Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Na, K-атфаза человека. Семейство генов каталитической субъединицы

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Na, K-атфаза человека. Семейство генов каталитической субъединицы"



РЯ чУУь

" АКАДЕМИЯ НАУК СССР /¿Ю

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ АН СССР им. М. М. ШЕМЯКИНА

На правах рукописи

УДК 577.152.361*3:577.113.5 БРОУДЕ Наталья Евгеньевна

Ыа, К-АТФАЗА ЧЕЛОВЕКА. СЕМЕЙСТВО ГЕНОВ КАТАЛИТИЧЕСКОЙ СУБЪЕДИНИЦЫ

03.00.03 Молекулярная биология

Диссертация на соискание ученой степени доктора химических наук в форме научного доклада

МОСКВА—1989

Работа выполнена в лаборатории структуры и функций геноь человека Института биоорганической химии им. М. М. Шемякине АН СССР

(зав. лаб. — член-корр. АН СССР Е. Д. Свердлов)

Официальные оппоненты:

член-корр. АН СССР, доктор химических наук, профессор Э. Я■ Грен

член-корр. ВАСХНИЛ, доктор биологических наук, профессор К■ Г. Скрябин

доктор биологических наук Е. В. Ананьев Ведущая организация ВНИИ «Генетика»

Защита состоится «_»_1989 г. в_час на засе

дании Специализированного совета Д 002.35.01 по защите диссер таций на соискание ученой степени доктора химических наук прг Институте биоорганической химии им. М. М. Шемякина АН СССР по адресу: 117871 ГСП Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/1 (

Автореферат разослан «_

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических наук

1989 г.

. А. Несмеяно!

»

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. Настоящая работа посвящена ¡труктурно-функциональному исследованию генов каталитический субъединицы Ыа.К-АТФазы человека . Ввиду отсутствия казне- либо- данных на этот счет предметом исследования явилась ак собственно структура геномных последовательностей, так [ характеристики их функциональной активности, а также не-»торые аспекты эволюции генов каталитической субьединицы 1а,К-АТ<Хазы. •

Исследование в целом представляет собой обобщение одно-•о из этапов комплексного изучения структуры и функций ка-■ион-транспортирующих мембранных систем,проводимого в инс-■итуте биоорганической химии АН СССР. В рамках этой работы >анее были клонированы гены и определена первичная структу-ia alpha- и beta-субьединиц На,К-АТФазы из почек свиньи. На »сновании данных по аминокислотной последовательности и дан-[ых- по ограниченному протеолизу мембранно-связанного фер-¡ента была предложена экспериментально обоснованная модель >асположения Na,К-ATФазы в мембране.

В. связи с задачами настоящей работы фрагменты гена tlpha-субъединицы Ыа.К-АТОазы свиньи были использованы для гаиска гомологичных последовательностей в геноме человека, [ля решения поставленных в работе задач были использованы 'радиционные методы молекулярного клонирования, рестриктно-'о анализа фрагментов ДНК, секвенирования и гибридизацион-:ого анализа, а также методы сравнительного компьютерного лалиаа генетических текстов: аминокислотных и нуклеотидных :оследовательностей соответствующих генов.

Основные этапы работы логически и исторически можно ;редставить в следующей последовательности:

- поиск и структурный анализ фрагментов генома челове-н, гомологичных' гену alpha-субъединицы Na, К-АТФазы;

тот этап включает создание геномных библиотек, выделение :з них искомых последовательностей, их рестрикционный ана-из, выявление перекрывающихся последовательностей и, нако-ец, анализ первичной структуры; сопоставление найденных уклеотидных последовательностей с обнаруженными ранее и звестными из литературы.

- анализ функциональной роли клонированных генов: этот тап включает аналитическое исследование первичной структу-

I-T

ры последовательностей генома с точки зрения обнаружения е них регуляторных последовательностей, свидетельствующих с функциональной роли или, наоборот, элементов, свидетельствующих о неактивности данного гена: сбое рамки считывания, наличии стоп-кодонов и т. д. Этот этап имеет чисто теоретический характер и правильность его предварительных выводоь может быть проверена экспериментально с помощью гибридиза-ционных тестов. Обнаружение транскриптов изучаемого гена I популяции мРНК прямо свидетельствует о его функционально{ активности; сопоставление уровня экспрессии изучаемого гене в различных тканях или в одной ткани на разных стадиях онтогенеза позволяет сделать выводы о характере экспрессю изучаемого гена. .

— наконец, последний этап исследований представляет собо! анализ эволюционных отношений клонированных геномных последовательностей и их белковых продуктов. На этом этапе проведен сравнительный математический анализ девяти известны; белков птиц, рыб и млекопитающих, гомологичных а1р1та-субъ-единице Ыа,К-АТФазы. Проведено сравнение как целых молеку; белка, так и фрагментов белка, соответствующих отдельны! экзонам.

• АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Ма,К-АТФаза представляет собой цитоплазматический мембранный фермент,обнаруженный практически во всех изученных животных клетках. Работа. N3,К-АТФазы заключается в использовании энергии АТФ для выброса ионов Иа из клетки и одновременного и координированного закачивания ионов К в клетку. В результате создаются электрохимический и осмотический градиенты, необходимые для протекания многих физиологических процессов.

В связи с важностью физиологических функций, обеспечиваемых Иа.К-АТФазой, этот фермент в течение многих лет бы объектом пристального исследования. В результате биохими ческих и кинетических исследований были сформулированы ос новные представления о сопряжении конформационных изменени фермента с катион-транспортирующими функциями. Однако пря мых доказательств на молекулярном уровне связи между струк турными изменениями белка и транспортом ионов получено н

было. Одним из основных факторов, обусловивших разрыв между структурными и функциональными исследованиями,явилось отсутствие информации о структуре белка и о его расположении в мембране.

Определение первичной структуры генов alpha- и beta-субъвдиниц Na.K-АТФазы ряда рыб, птиц и млекопитающих, в том числе и генов обеих субъединиц Na.K-АТФазы почек свиньи, выполненное в нашем институте, ликвидировало этот разрыв и создало основу для следующего этапа исследований.

Выбор в качестве объекта исследования генов Na,К-AT Фазы человека объясняется несколькими причинами. Во-первых, исследования генов Na,К-ATФазы человека представляют интерес с точки зрения фундаментальной науки как пример модели слояноорганизованных эукариотических генов. Во-вторых, эти исследования могут иметь и практический выход в медицину, поскольку такие формы патологии, как нарушения водно-солевого балланса, пароксизмальные состояния и др. могут быть связаны с нарушениями работы Na.K-АТФазы. Особый интерес исследования Na.K-АТФазы человека вызывают и потому, что этот фермент является единственной известной мишенью действия сердечных гликозидов. Поэтому выяснение механизма их действия необходимо для лечения ряда нарушений сердечной мышцы.

ОСНОВНЫЕ ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящего исследования явилось изучение структуры генов каталитической субъединицы Na,К-АТФазы в геноме человека. Исследование геномных последовательностей вслед за предварительным анализом кДНК является традиционным для генов эукариотических белков. Действительно, сопоставление структуры хромосомных генов со строением матричных РНК часто дает много новой информации о механизмах транскрипции и позволяет обьяснить причины многообразия форм соответствующих структурных генов и белков. Кроме того, изучение экзон-интронного строения генов мояет выявить определенные закономерности в топологии белка.

В соответствии с поставленными целями конкретные задачи исследования состояли в следующем:

— выделить и проанализировать геномные последовательности гомологичные гену alpha-субъединицы Na, К-АТФазы.

— исследовать зкзон-интронную структуру выделенного гена или генов и.сопоставить ее с. предполагаемой моделью трансмембранной организации белка.

исследовать функциональную активность найденных ге нов,используя для анализа методы гибридизационного. анализ. РНК с ген-специфическими зондами.

— провести сравнительный анализ всех известных белков структур, гомологичных ; alpha-субъединице Na, К-АТФазы для построения эволюционного дерева белков этого семейства.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА' И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ. В результате анализа фрагментов генома человека, гомологичных гену alpha-субъединицы Na,K-A75a3bi, обнаружено семейство родственных последовательностей, содержащее не менее пяти различных структур. Анализ их первичной структуры позволил идентифицировать часть генов, которые кодируют известные белковые изоформы каталитической субъединицы, но кроме тог позволил также предсказать существование одной или несколь ких новых изоформ. Изучение интрон-зкзонного строения гено найденного семейства приводит к выводу, что они построены по.единому принципу. Это в свою очередь может свидетельствовать об их происхождении от общего предшественника.

В серии нескольких перекрывающихся клонов выделен.ген, кодирующий неизвестную ранее форму (alphalllj каталитической субъединицы Na,К-АТФазы. Ген содержит 23 экзона и 2 интрона,суммарно охватывающих около 35 тыс. п. о. Сопоставле ние экзон-интронного строения гена с предложенной, модель трансмембранной организации белка . выявляет определении уровень корреляции с доменным строением белка.

Изучение экспрессии разных изоформ в тканях человека показало, что они экспрессируются тканеспецифично. Уровен экспрессии разных изоформ alpha- субъединицы меняется в хо де индивидуального развития.

Сравнительный анализ белков, родственных alpha-субъединице Na,К-АТФазы, позволил построить эволюционное дерев этого семейства. Результаты свидетельствуют об очень древ

нем происхождении изоформ каталитической субъединицы и об их эволюционной устойчивости.

.Клонированные в работе последовательности, представля-ощие собой ген-специфические зонды, используются в настоя-дее время для решения многих вопросов, имеющих как фундаментальное, так и прикладное значение. В частности, эни применяются для локализации соответствующих генов на хромосомах (Институт цитологии СО АН СССР), для исследова-шя популяционного и внутрисемейного полиморфизма генов Ма, (-АТФазы (НИИ мозга АМН СССР), для изучения экспрессии изо-(юрм каталитической субьединицы в культурах клеток лимфоцитов в связи с изменением ионных потоков (Институт цитологии Ш СССР, Ленинград) и для других целей.

Таким образом, результаты настоящей работы позволяют ¡формулировать новые представления о Иа,К-насосе как набо->е изоферментов с одинаковыми катион-транспортирующими ¡войствами, но различающимся по другим характеристикам, в гастности сродству к эндогенным ингибиторам и лигандам, функционирующим во вне- и внутриклеточном пространстве. Эти >азличия могут быть основой многообразия функций На,К-АТФа-1Ы в столь различающихся типах клеток, как клетки мозга, гачек, легких и т. д. В то же время проделанная работа отк->ыла перспективы для исследования механизмов регуляции экс-[рессии различных изоформ Ыа,К-АТФазы, что необходимо для [счерпывающего понимания функционирования Ыа, К-насоса в жи-ютной клетке, в том числе и для рационального применения нгибиторов Ыа,К-АТФазы, сердечных гликозидов.

Основные результаты, изложенные в диссертации и опубликованные в 24 статьях, получены в соавторстве с сотрудника-и ИБХ им. М. М. № мякина АН СССР Е А. Овчинниковым, Е. Д. Сверд-:овым, Г. С. Монастырской, Е Е Модяновым, К. Е. Петрухи-ым, С. Г. Арсеняном, А.. К Гришиным, М. Б. Костиной, . С.. Акопьянц, Ю. А. Ушкаревым, В. Е. Свердловым, И. Е. Дулубо-ой, А. М. Межовым. В работе использованы олигонуклеотиды, интезированные В. М. Ростэлшовым, И. Е Черновым и Т. Л Ажики-ой.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы исследования были доложены на Всесоюзных и международных конференциях и симпозиумах, в том числе: 4 и 5 Советско-швейцарских симпозиумах "Структура и функции биологических мембран (Лозанна, март 1986, Рига, апрель 1988), 7 и 8 германо-советских симпозиумах "Структура и функции эукариотического генома" (Гейдельберг, март 1987, Иркутск, июнь 1989), Советско-французском симпозиуме "Молекулярная биология белков и нуклеиновых кислот" (Москва, июнь 1986), 5 международной конференции "Na, К-АТФаза" (Дания, июнь 1987) и др.

ГЛАВА 1. ОБНАРУЖЕНИЕ И АНАЛИЗ СЕМЕЙСТВА ГЕНОВ, РОДСТВЕННЫХ ГЕНУ alpha-СУБЬЕДИНИЦЫ Na, К-ATФазы.

На первом этапе работы по молекулярному клонированию генов каталитической субьединицы Na,К-ATФазы в литературе было широко распространено мнение об уникальности этого гена. Это мнение базировалось на данных геномных блотов, где для нескольких рестриктаз получались достаточно простые картины. Первые работы по клонированию структурных генов alpha-субьединиц Na.K-АТФазы млекопитающих были проведены на материале библиотек кДНК из почек, ткани, содержащей наибольшее количество АТФазы. В обоих случаях (почки овцы и почки свиньи) были найдены уникальные последовательности.

С другой стороны биохимические исследования говорили о наличии по крайней мере двух изоформ каталитической субьединицы ШД-АТФазы у млекопитающих и ракообразных. Две формы alpha-субъединицы, названные alpha- и alpha+,(no новой номенклатуре alphal и alphall) различались по подвижности при электрофорезе и по чувствительности к уабаину. Обе формы имели также различные по структуре N-концевые фрагменты. Различия, по-видимому, затрагивали и другие части полипептидной цепи,что позволило выделить специфические к каждой изоформе антитела. Однако основные причины различий оставались неясны. Их могло быть несколько: наличие двух и более генов для alpha-субъединицы, альтернативный сплайсинг продукта единственного гена, различия в пост-трансляционной модификации уникального белкового продукта.

Для поиска хромосомных фрагментов, содержащих гены

alpha-субъединицы Na.K-АТФазы, были созданы геномные библиотеки ДНК, выделенной из тканей человека. ДНК подвергали случайному расщеплению с целью получения равномерно представленных и перекрывающихся фрагментов. Последние, размером 10-20 тыс. п. о., выделяли центрифугированием в градиенте концентрации сахарозы и лигировали с плечами фага EMBL3. Дотированную смесь упаковывали в фаговые частицы in vitro и высевали на клетки LE392 или DP50. Далее проводили скрининг полученных библиотек с помощью гибридизации с радиоактивно-меченными зондами. Предполагая высокий уровень гомологии для alpha-субьединиц ATФаз различных млекопитающих, в качестве гибридизационных проб использовали фрагменты структурного гена alpha-субъединицы Иа.К-АТФазы почек свиньи (рис. 1).

При скринировании амплифицированной библиотеки плацентарной ДНК человека (1,5 млн. клонов) было получено 32 положительных сигнала, из которых 10 оказались независимыми. ДЛя очистки до гомогенного состояния фагов, дающих положительную гибридизацию, проводили несколько стандартных циклов (гибридизацию, выкол нужной зоны агара, злюцюо фагов из агара, рассев с меньшей плотностью, снятие реплик, повторную гибридизацию и т. д.). Фаговую ДНК из индивидуальных клонов выделяли по модифицированному методу Ямамото. Для характеризации выделенных геномных фрагментов проводили их рестрикционный анализ. Для этого использовали эндонуклеазы рестрикции BamHI, EcoRI, Sali, не имеющие сайтов узнавания в плечах вектора EMBL3. Кроме того использовали рестриктазу HindiII, имеющую один сайт узнавания в правом плече вектора. Для построения рестриктных карт обычно применяли метод яеполного расщепления фрагментов, меченных по одному из cos -концов.

В результате первого скрининга геномной библиотеки с юмощью М-зонда было найдено 10 положительных клонов. Все эни имели различные рестриктные карты. На рис.2 приведены эестриктные карты пяти из них. Наличие геномных фрагментов, гомологичных одной и той же структуре кДНК alpha-субъедини-Na.K-АТФвзы свиньи, но имеющих разные рестриктные карты,

500 1000 1500 2000 2500 3000 т-1-1-1-1"

V и ПГ УППГУШ ( ((У(( УГ

_рВ 2801

рВ159 ™

1 рВ29

Рис.1 фрагменты кДНК а1р1та-субъединицы Ыа.К-АТФазы свиньи, использованные в качестве гибри-дизационных проб при скрининге геномных библиотек. Координаты даны в соответствии с кДНК а1рЬа-субъединицы Ма,К-АТ$азы почек свиньи.

^ . ? „ Г-г-

ЛЫКаЯЗ-2

ЛЛЛЛЛ^-:-* . -^лА^

л4лл1___х_22_5_!_н у н н 5. н

ллл/1—т: 1 „ 1-Г.--я-' Г ,,.-1 „ 1 М/У Ш«Р15-1

. М Е Н Ев ЕН ЕН И в 5 И

-1Л.11, 11 ,., 1 м ' , '\ЛЛ/ АЫКага^б

к4?? ЕН Е Е ЕНВНЕ8 В Н Н 3 1!

МЦ ,, " м 1 М '. '»'■,', М/У АМкТад*

Рис.2 Рестриктные карты пяти рекомбинантных клонов, выделенных из геномного банка при гибридизации с зондом рВ2801. Здесь и далее буквами обозначены ре-стриктазы: В-ВашН1, Е-Есо1?1, Н-Н1гка1 II, Б-БаП. Цифрами обозначены размеры фрагментов в тыс. пар оснований. Ломаная линия - плечи фага А.

можно было объяснить нееколькими причинами. Во-первых, учитывая сравнительно малый размер вставок в рекомбинантных клонах (15-18 тыс.п.о.) и относительно большой размер зонда (1 тыс. п. о.), можно предполагать, что часть клонов содержит перекрывающиеся или неперекрывающиеся последовательности, принадлежащие одному гену. При первом скрининге из 10 положительных клонов было найдено лишь два перекрывающихся (\NKdLR3-2 иЖой?10-3), для которых впоследствии (см. ниже) было показано, что они содержат фрагменты одного и того же гена Второй причиной различий рестриктных карт клонов, гибридизующихся с одним и тем же зондом, может быть наличие семейства близкородственных генов и/или псевдогенов.

Для проверки этого предположения было проведено определение первичной структуры отдельных субфрагментов в найденных положительных клонах (рис.3). Для определения нуклео-тидной последовательности геномные вставки выделяли из вектора с помощью редкощепящих рестриктаз, подвергали фрагментации ультразвуком или обрабатывали мелкощепящими рестриктазами, и полученные смеси клонировали в векторы на основе фага М13. Первичную структуру определяли с помощью модифицированного метода Сэнгера.

Анализ первичных структур пяти клонов показал наличие группы родственных последовательностей (рис.3 и табл.1), уровень гомологии которых в экзонных частях составляет 76-84%. Трансляция этих нуклеотидных последовательностей приводит к аминокислотным структурам также с высокой степенью гомологии (табл.2). Кроме того в ряде случаев в разных генах совпадает положение интронов. Таким образом, наши результаты свидетельствуют о существовании в геноме человека семейства, содержащего по крайней мере пять генов/или псевдогенов, гомологичных гену каталитической субъединицы Na, К-АТФазы.

Проанализированная область включает три экзона (245-334, 335-401 и 401-437) и четыре ограничивающих их ин-трона. Определение местоположения интронов не вызывает сомнений, во-первых, из-за наличия характерных по первичной структуре сплайс-сайтов и, во-вторых, благодаря возможности

m»s»j.i

XNU1S-I

INCaU-lt

Ul«Tir-4

..Introït l(1IS>.cta«cccctct{gcCtgcagCCACCGCTCCCC£CCTCGTCGTCCCCACCCGCCACCGCACTGTCATCGGCCGTATCCCCACCC

...latron........git gcccciccatgt t gcif CCACTGCCAGGGCCATTGTCATTCCCACACCACACCGGACCGTGATCGCCCGCATACCTACTC

...Intron.........tccctccccttct ItttaagGACCCCACGTCCTATTGTTCTCTACACTCGCCATCGCACT.TGATCGGAACAATTGCCACAC

UIaU-2

ШаЭД.2 m»>ts.i »«iaRD-l» aKtaTK-4

TCGCATCAGGGCTGCAGGTCCCCAAGACCCCCATCGCCATCCACATTGAGCACTTCATCCAGCTCATCACCGGCGTGGCTGTCTTCCTGGGTGTCTCCTT

TCCCCrCAGGCCTGGAGGTTGGCCGCACACCCATAiiCAATCCACATTCAACACTTCATCCACCTCATCACAGGCGTCCCTCTATTCCTGCGCGTCTCCTT TÎGCTTCTCCGCTGGAAGGAGGCCAGACCCCCATTCCTCCAGAAATTCAACATTTTATCCACATCATCACGGGTGTCCCTGTGTTCCÏGGCTGTGTCTTT

UKag]-2

UKaSH.J

»««45-1

UUC«IU>-lt

»ЯГаТ«-4

UKall-2

»«oS«.!

lMCo>IS-l

UIOD-lt

UKaTV-4

CTTCATCCTCTCCCTCATTCTCCGATACACCTCGCTrCAGGCTGTCATCTTCCTCATCGCCAÎCATCGTCCCCAATGTCCCAGAGCCTCTGCTCGCCACT

CTICGTCCTCTCCCTCATCCTCGGCTACACCTCGCTCGAGCCAGTCATCrTCCTCATCGGCATCATACTGGCCAACCTGCCTGAGGGCCTTCrGGCCACT CTrCATCCTTTCICTCATnCTTGAGTACACCTCCCTTCACGCTCTCATCTTCCTCATCCGTATCATCCTAGCCAATGTGCCCGAAGGTTTGCIGGCCACT

1017 1011 CTCACTgtaaggccaggctcctgggt. ..intron 1.......ctgcCttgctcgtcctccagGTGTGTCÎCACCGTCACCCCCAACCGCATCGCCCCG

..........................— Intron.........gtccttccc tctcctgctagGTGACCCTGTCGCTGACAGCAAAACGGATGGCCAAG

----------------------------------------------------CTGTCCCTGACAGCCAAGCGCCTCCCCAGT

CTCACTgtgagtgggtcaggctgagg... intron (170) .,.. ttctcctctt tctc taccagGTGTGCCTGACCCTGACAGCCAAGCGCATGCCACGG CTCACGgtaagaggcaggtgatggtc...intron......

AJdaKl-2

HKInSW.l i.vtexis-i

lSKaKO-16 ANCaTN.4

UKaU-2

A«oS»J.!

UUoKIS-l

UKoRD-lt

lKtaTK-4

AAGAACTGCCTGGTCAAGAACCTGGAGGCTGTAGACACCCTGGGCTCCACCTCCACCATCTCCTCAGATAAGACAGGGACCCTCACTCAGAACCGCATCA AAGAACTGCCTGGTCAACAACCTGGAGGCTCTGGAGACCCCTGGCTCCACCTCCATCATCTGCTCCCACAAGACTGGGACACTCACCCAGAACAGGATGA AAGAACTGCGTGGTCAAGAACCTCCAGCCGGTCGACACATTGCCCTCCACTTCCCTCATCTCCTCCGACAACACACCGACTCTCACTCAGAACCGCATGA AAGAACTGCCÏGGTGAAGAACCTGCAGCCCGTGCAGACGCTGGCCTCCACGTCCACCATCTGCTCGGACAAGACGGGCACCCTCACCCAGAACCGCATGA

1216

CACTCGCCCACATGTCGTTTGACAACCAGATCCACGAGGCTGACACCACTGAGGACCAGTCACgtgagcgcaggccccgggta. ..incron J(74).

CAGTGCCCCATCTGTGCTTCGACAATCAGATC-------------------------------------------------------------------

CTGTGTCCCAT-----—--------------------------—------—-----......---—----------------------------

CCGTCCCCCACATGTCGTTTGACAACCAAATCCATGACGCTGACACCACCGAAGATCAGTCTGgtgattgggtgetccagcgg... intron (123).

, .ctcacacatgcctcccccagCGACCTCATTTGACAAGACTTCGCACACCTGGCTCGCCCTCTCTCACATCGCTGGGCTCTCCAATCGCC

lMoSMJ.2 »NIt.il S-1 XMa«D-16 ASIaTK-4

иоши-г

ANXoSHS.2

UltatlS-l

A.NKaftD-16

INKaTV-4

.tccCcctcatttcctcccagGGGCCACTTTTCACAAACGATCCCCTACCTGGACGGCCCTGTCTCGAATTGCTCGTCTCTGCAACCGCG ---------------------------------------------------------CCTCTGTCCAGAATTGCAGGTCTTTGTAACAGCG

ista

CTGTCTTCAAGCGTGGTCAGGACAACATCCCTGTGCTCAAGg tgggttagctacIggccte.........Intron 4 (»4).

CCGTCTTCAAGGCAGCACACGAGAACATCTCCGTGTCTAACgtagggggtcaggacacaca.........Intron..

CACTGTTTCACGCTAACCACCAAAACCTACCTATTCTTAAGgtatgctcaagagttaaeta.........Intron.

Рис. 3 Нуклеотидная последовательность фрагментов пяти генов (см. рис. 2). Представлена область экзонов 749-1328 (в координатах кДНК оС-субъединицы свиньи). Цифры в скобках обозначают размер завершенных интронов в п.о., штриховая линия - структура не определена.

AMoHJ-2

- II -

сравнения структуры гена со структурой кДНК каталитической субъединицы Ыа.К-АТФазы свиньи. Как уже упоминалось выше, положение интронов в различных генах остается постоянным, однако структура их отличается высокой вариабельностью, что характерно для большинства интронов.

Подробный анализ структуры экзонов будет приведен ниже (см. стр.ЗС0. Здесь же интересно остановиться на экзоне 335-401 (в целой молекуле 9-й), который является одним из наиболее консервативных во всей молекуле. Этот экзон кодирует область активного центра и включает остаток Дер-369, образующий фосфорилированный продукт в ходе ферментативной реакции. Интересно отметить, что область вокруг Дер-369 остается консервативной в Е1Е2-АТФазах с другой специфичностью, например в Са-АТФазе саркоплазматического ретикулу-ма или Н,К-АТФазе слизистой желудка.

Вслед за нами группа американских исследователей обнаружила в геноме человека 4 различных последовательности, гомологичных гену а1р1та-субъединицы Ыа,К-АТФазы (БГшП М. 1лпдге1 ,1.1987). Сопоставление рестриктных карт и частичных первичных структур позволяет считать, что лишь в двух случаях мы имеем дело с одинаковыми генами. В остальных случаях клонированы другие гены, имеющие различающиеся рестрикт-ные карты. Таким образом очевидно, что в геноме человека существует семейство генов а1рЬа-субъединицы Ыа,К-АТФазы, содержащее не менее 7 различных последовательностей. Для эпределения конечного числа родственных генов в обнаружении семействе необходимо проведение дополнительных скринингов геномных банков и построение рестриктных карт. Это поможет выявить перекрывающиеся клоны, составить карты более фотяженных последовательностей и в конечном итоге даст юзможность охарактеризовать локус или локусы генов 1а,К-АТФазы. Эта работа проводится в настоящее время.

Обнаружение семейства генов, гомологичных гену 11р11а-субъединицы №,К-АТФазы, поставило вопрос об их функциональной активности. К решению этого вопроса мы подошли, юпользуя два различных метода. Во-первых, был сконструиро-ан и проанализирован банк кДНК из мозга человека. Этот

- 12 -

подход позволяет, в случае, если ген транскрибируется, не только убедиться в его функциональной активности, но и получить в клонированном виде структурный ген или его фрагменты. Во-вторых, был использован традиционный и более простой метод гибридизации мРНК с ген-специфическими зондами. Этот метод является лишь аналитическим, однако позволяет качественно и количественно оценить уровень транскрипции штересующего нас гена в данной популяции мРНК. Результаты этой части работы изложены в главе 4.

Для получения банка кДНК мозговую poly(A+)-PHK в смеси с oligo(dT)-затравкой использовали в реакции синтеза первой цепи кДНК с помощью обратной транскриптазы . Синтез второй цепи проводили по методу Габлер и Хоффмана с использованием РНКазы H и ДНК-полимеразы I. Полученную двухцепочечную ДНК метилировали EcoRI-метилазой, лигировали с EcoRI-линкерами, обрабатывали EcoRI-рестриктазой. Всю смесь пропускали через колонку с биогелем А-50 для отделения низкомолекулярных фрагментов. Подготовленные фрагменты ДНК лигировали в экви-молярных количествах с вектором gtlO, расщепленным эндонук-леазой EcoRI: Лигированную смесь высевали на селективный штамм Е.coli NM 514. Эффективность трансфекции составляла 10 клонов на 1 мкг вставки. Таким образом была получена клонотекг содержащая 2-l(f независимых клонов. Скрининг библиотеки кДНК проводили с помощью радиоактивно-меченных фрагментов кДНК alpha-субъединицы Na,К-ATФазы почек свиньи (см. рис 1). В результате скрининга было получено 69 положительных клонов, из них 49 - при гибридизации с зондом рВ29, 9 - с зондом рВ2801, 12 клонов гибридизовались и с рВ29, и с рВ2801. При гибридизации с N-концевым зондом рВ159 положительных клонов не было обнаружено. В связи с этим мы получили дополнительный кДНК-банк из мРНК мозга человека с одновременным использованием oligo(dT) и статистической затравки (random primer), кДНК в этом случае клонировали в pBR322. Цри скрининге этого банка (.5-10* клонов) зондом рВ159 были обнаружены 4 положительных клона, два из которых были охарактеризованы и оказались идентичными (клон рВ2301). На рис. 4 схематически представлены клоны, полу-

Таблица 1. Сопоставление нуклеотидных и аминокислотных после-ювательностей пяти генов из семейства генов каталитической суб-(вдиницы Ма,К-АТФазы (в сравнении со структурой генаШоО?3-2). [ифры в скобках обозначают число замен и длину фрагмента, соот-етственно.

Ген Нуклеотидные замены (%) Аминокислотные замены (%)

iNK«£W3.2 17.2(29/168) 12.7(7/55)

ANK«tR15-l 17. ОС 24/141) 15. 0(7/47)

ANKrfRD-16 16. 4(94/572) 8. 8(17/92)

ANKrfIW-4 24.2(83/343) 13.1(15/114)

Таблица 2. Аминокислотные последовательности, соответствующе генам, представленным на рис. 3. Аминокислоты пронумерованы в соответствии со структурой alpha-субъединицы Na,К-ATФазы почек св!шьи. Стрелки указывают положение интронов. Замены аминокислот в сравнении с геномЛЖ«И?3-2 обведены. Пунктир -структура не определена.

2S5*

VV

/ TGDRTVM3RIATLASGLE VHfPIAI

ANIUR3-2 ^TARGM XNKotSV3.2 XNKpIR15-1 , . «J XNKotRD-16uARG XNKAl.W-4 |TARG

XNIUR3-2 SVSFFl XNK«£SV3.2 - -XN1W?15-1 '--I ANK4?D-16 GVSFF'^LSLIlJ XNKJTW-4 GVSFF]

t TGDRTVM3RIATLASGLE VE R ГР1А i/SIEHFIQL

EIEHFIQL

\iIEHFl|miITSVAVFL

ITGVAVFL

IT6VAVFL

ANKJU?3-2 XNKjlSW3.2 XNKaR15-1 AN1W?D-16 XNKstJV-4 У

R<NC.

ILSLIL

VfTGDR IVM3RI ATLASGLEjSjGg]TP I A|

№MVLEAV IFLIGII VmPEGLLATVlMlTVTAKR№

-----WJSLTAKRV

-----^SLTAKRL|

Gi/HWLEAVIFLIGI IVANVPEGLLATVijVp JLT itLSLILE --------«"„.«.mr™ . »Tiri-I cr

VKNLEAVET L GSTS Г KRNCt VKNLEAVET F 3STSI S <NC V VKNLEAVET L 3STS VI R<NCLVKNLEAVETL3STSV

396 ¿r—, _

>NK»tR3-2 TEDQSGrSFDKBSHTV^l

ANK*SV3.2-----

ANK«iR15-l---i- - . . . . ^

XNK«tRD-16 TEDQSGMrDtfRfflrVfl XNKaTV-4

iГ tflEAVIFLIG11VANVPEGLLATVlf - -

' nn 395" ICSDKTGTLTQNRMTV i HИtfFDNQIHEADT ICSDKTGTLTQNRMTV A H.VFDNQ----

ICSDKTGTLTQNRMTV:H- -ICSDKTGTLTQNRMTV A HUtfFDNQIHEADT

IAGLCNRAVFKI

[AGLCNRAVF KAI [AGLCNRAVF3AI.

.jsvski

fPILjkl

рВ159

рВ2801

И о 2 9 с

¿2 &

? -

Е о

£§ X

I

го

СП Ю

g 5

Я -ч.

о о

11

рВ29 яри.

° Q 'к.

<х1

рз

£ о

С5

t^ m ш

gas

1,1 /VI ÍSJ

gt1210-

760

gt 18(32.

gtA03

2ЭЭ0

1900

gt 801

2160

pB13^—-

PB9l505___ 2305 pB1Ai5Ü3 2008

2380

pB-11

1640'

£

PB72650

28í0

lía. I

о ■ tn x

di 2

§8g S ais 8 2 В

«(Л^ ох I Z xw III i i и i

СО OI

Ю (М

даго-* сп (Чткс

рВ2301

§8ю SSggS S¡8

схЗ

-140

317

9t8021950 рВЮ

2285

3050

РВ62000" PB8íiZT

2665

~2Ы5

Рис. 4. Рестриктные картй структурных генов о- и allí•-изоформ каталитической субъединицы Ыа,к-АТФазы человека и схематическое представление рекомбинантных клонов, содержащих фрагменты соответствующих генов. Наверху приведены кДНК-зонды ( почки свиньи)/ использованные для скриннинга. Цифры обозначают координаты сайтов рестрикции или

г ЛЛг>тт1/ t

Я Т* U |/а^ТТЛПЛ wr

U «ГМОП Я TtT* С

- 15 -

ченные в результате скрининга двух клонотек кДНК из мозга человека.

Рестриктный анализ' положительных клонов, выделенных в результате первого скрининга, показал, что клоны распадаются на две группы. Первую группу составляют клоны, имеющие EcoRI-сайт в 3-концевой области структурного гена (клоны gtl210, gt403, gtl802, gt801), от них отличается клон gt802, не имеющий в соответствующей области EcoRI-сайта. При сопоставлении структуры найденных клонов со структурой. геномных последовательностей выяснилось, что первичная структура клонов первого типа (gtl210). соответствует структуре экзонных фрагментов reHaXNKoCTW-4, а клона gt802 структуре экзонов reHaxNK<*R3-2. Таким образом, эти результаты свидетельствуют о функциональной активности двух клонированных геномных последовательностей, поскольку их транскрипция показана по крайней мере в мозге человека..

► Параллельно с нами американская группа (J. Lingrel, университет Цинцинати) обнаружила в банке кДНК мозга крысы три различные формы кДНК alpha-субъединицы Na.K-АТФазы, обозначенные ими как alpha-, alpha*, alphalll (по новой номенкла-гуре alphal, alpha2, alpha3). Сопоставление с ними структуры клонированных нами генов показало, что ген NKoffW- 4 зоответствует alphal-форме, генШКои?3-2 - alpha3-форме, а reHXNKdRD-16 - alpha2 форме (табл. 3). Первичная структура клона XNK<*R15-1 оказалась идентичной структуре гена Н,К-АТФ азы слизистой желудка крысы, опубликованной к этому времени. ГенШ«*5\га. 2 не имеет пока аналогов и остается неиден-гифицированным. Таким образом, в мультигенном семействе alpha-субъединицы Na,K- АТФазы в настоящее время обнаружены гены alphal, alphalI и -alphalII-изоформ, ген Н,К-АТФазы и не-вдентифицированный ген (ANKotSV3.2), характеристики которого зейчас изучаются. Функциональная активность двух генов этого семейства в транскрипции доказана путем выделения струк-гурных генов alphal- и alphalП-изоформ из кДНК мозга чело-зека.

Возникает вопрос о причине отсутствия продуктов остальных генов в библиотеке кДНК, полученной из мозга человека.

- 16 -

Таблица 3. Семейство генов, гомологичных гену alpha-субъединицы Na,К-АТФазы.

обозначение идентификация источник выделения РНК

ген белка белка. ткани - человека ткани других млекопитающих

■XNKjIW-4 alpha (oíl) - клетки HeLa почки свиньи

(alphal) ~ мозг почки овцы

alpha+ (oQE) мозг крысы

>NK«*RD-16 + • ' — мозг крысы

(alpha2)

XNKü?3-2 alphalII + мозг мозг крысы

(alpha3)

XNKJSW3.2 alpha rp* - — —

XNIUR15-1 Н,К-АТССаза + - — желудок крысы

*alpha related protein

Особый интерес, вызывает продукт генаЖ<*И)-16, или alphall • -изоформа каталитической субъединицы, поскольку экспрессия аналогичного гена была обнаружена в мозге крысы (Shull,GLE, Greeb,J. .Lingrel,J. В. (1986). В связи с этим следует подчеркнуть, что библиотека кДНК была получена нами из мозга больного пожилого возраста, скончавшегося после продолжительного лечения, Дальнейшие эксперименты, как наши, так и других лабораторий, свидетельствуют, что экспрессия .различ-. ных форм каталитической субъединицы* Na,К-АТОазы меняется в ходе индивидуального развития. Наши данные показывают, что в препаратах мозга, имевшихся в нашем распоряжении, в большом количестве экспрессировались alphall и alphall1-изоформы Na.K-ATíasu (см. ниже стр.37). Кажется вероятным, что в наших препаратах alphalI-форма экспрессировалась либо в меньших количествах, либо не экспрессировалась вовсе. Косвенным подтверждением того, что экспрессия alphalI-формы уменьшается в ходе развития, являются результаты работы Фарш и Свиднер (Farshi,Sweadner,1987), в которой показано, что соотношение изоформ alphal/alphal I уменьшается при постнаталь-

- 17 -

ном развитии желудочков сердца крыс. В настоящий момент для исследования экспрессии а1р1та11 -формы каталитической субъединицы Ыа,К-АТФазы анализируется банк кДНК из эмбрионального мозга человека.

Обнаружение гена Н,К-АТФазы при гибридизации с зондом, специфичным к а1 р1та- субъединице ЫаД-АТФазы, не вызывает удивления, так как известно, что именно Н,К-АТФаза структурно наиболее близка к Ыа,К -АТФазе. В частности, антитела к этим двум белкам дают иммунологический перекрест. В работе, аналогичной нашей, американская группа использовала фрагменты кДНК а1р!та-субъединицы Иа,К-АТФазы почек овцы для поиска генов Н,К-АТФазы слизистой желудка крысы.

Неидентифицированный пока ген АМКойМЗ.2 очевидно также относится к семейству родственных генов и может кодировать неизвестную изоформу каталитической субъединицы Иа.К-АТФазы или другую ион-транспортирующую АТФазу с близкими свойствами или, наконец, белок с неизвестными функциями. Нельзя исключить также, что это может быть недавно возникший псевдо-ген.

Таким образом, в результате первого этапа работы в геноме человека обнаружено семейство генов, обладающих высокой степенью гомологии. Часть из них кодирует известные изоформы каталитической субъединицы Ыа.К-АТФазы, другие гены могут кодировать как новые формы а1р1та-субъединицы, так и другие АТФазы Е1Е2-типа, в частности, в этом семействе найден ген Н, К-АТФазы.

Применение методов молекулярного клонирования и секве-нирования генов для определения первичной структуры белков позволило установить широкую распространенность явления "семейственности" генов, приводящего к тому, что многие эу-кариотические белки существуют в клетке как совокупность близких по структуре изоформ. Среди таких белков оказались и многие мембранные белки: ацетилхолиновый рецептор, рецептор асиалогликопротеинов, рецептор трансферрина и многие другие, для которых раньше не было известно существование изоформ. Для ряда генов показан тканеспецифический ха-

- IB -

рактер экспрессии. Наиболее вероятным объяснением эволюционной сохранности изоформ является предположение о том, что их множественность является способом адаптации эукариоти-ческой клетки к варьирующим условиям существования на разных стадиях онтогенеза. Наличие нескольких близких по структуре и функциям белков делает клетку более пластичной в меняющихся условиях окружающей среды, а потому и более устойчивой. Другими словами, многообразие функциональных возможностей эукариотической клетки отражает многообразие белковых форм и само по себе является фактором для эволюционного закрепления этого многообразия.

ГЛАВА 2. СТРУКТУРА ГЕНА alphalII-изоформы КАТАЛИТИЧЕСКОЙ СУБЪЕДИНИЦЫ Иа.К-АТФазы.

Один из генов семейства alpha-субъединицы был выделен в серии нескольких перекрывающихся клонов. Это потребовало проведения нескольких циклов так называемой "прогулки по хромосоме". Для этой цели из первого положительного клона выделяли краевой фрагмент вставки и проводили новый скрининг банка, используя этот фрагмент как гибридизационный зонд. В следующем положительном клоне также выбирали краевой фрагмент новой вставки и т.д. Для проверки того, что выделенные клоны содержат фрагменты одного и того же гена, мы сопоставляли рестриктные карты и проводили определение первичной структуры в областях перекрывания. Во всех случаях первичная структура в областях перекрывания была идентичной, причем размеры перекрывающихся фрагментов, для которых была прочитана нуклеотидная последовательность, составляли не менее 2 тыс. п. о.

Таким образом в результате двух раундов "прогулки по хромосоме" были найдены три клона Л1Ш1?10-3, .XN&U53-2 и ANK¿J?M -1, содержащие, по-видимому, фрагменты одного и того же гена. Область перекрывания клонов XNKoüR3-2 и XNIUR10-3 содержит характерные сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции BamHI и EcoRI (рис.5). Первичная структура фрагментов BamHI-BamHI из обоих клонов идентична и включает как интронные. так и экзонные участки.

- 19 -

Некоторые сомнения относительно идентичности всей области перекрывания этих двух клонов вызывает несовпадение рестриктных карт в области, находящейся влево от BamHI-BamHI фрагмента. Одно из предположений, объясняющее это несовпадение, состоит в допущении перестройки одного из клонов в процессе клонирования. Оно, однако, было отвергнуто после сопоставления Саузерн-блотов геномной ДНК с Саузерн-блотами ДНК обоих клонов. Поскольку в геномной ДНК были обнаружены фрагменты, характерные как для клона Шо1Г?3-2, так и для клона xNK«t R10-3, можно было заключить об отсутствии перестроек при клонировании. Тогда разумным предположением, объясняющим несовпадение рестриктных карт, является допущение того, что в данном случае клонированы аллельные варианты одного и того же гена (или, что менее вероятно, высокогомологичные последовательности родственных генов).

Область перекрывания клонов ANK«cR3-2 h\NK<*RM-1 характерна тем, что содержит один сайт узнавания рестриктазы BamHI и не содержит сайтов узнавания рестриктаз EcoRI и HindiII. Первичная структура фрагмента Sail-Ban«I wi0HaXNKoLR3-2 (1,8 тыс. п. о.) полностью идентична структуре соответствующей области фрагмента BamHI-HindIII клона ANKctRM-l.

Наиболее веским доказательством того, что во всех трех клонах содержатся фрагменты одного и того же гена, является наличие в мозге человека мРНК, структура которой соответствует экзонным частям трех выделенных клонов. Действительно, структура'экзонов найденного гена полностью совпадала со структурой клонов gtl210 и рВ2301 (рис.4), выделенных из кДНК-банка мозга человека, что, учитывая отсутствие стоп-кодонов в предполагаемых экзонных участках, свидетельствовало о транскрипционной активности геномной последовательности. Эти данные в совокупности позволяли исключить предположение о том, что найденная структура представляет собой псевдоген. Сопоставление первичной структуры этого гена со структурами трех мРНК из мозга крысы (Shull et al.1986), позволило идентифицировать этот ген как ген alphaIII-изоформы каталитической субъединицы Na,К-АТФазы, с ® которой этот ген имеет наибольшую гомологию (99.1%). ю На рис. 6 приведена полная структура экзонных и частич-

Ter-3037

19Um2095 2264 2И9 25A3 2689 2820 29.22 30141

/\ /\ ,'¡/ gt802

\\\ X/ X 1 4 ¡ 4/ \/ ¿"V

11944 ¿¿xa аи /d^j zoos ¿oaj ¿v¿¿ juta i

-к-t-t--к-*-4-7*4--;я

ATG \ А, V \ l \ N / V ; '' '

1«> |7 93 153. 317 pHB2301 \ \ \ Ч 4 \ ' ' 1-'Л-к—h- J' V V \ \ \ I / /

V ^v \\ I //>

4—' iB iii» ni ..iaV

2 3 A 5678 910tl 12 13 14 15 16 171819 212223

S H EH В BE BE EES S S

U_I_I i_I I t I I_UWW\

20 12 2U 20 2Á 12 23 .8.8 1. 3

B E ANKJR10-3

/wwn-1-^-*—5-

! 18 11 2.8 20 лгмклк^

V H В V

/wwj a2 ' 30—1-gQ-ÍWW4 ANKJRM-1

Рис.5 Структурная организация гена aIII-изоформы каталитической субъединицы Na,К-АТФазы человека. Экзоны 1-23 обозначены вертикальными прямоугольниками. Обозначения сайтов рестрикции см.рис.2. Внизу приведены карты перекрывающихся геномных клонов. В верхней части рис. приведены схемы двух клонов, содержащих фрагменты кДНК аШ-из9формы каталитической субъединицы.

8 i

-21-

ная структура гатронных участков клонированного гена, а также аминокислотная последовательность белка, кодируемого, им. Реконструированный фрагмент размером около 35 тыс. п. о. содержит всю кодирующую последовательность, за исключением первых двух кодонов. Поэтому 5-нетранслируемая область и первые шесть транслируемых нуклеотида приведены по структуре кДНК а1р1та111--формы, клонированной из мозга человека (клон рВ2301, рис. 4).

Ген состоит из 23 экзонов, разделенных 22 интронами. Сопоставление структуры хромосомного гена и кДНК а1р!1аШ-изоформы показывает, что первый интрон расположен между вторым и третьим кодовом, то есть в структуре белка это соответствует отделению дипептида М^Б1у от остальной части молекулы. Размеры экзонов гена а1р11аЗ варьируют в пределах 60-269 п. о. со средней величиной 143 п. о., что хорошо согласуется с литературными данными,приведенными для большого числа генов высших эукариот. Длина интронов гена варьирует значительно сильнее, от 70 п. о. .до 5-7 тыс. п. о. Два наибольших по размерам интрона, 1-й и 16 -й, содержат . А1и-повторы и, повидимому, разделяют-определенные функциональные домены: 1-й интрон - Ы-концевой вариабельный учас-• ток, а 16-й - каталитический центр и С-концевую область белка. 12 интронов встречаются в рамке считывания О, б - в рамке считывания +1 и 4 - в рамке считывания +2. Интересно, что интроны, попадающие в рамку считывания'О, чаще встречаются в 5-концевой части гена, а интроны, разбивающие рамку - в 3-концевой. Большая часть интронов разбивает кодоны на гидрофильных аминокислотах, исключение не составляет и интрон 18, разделяющий кодон Б1у и расположенный в трансмембранном участке, где бблыпая часть аминокислот гидрофобна.

Структура 3- и -5-сплайс-сайтов (табл. 4) совпадает с консенсусной последовательностью, приведенной в литературе. Из других характеристик гена можно отметить неканонический сигнал полиаденилирования ААТАТА, находящийся на расстоянии 15 п. о. от ро1уА-конца.

Таким образом, ген а1р1та111-изоформы каталитической субъединицы На,К-АТФазы представляет собой типичный пример эукариотических генов, для которых кодирующая часть соетавля-

i-ie

19-9) 94-117

ue-isj

1S4-225 226-300 301*357 35S-40S 406-471 472-504 505-S79 580-604 607-678 679-724 725-780 781-8»S 856-9 JO

994*1038

1039-111: 1114-11¿8 iiím: m '124-1287 1288-1Î11 1312 >1386 1387-14 37 1438-1497 1498-1572 1573-1630 1631-1677 16 78-1752 1753-1806 1807-1854 1855-1929 19 30-1959

AAC CGACCGACCCACCCACGCCGCACCT ACCGACGGCCCGCGCGCTCCAGACGCTCCCAGCCCAAGCCTC AGCCTC AGCCCCCCCCCAGCTCCCCCCCCCC

CC CCCCTGCCTCTCTCGCСGCACCCGCCAAG ATO CGC..........i ft t ton 1..........ATÇGCCACCTCCCAC GAC AAG АЛА CAT

Met-Cly Aap-Lyi-Lya-Aap.

С AC AAG С AC TCA ССС AAG АЛС ААС AAG CGC ААС CAO CGC CGC САС CTG CAT ¿AC CTC AAG АЛС CAG CTG GCT ATG Afcp-Lys*Asp-Scr-Pro-l.y»-Ly8-Asn-ty*«Cly-[.yt-Clu-Arq-Ar9-'Asp'*L«u-Atp-A*p<L«u-Lys-Lys-GlU'>Val-AU'*Mec

GTAAGCCTCCCCCTC.....,....intron 2 »99b.p.)..........ACTCCTCTTCCTCAC АСА GAG С AC AAG ATG TCA CTC GAA

Thr-Clu-Hla-Ly»-M«t-S«r-Val-Glu-

GAG GTC TGC CCG AAA ' TAC ААС АСА СЛС ТСТ CTC CAG ÔTGTCGCCAGGCTGT,.........intron J..........CTCCTCTGTC

Clu-Val-Cy»-Ary-Ly«-Tyr-Aan-Thr-Aap~Cy»-Val-Gin

С CT AG GCT TTC ACC С AC AGC AAA ССС CAG САС АТС CTG ССС CGC GAT GGG С CT ААС CCA CTC ACG CCA CCG CCT ACC

Cly-Leu-Thr-Hl»-Ser-Ly»-Ala-Gln-Clu-Il»-Lcu-At*-Ar9-Aep-Gly-Pr0-A»n-Ala-Leu-Tbc-Pr0-Pr0-Pr0-Thc-kcc CCA GAG TCG GTC AAG TTT TGC CCC CAG ÇTC TTC CCG CGC TTC ТСС АТС CTC CTG TCG АТС CCG GCT АТС CTC Thr-Pro-Glj-Trp-Val-Ly»-Phe-Cy»-Arq-Cl,»-Leu-Ph*-Ciy-<;iy-Phe-Ser-Iie-Leu-Leu-Trp-IU-Gly-Al»-Ile-l-eu-

TGC TTC CTG CCC TAC GCT АТС CAG CCC CGC АС С GAG GAC GAC ССС* ТСТ CCT САС ААС GTGACTCCCTGGACC..........

Cye-Ph«-Lej-Ala-Tyr-Cly-U«j-ClPi-AXa-CIy-ThtGlu-A»p-A«p-Pro-Sor-Gly-Aep-A»n

...intron 4.......-...CACATÇTCCCCACAC СТв TAC CTC ССС АТС CTG CTG GCG CCC "GTG GTC АТС АТС ACT CGC TGC

Leu-Tyr-Leu-GIy-tl«-Vêl-U«a-AU-Ai*-V*l-V*l-Xlf-Ile-Thr-^ly-Cye-TTC ТСС TAC TAC CAG CA? CCC AAG AGC ТСС ААС АТС АТС САС ТСС TTC AAG ААС АТС GTG ССС С AG CTGAACGCTGCC Phe-Ser-Tyr-Tyr-Cln-Glu-Ali-Lys-Ser-Ser-Lyi-Ile-Het-Gig-Sec-Phe-Lyi-Ain-Het-Val-Pro-Gla

CAG..........Intron S {113b.p.I..........TCCATCCCACCTCAG CAA CCC CTC GTC АТС CCG CAA CGT CAfi AAG АТС

Gin-Ala-Lau-Val-Ila-Arg-CW-Gly-Clu-Lye-Net-CAG GTG AAC GCT CAG GAG CTG. CTC CTC CGC CAC*CTC CTC GAG АТС AAG CCT jGGA CAC CCA CTC CCA GCT GAC CTG

CCG АТС АТС TCA GCC CAC CGC TGC AAG GTCCCCCTCTAGCCC..........Intron t (433b.p.)..........TGCACCTACCC .

Ar^-IU-Ile-S«r-AU-Hl»-Cly-Cy»-t.y»

CCAG CTG GñC ААС ТСС ТСС CTC ACT ССС GAA ТСС CAG ССС САС ACT CGC ТСТ ССС САС ТСС АСС САС САС ААС ССС

, Vai«Asp-A»n-Ser-Ser-L*u-Thr-Gly'^Ilu-Ser-Clu-Pro-Cl'n-Thr-Arg-S«r-Pro-A»p-Cy»-Thr-Hli»A«p-^iazPl2z.

TTC CAG ACT CCG ААС АТС ACC TTC TTT TCC ACC ААС TGT CTC CAA С CTGACGCCCCTGCAC.........Intron 7 IIIS b,

Leu-Glu-Thc-Acq-Asft-tle-Thr-rhc-Phe-Ser-Thr-A»ii-cy»-Val-Glu-Clly)

........"."CCCTCTGGCCTCCAG CC ACG GCT CGC CGC CTC GTC CTG CCC ACC CCC CAC CCC ACT CTC АТС CCC CCT АТС

<Glly-Thr-Ala-Ar9-GIy-Val»V>l-Val'AIa-Thr-Gly-A»p-Ac9-Thr-V«l-4at-ClyArq~IU-GCC ACC CTC CCA TCA CCG CTC GAG GTG GCC AAC ACC CCC АТС CCC АТС CAC ATT CAG CAC TTC АТС CAC CTC АТС AU-Thr-Lea-Ala-Ser-Gly-Leu-Clu-Vai-Cly-Ly*-Thr-Pro-IU-Alä-Ue-Gla-Ile-Glu*Hl.»-Pb<f-Il«-Cln-L«u-Ile-ACC CGC GTG~CCT CTC TTC CTC GCT CTC TCC TTC TTC АТС CTC TCC CTC ÁTT CTC CCA TAC ACC TGC CTT CAC GCT Thr-Cly-Val-Ala-Val-Phe-Leu-Gly-Val-Ser-Pfta-Pfia-I la-Lau-Sar-Leu- í le-Lau-Gly-Tyr-Tht-Trp-l^eu-Clu-Ala-GTC AfC TTC CTC АТС'CCC АТС АТС CTC CCC AAT CTC CCÁ GAG CCT CTC CTC CCC ACT CTC ACT G7AACCCCACCCTCC. •. Val-Ila-Phe-Leu-Xle-Gly-Ile-Ile-Val-Ala-Aín-Val-Pro-Glu-Gly-Leu-Lcu'Ala-Thr-Val-Thr

........intron в.......'.. .TTGCTCGTCCTCCAC CTC TCT CTC ACC CTG ACC CCC ААС CCC АТС CCC CCC AAC AAC TCC

Vai-Cy»-Lej-ThrrVal-Thr-Ala-ty»-Afq-Met-Ala-Arg-Ly*-A»n-Cye* CTG CTC AAG AAC CTC CAG CCT СТА CAG ACÍ CTC CCC TCC ACÍ TCC ACC АТС TCC TCA CAT AAG АСА CGC ACC CTC L«u-Val-Ly»-A5n-I.eu-Cla-Ala--4'al-GiU-Thr-L*u-Gly-S«r-ihr-Ser-Thr-Ile-Cyi-Sec-Atp-.l,Y»»Thr-Cly-T^r-L«u-

ACT CAG AAC CGC АТС АСА GTC CCC CAC ATG TCC TTT CAC AAC CAC АТС CAC CAC GCT CAC ACC ACT GAG GAC CAG

Thr-cin-A5n-Arg-Met-Thr'Vai-AU-Hia-wec-Trp«Phe«A«p-A»n-Cln»Ila»RiaH;iu-Ala-Aap«Thr-Thr»Clu-A»p«Cln»

T¿A С GTGAJCGCAGCCCCC..........intron 9 (74b.p.)..........4CATCCCTCCCCCAC CG ACC TCA TTT CAC AAG ACT

SAT-Clly) (c> ly-thr»S»r-Ph«-A«p-by

TCC CAC ACC TCG CTU CCC CTC ТСТ CAC АТС CCT CGC CTC TCC AAT CCC CCT CTC TTC AAG CCT CCT CAC GAC AAC Scr-fli *-Thr-Trp-Vil-Ala-L«u-Ser-Hls-Ile-Al4H;iy-l^u-Cy«-A»n-Ar<j-Ala-Val-Phe-^

АТС CCT GTC CTC AAG AC GTGGC7TAGCTACTC.........»Intron 10 (84b.p.)..........CCTTTCTCCTTGCAG С CAT CTG

lU-Pro-Val-Leu-lya-Arfql (Ar)g-Aap-Val-

CCT CCG GAT GCC TCT GAC TCT CCC CTC CTC AAC TGC АТС CAC CTC TCC TCT CGC TCC CTC. AAG CTC АТС CGT. CAA Ala-Cly-A»?-Ala-Ser-Clu-Ser-Ala--L<a-L«u-»l.y»-Cy»~Ilt'CIu-Lau»Ser~S»r--Cly«Scr«Val~Ly»-L«u»?t«t»Ar9»Clu"

CCA AAC AAG AAA CTC CCT CAG ATT CCC TTC AAT TCC ACC AAC AAA TAC CAC СТАСТСТСССТП CC..........intron 11

Arg-Asn-Ly»-Lys-Val-Aia-Glu-Ile-*Pro-Ph*-Aan~S«r~Thr<»Asn*Ly*-Tyr''-Gln

........CIGATCGCTCCCCAC CTC TCC АТС CAT CAC ACC CAG CAC CCC AAC CAC AAC CCA TAC CTC CTC CTC ATG AAG GC

• L«u-Ser-tl«-Hi*-Clu-Thr-Clu-A»p-Pro-Aan-Aep-A*n-Arg-Tyr-Leu-Leu-Val-Met-Ly»-Gl

CCC CCC CAC CGC АТС CTC CAC CGC TCC TCC ACC АТС CTC СТА CAC CGC AAG CAC CAC CCT CTC CAC GAGCAA АТС AIa-Pro-Glü-Arg-ne-l.ea-Aap-Ara~Cys--Ser-iThri"Ilc»Leu-Lcu-Cln-Cly»Ly«-CIu-GVn-Pro-Leu-Asp-iClui-CIU"Met*

AAG CAC CCC TTT CAC AAT GCC TAC CTT GAG CTC CCT CGC CTG CCC CAG CCC CTC CTT С CTCCGAGGTGC............

Lys-Clu-Ala-Phe-Gl^-Asn-Ala-Tyr-Leu-Clu-I.ej-Cly-Gly-Leu-GIy-Clu-Ar^-V'al-Leu-G ( lv 1

..intron U..........CTTCCCTGCCACTAC CT TTC TCC CAT TAT TAC*CTC CCC CAC CAC CAC TAT CCC .CAA CGC TTT

(С)ly-Phe-Cyi-Hie-Tyr-Tyr-Leu-Pro-Clu-Clù-Gln-Tyr-Pro-Cln-Cly-Phe-CCC TTC CAC TCT CAT CAC CTC AAC TTC ACC» ACC CAC. AAC CTC TCC TTT CTC CGC CTC АТС TCC АТС АТС CGC CCA AIa-P?>e-Aip-Cy»-Asp-»A«p-»Val-Asn-Phe-Thr-T?ir«A«p»A»n-t.eu-Cy8"Phg''Val-Cly-Leu-4et-ST»43t-Il¿-Cly-Pro-

CCC CCG CCA CCC GTC CCT CAC CCC CTG CCC AAG TCT CCC AGC ССЛ GCC АТС AAG GTCTCGCTTGCCTGC..........intrc

Pro-Arq-AU-AIa-Val-Pro»Aap-AU-Val-GlyLy»-Cya-Arg-Ser-Ala-Gly~Ile-tya

13 173b.p. )..........AAACAATGCCTCCAG CTC АТС АТС CTC ACC CGC CAT CAC CCC АТС ACG CCC AAC CCC ATT CCC

Val-tl«-.4et-Val-Thr-Cly-Asp»Hia-Pro-lle-»Thr-Ala-Lya-Ala-IVa-'Aia» AAG GCT CTC CGC АТС АТС ТСТ САС ССС ААС CAG ACT CTG САС GAC АТС GCC ССС ССС С ТС ААС ATT ССС СТС АСС Lys-Gly-Vjl-GIy-Ile-I le-Ser-GIu-»Gly-Asn-Glu~Thr-Val-Glu-A»p-H«-Ala-Alj-Arq-Leu-A«n-Ile-Pro-VaI-Ser-

CAG GTT AAC CCC CC CTCAGCCACCCATTC..........intron 14..........CT¿TCCTCTTCCCAG G CAT CCC AAG GCC .TCC

Gln-Val-Asn-Pro-ArIqi {Ar)7-A»p-Ala-Lya-Ala-Cya-

Рис.6 (см,след.стр.)

0-2054 СТС АТС САС ССС АСС САС СТС ЛАС СЛС ГГС АСС ТСС САС САА АТС САС САС АТС СТО САС ААТ САС АСС САС АТС

4-2094 СТС ТТС ССС ССС АСА ТСС ССС САС САС ЛАС СТС АТС АТТ СТС САС ССС ТСТ САС АСА САС СТССССТССССТССС......

5"2142 15..........ЛСССТСТСТ^СССЛС ССТ ССА АТТ СТС <ХТ СТС АСС ССС САТ ССТ СТС АЛС САС ТСС ССС ССТ

С1у-А1>-11е-Уа1-А1а-Уа1-ТЬг-С1у-А»р-С1у-Уа1-А8г>-.А«р-5*Г-Рго-А1а-

3-2217 СТС ААб ААС ССС САС АТТ ССС СТО ССС АТС ССС АТС ССТ ССС ТСТ САС СТС ТСС ААС САС ССА ССТ САС АТС АТС L«u-Ly^-Ly«-AU^A»p-Ile-Cly-V^l-AU-H«t-C^y-llc-AU«cIy-S«г-A6p»VaI-Seг-L^/a-Cln-Ala-AU«A»p-Mtft-11о-

6-2263 СТС СТС САС САС ААС ТТТ ССС ТСС АТС СТС АСА ССС СТС САС САС С СТСАСТТССССАССС*.........1Шгоп 16.....

ии-Ь*и»А»р-А»р-А»п-РЬ«-А1а-5ег-1и-Уа1-ТЬг-С.1у-У«1-С1и-С1и-С(1у>

4-2322 ......СТССС ТСТССС А САС СС ССС СТО АТС ТТС САС ААС СТА ААС АЛС ТСС АТТ ССС ТАС АСС СТС АСС АСС ААТ АТС

(СПу Агд-Ьси-П«-РЬ»-А8р-Л»п-1^и-Ьу»-Ьу»-5<г-11е-А1а-Туг-ТЪг-1си-ТЬг-5ег-Азп-11е-3-235? ССС САС АТС АСС ССС ТТС СТС СТС ТТС АТС АТС ССС ЛАС АТС ССС СТС ССС СТС ССС АСС АТС АСС АТС СТС ТСС

6-2421 АТС САТ СТС ССС ЛСТ САС АТС СТСАССССТСССАСС..........ШЪгоп 17 (77Ь.р.)..........СССТССТСС'ХГСТАС СТС

• П«-Л»р-Ьаи-С1у-ТЬг«А8р-МеЬ ' Уа 1 -

2-2496 ССТ ССС АТС ТСА СТС ССС ТАС САС ССТ ССС САА АСС САС АТС АТС ААС АСА САС ССС АСС ААС ССС ССС АСС СЛС Уго-А1а-11е-5ег»Ьои«А1а»Туг"С1и-А1а-А1*-С1и-5ег-Авр-11«-Не1-1>у»-Аг9-С1п-Рго-АГ9-А8п-Рго-Агд-ТКг-Абр-

7-2542 АЛА ТТС СТС ЛАТ САС АСА СТС АТС АСС АТС ССС ТАС ССС САС АТТ С СТСАСССАССССССА..........Ап^оп 18....

Ьув-1ли-Уа1-А»п-С1и-Аг9-Ыи-11е»5«г-Ме^Л1а-Туг-С1у-С1п-11е-СЦу)

3-2(01. ......СТСТССТССТТССАС СА АТС АТС САС ССТ СТС ССТ ССС ТТС ТТС ТСТ ТАС ТТТ СТС АТС СТС ССА САА ААТ ССС

(С11у-Не1-1Хв-С1п-А1а-Ьви-С1у-С1у-РЬе-РПв-5ег-Туг-РЬв-Уа1-11е-Ьво-А1а-С1и-Аап-С1у-2-2676 ТТС ТТС ССС ССС ЛАС СТС СТО ССС АТС ССС СТС ЛАС ТСС САТ 1ЛС СвС АСС СТС ААТ САС СТС САА САС АСТ ТАС ?К*-1ли-Рго-С1у»л»п«'Ьво-Уа1-С1у-11е-Агд-1ли-Авп-Тгр-Авр-Авр-АГ9-ТЬг-Уа1-А1п-Авр-1еи-С1и-А5р-5ег-Туг-

7-2709 ССС САС САС ТСС СТСАСТАССССАССС.........1пйгеп 19..........ТСАССССТССТССЛС АСА ТАС САС САС АСС ААС СТС

С1у-С1я-С1п-Тгр ТЬг-Туг-С1и-С1п-Агд-Ьув-Уа1-

0-2764 СТС САС ТТС АСС ТСС САС ЛСС ССС ТТС ТТТ СТС АСС АТС СТТ СТС СТС САС ТОС ССС САТ СТС АТС АТС ТСС ААС

Уа1-СХи-РЬв*ТЬг-Су»-Н1.1-ТКг-А1а-РЬе-РЬе-Уа1-5вг-11е-Уа1-Уа1-Уа1-С1п-Тгр А1а-А5р-1ли-Пе-ие-Сув-Ьув-$-251» АСС ССС ЛСС ЛАС ТСС СТС ТТС САС САС ССС АТС ЛА СТСАССССССССССА..........1пйгоп 20.........СТТСТСТСС

0-1889 СТССАС С ААС ААС АТС СТС. АТС ТТС ССС СТС ТТТ САС САС АСС ССС СТС ССТ ССС ТТС СТС ТСС ТАС ТСС ССС ССА СЬу)а-А»п-Ьу»-11в-Ьво-Ив-РЬв-С1у-1ли-РЬв-С1и-С1и-ТНг-А1»-Ь*и-А1а-Л1а-РЬв-Ьаи-5вг-Туг-Су1-Рго-С1у-

0-29Л АТС САС СТС ССС СТС ССС АТС ТАС ССТ СТС АА СТСАСТСССССССТС....................21 ..........СТСТССССТСТС

Ией-Лар-Уа1-А1а»»ц-Агд-най.-Туг-Рго-ь«и-Ьу<«) 2-2994 СЛС С ССС АСС ТСС ТСС ТТС ТСТ ССС ТТС ССС ТАС АСТ ТТС СТС АТС ТТС СТС ТАС САС САА АТС ССС АЛА СТС АТС ду)»-Рго-&«г-Тгр-Тгр>РЬе>Су«-А1а-РЬ«-Рго-Туг-5ег-РЬа-Ь«и-11>-РЬе-Уа1-ТуГ"А«р-С1и-11е-Агд-Ъу»-1еи-11с-

5-3018 СТС ССС АСС ААС ССА ССС С СТСАСССАССТСССС........».Шггоп 22 (,'81Ь.р.)..........ТСТТТСТСТСТССАС СТ ТТС

1ли-Агд-Агд-Л»п-Рго-С1у-С<1у) |С)1у-Тгр-

9-ЗОЭ9 СТС САС ААС САА ЛСС ТАС ТАС ТСА ССТСАСтеССАССАСАТСССССАТСТСГТСССССТССССАССССАССАСССССССТСТСАСТСС^ , Туг-Туг ТЕ*

Г!ТГСТАГГСТССС^САССАГ<:а?гетСТТССТСТ^^ ССТОССйСССССЛСТС1айС7»^СТТСГСТСС

ССТСССЯСАААССТСТСГССТСТСТСТТТТСГСТСТСАСТ^^

тттт астссс сттс асссссс с сстс атссслтстстссттстссас аатт атс^ат атд^гс лете соеасасалее с стст отстсгтот ссст се тт тссасасссссасгссссстс<»асассатсссстстсттсссссс^

САСССЛЛТСТСАСАСССЛТСТАЛТСЛСССАСТТТТСЛАСТССАССАЛЛСТСАСАССАССТТСААТТС

Рис.6 Нуклеотидная последовательность гена и выведенная последовательность аминокислот аШ-фор-мы каталитической судъединицы Иа,К-АТФаэы человека. Подчеркнуты участки гомологии с другими ион-транс-портирующими АТФазами. Обведен рамкой предполагаемый сигнал полиаденилировант**

ет около 10% всей длины.

Экзон-интронную структуру гена alpha3 интересно -рассмотреть с точки зрения вторичной структуры белка и его упаковки в мембране. Хотя исследования белкового -продукта этого гена пока не проведены, ' его расчетная вторичная структура и профиль гидропатии практически не отличаются от таковых для alpha-формы каталитической субъединицы Na,К-ATФазы почек свиньи благодаря высокому уровню гомологии между ними. Поэтому правомочно сопоставить структуру гена alphaIII-изо-формы с моделью вторичной структуры alpha-формы.

Для мембранных белков высказывались предположения, что экзоны кодируют трансмембранные сегменты белковой молекулы. При этом интроны попадают в гидрофильные петли между мембранными alpha-спиральными участками. В случае экзонной структуры гена alpha3 видно, что семь предполагаемых трансмембранных тяжей ограничены восемью интронами (3,4,5,8,16,17,20 и 21). Наиболее характерной чертой расположения интронов в гене alpha3 является их отсутствие в участках гена, кодирующих трансмембранные домены. Исключение составляет лишь интрон 18, попадающий внутрь участка, кодирующего шестой трансмембранный домен. В цитоплазматической области следует отметить существование определенной корреляции между расположением интронов в гене и организацией белка в структурно-функциональные домены. Так, большая часть интронов ограничивает участки с выраженной вторичной структурой, то есть интроны как будто делят полипептидную цепь на отдельные домены,, представляющие собой различные комбинации alpha-спиральных и beta-складчатых структур.

В области активного центра Ыа^К-АТФазы обращает на себя внимание кластер подобных альтернирующих структур. Интересно провести сравнение Na,К-ATФазы с белками с известной вторичной структурой, выполняющими различные функции, но связывающими нуклеотиды в качестве кофакторов. При подобном сравнении обнаруживаются некоторые.совладения в структуре нуклеотид-связывающих доменов и кодирующих их генов. Такие белки, как алкогольдегидрогеназа, глицеральдегидфосфатдегид-рогеназа, фосфоглицераткиназа, пируваткиназа содержат нуклео-тид-связывающие участки, состоящие из шести параллельных

-25-

Таблица 4. Участки сплайсинга гена аП1-субъединицы На+,К+-АТФазы человека.

Номер интрона

Тип разрыва рймки

О +1 +2

Последовательность в области участка сплайсинга:

белковая

5•-донорная 3'-акцепторная

1 2

3

4

5

6

7

8 '9 10 11 12

13

14

15

16

17

18

19

20 21 22

-интрон-

М й и к ЭССС jgtg.. . . -Ьсесае^А

А М Т Е ТАЮ )gta. . ..cctcag(AC

V са в ь GCAG)gtg.. . .ctgtag(GG

В N Ы СААС)gtg.. ..ссаса^ССТ

Р <3 0 А ССАв)gtg.. . .CCtCELg(CA

с К V I) СААв)gtg.. ..оссоай(СТ

V Б а Т А йЛАО)gtg.. ..ctgcag(GC

V Т 7 С САСТ )в1<&. - ..ctccag(GT

игстз ТСАв)gtg.. ..ccccag(GG

Ь К И Ъ V АБАС)gtg.. . .•ttgcag(GG

т а ъ б ССАв)gta.. ..ОССО€^(СТ

V Ъ Э Р с СТТв)gtg..

I Ь VI СААС)gtg.. ..ctgcag(GT

N Р И Б А СССС)gtg.. ..tcccag(GG

Я О С А ACAG5gtg.. ..ccccag(GG

Е Е в й Ъ йАСС)gtg.. д.ссасав(СС

Б М V Р САТОвгв. .

0 I (!Н I АТТС)gtg.. ..^ Ъ с са^(СА

й 1/1 I йТСв)gtg.. ..ctgcag(AC

а м кN к ТОАА^е. . ..ctgcag(GA

Р Ъ К Р 8 TCAA)gtg.. . .с^йсадССС

Р й й I V вова)gtg.. ..ctccag(GT

Консенсус участков сплайсинга для данного гена

Частота встречаемости ну-клеотида, %

СУ о см

п п со ш •«» ш

СМ (V)

о л

СУ

аз о о

о" о

.о£*оав(а

см

яюо л со о ю I- ю о о

■ч •

- 26 -

beta-структур, соединенных а1рЬа-спиралями, и отделенных от . каталитических доменов. Характерной чертой генов нуклео-тид-связывающих белков является наличие интрона, разделяющего каталитический и нуклеотид-связываодий.домены, и интрона, де-ляшэго нуклеотид-связывающий домен на два субдомена.

На рис. 7 видно, что ив alpha-субъединице Na, К-AT Фазы нуклеотид-связывающий домен также содержит два кластера чередующихся alpha/beta структур, разделенных тремя beta-складчатыми участками, причем весь этот домен кодируется шестью полными зкзонами (10-15) и началом 16-го экзона. Роль интрона, разделяющего нуклеотид-связывающий домен на два субдомена в гене Na,К-АТФазы,может играть интрон 12 или 13, а в роли интрона, разделяющего каталитический и нуклеотид-связывающий. участки может выступать интрон 9. Таким образом, эти аналогии могут служить в поддержку гипотезы об общэм эволюционном происхождении нуклеотид-связывающих доменов и последующем их распространении путем внутриинтронной рекомбинации их генов с генами, кодирующими различные каталитические домены.

Другой подход, направленный на выявление закономерностей в структуре нуклеотид-связывающих участков, использует анализ первичных структур. Поиск в структуре Na.K-АТФвзы кон-сенсусных последовательностей позволяет найти пептиды с характерными элементами первичной структуры С этой точки зрения структура пептидов 242-270 и 710-744 наилучшим образом соответствует консенсусным последовательностям фрагментов А и В, идентифицированных Уолкером и др., как участки связывания АТФ. Действительно, непосредственное участие фрагмента 710-744 в связывании АТФ было показано экспериментально методами аффинного мечения. Если два пептида (242-270 и 710-744) формируют нуклеотид-связывающий домен, то это означает, что удаленные по первичной структуре пептиды сближены в третичной структуре и между ними расположен Asp-369, фосфорилируемый АТФ.

Оба пептида входят в участки, обладающие высокой гомологией с соответствующими участками Са-АТФазы саркоплазмати-ческого ретикулума. Это второй пример АТФазы Е1Е2-типа, для которой известно зкзон-интронное строение гена Интересно отметить, что гены обоих белков имеют сходное строение в облаю-

12 П ,0

Рис.7 Модель мембранной организации каталитической субъединицы Иа,К-АТФазы человека. Цилиндрами и стрелками обозначены а-спиральные и 8-структурные участки. Стрелки с цифрами указывают положения и номера интронов. Аминокислотные остатки О,,«, К5о1, 0710, 0714 .и К-., входят в активный центр фермента. Справа приведена модель В-суоъединицы фермёнта.

тях, соответствующих этим пептидам. Пептид 242-270 в обоих случаях кодируется экзоном 8, причем местоположение ограничивающих. его интронов 'отличается в двух генах лишь на 19' и 20 нуклеотидов. Граница следующего экзона 9, кодирующего сайт фосфорилирования в обеих АТФазах, в Са-АТФазе сдвинута всего на 50 нуклеотидов по сравнению с Ыа,К-АТФазой. Вторая область (710-744) кодируется в обоих белках началом 16-го экзона, а положение соответствующих интронов отличается на 18 нуклеотидов. Таким образом, консервативность в структуре участков полипептидной цепи Е1Е2-АТФаз, формирующих каталитический центр фермента,- находит свое отражение в консервативности эк-зон-интронной организации генов. Тем самым Ыа.К-АТФаза оказывается в группе белков, для которых оправдываются гипотезы Гилберта, Клейка и Го о соответствии экзонов структурным и функциональным доменам белка.

Полная экзон-интронная структура генов остальных изо-форм каталитической субъединицы неизвестна, но наш данные по частичной структуре фрагментов генов позволяют считать, что . все гены семейства имеют сходное расположение интронов. Эти результаты подтверждают предположение о существовании общего предшественника-транспортных АТФаз, который дуплицировался в процессе эволюции и дивергировал в разные формы.

ГЛАВА 3.. ЭВОЛЮЦИЯ ГЕНОВ Ыа.К-АТОазы.

В настоящий момент известны первичные структуры а1рЬа-субъединиц Ыа.К-АТФаз рыб, птиц и нескольких млекопитающих. Сравнительный анализ их структур в совокупности со структурами изоформ каталитической субъединицы человека, и крысы позволяет получить некоторые данные об их эволюции.

В табл.5 суммированы данные по сравнению аминокислотных последовательностей всех известных структур а1р!та-субъе-диниц. Результаты кластерного анализа этих данных представлены на рис. 8 в виде стандартной дендрограммы. Анализ показывает, что группу наиболее близких структур образуют а1рЬаШ-изо-формы человека и крысы, а также а1р1та1-формы млекопитающих. Другими словами, полученные результаты означают, что гомология родственных белков внутри вида (например, а1рЬа1- и а1рЬаШ-изоформы человека или а1рЬа1- и а1рЬа11- крысы) сущест-

Табл.5 Количество аминокислотных замен в а-субъединицах из разных источников. Верхняя цифра - абсолютное число замен, нижняя - доля совпадений от длины (1026), делеции и вставки считаются заменами.

скат цыпленок крыса овца свинья человек

а а а III а аШ

скат 147 136 173 175 140 135 136 179

0,857 0,867 0,831 0,829 o,ôéà 0,868 0,867 0,826

цыпленок 75 138 152 69 69 0,933 87 153

0,987 0,865 0,052 0,933 0,915 0,851

крыса а 140 150 ÏÏ75ÏÏ4 36 Ô79&5 29 0,972 34 155

0,863 0,967 0,849

+ а 138 0,865 140 0,863 133 138 140

0,870 0,86 0,863

аШ 146 140 145 9

0,858 0,863 0,859 0,991

овца 20 29 147

0,980 0,972 0,853

свинья 15 142

0,985 0.862

человек а 145 0,859

аШ

- 30 -

венно меньше, чем гомология разных, даже далеко отстоящих видов (например, а1ра111-формы человека и крысы). Это означает скорее всего, что изоформы образовались из общего предшественника очень давно, судя по результатам анализа (рис.8), раньше, чем произошло разделение птиц и млекопитающих.

Для количественной оценки времени образования изоформ можно использовать скорости эволюционных замен (табл.6). Результаты, приведенные в табл.6, свидетельствуют, что скорост! эволюционных замен в а1рЬа1-субъединицах была приблизительно одинаковой во всем изученном интервале времени. Средняя скорость замен на сайт в год равна Каа-0.18»10^ Особый интерес вызывает скорость эволюции а1р1ча11- и а1р1та111-изоформ. (По а1р1та11-изоформе сравнительных данных пока нет, так как известна единственная структура а1р1та11-изоформы из мозга крыса) Скорость эволюции а1р1та111-изоформ можно оценить по сопоставлению замен в соответствующих белках человека и крысы (табл.6). Оказывается,что скорость эволюции а1рЬаШ-изоформ1 по крайней мере на отрезке времени в 75 млн. лет, была значительно меныпе(0,06'16), чем скорость эволюции а1р1та1 -формы. Тогда, время образования а1рЬа111-изоформы можно получить иг сопоставления числа замен в а1рЬа1 и а1рЬа1I1-изоформах человека. Такая оценка времени образования а1рЬа111-изоформы приводит к цифре 1000 млн.лет тому назад (табл.6) .

Надеясь получить дополнительную информацию об эволюции изоформ каталитической субъединицы Ыа,К-АТ1азы мы провел] анализ эволюционных замен в отдельных структурных элемента: белка. Для этого все анализируемые последовательности был] разделены на фрагменты в соответствии с экзонным строение! гена а1р1та111-изоформы каталитической субъединицы. В связи < тем, что длина первого экзона сильно варьирует у разных изоформ, расчеты вели для первого и второго экзонов вместе. Полученные 22 матрицы подвергали кластерному анализу, как и 1 случае целого белка.

Рассмотрение 22 дендрограмм показывает, что они достаточно четко могут быть разделены на 3 группы. 1-ая включае' наиболее консервативные экзоны 9, 14, 16 и 23, для которы

о(Ш сШ1 оС

ы.

I I ____1__

0.9705

0.9500

0.9296

0.9091

0.8886

0,8501

0.8476 0.8374-4-

Рис.8. Эволюционное дерево семейства а-субъединиц Ыа,К-АТФазы, полученное на основании данных по сходству молекул целого белка.

ЫГ оШ1 <1

сап ы.

1.0

0,9957

0.9913

0.9870

0,9826

0.9783

0.9739

056960,9674 -I—

.и I- I-

о

I

Рис.9. Эволюционное дерево семейства белков а-субъединицы Ма,К-АТФазы, полученное на основании данных по сходству фрагментов, соответствующих экзону 23.

(консервативный экаон)

- 32 -

Таблица 6. Скорость эволюционных замен аминокислот в а1рЬа-субъединицах из различных источников (каа-10^сайт/год). Число аминокислотных замен (п) дано в сравнении с а1рЬа-субъеди-ницей человека. Каа-среднее число аминокислотных замен/пару гомологичных сайтов, Каа— 2,31е(1-р<1), р<3-доля аминокислотных различий. каа-Каа/(2Т)

-9

белок п Каа Т(млн) каа«<0 Т(млн) лет

лет вычисл

а1р1та-скат 136 0.146 400 0.18

alpha-цыпленок 87 0.090 300 0.15

alpha-крыса 34 0.034 75 0. 23

alpha-овца 29 0.029 70 0.21

alpha-свинья 15 0.015 60 0.13

alphal11-

человек 145 0.157 — —

alphal II-

человек/

alphalII-

крыса 9 0.0089 75 0.06

Таблица 7. Скорость эволюционных замен аминокислот для различных белков.

белок -к»109/год

ао.

alpha глобин 1. 20

миоглобин 0. 89

beta-субъединица Ыа.К-АТФазы 0. 51

инсулин А и В цепи 0. 44

цитохром С 0. 30

alpha-субъединица Na,К-ATФазы 0. 18

alphalII-изоформа Na,К-АТФазы 0. 06

гистон Е4 0. 01

alpha тубулин 0. 01

- 33 -

коэффициент сходства (расстояние Хеммингса) изменяется в очень узких пределах, 1.0-0.9. Поскольку в эту группу, входят наиболее зволюционно устойчивые структуры, для которых должны существовать ограничения на аминокислотные замены, то ясно, что из этих данных трудно извлечь какую-либо информацию о времени расхождения изоформ (рис.9). 2-ая группа наиболее обширна и включает экзоны с промежуточной вариабельностью, расстояния Хеммингса в этой группе варьируют в пределах 1.0-0.7. Эволюционная изменчивость этих доменов белка протекает, очевидно, при меньших ограничениях и поэтому по картинам сходства (имеются в виду дендрограммы) они занимают промежуточное положение между наиболее консервативными доменами и наиболее вариабельными. В результате эволюционные деревья для доменов этой группы (экзоны ) дают усредненную картину, практически не отличающуюся от. картины полученной для целого белка.

В 3-ю группу входят наиболее вариабельные экзоны 1-2,3 и 10, расстояния Хеммингса варьируют здесь в очень широких

<л * <* с( <* л <** сШ1

0.9792- —* Р 1-, |

0,9135-

0.8478 0,7821

0.7164

0,6507 0.5851

Ж

Рис. 10 Эволюционное дерево семейства белков -субъединицы На.К-АТФазы, полученное на основании данных по сходству фрагментов, соответствующих вариабельным зкзонам (1,2,3 И 10).

-34-

пределах, 1.0-0.3. Это означает, что с эволюционной точки зрения эта шкала оказывается наиболее чувствительной для изучения эволюционных событий. Усредненная дендрограмма для этих экзонов приведена на рис. 10. Картина для этих экзонов отличается от таковой для целого белка. Основное отличие касается времени образования изоформ. Судя по эволюции этих экзонов, изоформы образовались до расхождения рыб и млекопитающих, то есть раньше, чем 400 млн. лет тому назад. Таким образом, эти результаты не противоречат оценкам времени образования изоформ, полученным выше из скоростей эволюции.

Таким образом, результаты данного исследования позволяют оценить время образования изоформ каталитической субъединицы. Имеющиеся данные дают возможность высказать предположение о большей эволюционной устойчивости

а1р1таШ-изоформы по сравнению с а1р1-1а1-изоформой каталитической субъединицы (табл.7). Можно предполагать, что эта эволюционная устойчивость а1р1та1 II-изоформы отражает неизвестные пока структурные или функциональные свойства этога белка.

Проведенный анализ эволюционных изменений каталитической субъединицы Иа.К-АТФазы подтверждает один из основных постулатов теории нейтральности Кимуры о постоянстве темпа молекулярной эволюции в различных родословных данного белка (при отсутствии ограничений на функциональные замены). Действительно, скорости эволюционных замен для а1р1та1-субъединиц одинаковы на всем изученном отрезке времени (табл.7).

Второй постулат теории нейтральности:" Функционально менее важные молекулы или их части эволюционируют относительно быстрее, чем более важные", нашел практическое применение в данной работе. Анализ эволюции отдельных экзонов а1р1та-субъединицы На,К-АТФазы показал, что наибольшую информацию об эволюционной истории белка можно получить, изучая его наиболее вариабельные компоненты.

- 35 -

ГЛАВА 4. ТКАНЕСПЕЦИФИЧНОСТЬ ЭКСПРЕССИИ ИЗОЮРМ КАТАЛИТИЧЕСКОЙ СУЕЬЕДИНИЦЫ Na.K-АТФазы. 4.1 Наличие ген-специфических проб для каждой изоформы позволило начать работы по изучению их экспрессии в тканях человека. Следует отметить, что тканеспецифическое распределение alphal- и alphall-форм Ыа.К-АТФазы было показано раньше. В почках преимущественно обнаруживали alphal-форму, а в мозге смесь alphal- и alphalI-форм. С помощью специфических антител alphal-форма обнаружена в астроцитах и немиелинизированных волокнах, a alphall - в основном в миелинизированных волокнах. Однако, открытие третьей формы каталитической субъединицы с неизвестными функциями осложнило интерпретацию данных, полученных ,иммунохимическими методами. Поэтому использование методов блот-гибридизации мРНК с ген-специфическими пробами является пока наиболее простым и информативным.

На основании данных о первичной структуре генов alphal и alphaIII-изоформ Na.K-АТФазы человека были синтезированы олигонуклеотидные зонды, комплементарные соответствующим мРНК в участках их наименьшей гомологии. Структура олигонуклеоти-дов приведена в табл.8

пептид Lys Gly Val Gly Arg Asp Lys Туг G(lu)

alphal-мРНК 5- AAG GGG GUU GGA CGU GAU AAG UAU G -3; ЗОНД 5- С ATA CTT АТС ACG ТСС ААС ССС СТТ -3'

пептид Asp Lys Lys Asp Asp Lys Asp Ser P(ro)

alpha3-MPHK 5- GAC AAG AAA GAU GAC AAG GAC UCA С -3 ' зонд 5- G TGA GTC CTT GTC АТС TTT CTT GTC -3'

Таблица 8. Структура олигонуклеотидных зондов, специфичных к двум генам семейства alpha-суб-ъединицы Na.K-АТФазы человека. Оба зонда соответствуют ■ областям мРНК, кодирующим пептиды 3-11 в координатах alpha-субъедйницы Na.K-АТФазы из почек свиньи.

Зонды были синтезированы в нашей лаборатории ЕЯРос-тапшовым, И. П. Черновым и Т. Л. Ажикиной.

Для изучения экспрессии генов alpha-субъединицы мРНК, выделенную из различных тканей, подвергали электрофорезу в

- 36 -

денатурирующих условиях в 1.5Х агарозном геле, переносили на нейлоновую мембрану и гибридизовали с олигонуклеотидным зондом. Интенсивность - сигналов гибридизации определяли количественно с помощью сканирования на лазерном денситометре. После радиоавтографии фильтр отмывали от радиоактивной пробы и гибридизовали со следующим зондом. Для контроля за количеством мРНК,нанесенной на каждую дорожку, все фильтры гибридизовали с пробой на актин, поскольку известно, что количество актиновой мРНК в различных тканях относительно постоянно.

В предварительных опытах мы проверили воспроизводимость выделения мРНК из одной и той же ткани, а также отсутствие межиндивидуальных различий в почечной и мозговой ткани при гибридизации с зондом, специфичным к а1рЬаШ-форме каталитической субъединицы. Следует особо подчеркнуть, что на первом этапе работы образцы тканей были получены от больных, преимущественно пожилого возраста. На 4 образцах почечной и 3 образцах мозговой ткани были получены сходные результаты при гибридизации.с а1р1таЗ-зондом. На основании этих данных был сделан вывод о воспроизводимости метода выделения РНК и об отсутствии межиндивидуальных различий в экспрессии гена а1р1таЗ по крайней мере в этих тканях.

Результаты гибридизации мРНК из различных тканей человека с пробами на а1р1та1- и а1р1та111-формы каталитическое субъединицы Ыа.К-АТФазы приведены на рис.11. Оба зонда выявляют одну полосу гибридизации примерно одного и того же размера (3.7 тыс. п. о.).однако интенсивности полос гибридизации для разных зондов на одной и той же ткани различаются, что позволяет считать, что зонды не дают перекрестной гибридизации.

Полученные результаты свидетельствуют, что экспрессия генов а1рЬа1- и а1рЬа1I1-изоформ осуществляется тканеспеци-фично. мРНК а1рЬа1-формы в наибольшем количестве обнаруживается в почках и щитовидной железе, в меньших количествах она обнаруживается в мозге и практически не видна в печени. Эти результаты согласуются с литературными данными по активности Ыа,К-АТ<1азы в тканях млекопитающих. Известно, что почки является тканью наиболее богатой АТССазой, а печень содержит ее на два порядка меньше. Высокое содержание а1рЬаI-субъединиць

- 37 -

3 ч

Рис.11. Результаты гибридизации poly(А )-РНК из различных тканей человека с олигонуклеотидными зондами, комплементарными а (А) и аШ (Б) изоформам а субъединицы Яа,К-АТФазы, I-почка, 2-мозг, 3-щитовидная железа, 4-печень. Стрелками указаны положения 28S и 18S рибосомальных РНК. (В)-гибридизация с актиновой пробой.

- 38 -

Иа.К-АТФазы в щитовидной железе , вероятно, связано с интенсивным транспортом иода, который сопряжен с расходованием АТФ, выбросом ионов Ыа и поступлением ионов К в клетки щитовидной железы, что указывает на связь транспорта иода с активностью АТФазы. Количество а1рЬаЗ-мРНК убывает в ряду почка мозг щитовидная железа печень. Эти результаты вызывают особый интерес, поскольку о существовании этой изоформы раньше не было известно, и, свойства ее не изучены. Выявление ткани с высоким содержанием а1рЬа1II-изоформы позволяет начать выделение этого белка для исследования его характеристик.

Наши результаты по экспрессии а1р1та1- и а1р1та111-изо-форм каталитической субъединицы в тканях человека интересно сопоставить с аналогичными работами, проведенными на тканях других млекопитающих. Большая часть подобных работ была проведена на тканях крыс. В обоих случаях (ткани человека и крысы) получены сходные результаты. Единственное расхождение касается соотношения экспрессии а1рЬа1II-изоформы в почках и мозге. У крысы наибольшая экспрессия этого гена обнаружена в мозге, в то время как у человека - в почках. Как уже упоминалось выше, первые опыты по изучению экспрессии а1рЬаЗ-гена в тканях человека были поставлены на препаратах, полученных от больных пожилого возраста (возраст и диагнозы даны в подписях к рисункам). Для выяснения причин расхождений мы получили препараты почек и мозга двух индивидов, погибших в результате несчастного случая. И в первом, и во втором случае экспрессия а1рЬаЗ-гена в мозге была выше, чем в почках (рис.12). В связи с этим встал вопрос, чем объясняется изменение соотношения экспрессии гена а1р1таЗ почка/мозг при сравнении здоровых и больных: уменьшением экспрессии а1р!таЗ в мозге больных или увеличением у них экспрессии а1р11аЗ в почках, или тем и другим вместе? Имеющиеся в настоящий момент данные не позволяют четко ответить на этот вопрос. Сопоставление экспрессии а1рЬаШ-формы в почках и мозге больных и здоровых с соответствующими величинами для а1р1ча1-формы (рис.42) позволяет считать, что наиболее вероятным является уменьшение у больных экспрессии а1рЬаЗ в мозге при сохранении уровня экспрессии его в почках. Одна-

ос Ш ЩШ

165

235 185

1 1

18 5 актам 165

285

165

" -Л'-"'-- Г"'.-«-,

■103

Рис.12 Сравнение уровня экспрессии аШ-изоформы каталитической субъединицы Иа,К-АТФазы в почках и мозге различных индивидов.

А- почки (1) и мозг (2), женск., 72 г. ишемическая болезнь сердца.

Б- почки (1) и мозг (2) мужск.,48 л.»внезапная смерть, аналогичная картина была получена при анализе почек и мозга, мужск., 15 л., автокатастрофа.

- 40 -

ко, этот вопрос требует более детального изучения и накопления статистически достоверного материала. 4.2. ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ alpha-СУЕЪЕДИНИЦЫ Na,К-ATФазы в ПРОЦЕССЕ ПОСТНАТАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ.

Наличие ген-специфических проб позволило начать работы по изучению экспрессии изоформ каталитической субъединицы в процессе развития. Результаты показывают (рис.13 и 14 )гчто at прессия alphal- и alphalII-изоформ увеличивается в процессе постнатального развития мозговой и почечной ткани человека. Количество мРНК обеих изоформ в детской и взрослой мозговой и почечной ткани выше, чем в.соответствующих эмбриональных тканях. Эти результаты согласуются с известными литературными данными о том, что активность Na,К-АТФазы увеличивается при постнатальном развитии. Такие результаты были получены, например, на подчелюстных железах крыс и на гиппокампе кролика. Данные, полученные на сердце хорька, говорят об изменении уабаин-связывающих характеристик Na,К-АТФазы в процессе постнатального развития сердца, что, очевидно, является следствием изменения экспрессии изоформ каталитической субъединицы. Аналогичные результаты были получены иммунохимичес-кими методами на желудочках сердца крыс.

Таким образом, совокупность этих данных свидетельствует в пользу изменений экспрессии изоформ каталитической субъединицы в ходе постнатального развития. Применение в нашей работе ген-специфических проб позволило дифференцированно исследовать экспрессию alphal- и alphalII-изоформ в процессе индивидуального развития мозговой и почечной ткани и показало увеличение экспрессии обеих изоформ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Обнаружение различных изоформ каталитической субъединицы Na,К-АТФазы и семейства генов, кодирующих гомологичные белки, среди которых могут быть и новые йзоформы, ставит вопрос о функциональной роли этих изоформ. Вопрос приобретает еще больший интерес в связи с тканеспецифичностью экспрессии и изменением их экспрессии в ходе онтогенеза. Определенным ключом к пониманию роли изоформ может быть их различная чувствительность к сердечным гликозидам. Если представить себе, что йзоформы каталитической субъединицы обладают одинаковой специфичностью к одновалентным катионам, но раз-

12 3 4-

28s

Ï8s

1 2

HvV.

«МЭД. ••

28s

'Su'

•16s

18s

Рис.13. Результаты гибридизационного анализа экспрессии генов, кодирующих allí (А) и а-изоформы (Б) Na,K-AT4>a3bi -человека в почечных тканях. 1 - эмбриональная почка, 2,3 - детская почка, 4 - взрослая почка,. В - гибридизация с актиновой пробой. Стрелками указаны положения 28S и 18S рибосомальных РНК. -

1

4

- ' ' . 13s 1 2 3 f

Рис.14 Результаты гибридизационного анализа экспрессии генов кодирующих allí(А) и а(Б)-изоформы Na/K-АТФазы человека в мозговых тканях. 1 - мозг эмбриональный, 2,3 - мозг детский 4 - мозг взрослый. В - гибридизация с актиновой пробой. Стрелками указаны положения 28S и 18S рибосомальных РНК.

- 43 -

личаются другими характеристиками, то клетки с различным содержанием изоформ, будут по-разному реагировать на изменения внутри- и внеклеточной среды. Существование эндогенных ингибиторов ЫаД-АТФазы показано несколькими группами, однако в роли потенциальных регуляторов, вероятно, могут выступать многие лиганды. Необходимым этапом для проверки этих гипотетических представлений является изучение характеристик каждой изоформы каталитической субъединицы. В настоящий момент наличие структурных генов каждой изоформы дает возможность использовать их для получения соответствующих белков и исследования их свойств.

Таким образом, обнаружение семейства генов каталитической субъединицы Ыа.К-АТФазы в геноме человека открывает новый этап в исследованиях этого фермента. На сегодняшнем уровне наших представлений и методических приемов стали реальностью работы, невозможные еще пять лет тому назад. Основным направлением исследований на следующем этапе будет, по-видимому, выяснение механизмов тканеспецифической экспрессии различных изоформ каталитической субъединицы, а также изучение физиологической роли изоформ. Важность этих исследований несомненна как с теоретической, так и с практической точек зрения. Наши предварительные данные об изме-аднии.экспрессии изоформ у больных и здоровых индивидов юзволяют надеяться на возможность установления связи между татологиями определенного типа и функционированием отдельных изоформ. Наибольшее внимание с этой точки зрения прив-текают сердечно-сосудистые и психо-неврологические заболе-зания.

ВЫВОДЫ

1. В геноме человека обнаружено семейство родственных ге-юв, гомологичных гену каталитической субъединицы Ыа,К-АТФа-¡ы. Семейство содержит не менее пяти различных генов, имеющих ¡ходное экзон-интронное строение,уровень гомологии экзонных гчастков составляет 74-86%.

2. Среди выявленных генов идентифицированы те, которые ко-[ируют известные изоформы каталитической субъединицы Ыа,К-АТ-&зы (а1рЬа1 и а1р1ча11), другие гены могут кодировать неиз-¡естные до сих пор изоформы, или иные ион-транспортирующие ЛФазы Е1Е2-типа. Так, в этом семействе обнаружен ген Н.К-АТ-&зы.

- 44 -

3.1 Выделен ген неизвестной ранее alphal I I-изоформы каталитической субъединицы. Ген размером около 35 тыс. п. о. состоит из .23 экзонов, разделенных 22 интронами. Общий план строения гена alphalII-изоформы является характерным для большей части эукариотических генов: размеры зкзснов варьируют в пределах 60-269 п. о., в то время как интроны сильно различаются по длине, от 70 п. о. до 6-8 тыс. п. о. Структура 5- и 3-сплайс сайтов совпадает с консенсусной последовательностью, описанной в литературе.

3.2 Экзон-интронная структура гена alphal I I-изоформы каталитической субъединицы коррелирует с предполагаемой трансмембранной организацией белка и его вторичной структурой в цитоплазматической области. Это находит свое отражение в отсутствии интронов в участках генов, кодирующих трансмембранные домены, и в расположении интронов в участках, соответствующих неструктурированным областям полипептидной цепи в цитоплазматической области. Таким образом, особенности распределения интронов в пределах гена в основном отражают доменную структуру белка

4.1 На основании анализа кДНК библиотек продукты транскрипции генов alphal- и alphalII-изоформ каталитической субъединицы обнаружены в мозге человека Эти данные подтверждены методом Northern-гибридизации и показано, что гены alphal- и alphalII-изоформ каталитической субъединицы экс-прессируются тканеспецифично в различных тканях человека Наибольшее количество alphal-формы найдено в почках и щитовидной железе, alphalII-изоформа обнаружена в больших количествах в почках и мозге.

4.2 Экспрессия обеих изоформ каталитической субъединицы увеличивается в ходе постнатального развития мозговой и почечной ткани.

5.1 Анализ эволюционной истории семейства генов каталитической субъединицы свидетельствует об образовании изоформ из общэго предшественника более 400 млн. лет тому назад. Применение кластерного анализа аминокислотных замен в отдельных струи турных элементах белка (экзонах) показало, что наибольшую информацию об эволюционной истории белка можно получить изучая его компоненты, для которых отсутствуют ограничения на замены. Применительно, к семейству генов alpha-субъединицы Na,К-АТ-

Фазы самым информативным оказывается анализ Ы-концевых фрагментов. "

5.2 Сопоставление скоростей эволюции а1р1та1- и а1рЬа111-изоформ между собой, а также со скоростью эволюции других белков показывает высокую эволюционную устойчивость а1рЬа1-формы и исключительную устойчивость а1р1та111-формы. Можно предполагать, что эта особая устойчивость отражает важную структурную или функциональную роль этого белка.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. Петрухин К. Е. .Броуде а Е., Арсенян С. Г., Гришин А. В., Джанджугазян К Е, Модянов Е Е

Первичная структура а1р!та-субъединицы Ма.К-АТФазы. • Выделение, обратная транскрипция и клонирование матричной РНК. Биоорган, химия 1987,11,N12,1607-1613.

2. Броуде Е Е., Монастырская Г. С., Петрухин К Е., Гришин А. В., Кияткин Е И., Мелков А. М., Смирнов Е К , Свердлов В. Е., Малышев ЕВ., Модянов Е Е

Первичная структура Ье1а-субъединицы На,К-АТФазы почек свиньи. Обратная транскрипция, клонирование мРНК, определение полной нуклеотидной последовательности структурной части гена Биоорган, химия 1987, 13, N1, 14-19.

3. Монастырская Г. С., Броуде Е Е., Мелков А. М., Смирнов Е К , Малышев И. К , Арсенян С. Г., Саломатина И. С., Свердлов В. Е., Гришин А. В., Петрухин К. Е., Модянов Е Е Первичная структура а1р1та-субъединицы Na,K-ATФaзы почек свиньи. III. Определение полной нуклеотидной последовательности, соответствующей структурной части гена Биоорган, химия, 1987,13, N1, 20-26.

4. Овчинников К1 А. , Арсенян С. Г., Броуде Е Е., Петрухин К Е. , Гришин А. В., Алданова Е'А., Арзамазова Е М., Аристархова

Е. А., Мелков А. II-, Смирнов XI. В., Гурьев С. О., Монастырская Г..С., Мэдянов ЕЕ

Нуклеотидная последовательность кДНК и первичная структура а1рЬа-субъединицы На,К-АТФазы почек свиньи. Докл. АН СССР, 1985,25,N6,149Щ-1495.

- 46 -

5. Ovchinnikov Yu. A., Modyanov N. N., Broude N. E., Petrukhin К. E., Grishin A. V., Arzamazova N. M., Aldanova N. A., Monastyrskaya a S., Sverdlov E. D.

Pig kidney Na,K-ATPase. Primary structure and spatial organization. FEBS Lett.1986, 201, N2, 237-245.

6. Овчинников Ю. A., Монастырская Г. С., Броуде ЕЕ., Алликметс P. JL , Ушкарев Ю. А., Долганов Г. It, Мелков A.M.-, Смирнов Е R, Акопьянц Е С., Дулубова И. Е., Мэдянов Е Е, Свердлов Е. Д. Гены Na.K-АТФазы человека. Нуклеотидная последовательность, кодирующая С-концевую область alpha-субъединицы. Докл. АН СССР, 1986,287, N5, 1251-1254.

7. Ovchinnikov Yu. A., Monastyrskaya G. S., Broude N. E., Allik-mets R. L., Ushkaryov Yu. A. , Melkov A. M., Smirnov Yu. V., Malyshev I.V., Dulubova I.E., Petrukhin K.E., Gryshin A. V., Sverdlov V.E., Kiyatkin N. I., Kostina M.B., Modyanov N.N. , Sverdlov E. D.

The family of human Na,K-ATPase genes. A partial nucleotide sequence related to the alpha-subunit. FEBS Lett. 1987,213, 73-78.

8. Sverdlov E. D., Monastyrskaya G. S., Broude N. E., Ushkaryov Yu. A., Allikmets R.L., Melkov A. M., Smirnov Yu. V., Malyshev I.V., Dulubova I.E., Petrukhin K.E., Grishin A.V., Kiyatkin N. I.,. Köstina M.., Sverdlov V.., Modyanov N. N., Ovchinnikov Yu. A.

The family of human Na,K-ATPase genes. No less then five genes and/or pseudogenes related to the alpha-subunit. FEBS Lett. 1987, 217, 275-278.

9. Matveeva N. M., Khlebodarova Т. M., Karasik G. I., Rubtsov N. B. ,Serov 0. L. , Sverdlov E. D., Broude N. E., Modyanov N. N., Monastyrskaya aS., Ovchinnikov Yu. A. Chromosomal lokalization of the.gene coding for alpha-subunit of Na,K-ATPase in the American mink (Mustela vison). FEBS Lett.197,217,42-44.

10. Sverdlov E. D., Broude N. E., Sverdlov ,V. E., Monastyrskaya as., Grishin A. V., Petrukhin K.., Akopyanz N. S., Modyanov N. N., Ovchinnikov Yu. A.

Family of Na,K-ATPase genes. FEBS Lett. 1987,221,129-133.

11. Свердлов Е. Д., Петрухин К.Ё., Акопьянц ЕС., Броуде ЕЕ., Монастырская Г. С., Гришин A. R, Модянов ЕЕ Дифференциальная экспрессия двух генов alpha-субъединицы Na,К-ATФазы в нормальных и опухолевых тканях человека. Докл. АН СССР, 1988,298, N1, 236-239.

12. Свердлов Е. Д, Монастырская Г. С., Броуде Е Е. , Ушкарев Ю. А., Мелков А. М., Смирнов Е В., Малышев И. В., Аллик-метс P. JL , Костина М. В., Дулубова И. Е., Кияткин Е И., Гришин А. В., Мадянов Е Е, Овчинников KL А.

Семейство генов Ыа,К-АТФазы человека Структура гена изоформы alphalII. Докл. АН СССР,1987, 297,N6, 1488-1494.

13. Ovchinnikov Yu. А., Monastyrskaya a S., Broude N. Е., Ushkaryov Yu. А., Melkov А. М., Smirnov Yu. V., Malyshev

I. V., Allikirets R. L. , KostinaM.., Dulubova I.., Kiyat-kin N. I., Grishin A.V., Modyanov N.N., Sverdlov E. D. Family of human Na,K-ATPase genes. Structure of the gene for the catalytic subunlt (alphalII-form) and its relationship with structural features of the protein. FEBS Lett. 1988,233,87-94.

14. Sverdlov E. D. , Akopyanz N. S. , Petrukhin К. E. , Broude N. E., Monastyrskaya G. S., Modyanov N. N.

Na,K-ATPase: tissue-specific expression of genes coding for alpha-subunit in diverse human tissues. FEBS Lett. 1988, 239, 65-68.

15. Khlebodarova. Т. M., Karasik G. I., Lapteva S. E., Matveeva N. M., Serov 0. L., Sverdlov E. D. , Broude N. E. , Modyanov N. N., Monastyrskaya G. S. ■

Chromosomal localization of the gene coding for the beta-subunit of Na,K-ATPase of the American mink (Mus-tela vison). FEBS Lett. 1988,236,240-242.

16. Petrukhin К. E. , Broude N. E. , Smith C. L.

A simple and efficient method for isolating high molecular weight DNA from mammalian tissues. Nucl. Acids Res. 1988,16,5698. L7. Broude N. E. , Sverdlov e7d. , Ovchinnikov Yu. A. The family of human Na,K-ATPase genes. Abstracts of YII German-Soviet Symposium "Organization and Function of Eucariotic Genome",Heidelberg, 1987,p5-6. L8. Broude N. E., Modyanov N. N., Arzamazova N. M., Aristarcho-va E. A. , Arsenyan S. G., Grlsn:n A.V., Monastyrskaya G.S.

Primary structure of Na,K-ATPase. "Biological membranes.. Structure and functions". Abstracts of the IY soviet-swiss symposium, 1986,p28.

19. Broude N.E., Modyanov N. N., Monastyrskaya G. S., Sverd-lov E. D.

Na,K-ATPase. From the protein to the gene and back. FEBS Lett. 1989, in press.

20. Броуде E E., Модянов E E, Серов О. Л, Свердлов E. Д. Семейство генов Na,К-АТФазы. Тезисы Y советско-швейцарского симпозиума "Биологические мембраны. Структура и функции",Рига, 1988, стр.13.

21. Свердлов Е. Д., Бессараб Д. А., Малышев И. В., Смирнов КХ R , Монастырская Г. С., Броуде ЕЕ , Модянов ЕЕ Структура потенциальной регуляторной области гена из семейства генов alpha-субъединицы Na,К-АТФазы человека. Докл. АН СССР, 1989,305, N4,

22. Броуде Е Е., Модянов Е Е , Монастырская Г. С., Свердлов Е. J. Современное состояние молекулярно-генетических исследований Na,К-АТФазы человека. Биологические мембраны, 1989, в печати.

23. Modyanov N. N., Arystarkhova Е. А., Gevondyan N. М., Аг-zamazova N. М., Efremov R. G., Nabiev I. R., Broude N. E., Monastyrskaya.G. S., Sverdlov E. D.

Sodium pump. Current view on structural organization, in Molecular Basis of Biomembrane Transport (eds. Pal-mieri F. .Quagliariello E.) 1988, Elsevier, Amsterdam, NewYork, Oxford, p. 229-237.

24. Sverdlov E. D., Bessarab D. A. .Malyshev 1. V., Petrukhin К. E., Smirnov Yu. V., Ushkaryov u. A. , Monastyrskaya G. s., Broude N. E., Modyanov N. N.

Family of human Na,K-ATPase genes. Structure of putative regulatory region of the alpha+-gene. FEBS Lett. 1989,244, • 481-483.

Сдано в набор 17.07.S9 Подписано в печать 30.06.89 Т- 13269

Формат 60 х SO 1/16 Бум.офс.. Печать офсетная

Усл.деч.п.3,0 Усзиф.-отт. 3,12 Уч.-издл- 2,53

Tip. 100 »кз. Зак. 5384

Пронзасюстведио-плптапьсшД комбинат ВИНИТИ 140010, Люберцы 10, Мосювсхо 11 обл., ОктябрьсквЯ проспект. 403