Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Кинетика обратимой Mg2+-АДФ-зависимой инактивации CF1-АТФазы хлоропластов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Кинетика обратимой Mg2+-АДФ-зависимой инактивации CF1-АТФазы хлоропластов"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ПОЧВОВЕДЕНИЯ И ФОТОСИНТЕЗА

Р Г 5 ОД 1 5 ДЕК 190В

ВИЦЕВА ОЛЬГА ИВАНОВНА

КИНЕТИКА ОБРАТИМОЙ Л^2+-АДФ-ЗАВИСИМОЙ ИНАКТИВАЦИИ СЕгАТФазы ХЛОРОПЛАСТОВ

03.00.04 - БИОХИМИЯ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ПУЩИНО -1996

На правах рукописи УДК 577.3

Работа выполнена в лаборатории биоэнергетики фотосинтеза Института почвоведения и фотосинтеза РАН.

Научный руководитель: доктор биологических наук А. Н. Малья Официальные оппоненты:

доктор биологических наук E.H. Музафаров

кандидат биологических наук Т.В. Кулаковская

Ведущая организация:

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Защита состоится "ЗЛ'" декабря 1996 г. в " /6?' часов на заседании Специализированного Совета Д 200. 29. 01 по защите диссертации на соискание ученой степени кандидата наук при Институте почвоведения и фотосинтеза РАН (142292, Пущино, Институт почвоведения и фотосинтеза РАН).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан "ZJt' ноября 1996 г.

/ Ученый секретарь / Специализированного Совета доктор биологических наук

f

¿¿г J

Б.Н. Иванов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Одним из центральных вопросов биоэнергетики является вопрос о ме-:анизме преобразования и запасания энергии в биологических системах. В фоцессе фотосинтеза энергия света накапливается в виде химических соеди-!ений с высоким энергетическим потенциалом, таких как НАДФН и АТФ. апасенная в этих продуктах энергия обеспечивает в конечном счете все нергозависимые процессы, включающие биосинтетические реакции, актив-ый транспорт ионов, ассимиляцию СО2 в темновых стадиях цикла Кальви-а. В хлоропластах, а также в митохондриях и в бактериях, синтез/гидролиз .ТФ, сопряженный с трансмембранным переносом протонов, осуществляет-\ АТФ-синтазой (Н+-АТФаза, CFoCFi), которая является ключевым фер-ентом энергетического метаболизма в биологических системах (Mitchell, >74; Скулачев, 1974). АТФ-синтазный комплекс состоит из водораствори-ого сопрягающего фактора CFi, осуществляющего ферментативный ката-13, и мембранного сектора, CFo, выполняющего функцию протонного каша. Сложная субъединичная организация АТФ-синтазного комплекса, спорность его к модуляции каталитической активности в зависимости от leiiiHHX и внутренних факторов, предполагает наличие сложной системы [догенной регуляции процессов синтеза/гидролиза АТФ. Одним из путей ергозависимой регуляции Н+-АТФазы является Mg^-АДФ-зависимое ин-бирование фермента, которое связано с образованием неактивного Mg-ЦФ комплекса с каталитической частью фермента (CFi) и проявляется при энергнзации тилахоидной мембраны. При энергизации мембраны наблю-ется обратный процесс реактивации Н+-АТФазы, сопряженный с диссо-ацией прочно связанного АДФ (Boyer et all., 1976; Strotmann et all., 1976). 1тя механизму ингибирования фермента при участии Mg2+ и АДФ посвя-но значительное количество работ, ряд важных аспектов этого механизма гаются неясными. В частности, недостаточно изучены свойства центров, пывающих АДФ и ионы магния, ответственных за ингибированне фер-ита. Не рассматривалась возможность участия в процессе ингибирования /тих нуклеотидсвязывающих центров Н+-АТФазы. Остается открытым ipoc об участии минорных субъединиц фермента в Mg^-АДФ-зависимом -ибировании. Одним из важных методических подходов к изучению меха-:ма функционирования АТФ-синтазного комплекса был и остается метод (етического анализа. Такой анализ представлялось целесообразным продать на изолированном сопрягающем факторе хлоропластов CFi , кото-\ является простым объектом, сохраняющим способность к М£2+-АДФ-исимому ингибированию.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы является выяснение кинетических законо-ностей М^-АДФ-зависимого ингибирования CFi-АТФазы хлоропла-з в процессе гидролиза АТФ. В процессе исследования решались сле-ицие задачи:

Изучение кинетики Mg^-АДФ-завиеимого ингибирования CFi-АТФазы;

2. Определение кинетических характеристик связывающего АДФ центр! участвующего в ингибировании фермента;

3. Изучение взаимодействия Mg2+ с CFi-АТФазой в процессе Mg2+-AД<l зависимого ингибирования;

4. Выяснение способности фермента, дефицитного по минорным субъед! ницам (CFi-6, е) к М§2+-АДФ-зависимому ингибированию.

Научная новизна работы.

Впервые показано, что в присутствии АДФ и ионов Mg2+ происхсда медленная обратимая инактивация CFi -АТФазы хлоропластов. Выявлен изменения кинетических параметров на различных этапах инактивации фе] мента. Обнаружено, что инактивация CFi сопровождается увеличение сродства одного из нуклеотидсвязывающих центров к АДФ, другого цент! к АТФ и снижением сродства к АТФ третьего центра. Впервые показано, чт при удалении минорных 8 и е субъединиц CFi-5, е сохраняет способность К^2+-АДФ-зависимой инактивации. Впервые применительно к сопрягают му фактору хлоропластов CFi показано, что Mg2* и Н+ конкурируют за св зывание с кислотно-основными группами, ответственными за инактив цию/активацию CFi-АТФазы. Эти группы локализованны на уровне катал тической части CFi и играют решающую роль в регуляции функционалы!' активности АТФ-синтазного комплекса.

Практическое значение работы.

Полученные в работе данные расширяют представления о регулятс ных свойствах Н+-АТФазы хлоропластов. Результаты, представленные диссертации, могут быть использованы для дальнейшего изучения моле* лярного механизма функционирования АТФ-синтазных комплексов xлof пластов, митохондрий и бактерий.

Апробация работы.

Основные результаты работы докладывались на Всесоюзном симг зиуме "Молекулярные механизмы и регуляция энергетического обме! (Пущино, 1986), на Всесоюзных конференциях "Преобразование светов энергии в фотосинтетических системах и их моделях" (Пущино, 19S "Структурно-функциональная организация фотосинтетических мембр: (Пущино, 1993), "Биоэнергетика фотосинтеза" (Пущино, 1996), на 7-ом и ом Международных конгрессах по фотосинтезу (Провиденс, 1986; Монт лье, 1995).

Публикации.

По материалам дибсертации опубликовано 10 работ.

Структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы (4 главы), о сания методов исследования (10 разделов), изложения полученных резуль тов и их обсуждения (4 главы), заключения, выводов и списка цитируел литературы (263 ссылки). Работа изложена на страницах, содер; 22рисунка и 2 таблицы.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

I. Препаративные методы.

CFi-АТФазу выделяли из хлоропластов шпината по методу Биндера и соавт. (Binder et all., 1978). Очистку препарата CFi проводили согласно методу Шапиро и МакКарти (Shapiro et all., 1990). Выделение CFi хлоропла-DTOB, дефицитного по 5 и s субъединицам проводили по методу Рихтера и х>авт. (Richter et all., 1986). Для исследования кинетики гидролиза АТФ ис-тользовали предварительно активированный фермент. Активировали CFi-\ТФазу по методу Льена и Рекера (Lien and Racker, 1971).

Ï. Аналитические методы.

Концентрацию белка в препаратах CFi определяли по методу Бред-¡)орд (Bradford, 1976). Для контроля чистоты препарата растворимой АТФа-ы хлоропластов использовали электрофорез на пластинах 15% полиакрила-шдного геля в присутствии додецнлсульфата натрия в буферной системе 1эммли (Laemmli, 1970). АТФазную активность по окислению NADH, отряженному с гидролизом АТФ определяли по методу Пульмана (Pullman et

II., 1960). Определение АТФазной активности фермента по освобождению еорганического фосфата проводили по методу Лоури и Лопеса в модифн-ации Скулачева (Обзор методов калориметрического определения фосфо-а, Никулина Т.Н., 1965). Концентрацию АДФ в реакционной среде в про-ессе инактивации CFi-АТФазы рассчитывали согласно методу Мальяна вальян, 1981). Для определения количества прочно связанных ферментом уклеотидов использовали метод радиоактивного анализа (Мальян, 1990) и юциферин-люциферазный метод (Strehler, 1965).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

. Предстационарная кинетика гидролиза АТФ CFi-АТФазой лоропластов

1. Зависимость инактивации CFrA ТФазы от концентрации АДФ и тов Mg2*

С целью изучения кинетики Г^2+-АДФ- зависимого ингибирования Fi-АТФазы хлоропластов использовали систему сопряженных реакций, в >торых выделение АДФ при гидролизе АТФ сгехиометрически связано с •целением NADH при участии пируваткиназы и лактатдегидрогеназы ТФ-регенирирующая система) (Pullman et all., 1960). О протекании реак-1и судили по изменению оптической плотности при 340 нм, регистр ируемо-' на спектрофотометре UV-VIS Specopd. Методика позволяет регистриро-гь протекание реакции через 4-6 сек. после введения фермента в реакцион-ю среду.

На рис. 1 представлены результаты зависимости АТФазной активно-\ фермента от концентрации пируваткиназы. Варьирование пируваткина-позволяет изменять концентрацию АДФ в реакционной среде (снижение нцентрации пируваткиназы вызывает увеличение концентрации АДФ).

Как видно из рис. 1., в течение 30-40 сек. после введения СР1-АТФазы в р« акционную среду скорость гидролиза АТФ в присутствии М^1* значитвльн снижается, что позволяет говорить о зависимой от. времени инактиваци фермента. Активность фермента в стационарном режиме падает при сниж< нии концентрации в среде пируваткиназы (увеличении АДФ), что свидетел! ствует о зависимости АТФазной активности от концентрации АДФ.

Рис. 1. Зависимость гидролазнс активности Ср1-АТФазы от ко1 центрации пируваткиназы. Состг среды: 20 мМ Трис-НС1 (рН 7.8), ; мМ КС1, 4 мМ К^СЬ, 1 мМ АТФ, мМ фосфоенолпируват, 0.3 м] НАДН, 120 мкг/мл СБ!, 8 едЛ лактатдегидрогеназы. Содержал] пируваткиназы (ед/мл): 1 - 18.8; 2 12.3; 3-6.0; 4-3.

Однако даже при высоких концентрациях пируваткиназы (до 1 ед/мл) стационарная активность не достигала начального уровня.

Как следует из рис. 2, уровень стационарной активности фермента: висит от концентрации М§2+ в реакционной среде. Увеличение концентр ции ионов Мй2* вызывает снижение активности фермента (рис. 2). При н) ких концентрациях (кривая 1) наблюдается медленный переход ф( мента от нестабильного активного к стационарному состоянию. При вы< ких концентрациях (кривая 4) начальная скорость гидролиза А1

снижается быстро, достигая в дальнейшем низкого стационарного уровня.

Рис. 2. Зависимость гидролазн активности Ср1-АТФазы от к< центрации ОДСЬ. Состав среды: мМ Трис-НС1 (рН 7.8), 50 мМ К 1 мМ АТФ, 1 мМ фосфоенолпи] ват, 0.3 мМ НАДН, 120 мкг/мл С 8 ед/мл лактатдегидрогеназы, ед/мл пируваткиназы. Содержа! МяСЬ (мМ): 1 - 1.0; 2 - 2.0; 3 - 4.( -10.

Таким образом, согласно приведенным выше данным, степень и скорость инактивации Ср1-АТФазы определяются концентрацией АДФ и ионов

о.<

D.S

Рис. 3. Кинетика гидролиза АТФ в присутствии 10 мМ MgCli (1) или 10 мМ СаСЬ (2). Состав среды: 20 мМсТрис-НС1(рН 7.8), 50 мМ KCl, 1 мМ АТФ, 1мМ фосфоенопируват, 0.3.мМ НАДН, 8ед/мл лактатде-гидрогеназы, 40 ед/мл пируватки-назы, 175 мкг/мл CF|.

о

40

Время, сек

бо

ig2+ в реакционной среде. Эти данные хорошо согласуются с результатами сследования, полученными на препаратах Fi митохондрий, где было также оказано, что ингибирование ионами Mg2+ и АДФ имеет характер инакти-щии (Васильева с соавт., 1982).

В связи с выяснением способности Mg2+ ингибировать АТФазную ак-шность фермента представлялось интересным исследовать возможное ин-[бирующее действие ионов Са2+, широко применяемого в исследовании ТФазных свойств фермента в качестве кофактора реакции. На рис. 3 пред-авлены кинетические кривые гидролиза АТФ в присутствии ионов Mg2+ ривая 1) и Са2+ (кривая 2). Данные этого рисунка свидетельствуют о том, о АТФазная активность фермента в присутствии Mg2+ в начальный мо-;нт реакции превышает Са2+ -зависимую активность. При длительной ин-бации Са2+-зависимая активность фермента сохраняется, тогда как в при-тствии Mg2+ она снижается, достигая в течение 1 мин. низкого стационар-го уровня. Таким образом, кинетика гидролиза АТФ в присутствии ионов i2+ отличается отсутствием нарастающей во времени инактивации фермен-(рис. 3).

Представленные данные опровергают мнение о слабой Mg2+-шсимой каталитической активности CFi-АТФазы (Nelson et all., 1976) и ют основание подтвердить, что ее низкая величина обусловлена ннактива-ей фермента в результате его взаимодействия с АДФ и ионами Mg2+ . Эти ¡ультаты свидетельствуют также о том, что снижение активности CFi-'Фазы специфично к ионам Mg2+ и не наблюдается при Са2+ -зависимом фолизе АТФ.

'. Обратимость М^*-АДФ-зависгшой инактивации

Для выяснения вопроса об обратимости процесса Mg2+-AA®-исимой инактивации в присутствии АТФ-регенирирующей системы был

использован один из наиболее эффективных стимуляторов СБ^АТФазы • сульфит калия (Мальян с соавт., 1978, 1980). Как видно из рис. 4 (кривая 2) предынкубированный с 1 мМ МёСЪ в течение 5 мин фермент проявляет низ кую гидролазную активность, которая возрастает при добавлении сульфит! калия в реакционную среду. Начальная активность СР[ -АТФазы в присут ствии сульфита несколько ингибируегся (рисунок не представлен). Интерес но отметить, что стационарная активность фермента в присутствии сульфит) (8.0 мкмоль/мин на мг бедка) оказалась весьма близкой Г^2+-зависимой ак тивности Ср1-АТФазы, наблюдаемой в начальном периоде (8.6 мкмоль/мш на мг белка, кривая 1). Результаты исследования, представленные на рис. А свидетельствуют о том, что повышение Ь/^2+-зависимой активности СР1 АТФазы в присутствии стимулирующего компонента (сульфита калия) обу словлено обращением \^2+-АДФ-зависимой инактивации фермента.

1.3. Изменения кинетических параметров реакции гидролиза А ТФ в процессе инактивации

С целью выяснения изменений кинетических характеристик фермен в процессе инактивации исследовали зависимости скорости реакции от ко центрации АДФ и АТФ на различных этапах инактивации.

На рис. 5 представлены графики Лайнуивера-Берка, полученные п] двух различных концентрациях АДФ (2 мкМ и 20 мкМ) через 4 сек. пос введения фермента в реакционную среду. Оба графика линейны и позволя* определить константу Михаэлиса реакции (19 мкМ) и константу конкуреи кого ингибирования (24 мкМ). Протекающее во времени снижение скорое реакции сопровождается изменением характера исследуемых зависимости В области высоких концентраций АТФ графики приобретают нелинейш вид (рис. 6). Для квазистационарного состояния Ср1-АТФазы, достигаемо при продолжительности инкубации 2 мин. и более, в области низких конце траций субстрата (менее 7 мкМ) получаем графическим расчетом величи кажущейся константы Михаэлиса около 2 мкМ (Кт().

X

к««».

Рис. 4. Инактивация Ср1 АТФазы в результате инкубацш с и обращение инактива

ции сульфитом. 1 - без предынку бации; 2-е 5-минутной инкуба цией в присутствии 1 мМ МяСЬ Состав реакционной среды см рис. 1.

АТФ (мМ)

Рис. 5. Зависимость обратной скорости реакции от обратной концентрации АТФ через 4 сек. после введения СР)-АТФазы в реакционную среду. Состав среды: 20 мМ Трис-НС1 (рН 7.8), 50 мМ КС1, 10 мМ MgC\г, 1 мМ фосфоенолпи-руват, 0.15 мМ НАДН, 50 мкг/мл СРь 8 ед/мл лактат-дегидрогеназы. Концентрация пируваткиназы: 1 -40 ед/мл (2мкМ АДФ); 2 - 4 ед/мл (20 мкМ АДФ).

[АТФ, мМ]"1

1с. 6. Ингибированне квазистационарной скорости реакции аденозинди-зсфатом. Концентрация пируваткиназы: 1 - 40 ед/мл (2 мкМ АДФ); 2-4 /мл (20 мкМ АДФ). Содержание остальных компонентов среды см. рис, 5.

Низкая величина Кт1 указывет, что в этих условиях каталитический нтр имеет высокое сродство к АТФ. Ингибированне реакции аденозинди->сфатом в квазистационарных условиях в области низких концентраций ГФ имеет неконкурентный характер. Константа неконкурентного ингиби-вания (Ю) равнялась 0.4 мкМ (рис 6). Экстраполяция участка в области соких концентраций АТФ графика Лайнуивера-Берка (рис. 6) позволяет зсчитать значение кажущейся константы Михаэлиса в области высоких

концентраций АТФ (КШ2). Большая величина Кш2 (14мМ) указывает на сущ ствование центра, характеризующегося низким сродством к АТФ.

С целью проверки наших расчетов мы использовали другой метод oi ределения квазистационарной скорости гидролиза АТФ, основанный на и мерении выделившегося в ходе реакции неорганического фосфата. Получе: ное значение Кш2 = 16 мМ согласуется с измеренным первым методом.

Данные проведенного исследования свидетельствуют о том, что процессе инактивации кинетические параметры гидролиза АТФ резко изм няются. Нестабильное активное состояние CFi-АТФазы, наблюдаемое в н чальный момент реакции, характеризуется одним значением Km (19 мкМ) константой конкурентного ингибирования Ki (24 мкМ). Кинетическое пов дение фермента в этом состоянии можно объяснить участием в каталитич ской реакции одного центра или нескольких однотипных центров, характ ризующихся одинаковыми кинетическими параметрами. Последнее предп ложение согласуется с предложенным Бойером механизмом попереме'нног участия в реакции трех каталитических центров CFi-АТФазы (Воуег, 198 Инактивация фермента при увеличении продолжительности инкубации с провождается появлением перегиба на графиках Лайнуивера-Берка. Суще< вование такого перегиба обычно трактуется как свидетельство участия процессе друх нуклеотидсвязывающих центров - с высоким и низким срод| вом к АТФ (Ebel, Lardy, 1974). Исходя из такой трактовки, можно предг дожить, что в процессе инактивации CFi-АТФазы сродство одного из ц( тров к АТФ резко уменьшается (КШ2 достигает 14 мМ), а другого - несколь возрастает (Kmi снижается до 2 мкМ). Константа ингибирования реакц аденозиндифосфатом снижается от 24 до 0.4 мкМ (рис. 6). Неконкурентн характер ингибирования в квазистационарных условиях указывает, 1 центр связывания АДФ в этом состоянии фермента выполняет, по-видимо! регуляторную функцию. Изменение величин кинетических констант реакг в процессе инактивации иллюстрируется графиком (рис. 7), который полу1 на основании значений Кт2 и Ki, рассчитанных при временах инкуба! фермента 4, 10, 22, 44, 110 сек.

24 48 72 96 Время,сек

Рис. 7. Зависимость каэ щейся константы Михаэл! (в области высоких конц траций АТФ) и констан ингибирования реак!. аденозиндифосфатом времени инкубации СР) реакционной среде. Сод жание компонентов сре см. рис. 5.

О

Большая величина второй кажущейся константы Михаэлиса Кт2 (14 мМ) указывает, что в квазистационарных условиях связывание АТФ с соответствующим центром имеет место лишь при высоких концентрациях нук-леотнда. Для выяснения функциональной роли центра с низким сродством к АТФ (Кш2 = 14 мМ) мы исследовали влияние на скорость реакции негидро-лизуемого аналога АТФ - АМРРСР.

На рис. 8 показано, что АМРРСР ингибирует начальную, но повышает стационарную скорость реакции. Совершенно очевидно, что наблюдаемые эффекты невозможно объяснить, исходя только из конкуренции между АТФ и АМРРСР за связывание с каталитческим. центром фермента. Эти эффекты, однако, хорошо согласуются с предположением, что АМРРСР может взаимодействовать, наряду с каталитическим центром, также и с центром, ответственным за стимуляцию CFi-АТФазы высокими концентрациями АТФ. Увеличение скорости реакции при связывании АТФ, по-видимому, не обусловлено его гидролизом, поскольку аналогичный эффект вызывается негидролизуемым аналогом АТФ - АМРРСР. Из этого следует, что константа Кт2 соответствует центру, выполняющему в квазистационарных условиях не каталитическую, а регуляторную функцию. Связывание АТФ с этим центром повышает активность фермента до уровня, наблюдаемого до начала инактивации. Полученные результаты не дают однозначного ответа на вопрос, к какому типу центров - каталитическому или некаталитическому -относится центр с Кт2 = 14-16 мМ. Следует, однако, отметить, что для заполнения некаталитических центров достаточно всего лишь 20 мкМ АТФ (Milgrom et. all., 1991). Исходя из этого, можно предположить, что центр с низким сродством к АТФ, по-видимому, является каталитическим. В поддержку данного предположения говорят результаты работы группы Уолкера (Abrahams et all., 1994), где представлена трехмерная структура Fi-АТФазы митохондрий, полученная методом ренгеноструктурного анализа с разрешением 2.8 А. По данным этой работы, 3 каталитических центра различаются по способности связывать нуклеотиды. Один из центров не содержит нук-леотидов и соответствует, по-видимому, описанному нами центру с низким сродством к АТФ. Второй центр, содержащий АТФ, и третий, содержащий

1

Рис. 8. Влияние АМРРСР на активность Ср1-АТФазы. 1 - контроль, 2 - 1.8 мМ АМРРСР. Концентрация АТФ - 0.2 мМ, MgCl2 -4 мМ, остальных компонентов -как на рис. 5.

АДФ, соответствуют АТФ-связывающему и АДФ-связывающему центрам СР)-АТФазы.

Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о том, что инактивация Ср1-АТФазы затрагивает свойства, по крайней мере, трех нук-леотидсвязывающих центров. Логично предположить, что в активном состоянии фермента все эти центры характеризуются близкими значениями Кт АТФ (19 мкМ) и & АД® (24 мкМ). Инактивация Ср1-АТФазы сопровождается дифференциацией свойств и функций нуклеотидсвязывающих центров. Один из центров приобретает высокое сродство к АДФ (Кл = 0.4 мкМ), прочно связывает его и исключается из каталитического процесса; другой центр, повышая сродство к АТФ (КШ1 = 2 мкМ), сохраняет каталитическую функцию. Третий центр снижает сродство к АТФ. Поскольку в квазистационарном состоянии характеризующая его кажущаяся константа Михаэлиса (Кт2 = 14-16 мМ) значительно выше концентрации АТФ в реакционной среде, АТФ диссоциирует. Увеличение концентрации АТФ до значений, соизмеримых с величиной Кш2, приводит к заполнению центра с низким сродством к АТФ.

2. Участие прочно связывающего АДФ центра в процессе инактивации фермента

По результатам наших исследований с использованием радиоактивной метки [14С]АДФ и [14С]АТФ СР) после осаждения в 2 М сульфате аммония и последующей гель-фильтрации содержит 0.95 моля АДФ и 0.004 моля АТФ в прочно связанном состоянии. Результаты содержания прочно связанных нуклеотидов, полученные методом люциферин-люциферазного анализа (0.9 ± 0.1 моля АДФ и менее 0.005 моля АТФ на 1 моль СРО, подтверждают полученное при помощи радиоактивного анализа соотношение нуклеотидов на Ср1-АТФазе. С целью выяснения роли прочно связывающего АДФ центра в процессе инактивации, Ср1, содержащий прочно связанные 0.95 моля АДФ и 0.004 моля АТФ, предварительно инкубировали в течение 5. мин. в присутствии 1 мМ М^СЬ. Как следует из данных таблицы 2, такая инкубация сильно подавляла АТФазную активность фермента. В то же время, преинку-бация фермента с АДФ в отсутствие магния не влияла на его активность, а в присутствии магния не приводила к дополнительной инактивации (таблица 2).Отсутствие влияния АДФ (50 мкМ), а также-н АТФ-регенерирующей системы хорошо согласуется с предположением о том, что на центре, контролирующем активность фермента, находится прочно связанный АДФ. Эти данные позволяют сделать вывод, что центр прочного связывания АДФ и центр ответственный за инактивацию фермента аденозиндифосфатом и ионами магния в процессе гидролиза АТФ, функционально неразличимы и, очевид но, относятся к одному и тому же типу нуклеотидсвязывающх центров Ср1 АТФазы. Таким образом, инактивация СР1-АТФазы в присутствии ионо! М§2+ вызывается образованием комплекса магния с прочно связанным АДФ

Влияние состава среды прсинкубации на начальную активность СР^АТФазы

(за единицу принята активность СЕ ¡-Л ТФазы через 4 сек. после введения фермента в реакционную среду, равная 6,8 мкмоль-мин'1 на 1 мг)

Добавки в среду преинкубации

Среда - АДФ, 0,05 мМ Пируваткиназа (200 мкг/мл) + 2 мМ ФЕП

Без Mg2+ 1.0 1.0 0.88

В присутствии 1 мМ Mg2+ 0.03 0.03 0.03

3. Кинетические свойства CFi, дефицитного по минорным субъединицам

Известно, что минимальный комплекс субъединиц CFi-АТФазы, сохраняющим способность к гидролазной активности - аз[5зу (Richter et all). В связи с этим представлялось интересным выяснить, сохраняется ли способность к М£2+-АДФ-зависимой ннактивации у фермента, дефицитного по минорным субъединицам (CFi-8, е). Были исследованы зависимости АТФазной активности CFi-5, £ от различных концентраций АДФ и MgCbB реакционной среде. Согласно данным этого исследования, увеличение концентраций АДФ и MgCh в среде коррелирует со снижением активностиСр1-5,е стационарном режиме, подобно тому, как это наблюдалось на ферменте с полным набором субъединиц (рис 1,2).

Кроме того, способность фермента к обращению 1^2+-АДФ-зависимой инактивации сохраняется также и на препаратах CFi -8,s .

По результатам наших исследований с использованием радиоактивной метки [|4С]АДФ и [14С]АТФ, CFi-8, £ после осаждения в 2 М сульфате аммония и последующей гель-фильтрации содержит 0.9 моля АДФ и 0.005 моля АТФ в прочно связанном состоянии. Сопоставление с аналогичными данными, полученными на препарате CFi с полным набором субъединиц (раздел 2), позволяет сделать вывод, что при удалении 5 и с субъединиц сопрягающий фактор сохраняет способность к прочному связыванию АДФ. При исследовании кинетических закономерностей М§2+-АДФ-зависимой инактивации CFi-АТФазы (раздел 1.3) было показано, что один из центров прочно связывает АДФ с Ki = 0.4 мкМ, а другой - АТФ (Km = 2 мкМ). С целью изучения кинетических характеристик центра прочного связывания АДФ на ферменте, не содержащем минорные субъединицы, мы исследовали активность фермента в реакциях нуклеотидного обмена при субстехиомет-рических соотношениях АДФ/АТФ и CFi-8, е. Фермент инкубировали при субстехиометрических соотношениях [14С]АДФ и [14С]АТФ к ферменту 0.4 : 1 при комнатной температуре. Через определенные промежутки времени отделяли фермент от свободных нуклеотидов гель-фильтрацией. Порции элюата после денатурации белка при температуре 100 °С в течение 2 мин. наносили

на хроматографическую пластину (Cellulose 300 PEI) и разделяли нуклеоти-ды в среде, содержащей 0.1 M цитрата натрия (рН 4.1). На рис. 9а представлены кинетические кривые прочного .связывания АДФ и АТФ с CFi-ô, е. По данным этого графика расчитывали константы скоростей связывания нук-леотидов, которые соответствовали 1200 ± 200 M-'-s-1 для АДФ и 80 ± 20 М-'•s1 для АТФ. Значения констант расчитывались по начальным скоростям связывания и представляют среднее из трех измерений.

12

о

т-

><

и

со ■

1С

О

тз <

и

а -—С---°-0

• о * АДФ

АТФ

G О 0

« «

10 20

Время, мин

30

5 10 15 Время, мин

Рис. 9. (а) Кинетика прочного связывания [14С]АГ)Р и [14С]АТР. (б) Кинетика диссоциации прочно связанного [14С]АОР и [14С]АТР. Условия экспериментов описаны в тексте.

С целью определения скорости диссоциации прочно связанных АДФ и АТФ, СР1-6, е, содержащий 0.9 моля [14С]АДФ и 0.005 моля [14С]АТФ в прочно связанной форме, переносили на фильтр "Центрикон". После введения в среду в стехиометрическом соотношении "холодного" АДФ и АТФ (АДФ/АТФ : СР1-5, е = 0.4 : 1) через указанные промежутки времени (рис. 96) отбирали пробы фильтрата после центрифугирования и оценивали диссоциацию по появлению [14С]АДФ/АТФ в фильтрате. На рис.9б представлены кинетические кривые диссоциации прочно связанных [14С]АДФ/АТФ. По начальному наклону кривых рассчитывали значения констант скоростей диссоциации нуклеотидов, которые соответствовали (0.4 ± 0.1)-Ю-3^-1 для АДФ и (1 ± 0.2)-10-3-з-1 для АТФ. Полученные значения кинетических констант позволяют рассчитать равновесные параметры (Кл) взаимодействия АДФ и АТФ с ферментом (СР1-8, б), которые соответствовали 0.310-6 М и 1.2-Ю-5 М для АДФ'и АТФ соответственно: Сопоставление этих констант позволяет заключить, что в указанных условиях АТФ обладает значительно меньшим сродством к нуклеотидсвязывающему центру СБ] -8, е. Сравнение

полученных величин с соответствующими константами фермента с полным набором субъединиц приводит к выводу, что при удалении минорных субъединиц кинетические свойства прочно связывающего АДФ центра сохраняются.

4. pH-зависимость обратимой инактивации CFi-АТФазы

Согласно литературным данным, активация Н+-АТФазы связана с протонированнем групп внутреннего пула фермента и депротонированием групп внешнего пула (Graberet all., 1982; Mitchell et all., 1984; Haraux et all., 1987). Предметом дискуссии остается вопрос, локализованы ли эти группы в пределах каталитической части (CFi) или в мембранной части (CFo). На изолированной форме фермента было показано, что при значениях pH 5.2-5.5 наблюдается протонирование кислотно-основных (ионогенных) групп CFi-АТФазы, тогда как при значениях pH 8.0-9.0 эти группы депротонированы (Губанова с соавт., 1994). В связи с этим представлялось интересным исследовать закономерности обратимой Д^2+-АДФ-зависимой инактивации CFi в условиях, когда его ионогенные группы находятся в протонированной и де-протонированной форме, и тем самым выявить возможное участие этих групп, локализованных на уровне каталитической части фермента, в процессе активации/инактивации CFi-АТФазы хлоропластов. Необходимость использования АДФ в среде инкубации отсутствовала, поскольку нуклеотид содержался в прочно связанной форме в препаратах CFi-АТФазы.

4.1. Влияние pH на скорость и степень инактивации CFrA ТФазы

На рис. 10 представлена кинетика инактивации CFi-АТФазы ионами Mg2+ при низких и высоких значениях pH. Как следует из рисунка, инкубация CFi в присутствии ионов Mg2+ приводит к подавлению его АТФазной активности. Степень и скорость инактивации возрастают при переходе от pH 5.5 к pH 9.0.

• I

Рис. 10. Зависимость активности CFi-АТФазы от времени предынкубации с ионами Mg2+ при рН 5.5, 9.0. Состав среды предынкубации: 20 мМ Трис-MES-буфер, 5 мМ КС1, 0.25 мМ MgCl2 , 1 мг/мл CFi.

Время, мин

После предынкубации Ср1 с MgCl2 через указанные на рисунке промежутки времени определяли АТФазную активность по окислению НАДН. Время достижения 50%-го эффекта инактивации фермента при рН 9.0 составляет менее 0.25 мин., тогда как при рН 5.5 - около 7 мин. Равновесное состояние инактивации Ср1-АТФазы при рН 9.0 достигается примерно за 20 мин. и при рН 5.5 - за 50 мин.

На рис. II представлена зависимость АТФазной активности СР1-АТФазы от величины рН предынкубации с ионами магния. Как видно из рисунка, степень инактивации фермента существенно зависит от величины рН. При рН 5.2, когда степень протонирования кислотно-основных групп фермента высока, ингибирующее действие значительно ослаблено.

0.8

0.9

1.0

00 1.1 I

1.2

1.3

1.4

Рис. 11. Зависимость активности Ср1-АТФазы от величины рН среды предынкубации. Время предынкубации - 50 мин. Состав среды предынкубации: Трис-МЕБ-буфер (20 мМ), КС1 (5 мМ), СР1 (1 мг/мл). Аз - активность СР: после 50 мин. предынкубации с 0.25 мМ М^СЬ.

6 7 8 9

РН

При переходе от рН 5.2 к рН 9.0 количество депротонируемых груш увеличивается, что коррелирует со способностью фермента связывать Mg24 при этом степень инактивации CFi-АТФазы возрастает. В области рН 8.5-9.1 почти все исследуемые группы фермента переходят в депротонированно состояние и дальнейший рост рН не влияет на способность CFi связыват ионы Mg2+. Данные представленного эксперимента, свидетельствуют о том что АТФазная активность CFi зависит от степени протонирования депртонирования его кислотно-основных групп, ответственных за инактива цию фермента.

4.2. Зависимость АТФазной активности CF, от концентрации при рН 5.5 и 8.0

Исследовалось влияние различных концентраций Mg2+ на эффекта! ность инактивации CFi-АТФазы при высоких и низких значениях рН (5.5 8.0). Графики в координатах Лайнуивера-Берка (рис. 12) свидетельствуют конкурентном характере отношений между Mg2+ и Н+.

2,5

\ 10 "Н*0

*Г 1.5

I

о

0,51-

°'8,0 0,1 0,2 0,3 0,4 1/Mg24", мкМ"1

2,0 ■„

рН 5.5

Рис. 12. Зависимость обратной скорости гидролиза АТФ от обратной концентрации ионов Мя2+ в среде предынкуба-ции при рН 5.5 и 8.0. Время предынкубации - 50 мин. Состав среды предынкубации: Трис-МЕЯ-буфер (20 мМ), КС1 (5 мМ), СР1 (1 мг/мл). Ао -АТФазная активность СБ1 в начальный момент времени; Аз - активность Ср1 после 50 мин. предынкубации с К^СЬ.

Кажущаяся константа диссоциации (Kd) по Mg2+ при рН 5.5 равна 160 мкМ, тогда как при рН 8.0 - 1.6 мкМ (рис. 12). Полученные результаты свидетельствуют о том, что в протонированной форме фермента сродство Mg2+ к центру/центрам связывания ослабляется. При этом Mg2+ и Н+ конкурируют за связывание с этими группами, определяя уровень каталитической активности CFi-АТФазы. Аналогичный эффект конкуренции между Mg2+ и Н+ был показан группой Виноградова на препаратах Fi митохондрий при изучении свойств 1у^2+-связывающего центра, ответственного за инактивацию фермента (Bulygin et all., 1993).

4.3. Реактивация CFrA ТФазы при рН 5.5

Снижение степени инактивации при переходе к низким значениям рН (5.5) позволило предположить, что CFi-АТФаза, предынкубированная с ионами Mg2+ при рН 8.0, будет реактивироваться при снижении рН среды. С целью проверки этого предположения CFi-АТФазу инактивировали предын-кубацией фермента с 0.25 мМ MgCh в среде, содержащей 20 мМ трис-MES-буфер (рН 8.0). После 50 мин. инкубации фермента с MgCh, необходимых, согласно данным рис. 10, для инактивации CFi , снижали рН среды инкубации до рН 5.5 добавлением концентрированного (100 мМ) трис-МЕ8-буфера. Через промежутки времени, указанные в рис. 13, определяли АТФазную активность фермента. При снижении рН среды до 5.5 происходила реактивация CFi-АТФазы. Время достижения 50%-го эффекта составляло 10 мин. Реактивация CFi-АТФазы при низких значениях рН (5.5) согласуется с представлением о том, что активация/инактивация фермента зависит от протонирова-ния-депртонирования кислотно-основных групп, локализованных на уровне каталитической части CFi хлоропластов.

0,8

1,0

Рис. 13. Реактивация СР1-АТФазы низкими значениями рН (5.5). А5 - активность фермента после 50 мин. инкубации с МяСЬ; А1 - активность фермента после снижения рН до 5.5.

0,4

0,2 0,0

1,01.......■//■'• ■■

0 10 20 30 40 75 90

Время, мин

ВЫВОДЫ

1. Показано, что гидролиз АТФ изолированным Ср1 хлоропластов в присутствии АТФ-регенирирующей системы имеет двухфазный характер. Высокая начальная скорость гидролиза постепенно снижается, достигая в дальнейшем низкого стационарного уровня. Степень инактивации фермента возрастает с увеличением концентрации АДФ и М£2+.

2. Обнаружено, что снижение активности Ср1-АТФазы специфично к ионам

и не наблюдается при Са2+-зависимом гидролизе АТФ.

3. Инактивация СР]-АТФазы - обратимый процесс: при введении в реакционную среду сульфита (в качестве активатора) происходит реактивация фермента.

4. В активном состоянии фермента (начальная фаза) нуклеотидсвязываю-щие центры, участвующие в реакции гидролиза АТФ, обладают близкими кинетическими характеристиками. Инактивация фермента сопровождается увеличением сродства одного из нуклеотидсвязывающих центров к АДФ, другого центра к АТФ и снижением сродства к АТФ третьего центра.

5. Выявлено, что инактивация фермента может достигаться в отсутствие свободного АДФ в реакционной среде. В этом случае образование неактивного 1^-АДФ-Ср1 комплекса обеспечивается за счет эндогенного прочно связанного АДФ.

6. Ср1 хлоропластов, дефицитный по минорным субъединицам (СР1-5, е), сохраняет способность к 1\^2+-АДФ-зависимой инактивации.

7. Обнаружено, что А^2+-АДФ-завистшая инактивация проявляет рН-зависимые свойства. При снижении рН от 9.0 до 5.5 скорость и степень инактивации CFi-АТФазы уменьшается.

8. Выявлен конкурентный характер взаимодействия ионов Mg2+ и протонов с кислотно-основными группами, ответственными за М§2+-АДФ-зависимую инактивацию фермента. Связывание ионов Mg2+ с этими группами приводит к инактивации CFi-АТФазы, а вытеснение Mg2+ протонами сопровождается активацией фермента.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мальян А.Н., Вицева О.И. Предстационарная кинетика гидролиза АТФ CFt-АТФазой хлоропластов. //Биохимия, 1983, Т.48, вып. 5, с. 718-724.

2. Мальян А.Н., Вицева О.И. Кинетический анализ обратимой инактивации растворимой АТФазы хлоропластов. //Тез. докл. Всесоюз. симп. "Молекулярные механизмы и регуляция энергетического обмена". Пу-щино, 1986, с. 34.

3. Мальян А.Н., Вицева О.И. Кинетика стимуляции сульфитом Mg2+-зависимой активности CFi-АТФазы хлоропластов. //Физиол. биохим. культ, раст., 1987, Т. 19, вып. 5, с. 456-461.

4. Вицева О.И., Мальян А.Н. Прочное связывание нуклеотидов сопрягающим фактором хлоропластов CFi, дефицитным по 5 и s субъедииицам. //Биохимия, 1996, Т. 61, выл. 2., с. 337-344.

5. Вицева О.И., Мальян А.Н. рН-зависимость обратимой инактивации CFi-АТФазы. //Тез. докл. Межд. конф. "Биоэнергетика фотосинтеза". Пущи-но, 1996, с. 47.

6. Malyan A.N., Vitseva O.I. On the mechanism of regulation of catalytic activity of chloroplast coupling ! ATPase. //In "Progress in photosynthesis research", Dordrecht. M. NijhofTPubl., 1987, Vol. 3, p. 1-23.

7. Malyan A.N., Vitseva O.I. pH dependent changes in ADP and ATP affinity for the tight nucleotide-binding site of chloroplast coupling factor 1. //Photosynthesis Research, 1990, 25, p. 11-13.

8. Malyan A.N., Vitseva O.I. Kinetic analisis of ADP and Mg2+-dependent inac-tivation of CFi-ATPase. //Photosynthetica, 1990, 24 (4), p. 613-622.

9. Malyan A.N., Vitseva O.I The role of spesific acid-base groups of CFi in Mg2+-dependent inactivation and H+-dependent activation of chloroplast H+-ATPase. //Abstr. 10-th International Photosynthesis congress, Montpellier, France, 1995, p. 114.

10. Malyan A.N., Vitseva O.I. pH-dependent changes of active/inactive state equilibrium of chloroplast H+-ATPase. //"Photosynthesis: from Light to Biosphere", Kluwer Academic Publ. Boston/London, (P. Mathis, ed.) 1995, Vol. 3, p. 23-26.