Роль малых G-белков в регуляции эпителиальных натриевых каналов

Старущенко, Александр Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль малых G-белков в регуляции эпителиальных натриевых каналов
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Роль малых G-белков в регуляции эпителиальных натриевых каналов"

На правах рукописи

СТАРУЩЕНКО АЛЕКСАНДР ВИКТОРОВИЧ

РОЛЬ МАЛЫХ в-БЕЛКОВ В РЕГУЛЯЦИИ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ НАТРИЕВЫХ КАНАЛОВ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

003491011

Санкт-Петербург 2010

003491011

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт цитологии РАН, Научном центре здоровья Университета Техаса (США) и Медицинском колледже Висконсина (США)

Научный консультант: доктор биологических наук

Негуляев Юрий Алексеевич

Институт цитологии РАН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Крутецкая Зоя Иринарховна

Санкт-Петербургский государственный университет

доктор биологических наук Казначеева Елена Валентиновна

Институт цитологии РАН

доктор биологических наук Тихонов Денис Борисович

Институт эволюционной физиологии им. И.М. Сеченова РАН

Ведущая организация: Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН

Защита состоится « 19 » февраля 2010 года в 12 часов на заседании Диссертационного совета Д.002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4.

Сайт института: www.cytspb.rssi.ru

Адрес электронной почты института: cellbio@mail.cvtspb.rssi.ru Факс института +7(812)297-03-41

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН. Автореферат разослан « /г » января 2010 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат биологических наук / Е. В. Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В физиологии почки и в клинической практике вопрос о регуляции реабсорбции натрия остается одним из наиболее актуальных и дискуссионных. В собирательных трубочках почки транспорт На" является важнейшим механизмом поддержания электролитического и водного гомеостаза и, следовательно, кровяного давления. Концентрация натрия в плазме определяет объем крови и регулируется путем изменения транспорта через эпителий почки. Исследование механизмов, опосредующих реабсорбцию натрия, является интенсивно развивающимся направлением современной физиологии, клеточной биологии и медицины. Ведущую роль в поддержании функциональной способности эпителиальных тканей почки и ряда других органов играют различные транспортные процессы с участием ионных каналов клеточных мембран. Согласно современным представлениям, Ктаг пассивно входит в клетку по эпителиальным натриевым каналам (Е№С), расположенным в апикальной мембране, и удаляется из клетки при помощи №+/К+-АТФазы, локализованной в базолатеральной мембране эпителиальных клеток. Нарушение регуляции транспорта Ыа+ через Е№С приводит к различным патологическим состояниям (1-4). Разработка метода локальной фиксации потенциала (пэтч-кламп), позволяющего в реальном масштабе времени наблюдать элементарные события - одиночные открывания ионных каналов в участке плазматической мембраны (5), позволила существенно продвинуться в изучении ионных каналов, и ЕШС, в частности. Кроме того, в 1994 году была определена нуклеотидная последовательность ДНК, определяющая образование ЕК'аС (6,7), что позволило использовать различные модельные объекты для исследования механизмов транспорта натрия через Е№С.

Роль малых СТР-связывающих белков (малые О-белки) в различных клеточных процессах таких, как контроль клеточного роста, реорганизация цитоскелета, пролиферация и дифференцировка, не вызывает сомнения (8). Малые в-белки также вовлечены в различные сигнальные каскады в дифференцированных клетках. Недавно было установлено, что малые О-белки играют существенную роль в регуляции активности ионных каналов. Ионные каналы являются финальными эффекторами для различных малых О-белков (9).

Однако, несмотря на интенсивные исследования, в том числе и с использованием метода пэтч-кламп, до наших работ ничего не было известно о механизмах регуляции эпителиальных натриевых каналов малыми в-белками, а также о вовлечении фосфатидилинозитидов в эту регуляцию.

Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в установлении функциональных свойств, структуры и механизмов регуляции эпителиальных натриевых каналов. Основное внимание было уделено исследованию механизмов регуляции этих каналов малыми в-белками и вовлечению фосфатидилинозитидов в данный процесс. Отдельная часть работы посвящена исследованию стехиометрии канала и сайтов связывания фосфатидилинозитидов с субъединицами канала.

В связи с этим были поставлены следующие задачи исследования:

1. Зарегистировать и охарактеризовать реконструированные в клетки млекопитающих эпителиальные натриевые каналы и нативные амилорид-чувствительные натриевые каналы в клетках собирательной трубочки почки.

2. Разработать новые методические подходы, использующие флуоресцентную микроскопию, с помощью которых будет возможно исследовать как формирование новых каналов в живых клетках, так и транслокацию каналов к плазматической мембраны и от нее.

3. Определить субъединичный состав функционального канала и смоделировать структуру Е№С на базе протон-чувствительного канала, входящего в семейство Deg/ENaC.

4. Идентифицировать малые О-белки, участвующие в регуляции Е№С.

5. Изучить сигнальные пути и механизмы регуляции ЕЫаС малыми О-белками.

6. Исследовать возможную роль фосфатидилинозитидов в работе ЕЫаС и в регуляции канала малыми в-белками.

7. Идентифицировать сайты связывания канала с фосфатидилинозитидами. Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработанные нами новые методические подходы, включая регистрацию Е№С в нативных клетках и экспрессированного в клетки

млекопитающих, а также использование современных флуоресцентных методов микроскопии, позволяют исследовать структуру и функции ENaC в условиях приближенных к физиологическим.

2. Определена стехиометрия канала, показывающая, что ENaC является тримером и содержит равное количество a-, Р- и у-субъединиц. На основе протон-чувствительного канала cASICl смоделирована структура ENaC и идентифицированы потенциально важные для регуляции канала домены и сайты.

3. Функционирование ENaC регулируется малыми G-белками, входящими в семейства Ras, Rho и Rab. При этом малые G-белки вовлечены как в модуляцию воротных свойств канала, так и в изменение количества функционально активных каналов в плазматической мембране. Детально описаны механизмы регуляции ENaC малыми G-белками.

4. Показано, что фосфатидилинозитиды Р1(4,5)Р2 и Р1(3,4,5)Р3 вовлечены в регуляцию ENaC малыми G-белками. Эффект опосредован прямым связыванием указанных фосфатидилинозитидов с (3- и у-субъединицами канала. Идентифицированы сайты связывания ENaC с Р1(4,5)Р2 и

Р1(3,4,5)Р3.

Научная новизна полученных результатов. Работа представляет собой первое комплексное исследование структуры и механизмов регуляции эпителиальных натриевых каналов, выполненное с применением современных электрофизиологических методов и микроскопии. Полученные в процессе выполнения работы результаты обладают несомненной новизной, так как исследование эпителиальных натриевых каналов в плазматической мембране клеток млекопитающих до наших работ практически не проводилось и роль малых G-белков и фосфатидилинозитидов в регуляции ENaC не была изученной.

В настоящей работе разработаны электрофизиологические и микроскопические методы регистрации реконструированного ENaC в клетках млекопитающих и в нативных клетках, позволяющие изучать структуру и функции канала. Приоритетными являются данные по определению стехиометрии канала, которые показали, что ENaC является тримером, и опровергли существующие ранее теории о тетрамерной и нонамерной

организации канала. На основе протон-чувствительного канала смоделированы вторичная и третичная структуры ЕЫаС, необходимые для дальнейшего изучения функций канала. Впервые идентифицированы малые С-белки, участвующие в регуляции Е№С, и показаны механизмы их действия. Установлено, что малые С-белки участвуют как в модуляции воротных свойств канала, так и в сигнальных механизмах, приводящих к изменению количества функциональных каналов в плазматической мембране. Особый интерес представляют результаты, показывающие, что фосфатидилинозитиды принимают участие в регуляции активности канала малыми С-белками. Впервые определены сайты связывания Е№С с Р1(4,5)Р2 и Р1(3,4,5)Р3.

Теоретическое и практическое значение работы.

Результаты работы имеют большое теоретическое значение для понимания роли малых в-белков в регуляции Е№С и реабсорбции в эпителиальных клетках почки, а также роли этих каналов в поддержании необходимого уровня натрия в физиологических условиях и при различных патологиях. Полученные результаты позволяют расширить представление о эпителиальных натриевых каналах и механизмах их активности. Большое практическое значение работы состоит в определении стехиометрии канала, что позволяет более точно определить структуру и, соответственно, функции канала. В клетках почки абсорбция Ыа+ приводит к увеличению объема плазмы и повышению кровяного давления. В связи с этим повышенная активность ЕЫаС вызывает гипертонию, а пониженная - гипотонию (2-4). Мутации генов, кодирующих субъединицы Е№С, приводят к ряду тяжелых наследственных заболеваний, таких как синдром Лиддла и псевдогипоальдостеронизм типа 1(10-12). Таким образом, исследование сигнальных механизмов регуляции ЕЫаС необходимо для понимания физиологических и патофизиологических процессов, участвующих в регуляции реабсорбции натрия.

Полученные важные данные о регуляции ЕЫаС малыми О-белками и фосфатидилинозитидами могут быть полезны для изучения различных типов ионных каналов, включая другие каналы, входящие в семейство Ое^Е№С. Полученные результаты способствуют выяснению общих принципов

организации ионных каналов плазматических мембран в контексте их участия во внутриклеточной сигнализации.

Разработанная в процессе исследований новейшая технология, включающая в себя совместное использование флуоресцентных методов микроскопии (TIRF, FIR и FRAP), обладает уникальными возможностями для регистрации распределения функциональных каналов в плазматической мембране живых клеток. Данные по действию различных агентов на функциональные характеристики ENaC могут быть применены при разработке и тестировании фармакологических препаратов. Результаты работы могут использоваться в курсах лекций по клеточной биологии, физиологии и биофизике.

Апробация работы. Материалы работы доложены и обсуждены на 6 Санкт-Петербургской ассамблее молодых ученых и специалистов (Санкт-Петербург, 2001), ежегодной конференции Федерации Американских обществ по экспериментальной биологии «Трансляция генома» (Вашингтон, США, 2004 и 2007), 37 съезде Американского Нефрологического общества (Сэнт-Луис, США, 2004), совместной конференции Федерации Американских обществ по экспериментальной биологии и 35 международного съезда по Физиологическим наукам (Сан Диего, США, 2005), 49 международном съезде Биофизического общества (Лонг Бич, США, 2005), 5 международном Биофизическом конгрессе (Монпелье, Франция, 2005), 3 ежегодной конференции Центра Биомедицинских Нейронаук (Сан Антонио, США, 2005), 38 и 41 съезде Американского Нефрологического общества (Филадельфия, США, 2005 и 2008), ежегодной конференции Федерации Американских обществ по экспериментальной биологии (Сан Франциско, США, 2006), 51 международном съезде Биофизического общества (Балтимор, США, 2007), национальном съезде Фонда по болезням почек (Орландо, США, 2007), 6 международном симпозиуме «Альдостерон и ENaC: от гена к болезням», 40 съезде Американского Нефрологического общества (Сан Франциско, США, 2007), ежегодной конференции Федерации Американских обществ по экспериментальной биологии (Сан Диего, США, 2008), Пекинской совместной конференции по физиологическим наукам (Пекин, Китай, 2008), 53 международном съезде

Биофизического общества (Бостон, США, 2009), научной конференции «Ионные каналы: структура и функции» (Санкт-Петербург, 2009), ежегодной конференции Федерации Американских обществ по экспериментальной биологии (Нью Орлеан, США, 2009), международном конгрессе по Нефрологии (Милан, Италия, 2009) на семинарах кафедр физиологии, фармакологии или медицины (Научного центра здоровья Университета Техаса в Сан Антонио, Университета Калифорнии в Сан Франциско, Университета Флориды в Гэйнсвилле, Научного центра здоровья Государственного университета Луизианы в Новом Орлеане, Медицинского центра университета Рочестера, Аризонского университета, Университета Айовы, Университета Ла Лагуны и Медицинского колледжа Висконсина), а также на научных семинарах Института цитологии РАН.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 363 публикации. Работа изложена на 218 страницах машинописного текста и иллюстрирована 69 рисунками и 4 таблицами.

Финансовая поддержка работы. Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ, Американского национального института здоровья, Американской ассоциации по болезням сердца, Национального фонда по болезням почек и Американского общества нефрологов.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 23 статьи в ведущих отечественных и зарубежных изданиях и 45 тезисов докладов.

КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клетки. Клетки СНО и Cos-7 (АТСС) культивировали в стандартных условиях (DMEM + 10% эмбриональной телячьей сыворотки и антибиотики, 37 °С, 5 % С02) и трансфецировали, используя трансфекционный реагент Polyfect (Qiagen, США) согласно протоколу производителя за 24-72 ч до экспериментов. Пересев клеток осуществляли через каждые 72 ч.

Для регистрации нативных каналов использовали иммортализованную клеточную линию, выделенную из собирательных трубочек мыши (mpkCCDc|4).

Клетки выращивали на проницаемых подложках, в которых имеется доступ к обеим сторонам мембраны (Costar Transwells) в растворе, предложенном авторами, выделившими и предоставившими нам эту клеточную линию (13,14). Для формирования монослоя, имеющего высокое электрическое сопротивление и обладающего достаточным транспортом Na+, среду меняли каждые 48 ч в течение 7-10 сут. После формирования монослоя и образования межклеточных контактов подложку с клетками разрезали на несколько частей (~ 4x4 мм), которые использовались для проведения электрофизиологических и (или) микроскопических исследований функциональной активности каналов в апикальной плазматической мембране. Для измерения транспорта натрия клетки растили на проницаемых подложках в течение всего эксперимента.

Нами также были исследованы функциональные характеристики нативных каналов, локализованных в апикальной мембране клеток из собирательных трубочек, выделенных из почек крысы. Непосредственно перед экспериментами трубочки были изолированы из почек крыс (3-4 нед, любого пола) линии Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, США). Крыс содержали в течение 7 сут на нормальной диете (0.32 % натрия) или диете с низкой концентрацией натрия (0.01 %). Для обеспечения доступа к апикальной плазматической мембране клеток собирательные трубочки помещали на покровные стекла, покрытые полилизином, а затем последовательно вскрывали их заточенными стеклянными микропипетками, закрепленными на двух микроманипуляторах (Sutter или Narihige).

Электрофизиология. Регистрацию интегральных токов через эпителиальные натриевые каналы, реконструированные в клетках СНО, производили с помощью метода пэтч-кламп (5) в режиме отведения от целой клетки. Использовали усилитель Axopatch 200В (Axon Instruments), соединенный с персональным компьютером через аналого-цифровой преобразователь Digidata 1440 (Axon Instruments). Для регистрации и обработки данных использовали программное обеспечение pClamp 9 или 10.2 (Axon Instruments). Емкости клеток были компенсированы и составляли -8-10 пФ. Для регистрации ионных токов через одиночные каналы плазматической мембраны использовали конфигурации cell-attached, inside-out и outside-out. Для фильтрации сигнала при исследовании

одиночных каналов использовали 8-полюсный фильтр Бесселя (Warner Instr). Пипетки изготавливали из стеклянных капилляров (World Precision Instr) с использованием оборудования для вытягивания микроэлектродов Р-97 (Sutter). Непосредственно перед началом эксперимента пипетки заполняли соответствующим раствором.

Для регистрации реабсорбции Na+ в поляризованных клетках линии mpkCCDCi4 использовали систему Millicel с двусторонними Ag/AgCl электродами (Millipore Corp). При определении тока использовали отношение трансэпителиального электрического напряжения к сопротивлению.

TIRF микроскопия. Флуоресцентное излучение от CFP-M, YFP-M и CFP- или YFP-меченых субъединиц ENaC регистрировали с помощью TlRF (Total Internal Reflection Fluorescence) микроскопии, которая позволяет идентифицировать сигналы, поступающие с плазматической мембраны. Флуоресцентные излучения регистрировали с помощью инвертированного микроскопа ТЕ2000 (Nikon), оборудованного специальными линзами для регистрации TIRF. Образцы исследовали с использованием Аро TIRF масляно-иммерсионного 60х объектива с высоким разрешением (апертура 1.45). Флуоресцентные фотографии были получены с применением охлаждаемой ПЗС камеры (Cascade 512F; Roper Scientific Inc) и обработаны с помощью программного обеспечения Metamorph (Mol Devices).

FRAP микроскопия. FRAP (Fluorescence Recovery after Photobleaching) метод применялся нами в комбинации с TIRF микроскопией. Меченные флуорофорофорами a-, ß- и у-субъединицы ENaC и мембранные маркеры были выжжены на плазматической мембране при помощи аргонового лазера (длина волны 514 нм) при полной мощности в течение 2 мин. Флуоресцентные излучения от мембранных флуорофоров регистрировали при помощи TIRF микроскопии до и непосредственно после выжигания. Регистрацию сигнала производили каждую минуту до окончания эксперимента. В отдельных экспериментах для уменьшения выжигания сигнала на плазматической мембране регистрации производили через 15 и 30 мин после выжигания.

Статистический анализ. Результаты представлены как среднее ± средняя ошибка. Парные и непарные эксперименты сравнивали, используя соответствующие /-тесты Стьюдента. Различия с р < 0.05 считали достоверными.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Стехиометрия ENaC и моделирование структуры ENaC на основе ASIC каналов. ENaC состоит из трех гомологичных субъединиц - а, (3 и у. Все три субъединицы участвуют в формировании поры канала и определяют его

характеристики - проводимость, селективность и воротные

Эпителий собирательных трубочек

¡1

а г © ф " s

К I

н2о ф-

Альдостерон -индуцируемые белки

i 1

/ф ENaC

Альдостерон

Рис. 1. Модель, демонстрирующая регуляцию реабсорбции через

эпителиальные клетки. Показаны два возможных механизма изменения активности Е№С: 1) контроль вероятности открытого состояния находящихся в плазматической мембране каналов - влияние на воротные свойства Е№С и 2) стимулирование встраивания новых функциональных ЕЫаС в плазматическую мембрану или замедление интернализации ЕЫаС.

механизмы. Активность ЕЫаС, как и других ионных каналов, регулируется двумя

фундаментальными механизмами -изменением вероятности

открывания одиночных каналов (Р0) и изменением общего количества каналов в плазматической мембране. Ряд эндокринных факторов регулирует с помощью различных внутриклеточных

сигнальных каскадов количество и активность Е№С. Наиболее важным гормоном, влияющим на интенсивность натриевой

реабсорбции в дистальном нефроне является минералокортикоид

альдостерон. В клетках

собирательных трубочек коркового вещества он вызывает увеличение синтеза ряда белков, ответственных за повышение активности ЕЫаС,

включая малый в-белок К-Яаз. На рис. 1 показана схема регуляции реабсорбции Ыа+ через эпителиальные клетки. Как отмечено на данной схеме, альдостерон действует посредством: 1) контроля вероятности открытого состояния каналов в плазматической мембране и 2) стимулирования встраивания новых функциональных Е№С или замедления интернализации каналов.

Определение стехиометрии ЕЫаС необходимо для дальнейшего изучения функциональных характеристик, определения сайтов связывания и понимания вторичной и третичной структур канала. Существует несколько теорий, среди которых тетрамерная организация канала, согласно которой ЕЫаС состоит из

А.

еСРР"а 31 21

ю, еУРР-р V

В. еСРР-(

к, = 0.84

Б.

4 6 8

г (А.и.) з, еСРР-р еУРР-а

1:1 2:1 3:1

сЭМА соотношение, а-ЕМаС : р-ЕМаС

1:1 2:1 3:1

сРМА соотношение, р-ЕЫаС : а-Е№С

Рис. 2. Е1ЧаС состоит из одинакового количества а- и р-субъединиц. График рассеяния флуоресцентных излучений еСИР относительно еУРР, зарегистрированных с помощью НИР в клетках, трансфецированных еСРР-аР.ЫаС + еУРР-рЕЫаС и не меченых флуоресцентной меткой уЕЫаС (А) и еСТР-рНКаС + еУРР-аЕ№С и уЕШС субъединицами (В). Красные линии отражают наиболее соответствующие линейные регрессии, полученные при анализе данных и использовании соответствующих коэффициентов К/ и к?. Черные линии предсказывают соотношения субъединиц при указанной стехиометрии. Красные, голубые и зеленые кружки показывают данные, полученные в клетках, трансфецированных равным количеством еСРР- и еУРР-мсченых субъединиц, и тех, где соотношение еСРР превышало еУРР в два и три раза, соответственно. (Б, Г) Графики рассеяния значений отношения еСРР/еУРР флуоресцентных излучений, полученные из данных, приведенных на рисунках А и В, и представленные как функции относительного уровня экспрессии еСРР к еУРР.

2a:lß:ly субъединиц, получила наибольшее распространение (15-17). Описана также ноиамерная организация канала с 3a:3ß:3y субъединицами (18-20). Для определения стехиометрии канала мы использовали несколько современных биофизических подходов, включая электрофизиологические измерения и анализ соотношений флуоресцентной интенсивности (FIR) в комбинации с TIRF микроскопией (21).

Соотношение a:ß. ß:y и а:у субъединиц ENaC. определенное с помощью FIR/TIRF анализа, составляет 1:1. Для флуоресцентной микроскопии мы использовали флуоресцентные маркеры, прикрепленные ко всем трем субъединицам. Ранее нами были созданы CFP- и YPF-меченые конструкты всех трех субъединиц. После встраивания CFP- и YPF-меток все субъединицы продолжают оставаться функциональными и формируют активный канал. Так как eCFP и eYFP генетически привязаны к субъединицам канала, излучения от соответствующих флуорофоров прямо пропорциональны количеству eCFP- и eYFP-меченых субъединиц ENaC в мембране. На рис. 2 показаны графики рассеяния и построенные по ним линии регрессии (показаны красным цветом) Feefp относительно FcYh>, измеренные в клетках, экспрессированных eCFP-a + eYFP-ß + yENaC (рис. 2А) и eYFP-a + eCFP-ß + yENaC (рис. 2B). Предсказанные относительные (a-ENaC к ß-ENaC) FIR значения стехиометрии были подсчитаны и показаны как прерывистые черные линии. Для каждой пары меченых субъединиц ENaC мы определили уровень экспрессии eCFP-меченых субъединиц и, таким образом, экспрессировали равное количество eCFP-меченых субъединиц, а также в два или в три раза большее количество eYFP-меченых субъединиц. Кружки на графике показывают результаты отдельных экспериментов, для клеток, трансфецированных с равным количеством eCFP- и eYFP-меченых субъединиц (показаны красным цветом), с двухкратным (показаны голубым), и трехкратным (показаны зеленым) превышением eCFP кДНК. На рис. 2 Б и Г приведены отношения флуоресцентных интенсивностей сигнала для eCFP-a + eYFP-ß + yENaC и их комплементарной пары, соответственно, как функция от титрации eCFP-меченых субъединиц. к\ и кг для данных экспериментальных условий были равны 1.19 (г2 = 0.75) и 0.84 (г2 = 0.68), соответственно. На основании этих коэффициентов подсчитано

экспериментальное соотношение a-ENaC к |3-ENaC, которое было равно 1.19. Таким образом мы показали, что ENaC, локализованный на плазматической мембране клеток, состоит из равного количества а- и р-субъединиц.

Подобные эксперименты с титрацией ENaC субъединиц и FIR/TIRF анализом были проведены с двумя оставшимися комбинациями, когда мы последовательно трансфецировали клетки с различными соотношениями eCFP и eYFP-меченых р~ и y-, а также а- и у-субъединиц ENaC. Соответствующие немеченные субъединицы были добавлены во всех экспериментах. Для |3- и у-субъединиц ENaC к\ и ki были 0.98 (г2 = 0.86) и 1.02 (г' = 0.88), соответственно. Соотношение Р- относительно y-ENaC при данных коэффициентах равняется 0.98. Для а- и y-ENaC субъединиц, /с, и к2 были 1.02 (г2 = 0.81) и 0.96(г2 = 0.86), соответственно. Соотношение а- относительно y-ENaC равняется 1.03. Таким образом, можно предположить, что в плазматической мембране равное количество Р и у, а также а и у субъединиц ENaC.

Электрофизиологический анализ стехиометрии ENaC подтверждает, что функциональный канал состоит из равного количества субъединиц. Для того, чтобы исследовать соотношение субъединиц и, таким образом, стехиометрию

д с функционального ENaC,

' р 2601 *

мы использовали метод пэтч-кламп. Для

0.6а:0.2р:0.2у

? 200

о 150 л

g 100 X

g 50

а-ENaC (5-ENaC y-ENaC

шж

_L.

0.6 0.6 0.6

0.2

0.2 0.2

0.6 0.2 0.2 0.6 0.2 0.6

cDNA (мкг/35 мм2)

Рис. 3. Относительная стехиометрия Е№аС 1 а: 1 р: 1у.

(А) Примеры записей токов при подаче тестирующих импульсов потенциала от +60 до -100 мВ (при поддерживаемом потенциале 40 мВ) в клетках СНО, экспрессирующих 0.6, 0.2 и 0.2 мкг и 0.6, 0.6 и 0.6 мкг а-, Р- и у-субъединиц Е№С до и после добавления 10 мкг амилорида (показано стрелками). (Б) Плотность амилорид-чувствительных токов, измеренная при -80 мВ в клетках СНО, трансфецированных с указанным количеством а-, р- и у-ЕЫаС кДНК. * - достоверные изменения относительно других групп.

решения поставленной задачи нами были проведены электрофизиологические

эксперименты в

которых использовали различное количество а, Р- и у-субъединиц ЕЫаС. Количество кДНК для субъединиц Е№С было либо одинаковым (0.6 или 0.2

мкг субъединиц на 35 мм2 чашку), либо а- или и у-субъединицы ENaC были экспрессированы при больших концентрациях. Наша гипотеза заключалась в том, что если функциональный канал содержит одинаковое количество субъединиц, и при этом формируются в основном гетеромерные каналы, то увеличение экспрессии одной субъединицы по сравнению с другими, должно либо не иметь, либо иметь небольшое влияние на активность канала. Однако, если канал содержит больше а-субъединиц, как было предложено ранее для модели с тетрамерной организацией, то увеличение экспрессии одной этой субъединицы по отношению к другим двум должно быть равносильно простому увеличению экспрессии всех трех субъединиц. Данные приведенные на рис. 3 демонстрируют, что только эквивалентное увеличение кДНК для всех трёх субъединиц приводит к увеличению активности канала.

Таким образом, мы впервые показали, что ENaC состоит из равного количества субъединиц и опровегли устоявшиеся представления о структуре канала. Недавно, с помощью кристаллографии, которая на данный момент является наиболее точным методом, позволяющим определять вторичные и третичные структуры мембранных белков, была показана структура куриного ASICla, который относится к тому же семейству, что и ENaC, и обладает гомологией со всеми тремя субъединицами ENaC (22). Авторы показали, что ASICla состоит из трех субъединиц. Так как для формирования функционального ENaC требуются все три субъединицы, то, по всей видимости, правильной стехиометрией канала является 1а: 1(3:1 у.

Моделирование структуры ENaC на основе cASICl. Хотя ENaC и ASIC имеют меньше чем 20 % идентичности на аминокислотном уровне, мы обнаружили, что структура кристалла cASICl хорошо подходит для анализа структуры ENaC. Гетеротримерный ENaC и мономерные субъединицы ENaC в составе тримера, по всей видимости, содержат большую часть основных первичных, вторичных, третичных и четвертичных структурных особенностей идентифицированных в ASIC, за исключением небольших различий, которые могут иметь значительные влияния на функционирование канала. Эти различия, по всей видимости, являются ключевыми и приводят к тому, что ENaC

Рис. 4. Предполагаемая структура олигомеризованного ENaC человека. Вид

предсказанной нами гетеротримерной структуры ENaC человека перпендикулярно (А, В) и параллельно (Б, Г; с внеклеточной стороны) молекулярной оси, смоделированный на основе куриного ASIC 1а гомотримера (используя 2QTS структурные координаты). Отдельно представлен увеличенный рисунок, показывающий открывание (вид канала сверху) специального туннеля, который приводит через всю длину внеклеточного региона ENaC к поре канала. Широта тунеля варьирует от 4А до 14А при полном открытии, становится не чувствительным к рН, постоянно активным и не зависящим от

временной или каких-либо иных лиганд-зависимых инактиваций.

Структурные координаты (2QTS) для cASICl, размещенные в банке

данных для белков (22), были использованы для того, чтобы описать

гомологичную модель для ENaC. Для упрощения моделирования структуры

ENaC на основе cASICl, области с ограниченной аминокислотной

однородностью, например регион, непосредственно следующий за ТМ1, были

удалены. Небольшое количество дополнительных или отсутствующих остатков

были подкорректированы, чтобы более четко соответствовать сА81С1 последовательности. Для выравнивания и соответствующей подгонки а-, Р- и у-субъединиц Е№С относительно тримерной структуры сАБГС канала было использовано программное обеспечение ОеерУюш/Бипзз-РсИМешег у3.7.

На рис. 4 показаны а-, (3- и у-субъединицы Е№С человека (красные, желтые и голубые цвета), смоделированные на базе олигомеризованного сА81С1. Оба канала, по всей видимости, состоят из трех субъединиц, что согласуется с нашими данными, показывающими, что олигомеризованный ЕЫаС состоит из равного количества субъединиц и относительной стехиометрией 1<х:1|3:1у.

Регуляция Е№С малым С-белком К-Г<а*. Ранее было показано, что в эпителии почечных канальцев шпорцевой лягушки минералокортикоид альдостерон увеличивает экспрессию и повышает уровень активности малого С-белка К-ЯаБ (23,24). Для того чтобы исследовать влияние К-Г^аБ и других малых в-белков на активность ЕЫаС, мы реконструировали канал в клетках СНО в отсутствие или в присутствии различных малых в-белков.

К-Яаэ увеличивает активность канала, не оказывая влияния на ёмкость клеток. На рис. 5 показаны примеры

записей тока (А) и средние значения

плотности амилорид-чувствительного тока в клетках,

трансфецированных только с ЕКаС или одновременно экспрессирующих Е№С и К-Иав дикого типа, постоянно активный (С12У) или доминантно негативный (Б 1 Ж)

ЕНаС К-ИаБ К-Нав^К-Ваз™

ЕМаС К-Ка8 К-Рав6™ К-Раз™

Рис. 5. К-Яа« активирует £N80. (А) Примеры записей токов в клетках СНО, трансфецированных всеми тремя субъединицами ЕЫаС в отсутствие и в присутствии совместно экспрессированного К-Яая(Б) Активность Е№С в клетках, экспрессирующих только Е№С или ЕЫаС в сочетании с К-Яаэ дикого типа, постоянно активного (С12У) и доминантно негативного (Б 1714) мутантов. (В) Значения емкостных сопротивлений.

100 мс

+ вортманнин

амил

Рис. 6. К-Иав активирует Е^С через Р13-киназу. (А) Типичные примеры записей токов в клетках СНО, трансфецированных ЕИаС и постоянно активным К-Яав, не обработанных и выдержанных в растворе с вортманнином (200 нМ). (Б) Активность Е№С в клетках, экспрессирующих только ЕЫаС или ЕЫаС в сочетании с К-Яаз. Показана также активность Е№С + К-Яая при обработке различными блокаторами.

мутанты (Б). Постоянно активный K-Ras и малый G-белок дикого типа значительно увеличивают активность канала. Экспрессия K-Ras, как показано на рис. 5В, не влияла на ёмкость клеток.

K-Ras активирует ENaC через Р13-киназу. Ранее было показано, что Raf, RalGDS и РТЗ-киназа являются наиболее вероятными первичными эффекторами белков Ras, инициирующими МАРК 1/2, Ral/Rac/Rho/Rho-киназный и PI3-киназный сигнальные каскады, соответственно (8). Для исследования сигнальных механизмов активации ENaC мы использовали блокаторы различных потенциальных эффекторов малого G-белка K-Ras. На рис. 6 приведены примеры записей токов и суммарные данные, полученные при использовании различных блокаторов. Предварительная обработка клеток СНО, трансфецированных ENaC и K-Ras, блокаторами МАРК (10 мкМ PD98059, 1-2 ч; 500 нМ U0126, 1-3 ч), Ral/Rac/Rho/Rho-киназы (500 нМ Y27632, 30-60 мин; 15 мкг/мл СЗ-экзоэнзима, включенного в пипеточный раствор) не влияла на уровень активности канала. Обработка клеток вортманнином (200 нМ), который при данной концентрации является селективным ингибитором Р13-киназы, вызывала значительное уменьшение активности ENaC.

Данные, показанные на рис. 7, также подтверждают наше предположение о том, что Р13-киназа вовлечена в активацию ENaC малым G-белком K-Ras и что в данном сигнальном каскаде эта киназа находится между малым G-белком и

Рис. 7. Постоянно активный мутант К-Яав (С12:С40), работающий исключительно через Р13-киназу, активирует ГЛаС. (А) Записи токов в клетках СНО, трансфецированных а-, (5- и -у-ЕЫаС и различными постоянно активными мутантами К-Каэ, осуществляющими запуск специфических сигнальных каскадов. Показана также запись тока в клетках, трансфецированных Е№С и мутантом в12:С40 К-ЛаБ, обработанных блокатором Р13-киназы вортманнином. (Б) Графики для плотностей амилорид-чувствительных токов в клетках, трансфецированных отдельно ЕЫаС, или вместе с постоянно активным К-Лая (012У) или различными мутантами. (В) Графики для опытов с мутантом 012У:С40 до и после обработки вортманнином.

каналом. Нами были протестированы эффектор-специфические мутанты К-Лав (25), которые способны взаимодействовать исключительно с единственным первичным эффектором К-Лав и, таким образом, инициировать запуск только одного сигнального механизма. Специфический мутант К-Яав 012:Е38 активирует только с-ЯаГ киназу и, таким образом, запускает МАРК сигнальный механизм. Мутант 012:037 активирует ЯаЮБЗ и запускает Ка1/Яас/КЬо сигнальный каскад. Мутант 02:040, в свою очередь, вовлечен только в Р13-киназпый сигнальный путь. Как видно из рис. 7, только мутант 012:С40 активировал Е№С. Кроме того, эффект, вызванный одновременной экспрессией канала и мутанта 012:С40 блокировался при обработке клеток вортманнином.

Регуляция Е№С Р13-киназой в нативных клетках. Как показано в наших экспериментах в гетерологичной экспрессионной системе, существует прямая пространственно-временная связь между К-Яав, Р13-киназой и фосфолипидным продуктом этой киназы. Р1(3,4,5)Рз, по всей видимости, непосредственно связывается с каналом и увеличивает вероятность открытого состояния Е№С.

Для проверки этого предположения, влияние ингибирования Р13-киназы на нативный ЕЫаС было протестировано в клетках из постоянных клеточных линий и в свежевыделенных клетках собирательных канальцев кортекса ночки крысы. Первоначально использовали мышиные поляризованные дифференцированные клетки тркССВс|4, в которых ЕЫаС обуславливает реабсорбцию №+.

При ингибировапии Р13-киназы с помощью ЬУ294002 (50 мкМ) мы наблюдали значительное уменьшение Р1(3,4,5)Р3 в апикальной мембране. Типичные фотографии флуоресцентных излучений от вЕР-АИРН Р1(3,4,5)Р3 в апикальной плазматической мембране клетки тркССВс|4 до (1) и после 5 (2) или 15 (3) мин обработки с ЬУ294002 показаны на рис. 8А. Излучения были получены с помощью ТШТ, что позволило нам регистрировать сигналы только с апикальной плазматической мембраны. Таким образом, эти значения отражают

1 2 з ;

(нщШШН*

¿> Контроль ■ 1_У303511 • 1>У294002

8 10 12 14

Время, мин

1.21 1.01 0.80.60.40.2-о.о-

■ Контроль • 1_У294002

1 2 3 Время, ч

Рис. 8. Изменения №+-трансиорта и активности параллельны изменениям уровня Р1(3,4,5)Рз в апикальной плазматической мембране клеток шркССЭсы.

(Л) Фотографии показывающие флуоресцентные излучения от йРР-А^РН Р1(3,4,5)Рз в апикальной плазматической мембране клетки тркССБси, находящейся в пределах конфлюэнтного монослоя до (1) и после 5 (2) или 15 (3) мин обработки ЬУ294002 (50 мкМ). Данные значения отражают уровень Р1(3,4,5)Рз в апикальной мембране. (Б) Уменьшения относительного уровня Р1(3,4,5)Рз в апикальной плазматической мембране клеток шркССОС|4 при обработке ЬУ294002 (•). Показаны также значения при использовании неактивного аналога ЬУ303511 (■) и негативный контроль, в котором исследовали влияние ЬУ294002 на уровень РГ(4,5)Рг в таких же условиях (А). (В) Изменения во времени относительного Ыа+-транспорта в ответ на ингибирование Р13-киназы с помощью ЬУ294002.

уровень Р1(3,4,5)Рз в апикальной мембране. На рис. 8Б показаны средние значения относительного уровня Р1(3,4,5)Рз в апикальной плазматической мембране клеток mpkCCDci4 при обработке LY294002 (п=9). Значения откорректированы на незначительное уменьшение интенсивности свечения, вызванное выжиганием люминофора. На рис. 8В показаны результаты экспериментов, в которых измеряли трансэпителиальный ток через монослой клеток mpkCCDCi4, выращенных на проницаемых подложках. Относительная реабсорбция натрия значительно уменьшилась (приблизительно на 60 %) в течение 15 мин после добавления LY294002 (50 мкМ) и достигла максимального уменьшения (~ 80 %) к 45 мин. В конце эксперимента к апикальной стороне был добавлен амилорид (10 мкМ) для того,чтобы убедиться в том, что ионный ток через монослой опосредован ENaC. Через 1-2 мин после добавления амилорида ток полностью ингибировался (не показано на рисунке). Таким образом, уменьшение натриевого транспорта через монослой клеток mpkCCDci4, вызванное блокированием Р13-киназы, происходит параллельно снижению уровня Р1(3,4,5)Р3 в апикальной мембране.

Для того, чтобы провести эксперименты на нативных клетках, мы изолировали собирательные трубочки почки крысы. После изолирования трубочки вскрывали с помощью микропипеток и, таким образом, имели доступ к апикальной плазматической мембране. Для регистрирации изменений в активности канала в реальном времени использовали метод пэтч-кламп. В условиях отведения токов от фрагмента плазматической мембраны неповрежденной клетки (конфигурация cell-attached) зарегистрировали активность ионных каналов в нормальных условиях при различных уровнях поддерживаемого потенциала в диапазоне от 0 до -60 мВ. Собирательные трубочки были изолированы из почек крыс, которые находились в течение семи суток на диете с низкой концентрацией натрия (0.01 %). Нами также были проведены опыты, в которых трубочки были изолированы из почек крыс, которые содержались на нормальной диете (0.32 % натрия). Вероятность открытого состояния (Р0) в данной группе была значительно ниже. Кроме того, мы наблюдали меньшее количество активных каналов в экспериментах, сделанных на апикальной плазматической мембране в клетках, выделенных из

контроль р 0.6

+ вортманнин

с"—у^Д^Г^ о.о

контроль 2 сек ^ 0.6 Ро0.4

+ LY294002 0.2

контроль

р 0.6 1 о

0.4

+ LY303511 02

0.0

контроль + вортм

контроль + LY

контроль + ¡LY

Рис. 9. Вероятность открытого состояния ENaC в апикальной мембране вскрытых изолированных собирательных канальцев кортекса крысы зависит от Р13-киназы. Записи токов в конфигурации cell-attached в контрольных условиях и после добавления LY294002 (А), вортманнина (Б) и LY303511 (В). Графики изменения вероятности открытого состояния и средние значения указаны справа от каждой группы экспериментов. Поддерживаемый на мембране потенциал ^40 мВ.

крыс содержащихся на нормальной диете. При использовании крыс, содержащихся на недостаточной по Na+ диете, количество активных каналов и Р0 значительно возрастало.

На рис. 9 показаны типичные записи токов и графики уменьшения вероятности нахождения канала в открытом состоянии в нативных собирательных канальцах кортекса почек крыс до и после (5-10 мин) добавления 0.2 мкМ вортманнина, 50 мкМ LY294002 и 50 мкМ LY303511. Токи зарегистрированы с использованием конфигурации cell-attached в апикальной мембране клеток, изолированных из почек крыс, содержащихся на низкой натриевой диете. В этих экспериментах поддерживался мембранный потенциал -40 мВ и Р0 каналов регистрировали в течение всего эксперимента. Как видно из записей токов и средних значений Р0, ингибирование РГЗ-киназы двумя химически разнородными блокаторами, вортманниаом и LY294002, уменьшало значения Р0 нативного ENaC. Напротив, неактивный аналог LY294002,

LY303511, давал незначительный эффект в этих условиях. Сходные результаты были получены в клетках mpkCCDCi4. Полученные результаты демонстрируют, что ингибирование Р13-киназы в нативных клетках приводит к уменьшению Р0 активных каналов в апикальной мембране. Таким образом, исследование механизма регуляции ENaC Р13-киназой и Р1(3,4,5)Рз продемонстрировало, что изменения вероятности открытого состояния опосредуют данное взаимодействие. Кроме того, нами показано, что этот сигнальный механизм играет значительную роль в регуляции канала в нативных клетках.

Регуляция ENaC малыми G-белками семейства Rho. Малые G-белки, входящие в семейство Rho, регулируют различные клеточные процессы, включая организацию цитоскелета, дифференцировку и пролиферацию клеток, а также участие в разнообразных сигнальных механизмах в дифференцированных клетках. Недавно было также показано, что малые G-белки, входящие в семейство Rho, модулируют активность нескольких классов ионных каналов.

RhoA увеличивает активность ENaC. Первоначально нами была поставлена задача определить роль RhoA в регуляции эндогенного ENaC в поляризованных эпителиальных клетках. Для экспериментов мы использовали эпителиальные клетки амфибий А6. Ранее было показано, что Na+ ток через монослой клеток А6 в основном определяется активностью ENaC. Для исследования роли RhoA в этих клетках мы использовали проницаемый через клеточную мембрану химерный энзим СЗ (C2IN-C3), прикрепленный к токсину С2 из С. botulinum, который помогает энзиму проникать через плазматическую мембрану (26). Блокирование эндогенного RhoA в клетках А6 значительно уменьшает реабсорбцию Na+.

Как видно на примере исследования механизмов регуляции ENaC малым G-белком K-Ras, нами налажены и успешно используются электрофизиологические измерения активности канала, экспрессированного в клетки СНО в присутствии других белков. Для исследования регуляции ENaC белками, входящими в семейство Rho, мы продолжили использовать эту методику. На рис. 10 показаны примеры записей тока и средние значения плотности амилорид-чувствительного тока в клетках СНО, трансфецированных только с ENaC или одновременно экспрессирующих ENaC и RhoA дикого типа,

постоянно активный (вМУ) или доминантно негативный (Т19ТЧ) мутанты. Для оценки активности каналов регистрировали макроскопические токи, вызываемые короткими (500 мс) тестирующими импульсами потенциала от поддерживаемого потенциала в 30 мВ до 100 мВ в сторону положительных потенциалов и до -120 мВ — в сторону отрицательных, с шагом в 20 мВ. Активность Е№С измеряли как

отношение величины амилорид-чувствительного интегрального тока при -80 мВ к ёмкости клетки (плотность тока). Постоянно активный Ш1оАс|4у и малый й-белок дикого типа значительно увеличивают активность канала. Доминантно негативный мутант ШюАт19Ы, в свою очередь, значительно уменьшал амилорид-чувствительный ток через Е№С. Нами были также протестированы эффекты двух других белков, входящих в семейство Што. Дикий тип и постоянно активный (ОЦ Яас1, также как и ШюА, значительно увеличивает активность ЕИаС, когда совместно экспрессирован в клетках СНО. Однако ни дикий тип Сс1с42, ни постоянно активный мутант (012У) не оказывали влияния на активность канала. Таким образом, эффект малых О-белков в семействе Юю является специфическим.

ШтоА_активирует_Е№С

последовательно через Шю-киназу и Р1(4)Р 5-киназу. Для тестирования возможных сигнальных путей,

А.

ИЕ№С

+ ЯИоА

+ РИоА С14У

+ ^оА Т19И

200 мс 2 нА

Б.

_ 800 Л ©

В боон

го о

л 400-

о 200

■И

ИИ

I |

п=12

ЬЕ№С +G14V+T19N

Рис. 10. RhoA активирует £N80. (А)

Типичные записи макроскопических токов в клетках СНО до и после подачи амилорида. (Б) Плотность амилорид-чувствительных токов при -80 мВ в клетках СНО, экспрессирующих либо только ЕЫаС, либо ЕИаС совместно с ШтоА дикого типа или

соответствующим мутантом.

Рис. 11. Влияние экспрессии К11 о- или Р1(4)Р 5-киназ на акгивность Е№С.

Плотность амилорид-

чувствительного тока, измеренная в клетках СНО отдельно для Е№С и для ЕЫаС, экспрессированного в сочетании с постоянно активным (С14У) или доминантно негативным (Т19М) ИюА и их эффекторами в различных комбинациях.

<: о

го о

600-

450-

300

С 150-

IV У

Ш1

п=12

п—12

п 15

о *

а.

г * § 2

а 5оро л р Л а ю

а « а. * 9=.

о а ?? ¿а

участвующих в активации ЕИаС малым й-белком ЮюА, были проведены серии экспериментов с использованием ингибиторов МАРК, Р13-киназы и Шю-киназы. Только блокатор Шю-киназы (У27632; 1 мкМ) значительно уменьшил влияние ШюА на активность Е№С. Предварительная обработка клеток СНО, трансфецированных ЕИаС и ШюА, блокаторами МАРК РЭ98059 (10 мкМ) или Р13-киназы (ЬУ294002, 50 мкМ; вортманнин, 200 нМ) не влияла на увеличение уровня активности ЕИаС, вызванного ШюА.

Одновременная экспрессия Е№С и постоянно активной Шю-киназы также приводит к значительной активации ЕИаС (рис. И). Доминантно негативная Шю-киназа (Шю-К БЫ) не оказывает влияния на активность ЕЫаС. Эксперименты с одновременной экспрессией Е№С и постоянно активными (014У) или доминантно негативными (Т19М) мутантами ШюА совместно с Шю-К БЫ и Шю-К СА указывают на то, что ШюА является эффектором Шю-киназы и что рию-киназа требуется для активации ЕИаС малым О-белком ШюА. Из литературных данных известно, что Шю-белки и Шю-киназа являются активаторами Р1(4)Р 5-киназы, которая необходима для синтеза Р1(4,5)Р2. Поэтому наряду с Шю-киназой мы протестировали Р1(4)Р 5-киназу. Р1(4)Р 5-киназа также значительно активировала Е№С (рис. 11). Сходные эксперименты были проведены с одновременной экспрессией канала в присутствии Р1(4)Р 5-киназы и доминантно негативных ШюА и Шю-киназы. Таким образом, ШюА, по

а, Р .

1 ENaC ENaC ENaC

контр ENaC +RhoA +T19N +G14V

|160 i 105 75

MOMO

1 30

CD Q. ID 2 Ф 2

n*7

м o *

ЕЫаС Е№С Е№С Е№С +1=!11оА +Т19Ы в14У

всей видимости, активирует Е№С последовательно через Шю- и Р1(4)Р 5-киназы. ШюА увеличивает количество ЕЫаС

Рис. 12. ШюА увеличивает уровень ENaC па

плазматической мембране.

(А) Иммуноблоттинг фракции плазматической мембраны (М) и общего клеточного лизата (О) клеток СНО, экспрессирующих ОРР

(контр) и тус-меченые субъединицы ЕЫаС отдельно или в присутствии Я1юА дикого типа, или доминантно негативного (Т19М), или постоянно активного (вИУ) мутантов. (Б) Выраженная в процентах доля мембранной фракции относительно

общего клеточного лизата для клеток СНО,

экспрессирующих Е№С отдельно и с ШюА дикого типа или мутантами.

в плазматической мембране.

Следующая серия экспериментов была посвящена выяснению механизмов действия ШтоА на Е№С. На рис. 12А представлены данные типичного эксперимента, показывающие распределение Е№С в мембранной фракции относительно количества Е№С в общем клеточном лизате в клетках, трансфецированных только ОБР (контроль), а также в клетках, экспрессирующих ЕЫаС (ЕЫаС) и Е№С совместно с ШюА дикого типа (+ШюА) или доминантно негативным (+Т19ТЧ) или постоянно активным (+014У) мутантами. Выявление ЕЫаС производили моноклональными анти-тус антителами. Как показано на рис. 12Б, одновременная экспрессия канала с ШюА дикого типа или постоянно активным мутантном привела к значительному увеличению уровня Е№С в плазматической мембране. В том случае, когда мы использовали К-Яаэ вместо ШюА, увеличения мембранной фракции канала не наблюдали. Полученные данные позволяют предположить, что ШюА увеличивает активность Е№С за счет увеличения количества функционально активных каналов в плазматической мембране.

Увеличение количества каналов на плазматической мембране может быть как результатом увеличения транслокации каналов к мембране, так и снижением

А. Б. Ф ENaC + RhoAG14v

■ ENaC

контроль отмывка Y27632 О eCFP-m + RhoAs"v

О 10 20 30 40

Воемя (мин)

Рис 13. Активация Rho сигнального пути приводит к быстрому увеличению транслокации и встраивания ENaC в плазматическую мембрану. (А)

Микрофотографии клеток Cos-7, трансфецированных RhoA и либо eYFP-ENaC, либо мембранным маркером eCFP-m. Показана флуоресценция YFP (514 нм; верхние фотографии) и CFP (442 нм; нижние фотографии) на плазматической мембране до и после отмывки блокатора Rho-киназы Y-27632 (1 мкМ). Для регистрации сигнала с плазматической мембраны использовали TIRF. (Б) Графики, иллюстрирующие изменение во времени интенсивности флуоресценции для клеток Cos-7, трансфецированных либо отдельно YFP-ENaC, либо с постоянно активным RhoA. Показаны также значения для eCFP как в присутствии, так и в отсутствие RhoA.

скорости интернализации ЕЫаС с плазматической мембраны, опосредованной эндоцитозом (27,28). Первоначально были проведены исследования некоторых белков, вовлеченных в эндоцитоз. Были протестированы влияния эпсина, доминантно негативного динамика (К44А) и Ые(М4-2 на активность ЕЫаС, экспрессированного в клетки СНО. Эпсин и ЫесЫ4-2 значительно уменьшают активность ЕИаС посредством эндоцитоза. В отличие от эпсина и №ск14-2, доминантно негативный динамин значительно увеличивает активность канала. При одновременной экспрессии RhoA и доминантно негативного динамина (К44А) мы наблюдали совокупный эффект. Плотность амилорид-чувствительного тока в клетках, экспрессирующих одновременно Е№С, ЮюА и К44А, была значительно выше, чем при экспрессии Е№С отдельно с ЯЬоА или К44А. Таким образом, мы можем предположить, что ЯЬоА увеличивает активность ЕЫаС через механизм, не зависящий от динамина, возможно посредством ускорения трафика к плазматической мембране.

Активация ШюА способствует быстрой транслокации и встраиванию ЕИаС в плазматическую мембрану. Для того чтобы оценить процесс

транслокации ENaC на плазматическую мембрану клеток в реальном времени, использовали TIRF микроскопию. Для экспериментов по изучению транслокации субъединиц ENaC на мембрану, клетки Cos-7 были трансфецированы YFP-связанными субъединицами ENaC и мембранным маркером CFP-m в в отсутствие или присутствии постоянно активного RhoA. Клетки были предварительно обработаны в течение 30-40 мин ингибитором Rho-киназы Y27632 (1 мкМ), который в данной концентрации блокирует активацию ENaC малым G-белком RhoA. Транслокацию и встраивание ENaC в плазматическую мембрану регистрировали с момента начала отмывки блокатора. На рис. 13А приведены изображения клеток Cos-7, трансфецированных YFP-мечеными субъединицами ENaC и мембранным маркером CFP-m в присутствии RhoAGI4V. На фотографиях показана флуоресценция сигнала YFP и CFP, зарегистрированная на плазматической мембране клетки Cos-7 до и после активации Rho-зависимого сигнального механизма, вызванного отмывкой Y27632. На рис. 13Б приведены графики, суммирующие изменение во времени относительной интенсивности флуоресценции для клеток Cos-7, трансфецированных либо отдельно YFP-субъединицами ENaC, либо в сочетании с постоянно активным RhoA в течение 40 мин после отмывки Y27632. Показаны также контрольные значения для мембранного маркера CFP-m в отсутствие или в присутствии постоянно активного RhoA. Таким образом, активация Rho-каскада значительно ускоряет транслокацию и встраивание ENaC в плазматическую мембрану клеток (рис. 13). Брефельдин А, который является ингибитором трафика белков, устраняет транслокацию ENaC к плазматической мембране в ответ на активацию Rho каскада, вызванного отмывкой Y27632.

Для того, чтобы непосредственно исследовать эффект RhoA в живых клетках, мы использовали комбинацию TIRF и FRAP. FRAP применяется для исследования подвижности биоорганических молекул посредством инициации фотохимического разложения флуорохрома в зоне облучения и последующего его рассоединения с молекулами. После выжигания молекулы с флуорохромом из необлученной зоны движутся вследствие диффузии в облученную зону образца. По времени нарастания в ней флуоресценции можно судить о

еУРР-М

еУРР-Е№С

10 сек 1 мин 2 мин 5 мин 30 мин

еУРР-Е№С

подвижности молекул. Так как этот метод впервые применялся для анализа интегральных мембранных белков, нами были проведены несколько серий контрольных экспериментов.

Если предположить, что мембранный маркер еУРР-М имеет равномерное распределение и свободно перемещается, тогда восстановление репортера после выжигания с иллюминацией Т1ЯР должно в основном отражать латеральную диффузию не выжженных маркеров от регионов, расположенных рядом с плазматической мембраной. Напротив, если движение субъединиц Е1ЧаС ограничено, тогда восстановление свечения флуорофора в области плазматической мембраны должно отражать передвижение и встраивание канала в плазматическую мембрану. На рис. 14А показаны флуоресцентные

еУРР-М

10 сек после

30 мин после

Рис. 14. Измерение трафика Е^С к плазматической мембране с помощью ПЯР/гаАР микроскопии. (А) Флуоресцентные микрофотографии клеток Соэ-7, экспрессирующих мембранный маркер еУРР-М и еУБР-меченые субъединицы Е№С до выжигания УРР с помощью ТИЦ7 иллюминации, 10 с и 30 мин после выжигания. Шкала - 8 мкМ. (Б) Флуоресцентные излучения через участки клеток (показаны пунктирными линиями на рисунке А) до выжигания и через 10 с, 1, 2, 5 и 30 мин после выжигания.

ENaC + RhoA

Рис. 15. RhoA усиливает движение ENaC к плазматической мембране. (А)

Средние значения изменения во времени восстановления после выжигания в клетках, экспрессирующих только eYFP-ENaC и eYFP-ENaC совместно с постоянно активным RhoA. Излучения были зарегистрированы с помощью TIRF. (Б) Средние значения восстановления через 30 мин после выжигания для ENaC и ENaC + RhoA.(B) Средние значения времени необходимого для увеличения флуоресценции в клетках, экспрессированных ENaC отдельно и в присутствии RhoA.

фотографии клеток Cos-7, экспрессирующих мембранный маркер eYFP-M или YFP-меченые субъединицы ENaC. Наблюдения велись с помощью метода TIRF. Изображения получены непосредственно до выжигания с иллюминацией TIRF и спустя 10 с или 30 мин после него. Восстановление свечения после выжигания присутствует в обоих случаях. Однако, в случае с мембранным маркером сначала происходит восстановление по краям клетки. В отличие от eYFP-M, ENaC равномерно распределяется по всей клетке. Разница в распределении eYFP-M и ENaC более четко прослеживается на рис. 14Б, на котором показаны относительные значения флуоресцентной интенсивности сигнала через определенные участки клеток (показаны пунктирными линиями на рис. 14А). Таким образом, как видно из данных экспериментов, восстановление свечения мембранного маркера после выжигания вызвано его латеральной диффузией, а ENaC - встраиванием новых каналов.

Для исследования механизма действия RhoA на канал клетки Cos-7 были экспрессированы только с субъединицами ENaC или совместно с постоянно активным RhoAGI4V. На рис. 15А показаны средние значения изменения во времени восстановления свечения после выжигания в клетках, экспрессирующих только eYFP-ENaC, или eYFP-ENaC совместно с RhoAG14V. Значения интенсивности флуоресценции были нормированы по отношению к

А.

eYFP-ENaC + RhoA

Б.

0.8-,

0.6-

eYFP-ENaC

10 15 20 25 30 Время, мин

о х н О

0.4

0.2

п = 19

п = 13

В.

ENaC + RhoA

2.5-

I 2.0-f

™ 1.51.0

интенсивностям излучения до выжигания. На рис. 15Б и В показаны средние значения восстановления свечения после выжигания для ЕЫаС и ЕЫаС + ШюА (через 30 мин) и времени необходимого для увеличения флуоресценции в клетках, экспрессированных ЕЫаС отдельно и в присутствии ЯЬоА. Как видно из рисунка, восстановление Е№С в присутствии 11ЬоАс14У было значительно больше и быстрее, чем в отсутствие малого в-белка.

ШтоА и К-Яаэ независимо влияют на активность ЕЫаС. действуя через параллельные сигнальные пути. На рис. 16 показаны типичные записи интегральных токов до и после добавления амилорида в клетках СНО, трансфецированных а-, (3- и у-ЕЫаС отдельно или в присутствии постоянно активных ЮюА0ИУ или К-К.ав0124' по отдельности или вместе. Для этих экспериментов плазмиды, кодирующие малые в-белки, были трансфецированы насыщающими количествами (1 мкг) ДНК (рис. 16 Г и Д). На рис. 16Б показано как оба малых в-белка значительно увеличивали активность Е№С. Кроме того,

К-Нав

Конт ЯЬоА КГюА

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 К-Каг0™|мкг)

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 РШоА5"™(мкг)

Рис. 16. ИЬоА и К-кав независимо влияют на активность Е^С. (А) Типичные записи макроскопических токов до и после амилорида в клетках СНО, трансфецированных а-, (5- и у-ЕЫаС отдельно или в присутствии постоянно активных Я11оАЬ|4У или К-Казс|2У (1 мкг кДНК) по отдельности или вместе. (Б) Плотность амилорид-чувствительных токов в клетках, трансфецированных только ЕЫаС или совместно с малыми О-белками. (В) Вестерн-блоты, содержащие лизаты контрольных клеток и клеток, трансфецированных НА-мечеными К-Ка5С,'"У и шус-мечеными ШюА0'^' отдельно или вместе. (Г) Средние значения плотности амилорид-чувствительного тока в клетках СНО, трансфецированных ЕЫаС и различным количеством К-11аз012у и ЯЬоАг,|4у кДНК. (Д) Соответствующие Вестерн-блоты клеток, трансфецированных различными количествами НА-меченых К-Яаз012У и шус-меченых ЯЬоА01^.

Рис. 17. Rabila и Rab3a увеличивают активность ENaC. (А) Примеры записей токов в клетках, экспрессирующих а-, (5- и y-ENaC отдельно и совместно с Rabí la. (В) Плотность амилорид-чувствительных токов в клетках, трансфецированных ENaC отдельно и совместно с соответствующими малыми G-белками.

когда ЯЬоА и К-Кав были экспрессированы вместе, наблюдался кумулятивный эффект. На рис. 16В показаны типичные Вестерн-блоты демонстрирующие уровень экспрессии экзогенного К-11а8012У и ЯЬоАСИУ. Таким образом, ЯЬоА и К-ЯаБ независимо влияют на активность Е№С, действуя через параллельные сигнальные пути.

Регуляция Е№С малыми С-белками семейства КаЬ. Наши недавние исследования показали, что различные изоформы малых О-белков, входящих в семейство ЯаЬ, физически взаимодействуют и (или) модулируют активность некоторых эпителиальных ионных каналов. Нами была поставлена задача идентифицировать малые С-белки в семействе ЯаЬ, вовлеченные в регуляцию Е№С, и охарактеризовать механизмы их действия. Исследование было сфокусировано на нескольких типичных малых О-белках, входящих в семейство ЛаЬ, которые представляют потенциальный интерес как регуляторы активности каналов в эпителиальных клетках почки. Так, ЯаЬ 11 а известен как участник регуляции трафика различных белков. ЯаЬЗ вовлечен в Са2+-зависимый экзоцитоз. ЯаЬ5 присутствует на ранних эндосомах и регулирует ранние стадии эндоцитоза. ЯаЬ38 — это новый член данного семейства, который регулирует внутриклеточный транспорт и может быть вовлечен в развитие различных болезней почек. ЯаЬ27а и их эффекторы играют роль в экзоцитозе. Белки А^

Рис. 18. Различные влияния Брефельднна А на отдельно ENaC и в сочетании с Rablla.

Плотность амилорид-

чувствительного тока в клетках СНО, трансфецированных ENaC отдельно и совместно с Rablla, не обработанных и обработанных БФА.

принадлежат к подсемейству

Sarl/Arf малых G-белков и

регулируют почкование

везикул.

Нами были

идентифицированы два белка, влияющих на активность ENaC. Rablla и Rab3a

значительно увеличивали плотность амилорид-чувствительного тока в том

случае, когда были экспрессированы совместно с ENaC в клетках СНО. На рис.

17 показаны записи токов и средние значения активности канала в клетках,

трансфецированных ENaC отдельно и совместно с соответствующими малыми

G-белками. В отличие от Rabl la и Rab3a, другие исследованные Rab белки не

оказывали влияния на активность канала.

Механизм регуляции ENaC малым G-белком Rabl la. При использовании различных ингибиторов нами не были установлены сигнальные пути регуляции ENaC малым О-белком Rablla. При одновременной экспрессии Rablla и доминантно негативного мутанта динамина К44А мы наблюдали кумулятивный эффект. Таким образом, мы можем предположить, что Rablla увеличивает активность ENaC через механизм, не зависящий от динамина, возможно посредством ускорения трафика к плазматической мембране. Активность ENaC не увеличивалась при одновременной экспресси Rablla и SGK1 (Serum and glucocorticoid regulated kinase 1). Основываясь на этих результатах мы можем предположить, что SGK1 может быть вовлечена в Rabl 1а-зависимую регуляцию ENaC.

Для того, чтобы исследовать, опосредуется ли стимулирующее влияние Rablla на активность ENaC через пути, регулирующие внутриклеточную транслокацию белков, мы обработали клетки, экспрессирующие либо отдельно

600

-450

в с

с го о

£ 300-

о о

5 150-] с 1=

п=21

О ш

п=16

п=7

п=12

п=10

т (1=8

в LO

JD ГО

< ©

< В

LD +

канал, либо ENaC совместно с Rabí la, брефельдином А (БФА). БФА (5 мкг/мл) значительно снижал активность ENaC через 24 ч после обработки как в клетках, экспрессирующих только ENaC, так и в клетках, трансфецированных также Rabila (рис. 18). Напротив, при разрушении эндомембраных систем при помощи БФА за 2 ч, плотность тока уменьшалась только в клетках, одновременно экспрессирующих ENaC и Rabí la. Таким образом, БФА, который блокирует трафик, уменьшает Rabí 1а-зависимое движение ENaC к плазматической мембране. Нами также показано, что ENaC колокализуется с Rabí 1а как в цитозольной, так и в мембранной фракциях.

Молекулярные механизмы Р1(3,4,5)Рз и Р1(4,5)Р2 регуляции ENaC. Фосфатидилинозитиды вовлечены в различные внутриклеточные каскады, включая сигнальные пути, приводящие к изменению активности ионных каналов. Во многих случаях фосфатидилинозитиды непосредственно связываются с ионными каналами, влияя на воротные свойства и, таким образом, на активность каналов. Нами было показано, что как Р1(3,4,5)Р3, так и Р1(4,5)Р2 вовлечены в регуляцию ENaC малыми G-белками. Связывание и прямая активация ионных каналов фосфатидилинозитидами имеет высокое физиологическое и патофизиологическое значение, так как разрушение связывания может приводить к различным болезням, таким как синдром Андерсена-Тэвила, Бартера, QT-синдром или врожденный гиперинсулинизм (2931). Чтобы лучше понять молекулярные механизмы регуляции ENaC фосфатидилинозитидами, нами были произведены серии экспериментов по исследованию влияния Р1(3,4,5)Р3 и Р1(4,5)Р2 как на нормальный ENaC, так и на канал, в котором были проведены замены/делеции некоторых регионов, которые могут быть потенциально ответственны за данную регуляцию.

Механизмы РК3.4,5)Р3 регуляции ENaC. Каждая из трёх субъединиц ENaC содержит трансмембранные домены ТМ1 и ТМ2, которые имеют в своем составе кластеры повторяющихся у разных видов субъединиц положительно заряженных аминокислотных остатков. Кроме того, р- и у-субъединицы ENaC имеют консервативные кластеры в составе цитозольных N- и С-концов. Мы начали исследование молекулярных механизмов регуляции ENaC фосфоинозитидами с того, что охарактеризовали мутантные каналы,

содержащие либо замены, либо удаления консервативных аминокислотных последовательностей. Для этого были созданы и протестированы 12 мутантов мышиного Е№С: (1) три а-ЕЫаС, включая 1*98-К108 (а 10) и 1*614-1*630 (а2Б) делеции и Я98А + К ЮЗА (а 18) замещения; (2) четыре Р-ЕЫаС, включая К4-К16 (рЖ>), К39-К49 (РШ) и К.552-11563 (р20) делеции и К39А + Л40А (018) замещения; и (3) пять у-ЕЫаС, включая 1*42-1153 (уЮ) и С>573-1*583 (у2Б) делеции и К6А + К8А + К10А + К12А + К13А (уЫБ), Я42А + Я43А (у1 Б) и Я569А +И570А + К574А + К576А + 11581А + Я582А + 11583А (у28) замещения. Семь из двенадцати мутантов формировали активный канал (рис. 19).

Ранее нами было показано, что регуляция ЕИаС малым О-белком К-Рав опосредована действием Р13-киназы и что продукт этой киназы, Р1(3,4,5)Р3, увеличивает вероятность открытого состояния канала. Чтобы протестировать, как мутантные Е№С субъединицы отвечают на стимуляцию Р13-киназы, мы экспрессировали в клетках СНО мутантные субъединицы одновременно с комплементарными субъединицами дикого типа в отсутствие и в присутствии постоянно активной Р13-киназы. Для лучшего понимания механизмов регуляции

Р13-киназой и

Плотность тока (пА/пФ)

А.

ЕЫаС

Б.

аШ а1Э а.20

р№ Э Ю Р1Э

Р2Р у^

уЮ у1Э у2Р у2Э

32а

¡н

но, 12 но, 12

]]—1 *

но, 12 но, 12

-Н

но, 20

и-

_}- *

и.

Р1(3,4,5)РЭ были

проведены измерения активности каналов на уровне регистрации унитарных токов. На рис. 20А-Г показаны влияния экзогенного Р1(3,4,5)Р3 на

вероятность открытого состояния (Р0) ЕИаС для

Рис. 19. Мутанты Е№С, использованные для тестирования регуляции канала фосфоинозитидами. (А) Схема, демонстрирующая ЕЫаС дикого типа (Е№С) и мутанты а-, Р- и у-субъединиц Е№С. Относительное распределение позиций, в которых были проведены удаления (показано черными квадратами) или замещения аминокислот (черные линии), показаны для всех мутаций. (Б) Средние значения плотности тока для ЕШС дикого типа и соответствующих мутантов, зарегистрированные при экспрессии соответствующих субъединиц в клетках СНО; но - значения не определены.

А.

Д-

1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0

1.0 0.8 'о.б

0.4 0.2 0.0

чЛ

контроль +Р!Р3

Е.

1.0

0.8 а 0.6 0.4 0.2 0.0

1.0 0.8 °0.6 0.4 0.2 0.0

<х20

В.

контроль +Р!Р3

ж.

Е№С + Р13-К

а2Э

1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0

Р2Э

Г.

контроль +Р1Р3

Р2Р

■ Р13-К

1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0

1.0 0.8 'о.б

0.4 0.2 0.0

Г2Э

контроль +Р!Р3

Г2Э

■ Р13-К

Рис. 20. Положительно заряженные аминокислотные последовательности непосредственно после ТМ1 и ТМ2 в (!- и у-Е№С необходимы для регуляции канала Р13-киназой и Р1(3,4,5)Рз. Средние значения влияния Р1(3,4,5)Рз на Р„ для Е№С, экспрессированного в клетках СНО и содержащего все три субъединицы дикого типа (А) или мутантные субъединицы в присутствии комплементарных двух других субъединиц Е№С (Б-Г). Д-3 Средние значения Р0 для Е№С, экспрессированного в клетки СНО в отсутствие или в присутствии постоянно активной Р13-киназы.

дикого типа (ЕЫаС) и каналов, содержащих либо аТО, либо (320 или у2в мутации. Изменения Р0 после добавления Р1(3,4,5)Р3 были подсчитаны в парных экспериментах. Каналы, состоящие из субъединиц только дикого типа и каналы содержащие мутант а2П, значительно активировались при добавлении Р1(3,4,5)Р3. Напротив, когда каналы содержали мутанты р21> или у2Э, влияния Р1(3,4,5)Р3 на Р0 не наблюдали. Полученные результаты полностью согласуются с измерениями интегральных токов в клетках, экспрессирующих ЕЫаС (дикого типа и мутанты) и Р13-киназу и значениями Р0 для ЕИаС (дикого типа и мутантов) в отсутствие и в присутствии Р13-киназы, приведенными на рис. 20Д-3. На этих графиках показаны средние значения, подсчитанные в непарных 0и181с1е-0111 экспериментах. Таким образом, полученные нами данные демонстрируют важность консервативных положительно заряженных последовательностей непосредственно после ТМ2 в (3- и у-Е№С в регуляции Р13-киназой, и, соответственно Р1(3,4,5)Р3.

Механизмы Р1(4.5)Р7 регуляции ЕИаС. Нами также было показано, что увеличение активности ЕИаС КЬоА вызвано влиянием Р1(4,5)Р2 на канал. После

, Р1(4,5)РгЗ

(шИши иП*СгоЛД

1-I'lj'T "У|Т#"'"ЦП IT

в.

Г. 0.6 р.,

ЛЛ®.

+Р|(4,5)Рг

+Р1(4,5)Р,

Рис. 21. Положительно заряженные аминокислоты в N-конце |5- и у-субъединиц необходимы для Р1(4,5)Р2 регуляции ENaC. (А, Б) Типичные записи токов в конфигурации inside-out в клетках СНО, экспрессирующих ENaC дикого типа (А) или yNS + pND мутанты (Б) до и после добавления РГ(4,5)Р2 (20 мкМ). Потенциал на мембране -60 мВ. Показаны также примеры записей токов в увеличенном масштабе до затухания активности (1), непосредственно до (2) и после (3) добавления Р1(4,5)Р2. (В, Г) Средние значения Р0 до и после добавления Р1(4,5)Р2 для ENaC дикого типа и мутантов yNS + (5ND.

того как были идентифицированы участки, необходимые для регуляции ENaC Р13-киназой и Р1(3,4,5)Р3, роль консервативных участков в Р1(4,5)Р2 регуляции канала была также исследована.

Прямое влияние экзогенного Р1(4,5)Р2 на вероятность нахождения ENaC в открытом состоянии были исследованы в парных экспериментах при использовании конфигурации inside-out метода пэтч-кламп. Результаты, полученные в этой серии экспериментов, показаны на рис. 21. Как и ожидалось, активность канала быстро уменьшалась при отрыве фрагмента мембраны от клетки. Известно, что такое уменьшение активности при измерениях в конфигурации inside-out характерно как для каналов ENaC, так и для некоторых других каналов (32-34). В наших экспериментах, добавление Р1(4,5)Р2 (20 мкМ) к внутриклеточной стороне плазматической мембраны быстро восстанавливало активность ENaC дикого типа (рис. 21 А, В). Напротив, каналы, содержащие мутанты yNS и (3ND, не реагировали на добавление экзогенного Р1(4,5)Р2. На

Рис. 22. Схема регуляции ENaC малыми G-белками K-Ras, Rabil и RlioA.

ENaC

Р1(4)РЩ|1М|||р Rho-шназа

RíiOlí;

рис. 21Б и Г показаны типичный пример такого эксперимента и средние значения для проведенной нами серии опытов. Таким образом, полученные результаты

согласуются с идеей, что участки в И-конце р~ и у-Е№С играют роль в регуляции канала Р1(4,5)Р2.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате

выполненной работы

достигнуты значительные успехи в понимании

механизмов регуляции эпителиальных натриевых каналов малыми G-белками и фосфатидилинозитидами. ENaC, наряду с другими ионными каналами, является конечной мишенью для малых G-белков и ассоциированных с ними сигнальных каскадов. Малые G-белки воздействуют как на воротные свойства ENaC, так и на количество активных каналов в плазматической мембране. При этом, как минимум в нескольких случаях фосфатидилинозитиды вовлечены в регуляцию канала опосредованную малыми G-белками. На рис. 22 показана предполагаемая модель регуляции ENaC малыми G-белками K-Ras, RlioA и Rabí 1. K-Ras, через PD-киназу и Р1(3,4,5)Рз, влияет на вероятность открытого состояния канала. RlioA и Rabil участвуют в транслокации канала к плазматической мембране. Показано, что и другие малые G-белки вовлечены в изменение активности ENaC, и их влияние на канал специфично. Таким образом, накоплен достаточный экспериментальный материал показывающий, что регуляция эпителиального Na+ канала малыми G-белками и фосфатидилинозитидами широко распространена и играет физиологическую роль в поддержании ENaC-опосредованного №+-гомеостаза.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что ENaC состоит из равного количества субъединиц с относительной стехиометрией la:ip:ly. На основе протон-чувстительного канала, принадлежащего к тому же семейству, смоделирована структура ENaC как гетеротримера и показаны потенциально важные для физиологической регуляции домены в субъедипицах ENaC.

2. Количество функциональных каналов в плазматической мембране и активность ENaC регулируются малыми G-белками, входящими в семейства Ras, Rho и Rab. Механизмы активации и сигнальные каскады, вовлеченные в модулирование канала малыми G-белками, различны.

3. Активность ENaC регулируется малым G-белком K-Ras через Р13-киназу и соответствующее увеличение уровня Р1(3,4,5)Р3. Вероятность открытого состояния канала зависит от уровня фосфатидилинозитида.

4. Встраивание новых каналов в плазматическую мембрану осуществляется при участии малых G-белков RhoA и Rabila. При этом RhoA влияет на ENaC последовательно через Rho-киназу, Р1(4)Р 5-киназу и фосфатидилинозитид PI(4,5)P2. Rabila колокализуется с субъединицами ENaC и, по всей видимости, участвует в транслокации канала к плазматической мембране через механизм, опосредованный SGK1.

5. Положительно заряженные аминокислоты непосредственно после ТМ2 в и y-ENaC вовлечены в регуляцию Р13-киназой и, соответственно, Р1(3,4,5)Р3. Увеличение активности канала, вызванное одновременной экспрессией PI3-киназы или добавлением Р1(3,4,5)Рз, зависит от консервативных регионов в Р-и у-субъединицах ENaC. Консервативный регион в N-конце Р- и y-ENaC вовлечен, в свою очередь, в регуляцию канала Р1(4,5)Р2.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Staruschenko A., Patel P., Tong Q., Medina J.L., Stockand J.D. 2004. Ras activates the epithelial Na+ channel (ENaC) through phosphoinositide 3-OH kinase (PI3-K) signaling. Journal of Biological Chemistry. 279(36): 37771-37778.

2. Staruschenko A., Nichols A., Medina J.L., Camacho P., Zheleznova N.N., Stockand J.D. 2004. Rho small GTPases activate the epithelial Na+ channel. Journal of Biological Chemistry. 279(48): 49989-49994.

3. Staruschenko A., Medina J.L., Patel P., Shapiro M.S., Booth R.E., Stockand J.D. 2004. Fluorescence resonance energy transfer analysis of subunit stoichiometry of the epithelial Na+ channel. Journal of Biological Chemistry. 279(26): 27729-27734.

4. Staruschenko A., Pochynyuk O.M., Tong Q., Stockand J.D. 2005. Ras couples phosphoinositide 3-OH kinase to the epithelial Na+ channel. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1669(2): 108-115.

5. Staruschenko A., Adams E„ Both R.E., Stockand J.D. 2005. Epithelial Na+ channel subunit stoichiometry. Biophysical Journal. 88(6): 3966-3975.

6. Pochynyuk O., Staruschenko A., Tong Q., Medina J., Stockand J.D. 2005. Identification of a functional phosphatidylinositol 3,4,5-fmphosphate binding site in the epithelial Na+ channel. Journal of Biological Chemistry. 280(45): 37565-37571.

7. Staruschenko A., Pochynyuk O., Stockand J.D. 2005. Regulation of epithelial Na+ channel activity by conserved serine/threonine switches within sorting signals. Journal of Biological Chemistry. 280(47): 39161-39167.

8. Staruschenko A., Booth R.E., Pochynyuk O., Stockand J.D. Tong Q. 2006. Functional «constitution of the human epithelial Na+ channel (ENaC) in a mammalian expression system. From: Methods in Molecular Biology, Ion Channels: Methods and Protocols. Humana Press Inc., Totowa, NJ. 337: 3-13.

9. Pochynyuk O., Tong Q., Staruschenko A., Ma H.P., Stockand J.D. 2006. Regulation of the epithelial Na+ channel (ENaC) by phosphatidylinositides. American Journal of Physiology: Renal Physiology. 290(5): F949-F957.

10. Починюк O.M., Железнова H.H., Медина Дж.Л., Стокканд Дж.Д, Старущенко А.В. 2006. Регуляция эпителиальных натриевых каналов (ENaC) малыми G-белками. Биологические Мембраны. 23: 327-338.

11. Pochynyuk О., Medina J.L., Gamper N., Genth H., Stockand J.D., Staruschenko A. 2006. Rapid translocation and insertion of the epithelial Na+ channel in response to RhoA signaling. Journal of Biological Chemistry. 281(36): 26520-26527.

12. Pochynyuk O., Tong Q., Staruschenko A., Stockand J.D. 2007. Binding and direct activation of the epithelial Na+ channel (ENaC) by phosphatidylinositides. Journal of Physiology. 580(2): 365-372.

13. Staruschenko A., Dorofeeva N.A., Bolshakov K.V., Stockand J.D. 2007. Differential effects of Cd2+ and Ni2+ on distinct acid-sensing ion channel (ASIC) isoforms. Developmental Neurobiology. 67(1): 97-107.

14. Pochynyuk* O., Staruschenko* A., Bugay V., LaGrange L., Stockand J.D. 2007. Quantifying RhoA facilitated trafficking of ENaC to the plasma membrane with TIRF-FRAP .Journal of Biological Chemistry. 282(19): 14576-14585. *-equal contribution.

15. Staruschenko A., Pochynyuk O., Bugay V., Vandewalle A., Stockand J.D. 2007. Acute regulation of Epithelial Na+ Channel induced by inhibition of phosphatidylinositol 3-kinase in the cortical collecting duct. Journal of American Society of Nephrology. 18(6): 1652-1661.

16. Pochynyuk O., Tong Q., Medina J., Vandewalle A., Staruschenko A., Bugay V., Stockand J.D. 2007. Molecular determinants of PI(4,5)P2 and PI(3,4,5)P3 regulation of the epithelial Na+ channel. Journal of General Physiology. 130(4): 399-413.

17. Pochynyuk О., Stockand J.D. Staruschenko A. 2007. Ion channel regulation by Ras, Rho and Rab GTPases. Experimental Biology and Medicine. 232(10): 1258-1265.

18. Dorofeeva N.A., Barygin O.I., Staruschenko A., Bolshakov K.V., Magazanik L.G. 2008. Mechanisms of non-steroid anti-inflammatory drugs action on ASICs expressed in hippocampal interneurons. Journal ofNeurochemistry. 106 (1): 429-441.

19. Stockand J.D., Staruschenko A., Pochynyuk O., Booth R.E., Silverthorn D.U. 2008. Insight toward epithelial Na+ channel (ENaC) mechanism revealed by the acid-sensing ion channel 1 (ASIC1) structure. International Union of Biochemistry and Molecular Biology Life. 60(9): 620-628.

20. Karpushev A.V., Levchenko V., Pavlov T.S., Lam V., Vinnakota K.C., Vandewalle A., Wakatsuki Т., Staruschenko A. 2008. Regulation of ENaC expression at the cell surface by Rabl 1. Biochemical and Biophysical Research Communications. 377(2): 521-525.

21. Pochynyuk O., Kucher V., Boiko N., Mironova E., Staruschenko A., Karpushev A.V., Tong Q., Hendron E., Stockand J. 2009. Intrinsic voltage dependence of the epithelial Na+ channel is masked by a conserved transmembrane domain tryptophan. Journal of Biological Chemistry. 284(38): 25512-25521.

22. Dorofeeva N.A., Karpushev A.V., Nikolaev M.V., Bolshakov K.V., Stockand J.D., Staruschenko A. 2009. Muscarinic Ml modulation of acid-sensing ion channels. Neuroreport. 20(15): 1386-1391.

23. Карпушев A.B., Павлов T.C., Старущенко A. 2009. Регуляция эпителиальных натриевых каналов малыми G-белками и фосфатидилинозитидами. Биологические мембраны. 26(4): 265-279.

Karpushev A.V., Pavlov T.S., Staruschenko А. 2009. Regulation of the epithelial sodium channel (ENaC) by small G proteins and phosphatidylinositides. Biochemistry (Moscow), Series A: Membrane and Cell Biology. 3(3): 261-274.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Alvarez de la Rosa D., Canessa, С. M., Fyfe, G. K., and Zhang, P. (2000) Annu. Rev. Physiol 62, 573-594. 2. Rossier, В. C., Pradervand, S., Schild, L., and Hummler, E. (2002) Annu. Rev. Physiol 64, 877-897. 3. Rossier, В. C. and Schild, L. (2008) Hypertension 52, 595-600. 4. Schild, L. (2004) Rev. Physiol Biochem. Pharmacol 151, 93-107. 5. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, В., and Sigworth, F. J. (1981) Pflugers Arch. 391, 85-100. 6. Canessa, С. M., Horisberger, J. D., and Rossier, В. C. (1993) Nature 361, 467-470. 7. Canessa, С. M., Schild, L., Buell, G., Thorens, В., Gautschi, I., Horisberger, J. D., and Rossier, В. C. (1994) Nature 367, 463-467. 8. Takai, Y., Sasaki, Т., and Matozaki, T. (2001) Physiol Rev. 81, 153-208. 9. Pochynyuk, O., Stockand, J. D., and Staruschenko, A. (2007) Exp. Biol. Med. (Maywood.) 232, 1258-1265. 10. Chang, S. S„ Grander, S., Hanukoglu, A., Rosier, A., Mathew, P. M., Hanukoglu, I., Schild, L., Lu, Y., Shimkets, R. A., NelsonWilliams, C., Rossier, В. C., and Lifton, R. P. (1996) Nat. Genet. 12, 248-253. II. Hansson, J. H., Nelson-Williams, C., Suzuki, H., Schild, L., Shimkets, R., Lu, Y., Canessa, C., Iwasaki, Т., Rossier, В., and Lifton, R. P. (1995) Nat. Genet. 11, 76-82. 12. Lifton, R. P., Gharavi, A. G„ and Geller, D. S. (2001) Cell 104, 545-556. 13. Bens, M., Vallet, V., Cluzeaud, F„ Pascual-Letallec, L., Kahn, A., Rafestin-Oblin, M. E., Rossier, В. C., and Vandewalle, A. (1999) J. Am. Soc. Nephrol 10, 923-934. 14. Bens, M., Chassin, C., and Vandewalle, A. (2006) Pflugers Arch. 453, 133-146. 15. Anantharam, A. and Palmer, L. G. (2007) J Gen. Physiol 130, 55-70. 16. Firsov, D., Gautschi, I., Merillat, A. M., Rossier, В. C., and Schild, L. (1998) EMBOJ 17, 344-352. 17. Kosari, F., Sheng, S., Li, J., Mak, D. O., Foskett, J. K., and Kleyman, T. R. (1998) J Biol. Chem. 273, 13469-13474. 18. Cheng, C„ Prince, L. S„ Snyder, P. M., and Welsh, M. J. (1998) J Biol. Chem. 273, 22693-22700. 19. Eskandari, S., Snyder, P. M., Kreman, M., Zampighi, G. A., Welsh, M. J., and Wright, E. M. (1999) J Biol. Chem. 274, 27281-27286. 20. Snyder, P. M., Cheng, C., Prince, L. S., Rogers, J. C.,

and Welsh, M. J. (1998) J Biol. Chem. 273, 681-684. 21. Zheng, J. and Zagotta, W. N. (2004) Neuron 42, 411-421. 22. Jasti, J., Fumkawa, H., Gonzales, E. B., and Gouaux, E. (2007) Nature 449, 316-323. 23. Spindler, B., Mastroberardino, L., Custer, M„ and Verrey, F. (1997) Pflugers Arch. 434, 323-331. 24. Stockand, J. D., Spier, B. J., Worrell, R. T„ Yue, G„ Al-Baldawi, N„ and Eaton, D. C. (1999) J. Biol. Chem. 274, 35449-35454. 25. Rodriguez-Viciana, P., Warne, P. H., Khwaja, A., Marte, B. M., Pappin, D., Das, P., Waterfield, M. D„ Ridley, A., and Downward, J. (1997) Cell 89, 457-467. 26. Genth, H„ Gerhard, R., Maeda, A., Amano, M„ Kaibuchi, K.., Aktories, K., and Just, I. (2003) J Biol. Chem. 278, 28523-28527. 27. Butterworth, M. B., Edinger, R. S„ Frizzell, R. A., and Johnson, J. P. (2009) Am J Physiol Renal Physiol 296, F10-F24. 28. Snyder, P. M. (2005) Endocrinology 146, 5079-5085. 29. Donaldson, M. R., Jensen, J. L., Tristani-Firouzi, M., Tawil, R., Bendahhou, S„ Suarez, W. A., Cobo, A. M., Poza, J. J., Behr, E., Wagstaff, J., Szepetowski, P., Pereira, S., Mozaffar, T„ Escolar, D. M., Fu, Y. H„ and Ptacek, L. J. (2003) Neurology 60, 1811-1816. 30. Lopes, C. M., Zhang, H., Rohacs, T., Jin, T., Yang, J., and Logothetis, D. E. (2002) Neuron 34, 933-944. 31. Ma, D., Tang, X. D., Rogers, T. B., and Welling, P. A. (2007) J Biol. Chem. 282, 5781-5789. 32. Ma, H. P., Saxena, S„ and Wamock, D. G. (2002) J Biol. Chem. Ill, 7641-7644. 33. Ma, H. P., Chou, C. F„ Wei, S. P., and Eaton, D. C. (2007) Pflugers Arch. 455, 169-180. 34. Pochynyuk, O., Tong, Q., Staruschenko, A., Ma, H. P., and Stockand, J. D. (2006) Am J Physiol Renal Physiol 290, F949-F957.

Лицензия ЛР № 020593 от 07.08.97

Подписано в печать 19.11.2009. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 2,0. Уч.-изд. л. 2,0. Тираж 100. Заказ 5357Ь.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.: (812)550-40-14 Тел./факс: (812) 297-57-76