистопа. Тритона Х-100 и дезоксихолата натрия

Модификатор Концентрация (М) Коэффициент Активность поверхностного " На.К-А'Писи натяжения дин/см %

Без добавок - 66.5* . 100.

Гистон, ' ' 5x10~7 63.4 ■ 112+3

5x10-6 ■ 62.7 . 70+3 '

Тритон,Х-100 Зх10~4 45.1 • 136+4 ■

5x10~4 39.4 55+10

ДОС . ЗХ10"3 50.7 174+14

5x1О-3 45.1 42+8

* Коэффициент поверхностного натяжения суспензии микросом, содержащей 0.7 мг белка в 1 мл.

При сопоставлении представленных в табл.6 результатов

прежде всего обращает на себя внимание то, что модифицирующие АТФазную активность концентрации гистона на 2-3 порядка ниже соответствующих концентраций Тритона Х-100 и ДОС. Модифицирующие концентрации сравниваемых ПАВ составляют при активации 5х10~7, ЗхЮ-4, ЗхЮ-3, а при икгибировании 4Х10-6, 5х10"4, Зх10~% для гистона, Тритона Х-100 и ДОС соответственно. Эту разницу можно объяснить тем, что положительный заряд гистона "облегчает его взаимодействие с отрицательно заряженной клеточной мембраной, тогда как.отрицательный заряд головки ДОС затрудняет это взаимодействие, а неионный Тритон Х-100 - нейтрален.- Проведенное сравнение показывает, что модифицирующее действие гистона не является результатом его поверхностной активности, поскольку при увеличении "концентрации гистона в среде в 10 раз (с 5x10"' дф 5х10~%), сопровождающемся переменой знака изменения ферментативной активности с максимально возможной активации до ингибирования, имеет место лишь минимальное изменение коэффициента поверхностного натяжения.

4. Природа функциональных групп, участвующих во взаимодействии между На.к^АТФазой и гистоном. С целью получений-сведений о природе указанных групп была измерена активность Па,К-АТФазы в присутствие гистона, ДНК и ДНП. ДНП в наших .опытах содержал количества гистона, которые давали четко выраженный активирующий или ингибирующий эффект. Оказалось, что гистон после взаимодействия с. ДНК перестает реагировать с На,К-АТОазой (табл.7). .. .

Таблица 7. Влияние гистона,ДНК и ДНП на активность Яа,К-ЛТФ-азы

Гистон Активность ДНК Активность ДНП Гистон Активность мкг/мл АТФазы, % мкг/мл АТОезы, % мкг/мл в ДНП АТвезы, % ___;___мкг/мл

0 100 0 ■100 0 0 100

0.3 106 2.5 95 - - -

' 0.5 110 5.0 . 94 2.8 .0.5 99

. 2.5 86 .10.0 90 - -• -

5.0 71 15.0 101 - 28.0 • 5.0 99

1.0.0 75 20.0 99 ■ - - _

25.0 82 25.0 99 - - - '

Поскольку известно, что за взаимодействие ДНК-гистон ответственны фосфатные группы ДНК и положительно заряженные 4 групгш лизинобых и аргининовых остатков гистона (сгатр^а ег а1.,1Э57; Уепаге1у ек а1.,19бО),а образующийся продукт в значительной мере теряет способность поддерживать синтез РНК,тот факт, что гистон в составе ДНП перестает быть модификатором Яа,к-АТФазы, свидетельствует в пользу предположения, что взаимодействие гисгон-ЛТ&за происходит за счет тех же функциональных групп,-что и гистон-ДНК. Известно также (Ашмарин и др.,1968), что в комплексах ДНК-гийтон-метафосфат и ДНК-гис-. тон- л-казеин ДНК восстанавливает свою РНК-синтезирующую ак- _ тивность. В наших опытах было изучено совместное действие гистона и ¿.-казеина на Яа,к-АИазу (рис.11).

Рис.11. Действие с*.-казеина на ингибирование активности.Яа,К-• АТГазы гистонами. По оси абс-' цисс - содержание ^-казеина (мкг/мл). По оси ординат - активность АТ2азы {% к исходному уровню). 1,2,3,4 - соответственно фракции гистонов Н^.Н^, ^2в'%> 5 " пробы без гистона.

Полученные результаты показывают, .что «¿.-казеин действительно снимает ингибирующее влияние гистонов,' что сввдетель-■ ствует.в пользу изложенной выше трактовки. Обращает на себя , внимание тот факт, что ¿.-казеин не только возвращает активность фермента'к уровню, наблюдаемому в отсутствие гистона, но и позволяет несколько превзойти этот уровень. Такая активация может быть истолкована как результат смещения реакции ' гистон-АИаза в результате конкурентного образования комплекса гистон-казеин в сторону малых концентраций гистона, т.е. в . область, где гистон активирует АТФазу. В таком случае при дальнейшем повышении концентрации казеина или внесении его в среду с исходно малым (активирующим) количеством гистона активность фермента должна снизиться до исходного уровня, что

мы и наблюдали в'действительности (рис.12а). Однако оказалось, что при добавлении небольших количеств казеина (10-20 мкг/мл) в среду, содержащую АТФазу и гистон в активирующей . концентрации, наблюдается дополнительное увеличение активности системы на 10-20$ по сравнению с уровнем, наблюцавшимЬя в присутствие одного гистона. Поскольку этот факт оказался . для нас неожиданным, воспроизводимость его была проверена на всех четырех тлеющихся в нашем распоряжении фракциях гисто-пов (рис.126). ■ . _ ,

• Рис.12. Влияние •'--казеина на активацию АТФаэы пистонами. По оси абсцисс

- концентрация л-казеина (мкг/мл). По оси ординат

- активность АТФазы {%). А - фракция Н2а! Б - гис- ■ тоны различных фракций: 1,2,3,4 - соответственно

н2а,н3'н2в,н1-

Полученные данные свидетельствуют в пользу высказанного нами ранее предположения, что гистон, реагируя с На,к-АТ$а-зой, локализованной в мембране, снимает часть отрицател1,ных зарядов и позволяет .мембране принять конфигурацию, обеспечивающую появление некоторого дополнительного количества активно функционирующих группировок. В результате этого увеличивается количество мест, способных реагировать с натрием, и некоторое повышение содержания натрия в среде становится эффективным. Одновременно с увеличением количества активных мест, за счет изменения.конфигурации, вероятно, происходит экранировка от натрия некоторого количества ранее существовавших, равно как и вновь образованных, центров свободными положительными зарядами.гистонов. Таким образом активирующее и инги-бирующее действие гистонов постоянно суммируется и при достаточно высоком их.содержании в среде последнее оказывается древалиругощим. Если принять такое объяснение, становится понятной и суперактивация, обнаруженная ври воздействии умерен-., ных количеств «с-казеина на' АТСазу, активированную малыми ' •

количествами гистона. При таком понимании предпочтительной становится трактовка, предполагающая образование тройного

• комплекса АТЗеза-гистон-казеин. В этом случае казеин, снимая экранировку гистоном активных групп АТ£азы, позволяет наблюдать свободный от сопутствующего тормозящего влияния актиЕа-ционный эффект конформационных изменений, связанных с образованием комплекса АИаза-гистон.

Поскольку даже высокоочищенные препараты На,К-АТ1азы представляют собой сложные липофосфопротеидные комплексы, фосфатные группы в них могут принадлежать как белковому, так и липиднсму компоненту. По нашим определениям, доля фосфора, принадлежащего фосфолипидам, составляет по крайней мере 87$, и если гистон неспецифически реагирует с любыми фосфатными

• группами препарата, на что косвенно указывает снятие гисто-нового ингибирования такими различными фосфоросодержащими веществами как ¿.-казеин и метафосфат, можно ожидать, что внесение в среду дополнительного количества фосфолипида.также ослабит действие гистона. Действительно, в случае, когда

. 25 мкг/мл гистона вызывало снижение АТЗазной активности на Ы%, в присутствие 47 мкг/мл лецитина то же количество гистона давало снижение.лишь на 53% («¿-=0.999), а внесение в среду 25 мкг/мл гистона дополнительно' снимало защитное дей-

• ствие лецитина. Приведенные данные свидетельствуют о том,что

• гистон способен реагировать с фосфатными группами самых различных типов соединений (белок, ДНК, липиды).

5. Влияние состояния клеточной мембраны-на взаимодействие между гта.к-АТДазой и гистоном. В опытах на бислойных ли-пидных,'мембранах (см. Антонов, 1982) показано, что взаимодействие основных белков с мембраной зависит от заряда, который может- быть наведен в результате обработки детергентами. По-, скольку отрицательный заряд клеточной мембраны способствует

, ее электростатическому взаимодействию с несущей положительный заряд молекулой гистона, можно ожидать, что предварительная .обработка клеточной мембраны ПАВ, изменяющая ее заряд,

' должна соответствующим образом сказаться на результатах взаимодействия мембраны-с гистоном. Мы обрабатывали мембрану ДОС, взаимодействие с которым могло повысить ее отрицательный заряд или Тритоном Х-100, который, как было показано, ее

заряда не изменяет. Предварительная обработка мембран указанными детергентами проводилась таким образом, чтобы в результате активность АТГазы была максимально повышена или снижена примерно на 50$ от исходного уровня. После снижения концентрации ПАВ 5-кратным разведением суспензии в нее вводили ги-стон в концентрациях, вызывающих максимальную активацию или ингибирование исходного препарата. Рассмотрение полученных результатов показывает (табл.8), что закономерности, наблюдаемые на бислойных липвдных мембранах, частично приложили к. естественным мембранам. По-видимому,. как в том, так и в другом случае пусковым механизмом реакции является электростатическое взаимодействие, на что указывает зависимость рабочих концентраций агента от заряда. Однако необходимо отме- . тить, что активирующие и цнгибируищие концентрации этих агентов остаются неизмешпки в диапазоне рН от 6.1 до 9.0, ■ хотя абсолютная величина активности при сдвиге рН среды сильно меняется. Вероятно, второй этап реакции - гидрофобное взаимодействие-- в случае клеточных мембран гораздо сложнее и определяется большим количеством параметров, в том числе пространственной конфигурацией молекул действующего агента и состоянием клеточной мембраны.

. Таблица 8. Влияние гистона на активность На,К-АТ5азн клеточных мембран, предварительно обработанных поверхностно-активными веществами

Предварительная обработка

Активность АТФазы (%)

Без гистона

гистон

Без обработки ДОС, Зх10~2М То же, 5х10-5М ' Тритон Х-100, 3x10" То же, 5х10~4М '

бхЮ-'М 5x10-6!

100 112+3 70+3

. 174+14 176+11 70+6

42+8 49+10 18+4

136+4 • 142+9' 66+7

55+10 83+9 37+8

Характер наблюдаемых изменений АТФазной активности под влиянием гистонов (величша активации и угнетения, копцент- ' рации гистона, при которых-эти изменения наблюдаются) неско--лько изменяются от препарата к препарату. Эти колебания могут.

ьз

быть результатом различного состояния структур« мембраны, в частности различной величины мембранных Арашентов, а также " состояния и прочности связей между различными компонентами мембраны в этих частицах, поэтому была сделана попытка оценить влияние этих факторов на активность На.К-АТФззы и взаимодействие ее с гистоном с помощью обработки изучаемых препаратов ультразвуком, с целью уменьшении степени полидпспер-сности частиц, и агентами, диссоциирующими внутримембрашше связи. В результате обработки изучаемых препаратов ультразвуком активность фермента падала В среднем на'49+3$. При этом, если до обработай она варьировала в широких пределах (34-97 мкмоль на мг бежа, п=15, 3 =18), то в результате об' работки существенно выравнивалась (20-44 мкмоль на мг, п=15, ¿=8). Активацпонный эффект гистонов на озвученных препаратах усиливается и стабилизируется, тогда как гистоновая инактивация ослабляется; амплитуды колебаний между максимальной и минимальной активностями, которые могут быть достигнуты, у каждого данного препарата в присутствие гистона у исходных , (37+5) и озвученных (28_»4) препаратов, существенно не-различаются (^ =0.902). Обработка 2М мочевиной с последующей отмывкой, что привело к увеличению активности с 66^6 до 77+5 мкмоль/мг, и 20$ ацетоном в условиях,' не приводящих к'экст-. ' ракции липвдов; снизившая активность препарата с 60+5 до 48+ ■ +4 мкмоль/мг, показала, что в обоих случаях препараты с более высокой активностью слабее отвечают на активирующее воздействие малых концентраций гистона и значительно более чувствительны к его ингибирующему действию. При этом кинетические характеристики мембранных препаратов ?;а,к-АТг«зыр полученных'с помощью различных способов обработки, под воздействием гистона изменяются сходным и неотличимым от исходного препарата образом (табл.9).

■ Сравнение результатов,' полученных при воздействии гистона на препараты Ыв,к-АТФазн с различной исходной активностью позволяет придти к заключению, что чем выше активность-препарата, определенная в отсутствие гистона,.тем меньше проявляется активационный эффект его малых концентраций, а Вызванная гдетоном инактивация глубже и наоборот; при этом диапазон наблюдаемых в присутствие гистона изменений у

Таблица. 9. Влияние гистона на константу ингибирования для Не

Препарат К_о.5

• без гистона' гистон 2.5-10 мкг/мл 25-50 мкг/мл

Исходный 4.7 5.1 15.0

Обработанный:

а) мочевиной . 3.7. 6.0, 15.0 .

б) ультразвуком 5.4 .4.7 22:4

в) ацетоном ' 4.6 4.6 20.0

г) ПАВ (ДОС, 3-6 3-6 15-20

Тритон Х-100) 1

всех испытанных препаратов существенно не различается. Таким образом, характер ответа изучаемой ферментной системы на воздействие гистонов оказывается чувствительным показателем ее состояния и потенциальных возможностей. Использование гистонов позволило нам продемонстрировать резервные механизмы-срочной регуляции активности системы противоградиентного транспорта одновалентных катионов в ответ на изменение соста-" , ва окружающей среды и состояния клеточной мембраны.

Другой стороной проблемы поддержания ионного гомеостаза • клетки является обеспечение саморегуляции натриевой помпы при изменении условий среды,не связанных непосредственно с осуществлением основной функции, т.е. неспецифических для данной системы факторов, таких, например, как температура.

П. Механизмы поддержания активности Ка.К-АМазы при ■

изменении температурных условий ее функционирования

Задача поддержания на достаточном для жизнеобеспечения уровне работы натриевой яомлы при изменении температуры окружающей среды может, бытв решена как с помощью специальных механизмов, обеспечивающих постоянную температуру тела животного, так и, как это имеет место у пойкилотермных организмов, с помощью соответствующих измененным температурным условиям мо- , дификаций самой ферментной'системы, последние представляют ' .

для нас наибольший интерес.

Зависимость температуры инактивации клеточных ферментов "от температуры среды обитания животного била установлена и детально изучена в коллективах, руководимых В.Я.Александровым и Б.П.Ушаковым (Александров,1975,1985; Ушаков,1989). Корреляция между теплоустойчивостью (ТУ) белков-ферментов и температурой обитания вида была продемонстрирована на -многих примерах, в том числе на примере различных АТЯаз (Комкова, Ушаков,1955; Мурзахметова и др.,1979; Писарева и др.,1983). Однако данных, о воздействии температуры на На.к-ДТ&чзу мало, . и получены они в разных методических условиях, а поэтому с трудом по,вдаются систематизации.

Проведенное яри максимальной стандартизации условий эксперимента определение величины Т^р^ ряда ферментов, относящихся к системе энергетического обмена (Глушанкова и др., 1981,1986), показало, что по ТУ исследованные препараты четко делятся на две группы. Одну группу составили ферменты, мало устойчивые к нагреву, Т^у которых колеблется в пределах ,31-37°С (фосфофруктокиназа, актомтозин, креатинкиназа-и аль-долаза), ко второй значительно более теплоустойчивой группе относятся Иа.к-АТФаза, 1^-АМаза и сукцинатдегидрогенаэа (СДГ), Т^о^ которых составляет 47-52°С (рис.13).

Рис..13. Теплоустойчивость ферментов травяной лягушки. Но оси абсцисс - температура 30-мин воздействия (°С). Но оси ординат - остаточная актинность фермента {%). 1 - кре'атиккипаза, 2 -актомиозии, 3 - гссЯс^руктокиназа, 4 - альдолаза, 5 - сукци-яатдегвдрогеназа, а - па.к-АТваза, 7 - кв-АТСаза, Точки пересечения ит|.ихсвсй лшпш с кривыми ТУ соответствуют температуре полушиштипащ'.'; >огдан-га (Тгл»).

О I >;0

В дальнейшей мы оценивали характер зависимости от температуры среды активности и ТУ На,К-АТФазы и для сравнения двух других ферментов теплоустойчивой группы : Mg-ATSasH, о которой известно, что она имеет с на,К-АТ$азой тесную топографическую, а по данным ряда авторов (Ktnmelberg.Papahadjopouloe", 1974; lagerepetz,19TB; Terri et al.,1978) и функциональную . связь, и СДГ, активность которой в клетках секреторного эпителия почек изменяется при изменении уровня реабсорбции натрия параллельно с активностью Яа,к-А№1зы (Крестинская.Ману-сова,1973,1976; Наточин,1983)..

При оценке сезонных показателей активности и ТУ сравниваемых ферментов травяной лягушки (табл.10) обнаружено повышение среднего для популяции уровня Активности в репродуктивный период, который в нашей климатической зоне приходится на май месяц, и на этом фоне увеличение степени согласованности активностей исследуемых ферментов внутри каждого данного ор- . ганизма в эти же сроки (табл.11).

Таблица 10. Сезонные изменения активности и теплоустойчивости ферментов травяной лягушки . .

Яа,К-АТФаза Ие-АТФаза СДГ

актив- Тс/у актив- Тел* актив- Тсп£ •Сезон ность „0 ность ^ ность J?4?

(у.е.) (°С) (у.е.) (°С) (у.е.) (°С).

январь 4.3+0.В 50.7+0.5 10.9+0.6 53.9+0.4 7.2+0.3 46.4+0.6 март 4.3+0.3 - 49.7+0.2 10.1+0.6 52.9+0.3 7.1+0.3 45.9+0.4 май 5.8+0.3* 50.6+0.6 11.8+0.6* 55.5+0.8 9.4+0.5* 47.2+0.6

* результат достоверно отличается от значений, полученных в январе и марте (р<0.05).

Таблица 11. Сезонные изменения уровня индивидуальных корреляций активности и теплоустойчивости ферментов травяной лягушки

Сравниваемые пары ферментов

Сезон

На,К-АТ$аза- Mg-АТФаза-СДГ. На,К-АТФаза-СДГ

-Mg-АТФаза _

актив- Тсгр актив- Тсг^ актив- Тс^ ' _ность_ окг'° ность ность ои/°

январь +0.43* +0. 25 +0.16 -0.13 +0.01 -0.05

Продолжение таблицы 11

лмарт +0.73* +0.27 +0.20 +0.21 +0.42* -0.05 май +0.79* +0.01 +0.61* +0.14 +0.33* -0.17

1 корреляция статистически достоверна (р<0.01).

Поскольку обнаруженные изменения активности ферментов относятся в основном к репродуктивному периоду, а работа выполнялась на смешанной популяции животных, была дополнительно проведена оценка результатов по каждому полу, (табл.12).

фермент

ГГа.К-АТФаза Мй-АТФаза СДГ__

Примечание: ни в одном случае активность ферментов самцов и самок достоверно не различается (р>0.05).

Оказалось, что различий в активности анализируемых белков-ферментов у самцов и самок практически нет, следовательно, повышение активности ферментов'энергообеспечения в ре-■ продуктивный период обеспечивается в популяции за счет особей обоего пола. Обнаруженные сдвиги активности исследуемых ферментов представляются целесообразными с общебиологической точки зрения, так как более высокий и согласованный уровень активности отдельных ферментов, по-видимоцу, повышает общую жизнеспособность'организма.

.Параллельно с измерением активности сравниваемых ферментов проводили оценку их ТУ по критерию ГБ0,; (см. табл. 10). ■ Полученные результаты показывают, что при переходе животных от зимнего покоя к активному состоянию не происходит существенных изменений средней для популяции ТУ исследуемых ферментов. Попарное сравнение индивидуальных величин ТУ изучаемых ферментов (см. табл.11) также свидетельствует об отсутствии согласованных изменений этого признака. Только анализ изменчивости ТУ позволил обиару-нггь перемены, происходящие к моменту икрометания. Вариабельность ТУ Пя-А'ЛСазн л СДГ к маю

активность (у.е,) самцы

самки

5.3+0.5 ~Х9+о77" 11.9+0.9 11.6+0.9 10.4+1.0 8.2+0.5

Таблица 12. Активность ферментов самцов и самок травяной лягушки в репродуктивный период

увеличивается, причем за счет женских особен, более чем в -два раза. Все параметры, характеризующие ТУ ка,к-ЛТФазы оставались неизменными. Поскольку температура содержания животных в сравниваемые периоды оставалась постоянной (4-6°С), причиной обнаруженных сдвигов, по-видимому, надо считать изменение гормонального статуса оргапизма при изменении уровня физиологической активности.

При расширении диапазона температур предварительной инкубации выяснилось, что высокая ТУ Ца.К-АКазн обеспечивается ее большей сохранностью при начальных температурах'прогрева, тогда-как высокий-уровень Т5д* Мв-АТФазы определяется низким темпом ее инактивации (рис.14а). Полученные результаты позволили предположить возможность существования различных путей . филогенетической адаптации; у АТФ-гвдролизующих ферментов, связанных с различными физиологическими функциями. Для проверки этого предположения было проведено исследование темпе-. ратурной зависимости АТФаз другого вида - озерной лягушки (рис.146), оптимальная температура развития которой на 7°С выше, чем у травяной. Кривая температурной инактивации Ка,К--АИазы у озерной лягушки оказалась смещенной вправо и Т^д^ увеличилась примерно на 3°С за счет повышения температуры начала инактивации. ТУ 1^-АТ(Еазы, оцениваемая по этому критерию, снизилась, однако, определяющим фактором здесь, как и у травяной лягушки," бал темп инактивации, который существенно увеличился, хотя температура начала инактивации повысилась соизмеримо с таковой у гта,К-АТФазы. Существование обратной компенсации у Мк-АТФазы на отставленных сроках адаптации отмечали И Другие авторы (й1огаап,19В0) ЬаБегзрегг,Ы.1теп,19В4} Ьайег8ре1г,1987). Обнаруженные.факты представляются не случайными. на,к-АТ2аза является основным компонентом натриевого насоса, обеспечивающего ионную и осмотическую регуляцию, поэтому, если адаптация организма к изменению солености включает в себя изменение активности этой ферментной системы, вполне возможно, что адаптация к температуре заключается в изменении условий ее функционирования таким образом, чтобы ее способность реагировать на изменение концентрации внутрикле-• точного натрия оставалась неизменной. Если так, то высокая . ' стабильность- Иа.К-АТФазы при начальных температурах прогрева

и является проявлением такого рода адаптивной реакции, обеспечивающей ферменту способность адекватно реагировать на изменение ионных градиентов в широком диапазоне температур. С целью исследования сиюминутной реакции сравниваемых ферментов па внезапное, шоковое воздействие температуры была сде-,лана сравнительная оценка по тем же параметрам препаратов На.К-АТЯазц и Мй-АТЗазы, выделенных из почек животных (озерной лягушки), подвергнутых тепловому шоку, и контрольных, которые все время до препаровки находились при температуре содержания (4-6°С) (рис.15).

Оказалось, что ТУ обоих исследованных ферментов в результате перенесенного животным теплового шока увеличилась: в случае На.К-АКазн произошло повышение температуры начала инактивации, а в случае Мз-АТЗазн - снижение теша инактивации. Таким образом, наблюдается совпадение характера сдвига кривой зависимости активности Па.к-АТФазы от температуры, возникшего в процессе видообразования-и в результате внезапного теплового отбора. Это позволяет предположить, что повышение порога инактивации является для Па.К-АТЯазн генеральной реакцией при температурной адаптации. При таком подходе ста-

Рис.14. Теплоустойчивость АТФ-гидролизующих ферментов травяной и.озерной лягушек. По оси абсцисс - температура 30-мин воздействия.(°С). По оси ординат - остаточная активность фермента (%). "а" - травяная-лягушка; "б" - озерная лягушка. 1 --На.К-АМаза, 2 - Мк-АТССаза..'

со го

ю

те

го

I, ~4

-Нх4

-ЗЬ 10 чч

чг

52. 56

зь

40 Щ иг 5Я 56

Риз.15. Теплоустойчивость ДТФ-гидролизуюашх ферментов озерной лягутакп в норме и после теплового атака животного. По оси абсцисс - температура 30-мин воздействия (°С). По осп ординат - . остаточная активность фермента (.%). "а" - норма; "б" - результат теплового шока. 1 - Па,К-АТФаза; 2 - Мя-АТ5аза.

иости т?а,К-АТФазы и отсутствие корреляции ее ТУ с ТУ других Ферментов энергообеспечения, с одной стороны, так и повышение ферментативной активности и степени ее согласованности в ре-продуктивный период, когда меняется реабсорбция натрия, с другой. При этом,- однако, необходимо отдавать себе отчет в том, что единообразие ответа "системы активного транспорта одновалентных катионов на воздействие температуры в различных временных рамках, очевидно, достигается за счет различных по своей природе модификаций как самой клеточной мембраны, так и встроенных в нее ферментных систем.

Заюшчение

Нацеленная на поддержание ионного гомеостазй клетки Иа,К-АТФаза тонко приспособлена к тому, чтобы немедленно отвечать на возникновение потребности по восстановлению и поддержанию неравновесного распределения, ионов натрия и калия по обе стороны клеточной мембраны. Решению этой задачи прежде ноего служит механизм саморегуляции, то есть изменения активности гонтранспортирурпей системы в ответ на изменение кон-

центраций транспортируемых ионов. Это нашло отраженно в са\ названии исследуемого фермента - На,к-активируемая, Независимая аденозинтрифосфатаза. Однако при резком изменении ионных .условий среды может возникнуть необходимость мобилизации дополнительных механизмов "срочного" регулирования активности транспортной системы, так как вынужденное поддержание работы фермента на уровне, близком к критическому, снижает гибкость системы-и ее способность реагировать на иные, в том числе и не связанные непосредственно с основной (функцией изменения внешних условий, например температуры окружающей средн. В этом случае транспортная система должна по возможности долго сохранять способность адекватно реагировать на изменение ионных градиентов соответствующими изменениями активности. Наш опыт показал, что генеральной реакцией На.К-АИязы на изменение температуры, как длительное - в процессе филогенеза, так и мгновенное - в процессе внезапного теплового отбора, является снижение чувствительности к изменениям этого параметра, что выражается в повышении теплоустойчивости в результате сдвига кривых температурной инактивации в сторону более высоких температур за счет повышения температуры начала инактивации у особей более теплолюбивого вида или у особей того же веда после перенесенного животным теплового шока. Такое единообразна, как уже отмечалось, скорее всего достигается с помощью различных по своей природе модификаций как самой клеточной мембраны, так и встроенных в нее ферментных систем.

Большое значение в обеспечении такой регуляции функционирования Na.K-АТФазы имеют мембранные липвди (Girmjd et al., 1981; Болдырев,1988; 4едосова,19S0; Lagarppetz, 1990; Tmiga-wa,Lagerr,petz,l990), причем основная роль отводится ближайшему лиявдному окружению белковой структуры фермента. С другой стороны, интегральные белки могут в свою очередь влиять на организацию липидного бислоя мембраны. Бзланс между гибкостью и стабильностью таких сложных биологических систем как клеточные мембраны и встроенные в них ферменты в значительной кере осуществляется за счет "слабых" нековалентных связей, таких кат; электростатические, гидрофобные и т.п.

Опит нашего исследования взаимодействия гистонов с мемб-оеЕнвма псесапатшиг На.к-АТФазы позволит псоцеионстрировахь

многообразие механизмов модификации активности транспортной системы. Гистоны, реагирующие с клеточной мембраной как за счет электростатического взаимодействия с отрицательными зарядами самой мембраны, таг. и с фосфатными группами компонентов транспортной системы и способные в результате такого взаимодействия осуществлять двуфазную, зависимую от концентрации гистона и состояния мембраны модификацию активности На,к-АТФ-азн, оказались в высшей степени удобным инструментом для изучения разнообразных механизмов "срочной" регуляции транспорта, одновалентных катионов через клеточную мембрану и поддержания ионного гомеостаза клетки.

Выводы' 1 •

1. Выделено и охарактеризовано фосФорилированное соединение, белковой природы, промежуточное при гидролизе АТФ мембранной транспортной АТФазой. С помощью потенциометрического определения активности ионов натрия установлено, что в ходе гидролиза АТФ происходит связывание ионов натрия с системой Иа.к-АТфязы и последующее освобождение его в результате внесения в среду ионов калия, что указывает на образование временных связей между комплексом Па.к-АТЗвзы и транспортируемы-'Ми при ее участии конами.

2. Продемонстрировано наличие реакций обмена в системе Па.к-А'ГСезы, что служит 'указанием на образование фосфо-рилированных пнтермедиатов в ходе гидролиза АТФ этой системой. Отношение прямого.обмена и На,К-зависимоа АТСазной активности, выраженных в соответствующих единицах,практически не меняется от препарата к препарату и в среднем составляет 1.5+0.1.

3. При достаточной сохранности мембранной структуры литий является практически полным аналогом натрия в активировании на,К-ЛТ5езы. Представление об уникальной роли ионов натрия в этом процессе является результатом нарушения свойств натриевого центра в процессе выделения и очистки фермента. Селективность калиевого центра, как показывают данные об активации различных форм ферментного препарата литием, в меньшей степени зависит от процедур по изоляции фермента.

4. В результата взаимодействия мевду фосфатными группами мембранных препаратов На,К-АТФазы и положительно заряженными

"группага лизиновых и аргининовнх остатков гистона происходит двуфазное, зависимое от концентрации.гистона изменение активности ферментной системы. Увеличение активности при малых концентрациях гистона происходит без изменения К_0 5 для Па+ и к+ и является результатом демаскирования предсуществугощих активных центров. Снижение АТФазной активности при увеличении концентрации гистона в среде является результатом конкуренции между положительными зарядами гистойа с одной стороны и ионами Па+ и к+, с другой, и сопровождается увеличением К_0 5 для этих ионов в 3-4 раза.

5. Влияние гистонов на Па.К-АИазу не является результатом их поверхностно активных свойств, поскольку модифицирующие АТФаэу концентрации гистона значительно Сна 2-3 порядка) ниже таковых известных поверхностно активных веществ (ДОС, Тритон Х-100), также оказывающих на активность На,к-АТ£азы двуфазное действие, а 10-кратное увеличение концентрации ги-

,стона, сопровождающееся переменой знака его модифицирующей активности, практически'не приводит к изменению поверхностного натяжения содержащей АТФазу суспензии.

6. Соотношение между фазами повышения и понижения актив-• ности АТФазы под влиянием гистонов зависит от исходных характеристик препарата: чем выше исходная активность, тем меньше стимулирующий эффект гистона и значительнее ингибирование и наоборот. Суммарный эффект (+д) практически не меняется от препарата к препарату.

■ ■ 7.' Теплоустойчивость Г1а,К-А'№зы. поГисилотермных организмов,. оцениваемая по критерию Тдо^ (температура, при которой за 30 минут достигается падение активности препарата на 50$?) выше у животных того вида, у которого оптимальная температура развития выше (в наших опытах у озерной лягушки по сравнению . с травяной) или у животных того же вида, но перенесших тепловой шок. Повышение Тпроисходит за счет повышения темпера-'туры начала инактивации фермента, что обеспечивает системе активного транспорта возможность адекватно реагировать на изменение Ионных условий среды в широком диапазоне температур.

8. Предложена схема изменения характеристик системы ак-

Timiioro транспорта одновалентных катионов через клеточную мембрану при изменении условий окружающей среды как специфических для данной системы (концентрации транспортируемых катионов), так и неспецифических (температура), учитывающая многообразие возможных путей достижения необходимых изменений.

Список ооноеных работ по теме диссертации:

1. Писарева Л.Н. Свойства к+ и На+-активируем0й АТФазы из коры почек морской свинки // Биофизика. 1968. Т.13, № 3. С. 550-554. - ...

2. Писарева Л.Н. Активируемая н'а+ и к+ аденозинтрифос-фатаза из коры почек морской свинки. I. Получение, взаимодействие с ионами и ферментными ядами // Цитология. 1968. . Т. 10,- JS 8. С.988-994.

3. Писарева Л.Н., Пост Р. Л. Активируемая Па+ и К+ аде-ноэинтрифосфатаза из коры почек морской свинки. П. Получение и свойства фосфорилированного промежуточного соединения, - образующегося в ходе гидролиза АТФ Na и к АТФазой // Цитология. 1968. Т.10, №9. С.1127-1132. .

4. Лев A.A., Писарева Л.Н. Наличие ионнообменного втапа в реакции гидролиза AT® мембранной АТ4азой // Тез. второго . Всесоюз. биохим.' съезда. 1969. Ташкент. С.129.

5. Лев A.A., Писарева Л.Н. Взаимодействие ионов Na и к в ходе гидролиза АТФ мембранной АИазой // Цитология. 1970. Т.12, К 7. С.879-886,

6. Lev A.A., Pisareva L.II. A study of sodium release in the course of ATP hydrolysis by membrane ATPase //J. Membrane Biol. 1970. Vol.2. P.103-118.

7. Lev A.A. , PisarevaL.H. Direct evidence of sodium

, release in the course of Ha+, K+-dependent ATPase reaction // BBRO. 1970. Vol.38, Ho.3. P.465-469-

8. -Писарева Л.Н., Комкова А.И., Данилова(Парфенова)Е.В. . ■Взаимодействие гистонов с мембранной АТ£азой // Цитология. •1970. Т. 12, И 11. С. 1406-1411. " - . .

• 9. Писарева Л.Н. Анализ механизма регулирования активности транспортной АТС-азы катионами // Укр.биохим.журнал. 1971. tf 1. С.53-59. .' , "

10. Писарева Л.Н., Иванова Г.И. Соотношение активации и торможения ферментативной активности Па,к-АТФазы при взаимо- действии ее с гистонами // Цитология. 1972. Г.14, № 8. С.975

-979.

11. Скворцевич Е.Г., Пантелеева Н.С., Писарева Л.Н. Реакции изотопного обмена кислорода в системе ?1а+-к+-зависимой АТСазы //ДАН СССР. 1972. Т.206, Я 1. С. 240-242. '

12. Писарева Л.Н., Иванова Г.И. Влияние ряда неэлектролитов на активность Ыа.к-АТФазы // Цитология. 1973. Т. 15,' »4. С.415-422.

13. Трошин А.С., Писарева Л.Н., Иванова Г.И. Взаимодействие Яа,к-АТФазы с сахарами и некоторыми другими неэлектролитами // Тез. 1У Междун. биосТиз. конгресса. Москва, 1972. Т.З. С.111-112.

14. Писарева Л.Н., Парфенова Е.В. Влияние исходного состояния мембранного препарата ма,к-АТ4езы на взаимодействие его с гистонами // Биофизика мембран. Каунас, 1973. С.514--517.

15. Писарева Л.Н. Влияние размера частиц мембранных препаратов Па,К-АТФазы на свойства локализованной в них ферментной системы // Матер. Всесоюз. симп. "Физико-химические основы функционирования надмолекулярных структур клетки". Москва, 1974. Т.2. С.62-63.

16. Писарева Л.Н., Пинаев Г.П., Парфенова Е.В., Иванова Г.И. О природе функциональных групп, реагирующих с гистона-ми, в препаратах 1Га,к-активируемой аденозинтрифосфатазы // Цитология. 1974. Т.16, № 2. С.183-186.-

■ ■ 17. Парфенова Е.В., Писарева Л.Н, Некоторые свойства препаратов На,к-АТФазы, обработанных разбавленным ацетоном // Цитология. 1974. Т.16, И 4. С.470-475.

18. Писарева Л.Н., Иванова Г.И. Влияние обработки ультразвуком на свойства препаратов Яа+,к+-АТФ-нзы из коры почек ■ морской свинки // Цитология. 1974. Т.16, Л 5. С.604-609,

•19. Парфенова Е.В., Писарева Л.Н. Влияние гистонов на К-зависимую фосфатазную активность препаратов На,К-АТФазы из коры почек морской свинки-// Цитология. 1974. Т.16, № 12. С. 1493-1498. .' •

20. Парфенова Е.В., Писарева Л.Н. Некоторые свойства

препаратов Яа+,К'+-АТФазы, обработанных дезоксихолатом // Цитология'. 1975. Т\17, № 5. С.539-544.

21. Pisarevci L.H., Parf^enova K.V. The mechanism of Па.К-ЛТРасе activity ohangee by polycations // Abstr. of 5-th Int. Biophyn. Congr. Copenhagen, 1975. P.43.

22. Писарева Л.Н. Влияние некоторых органических оснований на активность мембранных препаратов На,К-АТФазы // Цитология. 1976. Т.18, № 11. С.1403-1405.

23. Писарева Л.Н., -Иванова Г.И. Влияние мочевины на свойства мембранных препаратов Иа,К-АТФазы // Цитология. 1977: Т.19, № 3."С.378-381.

24. Pisarevä L.H., Samoilova К.A. The effeot of- ultraviolet irradiation on the Iia+,K4'-ATi,aBe activity // Abstr. VI UV-Kolloquium "UV Strahlen in Biologic and Medicine" // KihlungGborn DDR, 1977. '

■ 25. Писарева Л.Н. Г1а,К-АТСаза из коры почек морской свинки // Сб. Транспортные аденозинтрифосфатазы. (Современные методы исследования). 1977. Изд.М1У. С.26-28.

26. Писарева Л.Н. Итоги работы по очистке На,к,-АТФазы // Сб. Транспортные оденозинтрифосфатазы. (Современные методы исследования). 1977. Изд.МГУ. С.51-53.

27. Писарева Л.Н. Действие УФ излучения на активность препаратов На,К-АТСазы из почек морской свинки // фотобиоло- ' гия живой клетки. Л., Наука, 1979. С.61-63.

28. Скворцевич Е.Г., Пантелеева Н.С., Писарева Л.Н., Василенко Т.Ф. Влияние детергентов на *®0-обмен, катализируемый Яа.к-АТСазои' // Тез. докл. Всесоюз. симп. "Транспортные АТСезы". Тбилиси, 1978. С.48.

29. Василенко Т.Ф., Писарева Л.Н., Скворцевич Е.Г. Влияние поверхностно-активных веществ на тта.к-АТФазу из почек морской свинки // Цитология. 1980. Т.22, №1. С.44-51.

30. Глушанкова М.А., Иванова Г.И., Пасынкова P.A., Писарева Л.Н., Правдина К.И., Схолль Е.Д. Исследование корреляций между уровнями теплоустойчивости ферментов травяной лягушки // Цитология. 1981. Т.23, JS 7. С.797-802.

31. Глушанкова H.A., Писарева Л.Н., Схолль Е.Д. Зависимость мегду степенью корреляции теплоустойчивости и функ- . циональной йзаимосвязыо отдельных ферментов травяной лягушки

// Тез. докл. У1 конф. биохимиков прибалтийских республик, Белорусской ССР и Ленинграда. Рига, 1981.' С.219-220.

32. SkulBkii I.А., Kreetlnskaya T.V., Pisareva L.N., Baklanova S.M., Saulus A.A. Importance of oeil integrity for Li+-Ha* isomorphism in the aotioation of Ha++K+-ATPase // Gen. Physiol., Biophys. 1982. Vol.1, Ho 1. P.37-42.

33. Скульский И.А., Крестинская T.B., Писарева Л.Н., Бакланова С.Н., Солюс A.A. Влияние структурной сохранности препаратов На.К-АТЙазы на способность лития замещать натрий в активации фермента // Цитология. '1982. Т.24, 'Ii 1. С.95-98.

34..Василенко Т.Ф., Писарева Л.Н., Скворцевич Е.Г. Влияние pH на АТФазную активность и ^0-обмен, катализируемые мембранными препаратами На.К-АТФазы из почек морской свинки // Цитология. 1982. Т.24, Ü 4. С. 492-496.

35. Глушанкова М.А., Иванова Г.И., Писарева Л.Н. Связь мевду теплоустойчивостью различных аденозинтрифосфатазi их физиологической функцией и теплоустойчивостью вида // Тезисы У1 Всесоюз. конф. по экологической физиологии-. Сыктывкар, .1982. С.77. -

.. 36. Писарева Л.Н.,'Глушанкова М.А., Иванова Г.И. Сравнение теплоустойчивости АТФ-гцдролизугощих ферментов у двух ввдов лягушек // Цитология. 1983. Т.25, JS 2. С.210-213.

-37. Скульский И.А., Крестинская Т.В., Писарева Л.Н., • Малов A.M., Солюс A.A. Влияние .нарушений мембранной структуры на.ионную избирательность На+-связывающих участков уаба-ин-чувствительной АТФавы.// Тез. Ш Советско-швейцарского сими. "Биологические мембраны. Структура и функции". Ташкент, 1983. С.143.

. ЗЙ. Скульский И.А., Крестинская Т.В.,. Малов A.M., .Писарева Л.Н., Солюс A.A. Влияние пропранолола на ионную избирательность На+-связывающего центра (На+-К+)-АТСезы нейронов моллюска Pi anorbia oorneua У/ Цитология. 1984. T.26, № 2. С.203-208. .

• 39. Писарева Л.Н., Глушанкова U.A., Иванова Г.И. Изучение активности и теплоустойчивости некоторых ферментов энергообеспечения травяной лягушки // Цитология. 1985. Т.27, JS 2. С. 230-232. . : .

40. Писарева Л.Н., Иванова Г.И., Василенко Т.Ф. Завися-

мость ферментативной активности На,К-А№аы от поверхностных свойств и заряда взаимодействующих с клеточной мембраной веществ // Цитология. 1986. Т.28, № 2. С.181-185.

41. Писарева Л.Н., Глушанкова М.А,, Иванова Г.И. Исследование свойств ферментов энергообеспечения травяной лягушки при разных физиологических состояниях организма.I.Активность аденозинтрифосфатаз и сукцинатдегидрогеназы // Цитология.

1986. Т.28, Я 4. С.418-421. .

42. Глушанкова М.А.,, Иванова Г,И., Писарева Л.Н. Исследование свойств ферментов энергообеспечения травяной лягушки ' при разных физиологических состояниях организма. П.Изменение теплоустойчивости аденозинтрифосфатаз и сукцинатдегидрогеназы // Цитология. 1986. Г.28, № 5. С.'524-529.

43. Глушанкова М.А.,| Иванова Г.И., Писарева Л.Н. Исследование корреляций индивидуальных уровней активности и теплоустойчивости ферментов энергообеспечения озерной лягушки . // Цитология. 1987. Т.29, № 1. С.108-112. .

44. Писарева Л.Н., Глушанкова М.А., Иванова Г.И. Изменение свойств ферментов энергообеспечения озерных лягушек в результате теплового шока // Цитология. 1988. Т.ЗО, № 1. . С.92-96.

45. Писарева Л.Н., Скульский И.А., Крестинская Т.В. Влияние натрия, лития и амилорида на Независимую фосфатаз-ную активность мембранных препаратов НаД-АТ&азы // Цитология. 1989. Т.31, № 2. С.234-237.--

46. Писарева Л.Н.- Исследование характера изменения активности На.к-АТЗазы под влиянием температуры // Тез. докл. ХП Всесоюз. совещания по транспортным АТФазам. Иркутск,

1987. С.15.

47. Писарева Л.Н., Крестинская Т.В., Скульский И.А. Низкое сродство м к Ка+-активируемым участкам уабаин-чувст-вительной АТФазы является артефактом // Дитология. 1990. Т.82, * 9. С.946-947., .......

48. Писарева Л.Н. Факторы, определяющие функциональную активность На.к-АТОазы // Цитология. 19911 Т.ЗЗ, № 11.

•С.26-31. '