Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Натрий-проводящие каналы клеток миелоидной лейкемии человека

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Максимов, Антон Владимирович, Санкт-Петербург

/:/■ ■ , / • ,

ИНСТИТУТ ТТИТОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи УДК 577.352.465

НАТРИЙ-ПРОВОДЯЩИЕ КАНАЛЫ КЛЕТОК МИЕЛОИДНОЙ ЛЕЙКЕМИИ ЧЕЛОВЕКА: БИОФИЗИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ СВЯЗЬ С МИКРОФИЛАМЕНТАМИ

03.00.25

ДИССЕРТАЦИЯ На соискание ученой степени кандидата биологических наук

научный руководитель -кандидат биологических наук Ю.А. Негуляев

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1998

СОДЕРЖАНИЕ

Стр.

Список сокращений 3

Введение 4

Обзор литературы 8

Глава1. Потенциал-управляемые натриевые каналы 8

1.1 Краткие сведения о физиологической роли и 8 функциональных характеристиках потенциал-

управляемых натриевых каналов

1.2 Блокаторы и модификаторы потенциал-управляемых 9 натриевых каналов

1.3 Молекулярная организация потенциал-управляемых 12 натриевых каналов

Глава 2. Потенциал-независимые натриевые каналы 16

2.1 Физиологическая роль и характеристики потенциал- 16 независимых натриевых каналов эпителиальных тканей

2.2 Регуляция эпителиальных натриевых каналов 17

2.3 Потенциал-независимые натриевые каналы 20 мышечных клеток, клеток крови и клеток эпидермальной карциномы человека А431

2.4 Молекулярная организация потенциал-независимых 21 натриевых каналов

Глава 3. Роль цитоскелета в регуляции ионных 31 каналов плазматических мембран

Глава 4. Материалы и методы исследования 35

4.1 Клетки 35

4.2 Электрофизиология 35

4.3 Растворы 36

4.4 Математическая обработка данных 37 Глава 5. Результаты исследования 40

5.1 Характеристики натрий-проводящих каналов клеток 40 К562

5.2 Цитохалазин-Д вызывает активацию Na каналов в 44 cell-attached экспериментах

5.3 Влияние цитохалазина-Д на интегральную прово- 46 димость плазматической мембраны клеток К562

5.4 Экзогенный гельзолин активирует натриевые каналы 48 в inside-out экспериментах

5.5 Повышение уровня свободного внутриклеточного 50 кальция приводит к активации натриевых каналов в cell-

attached экспериментах

5.6 Проводимость и селективность натриевых каналов не 52 изменяется при модификациях микрофиламентов

5.7 Анализ кинетических характеристик Na+ каналов при 54 модификации микрофиламентов

5.8 Доказательства в пользу кластерной организации 57 натриевых каналов в плазматической мембране

5.9 Механочувствительные каналы клеток К562 60

Глава 6. Обсуждение результатов 63

6.1 Характеристики натрий-проводящих каналов клеток 63 К562 и их место в семействе потенциал-независимых

катионных каналов

6.2 Регуляция натриевых каналов клеток К562: роль 66 микрофиламентов

6.3 Кластерная организация натриевых каналов в 70 плазматической мембране клеток К562

6.4 Механочуствительные каналы плазматической 71 мембраны клеток К562

Выводы 73

Список литературы 74

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

К; - константа ингибирования (диссоциации)

Рх - проницаемость для иона X

БТХ - сакситоксин

АТФ - аденозинтрифосфат

ГТФ - гуанозинтрифосфат

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

Ер - потенциал реверсии

кДа - килодальтон

МА - местный анестетик

мВ - милливольт

МОм - мегаом

пА - пи ко ампер

пСм - пикосименс

РНК - рибонуклеиновая кислота

т.н.п. - тысяча нуклеотидных пар

ТМ - трансмембранный

ТТХ - тетродотоксин

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат цГМФ - циклический гуанозинмонофосфат

ВВЕДЕНИЕ Общая характеристика работы Актуальность проблемы.

Вход ионов натрия (Na+) в цитозоль из наружной среды играет ключевую роль в передаче нервного импульса (Hille, 1992), регуляции водно-солевого баланса (Palmer, 1992), и приводит к запуску ряда сигнальных процессов, сопряженных с изменением активности ферментов и обменников (Basudev et al., 1995), выходом кальция из внутриклеточных депо (Lipp et al., 1994). Пассивный транспорт Na+ по градиенту электрохимического потенциала происходит при участии

специализированных белков плазматической мембраны - ионных каналов. В настоящее время известно два семейства ионных каналов, селективных для натрия - потенциал-управляемые натриевые каналы, экспрессирующиеся, преимущественно, в нервных тканях (Hille, 1992) и амилорид-чувствительные Na+ каналы, обнаруженные в эпителиях (Palmer, 1986), нейронах (Waldmann et al., 1997), мышечных клетках (Van Renterghem et al., 1991), макрофагах (Negulyaev et al., 1994) и лимфоцитах (Bubien et al., 1993). В то время как физиологическое значение и молекулярная организация потен циал-управляемых Na+ каналов достаточно подробно изучены, семейство амилорид-чувствительных каналов быстро расширяется, что порождает массу вопросов о функциях, выполняемых этими каналами в специализированных тканях, взаимосвязи между различиями в молекулярной структуре отдельных представителей семейства и такими их характеристиками как кинетическое поведение, селективность, проводимость и чувствительность к блокирующим агентам и, наконец, механизмах регуляции активности каналов. Исследование. биофизических свойств Na+ каналов с использованием

электрофизиологических методов, а также, идентификация вторичных посредников и белков, связывающихся с субъединицами каналов и

модулирующих их активность, необходимы для ответа на перечисленные вопросы.

В последние годы возрос интерес к роли примембранного цитоскелета в регуляции транспорта ионов. Взаимодействуя с различными интегральными белками плазматических мембран, в том числе и с ионными каналами, элементы цитоскелета препятствуют их латеральной диффузии, определяя, таким образом, пространственную локализацию в специализированных участках мембраны (Levina et al., 1994). Неоднократно было показано что транспорт синтезированных de novo белков из примембранных пулов также зависит от цитоскелета (Garty et al, 1983). Особенно интересными представляются последние результаты, свидетельствующие о функциональной связи между состоянием актиновых микрофиламентов и активностью различных ионных каналов, в частности потенциал-зависимых Na+ каналов (Undrovinas et al., 1995), калиевых и хлорных каналов в бронхиальных эпителиях (Hug et al., 1994), АТР-чувствительных каналов в кардиомиоцитах (Terzic et al., 1996).

Идентификация молекулярной организации и мембранной топологии нескольких субъединиц амилорид-чувствительных Na+ каналов (Canessa et al., 1994, Waldmann et al., 1995) создала теоретические предпосылки для детального исследования роли цитоскелета в регуляции белков этого семейства.

Цели и задачи исследования.

Цель настоящей работы заключалась в изучении функциональных свойств натриевых каналов плазматической мембраны клеток хронической миелоидной лейкемии человека К562 и оценке роли актиновых филаментов в регуляции активности этих каналов.

Были поставлены следующие задачи:

1) Идентифицировать каналы плазматической мембраны клеток К562 и охарактеризовать их проводящие и селективные свойства, а также кинетическое поведение.

2) Изучить влияние агентов, модифицирующих сеть микрофиламентов, на активность натриевых каналов.

3) Проверить гипотезу о возможности кальций-зависимой регуляции Ыа+ каналов клеток К562 и участия актина в этом процессе.

4) Установить механизмы изменения активности каналов при модификации микрофиламентов.

Научная новизна полученных результатов.

В результате настоящей работы впервые были описаны натриевые каналы клеток хронической миелоидной лейкемии человека К562, охарактеризованы их проводящие свойства, кинетическое поведение и селективность для одновалентных и двухвалентных катионов. С помощью цитохалазина-Д, актина и актин-связывающего белка гельзолина впервые доказан функциональный эффект микрофиламентов на активность Ка+ каналов, а также, показана роль свободного внутриклеточного кальция в этом процессе. Путем анализа кинетических характеристик каналов выяснен механизм изменения вероятности их открытого состояния при модификациях актиновой сети.

Теоретическое и практическое значение работы.

Описание характеристик каналов клеток хронической

миелоидной лейкемии человека К562, приведенное в работе, несомненно, необходимо для понимания их молекулярной организации и места в филогенетическом древе семейства потенциал-независимых натриевых

каналов. Клетки К562 имеют свойства стволовых клеток-предшественников миелоидного ряда, поэтому результаты, полученные в работе, могут быть полезными для выяснения общих механизмов регуляции натриевых каналов в широком спектре невозбудимых клеток, в частности - в клетках крови. Доказательства существования функциональной связи между активностью натриевых каналов и состоянием микрофиламентов подтверждают участие цитоскелета в регуляции транспорта ионов и, безусловно, представляют теоретический интерес как механизм активации ионных каналов. Наконец, данные о функциональных характеристиках натриевых каналов могут применяться при разработке и тестировании фармакологических препаратов.

Обзор литературы

глава 1. потенциал-управляемые натриевые каналы

1.1 Краткие сведения о физиологической роли и функциональных характеристиках потенциал-управляемых натриевых каналов

Потеыциал-управляемые натриевые каналы играют ключевую роль в генерации спайка и проведении нервного импульса в возбудимых тканях (Hille, 1992). Началом интенсивных исследований этого большого семейства трансмембранных белков можно считать открытие Ходжкина и Катца установивших, что возникновение потенциала действия в гигантском аксоне кальмара в ответ на электрический стимул вызвано увеличением натриевой проницаемости плазматической мембраны (Hodgkin, Katz, 1949). Вскоре, с помощью радиоактивного изотопа 24Na, было обнаружено что возбуждение сопровождается входом натрия в цигозоль из наружной среды (Keynes, 1951). Последующие эксперименты с использованием метода фиксации потенциала позволили зарегистрировать входящий натриевый ток, возникающий при деполяризации мембраны (Hodgkin and Huxley 1952а). Сейчас, спустя более сорока лет, хорошо известно, что увеличение Na+ проницаемости мембран возбудимых клеток в ответ на стимул связано с активацией потенциал-управляемых натриевых каналов плотность которых в аксонах может достигать 2000 на мкм2.

Само название "потенциал-управляемые" говорит, что активность каналов зависит от потенциала на мембране. При потенциалах покоя (в нейронах - обычно около -70 мВ) натриевые каналы закрыты, следовательно, мембрана имеет низкую проницаемость для ионов Na+. Деполяризация мембраны приводит к активации каналов и входу Na+ в цитозоль по градиенту электрохимического потенциала, после чего каналы быстро инактивируются и натриевая проницаемость снова возвращается к исходному уровню. Подобная кинетика каналов объясняется наличием у

них активационных (m) и инактивационных (h) ворот (Hodgkin, Huxley, 1952b).

В разных объектах потенциал-управляемые натриевые каналы имеют элементарную проводимость 4-24 пСм и высокую селективность для Na+. Так, для катионов щелочного ряда, проницаемость уменьшается с увеличением кристаллического радиуса Li+~Na+>K+>Rb+>Cs+ что соответствует XI или X рядам селективности Эйзенмана (Chandler and Meves, 1965, Hille, 1992). Малые органические катионы гидроксиламмоний и гидразин имеют проницаемость, сходную с натрием (Hille, 1971), проницаемость для протонов в 252 раза выше чем для натрия (Mozhaeva et al., 1983), а для физиологических катионов К+ и Са2+ по крайней мере в 10 раз ниже (Hille, 1972). По модели "молекулярного сита", пора потенциал-управляемого натриевого канала имеет размер 0.31 х 0.51 нм и окружена восемью атомами кислорода. Ион Na проходит через пору в окружении 1-3 молекул воды, то есть частично дегидратируясь (Hille, 1972, 1992). Следует,. однако, заметить, что только установление кристаллической структуры канала позволит понять точную геометрию поры и расположение внутренних лигандных групп, с которыми связывается катион.

1.2 Ело катар м и модификаторы п о men ц и ал -управляем ых натриевых каналов

Неудивительно, что играя важную роль в передаче сигнала, потенциал-управляемые натриевые каналы являются мишенью для широкого спектра блокаторов и модификаторов. Тетродотоксин (ТТХ) -паралитический яд, содержащийся в организмах рыб семейства Tetradontidae и тритонов Tarica - блокирует Na+ каналы при действии с наружной стороны клеточной мембраны и подавляет натриевый ток в аксонах кальмара (Nakamura et al., 1965) и миелинезированных аксонах лягушки (Hille, 1968) оставляя калиевый ток неизмененным. Аналогичным действием на каналы обладает сакситоксин (STX), выделенный из

жгутиковых Gonyaulax (Narahashi et al., 1967). Положительно заряженные ТТХ и STX связываются со специфическими рецепторами, находящимися на наружной стороне канала, вблизи устья, с высокой афинностью - для блока достаточно наномолярных концентраций токсинов (Narahashi et al., 1964, Hille, 1992). В экспериментах по регистрации одиночных потенциал-управляемых натриевых каналов, встроенных в бислойные мембраны, установлено, что ТТХ и STX уменьшают вероятность их открытого состояния действуя по механизму быстрого блока. При добавлении с цитоплазматической стороны мембраны оба токсина не имеют эффекта на каналы. (Guo et al., 1987, Hille, 1992). Не все натриевые каналы чувствительны к тетродотоксину. Так, показано, что в процессе эмбрионального развития, в мышцах и нейронах есть фракция Na+ каналов, которые не блокируются ТТХ (Spitzer, 1979, Weiss and Horn, 1986, Lee et al., 1987). Кроме того, ТТХ не блокирует натриевые каналы в организмах видов, синтезирующих токсин (Hille, 1992).

Другая группа агентов, блокирующих потенци ал-упр ав ляемые натриевые каналы, - местные анестетики (МА). Новокаин, лидокаин, тримекаин и другие местные анестетики, широко применяемые в медицинской практике, блокируют возникновение потенциалов действия в нейронах и мышцах (Weidmann, 1955, Taylor, 1959, Hille, 1966) и, таким образом, вызывают обезболивающий эффект. Практически все эти соединения - третичные амины, имеющие, в зависимости от pH, нейтральный или положительный заряд и способные проникать через плазматическую мембрану. С помощью электрофизиологических методов установлено, что рецептор для МА находится, скорее всего, в поре канала между селективным фильтром и воротной структурой (Hille, 1992). Считается, что местные анестетики проникают в пору с цитоплазматической стороны мембраны (в случае когда канал открыт) (Frazier et al., 1970, Narahashi et al., 1970, Strichartz, 1973) или, если канал закрыт, со стороны липидного бислоя (Courtney, 1975). Эта модель

подтверждается данными, свидетельствующими, что фракция каналов, блокированных местными анестетиками, может меняться в зависимости от потенциала мембраны, концентрации ионов натрия в наружной среде а, также, при действии ТТХ (Cahalan and Almers, 1979 a,b).

Помимо блокаторов Na+ каналов, известно большое количество соединений, модулирующих их функции. В зависимости от влияния на каналы эти соединения делятся на три группы: 1) соединения, предотвращающие инактивацию, 2) соединения, стимулирующие активацию и 3) соединения, вызывающие сдвиг потенциал-зависимости активации и инактивации (Hille, 1992).

Инактивационные ворота Na+ канала чрезвычайно чувствительны к действию модификаторов. Внутриклеточная перфузия аксона кальмара проназой - смесью протеолитических ферментов - устраняет инактивацию натриевых токов и увеличивает их амплитуду (Armstrong and Bezanilla, 1973). Аналогичное действие на каналы с цитоплазматической стороны мембраны оказывает широкий спектр соединений, связывающихся с аргинином, тирозином, триптофаном и гистидином (Hille, 1992). Так, например, показано что бромацетамид увеличивает вероятность открытого состояния потенциал-управляемых натриевых каналов в мышечных клетках (Patlak and Horn, 1982). Соединения, устраняющие натриевую инактивацию, являются удобным инструментом, позволяющим получать каналы с высоким уровнем активности и, поэтому, часто применяются в экспериментальной работе.

Еще одна группа модуляторов каналов - токсины скорпионов и морских анемон - короткие полипептиды из 27-70 аминокислот. Связываясь с открытыми каналами, a-токсины скорпионов замедляют их инактивацию a ß-токсины вызывают сдвиг в потенциал-зависимости активации. В обоих случаях натриевые каналы становятся гиперактивными, что приводит к появлению болевых ощущений, сердечной аритмии и параличу (Strihartz et al., 1987). Установлено, что токсины скорпионов и

анемон связываются с каналами с наружной стороны мембраны. Связывание токсинов не препятствует проникновению ионов в пору канала, следовательно, их рецептор локализован отдельно от рецептора ТТХ (Hille 1992). Растворимые в липидах алкалоидные нейротоксины аконитин, батрахотоксин и др. действуют аналогично токсинам скорпионов замедляя или устраняя инактивацию каналов и сдвигая потенциал-зависимость их активации (Albuquerque et al., 1971, Khodorov, 1985, Mozhaeva et al., 1977). Кроме того, эти соединения изменяют элементарную проводимость (Hille, 1992) и селективность каналов (Mozhaeva et al., 1977).

1.3 Молекулярная организация потенциал-управляемых натриевых каналов

Установление молекулярной организации потенциал-управляемых натриевых каналов стало возможным с появлением радиоактивных ТТХ и STX. Впервые белки, специфически связывающиеся с тетродотоксином, были выделены из мембран ольфакторных нейроно