Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Каталитические и регуляторные субъединицы Х + , К +-АТФаз

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Романова, Людмила Геннадьевна

Из-за сложности получения клинического материала выборка тканей человека была существенно меньше. Среди исследованных образцов наибольший уровень экспрессии гена atplall обнаружен в коже, клеточной линии аденокарциномы кишечника Сасо 2 и почке, в то время как в плаценте, мозгу и сигмовидной кишке удалось детектировать лишь следовые количества транскрипта.

Таким образом, наблюдается сходный характер тканевой экспрессии гена каталитической субъединицы Н+,К+-АТФазы у различных видов млекопитающих. Активность гена во всех случаях наиболее высока в коже, в дистальном отделе кишечника и почке. Слабый сигнал в сигмовидной кишке человека может объясняться частичной деградацией РНК до выделения или влиянием каких либо заболеваний кишечника, поскольку образцы тканей являлись операционным материалом, полученным в клинике.

Общие для всех исследованных видов закономерности экспрессии гена а-субъединицы Н+,К+-АТФазы позволяют сделать следующие выводы:

Рис.2. Результаты ПЦР на кДНК органов крысы. Продукты ПЦР на матрице к ДНК р3-субъединицы: 1 - 100 bp ladder, 2- почка, 3 - кожа, 4 - коагулирующая железа, 5 -препуциевая железа, 6 - кишка, 7 - мозг (а); продукты ПЦР на матрице кДНК Pi-субъединицы: 1 - 100 bp ladder, 2 - мозг, 3 - кожа, 4 - коагулирующая железа, 5 -препуциевая железа, 6 - кишка, 7 - почка (б); продукты ПЦР на матрице кДНК р2-субъединицы: 1 - 100 bp ladder, 2 - почка, 3 - мозг (в).

Таким образом, качественная оценка экспрессии генов а- и р-субъединиц не дала однозначных результатов. Поэтому было решено провести количественный анализ экспрессии всех каталитических и регуляторных субъединиц Х+,К+-АТФаз в трех органах: кишке, коже и коагулирующей железе. праймеров, таким образом в проведенных экспериментах определяли суммарное количество транскриптов всех изоформ. Очистку продуктов ПЦР проводили на колонках CHROMA SPIN. Далее спектрофотометрически была определена их концентрация. Очищенные конкуренты доводили до концентрации 100 аттомоль/мкл, разбивали на аликвоты и хранили при -20°С.

Первичную конкурентную ПЦР проводили, используя десятикратные разведения полученных раствора конкурентных матриц. В реакционные смеси, содержащие одинаковое количество кДНК, вносили аликвоты конкурентов понижающейся концентрации. Таким образом, после анализа результатов ПЦР электрофорезом определяли диапазон концентраций конкурентов для проведения дальнейшего титрования. Вторую ПЦР проводили используя уже двукратные разведения конкурентной матрицы в области выбранных концентраций. Полученное изображение электрофореза обрабатывали при помощи программы Scion Image for Windows b.4.0.2 (рис. 4 a). Полученные таким способом данные представляли в виде линейной зависимости логарифма соотношения количества ПЦР продукта тестируемой матрицы к продукту ПЦР конкуретной матрицы от логарифма концентраций конкурента (рис. 46) с использованием программы Origin 5.0. Искомой являлась точка, где функция равна нулю, то есть внесенное в реакцию количество конкурента равно содержанию исследуемой кДНК в образце. При расчетах вносилась поправка на различия в длине продуктов ПЦР исследуемой кДНК и конкуретной матрицы. Было проведено три эксперимента по количественной ПЦР на кДНК трех независимых выделений РНК. Результаты представлены в табл. 3.

3.5 Локализация мРНК каталитической субъединицы нежелудочной Н+,К+-АТФазы в органах крысы методом гибридизации in situ.

Мы показали, что экспрессия генов а-субъединиц нежелудочных Н+,К+-АТР-аз является тканеспецифичной, причем у различных видов млекопитающих она имеет сходный характер. Более точная локализация белка по типу клеток, в которых он преимущественно синтезируется, абсолютно необходима для выяснения его возможной физиологической роли. С этой целью мы провели локализацию мРНК каталитической субъединицы Н+,К+-АТФазы методом гибридизации РНК in situ в органах крысы, где по полученным данным ее концентрация была наибольшей: в коже и коагулирующей железе. Одновременно в тех же органах была проведена и локализация родственного фермента ]Ча+,К+-АТФазы методом иммуногистохимии с использованием поликлональных антител. Различия в методических подходах для локализации обоих белков объясняются отсутствием специфичных антител к Н+,К+-АТФазе крысы. В то же время наличие высокоспецифичных поликлональных антител к С-концевому пептидному фрагменту Lys-Glu-Thr-Tyr-Tyr, консервативному для всех изоформ а-субъединицы Ыа+,К+-АТФазы [189], позволило провести локализацию этого белка методом иммуногистохимии. Эксперименты на срезах кишки были проведены в качестве контроля, поскольку ранее было показано, что в дистальном отделе кишечника Н+,К+-АТФаза локализована в апикальной мембране клеток, выстилающих полость кишечника, тогда как Na ,К -АТФаза - в базолатеральной мембране этих клеток и криптах [190].

Известно о существовании двух различных вариантов сплайсинга мРНК а-субъединицы Н+,К+-АТФазы крысы [130], в результате которого продукт одного из транскриптов является укороченным примерно на 110 а.о. с N-концевой части белка.

Лиисйка 50 мкм

Рис. 5. Локализация Ыа+,К+-АТФазы и мРНК Н+,К+-АТФазы в коже крысы. Морфология кожи крысы при окрашивании среза гематоксилин-эозином: 1 - роговой слой, 2 - блестящий слой, 3 - шиповатый слой, 4- - зернистый слой, 5- -базальный слой (а); иммуногистохимическая локализация На+,К+-АТФазы в коже крысы (б); отрицательный контроль - инкубация без первичных антител (в); гибридизация in situ мРНК а-субъединицы Н+,К+-АТФазы в коже крысы с использованием антисмыслового зонда (г); отрицательный контроль - гибридизация со смысловым зондом (д).

В экспериментах по иммуногистохимической локализации Na4 ,К+-АТФазы в коагулирующей железе мы наблюдали равномерное окрашивание всего эпителия, причем интенсивность его была очень низкой. Полученный результат говорит о том, что в данном органе содержание этого белка относительно невелико, причем по данным количественной ПЦР даже ниже, чем Н+,К+-АТФазы. Этот факт довольно необычен, поскольку количество Na ,К -АТФазы в клетках всегда высоко и несравнимо больше количества Н+,К-АТФазы.

Гибридизация in situ мРНК каталитической субъединицы Н+,К+-АТФазы подтверждает экспрессию гена этого белка в клетках железистого эпителия коагулирующей железы (рис. 6). Таким образом, в данном случае оба белка синтезируются в одних и тех же клетках. Почему секретирующие клетки железы нуждаются в синтезе повышенных количеств

Показано, что существуют различия в локализации Х+,К+-АТР-аз относительно плазматической мембраны в клетках поляризованного эпителия:

Na ,К -АТФаза расположена в ее базолатеральной части, а Н+,К+-АТФазы - в апикальной [189, 203]. В то же время существуют и исключения, например, Мобашери и соавторы продемонстрировали, что в простате человека ai-субъединица №+,К+-АТФазы присутствует как в базолатеральной, так и в апикальной мембранах эпителиоцитов [204]. В коагулирующей железе мембранная локализация обоих белков неизвестна. Скорее всего, после синтеза

Na+,К-АТФаза и Н^К^-АТФаза направляются в различные отделы плазматической мембраны клетки, при этом Н+,К+-АТФаза встраивается в мембрану, обращенную в люминальную полость железы. Вероятно, в данном случае Н+,К+-АТФаза может участвовать в формировании ионного состава секрета железы.

Интересно, что секреция в коагулирущей железе происходит по апокриновому типу, то есть от поверхности апикальной мембраны эпителиальной клетки

Создание SAGE-библиотеки ^ Построение библиотеки и севенирование

Базы данных GenBank и ► Создание кластеров

EST UniGene

Рис. 7. Схема получения и обработки данных методом SAGE. название библиотеки SAGE Duke 1273 SAGE Duke thalamus

SAGE Duke HI020 SAGE Duke BB542 normal cerebellum SAGE 293-CTRL SAGE HCT116 SAGE Caco 2 SAGE Chen LNCaP SAGE Chen LNCaP no-DHT

SAGE Chen Normal Pr

SAGE Chen Tumor Pr

SAGE CAP AN 1 SAGE CAPAN2 SAGE HS766T SAGE Panel SAGE HX SAGE HI26 SAGE Duke H54 lacZ

SAGE Duke H54 EGFRvIII SAGE Duke H392 SAGE Duke GBM H

SAGE SW837 SAGE RKO SAGE CPDR LNCaP-C SAGE CPDR LNCaP-T SAGE 293-IND количество маркеров на миллион общее подсчитанное количество количество маркеров в маркеров библиотеке

Рис. 8. Результаты виртуального Нозерн-блоттинга для маркера гена ai-субъединицы №+,К+-АТФазы. общее количество подсчитанное количество маркеров на количество маркеров в название библиотеки миллион маркеров библиотеке

SAGE Duke

SAGE Duke thalamus 1 оз ^

SAGE Duke HI

SAGE Duke BB542 normal cerebellum

SAGE HCT

SAGE Caco

SAGE HI

SAGE Duke H54 lacZ

SAGE Duke H54 EGFRvIII

SAGE SW

SAGE RKO

SAGE 293-IND

SAGE pooled GBM

SAGE BB542 whitematter 179 •

SAGE normal pool(6th) 237 •

SAGE ОУЮ63

SAGE Duke H

SAGE MouseP8 PGCP

SAGE ОС

SAGE normal cerebellum

SAGE Duke HI

Рис. 10. Результаты виртуального Нозерн-блоттинга для маркера гена аз-субъединицы Na+,K+-AT<Da3bi. название библиотеки

SAGE Caco 2 SAGE SciencePark MCF7 Control Oh SAGE 95количество маркеров на миллион подсчитанное количество маркеров количество маркеров в библиотеке

Рис. 11. Результаты виртуального Нозерн-блоттинга для маркера гена atplall. общее количество подсчитанное количество маркеров на количество маркеров в название библиотеки миллион маркеров библиотеке

SAGE Duke

SAGE Duke thalamus

SAGE Duke HI

SAGE Duke BB542 normal cerebellum

SAGE 2 93-CTRL 276 ^

SAGE HCT

SAGE Caco

SAGE Chen LNCaP

SAGE Chen LNCaP no-DHT

SAGE Chen Normal Pr

SAGE Chen Tumor Pr

SAGE CAPAN1 210 '

SAGE CAPAN

SAGE HS766T

SAGE Panel 401 <=®"

SAGE HX 310 «да

SAGE HI

SAGE Duke H54 lacZ

SAGE Duke H54 EGFRvIII

SAGE Duke H392 225

SAGE Duke GBMH

SAGE SW

SAGE RKO

SAGE CPDR LNCaP-C 264 v.*

SAGE CPDR LNCaP-T 226

SAGE 293-IND

SAGE PR317 normal prostate

SAGE PR317 prostate tumor

SAGE pooled GBM

SAGE BB542 whitematter

SAGE NHA(5th)

SAGE normal pool(6th)

Рис. 13. Результаты виртуального Нозерн-блоттинга для маркера гена Рз-субъединицы №+,К+-АТФазы. экспрессии наблюдается со стороны гена регуляторной (Pi), а не каталитической субъединицы. Также при раковых изменениях кишечника уровень транскрипции изменяется только у регуляторной (Рз) субъединицы. Такие изменения интенсивности транскрипции генов именно регуляторных субъединиц могут вызывать следующие предположения. Во-первых, эти данные косвенно подтверждают выдвинутую ранее гипотезу о том, что образование сф-комплексов является гибким процессом, и количественно-качественное соотношение а- и р-субъединиц может и не быть строго определено, а варьирует в зависимости от ткани и, возможно, изменения состояния клетки. Во-вторых, это указывает на важность регуляторных субъединиц, и возможно, на их более значительное влияние на функции каталитических субъединиц, чем предполагалось ранее, или какие-либо новые автономные не связанные с катализом функции этих белков. Таким образом, полученные данные открывают новые возможности для изучения роли каталитических, регуляторных субъединиц Х+,К+-АТФаз и их комплексов в нормальных тканях и при раковой трансформации клеток.

2. 53 г Na2SC>3 (безводный), 10 г NaOH, 10 г КВг растворяли в 500 мл воды. Растворы 1 и 2 объединяли и фильтровали. Прерыватель: 2.5% уксусная кислота. Фиксаж:

1. 200 г ИагЭгОз, 20 г ЫагБОз растворяли в 800 мл воды.

2. 25 мл ледяной уксусной кислоты разводили водой до 100 мл. Растворы 1 и 2 объединяли.

3. 40 г NH4CI растворяли в 100 мл Н20. Раствор 3 объединяли с предыдущими.

В работе использовали рентгеновские пленки Hyperfilm-pmax (Amersham). Режим обработки пленок при проявлении: в проявителе при 20°С 2-4 мин, в прерывателе 0.5 мин, в фиксаже 7-10 мин. version 2.0" (фирма "USB").' Перед проведением реакций секвенирования рекомбинантные плазмиды подвергались щелочной денатурации. Для этого к 18 мкл раствора плазмиды (содержащему 2 мкг ДНК) добавляли 2 мкл 2М раствора NaOH и инкубировали 30 мин. при 37°С. Затем добавляли 2 мкл раствора ЗМ AcNa рН 4,9 и 80 мкл этанола. Смесь перемешивали, выдерживали при -20°С в течение суток, центрифугировали 15 мин. при 12000 об/мин. Осадок промывали 80% этанолом и высушивали. К сухому осадку добавляли 6 мкл воды, 2 мкл буфера для ДНК-полимеразы фага Т7 и 2 мкл раствора олигонуклеотидного праймера (2 пМ/мкл). После тщательного перемешивания смесь инкубировалась 30 мин. при 37°С. Реакции секвенирования проводились в строгом соответствии с протоколом, предлагаемым фирмой "USB". в) Проведение электрофореза.

После проведения реакций секвенирования образцы прогревали 5 минут при 75°С и подвергали охлаждению до 0°С и наносили на гель. Перед нанесением образцов гели подвергали преэлектрофорезу при напряжении 1500V в течение 1 часа. Электрофорез проводили при 2000-3000V, следя за тем, чтобы температура стекла не превышала 60°С. Окончание электрофореза определяли по положению маркерных красителей: для коротких прогонов бромфеноловый синий доходил до дна, для длинных прогонов -после выхода ксиленцианового голубого из геля электрофорез продолжали в том же режиме еще 2-3 часа. г) Обработка геля после электрофореза.

После прохождения электрофореза гель на стекле фиксировали в 10% уксусной кислоте, ополаскивали водой и высушивали при +60°С под струей воздуха. По окончании электрофореза гели авторадиографировали при комнатной температуре. Для этого к гелю прикладывали рентгеновскую пленку и прижимали ее чистым стеклом. В

5 ВЫВОДЫ.

1. Выявлен сходный тканеспецифичный характер экспрессии генов каталитических субъединиц Н+,К+-АТФазы у различных видов млекопитающих.

2. На основании данных конкурентной ПЦР в органах крысы выдвинуто предположение, что а-субъединица Н^К^АТФазы может образовывать комплексы с различными р-субъединицами в разных типах клеток.

3. Установлено, что в коже крысы Na ,К -АТФаза и Н+,К-АТФаза синтезируются в различных слоях эпидермиса. Выдвинуты гипотезы о возможной физиологической роли в коже.

4. Показано, что в коагулирующей железе Н+,К-АТФаза синтезируется в ее секреторном эпителии. Выдвинута гипотеза об участии Н+,К+-АТФазы в формировании ионного состава секрета.

5. Проведен анализ экспрессии генов известных субъединиц Х+,К+-АТФаз с использованием базы данных SAGEmap. Выявлено вероятное снижение уровня экспрессии генов отдельных изоформ как каталитических, так и регуляторных субъединиц №+,К+-АТФазы при злокачественной трансформации некоторых тканей.

Рапс 1 аденокарцинома поджелудочной железы,, клеточная линия

Рапс 91-16113 неоплазия поджелудочной железы,

Рапс 91-6252 неоплазия поджелудочной железы,

О VI063-3 карцинома яичников, клеточная линия

Es2-1 карцинома яичников, клеточная линия

А2780-9 карцинома яичников, клеточная линия

ОС14 карцинома яичников

OVT-6 аденокарцинома яичников

OVT-7 аденокарцинома яичников

OVT-8 первичная аденокарцинома

ML10-10 аденома яичников, клеточная линия sciencePark MCF7 control oh карцинома молочной железы, клеточная линия sciencePark MCF7 control 3li карцинома молочной железы, клеточная линия sciencePark MCF7 control 10h карцинома молочной железы, клеточная линия

PTEN карцинома молочной железы, клеточная линия

95-260 карцинома молочной железы

95-348 карцинома молочной железы

DCIS 2 карцинома молочной железы

95-347 карцинома проводящего протока молочной железы

95-259 карцинома проводящего протока молочной железы lacZ аденокарцинома молочной железы, клеточная линия

MDA453 аденокарцинома молочной железы, клеточная линия

SKBR3 аденокарцинома молочной железы, клеточная линия

DCIS карцинома молочной железы

95-348 карцинома молочной железы

Meso-12 первичная мезотелома эпителия кожи response to changes in extracellular Na+ concentration. Int. J. Biochem. Cell. Biol., V. 29, 649-57.

33. Mobasheri A., Errington R.J., Golding S., Hall A.C., Urban J.P. (1997). Characterization of the Na, K-ATPase in isolated bovine articular chondrocytes; molecular evidence for multiple alpha and beta isoforms. Cell Biol. Int., V. 21, 201-12.

34. Mobaseri A. (1994). J. Physiol., V. 505P, 59.

35. Shamraj O.I., Lingrel J.B. (1994). A putative fourth Na,K-ATPase alpha-subunit gene is expressed in testis. Proc Natl Acad Sci USA, V. 91,12952-6.

36. Medford R.M., Hyman R., Ahmad M., Allen J.C., Pressley T.A., Allen P.D., Nadal-Ginard B. (1991). Vascular smooth muscle expresses a truncated Na,K-ATPase alpha-1 subunit isoform. J. Biol. Chem., V. 266, 18308-12.

37. Lucking K., Nielsen J.M., Pedersen P.A., Jorgensen P.L. (1996). Na,K-ATPase isoform (alpha 3, alpha 2, alpha 1) abundance in rat kidney estimated by competitive RT-PCR and ouabain binding. Am. J. Physiol., V. 271, F253-60.

38. Jewell E.A., Lingrel J.B. (1991). Comparison of the substrate dependence properties of the rat Na,K-ATPase alpha 1, alpha 2, and alpha 3 isoforms expressed in HeLa cells. J. Biol. Chem., V. 266, 16925-30.

39. Jorgensen P.L., Collins J.H. (1986). Tryptic and chymotryptic cleavage sites in sequence of alpha-subunit of Na,K-ATPase from outer medulla of mammalian kidney. Biochim. Biophys. Acta, V. 860, 570-6.

40. Arystarkhova E., Gasparian M., Modyanov N.N., Sweadner K.J. (1992). Na,K-ATPase extracellular surface probed with a monoclonal antibody that enhances ouabain binding. J. Biol. Chem., V. 267, 13694-701.

64. Burns E.L., Price E.M. (1993). Random mutagenesis of the sheep Na,K-ATPase alpha-1 subunit generates a novel T797N mutation that results in a ouabain-resistant enzyme. J. Biol. Chem., V. 268, 25632-5.

65. Crambert G., Hasler U., Beggah A.T., Yu C., Modyanov N.N., Horisberger J.D., Lelievre L., Geering K. (2000). Transport and pharmacological properties of nine different human Na,K-ATPase isozymes. J. Biol. Chem., V. 275, 1976-86.

66. Blanco G., Melton R.J., Sanchez G., Mercer R.W. (1999). Functional characterization of a testes-specific alpha-subunit isoform of the sodium-potassium adenosinetriphosphatase. Biochemistry, V. 38, 13661-9.

67. Fisone G., Cheng S.X., Nairn A.C., Czernik A.J., Hemmings H.C., Hoog J.O., Bertorello A.M., Bergman Т., Jornvall H. (1994). Identification of the phosphorylation site for cAMP-dependent protein kinase on Na,K-ATPase and effects of site-directed mutagenesis. J. Biol. Chem., V. 269, 9368-73.

68. Bertorello A.M., Aperia A., Walaas S.I., Nairn A.C., Greengard P. (1991). Phosphorylation of the catalytic subunit of Na,K-ATPase inhibits the activity of the enzyme. Proc Natl Acad Sci U S A, V. 88, 11359-62.

69. Feschenko M.S., Sweadner K.J. (1994). Conformation-dependent phosphorylation of Na,K-ATPase by protein kinase A and protein kinase C. J. Biol. Chem., V. 269, 30436-44.

70. Middleton J.P., Khan W.A., Collinsworth G., Hannun Y.A., Medford R.M. (1993). Heterogeneity of protein kinase C-mediated rapid regulation of Na,K-ATPase in kidney epithelial cells. J. Biol. Chem., V. 268, 15958-64.

71. Chibalin A.V., Ogimoto G., Pedemonte C.H., Pressley T.A., Katz A.I., Feraille E., Berggren P.O., Bertorello A.M. (1999). Dopamine-induced endocytosis of Na,K-ATPase is

99. Mobasheri A., Brefeldin A. (1999). Influences the cell surface abundance and intracellular pools of low and high ouabain affinity Na,K-ATPase alpha subunit isoforms in articular chondrocytes. Histol. Histopathol., V. 14, 427-38.

100. Trujillo E., Alvarez de la Rosa D., Mobasheri A., Gonzalez Т., Canessa C.M., Martin-Vasallo P. (1999). Sodium transport systems in human chondrocytes. II. Expression of ENaC, Na,K,2Cl- cotransporter and Na,H - exchangers in healthy and arthritic chondrocytes. Histol. Histopathol., V. 14(4), 1023-31.

101. Renaud K.J., Inman E.M., Fambrough D.M. (1991). Cytoplasmic and transmembrane domain deletions of Na,K-ATPase beta-subunit. Effects on subunit assembly and intracellular transport. J. Biol. Chem., V. 266, 20491-7.

102. Hamrick M., Renaud K.J., Fambrough D.M. (1993). Assembly of the extracellular domain of the Na,K-ATPase beta subunit with the alpha subunit. Analysis of beta subunit chimeras and carboxyl-terminal deletions. J. Biol. Chem., V. 268, 24367-73.

103. Geering K., Jaunin P., Jaisser F., Merillat A.M., Horisberger J.D., Mathews P.M., Lemas V., Fambrough D.M., Rossier B.C. (1993). Mutation of a conserved proline residue in the beta-subunit ectodomain prevents Na,K-ATPase oligomerization. Am. J. Physiol., V. 265, CI 169-74.

104. Lemas M.V., Hamrick M., Takeyasu K., Fambrough D.M. (1994). 26 amino acids of an extracellular domain of the Na,K-ATPase alpha-subunit are sufficient for assembly with the Na,K-ATPase beta-subunit. J. Biol. Chem., V. 269, 8255-9.

105. De Tomaso A.W., Mercer R.W. (1992). Functional expression of the Na,K-ATPase using baculovirus. Acta Physiol. Scand. Suppl., V. 607,171-5.

ATPase: tissue-specific expression of the mammalian genes encoding the catalytic alpha subunit. FEBS Lett., V. 440, 320-4.

132. Modyanov N.N., Petrukhin K.E., Sverdlov V.E., Grishin A.V., Orlova M.Y., Kostina M.B., Makarevich O.I., Broude N.E., Monastyrskaya G.S., Sverdlov E.D. (1991). The family of human Na,K-ATPase genes. ATP1AL1 gene is transcriptionally competent and probably encodes the related ion transport ATPase. FEBS Lett., V. 278(1), 91-4.

133. Sverdlov V.E., Kostina M.B., Modyanov N.N. (1996). Genomic organization of the human ATP1AL1 gene encoding a ouabain-sensitive H,K-ATPase. Genomics, V. 32, 317-27.

134. Lingrel J.B., Kuntzweiler T. (1994). Na,K-ATPase. J. Biol. Chem., V. 269, 19659-62.

135. Lyu R.M., Farley R.A. (1997). Amino acids Vail 15-Ile 126 of rat gastric H,K-ATPase confer high affinity for Sch-28080 to Na,K-ATPase. Am. J. Physiol., V. 272, C1717-25.

136. Sachs G., Shin J.M., Besancon M., Munson K., Hersey S. (1992). Topology and sites in the H,K-ATPase. Ann N Y Acad Sci, V. 671, 204-16.

137. Jaisser F., Horisberger J.D., Geering K., Rossier B.C. (1993). Mechanisms of urinary K+ and H+ excretion: primary structure and functional expression of a novel H,K-ATPase. J. Cell. Biol., V. 123, 1421-9.

138. Codina J., Kone B.C., Delmas-Mata J.T., DuBose D.T. Jr.(1996). Functional expression of the colonic H,K-ATPase alfa-subunit. Pharmacologic properties and assembly with X,K-ATPase beta-subunits. J. Biol. Chem., V. 271, 29759-29763.

139. Cougnon M., Planelles G., Crowson M. S., Shull G.E., Rossier B.C. (1996). The rat distal colon P-ATPase alpha subunit encodes a ouabain-sensitive H,K-ATPase. J. Biol. Chem., V. 271,7277-7280.

163. Codina J., Delmas-Mata J.T., DuBose T.D. Jr. (1998). The alpha-subunit of the colonic H,K-ATPase assembles with betal Na,K-ATPase in kidney and distal colon. J. Biol. Chem., V. 273, 7894-9.

164. Sangan P., Thevananther S„ Sangan S„ Rajendran V.M., Binder H.J. (2000). Colonic H,K-ATPase alpha- and beta-subunits express ouabain-insensitive H,K-ATPase. Am. J. Physiol. Cell. Physiol., V. 278, CI82-9.

165. Lavoie L., Levenson R., Martin-Vasallo P., Klip A. (1997). The molar ratios of alpha and beta subunits of the Na,K-ATPase differ in distinct subcellular membranes from rat skeletal muscle. Biochemistry, V. 36, 7726-32.

166. Rivas E., Lew V., De Robertis E. (1972). (3 H) Ouabain binding to a hydrophobic protein from electroplax membranes. Biochim. Biophys. Acta, V. 290, 419

167. Forbush B. 3d, Kaplan J.H., Hoffman J.F. (1978). Characterization of a new photoaffinity derivative of ouabain: labeling of the large polypeptide and of a proteolipid component of the Na,K-ATPase. Biochemistry, V. 17(17), 3667-76.

168. Rossi В., Vuilleumier P., Gache C., Balerna M., Lazdunski M. (1980). Affinity labeling of the digitalis receptor with p-nitrophenyltriazene-ouabain, a highly specific alkylating agent. J. Biol. Chem., V. 255, 9936-41.

169. Reeves A.S., Collins J.H., Schwartz A. (1980). Isolation and characterization ofNa,K-ATPase proteolipid. Biochem. Biophys. Res. Commun., V. 95, 1591-8.

170. Forbush B. 3d, Hoffman J.F. (1979). Direct photoaffinity labeling of the primary region of the ouabain binding site of Na,K-ATPase with [3H]ouabain, [3H]digitoxin and

3H]digitoxigenin. Biochim. Biophys. Acta, V. 555, 299-306.

171. Rogers T.B., Lazdunski M. (1979). Photoaffinity labelling of a small protein component of a purified Na,K-ATPase. FEBS Lett., V. 98, 373-6.

202. Williams-Ashman H.G. (1984). Transglutaminases and the clotting of mammalian seminal fluids. Mol. Cell. Biochem., V.58, 51-61.

203. Dunbar L.A., Roush D.L., Courtois-Coutry N., Muth T.R., Gottardi C.J., Rajendran V., Geibel J., Kashgarian M., Caplan M.J. (2001). Ion pumps in polarized cells: sorting and regulation of the Na, K+ and H, K+ATPases. J Biol Chem., V.276, 29617-20.

204. Mobasheri A., Oukrif D., Dawodu S.P., Sinha M., Greenwell P., Stewart D., Djamgoz M.B., Foster C.S., Martin-Vasallo P., Mobasheri R. (2001). Isoforms of Na+, K+-ATPase in human prostate; specificity of expression and apical membrane polarization. Histol. Histopathol., V.16, 141-54.

205. Velculescu V.E., Zhang L., Zhou W., Vogelstein J., Basrai M.A., Bassett D.E., Hieter P., Vogelstein В., Kinzler K.W. (1997). Characterization of the yeast transcriptome. Cell, V.88, 234-251.

206. Velculescu V.E., Zhang L., Vogelstein В., Kinzler K.W. (1995). Serial Analysis Of Gene Expression. Science, V.270, 484-487.

207. Polyak K. and Riggins G. (2001). Gene discovery using the Serial Analysis of Gene Expression technique: implications for cancer research. J. or Clinical Oncology, V.19, 294858.

208. Velculescu V.E., Vogelstein В., Kinzler K.W. (2000). Analysing uncharted transcriptomes with SAGE. Trends Genet., V.16, 423-425.

209. Adams M.D. (1996). Serial analysis of gene expression: ESTs get smaller. Bioessays, V.4, 261-262.

210. Lai A., Lash A.E., Altschul S.F., Velculescu V., Zhang L., McLendon R.E., Marra M.A., Prange C., Morin P.J., Polyak K., Papadopoulos N., Vogelstein В., Kinzler K.W., Strausberg R.L., Riggins G.J. (1999). A public database for gene expression in human cancers. Cancer Res., V.59, 5403-7.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Романова, Людмила Геннадьевна

1. Выявлен сходный тканеспецифичный характер экспрессии генов каталитических субъединиц Н ,^К*-АТФазы у различных видов млекопитающих.2. На основании данных конкурентной ПЦР в органах крысы вьщвинуто предположение, что а-субъединица Н ,^К -^АТФазы может образовывать комплексы с различными Р-субъединицами в разных типах клеток.3. Установлено, что в коже крысы Na^,K-АТФаза и Н^К-АТФаза синтезируются в различных слоях эпидермиса. Вьщвинуты гипотезы о возможной физиологической роли Н ,^К -^АТФазы в коже.4. Показано, что в коагулирующей железе Н\К-АТФаза синтезируется в ее секреторном эпителии. Вьщвинута гипотеза об участии Н ,^К -^АТФазы в формировании ионного состава секрета.5. Проведен анализ экспрессии генов известных субъединиц Х ,^К -^АТФаз с использованием базы данных SAGEmap. Выявлено вероятное снижение уровня экспрессии генов отдельных изоформ как каталитических, так и регуляторных субъединиц Ка*,К -^АТФазы при злокачественной трансформации некоторых тканей.