Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экпрессия генов альфа-субъединицы Na+, K+ -АТФазы в различных органах и тканях человека

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Экпрессия генов альфа-субъединицы Na+, K+ -АТФазы в различных органах и тканях человека"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ имени М. М. ШЕМЯКИНА

На правах рукописи

АКОПЬЯНЦ. Наталия Сергеевна

УДК 577.152.361*3:577.113.5 577.1

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ а-СУБЪЕДИНИЦЫ Ыа+, К+-АТФазы В РАЗЛИЧНЫХ ОРГАНАХ И ТКАНЯХ ЧЕЛОВЕКА

03.00.03 — Молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА — 1988

Работа выполнена в ордена Трудового Красного Знамени Институте биоорганической химии имени М. М. Шемякина Академии наук СССР

Научный руководитель — член-корреспондент АН СССР, профессор Е. Д. Свердлов

Официальные оппоненты — доктор биологических наук Е. М. Луканидин

кандидат биологических наук А. Р. Ибрагимов

Ведущая организация — Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Минмедмнкробиопрома.

заседании Специализированного совета Д 002.35.01 при Институте биоорганической химии им. М. М. Шемякина АН СССР по адресу: 117871, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина АН СССР.

Защита состоится «

1988 г. в

'Ю

час. на

Автореферат разослан «

11, 1988 г

Ученый секретарь Специализированного совета ИБХ АН СССР кандидат химических наук

В. А. Несмеянов

Салон. Моск. тип. № 4. Цветной бульвар, 26.

Т—14231. 04.07.88.

Зак. 9313.

Тир. 100.

' • ' ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. На+,к+-А'ЕБаза плазматических мембран ¡-■живогншЬ обеспечивает постоянство ионного состава внутриклеточной среда. Этот фермент присутствует во всех животных клетках и осуществляет транспорт ионов Ка+ и к+ против их концентрационных градиентов за счет энергии гидролиза АТФ, Иа+,к+-АТФаза является мишенью действия сердечных гликозидов.

Биохимические исследования последних лег на белковом уровне показали наличие двух изоформ для сС субъединицы На+,К^АТФазы -оС и сС+, сушественно различающихся тканевой специфичностью, чувствительностью к сердечным гликозидам и некоторыми другими характеристиками. Применение техники молекулярного клонирования.позволило установить существование трех высокогомологичных мРНК, две из которых кодируют оС и оС+ изоформы белка, а третья содержит открытую рамку считывания для белка выоокогомологачного первым двум. Этот гипотетический белок получил название еСШ изоформн. Работами нашего Института в геномном банке человека было установлено наличие не менее 5 генов, гомологичных гену оС субъединицы На+,к+-Атаазы. В связи о этим возник вопроо о функциональней значении кавдого из этих генов и о тканеспецифической экспрессии их. Исследование этих вопросов необходимо для более полного изучения механизмов функционирования На+,к+-АТФазы человека.

Цель работы. Данная работа проводилась.в.рамках осуществляемых в Инотитуте биоорганической химии им. М.М.Шемякина АН СССР комплексных структурно-функциональных исследований ив+,к+-А1Фазы человека. Настоящая работа представляет собой один из этапов изучения экспрессии генов На+,к+-АТФазы человека и посвящена изучению экспрессии двух генов ©С .субъединицы Иа+,к+-А1Фазы в различных органах и тканях человека. В связи о этим в данной работе были по-

ставлены оледукше задачи:

1. Получить препараты poly(A+)-PHK из различных органов и тканей человека.

2. Получить и проанализировать банк кДНК из мозга человека.

3. Сравнить экоцрессию двух генов оС оубъединивд На+,К+-АТФазы в различных нормальных и опухолевых тканях человека.

Научная новизна и практическая ценность работы. В результате проделанной работы в банке кЦНК из мозга человека обнаружены транокрипты двух генов, кодирующих две из оформи (оСи сСШ) каталитической субъединицы Иа+,к+-АТФазы. Установлено, что экспрессия генов, кодирующих оС и сСШ изофорш оС субъединицы На+,к+-АТФазы, регулируется тканеспецифично. Показано, что содержание оСШ-мРНК наиболее велико в почках. Это позволило начать работу по выделению и изучению этой формы каталитической субъединицы На+,к+-АТФазы методами белковой химии. Экспрессия двух генов оубъединиш уменьшается в опухолевых тканях почки по сравнению о нормальной почечной тканью. Установлено, что экопреосия генов, кодирующих оСШ и.«С изоформы Нв+,к+-АТФазы человека, регулируется в онтогенезе,

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. Получение ро1у(А*)-ШК из различных органов и тканей человека

Известно, что оС субъединица Яа+,к+-А1Фазы содержит около 1000 аминокислотных оотагков и, следовательно, кодирующая ее мРНК имеет не менее 3000 нуклеотидных звеньев. Выделение таких высокомолекулярных мРНК связано о необходимостью эффективного ингибиро-вания внутриклеточных рибонуклеаз.В литературе описано много опо-ообов выделения мРНК. Выбор тех или иных методик диктуетоя характером предпринимаемых исследований и свойствами используемого био-

логического материала. Для выделения оуммаряой РНК из тканей наиболее чаото используются методы, оонованные на применении оиль-ного хаотропного агента - гуанидинизотиоционата, быстро денатуря-рушего эндогенные рибонуклеазы. Этот наиболее универсальный метод для различных тканей был применен в данной работе. При элект-рофоретическом анализе выделенной клеточной РНК были отчетливо видны полооы 283 и 18S рибоссмальных РНК, что свидетельствовало об отсутствии деградации РНК во время.ее выделения.

Для получения ро1у(А+)-мИК проводили 2 цикла аффинной хроматографии на oligo(dT)-целлюлозе. В ореднем выделенная poiy(A+)~ РНК о оставляла I-I,Ъ% от исходной клеточной РНК и содержала некоторое количество 28S и 18S рибооомальной РНК, оохраянооть которой говорила od отсутствии деградации во время хроматографии. В табл.1 приведены результаты экспериментов по выделению сушарной клеточной РНК и фракций poly(A.+)-PHK из различных тканей человека.

Из табл. I оледует, что наибольшее количество оушарной клеточной РНК на I г образца - 1,9 мг было выделено из таких тканей как почка эмбриональная, рак почки, опухоль Вильмоа, тогда как из почки взроолой, мозга дегокого и мозга взроолого выход тотальной РНК на I г ткани соотавлял от 0,34 до 0,53 мг,

2. Получение банка кДНК из мозга человека*

Дяя изучения уровня экспрессии того или иного гена обычно иопользуютоя 2 различных подхода. Это либо метод, оонованный на получении и анализе кЛЩК банков, либо метод гибридизации юмоби-лизованной РНК, выделенной из различных тканей, о клонированным фрагментом структурного гена. В данной работе для решения поставленных задач были использованы оба метода;

* Работа по получению и окринингу банка проведена оовмеотно о Ароеняном С.г., Алинкметсом Р.л. я Гришиным A.B.

Таблица I. Результаты экспериментов по выделению суммарной клеточной Ш( и poly(A+)-FHK из различных тканей человека

I. Почка взроолая 5 0,53±0,20 1,8±0,4

2. Почка детская 2 О,92±0,18 1,7±0,1

3. Почка эмбриональная 2 1,80±0,Ю 1,4±0,2

4. Рак почки 2 1;эо±о,ю 1,0±0,1

5. Опухоль Вильмоа I 1,90 0,8 '

6. Мозг взрослый 10 0,34±0;15 1,6±0,4

7. Мозг детский 2 0,53±0,Ю 2,0±0,4

8. Мозг эмбриональный 4 0,98±0,20 1,0±0,1

9. Щитовидная железа 2 1,40±0,65 1,0±0;2

10. Печень 2 1,68±0,30 0,9±0,1

Для получения банка кДНК была попользована poly(A+)-FHK из мозга человека. Ферментативный синтез двухцепочечной кЩЖ на матрице poly(A+)-EHK является одним из основных методов молекулярного клонирования структурных генов эукариотичеоких белков и включает в оебя 2 arana:

1. Синтез I цепи кДНК о помощью обратной транскрштазы (РНК-зависимой ДНК-полимеразы).

2. Синтез второй.цепи кДНК ДНК-полиыераэ ой I (синтез затрав-лялоя фрагментами РНК, образованными после обработки гибрида РНК-первая цепь кДНК РНКазой Н).

Основным критерием при подборе условий реакции оинтеза первой цепи является синтез достаточно длинных транскриптов. Наиболее оушеотвенным фактором при синтезе кДНК являетоя качество обратной гранокриптазы, иопользуемой в реакции. В результате анали-

тичеоких экспериментов были подобраны условия, при которых эффективность синтеза.первой цепи составляла примерно 305? от количества исходной мРНС. Синтез первой цепи проводили о помощью затравки о11во(<1Т)12_18. Было показано наличие гранокриптов, соответствующих размерам матрицы. Синтез второй цепи кЦНК проводили о помощью ДНК-полимеразы I и РНКазы Н. Б наших экспериментах оинтез второй цепи проходил о выходом 50~100£ от количества первой цепи кДНК, введенной в реакцию.

Полученную таким образом двухцепочечную ДНК метилировали о . помошью ЕвоЫ-метилазы, лигировали о ЕооЩ-линкерами, обрабатывали эндонуклеазой рестрикции ЕооМ и очишали от примеоей, затруднявших клонирование, хроматографией на колонке о биогелем А-50м. Размеры клонируемой двухцепочечной ДНК ооотавляли более 500 пар оонований. В качестве вектора для клонирования был выбрав фаг Лемо.

Для получения вектора препаративные количества фага нарабатывали методом полного лизиоа на чашкйх.

Полученные фрагменты ДНК о датированными линкерами и вектор, для клонирования лигировали в эквимолярных соотношениях, упаковывали в Лв1;10 и рассева ли, используя о элективный штамг Е.ооИ им 514 в качестве хозяина. Эффективность транофакции ооотавляла . Ю*7 на I мкг вставки. В результате была получена клоногека,содержащая 2.Ю7 независимых рекомбинантных клонов.

3. Анализ клонов, содержащих фрагменты генов каталигичеокой оубьединипы Иа+,К*-АТОазы

Скрининг библиотеки кДНК проводили гибридизацией о радиоактивно-меченными пробами - фрагментами ДНК, представляющими ообой участки структурного гена оС-оубъедишшы На+,к+-АТФазы ив почек свиньи и кодирующими н-концевую (рВ159), серединную (рВ2801) и

С-концевую (рВ29) области молекулы бежа. Первичный высев банка проведали на чашки Петри диаметром 100 мм о плотностью 5,0»10^ БОБ на чашку. Клоны, давшие положительный оигнал гибридизации, доводили до индивидуального ооотояния в результате 2-3 рассевов.

В результате скрининга было получено 69 положительных сигналов гибридизации, из них 49 - при гибридизации о "С-концевым" зондом, 9-со "срединным" (М) фрагментом и 12 клонов гибриди-зовалиоь о двумя (С и М) фрагментами. При гибридизации на н-кон-цевой зонд не было найдено ни одного положительного клона. Отсутствие клонов, гибридизующихоя на н-концевой зонд, объясняется, по-видимому, недостаточной большим размером транс крипт ов,ко-торые получаются при оинтезе кДНК о помощью обратной транмфип-тазы. До индивидуального состояния было доведено 5 клонов (рио. I), причем 4 ИЗ НИХ (клоны ^403, 8-Н802, И gt802) ГИбрИ-

дизовалаоь только на "С-концевой " зонд, а один (в1;1210) - на "орединный" и "С-концевой" зонд.

Выделение фаговой ДНК рекомбинантных клонов осуществляли по известному методу Ямамото о модификациями. Определение нуклеотид-ной последовательности проводили модифицированным методом Сэнге-ра. В качестве вектора попользовали производные фага М13 шрв и М13 шр9. Анализ реотриктных карт положительных клонов показал наличие двух групп клонов: клоны в*40з, в-Нвог, в-мгю и в*801 содержали внутренний ЕооЫ-оайт, а клон gt802 этого сайта не содержал (рио. I).

Определение первичной структуры фрагментов кЩК рекомбинантных клонов показало, что нуклеогидная последовательность вставок из клонов gt4oз, е^802, к*801 и gt1210 полностью совпадает с опубликованной последовательностью структурного гена Иа+,к+-А1Фа-зы из клеток человека линии НеЬа, определенной незадолго до этого японскими авторами. Первичная структура вставки из клона gt802

рВ159

pBZSOl

ре>29

А

t=i 1=1 о

б ей

CjtiZlO

760

И

<3

И б

5

<t UJcQ

оС

a

а за

gtiaoz

iaoo gt80i

15Э0

I

¿зао

gt20Z

\sso

d ■41

9

•a

м H и

S v <s

5 d > <SV0 <

M

ip S

Ulil 2

и И

a it X ЯЗ

a 85

S n S

Cfl to 00 й aS 2 S 2 33 Д

oCffi

Рис.1 Схема рекомбинантных клонов ( Б ), полученных в результате скрининга мозгового человеческого банка на участки структурного гена ct-субъединицы Nat ' К+-АТФазы из почек свиньи ( А ) .

была гомологична, но существенно отличалась от структуры клонов gt403, gtl802, gteoi и gtl21 о. К этому моменту в нашей лаборатории было обнаружено существование семейства высокогомологичных генов ос-субъединицы Иа+,к+-Атаазы в геноме человека (табл. 2) и была определена частичная структура одного из этих генов. Сравнение первичной структуры вставки из к,*' ;;,teo2 показало полное совпадение с определенной нами с г- , рой экзонов из геномного гена и была на гомологична последовательности оС-субъединицы из клеток HeLa.

Таким образом, наши результаты по скринингу кЦНК г аса из мозга человека показали наличие в нем двух высокогомологичных мРНК, вероятно, кодирующих различные формы ос-субъединицы Na+, К+-А1Фазы.

Практически одновременно о нашей работой были опубликованы резул): >■■!!, в которых было показано наличие трех различных типов мРНК, кодирующих ос -оубъадиницу Ка+,К+-Ате>8зы из мозга крысы. Соглаоно номенклатуре, предложенной в этой работе, и на основании гомологии нуклеотидных последовательностей мРНК крысы и человека можно заключить, что в нашем банке из мозга человека обнаружены кДНК, соответствующие оС-форме (клоны $t180P, r,t403, ^teoi и gt!2io) и оСШ-форме (клон gt802) каталитической субъединицы На+,к+-АТ5азы. Это говорит о тем, что по 1файней мере в мозге человека транскрибируются гены, кодирующие оСи оСШ-изоформы каталитичеокой оубъеданшн. К оокалению, в этом банке нам не удалось пока обнаружить клоны, соответствующие оС* форме. Можно предположить, что этот структурный ген хуже клонируется, поэтому доля его в банке столь незначительна, что идентификация крайне затруднена. Другим объяснением может быть относительно низкая доля соответствующей мРНК, что также может приводить к меньшей представительности этой формы в банке кЦНК.

Таблица 2. Семейотво генов, гомологичных гену оС-оубъедишшн Иа+,к+-А'гаазы*

Обозначение{цденти- { Иоточник выделения мРНК

копируемого {фикядая ---

белка {на уров-j гп~""** ф—-----

! rfrt Ха шм I

Ген

не белка

Ткани • человека j

Ткани других млекопитающих

NKoCTW-4

NKoCRD-16

оС

оС+

Клетки HeLa /I/

МОЗГ /2/

почки овиньи /4/

почки овца /5/ мозг крыоы /6/

NKoCR3-2 o6«i(ocrp1) NKeCSW3.2 oCrp2 HKoCR15-1 H*K+-AT<PeJa

+

Н6ИЗВ.

неизв. +

не вдентиф. мозг крыоы /6/

мозг /3/ мозг крыоы /6/

не иденгиф. не идентиф.

не вдентиф. олизиотая желудка крыоы /7/

/I/ Kawelcami К. et al., J. Bloohem., 1986, 5, 389-397.

/2/ Свердлов Е.Д. и др., неопубликованные данные.

/3/ Свердлов Б.Д. и др., ДАН, 1987, т. 297, № 6, ЩВ-тэч,.

/4/ Ovchlimikov Yu.A. et al., FEBS Lett., 198$, v.201, 237-245.

/5/ Shull G. et al., Nature, 1985, v.316, $91-695. .

/6/ Shull G. et al., Biochemistry, 1996, vf25, 8125-8132.

/7/ Shull G. and Lingrel J.B., J.Blol.Chem.,1986,V.216,167B8-16791.

4. Изучение экопреооии двух изофош еС и сСШ каталигичеокой оубъеяиницы Да , -АТОазы методом РНК-блот-гибридизаши

Другим, более раопроотраненным и менее трудоемким методом для оценки уровня экопреооии того или иного гена в различных тканях являегоя метод, оонованный на гибридизации специфических олиго- или полинуклеотвдных зондов о РНК, иммобилизованной на твердом носителе (нейлоновой мембране НуЪопй-в) пооле электрофо-

* Номенклатура генов дана по отатье febs Lett., 1987,

v. 221, № I, p. 123-133.

- Ill -

реза в денатурирующих условиях.

На основании данных о первичной структуре генов оС и оСШ-изоформ были оинтезированы олигонуклеотвдные зонды, комплементарные оС и оСШ формам мРНК в учаогках их наименьшей гомологии. Структуры олигонуклеотвдншс зондов приведены в табл. 3. Зонды были оинтезированы в нашей лаборатории сотрудниками Роогапшевым В.М., Черновым И.П. и Ажикиной Т.Л. Интенсивность оигиалов гибридизации оценивалаоь количественно о помощью сканирования ради оавтограмм на лазерном деноитометре.

Шло необходимо выяснить, во-первых, наоколько воспроизводимы результаты по выделению poly(A+)-PHK, электрофоретическому разделению ее и гибридизации о зондами и, во-вторых, оушествуют ли различия по экспреосии мРНК в одной и той же ткани из различных источников.

С этой целью из трех препаратов мозга человека была дважды независимо выделена ро1у(А+)-ЩС. РНК из кадцого препарата дважды независимо гибриднаовали о зондом, соответствующим оСШ-изо-форме оС субьединицы Na+,K+-ATOa3H. Результаты этих экспериментов приведены на рио; 2. В дорожке № I концентрация poly(A+)-РНК в 2 раза выше, чем в последующих. Был также поотавлен аналогичный опыт о почечной тканью из трех различных источников (рио. 2,В). Из этих результатов однозначно следует, что, во-первых,результаты экспериментов воспроизводимы, и, во-вторых, межиндиви-дувльных различий по экспрессии, по крайней мере оСШ изофорш оС субьединицы Na+,K+-AWasH в мозге и почке человека нет.

Для изучения тканеопвцифичнооти экопреосии генов РНК из 4-х тканей - почек, моага, щитовидной железы и печени, после электро-форетичеокого разделения в 1,5$ агарозном геле в денатурирулаих условиях переносили на нейлоновую мембрану Hybond-N и гибридизо-вали в жестких уоловиях о олигонуклеотидным зондом, соответствую-

Таблица 3. Структуры олигонуклеотвдных зондов, специфичных двум генам сС субъединицы (тсестим и нкослз-г) На+,к+-Атаазы человека. Оба олигонуклеогвдных зонда соответствуют областям мРНК, кодирующим пептида, гомологичные пептиду 3-11 в координатах оубъединицы На+,к± АТФазы из почек свиньи.

А. пепгвд Ьуа 01у Уа1 С1у Ага Аар Ьуа Туг а(Ьи)

оС- мШК 5» - ААО <ХЮ ОГО ССА Сйи ОАи ААО иАОО.-З' Олигонуклеотид-

ный зонд 229 5' - с АТА СИ АТС АСй ТСС ААС ССС СТ!Г - 3» I

м м

Б, ПвПГИД Аар Ьуа Ьуа Аар Аар Ьуа Аар Бег Р(го) I

оСЩ - мРНК 5' - САС ААС ААА САО ОАО ААО ОАС иСА С - V

Олигонуклеотид-ннй ЗОНД 228

5» - £ ТСА СТС СГТ СГС АТС ТТТ СИ? СТС - 3'

• #

алЩБ -.-.-¿¿к «wutti» *►«•*» V^OT

2r> J .

г

«1 Л

В

Рио. 2. Результаты гибридизации poly(A.+)-PHK из трех (А) различных препаратов мозга человека и (В) почек человека с олигонуклео-тидным зондом,комплементарным оСШ изоформе На+,к+-АТФазы человека. Стрелками указаны положения 28S и 18S рибооомальных РНК. А и Б - повторение одного и того же опыта. В дорожках № I А и Б концентрация poly(A+)-PHK вдвое больше, чем в остальных, а,б - независимые выделения poly(А+)"РНК,

шим оСШ изоформе каталитической субъединицы. Пооле радиоавго-графии фильтр о иммобилизованными poiy(A+)-PHK отмывали от радиоактивно-меченой пробы и гибридизовали при тех же условиях о олигонуклеотидным зондом, соответствующим оС изоформе каталитической оубъединицы Ла+,к+-АТФазы. Результаты этих экспериментов приведены на рис. 3 и в табл. 4. Для оценки количества материала в дорожках вое используемые в работе фильтры о иммобилизованными poiy(A+)-PHK отмывали от радиоактивно-меченой пробы и гибридизовали о актиновой пробой. Из литературных данных известно, что количество актиновой мРНК в различных тканях различается незначительно, поэтому такая проба может быть попользована для оравнения количества исследуемого материала (рио. 3,8).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что экспреосия генов, кодирующих оС и еСШ изоформы каталитической оубъединицы, регулируется тканеспецифично. Количество обеих мРНК наиболее велико в почках. Это, несомненно, овязано о высоким уровнем активности иа+,к+-АТОазн в почках. Содержание ос-мРНК в щитовидной железе сравнимо о количеством этой мРНК в почках. Высокое содержание матричной РНК, кодирующей эту форму каталитической субъединицы в щитовидной железе, вероятно, обусловлено интенсивным транспортом иода в клетки щитовидной железы. Известно, что накопление иода в этой железе связано с расходованием АТФ, поступлением К*- и выходом Na+. Это указывает на сопряжение транспорта иода о обменом К? и Иа+, т.е. о активностью Na+,K+-Al$a3H. Количество мйЖ, кодирующей оС-форму каталитической субъединицы в мозге человека, составляет 10$ (табл. 4) от количества этой мРНК в почках. Оценивая содержание оСШ-мРНК в различных тканях человека, оледует отметить, что эта мРНК наиболее предотавлена в почках, в меньшей отепени в мозге, щитовидной железе, легких. Выявление ткани, в которой содержание оСШ-мРНК наиболее велико, поэ-

А

ос.

«III

В

АКТИ1

Рио. 3. Результаты гийрвдизации>ро1у(А+)-РНК иэ различных тканей человека о олигонуклеотидными зондами,комплементарными оС(А) и оСШ (Б) изоформам оСоубъедишщы Na+,K+-ATíaзи, I - почка, 2 -мозг, 3 - щитовидная железа, 4 - печень. Стрелками указаны положения 28S и íes рибоссыалышх РНК. (В) - гибридизация о актиновой пробой.

волило начать работы по выделению и изучению этой формы каталитической субъединиш На+,к+-АТФазы методами белковой химии.

При гибридизационном анализе poiy(A+)-PHK из печени человека не удалось обнаружить полосы специфической гибридизации ни о одним из зондов. Это может быть связано либо о низкам содержанием оС и оСШ-мРНК в печени, так как из литературных данных изве-отно, что клетки печени подержат в 100 раз меньше молекул Na+,K+-АТФазы, чем клетки почек, либо о тем, что печень содержит другую изоформу каталитической оубъадиницы Иа+,к+-АТФазы. По результатам, приведенным в работе Янг и Лингрел (Young R.M. and Llngrel J.B., 1987) по изучению экопрессии трех изоформ оС оубъединшн На+,к+-АТФазы в тканях крыоы, также не удалось обнаружить экспрессию ганов оС-субьединицы Ла+,к+-АТФазы в тканях печени.

5. Изучение уровня экопреооии двух генов оС-оубъединипн Иа+,к+-АИазы в ношальннх и опухолевых тканях человека

Помимо изучения уровня экспрессии двух генов каталитичеокой субъединиш в нормальных тканях человека было определено содержание оС и оСШ-мРНК в двух опухолевых тканях человека. Эти результаты приведены на рио. 4 и в табл. 4. Видно, что оС-мРНК в poiy-(А+)~РНК, выделенной из клеток рака почки и опухоли Вильмса, составляет и 1% соответственно от содержания этой мРНК в poif (А+)-РНК здоровой почки. Содержание обШ-мРНК в клетках рака почки составляет 2С$ от количества оСШ-мРНК в клетках здоровой почки. В клетках опухоли Вильмса на удалось обнаружить мРНК, кодирующую оСШ форму каталитической субьединицы ®а+,к+-АТФазн. Возможно, количество этой мРНК лежит за пределами чувствительности иополь-зуемого гибридизационного теста. Опухоль Вильмса предотавляет собой ткань, состоящую из эмбриональных зачатков, причем гиотологи-чвокий анализ показывает наличие тяжей, солидных структур, подо-

Б

• »

o(III

• *

>

«.

в

АКТИН

Рис. 4. Результаты гибридизации poiy(A+)-PHK о олигонуклеотидными зондами .комплементарными оС (А) и оСШ (Б) изоформам оС оубъедини-цы Ка+,К+-Атаазы человека. I - нормальная почка человека, 2 - рак почки, 3 - опухоль Вильмоа. Положения 28S и 18S рибосомальных РНК указаны стрелками. (В) - гибридизация с актиновой пробой.

Таблица 4. Результаты онанирования радиоавтографов на лазерном денситометре (среднее из трех опытов)

Ткань

Относительное содержание ос-мРНКв % держанию в почках

Относительное {содержание осш-к со- мРНКв % к содержанию в поч-{ ках

Почка взрослая 100 100

Мозг взрослый 10 33

Щитовидная железа 90 II

Печень 0 0

Рак почки 8 21

Опухоль Вильмоа I 0

Почка эмбриональная 6 3

Почка детская 95 90

Мозг эмбриональный 1.5 3

Мозг дегокий 10 30

бие канальцев. Таким образом, эту опухоль молено рассматривать как эмбриональную ткань почечного происхождения. Вполне вероятно, что низкий уровень «с и осЩ-мРНК в опухоли Вильмоа по сравнению о нормальной почечной тканью можно объяснить онтогенетической регуляцией экопреооии каталитической оубъеднницы На+,к+-АЗФазы. В обзоре Иоргеноена (.Тогвепвеп, 1982) приведены данные, не исключающие эту точку зрения: активность Ка+,к+-АТФазы в кортикальных сегментах новорожденного кролика составила 20$ от таковой в зрелой почке кролика. Наши более поздние данные также указывают на то, что экспреосия генов каталитической оубъеднницы может регулироваться в онтогенезе. Эти результаты будут приведены ниже;

Сравнивая содержание ос я оСШ-мРНК в клетках рака почки о оодержаниам этих мРНК в нормальных почечных клетках, оледует отметить снижение уровня экопреосии обеих мРНК в трансформирован-

ной ткани. Это также характерно для вСШ-мРНК в случав нормальной эмбриональной и опухолевой вмбриональной (опухоль Вильмса) тканей. Изменения в уровне экопреооня генов, кодирующих изофорда каталитической оубъеяинщн На+,к+-АТФазы, возможно, отражают изменения в уровнях активного транспорта одновалентных катионов, происходящие в почечных тканях пооле неоплаотичеокой трансформации. Другим объяснением онижения экопреооии может быть то, что в опухолевых тканях начинают экспреооираватьоя другие иэоформы На+,к+-АТФазы.

6. Экопреооня генов осоубъединицы Ма^^-АТОазы в онтогенезе

Следующей задачей данной раЗоты было изучение экспреосии генов, кодирующих оС оубъвдиницу Мв+,к+-АТФазы, в онтогенезе. Для этого, иоходя из данных, представленных на рис. I, были выбраны мозговая и почечная ткани,характеризуют!еоя выооким уровнем экопреооии изучаемых генов.

Ро1у(А+)-РНК была выделена из вмбриональной, детокой и взрослой почки, а также из эмбрионального, детокого и взрослого мозга (табл. I). РНК была иммобилизована на нейлоновой мембране и гибридаована по опиоаннсй выше методике о зоцдам, специфичным к сСШ изоформе. Результаты представлены на рис.?, 6 я в табл. 4. После радиоавтографии фильтры отмывали и габридизовали их в тех же уоловиях со вторым зондом, соответствующим с£-изоформе. Эти данные экспериментов предотавлены на рис.5,6 и в табл. 4. Как видно из результатов этих опытов, экопреооня генов, кодирующих оСШ-и оС-иаоформы в процессе развития почечной ткани различна: она одинакова для детокой я взрослой почек и значительно ниже для эмбриональной. Эти данные оогласуюгоя о приведенными выше данными Иоргеноена.

Для мозговых тканей наблюдается оходная картина: увеличение

3 4

105

ридизапионного анализа экопрвооии генов,ко-с-изоформи (Б) в почечнкх тканях. I - амб-- детокая почка, 4 - взроолая почка, Сгрел-28S и 18S рибооомальннх РЖ. (В) - гибри-обо*.

Pao. 6. Результаты гибридизационного анализ. ДИруШЯХ оСШ (А) И оС-И30ф0рМЫ (Б) В МОЗГ' эмбриональный, 2,3 - мозг детокий, 4 - мозг указаны положения 28S я 18S рвбооомальных Е о актиновой пробой.

экопреооии оС к осШ-мРНК детской и вэроолой тканей по оравнешш о эмбриональной (рио. 6).

7. Обоэтшение и гипотезы

Как упоминалооь выше, наши результаты по окринингу кДНК банка из мозга человека и результаты экспериментов о использованием блот-гибрвдизации мРНК из разных тканей человека показали наличие двух внсокогомологичных мРНК, которые, вероятно, кодируют различные формы ос -субьединицы Иа+,к+-АТФазы.

Из литературных данных известно, что в результате окрининга кДНК библиотеки из мозга крысы были идентифицированы последовательности, кодирующие различные изоформы каталитичеокой оубъеди-ницы На+,к+-АТФазы, а именно ос , сС+ и гипотетической оСШ-изо-формы. Вига также установлено, что эти изофорш являются продуктами различных генов;

В наотояшей работе показано, что экопреосия двух генов из оемейотва генов оС-субъединица Иа+,к+-АТФазы человека регулируется тканеопецифично. Количество оС-мРНК наиболее велико в почках. Недавно опубликованные данные американских ученых по экопреооии генов На+,к+-АТФазы в тканях крыоы также указывают на то, что наибольшая экопреосия оС-мРНК идет именно в почечной ткани. Сравнивая содержание оСШ-мРНК в различных тканях человека, необходимо отметить, что эта мРНК наиболее предотавлена в почках и в меньшей отепени в других изученных тканях. Эти данные противоречат результатам других авторов по экопреооии оСШ-мРНК в тканях крыоы, где наибольшая экопреосия была обнаружена в мозговой ткани. Подобные различия, по-видимому, могут объясняться либо различием экопреооии этой изоформы у равных видов, либо наличием большего, чем мы предполагаем пока чиола изоформ и перекрестной гибридизацией. В настоящее время извеотное чиоло генов для каталити-

чеокой оубъединицы На+,к+-А1Фазы превышав! число иэоформ фермента, поэтому нельзя исключить возможность того, что в определен- • ных тканях будут обнаружены неизвестные до настоящего времени изоформы каталитичеокой субьединицы.

В настоящее время известно, что активность Ка+,к+-АТФазы регулируется многими факторами: гормонами, нейротраномиттерами, изменениями в ионном окружении клетки и другими. Однако пока мало данных о генетичеокой основе такой регуляции. Результаты этой работы, а также аналогичных наследований на тканях крысы свидетельствуют, что распределение изоформ является тканеопецифичным. Это, скорее воего, связано о различной скоростью транокришш разных генов в изученных тканях. Нельзя исключить, однако, и других причин тканеспецифичной экспрессии, таких как различная скорость созревания разных мРНК или их стабильность. Одно из возможных объяснений биолотаческого омыола наличия нескольких изоформ каталитичеокой оубъединицы заключается в том, что разные оубъединицы могут выполнять, помимо основной функции, связанной о транспортом ионов, какие-то дополнительные функции. Такими функциями может быть, например, рецепция биорегуляторов в процессах клеточной дифференцировки или при отклике на изменение условий внешней ореда. Действительно, оС и иаоформы ведут себя различно по отношению к оубаину: оС -форма ингибируетоя этим серъ дечным гликозидда, тогда как оС+ устойчива к его действию. Если оубаин является аналогом какого-либо ооботвенного биорегулятора организма, то можно представить себе следующую простейшую модель регуляции клеток в органах-мишенях дейотвия этого биорегулятора: клетки этих органов содержат два типа АИаз, одна из которых чувствительна, тогда как другая устойчива к действию биорегуляторе. При определенных уоловиях, вызывающих увеличение концентрации биорегуляторов в данном органе, он ингибирует сдну из АТВаз, умень-

шая поток ионов в клетку. Другая же АТФаза обеспечивает низки! порог ионного транспорта, необходимый для жизнедеятельности клеток. Благодаря ей даже при самых высоких концентрациях регулятора клетки сохраняют способность к функционированию. Таким образом могла бы осуществляться модуляция ионного транспорта. Можно представить себе далее, что в другом органе подобным же образом могла бы действовать другая пара АТФаз, одна из которых чувствительна к другому биорегулятору, тогда как вторая уотойчива.

Эта спекулятивная гипотеза, так же как и любые другие гипотезы, призванные объяснить необходимость множественности иэоформ, требует для своего подтверждения или опровержения дополнительных биохимических экспериментов. Представленные нами данные о ткане-специфичности экспрессии семейства генов отавят вопроо о значимости этого явления. Ответ на него, можно надеяться, будет получен в дальнейших экспериментах.

ВЫВОДЫ

1. В результате скрининга кДНК банка из мозга человека показано наличие в нем двух высокогомолопгчных мРНК, кодирующих ©С и аСШ-дзоформы об-субъединицы На+,к+-Атаазы.

2. Установлено, что экспрессия генов, кодирующих оС и оСШ-изоформн каталитической оубъединицы На+ ,к+-АТФазы человека, регулируется гканеспецифично. Содержание оси оСШ-мРНК наиболее велико в почках.

3. Экспресоия генов, кодирующих оСи оСШ из оформи оС субъединицы Иа+,к+-АТФазы, уменьшается в опухолевых тканях почки по сравнению с нормальной почечной тканью.

4. Экспреосия генов, кодирующих оС и с<.Ш изоформы каталитической оубъединицы Ма+,к+-АТФазы в почечной и мозговой тканях,

зависит от стадии онтогенеза.

Основные результаты дисоертации опубликованы в виде следующих печатных работ:

1. Ю.А. Овчинников, Г.С. Монаотырокая, Н.Е. Броуде, Ю.А. Ушкарев, Г.М. Долганов, A.M. Мелков, Ю.В. Смирнов, Н.С. Акопьянц, И.Е. Дулубова, Р.А. Алликметс, Н.Н. Модянов, Е.Д. Свердлов. Гены На+,к+-АТФазы человека. Нуклеотидная последовательность, кодирующая С-концевую область ос-субъедшида.' - Доклады Академии наук СССР, 1986, т. 187, * 5, с. I25I-I254.

2. E.D. Sverdlov, N.E. Broude, V.E. Sverdlov, G.S.Monastyrslcaya, A.V. Griehin, K.E. Prtrukhin, H.S. Alcopyanz, N.N. Modyanov and Yu.A. Ovchinnikov. - Family of Na+,K+-ATPaBe genes. Intraindividual tissue - specific restriction fragment lenght polymorphism. - FEBS Lett., 1987, v. 221, N 1,

pp. 129-133.

3. Е.Д. Свердлов, K.E. Петрухин, Н.С. Акопьянц, Н.Е. Броуде, Г.С. Монаотырокая, А.В. Гришин, В.Е. Свердлов, Н.Н. Модянов. Дифференциальная экспрессия двух генов ос -оубъединипн Na+,K+-АТФазы в нормальных и опухолевых тканях человека. - Доклады Академии наук СССР, 1988, т. 288, № I, о. 236-239.