Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Н +-АТФазный комплекс хлоропластов: механизмы катализа, регуляции и трансформации энергии

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Н +-АТФазный комплекс хлоропластов: механизмы катализа, регуляции и трансформации энергии"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ им. А.Н.БАХА

На правах рукописи УДК 577.3

МАЛЬЯН АЛЕКСАНДР НЕРСЕСОВИЧ

Н+-АТФазньтй КОШЛЕКС ХЛОРОПЛАСТОВ: МЕХАНИЗМЫ КАТАЛИЗА, РЕГУЛЯЦИИ И ТРАНСФОРМАЦИИ ЭНЕРГИИ

03.00.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

А'¡435

Москва - 1988 г.

Работа выполнена в Институте почвоведения и фотосинтеза АН СССР

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор А.Д.Виноградов

Доктор биологических наук, профессор Д.Н.Островский

Доктор биологических наук Ю.Г.Молоткшский

Защита диссертации состоится "_"_ 1989 г.

в_часов на заседании Специализированного совета Д 002.96.01

по залдате диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биохимии им. А.Н.Баха АН СССР (117071, Москва, Ленинский пр., 33, корп. 2).

Ведущая организация: Институт химической физики АН СССР.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы АН СССР (117071, Москва, Ленинский пр., 33, корп. I).

Автореферат разослан "_"_ 1989,г.

Ученый секретарь Специадтэ'доованного совета доктор химических наук •

К.Л.Гладилин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Фотофосфорилирование аденозиндифос-фата является одним из центральных звеньев процесса преобразования солнечной энергии фотосинтетическими мембранами и составляет основу энергетического баланса растительного организма. Основные этапы процесса преобразования энергии в хлоропластах исследовались радом научных коллективов у нас в стране и за рубежом. В результате этих исследований достигнуты значительные успехи в понимании структурной и функциональной организации фотосинтетического аппарата и, в частности, в изучении молекулярной организации светособирающих и электронтранспоргных комплексов, закономерностей разделения зарядов, транспорта электронов и его сопряжения с переносом протонов, в выяснении природы темновых стадий фотосинтеза, связанных с ассимиляцией углекислоты. Существенный вклад в создание современных представлений о мембранном энергетическом сопряжении в энергопреобразующих системах различного происхождения внесли работы П.Митчелла, Р.Дж.П.Вильямса, В.П. Скулачева.

В хлоропластах, митохондриях и бактериях конечный этап трансформации энергии реализуется посредством сопряжения переноса протонов с синтезом АТФ, которое осуществляется специализированным полипептидным комплексом - Н+-АТ®азой (АТФ-синтетазой) /Скулачев, 1974/. Непосредственно участвуя в образовании АТФ и контролируя (через рН внутритилакоидного пространства и электронный транспорт) образование другого богатого энергией соединения - восстановленного НАДФ.-АТФаэный комплекс хлоропластов занимает ключевое положение в системе энергообеспечения растительного организма. Способность комплекса к модуляции каталитической активности и к изменению сродства к субстратам и продуктам фотофосфорилирования определяет возможности адаптации энергетического аппарата растений к изменяющимся условиям внешней среды. Комплекс состоит из двух основных частей: водорастворимого сопрягающего фактора фотофосфорилирования СФр осуществляющего ферментативный катализ и регуляцию реакции, и гидрофобного фактора СФ0, обеспечивающего перенос протонов к СФр Несмотря на решающую роль СФ^ в проявлениях функциональной активности АТФаз-ного комплекса, молекулярные механизмы, определяющие его каталитическую активность и регуляторные свойства, изучены весьма слабо.

Характерной особенностью Н+-АТФазных комплексов является их способность обратимо трансформировать разность электрохимических

потенциалов протонов через мембрану в энергию макроэргической фосфоангидридной связи АТФ /Митчелл, 1966; Скулачев, 1974/. Физико-химическая природа процессов трансформации энергии полипептидными комплексами неясна, и ее изучение составляет одну из фундаментальных задач биоэнергетики. Выяснение механизма основных стадий трансформации энергии Н^АТФазным комплексом хлоро-пластбв может внести в решение этой задачи существенный вклад.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является выяснение молекулярного механизма функционирования Н+-АТФазного комплекса хлоропластов как биологической структуры, сочетающей ферментативные свойства со способностью к преобразованию разности электрохимических потенциалов протонов в энергию фосфоангидридной связи АТФ. Достижение указанной цели потребовало решения следующих основных задач:

- изучения субъединичного состава и свойств изолированного и встроенного в липосомы Н+-АТФазного комплекса хлоропластов как наиболее простой структуры, способной осуществлять процессы гидролиза и синтеза АТФ сопряженно с трансмембраннш переносом протонов;

- выяснения аминокислотного состава, структуры и локализации каталитического центра сопрягающего фактора СФр

- исследования закономерностей регуляции АТФазной активности выяснения роли нуклеогидов и других эффекторов, определения функций и характера взаимодействий нуклеотидсвязывагацих центров фермента;

- анализа взаимосвязи АТФазной и АТФ-синтетазной активностей АТФазного комплекса;

- выяснения роли СФ^ в переносе протонов и сопряжении этого процесса с отдельными стадиями синтеза и гидролиза АТФ.

Научная новизна. В диссертационной работе вццвинуты и экспериментально обоснованы новые представления о механизмах катализа, регуляции и трансформации энергии Н+-АТФазным комплексом хлоропластов, совокупность которых можно квалифицировать как новое направление в области биоэнергетики фотосинтеза.

Уточнен субъединичный состав и молекулярные массы субъединиц АТФазного комплекса хлоропластов, способного к „-АТФ

н

обмену и гидролизу АТФ, сопряженному с трансмембранным переносом протонов. Определены кинетические параметры [р32] ФН-АТФ обмена. Определены аминокислотные остатки, участвующие в каталитическом акте и входящие в состав нуклеотидсвязывакмцих центров фермента. Показано, что каталитические центры фермента локализованы на его -субъединицах. Установлено, что нуклеотидсвязывающие центры

оС -субъединиц не принимают непосредственного участия в гидролизе АТФ. Предложен механизм катализа, согласно которому ускорение обратимой реакции гидролиза АТФ происходит в результате связывания отрицательных зарядов атомов кислорода фосфатных групп аминогруппами лизина и аргинина, а также ионами Ма2+, что приводит к появлению парциального положительного заряда на атоме ^-фосфата, облегчающего нуклеофильную атаку гидроксилом воды.

Раскрыт механизм нуклеотидзависимой регуляции АТФазной активности сопрягающего фактора хлоропластов. Обнаружена специфичность регуляции к иону магния. Показано, что регуляция осуществляется путем медленного обратимого подавления 1^2+-зависимой АТФазной активности СФ^ в результате связывания АДФ с одним из центров, диссоциации АТФ с другого центра при сохранении связи АТФ с третьим центром фермента. Обратный процесс - связывание АТФ и сопряженная диссоциация АДФ - приводит к реактивации СФ|-АТФазы. Найдено, что роль активирующего лиганда, помимо АТФ, могут играть оксианионы. Предложенный механизм активации позволяет объяснить регуляторные эффекты бикарбоната, фосфата, флавонолов и других соединений анионной природы, локализованных в хлоропла-стах. Установлено, что нуклеотидзависимая регуляция осуществляется на уровне -субъединичных пар СФр Выявлена роль кооперативных перестроек структуры в изменении каталитических свойств фермента.

Впервые применительно к сопрягающему фактору хлоропластов установлено, что он может находиться в двух альтернативных состояниях: АТФазном (гидролазном) и АТФ-синтетазном. Прочное связывание АДФ подавляет гидролазное и поддерживает синтетазное состояние СФр связывание АТФ подавляет синтетазное и стабилизирует гидролазное состояние фермента. На основании сопоставления полученных закономерностей с закономерностями регуляции митохон-дриальной АТФазы, раскрытыми Виноградовым с соавт. /1980, 1984/, сделан вывод об общности механизмов взаимопревращения АТФазного и АТФ-синтетазного состояний сопрягающих факторов различного происхождения.

Выявлена зависимость соотношения АТФ и АДФ, прочно связанных с СФ}-, от рН среды. Характер зависимости свидетельствует о существовании специфических кислотно-основных групп фермента, протонирование которых сдвигает равновесие реакции в сторону АТФ. Сделан вывод, что энергозависимой стадией фотофосфорилирования наряду с диссоциацией АТФ является синтез АТФ на каталитическом центре из АДФ и фосфата. Предложен молекулярный механизм сопряжения переноса протонов через СЯ^ с образованием фосфоангидрид-

ной связи АТФ, включающий циклические изменения относительного сродства ОФ^- к субстратам и продуктам реакции в результате про-тонирования и диссоциации специфических кислотно-основных групп, попеременно контактирующих с протонным каналом АТФазного комплекса и реакционной средой.

Научное и практическое значение работы. Сформулированные в работе представления о механизме функционирования Н+-АТФазы хло-ропластов важны для понимания основных принципов работы энерго-трансформирующих ферментов. Концепция взаимосвязи процессов про-тонирования-депротонирования с энергетическими уровнями интерме-диатов каталитического процесса может быть использована для выяснения механизмов функционирования Н+-АТФаз различного биологического происхождения.

Описание аминокислотной структуры активного участка СФ|-АТФазы представляет интерес для изучения каталитических свойств других аденозинтрифосфатаэ, а также для конструирования ферментов методами генной инженерии. Раскрытые в работе закономерности регуляции активности С^-АТФазы являются теоретической основой для понимания механизмов влияния эндогенных регуляторов на процессы запасания энергии в хлоропластах. Они могут быть применены для целенаправленного поиска средств регулирования активности фотосинтетического аппарата растений. Выявленные в результате проведенного исследования свойства АТФазного комплекса хлоропла-стов и кинетические закономерности его функционирования в настоящее время используются в работе по созданию искусственных фото-синтезирующих систем регенерации АТФ. Они могут быть также положены в основу математических моделей энергообеспечения растительного организма.

Разработанные в ходе проведенного исследования новые методические приемы могут найти применение в энзиматических исследованиях. В частности, метод расчета концентрации АДФ в нестационарном режиме может быть использован при определении кинетических параметров АТФаз, спектрометрический метод титрования тиро-зиновых остатков - для изучения конформационных изменений белков, метод неспецифичного ковалентного связывания радиоактивной метки - для локализации модифицированных аминокислотных остатков.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены на Ш и У Всесоюзных биохимических съездах /Рига, 1974; Киев, 1986/, I Всесоюзном биохимическом съезде /Москва, 1982/, 1У, У и IX Всесоюзных семинарах по фотосинтезу /Пущино, 1972, 1973 и 1976/, Всесоюзной школе по биомембранам /Звенигород, 1981/, IX Всесоюзном симпозиуме "Митохондрии. Механизмы сопряже-4

ния и регуляции" /Пущино, 1981/, Всесоюзной конференции "Проблемы фотоэнергетики" /Львов, 1984/, Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы и регуляция энергетического обмена" /Пущино, 1986/, на заседании Всесоюзного биохимического общества /Москва, 1985/, семинарах Межфакультетской проблемной НИЛ молекулярной биологии и биоорганической химии им. А.Н.Белозерского, а также на У и У1 Объединенных симпозиумах биохимических обществ СССР-ГДР /Веймар, 1979; Таллин, 1981/, ХУЛ симпозиуме "Структура и функции фотосинтетического аппарата" /Рейнхардсбрунн, 1979/, Ш Советско-шведском симпозиуме "Физико-химическая биология" /Тбилиси, 1981, Ш Международной школе по структуре и функциям биомембран /Варна, 1984/, 16-й и 18-й Конференциях ФЕБО /Москва, 1985; Любляна, 1987/, УП Международном конгрессе по фотосинтезу /Провиденс, 1986/.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 41 работа в отечественных и международных изданиях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 316 страницах машинописного текста и содержит 81 рисунок, 21 таблицу. Список литературы включает более 500 ссылок на работы отечественных и зарубежных авторов.

Глава I. СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ Н+-АТФазного КОМПЛЕКСА ХЛОРОПЛАСТОВ

АТФазный комплекс хлоропластов (АКХ) представляет собой наиболее простую биологическую структуру, сохраняющую все функции АТФазной системы хлоропластов - способность катализировать синтез и гидролиз АТФ сопряженно с трансмембранным переносом протонов. В связи с этим представлялось целесообразным исследовать его субъединичный состав, свойства и рассмотреть возможность его использования для изучения молекулярного механизма этих процессов.

I. Субъединичный состав АКХ. Согласно литературным данным, в состав изолированного АКХ входит от 8 до 13 типов субъединиц /Cermeli, Racker, 1973; Winget et al., 1977; Pick, Racker, 1979; Nelson et al., 1980/. Расхождения в субъединичном составе препаратов АКХ, полученных различными исследователями, также, как и низкие активности этих препаратов, могут быть вызваны недостатками методов их вьделения, очистки, встраивания в липосомы и анализа. Поэтому в настоящей работе использовали усовершенствованную нами ранее методику получения АКХ /Захаров, Мальян, 1981/

Основные этапы методики включали экстрагирование хлоропластоь раствором холата натрия, высаливание экстракта при 30-38?6 насыщения сульфатом аммония и очистку центрифугированием в градиенте концентраций сахарозы. Полученный препарат, не проявляя РДФ-кар-боксилазной активности, обладал АТФазной активностью и способностью после встраивания в липосомы катализировать 1^р]фн-АТФ обмен, подавляемый ДЦКД. Электрофорез этого препарата свидетельствует о наличии в общей сложности 8 типов субъединиц, из которых 5 принадлежат C$j и 3 - СФ (рис. I). Молекулярные массы субъединиц OSj составили: 59,2±0,9 (ot), 56,0±0,6 (f ), 38,0±0,7 (у), 20,7±0,5 (5 ) и 15,5-0,6 (& ) кД, субъединиц СФ0 - 18,6± 0,9 (а ), 15,3±0,5 ( Ь) и 8,1*0,5 (С ) кД.

Рис. I. Электрофорез в 15/6 ПААГ в присутствии 0,1% додецилсульфата натрия АКХ, очищенного центрифугированием в сахарозном градиенте. оС, j* . у I $ и £ - субъединицы СФ|; а , b и с - субъединицы гидрофобной части АКХ.

Аналогичный субъединичный состав имеют АТФазные комплексы из термофильной бактерии is 3 и Escherichia coli. Учитывая подобие в стехиометрии субъединиц, можно заключить, что АТФазные комплексы хлоропластов и бактерий структурно близки.

2. Свойства АКХ, встроенного в липосомы. Протеолипосомы со встроенным АКХ катализировали гидролиз АТФ, [Р]ФН~АТФ обмен и обладали способностью вызывать тушение флуоресценции 9-аминоакридина (9-АА), подавляемое ингибиторами трансформации энергии (ДЦКД.ТБО), разобщителем (FQCP) и ингибитором гидролиза АТФ (ДЦФ). Эти данные свидетельствуют о возникновении на мембранах протеолипосом градиента электрохимического потенциала протонов, , вызы-

ваемого переносом протонов внутрь протеолипосом, сопряженным с гидролизом АТФ. В присутствии Фн и АДФ энергия ajSH->- используется в реакции синтеза АТФ, которая, по современным представлениям /Davenport, McCarty, 1981; Захаров, 1983/, является одной из стадий реакции обмена.

При анализе кинетики -АТФ обмена был обнаружен лаг-

период реакции. Сопоставление влияния ингибиторов и стимуляторов гидролиза АТФ на величину лаг-периода и на время достижения ста-6

• -в -f

9тЛ

§

-6 - а

=С L

- С

ционарного уровня флуоресценции 9-АА позволяет сделать вывод,что появление лаг-периода обусловлено временем, необходимым для достижения такой величины , которая достаточна для инициации синтеза АТФ.

С целью выяснения возможности использования встроенного в липосомы АКХ в качестве модельной системы для изучения механизма катализируемых им процессов, были определены кинетические параметры синтетазной и гидролазной составляющих реакции обмена и сопоставлены с параметрами реакций, катализируемых хло-ропластами. Применение усовершенствованной нами методики выделения и реконструкции АКХ позволило существенно сблизить кинетические параметры обоих систем. Однако между сравниваемыми системами остаются значительные различия в величинах кажущихся констант Михаэлиса для АТФ (I мМ на протеолипосомах и 33 мкМ на хлоропла-стах) и, особенно,, в стационарной скорости синтетазной реакции (4,6 с и 400 с , соответственно). Резкое изменение кинетических параметров реакции синтеза АТФ при переходе от тилакоидных мембран к протеолипосомам независимо от причин, вызывающих эти различия (взаимосвязь синтетазной и гидролазной составляющих обмена, сопряженных через влияние различий в липидном составе мембран на их протонную проницаемость и каталитические свойства АКХ) может быть следствием смены лимитирующей стадии реакции. Поэтому применение протеолипосом как модельной системы для кинетического исследования механизма функционирования АКХ представлялось неправомерным. По уровню активности к нативной АТФазной системе хлоропластов наиболее близок сопрягающий фактор СФ^ (до 500 с-1 при 37°). Учитывая, что выполняет каталитические функции АКХ, мы его выбрали в качестве наиболее простой модельной системы для изучения ферментативных свойств комплекса. Дальнейшая работа показала, что в сочетании с изучением АТФазных и АТФ-синтетазных свойств тилакоидных мембран, изучение может дать обширную информацию о механизме регуляции и трансформации энергии АТФазным комплексом хлоропластов.

Глава 2. КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА СОПРЯГАНДЕГО ФАКТОРА ХЛОРОПЛАСТОВ

Структура фермент-субстратного комплекса реакции гидролиза и синтеза АТФ. Субстраты и продукты реакций гидролиза и синтеза АТФ, являясь остатками многоосновных кислот, присутствуют в реакционной среде в нескольких формах, различающихся степенью диссоциации и способностью образовывать комплексные соединения с двухвалентными металлами. При изменении концентрации

СаС12 в реакционной среде скорость гидролиза АТФ меняется сим-батно увеличению содержания комплекса Са-АТФ и не коррелирует с содержанием свободных форм АТФ (рис. 2). При концентрациях МеС12 до I мМ аналогичный характер имеет зависимость скорости реакции от концентрации М§-АТФ.

5 |

ё 9-

С?

¡2 О

г

50 ■

[АТФ-4] [С."]

Рис. 2. Зависимость скорости гидролиза АТФ и концентраций АТФ^~ Са-АТФ2~ и Са2+ от содержания в среде хлорида кальция. Состав .среды: 25 мМ трис-сульфа-та (рН 8,0), 2,5 мМ АТФ, 24 мкг/мл СФр

Изменение скорости синтеза АТФ коррелирует с концентрацией магниевых комплексов фосфата и АДФ и не коррелирует с концентрациями свободных форм этих реагентов. С возрастанием концентрации МвС12 значения кажущихся констант Михаэлиса по АДФ и Фн уменьшаются. В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что "истинными" субстратами реакций гидролиза и синтеза АТФ являются магниевые комплексы АТФ, АДФ и фосфата.

Участие магния в обоих субстратах фотофосфорилирования позволяло ожидать, что в интервале концентраций, далеких от насыщения, будет наблюдаться второй порядок реакции по иону магния. Исходя из принципа полной микрообратимости каталитических стадий, такой же порядок по иону металла должна иметь реакция гидролиза АТФ. Найдено, что в области низких концентраций ионов кальция или магния в широком интервале рН кинетика реакции описывается зависимостью второго порядка по иону металла. Такой характер кинетики указывает, что в состав комплекса субстрата (субстратов) с каталитическим центром фермента входят два двухвалентных катиона (кальция или магния).

Результаты ряда экспериментов свидетельствуют о том, что свободные формы нуклеотидов, фосфата и двухвалентных катионов могут непосредственно связываться с СФ^. Защитное влияние этих соединений проявлялось при инактивации фермента щелочными значениями рН или хаотропным реагентом (0,46 М ЫаВг), а также при мо-

дификации его функционально важных аминокислотных остатков (табл. 2). В результате инкубации СФ| с радиоактивными нуклеоти-дами в присутствии I мМ ЭДТА при рН 8,0 в него включалось до 1,2 моль [14с]дцф и 0,2 моль АТФ на моль фермента. Исследования методом ЭПР показали, что СФ^ может связывать до 6 ионов марганца, способного заменять ма-гний в реакциях синтеза и гидролиза АТФ.

Способность нуклеотидов, фосфата и двухвалентного катиона взаимодействовать с ферментом и друг с другом дает основание предложить следующую структуру комплекса субстратов (продуктов) реакщи с каталитическим центром фермента:

Ме-АТФ-Ме--- Ме-ДДФ-Ф„-Ме

| II 11 Г 1

'77777777777777' 7777777777777777

2. Локализация каталитического центра СФ|-АТФазы. Сопоставление АТФазной активности препаратов СФр отличающихся своим субъединичным составом, показало, что исключение минорных (у,

, £) субъединиц не снижает каталитической активности фермента. Для уточнения локализации каталитического центра СФ| инкубировали с мечеными активированными аналогами АТФ и АДФ, [ %]оАДФ и

[Зн]

оАТФ, подвергали денатурирующему электрофорезу и определяли радиоактивность его о1 и ^ субъединиц, В отсутствие ионов магния метились обе субъединицы. Включение магния в среду инкубавди приводило к преимущественному увеличению радиоактивности р субъединицы как в случае оДЦФ, так и оАТФ. Определение локализации карбоксильной группы, ответственной за связывание двухвалентных катионов, входящих в состав "истинного" субстрата реакции, показало, что эта группа также располагается на р субъединице (подробнее об этом см. раздел 4, рис. 4). На основании полученных результатов сделан вывод о локализации каталитического центра СФ£ на субъединице.

3. Функционально важные участки молекулы субстрата СФ|-АТФ-азы. Сравнение эффективности ингибирования гидролиза АТФ различными его аналогами - АМРРСР, АДФ, АМФ, аденозином и аденином -свидетельствует о том, что в связывании с ферментом принимают участие р и [ фосфорильные остатки полифосфатной цепи нуклео-тида. Замена иминогруппы при Сб на кислород при переходе от аде-нозин- к гуанозинфосфатам приводит к увеличению константы ингибирования реакции нуклеозиддифосфатом и снижению реакционной способности нуклеозидтрифосфата. В то же время отсутствие имида-зольной части гетероциклического основания (переход от гуанозин-

к уридинтрифосфатаы) практически не отражается ни на способности нуклеотида к ингибированию гидролиза, ни на его реакционной способности. Эти данные позволяют предположить, что во взаимодействии субстрата с каталитическим центром важную роль наряду с пирофосфатной частью молекулы выполняет иминогруппа при С6 аде-нинового основания.

4. Функционально важные аминокислотные остатки СФ^АТФазы. Одним из подходов к выяснению природы таких остатков является выяснение констант диссоциации их кислотно-основных' групп. Анализ зависимости, приведенной на рис. 3 (кривая I), указывает на существование двух таких групп, одна из которых, с рК 6,3,: в каталитически активном состоянии фермента находится в недиссоци-ированной форме, а другая, с рК 8,9 - в диссоциированной. Значения констант диссоциации группы, ответственной за связывание ионов магния, рассчитывали по уравнению

¿Г

.2+

]

справедливому в области низких концентраций ионов магния. Определенное графически значение рК этой группы равно 8,3 (рис.'3, кривая 2).

11,0

о,о

2,0

6,0

рН

в,О

Рис. 3. Зависимость максимальной скорости гидролиза АТФ (I) и константы диссоциации комплекса магния с О»! (2) от рН среды. Состав среды: 40 мМ МЭС-трис-хло-рида; 4,2 мМ АТФ; 100 мМ Иа^о^; 2 мМ фосфоенолпиру-вата; 1055 об. с2н5он; 0,82,5 мкг/мл СФ^ 60 мкг/мл пируваткиназы.

Для выявления функционально важных аминокислотных остатков применяли реагенты, модифицирующие ионогенные группы: сульфгид-рильную группу цистеина (ПХМБ), имидазольную группу гистидина (бенгальский розовый и метиленовый голубой), фенольную группу тирозина (йод, тетранитрометан (ТНМ)), 6 -аминогруппу лизина (тринитробензолсульфокислота (ТНБС), пиридоксаль фосфат (ПФ), диальдегидные производные нуклеотидов (оАДФ, оАТФ)), гуанидино-

вую группу аргинина (фенилглиоксаль (ФГ)), карбоксильные группы аспарагиновой и глугеминовой кислот (карбодиимиды ЩКД и ДЦКД). Способность почти всех указанных модификаторов реагировать с БН-группами и части из них (карбодиимиды) - с имидазольными группами, а также близость констант диссоциации этих групп к значениям, найденным при исследовании кинетики гидролиза АТФ, определила необходимость первоочередного выяснения роли цистеиновых и гис-тидиновых остатков в ферментативной активности СФр Было обнаружено, что ПХМБ в концентрации 2 х Ю-4 М при 30-минутной инкубации подавляет активность фермента, обладающего полным набором субъединиц, но не влияет на активность препарата, содержащего только оС и р полипептиды. Из полученных результатов следует, что влияние модификации БН-групп на активность СФ|-АТФазы осуществляется через сульфгидрильные группы минорных- субъединиц.

Таблица 2

Влияние АТФ, ДДФ, фосфата, ионов кальция и магния на

инактивацию СФ^АТФазы групп специфичными реагентами

Модификатор

Условия инкубации

!АТФ!АДФ! Ф„ »СаС10!МвС10!СаАТФ!МЕА'К6!кон- !вре-! ? ! ! \ \ ! \цент-!мя,

'рация!

активность, % от контроля ! !.

¡мин

Йод 27 30 _ 27 34 _ 37 0,2 5

Тетранитро-метан 45 65 56 46 41 79 69 67 2,8 25

Фенилглиоксаль аз 1 36 28 28 16 _ 22 _ 1,0 45

ТНБС 9- 23 24 - 6 8 - - 0,45 30

Пиридоксаль фосфат '39' 62 52 35 42*) 24 _ _ _ 0,7 5

оАДФ 27 58 58 27 - - - 0,5 10

ЦМВД (рН 6) 21 25 23 - 38 43 38 42 1,0 60

Исходная активность СФ^-АГФазы составила 20,6 мкм0ль'мин~*'мг~*. За исключением неорганического фосфата (2 мМ и 16 мМ*^), все добавки вводились в концентрации I мМ.

Освещение растворов СФ| в присутствии бенгальского розового и метиленового голубого приводило к инактивации фермента. Однако, рН-профиль инактивации не соответствовал модификации гистидино-вого остатка. Очевидно, причиной изменения активности в этом

случае является неспецифическая модификация другого аминокислотного остатка, вероятнее всего, тирозинового. СФ^-АТФаза инакти-вировалась йодом, ТНМ, ТНБС, ПФ, ФГ, ЦМВД и ДЦВД (табл. 2). При отсутствии в каталитическом центре сульфгидрильных и имидазоль-ных групп, подавление активности этими реагентами свидетельствовало о функционально важной роли остатков тирозина, лизина, аргинина и карбоксильных групп аспарагиновой/глутаминовой кислоты. Первый порядок инактивации фермента ТНБС, ФГ и ЦМКД указывал, что потеря активности вызывается модификацией лишь одного аминокислотного остатка. Было определено рК карбоксильной группы, равное 6,3. Измерения спектра поглощения СФр инкубированного с ЦМВД в присутствии красителей (используемых в качестве ковалент-но связывающихся нуклеофильных соединений), показали, что модификация 1,3 карбоксильной группы ла моль СФ^- приводит к 86-88% инактивации фермента. С помощью другого нуклеофильного соединения, [14с] лизина было установлено, что модифицируемая карбоди-имидами группа локализована на субъединице, выполняющей каталитическую функцню (рис.. 4).

и

I

500

300 100

kJ

JJ

Рис. 4. Гель-электрофорез С$2 в присутствии додецил-сульфата натрия после инкубации с ДЦВД и [14с] лизином.

1УГ>ПН-_С=И

0 3 5 7 9 см

Наряду с ТНБС и ПФ мы использовали применяемые в качестве реагентов на лизиновые остатки диальдегидные производные АТФ и АДФ Дашей et al., 1978; Lowe et al., 1979/. В реакции гидролиза АТФ эти производные проявляли себя в качестве слабореакционно-способных субстратов (оАТФ) или конкурентных ингибиторов (оАДФ). Предынкубация фермента с ТНМ, ПФ, ФГ и ЩКД приводила к снижению включения в СФ^ [ ШоАТФ, что свидетельствовало об участии тиро-зиновых, лизиновых, аргининовых и аспарагиновых/глутаминовых остатков в связывании нуклеогидов. Дополнительным доказательством такого участия явилось снижение степени инактивации фермента в присутствии нуклеотидов, фосфата и двухвалентных катионов (табл. 2). В отличие от действия модификаторов лизиновых и аргининовых остатков, эффект реагентов на тирозин ослаблялся не только аде-12

ниннуклеотидами, но и ионами магния. Это может указывать на существование двух типов тирозиновых остатков, взаимодействующих, соответственно, с нуклеотидаш и ионами Мс2+. Такое предположение согласуется с существованием двух обнаруженных кинетическим исследованием кислотно-основных групп, с рК 8,9 и 8,3, ответственных за связывание нуклеотидов и ионов магния. Наличие тирозиновых остатков со столь низкими значениями рК подтверждается данными спектрофотометрического титрования СФр Совокупность полученных данных позволяет сделать вывод, что в состав каталитического центра входят остатки тирозина, лизина, аргинина и аспарагиновой/глутаминовой кислот.

Принимая во внимание способность тирозиновых остатков вступать в стэкинг-взаимодействие с гетероциклической частью аденин-нуклеотида, можно предположить существование связи между пурино-вой частью АТФ и тирозиновым остатком (рис. 5). Образование водородной связи между аминогруппой при С6 аденина и гидроксильной группой тирозина будет обеспечивать избирательную фиксацию аде-нинового основания. Ослабление инактиващи СФ^-АТФазы, вызываемой реагентами на лизиновые и аргининовые остатки, в присутствии фосфатсодерскащих лигандов (ДДФ, АТФ, Фн) между отрицательно заряженными атомами кислорода фосфорильных групп субстрата (субстратов) и положительно заряженными амино-/иминогруппами этих остатков дают основание полагать, что последние связываются с полифосфатным "хвостом" АТФ. Способность 2'3'-диальдегидной группы оАДФ СоАТФ) взаимодействовать с лизином говорит об их близком расположении и позволяет предполагать, что лизиновый остаток взаимодействует с атомом кислорода, принадлежащим ко(-фос-фату нуклеозидцифосфата. Гуаняновая группа аргинина, соответственно, связывается с кислородными атомами р и ¡С -фосфатов. Хелатируемый нуклеотидом двухвалентный катион вступает в координационное взаимодействие с карбоксильной группой аспарагиновой/ глутаминовой кислоты. В пользу этого предположения свидетельствуют защитное действие ионов Ме2+* от инактивации карбодиимида-ми и потеря способности модифицированного СФ^ или его субъединицы к связыванию иона марганца и [.^-оАТФ. Второй ион Ме2+> как следует из данных кинетического анализа, участвует В' проме- • жуточной стадии стабилизации ортофосфата при его присоединении к АДФ или отщеплении от АТФ. Этот ион Ме2+ может связываться с защищаемым ионом магния вторым остатком тирозина. На начальной стадии гидролиза АТФ в каталитическом центре происходит взаимодействие атомов кислорода ^ фосфата АТФ с гуанидиновой группой и ионами Ме2+, что вызывает смещение электронной плотности в

сторону атомов кислорода и появление на у- фосфате парциального положительного заряда. Поляризация 0-Р связи облегчает нуклео-фильную атаку ^ фосфата ОН-группой молекулы воды, входящей в координационную сферу одного из ионов Ме2+. Следующая стадия, в соответствии с общими закономерностями гидролиза фосфорно-эфир-ной связи, включает образование тригональной бипирамидальной структуры и стабилизацию продуктов реакции за счет ухода АДФ из аксиального положения по отношению к фосфату /Hudson, 1965; Ксг-шап, McLick, 1972/. Б последующих стадиях происходит освобождение кислорода фосфорильной группы из координационной сферы хела-тируемого нуклеотидом Ме2+ и диссоциация продуктов реакции.

Глава 3. РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ СОПРЯГАНЦЕГО ФАКТОРА ХЛОРОПЛАСТОВ

1. Формирование представлений о регуляторных свойствах СФ^--АТФазы. В разделе рассмотрены литературные данные о факторах, участвующих в регуляции активности АКХ и изолированного СФр Обоснованы задачи исследования, включающие выяснение закономерностей регуляции активности СФ^-АТФазы нуклеотидами, ионами магния, рядом физиологически активных соединений и установление взаимосвязи АТФ-гидролазной и АТФ-синтетазной активностей АКХ.

2. Ингибирование СЯ^-АТФазы АДФ и ионами магния в квазистационарном режиме. Ингибирующее действие АДФ и ионов магния взаимозависимо - снижение концентрации одного из них ослабляет влия-

ние другого (рис. 6). При рН 8,0 кажущиеся константы ингибирования (при избытке второго компонента) составляют: по АДФ 0,2 мкМ, по Мв2+ 56 мкМ. Неконкурентный характер ингибирования позволяет

Рис. 6. Влияние АТФ-ре-генерирующей системы на ингибирование реакции ионами магния. Состав среды: 25 мМ трис-суль-фат (рН 8,0); 0,2 мМ ЭДТА; 4,8 мМ АТФ; 0,2Ш АДФ (I); 2 мМ фосфо-енолпирувата (2); 15 мкг/мл пируваткиназы (2); 15 мкг/мл ОФр

заключить, что центр, ответственный за связывание АДФ и Мв2+, является аллостерическим. Зависимость ингибирования реакции от присутствия обоих ингибирующих компонентов свидетельствует о том, что подавление активности обусловлено образованием тройного комплекса СФ]- с АДФ и ионом Ме2+. Принимая во внимание различия в константах ингибирования этих компонентов, образование такого комплекса должно происходить в произвольной последовательности:

СФ! Мд-СФ,*АДФ

Мд-'АДФ

3. Кинетика обратимой инактивации ОФ^АТФазы. Непосредственно после введения в реакционную среду СФ^-АТФаза проявляет высокую 1^2+-зависимую активность, превышающую активность фермента в присутствии ионов Са^+ (рис. 7). При длительной инкубации Са-зависимая активность сохраняется, тогда как М£2+-зависи-мая активность падает, достигая в течение 1-2 минут сравнительно низкого стационарного уровня.

Полученные зависимости дают основание рассматривать наблюдаемое в квазистационарных условиях ингибирование реакции как следствие АДФ- и Мё2+-зависимой обратимой инактиващи фермента.

15

Аналогичное свойство митохондриальной АТФазы было ранее обнаружено Виноградовым с сотр. /1979/.

Рис. 7. Кинетика гидролиза АТФ в присутствии 4 мМ МеС12 (I), 10 мМ СаС12 (2). Состав среды: 20 мМ трис-сульфата (рН 7,8); 50 мМ КС1; I мМ АТФ; I мМ фосфоенолпирувата; 0,3 мМ НАД-Н; 8 ед/ мл лактатдегидрогеназы; 40 ед/мл пиру-ваткиназы; 175 мкг/мл СФ|.

При инкубации СФ]--АТФазы, содержащей 0,95±0,1 моля прочно связанного АДФ на моль СФ-р с I мМ МеС12 в отсутствие АТФ, высокая начальная активность фермента подавляется без изменения стационарной активности. Эти данные позволяют заключить, что центр прочного связывания АДФ и центр, ответственный за АДФ- и Не2+-зависимую инактивацию, функционально неразличимы.

В условиях избытка АДФ инактивация фермента описывается уравнением 1-го порядка. Кажущаяся константа скорости инактивации (12 мин-*) примерно на 2 порядка ниже константы скорости реакции, что позволяет исследовать изменения кинетических параметров фермента в процессе его инактиващи. Через 4 сек после введения фермента в реакционную среду зависимость обратной скорости реакции от обратной концентрации АТФ имеет линейный вид и характеризуется кажущимся значением «= 19 мкМ. Реакция конкурентно ингибируется АДФ (КА = 24 мкМ). В результате инактивации график Лайнуивера-Берка в области высоких концентраций субстрата становится нелинейным (рис. 8). Вид графика предполагает участие двух нуклеотидсвязывающих центров - с высоким и низким сродством к АТФ. Характер такого графика в области низких концентраций субстрата при варьировании АДФ свидетельствует о наличии каталитического центра (К^ 2 мкМ) и контролирующего активность АДФ-связывающего центра (1^ = 0,4 мкМ) (рис. 8). "Неконкурентное" поведение СФ|-АТФазы и увеличение сродства обоих центров к АДФ и АТФ в процессе инактивации позволяют предположить, что неактивной форме фермента соответствует комплекс АДФ'СФ^АТФ.

Экстраполяция графика Лайнуивера-Берка, полученного при варьировании высоких концентраций АТФ (2,5-10 мМ), позволяет определить кажущуюся константу Михаэлиса, характеризующую центр слабого связывания АТФ (К& = 13 мМ). Для выяснения функциональной роли этого центра исследовали кинетику гидролиза АТФ в присутствии негидролизуемого аналога АТФ - АМРРСР. Было обнаружено,

что АМРРСР, ингибируя начальную скорость, повышает ее стационарное значение. Эффект негидролизуемого аналога свидетельствует о том, что увеличение стационарной скорости реакции при высоких концентрациях нуклеотида вызывается не превращением, а связыванием АТФ с центром, выполняющим регуляторную функцию.

[АТФ, мМ]"1

Рис. 8. Ингибирование квазистационарной скорости реакции аденозиндифосфатом. Состав среды: 20 мМ трис-хлорида (pH 6,5); 50 мМ KCl; 10 мМ MgCl2; 0,15 мМ НАД-Н; 2,0 мМ фосфоенолпирувата; 8 ед/мл лактатдегидрогеназы; 50 мкг/мл Gij. Концентрация пируваткиназы: 1-40 ед/мл; 2-4 ед/мл.

На рис. 9 представлены зависимости значений Ка и от продолжительности инкубации C3>j в реакционной среде. В сопоставлении с изменениями скорости реакции данные рис. 9 свидетельствуют о том, что изменения сродства АТФ и ДДФ к нуклеотидсвязывающим центрам (центру), выполняющим регуляторную функцию, взаимосвязаны и сопряжены с инактивацией фермента. Наряду с указанными процессами в ходе инактивации происходит повышение сродства АТФ к каталитическому центру, на что указывает снижение величины К^.

4. Локализация центра, ответственного за обратимую инактивацию СФу-АТФазы'. Сопоставление препаратов C$j, различающихся субъединичным составом, по их способности к обратимой инактивации 'привело к заключению, что центр, контролирующий АТФазную активность фермента, находится в пределах о( - ji субъединичной пары. Было найдено, что при модификации карбодиимидами карбоксильных групп, ответственных за связывание двухвалентных катионов, наряду со снижением каталитической активности происходит ослабление

Рис. 9. Зависимость кажущейся константы Михаэлиса (в области высоких концентраций АТФ) и константы ингибирования АДФ (в области низких концентраций АТФ) от продолжительности инкубации СФ| в реакционной среде.

способности фермента к и АДФ-зависимой инактивации. Из

этого следовало, что карбоксильные группы участвуют в связывании не только катиона, входящего в фермент-субстратный комплекс, но и катиона, вызывающего инактивацию. Поскольку обе модифицируемые карбодиимидами группы расположены на §> субъединицах, можно заключить, что центр, ответственный за обратимую инактивацию СФ|-АТФазы, расположен на том же типе субъединиц (р ), что и каталитический центр.

5. Конформационные изменения, вызываемые взаимодействием СФ]- с нуклеотидами и двухвалентными катионами. Низкая скорость инактивации СФ^-АТФазы (по сравнению со скоростью каталитической реакции) указывает, что изменения активности могут быть связаны со структурными перестройками фермента. Наличие такой связи предполагает, что конформационное состояние, принимаемое ферментом в присутствии ионов Са2+ и АТФ, когда его активность высока,

должно существенно отличаться от состояния с низкой АТФазной акр ,

тивностью в присутствии АДФ и ионов Мё . Для изучения конформа-ционных изменений СФ^ использовали метод спектрофотометрического титрования тирозиновых остатков фермента. В интервале рН 6,0-8,0 в присутствии АТФ, Са2+ или Са-АТФ (I ыМ) диссоциировало до 25% тирозиновых остатков, тогда как в присутствии АДФ, Мв2+ или их комплекса - лишь 0-7%. Достигаемое в присутствии АДФ и Мв2+ состояние фермента отличалось весьма узким, сдвинутым в щелочную область (по отношению к диссоциации свободного тирозина) интервалом диссоциации, в котором титровалось до 90% тирозиновых остатков. Эти отличия указывают, что АДФ- и Мв2+-зависимая инактивация СФ^-АТФазы сопровождается образованием специфической кон-формации, охватывающей основную часть молекулярной структуры СФт.

6. Стимуляция Mg2+ зависимой АТФазной активности СФр Mg2+-зависимая АТФазная активность связанного с мембраной СФТ близка активности изолированного фермента непосредственно после введения его в реакционную среду, но в десятки раз превышает его стационарную активность. В поисках эффекторов, позволяющих в квазистационарных условиях демаскировать стационарную активность СФ^-АТФазы, мы обратились к группе оксианионов, стимулирующих АТФаз-ную активность митохондрий /Mitchell, Moil, 1971; Lambeth, Lardy, 1971/. Было найдено, что принадлежащие к этой группе анионы борной, сернистой, фосфорной, угольной и ряда других кислот оказывают аналогичное действие на СФ^-АГФазу хлоропластов. Стимулирующий эффект сульфита, одного из наиболее энергично действующих оксианионов, проявлял специфичность к адениновому основанию нук-леотидфосфата. Включение сульфита в реакционную среду снимало АДФ- и Mg +-зависимую инактивацию СФт-АТФазы (рис. 10), оказывая лишь незначительное влияние на ее Ca ^-зависимую активность.

Значительный стимулирующий эффект был обнаружен у флавоно-лов - соединений фенольной группы, присутствующих в хлоропластах. Детальное изучение одного из них, кверцетина (Кв), показало, что стимулирующие свойства проявляет его свободная форма, тогда как комплекс Кв с двухвалентным катионом ингибирует фермент. При переходе к более гидрофильным гликозидированным и ацилированным производным Кв их ингибирующее и стимулирующее действие ослаблялось. Влияние гидрофобных свойств флавонолов на их эффективность свидетельствует о значительной роли гидрофобных взаимодействий в связывании этих соединений с СФ^.

Среди соединений других классов стимулирующие свойства были обнаружены у некоторых полярных растворителей (спирты, хлороформ) и детергентов (холат, додецилсульфат, октилглюкозид). При низких концентрациях эффект спиртов возрастал с увеличением удельного веса гидрофобной части молекулы в ряду

CHjOH < С2Н50Н < С4НдОН < С6Н13ОН

Стимулирующий эффект детергентов не коррелировал с их способностью вызывать диссоциацию СФ^ на субъединицы.

Общим свойством всех стимулирующих соединений является избирательное увеличение М£2+-зависшой АТФазной активности, уровень которой весьма низок вследствие АДФ- и Мв2+-зависимой.инактивации фермента. При всем разнообразии этих соединений, ни одно из них не стимулирует активность более того уровня, который характерен для нестабильного активного состояния фермента, наблюдаемого в начальный момент его инкубации в реакционной среде

(рис. 7) Полученные данные позволяют сделать вывод, что повышение Мй:2+-зависимой активности СФ^-АТФазы под влиянием стимулирующих соединений не связано с непосредственным участием этих соединений в каталитических стадиях гидролиза АТФ и обусловлено обращением АДФ- и Мв2+-зависимой инактивации.

Характерным свойством полярных растворителей и детергентов является высокий уровень их эффективных концентраций (доли 'моля и моли) и наличие различающихся по структуре гидрофобной и полярной частей молекулы. Можно предполагать, что связывание полярных растворителей и детергентов нарушает структуру фермента, предотвращая кооперативные перестройки, сопровождающие его обратимую инактивацию.

Для детального изучения механизма стимулирующего действия оксианионов использовали один из наиболее эффективных стимуляторов СФ^-АТФазы - анион сульфита. Предстационарная кинетика АТФ-азной реакции в присутствии'сульфита имеет сложный характер (рис. 10).

Рис. 10. Влияние сульфита на предста-ционарную кинетику гидролиза АТФ. I - в отсутствие К^о^,

2 - I мМ К2303,

3 - 7,5 мМ К2303,

4 - 7,5 мМ К2Э03 добавлено через 3 мин после начала реакции.

I МОз

Низкие концентрации сульфита (I мМ) незначительно влияют на начальную стадию реакции, но существенно увеличивают ее стационарную скорость. При более высоких концентрациях сульфита (7,5 мМ) наряду с дальнейшим возрастанием стационарной скорости наблюдается конкурентное ингибирование начальной скорости реакции (К^ " 0,41 мМ). При еще более высоких концентрациях стационарная скорость снижается. Медленное развитие процесса активации фермента позволяет предположить, что он лимитируется конформацион-ными перестройками белковой молекулы и может описываться уравнением первого порядка. Справедливость этого предположения подтверждается линейным характером зависимости логарифма степени активации от времени. Зависимость наблюдаемой константы скорости активации от концентрации сульфита также линейна. Это позволяет 20

заключить, что активация СФ^-АТФазы обусловлена присоединением к ферменту I молекулы стимулятора:

Е* + А —- Е*А —- ЕА,

где Е*, Е - неактивное и активное состояние СФ^АТФазы, А - ок-сианион.

Поскольку АДФ- и 1^2'|"-зависимая инактивация определяется связыванием двух компонентов, ее обращение может достигаться при диссоциации любого из них. В присутствии сульфита подавление активности АДФ заметно ослаблялось. Включение сульфита в реакционную среду снижало содержание прочно связанного АДФ. При изучении методом ЭПР связывания с СФ| аналога иона магния - иона марганца - было найдено, что I мМ сульфита в 4-6 раз ослабляет взаимодействие марганца с двумя из шести центров СФ|, связывающих двухвалентные катионы. Полученные данные свидетельствуют о том, что обращение инактиващи О^-АТФазы анионом сульфита осуществляется через ослабление связи с ферментом АДФ и ионов магния.

В квазистационарном состоянии эффект сульфита зависел от концентрации АДФ в среде. Так, концентрация сульфита, соответствующая полумаксимуму стимуляции СФрАТФазы, возрастала от 0,2 мМ до 1,8 мМ при увеличении АДФ от 0,1 до 9,7 мкМ. Таким образом, эффекты сульфита и АДФ взаимозависимы: связывание сульфита вызывает диссоциацию АДФ и, наоборот, связывание АДФ вызывает диссоциацию сульфита.

Для более детального изучения взаимосвязи между эффектами этих соединений исследовали влияние оксианиона на ковалентное связывание активированного аналога АДФ - [%]оАДФ. Чтобы исключить возможное взаимодействие сульфита с альдегидными группами оАДФ> в качестве оксианиона использовали бикарбонат. Введение 40 мМ бикарбоната увеличивало включение [%]оАДФ в СФ£ почти вдвое. Полученный результат, исключая возможность прямой конкуренции между оксианионом и АДФ, свидетельствует о том, что связывание АДФ и оксианиона происходит на разных центрах. Поскольку стимулирующий эффект оксианиона не может быть вызван его связыванием с каталитическим центром СФ^-АТФазы, в катализе и регуляции фермента должны принимать участие в общей сложности 3 нуклеотидсвя-зывающих центра.

С увеличением концентрации АТФ стимуляция стационарной скорости реакции сульфитом снижалась. Стимулирующий эффект высоких концентраций АТФ в свою очередь ослаблялся с возрастанием концентраций сульфита. В присутствии сульфита на графике Лайнуиве-ра-Берка исчезал криволинейный участок в области высоких концен-

традий АТФ. Наблюдаемые конкурентные взаимоотношения между сульфитом и АТФ и стимулирующее действие негидролизуемого аналога АТФ (см. раздел 3) дают основание предполагать одинаковый механизм действия на активность СФ^-АТФазы оксианионов и АТФ. Согласно этому механизму активация начинается с присоединения стимулятора к свободному нуклеотидсвязывающему центру, что ведет к диссоциации АДФ и включению освободившегося центра в каталитическую реакцию (способность центра прочного связывания АДФ к катализу рассмотрена в главе 4, разд. 3). Снижение концентрации стимулятора или повышение концентрации АДФ сдвигают равновесие в сторону, образования неактивного состояния (рис. II).

Д

Рис. II. Схема'активации 1\^2+-зависимой СФрАТФазы. Символы Д, Т и А обозначают АДФ, АТФ и оксианион. Заштрихованные фигуры соответствуют неактивному состоянию СФ1-АТФазы.

Принимая во внимание необходимость кооперативного функционирования как минимум двух каталитических центров /Кауа1аг et а1., 1977/, механизм гидролиза АТФ СФ^-АТФазой должен включать связывание субстрата с одним из центров и сопряженную диссоциацию продукта с другого центра при третьем центре, занятом АТФ или оксианионом и поддерживающим активное состояние фермента.

7. Регуляция АТФ-синтетазной активности СФ|. Увеличение концентрации ионов магния при практически неизменном содержании Мд-АТФ и избытке фосфата приводит к.возрастанию скорости реакции и снижению кажущейся величины Ку (АДФ). Такой же эффект наблюдается при увеличении рН среды. Это указывает, что с увеличением концентрации ионов магния и рН сродство АДФ к каталитическому центру возрастает. Увеличение уровня освещенности вызывает возрастание величины (АДФ). Согласно литературным данным ДоеЬг et а1., 1985/, сходным образом возрастают константы диссоциации прочно- и слабосвязанных нуклеотидов. Симбатность изменений Ку и Кд свидетельствует о том, что при увеличении освещенности происходит ослабление связи АДФ с ферментом. Таким образом, влияние концентраций ионов магния, рН и освещенности на связывание АДФ с СФ: в реакциях синтеза и гидролиза АТФ проявляется аналогичным 22

образом. Принимал во внимание эту аналогию, а также одинаковую локализацию "каталитического" и "регуляторного" центров, полученные данные позволяют предположить, что каталитические и регу-ляторные свойства являются различными функциональными проявлениями одного и того же нуклеотидсвязывающего центра.

8. Взаимосвязь АТФазной и АТФ-синтетазной активностей СФр К настоящему времени накоплены многочисленные доказательства того, что кинетические механизмы АТФазной и АТФ-синтетазной реакций не являются простым обращением друг друга. На наш взгляд, наиболее убедительно объясняет это явление гипотеза, предложенная применительно к митохондриульной АТФазе, согласно которой реакции синтеза и гидролиза АТФ катализируются различными состояниями фермента /Виноградов с соавт., 1980, 1984/. С целью выяснения ее применимости к описанию поведения СФ| мы провели сравнительное изучение влияния преинкубации хлоропластов с АДФ и АТФ на предстационарнуто кинетику фотофосфорилирования и гидролиза АТФ. Было найдено, что присутствие I мМ АТФ практически не влияет на начальную активность хлоропластов в синтезе АТФ, но сильно подавляет ее после 3,5 мин световой инкубации (рис. 12). Подавление синтетазной активности обратимо: в результате двухминутной инкубации в темноте она восстанавливается. После выключения света хлоропласты с низкой синтетазной активностью проявляли высокую активность в реакции гидролиза АТФ. АТФазная активность хлоропластов, преинкубированных в присутствии АДФ и обладавших высоким уровнем синтеза АТФ, оказалась в 5 раз ниже.

С учетом данных о прочном связывании АДФ в темноте и ускорении обмена связанных и свободных нуклеотидов при освещении,

Рис. 12. Подавление синтетазной и стимуляция гидролазной активностей 0Ф| аденозинтрифосфатом. Реакцию начинали включением света (3-10^ эрг см-2 сек-1) после предварительной световой активации в присутствии 0,5 мМ дитиотрейтола в течение I мин. Реакционная среда содержала 300 мМ сахарозы, I мМ трицин-КОН,(рН 7,8), 50 мМ КС1, 3 мМ меС12, 0,05 мМ ФМС, 0,5 мМ дитиотрейтола, I мМ Фн, а также 50 мкМ АДФ (I) или I мМ АТФ и 50 мкМ АДФ (2).

н'

с

результаты эксперимента свидетельствуют о том, что неактивная в гидролизе форма №2, содержащая связанный АДФ, проявляет свойства активной АТФ-синтетазы, а неактивная в синтезе форма СФ^, содержащая связанный АТФ, - АТФ-гидролазы. Этот вывод полностью согласуется с гипотезой А.Д.Виноградова о существовании синте-тазного и гидролазного состояний фермента, медленное взаимное превращение которых контролируется АДФ и АТФ.

Глава 4. ТРАНСФОРМАЦИЯ ЭНЕРГИИ Н+'-АТФазным КОМПЛЕКСОМ ХЛОРОПЛАСТОВ

1. Анализ современных концепций энергетического сопряжения. В разделе рассмотрены литературные данные о роли СФ| в трансформации энергии АТФазным комплексом хлоропластов. Приводятся свидетельства участия СФХ в переносе протонов. Дается критический обзор современных концепций энергетического сопряжения, обсуждается взаимосвязь отдельных этапов сопряжения с конформационными-изменениями СФр

2. Влияние модификации Г субъединицы тетранитрометаном на энергозависимые функции СФд-. Обработка хлоропластов I мМ ТНМ не влияет на Са +-зависимую активность изолированного СФ^, но сильно подавляет энергозависимые функции АКХ: фотофосфорилирование, Мд -зависимую АТФазную активность, светозависимое увеличение буферной емкости и поглощение протонов хлоропластами (дН+),частично обращаемое ДЦВД. Близкое по величине снижение д Н\ вызываемое старением хлоропластов, приводит лишь к незначительному спаду их гидролазной и синтетазной активностей. Опыты с экстракцией и его реконструкцией на освобожденных от СФ| мембранах показали, что местом атаки ТНМ является сопрягающий фактор.Включение ТНМ в СФ| подтверждается увеличением оптической плотности растворов фермента при 428 нм, соответствующем образованию двух нитротирозильных остатков. С целью локализации этих остатков контрольный и обработанный ТНМ С^ инкубировали с [ с]оАДФ в условиях неспецифического взаимодействия диальдегидного аналога с ферментом. Инкубация приводила к трёхкратному уменьшению радиоактивности у субъединицы. Полученные результаты показывают, что модифицируемые ТНМ тирозиновые остатки локализованы на у субъединице СФр Следствием модификации и сопровождающих ее кон-формационнъх изменений у субъединицы является увеличение протонной проводимости и нарушение сопряжения между протонным переносом через и синтезом (гидролизом) АТФ.

3. Зависимость равновесия прочно связанных АДФ и АТФ от протонирования кислотно-основных групп СФ . Принимая во внимание 24

участие в переносе протонов, мы исследовали возможности сопряжения стадий протонирования-депротонирования его кислотно-основных групп с энергозависимыми стадиями синтеза и гидролиза АТФ. С этой целью было изучено влияние рН среды на содержание и соотношение АДФ и АТФ, прочно связанных с СФр После достижения равновесия между связанными и введенными в реакционную среду мечеными нуклеотидами при соотношении нуклеотидов к СФ^, приближающемся к I, было найдено, что содержание [^р] АТФ в прочно связанных нуклеотидах при снижении рН с 8,0 до 5,2 увеличивается в десятки раз (рис. 13). Более, чем в 150 раз возрастают различия в сродстве АТФ и АДФ к нуклеотидсвязывающему центру. В результате инкубации фермента с [ 14С] АДФ в присутствии неорганического фосфата при рН 5,2 часть связанного меченого АДФ переходила в АТФ, что свидетельствовало о каталитической природе центра проч-

Рис. 13. Зависимость содержания [32р]

АТФ в прочно связанных меченых нуклеотидах (I) и суммы прочно связанных (меченых и немеченых) нуклеотидов (2) от рН среды инкубации. Соотношение меченых нуклеотидов и СФ£ в среде инкубации равно 0,32.

рН

Характер зависимости содержания связанного на каталитическом центре АТФ от рН среды указывает на существование специфических кислотно-основных групп фермента с рК ^ 5,8, протонирова-ние которых сдвигает равновесие реакции в сторону АТФ. Аналогичное увеличение прочно связанного АТФ отмечается при энергизации мембраны хлоропластов /Magnusson, MoСarty, 1976; Smith et' al., 1983/. С учетом этих данных результаты эксперимента позволяют предположить, что протонирование специфических групп C$j моделирует процесс энергизации. При этом по крайней мере часть энергии', затрачиваемой в цикле протонирования-депротонирования, идет на смещение равновесия нуклеотидов на каталитическом центре в сторону АТФ, а другая часть, в соответствии с принятыми представлениями /Воуег et al., 1973; Slater, 1974/, - на диссоциацию АТФ. Гипотеза об энергозависимом сдвиге равновесия между прочно

ного связывания нуклеотидов»

связанными АДФ и АТФ позволяет объяснить способность хлороплас-тов к фосфорилированию при соотношении АТФ/АДФ в реакционной среде, на несколько порядков превышающем их равновесное соотношение на ферменте (при рН 8,0 около 0,01).

4. Механизм трансформации энергии Н+-АТФазным (АТФ-синте-тазным) комплексом хлоропластов) В основу предлагаемого механизма помимо приведенных выше зависимостей легли известные данные о способности СЗ^ посредством конформационных изменений изолировать каталитический центр от реакционной среды и обратимо изменять его активность. Предполагается, что на начальной стадии синтеза АТФ происходит связывание АДФ и Фн с каталитическим центром, локализованным на о<- р> субъединичной паре, содержащей де-протонированные кислотно-основные группы (рис. 14, сост. 1-3). Энергия связывания субстратов используется для конформационных изменений, ведущих к переориентации кислотно-основных групп в сторону протонного канала СФ0 (сост. 3-4). Протонирование групп вызывает сдвиг равновесия на каталитическом центре в сторону образования АТФ (энергозависимая стадия, сост. 4-5) и приводит к конформационным перестройкам, вновь открывающим доступ кислотно-основных групп в реакционную среду с низкой активностью протонов (сост. б). Депротонирование групп снижает устойчивость комплекса АТФ с каталитическим центром и вызывает его диссоциацию (энергозависимая стадия). При кооперативном режиме функционирования каталитических центров часть энергии связывания субстратов с одним из центров может использоваться на стадии диссоциации АТФ с другого центра. Два таких центра попеременно осуществляют связывание субстратов, их превращение и диссоциацию продуктов реакции, тогда как третий центр, связывая ДЦФ или АТФ, поддерживает син-тетазное или гидролазное состояние АКХ.

1 1 з

Рис. 14. Схема сопряжения переноса протонов через Н+-АТФазный комплекс с синтезом

АТФ.

Глава 5. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В первом разделе главы приводится описание методов выделения и очистки хлоропластов, АТФазного комплекса и сопрягающего фактора СФр Здесь же описываются методы получения препаратов СФ| с измененным субъединичным составом, процедуры встраивания АКХ в липосомы, активации обработкой теплом или трипсином, модификации СФ| групп специфическими реагентами. В разделе 2 излагаются аналитические методы исследования. Рассмотрены особенности применения методов стационарной и предстационарной кинетики к изучению реакций синтеза, гидролиза АТФ и [^Р]ФН-АТФ обмена. Описываются методы изучения равновесия прочно связанных с СФ^ нуклеотидов, локализации нуклеотидсвязывающих центров и специфических карбоксильных групп, связывания ионов марганца с СФ^, определения константы устойчивости магниевого комплекса квер-цетина. Приводится методика расчетов концентраций ионов металлов и их комплексов с адениннуклеотидами.

В заключении диссертационной работы обсуждаются особенности строения и функционирования АКХ как ферментативной энерготранс-формирующей биологической системы. Материалы проведенных исследований показывают, что эти особенности проявляются на различных уровнях молекулярной организации системы, от структуры каталитического центра до молекулярной архитектуры АКХ. Рассмотрено место настоящей работы в изучении принципов функционирования ферментативных энерготрансформирукяцих систем.

ВЫВОДЫ

1. Изучен субъединичный состав Н+-АТФазного комплекса хлоропластов. Выявлено 8 типов субъединиц, из которых 5 принадлежат каталитической (СФ^ и 3 - мембранной части комплекса (СФ0).Экспериментально доказана способность встроенного в липосомы АТФаз-ного комплекса осуществлять [*^Р]ФН-АТФ обмен и гидролиз АТФ, сопряженный с переносом протонов внутрь липосом.

2. На основании данных кинетического анализа, исследования связывания СФ| с субстратами и продуктами реакции и их аналогами, модификации СФ^- групп специфичными реагентами предложена схема каталитического центра фермента, согласно которой аденино-вая часть аденозинфосфатов связывается одним из тирозиновых остатков (рК 8,9), а фосфатные группы - остатками лизина и аргинина. Атомы кислорода фосфатных групп входят в координационную сферу атома магния (кальция), связанного карбоксильной группой фермента (рК 6,3), а один из атомов кислорода ^ фосфата (или

неорганического фосфата) - в координационную сферу второго атома магния (кальция), связанного с тирозиновым остатком с рК 8,3. Установлено, что каталитический центр локализован на £ субъединице.

3. Показано, что в присутствии АДФ и ионов магния происходит медленная обратимая инактивация СФ]--АТФазы. Инактивация сопряжена с перестройками структуры фермента, имеющими кооперативный характер. Она сопровождается изменением прочности связи АДФ с нуклеотидсвязывающими центрами, выполняющими регуляторную и каталитическую функции. Установлено, что центр, ответственный за АДФ- и Ме2+-зависимую обратимую инактивацию, расположен на ^ субъединице СФр

4. Г'£2+-зависиыая АТФазная активность СФ| стимулируется АТФ, оксианионами, флавонольными соединениями, полярными раство-

нений обусловлен обращением дцш- и ме -зависимой инактивации фермента. Показано, что -стимуляция СФ]--АТФазы вызывается присоединением оксианиона или АТФ к одному из нуклеотидсвязывающих центров и сопряженной диссоциацией прочно связанного АДФ.

5. Обнаружено подавление АТФ-синтетазной активности при одновременном увеличении АТФазной активности СФ| в результате инкубации хлоропластов на свету в присутствии АТФ. Изменения активности под влиянием аденозинфосфатов согласуются с концепцией о существовании двух состояний фермента: АТФ-гидролазного и АТФ-синтетазного. Эти состояния поддерживаются связыванием, соответственно, АТФ и АДФ с центрами СФ^-, выполняющими регуляторную функцию.

6. Показано, что модификация двух тирозиновых остатков, локализованных на у- субъединице, подавляет функщи АТФазного комплекса, сопряженные с переносом протонов, и не влияет на гидролиз АТФ изолированным СФ]-. Полученные результаты свидетельствуют об участии у- субъединицы в переносе протонов, поступающих через протонный канал ^-АТФазного комплекса хлоропластов.

7. Выявлена зависимость соотношения прочно связанных на каталитическом центре АДФ и АТФ от рН реакционной среды. Характер зависимости указывает на существование специфических кислотно-основных групп СФр протонирование которых сдвигает равновесие реакции на каталитическом центре в сторону АТФ.

8. На основе всей совокупности результатов проведенного исследования предложен молекулярный механизм преобразования энергии трансмембранного градиента протонов в процессе фотофосфори-лирования, включающий две энергозависимые стадии - фосфорилиро-

рителями и некоторыми

стимулирующих соеди-

вание ДЦФ на каталитическом центре и диссоциацию АТФ, сопряженные, соответственно, с протонированиеми диссоциацией специфических кислотно-основньтх групп, попеременно контактирующих с протонным каналом АКХ и реакционной средой.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мальян А.Н., Саранча Ю.П., Макаров А.Д. Выделение и свойства сопрягающего фактора фотофосфорилирования из хлоропластов го-роха//Методы выделения и исследования белков-компонентов фотосинтетического аппарата. Пущино. 1973. С. 66-73.

2. Мальян А.Н., Саранча Ю.П., Макаров АЛ1. Кинетика и механизм реакции гидролиза АТР Са-зависимой АТРазой из хлоропластов гороха//Биохимия. 1974. Т. 39. № 5. С. 1062-1067.

3. Мальян А.Н., Макаров А.Д. Исследование кинетики и механизма гидролиза АТР растворимой АТРазой хлоропластов (CP-)) в присутствии ионов Mg2 У/Биохимия. 1976. Т. 41. № 6. С. 10871093.

4. Позмогова И.Н., Мальян А.Н. О физиологии термофильных и мезо-фильных башлл при оптимальных и субмаксимальных температурах развития/УМикробиология. 1976. Т. 45. С. 284-290.

5. Мальян А.Н. Свойства сопрягающего фактора фотофосфорилирования и механизм его участия в реакциях гидролиза и синтеза АТФ//Итоги исследования механизма фотосинтеза. Пущино. 1976. С»

6. Мальян А.Н., Акулова Е.А., Музафаров E.H. Кверцетин-аллосте-рический регулятор активности сопрягающего фактора фотофосфо-рилирования, &^1//Биоорг. химия. Г977. Т. ЗГС. 639-645Г

7. Мальян А.Н., Музафаров E.H., Акулова Е.А. Взаимодействие фла-вонолов (агликона, гликозидированньк и ацилпроизводных) с сопрягающим фактором фосфорилирования CP-) //Регуляция энергети-

ческого обмена хлоропластов и митохондрий эндогенными феноль-ными ингибиторами. Пущино. 1977. С. 41-54.

8. Захаров С.Д., Сытник С.К., Мальян А.Н., Макаров А.Д. Выделение и свойства cf-j -АТРазы с измененной субмолекулярной струк-турой//Биохимия. 1978. Т. 43. С. 887-891.

9. Мальян А.Н., Акулова Е.А. О механизме стимуляции растворимой АТРазы хлоропластов (CFL)//Биохимия. 1978. Т. 43. С. 1206-121I. 1

10.Мальян А.Н. Об участии карбоксильной группы в активном центре -АТФазы хлоропластов//Докл. АН СССР. 1979. Т. 247. № 4.

С. 993-996.

11.Мальян А.Н. Аллостерические свойства CFi -АТРазы хлороплас-тов//Биохимия. 1980. Т. 45. С. I73I-I739.

12.Мальян^А.Н^ Инактивация СРч-АТФазы хлоропластов//Биофизика.

13.Мальян А.Н., Проскуряков И.И. Аллестерическая регуляция Независимой активности с?! -АТРазы//Митохондрии. Механизмы сопряжения и регуляции. Пущино. 198Г. С. 49.

14.Захаров С.Д., Мальян А.Н. Свойства и субъединичный состав Н+-АТРазного комплекса хлоропластов гороха//Биохимия. 1981. Т. 46. № 12. С. 2136-2143. 2

15.Мальян А.Н. Кинетическое исследование Mg -зависимой СРч -АТРазы в присутствии стимуляторов//Биохимия. 1982, Т. 47. № 4. С. 540~о45•

16.Мальян А.Н. О связи потенциала ионизации, энергии гидратации и радиуса двухвалентных ионов металлов с их способностью активировать CF-i -АТФазу хлоропластов//Тез. докл. I Всесоюз. биофиз. съезда. М.: Йзд-во АН СССР, 1982. С. 268.

17. Захаров С.Д., Бронников Г.Е., Мальян А.Н. Кинетика Фн-АТФ обмена, катализируемого Н -АТФазными комплексами хлороплас-тов и митохондрий, встроенными в липосомы//Тез. докл. I Все-союз. биофиз. съезда. М.: Изд-во АН СССР, 1982. С. 270-271.

18. Мальян А.Н., Вицева О.И. Предстационарная кинетика гидролиза АТФ CFi-АТФазой хлоропластов//Биохимия. 1983. Т. 48. № 5.

С. 718-724.

19. Сытник С.К., Мальян А.Н. Исследование функций и локализации ■ нуклеотидсвязывающих центров (ЙЧ-АТРазы с помощью диальде-

гидных^производных АДР и АТР//Биохимия. 1983. Т. 48. № 6.

20. Мальян А.Н., Сытник С.К., Вицева О.И. Связывание диальдегид-ного производного АТР CFi-АТРазой, модифицированной реагентами на функциональные группы//Биохимия. 1984. Т. 49. № 6.

С. 933—937.

21. Мальян А.Н., Вицева О.И. Многофакторная кинетическая модель фотофосфорилирования//Проблемы фотоэнергетики растений и повышение урожайности. Тез. докл. Всесоюзн. конф. Львов. 1984. С. 32.

22. Мальян А.Н., Вицева О.И. О взаимодействии регуляторного" и "каталитического" центров СР.,-АТФазы//16 конф.'ФЕБО. Тез. докл. М. 1984. С. 290. 1

23. Мальян А.Н. Каталитические свойства С^-АТФазы хлороплас-. тов//Изв. АН СССР. Сер. биол. 1986. № 2. С. 218-229.

24. Мальян А.Н., Вицева О.И. Кинетический анализ обратимой инактивации растворимой АТФазы хлоропластов//Тез. докл. Всесоюз. симп.: Молекулярные механизмы и регуляция энергетического обмена. Пущино. 1986. С. 34.

25. Мальян А.Н. Возможный механизм сопряжения синтеза АТФ с переносом протонов в ферментативном комплексе СР1 хлороплас-тов//ДАН СССР. 1986Г Т. 291. С. I0I5-I0I8. 1 2+

26. Мальян А.Н., Вицева О.И. Кинетика стимулящи сульфитом Mg -зависимой активности Ср1-АГФазы хлоропластов//Физиол. био-хим. культ, растений. 1987. Т. 19. С. 456-461.

27. Мальян А.Н. молекулярные механизмы регуляции процессов фото-фосфорилирования//Комплексное изучение продуктивности агро-ценозов. Пущино: ОНТИ, 1988. С. 153-168.

28. Malyan A.N. The regulatory activity of chloroplast CFt-ATP-ase//At>str. of 5th joint aymp. of Biochem. Soc. of the USSR and GDH. Weimar. 1979. P. 48.

29. Malyan A.N. The regulatory properties of chloroplast СР-|-ATPase//Abstr. of 17th symp.: Structure and functions of photosynthetic apparatus. Reinhardsbrunn. 1979. P. 27.

30. Malyan A.N., Zakharov S.D., Proskuryakov I.I. The role of carboxyl groups in the catalytic and regulatory properties of CF-i-ATPase//Bxochem. Phyaiol. Pflanzen. 1981. Vol. 176. N 9. P. 828-834.

31. Malyan A.M. Chloroplast ATIase (CF-|): allosteric regulation by ADP and Mg^"1" ions//Photosynthetica. 1981. Vol. 15. И 4. P. 474-483.

32. Malyan А.И., Zakharov S.D. The mechanism of regulation and localization of Mg2+- and ADP-sensitive regulatory site of chloroplast H+-ATPase (CFi)//Abstr. of 6th joint symp. of Biochem. Soc. of the GDR and USSR: Regulation in metbabolism and bioenergetics. Tallinn. 1981. P. 69.

33. Malyan A.N., Kuzmin A.N., Vitseva O.I. On the participation of the "regulatory" site of CPi-ATPase in photophosphoryla-tion//Biochem. Intern. 1982. N 2. Vol. 5. P. 325-328.

34. Malyan A.N., Vitseva O.I. Relation of "regulatory" site of CF-i-ATPase to photophosphorylationZ/Photosynthetica. 1983. Vol. 17. N 4. P. 499-505.

35. iiakharov 3.D., Bronnikov G.E., Ualyan A.¡J. Effect of sulfite on the Pi-ATP exchange activity of chloroplast and mitochondrial H+-ATPase//Biochem. Intern. 1983. Vol. 6. N 6. P. 805811 .

36. Malyan A.H., Vitseva 0.1. Localization of essential tyrosyl residues involved in energy coupling during photophosphory-lation//Biochen. Intern. 1984. Vol. 9• H 1. P. 17-23.

37. Malyan A.H., Vitseva 0.1., Opanascnico V.K, Properties of totranitromethane-treated chloroplast ATP synthetase and localization of tyrosyl residues involved in energy coupling during photophosphorylation//Photosynthetica. 1935. Vol. 19. II 3- P. 373-381 .

38. I.tuzafarov E.I!., Ivanov 3.11., i'alyan A.U., Zolotarcva U.K. Dependence of flavonol functions on their chemical structure in chloroplast energy reactions//Biochern. Physiol. Pflanzen.

1986. Vol. 101. P. 361 .

39. Malyan A.IT., Vitseva 0.1. On the mechanism of regulation of catalytic activity of Chloroplast coupling 1 ATPase//Prog-ress in photosynthesis research, Dordrecht. I.I. Uijhoff Publ.

1987. Vol. 3. P. 1-23.

40. Malyan A.IT., Vitseva 0.1. Equilibrium of ADP and ATP tightly bound viith chloroplast coupling factor 1 depends on protonation and dissociation of H+-binding groups//18th FHB3 meeting. Abstr. Ljubljana. 1987. P. 250.

41. Malyan A .IT. Regulation of ATP synthesis and hydrolysis by the isolated and membrane-bound chloroplast coupling factor 1 (CP-| )//Xntern. symp. on regulation and efficiency of photosynthesis. Abstr. Shanghai. 1988. P. 32.