Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Натрий-проводящие каналы миелоидной лейкемии человека К562: биофизические характеристики и функциональная связь с микрофиламентами

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Натрий-проводящие каналы миелоидной лейкемии человека К562: биофизические характеристики и функциональная связь с микрофиламентами"

V. ~ На правах рукописи

со

МАКСИМОВ Антон Владимирович

Натрий-проводящие каналы клеток миелоидной лейкемии человека К562: биофизические характеристики и функциональная связь с микрофиламентами.

03.00.25 - клеточная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург, 1998

Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Ю.А. Негуляев Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение:

доктор биологических наук И.И.Марахова Институт цитологии РАН

доктор биологических наук Б.В.Крылов Институт физиологии им. А.П.Павлова РАН

Санкт-Петербургский Государственный Университет, Биолого-почвенныый факультет

Защита состоится

998 года в_

На заседании Диссертационного совета Д.002.73.01 Института цитологии РАН по адресу:

194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Реферат разослан " к&гЛ^года Ученый секретарь Диссертационного совета

Д-О.Н. [

Л.Н. Писарева

Общая характеристика работы Актуальность проблемы.

Вход ионов натрия (Na+) в цитозоль из наружной среды играет ключевую роль в передаче нервного импульса (Hille, 1992), регуляции водно-солевого баланса (Palmer, 1992), и приводит к запуску ряда сигнальных процессов, сопряженных с изменением активности ферментов и обменников (Basudev et al., 1995), выходом кальция из внутриклеточных депо (Lipp et al., 1994). Пассивный транспорт Na+ по градиенту электрохимического потенциала происходит при участии специализированных белков плазматической мембраны - ионных каналов. В настоящее время известно два семейства ионных каналов, селективных дня натрия - потенциал-управляемые натриевые каналы, экспрессирующиеся, преимущественно, в нервных тканях (Hille, 1992) и амилорид-чуствительные Na+ каналы, обнаруженные в эпителиях (Palmer, 1986), нейронах (Waldmann et al., 1997), мышечных клетках (Van Renterghem et al., 1991), макрофагах (Negulyaev et al., 1994) и лимфоцитах (Bubien et al., 1993). В то время как физиологическое значение и молекулярная организация потенциад-управляемых Na+ каналов достаточно подробно изучены, семейство амилорид-чуствительных каналов быстро расширяется, что порождает массу вопросов о функциях, выполняемых этими каналами в специализированных тканях, взаимосвязи между различиями в молекулярной структуре отдельных представителей семейства и такими их характеристиками как кинетическое поведение, селективность, проводимость и чуствительность к блокирующим агентам и, наконец, механизмах регуляции активности каналов. Исследование биофизических свойств Na+ каналов с использованием

электрофизиологических методов, а также, идентификация вторичных посредников и белков, связывающихся с субъединицами каналов и модулирующих их активность, необходимы для ответа на перечисленные вопросы.

В последние годы возрос интерес к роли примембранного цитоскелета в регуляции транспорта ионов. Взаимодействуя с различными интегральными белками плазматических мембран, в том числе и с ионными каналами, элементы цитоскелета препятствуют их латеральной диффузии, определяя, таким образом, пространственную локализацию в специализированных участках мембраны (Lcvina et al., 1994). Неоднократно было показано что транспорт синтезированных de novo белков из примембранных пулов также зависит от цитоскелета (Garty et al, 1983). Особенно интересными представляются последние результаты, свидетельствующие о функциональной связи между состоянием актиновых микрофиламентов и активностью различных ионных каналов, в частности потенциал-зависимых Na+ каналов (Undrovinas et al., 1995), калиевых и хлорных каналов в бронхиальных эпителиях (Hug et al., 1994), АТР-чуствительных каналов в кардиомиоцитах (Terzic et al., 1996).

Идентификация молекулярной организации и мембранной топологии нескольких субъединиц амилорид-чуствительных Na+ каналов (Canessa et al., 1994, "Waldmaim et al., 1995) создала теоретические предпосылки для детального исследования роли цитоскелета в регуляции белков этого семейства.

Цели и задачи исследования.

Цель настоящей работы заключалась в изучении функциональных свойств натриевых каналов плазматической мембраны клеток хронической миелоидной лейкемии человека К562 и оценке роли актиновых филаментов в регуляции активности этих каналов. Были поставлены следующие задачи:

1) Идентифицировать Na+ каналы плазматической мембраны клеток К562 и охарактеризовать их проводящие и селективные свойства, а также кинетическое поведение.

2) Изучить влияние агентов, модифицирующих сеть микрофиламентов, на активность натриевых каналов.

я

3) Проверить гипотезу о возможности кальций-зависимой регуляции Ыа+ каналов клеток К562 и участия актина в этом процессе.

4) Установить механизмы изменения активности каналов при модификации микрофиламентов.

Научная новизна полученных результатов.

В результате настоящей работы впервые были описаны натриевые каналы клеток хронической миелоидной лейкемии человека К562, охарактеризованы их проводящие свойства, кинетическое поведение и селективность для одновалентных и двухвалентных катионов. С помощью цитохалазина-Д, актина и актин-связывающего белка гельзолина впервые доказан функциональный эффект микрофиламентов на активность №+ каналов, а также, показана роль свободного внутриклеточного кальция в этом процессе. Путем анализа кинетических характеристик каналов вьиснен механизм изменения вероятности их открытого состояния при модификациях актиновой сети.

Теоретическое и практическое значение работы.

Описание характеристик Ыа+ каналов клеток хронической миелоидной лейкемии человека К562, приведенное в работе, несомненно, необходимо для понимания их молекулярной организации и места в филогенетическом, древе семейства потенциал-независимых натриевых каналов. Клетки К562 имеют свойства стволовых клеток-предшественников миелоидного ряда, поэтому результаты, полученные в работе, могут быть полезными для выяснения общих механизмов регуляции натриевых каналов в широком спектре невозбудимых клеток, в частности - в клетках крови. Доказательства существования функциональной связи между активностью натриевых каналов и состоянием микрофиламентов подтверждают участие цитоскелета в регуляции транспорта ионов и, безусловно, представляют теоретический интерес как механизм активации ионных каналов. Наконец, данные о функциональных характеристиках натриевых каналов могут

применяться при разработке и тестировании фармакологических препаратов.

Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ-

Материалы диссертации докладывались на: Конференции молодых физиологов и биохимиков России "Биохимические и биофизические механизмы физиологических функций" (С.-Петербург, 1995), 40 конференции Биофизического общества СИ1А (Балтимор, 1996), XII международном биофизическом конгрессе (Амстердам, 1996), 41 конференции Биофизического общества США (Новый Орлеан, 1997). Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Материалов и методов исследования, Результатов, Обсуждения, Выводов и Списка литературы, содержащего/£23~публикаций. Работа изложена на страницах машинописного текста и иллюстрирована рисунками.

Материалы и методы исследования Электрофизиология

Для регистрации одиночных каналов использовался метод локальной фиксации потенциала (patch-clamp) (Hamill et al., 1981). Токи регистрировались с помощью усилителя, собранного в лаборатории. Пипетки вытягивались в четыре стадии из заготовок стекла С-52 с наружным диаметром 1.4-1.6 мм на вытяжке МЭ-4 и покрывались в районе кончика силиконовой резиной Sylgard для уменьшения шума, связанного с физическими свойствами стекла. Готовые пипетки с диаметром кончика 1-2 им заполнялись соответствующим раствором (см. Растворы) и имели сопротивление 2-10 мОм. Экспериментальная камера с рабочим объемом 0.15 мл крепилась на антивибрационном столике. Непосредственно перед началом работы, в камеру, заполненную наружным натриевым раствором (см. Растворы), помещалось покровное стекло размером 4x4 мм с

прикрепленными клетками. При регистрации токов от изолированного фрагмента мембраны пипетка перемещалась в отсек объемом 20 цл. Оптические наблюдения осуществлялись с помощью инвертированного микроскопа с дифференциальным контрастом. Все эксперименты проводились при температуре 22-24°С. С входной головки преобразователя ток-напряжение (сопротивление обратной связи 20 Юм) сигнал поступал на усилитель и записывался на пленку ЧМ-магнитографа N067. Поддерживаемый потенциал фиксировался с помощью компьютера ДВК. Для фильтрации сигнала использовался регулируемый 4-х полюсный фильтр Бесселя (полоса пропускания - 0.2-1кГц). С магнитографа записи экспериментов вводились через 12-разрядный аналого-цифровой преобразователь в компьютер ДВК, окончательная обработка данных осуществлялась на компьютере РС/АТ-486.

Амплитуды токов через одиночные каналы рассчитывались из амплитудных гистограмм. Уровень активности каналов в патче оценивался по значению вероятности открытого состояния (Ро):

Ро=<1>/№,

где N - число элементарных уровней проводимости <1> - средний ток для заданного временного интервала (рассчитывался из амплитудных гистограмм), 1 - элементарный ток. Отношение проницаемостей каналов для одновалентных катионов рассчитывалось из уравнения Гольдмана-Ходжкина-Катца (НШе, 1992):

Ет=(Я ТЛ;)1 П (Рл [ А+] 0 иЛ3!) [В +] т), где Ег - потенциал реверсии, К - универсальная газовая постоянная, Р -константа Фарадея, Раи - проницаемость дая данного иона и [А(В)+] -концентрация иона в наружном или внутреннем растворе. Для анализа времен жизни в открытом и закрытом состояниях использовался метод пересечения порога по уровню половины амплитуды (Закшапп, КтсЬег 1983). Временные гистограммы с шириной бина 10 миллисекунд строились на

основе записей токов общей продолжительностью более 10 минут и описывались одно- и двухэкспоненциальными функциями для расчета постоянных времени.

Клеточная культура Клетки хронической миелоидной лейкемии человека К562 (Blood, 45:321334, 1975) (Всероссийская коллекция клеточных культур, Институт цитологии РАН) культивировались на среде RPMI-1640, с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1 рг/мл глутамина и антибиотиков (100дг/мл пенициллина, 100ед/мл стрептомицина). Клеточная суспензия содержалась во флаконах Карелли при температуре 37° С, пассажи осуществляли через каждые 72 часа. Для экспериментов клетки высевались на покровные стекла размером 4x4 мм.

Растворы

Наружный раствор в регистрирующей пипетке и экспериментальной камере содержал (мМ): 145NaCl, 2CaCh, IMgCh, lOHEPES/TrisOH. В части контрольных экспериментов Na+ в пипеточном растворе заменяли на Li+. При регистрации токов от интактной клетки (конфигурация cell-attached), после образования гигаомного контакта, наружный раствор заменялся на калиевый, содержащий: 140КС1, 2CaCh, lMgCh, lOHEPES/KOH. Искусственный внутриклеточный раствор содержал: 140КС1, lMgCh, lOHEPES/KOH, 2EGTA, I О 8 М Са2+ . При регистрации от изолированного фрагмента мембраны (конфигурация inside-out), для исключения хлорных токов входящего направления, КС1 во внутриклеточном растворе заменялся на K2SO4. рН всех растворов 7.2-7.3. Цитохалазим-Д и А23187-4Вг растворялись в диметилсульфоксиде (DMSO) до концентраций соответственно 1мг/мл и SOOjjM. Непосредственно перед экспериментами вещества добавлялись в наружный раствор до конечных концентраций 10-20цг/мл цитохалазина-Д и ЮцМ А23187-4Вг. Актин скелетных мышц кролика выделялся по методу Спудига (Spudich, Watt 1971). Очищенный G-

актин в 2 мМ Tris-HCl, рН=7.5, 0.2 мМ СаСЬ, 0.5 мМ АТР использовался в течении 7 дней. Во время эксперимента, для полимеризации, 15рл раствора G-актина добавлялось в камеру с внутриклеточным раствором до финальной концентрации 100-300)л7мл. Гельзолшн был получен от Dr. Hinssen (Университет Билефельда, Германия). Осадок гельзолина в сульфате аммония суспензировали в 10 мМ Tris-HCl, рН=7.5, 0.2 мМ EGTA, диализовали против этого раствора и использовали в течении 7 дней. Для экспериментов гельзолин растворялся во внутриклеточном растворе до концентрации 25 цг/мл.

Результаты

Характеристики натриевых каналов клеток К562

Для изучения натриевых каналов клеток К562 в нативных условиях использовалась конфигурация cell-attached метода локальной фиксации потенциала. В 26 (примерно 26%) из 99 экспериментов, в условиях, когда наружный раствор в регистрирующей пипетке содержал 145мМ NaCl, в диапазоне поддерживаемых потенциалов от +10 до -90 мВ, наблюдались токи входящего направления (рис. 1А). Отделение изолированного фрагмента мембраны и замена аниона С1- во внутреннем растворе на SO42', не приводили к устранению входящих токов или изменению их амплитуды, что доказывает катионную природу носителя заряда. Вольт-амперная характеристика, построенная по данным пяти экспериментов, представлена на рис. 1Б. Амплитуды элементарных токов описаны линейной регрессией первого порядка, коэффициенты которой соответствуют проводимости 11.9+0.5 пСм и потенциалу реверсии 25±2 мВ. Положительные значения потенциала реверсии, а также факт, что натрий является основным катионом в наружном растворе в регистрирующей пипетке, свидетельствуют

20 мВ

0 мВ

. , .. .. , ,,. ^».„^.^^у-уу"*'"«*^»1 -1 0 мВ

400 мсек

мВ

| i | i [ i -100 -75 -50 -25

-1.5 -1

25

I, ЛА

Рис.1. А, токи через Na+ каналы плазматической мембраны клеток К562, зарегистрированные при разных значениях поддерживаемого потенциала (указаны справа у каждой записи) в cell-attached эксперименте. Фильтр 100Гц. Б, Суммарная вольт-амперная характеристика канала, элементарная проводимость 12±0.5 пСм, потенциал реверсии 25+2 мВ (п=5).

о том, что регистрируемые события вызваны входом Ыа+ в клетку через селективные каналы плазматической мембраны. Для более детальной оценки селективности натриевых каналов клеток К562 Ыа+ в наружном растворе заменялся на другие одновалентные и двухвалентные катионы. Эти эксперименты показали, что каналы проницаемы для натрия и лития и непроницаемы для кальция и магния. Отношения проницаемостей натриевых каналов для одновалентных катионов рассчитанные по уравнению Гольдмана-Ходжкина-Катца составили Рт:Ри'.Рк=3:3:1.

Вероятность открытого состояния Ыа+ каналов клеток К562 слабо зависит от потенциала на мембране (рис. 2), что характерно и для других представителей этого семейства. В условиях регистрации от интактной клетки и изолированного фрагмента мембраны Иа+ токи наблюдались без инактивации в широком диапазоне поддерживаемых потенциалов. Однако,

0,20 -, Ро

0.00 —-:-,---,-;-,-,--—-,

-ЬГу -ео -40 -20 0 20

Рис. 2. Зависимость вероятности открытого состояния Ка+ каналов от потенциала на мембране. Показаны данные экспериментов на интактной клетке (И) и изолированном фрагменте мембраны (р).

практически во всех случаях, каналы проявляли низкий уровень активности. Вероятность открытого состояния каналов не превышала 0.07+0.15 (п=18) в cell-attached экспериментах и 0.04±0.06 (п=5) при регистрации от изолированного фрагмента мембраны.

Цитохалазии-Д вызывает активацию Na+ каналов в cell-attached экспериментах.

Цитохалазин-Д (CD) - низкомолекулярное гетероциклическое соединение, способное проникать через плазматическую мембрану и связываться с плюс-концами актиновых фибрилл препятствуя, таким образом, их полимеризации и вызывая постепенное разрушение филаментов (Goddette et al„ 1986). Добавление 20 цг/мл цитохалазина-Д в наружный раствор приводит к активации Na+ каналов в cell-attached экспериментах (рис. ЗА, В). Увеличение вероятности открытого состояния каналов происходило с задержкой в 1-2 минуты с момента добавления CD, причем активность каналов наблюдалась длительное время и не устранялась при удалении цитохалазина-Д из наружного раствора, отделении изолированного фрагмента мембраны и изменении концентрации

А

Контроль

СО

0,0-

60 мим СО

~ я^Г ^'Тгц Т1уд' •' Чвдч'

^ 0,5 -Г Ро

1 ПА

400 мсек

Контроль Змин Сй бОмин.СО

Б

Рис. 3. Активация натриевых каналов, вызванная цитохалазином-Д. А, Записи Иа* токов в контроле (две верхние записи) и через 3 минуты после воздействия 20цг/мл цитохалазина-Д с наружной стороны мембраны клетки (две нижние записи). Потенциал на мембране -30 мВ, фильтр 100 Гц. В, Токи через натриевые каналы после инкубации клеток в 20 цг/мл СИ в течении 60 минут (два элементарных уровня проводимости соответствуют независимым каналам). В, Средние значения вероятностей открытого состояния каналов (Ро) в серии экспериментов в контроле, до добавления СБ (Ро=0.01±0.02, п=5), через три минуты после добавления 20 цг/мл СО (Ро=0.17±0.15, п=5) и при регистрации после инкубации клеток в 20 цг/мл СР в течении 60 минут (Ро=0.43±0.13, п=7)

свободного кальция с цитоплазматической стороны мембранного фрагмента в диапазоне от 10 9 до ¡О 6 М. Подобное влияние цитохалазина-Д на каналы наблюдалось в 7 (21%) экспериментах из 33, в остальных случаях спонтанной активности каналов не было в контроле, после образования гигаомного контакта с клеткой, и цитохалазин-Д также не имел эффекта. Преинкубацияклеток с СО (20 цг/мл) в течении часа также

Контроль

I

-0,5 0,0 0,5

•2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5

I—1 Г Г"

-0,6 0,0

5 секунд

Рис. 4. Влияние экзогенного гельзолика на активность Na+ каналов в inside-out эксперименте. Записи натриевых токов в условиях регистрации от изолированного фрагмента мембраны в нормальных условиях (верхняя запись тока), после добавления 25 цг/мл гельзолина с цитоплазматической стороны мембраны (средняя запись) и после полимеризации глобулярного актина. Фильтр 100 Гц, потенциал на мембране -ЗОмв. Справа показаны соответствующие каждой записи тока амплитудные гистограммы, описанные функцией Гаусса.

приводит к активацчи натриевых каналов, причем вероятность их открытого состояния превышает таковую в контрольных экспериментах и после добавления цитохалазина-Д непосредственно в процессе регистрации (рис. ЗБ, В).

Активация натриевых каналов при модификации микрофиламентов не сопровождается изменением их селективности и проводящих свойств. Как можно видеть из рисунка 8 и таблицы 1, вольт-амперные характеристики канала до и после воздействия CD идентичны.

Экзогенный гельзолин активирует натриевые каналы в inside-out экспериментах

Гельзолин - актин-связывающий белок, способный вызывать фрагментацию микрофиламентов в присутствии микромолярных концентра-

Контроль (рСа=6)

AJUJUL^JiU^A^

Гельзолин (рСа=8)

Гельзолин (рСа = 8)

Отмывка ОСа

Рис. 5. 'Зависимость активации натриевых каналов, вызванной экзогенным гельзолином, от кальция. Потенциал на мембране- -30 мВ, концентрации свободного кальция во внутриклеточном растворе указаны над каждой записью тока.

G-Актин, ОСа

1 пА

1 сек.

ций свободного кальция (Yin 1987). Рисунок 4 иллюстрирует эффект экзогенного геяьзолина при добавлении с цитоплазматической стороны фрагмента мембраны в случае, когда редкие события входящего направления регистрировались в контроле, после образования контакта с клеткой и перехода в конфигурацию inside-out (Ро=0.01±0.02). Добавление 25 цг/мл гельзолина во внутриклеточный раствор приводит к необратимой активации натриевых каналов без измеримого латентного периода. Активация наблюдалась в 14 экспериментах (26%, Ро=0.35+0.07) из 54, причем, в большинстве случаев, регистрировалось несколько уровней проводимости, соответствующих независимым каналам.

Важно отметать, что эффект гельзолина па Na+ каналы зависит от кальция. В 13 экспериментах из 14 увеличение активности каналов при добавлении гельзолина происходило только после повышении концентрации свободного кальция с цитоплазматической стороны мембранного фрагмента с 10 s до КИ М (рис. 5), что хорошо согласуется с данными о кальций-зависимости активности гельзолина. Однако, после активации, удаление гельзолина из внутреннего раствора и понижение концентрации свободного кальция с 10 6 до Ю-9 М не имели эффекта. Последующее добавление в экспериментальную камеру глобулярного

актина (300 рг/мл) который, при увеличении ионной силы среды способен быстро полимеризоваться, практически полностью подавляло активность каналов (Ро=0.07±0.02, п=4). Таким образом, на основании экспериментов с цитохалазином-Д, экзогенным гельзолином и глобулярным актином мы можем заключить что натриевые каналы клеток К562 активируются при деполимеризации примембранного актина и инактивируются при его полимеризации.

Повышение уровня свободного внутриклеточного кальция приводит к активации натриевых каналов в cell-attached экспериментах.

Ионофор А23187-4Вг индуцирует повышение концентрации свободного кальция в цитозоле за счет электронейтрального обмена Са2+ на протоны или магний (Erdahl et al., 1994 ). Добавление 10 рМ А23187-Вг в наружный раствор, омывающий клетку, приводит к активации натриевых каналов в cell-attached экспериментах (рис. 6). Активация Na+ каналов, вызванная А23187-4Вг, наблюдалась в 15 (39%) из 38 стабильных cell-attached патчей (Ро=0.13+0.04, п=12). Развитие токов входящего направления происходило с задержкой в 60±12 секунд (п=12), в то время как калиевые каналы, которые регистрировались в части экспериментов, активировались через 17+9 (п=5) секунд после добавления ионофора в наружный растаор. Удаление А23187-4Вг и отделение изолированного фрагмента не приводили к подавлению натриевых токов. Кроме того, в пяти экспериментах, после удачного перехода в inside-out, активность каналов длительное время (2-5 минут) наблюдалась при регистрации в безкальциевом внутреннем растворе, содержащем 2мМ EGTA (Ро=0.13±0.07, п=5) (Рис. 6Б). Дальнейшее добавление во внутриклеточный раствор 300цг/мл глобулярного актина приводила к подавлению активности натриевых

А23187-4ВГ

Контроль

10 A23167^Br

0 Ca. 2EGTA

1nA '

1 сек.

Рис. 6. Кальциевый ионофор Л23187-4Вг вызывает активацию натриевых каналов в cell-attached эксперимйгтах. А, Непрерывная запись регистрации токов от интактной клетки продолжительностью 40 секунд иллюстрирует эффект повышения уровня свободного внутриклеточного кальция на активность одиночных каналов. Внизу, две развернутые записи показывают активацию кальций-зависимых калиевых (слева, события выходящего направления) и натриевых каналов (справа). Б, Данные другого эксперимента, иллюстрирующие активность Na+ каналов в контроле, после добавления А23187-4Вг и после отделения изолированного фрагмента мембраны и полного удаления кальция из внутриклеточного раствора. Фильтр 100 Гц, потенциал на мембране -40 мВ.

каналов, вызванной А23187-4Вг (Ро-0.04+0.03, п=3), что свидетельствует о вовлечении актина в процесс кальций-зависимой активации Na+ каналов. Этот эффект может быть объяснен активацией эндогенного гельзолина при повышении уровня свободного кальция в цитозоле, что согласуется с ульт-

|№ЮЕ-ОиТ ЭКСПЕРИМЕНТЫ

CELL-ATTACHED ЭКСПЕРИМЕНТЫ

Контроль.рСа=8 + Гельзолин

Контроль.рСа=6- ^

+ Гельзолин + G-Актин

D4

Ш

Ро

"Г' П I ' I 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

Cell-attached контроль

+ А23187-БГ

Inside-out рСа=8

Inside-out 0Ca,2EGTA

+ G-Акгин

Ро

I 1 I U 1 I

0,00 0,05 0,10 0,15 0,200,25

Рис. 7. Суммарный график, иллюстрирующий эффект экзогенного гельзолина, А23187-4Вг и глобулярного актина на вероятность открытого состояния На+ каналов.

-75

-100

I—

• Контроль

□ CD

Т Гельзолин

О А23187-4ВГ

-50

-25

25

ж

-1,0-

-1,5

■ ■ 1 :•• " ИВ

пА

Рис. 8. Вольт-амперные характеристики каналов в нормальных условиях и после активации, вызванной СО, экзогенным гельзолином и А23187-4Вг.

Проводимость

Потенциал реверсии

1

Контроль П.9±0.5 25+2 (п=5)

CD П.6 + 0.7 24+ 3 (п=11)

Гельзолин 11.710.4 24±5(п=14)

А23187-4Вг 11.8+0.7 2416 (п=12)

Таблица 1. Значения проводимостей и потенциалов реверсии Иа+ каналов в нормальных условиях и после активации, вызванной СИ, экзогенным гельзолином и А23187-4Вг.

1.Й

о

т

1500

время жизни в открытом состоянии

0

время жизни в закрытом состоянии

2000

Рве. 9. Гистограммы распределений времен жизни каналов в нормальных условиях и после активации, вызванной экзогенным геяьзолином.

раструктурными данными, свидетельствующими что в макрофагах и тромбоцитах значительная часть гельзолина находится в мембранных фракциях (Hartwig et al., 1989).

Кинетические характеристики Na+ каналов меняются при модификации микрофишнентов.

Для выяснения механизма изменения вероятности открытого состояния каналов при модификации микрофиламентов необходимо проанализировать временные характеристики элементарных натриевых токов. Гистограммы распределений времен жизни каналов, построенные на основе записей контрольных экспериментов, оптимально описываются одноэкспоненциальной функцией с постоянной времени то=40 мсек для времени жизни в отарытом состоянии и двухэкспоненциальной функцией с постоянными времени t3i =80 мсек и т32=627 мсек для времен жизни в закрытом состоянии. Разрушение микрофиламентов приводит к изменению временных характеристик натриевых каналов. Гистограммы распределений времен жизни после активации каналов, индуцированной гельзолином,

описываются двухэкспоненциальными функциями с постоянными времени То!=41 мсек и т0:=417 мсек для времен жизни в открытом состоянии и т31=62 мсек и ъг=457 мсек для времен жизни в закрытом состоянии (Рис. 9). Таким образом, эффект увеличения вероятности открытого состояния вызван изменением времен жизни каналов в открытом и закрытом состояниях.

Выводы

1) С помощью метода локальной фиксации потенциала в плазматической мембране клеток хронической миелоидпой лейкемии человека К562 обнаружены - проводящие каналы, которые характеризуются проводимостью 12 пСм, отношением Рк»:Рк=3:1 и слабой зависимостью вероятности открытого состояния от потенциала. В физиологических условиях эти каналы могут принимать участие в пассивном транспорте натрия в цитозоль.

2) Активность каналов клеток К562 зависит от состояния примембраиного актина - каналы активируются при деполимеризации микрофиламентов и инактивируются при их полимеризации.

3) В физиологических условиях активация каналов может быть вызвана повышением уровня свободного внутриклеточного кальция.

4) Перестройки в системе микрофиламентов приводят к гомеиеиию времен жизни каналов в открытом и закрытом состояниях в то время как их проводимость и селективность остаются неизмененными.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи

1) Негуляев Ю.А., Ведерникова Е.А., Максимов А.В. Альдостерон повышает уровень активности Na+- проводящих каналов в клетках хронической миелоидной лейкемии К562. ДАН РАН, 1996, том. 349, N5, с. 701-703.

2) Negulyaev, Yu.A., Vedemikova Е.А., and Maximov, A.V. Disruption of actin filaments increases the activity of Na-conducting channels in human myeloid leukemia cells, Molecular Biology of Cell, 1996, V7, pp. 1857-1864

3) Negulyaev, Yu.A., Maximov, A.V., Vedemikova E.A., and Katina I.E. Voltage-insensitive Na channels of different selectivity in human leukemic cells. Gen. Physiol. Biophys.,1997, V16, No2, pp 163-173.

4) Maximov A. V., Vedemikova E. A., Hinssen H. , Khaitlina S. Y. & Negulyaev Yu. A. Ca-dependent regulation of Na+- selective channels via actin cytoskeleton modification in leukemia cells. FEBS Letters, 1997, V412, pp 94 -96.

5) Ведерникова E. А., Максимов А. В., Негуляев Ю. А. Функциональные свойства и цито ск еяет-з ав и с и м ая регуляция натриевых каналов в плазматической мембране лейкозных клеток. Цитология, 1997, том 39, N12, стр.1142-1151.

Тезисы докладов

1) Негуляев Ю.А., Ведерникова Е.А., Максимов А.В. Влияние альдостерона на уровень активности натрий-селективных каналов в клетках миелоидной лейкемии человека К562. Цитология, 1996, том 38, N2, стр. 228-229.

2) Максимов А.В., Ведерникова Е.А., Негуляев Ю.А. Состояние актиновых филаментов влияет на активность натрий-проводящих каналов в клетках миелоидной лейкемии человека К562. Цитология, 1996, том 38, N2, стр.221.

3) Negulyaev, Yu.A., Maximov, A.V., and Vedemikova, E.A. Disruption of actin filaments increases the activity of Na-conducting channels in human myeloid leukemia cells. Biophysical Journal, 1996, 70, N2, Part 2, p. A73

4) Maximov, A.V., Vedemikova E.A. and Negulyaev, Yu.A. Actin filaments regulate the activity of Na+-selective channels in human myeloid leukemia cells. Progress in Biophysics & Molecular Biology, 1996, V 65, Suppl. 1, p. 96.

5) Maximov, A.V., Vedemikova, E.A., and Negulyaev, Yu.A. F-Actin network regulates the activiti of Na+-selective channels in human myeloid leukemia cells. The role of plasma gelsolin and intracellular calcium. Biophysical Journal, 1997, 72, N2, Part 2, p. A266

6) Негуляев Ю.А., Максимов A.B., Ведерникова E.A. Состояние актиновых филаментов регулирует активность натриевых каналов в клетках миелоидной лейкемии человека. Второй съезд Биохимического общества Российской Академии Наук. Тезисы докладов ч. I, стр 278-279, Пущино 1997 (в Москве).

7) Negulyaev, Yu.A., Maximov, A.V. & Vedemikova E.A. Calcium-dependent rearangement of actin filaments regulates Na+ channels in leukemia cells. XXXIII International Congress of Physiological Sciences, St. Petersburg, 1997, P002.39 (Abstracts).

8) Vedemikova E.A., Maximov, A.V. & Negulyaev, Yu.A. Two types of Na+ -selective channels in human leukemia cells. XXXIII International Congress of Physiological Sciences, St. Petersburg, 1997, P002.43 (Abstracts).

Лицензия ЛР № 020593 от 7.08.97

Подписано в печать .Объем в п.л.

Тираж </00 . Заказ №

Отпечатано с готового оригинал-макета в Издательстве СПбГТУ 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29