Натриевые каналы в клетках лейкемии человека К562 и лимфомы U937: идентификация и особенности регуляции

Сударикова, Анастасия Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Натриевые каналы в клетках лейкемии человека К562 и лимфомы U937: идентификация и особенности регуляции
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Натриевые каналы в клетках лейкемии человека К562 и лимфомы U937: идентификация и особенности регуляции"

На правах рукописи

СУДАРИКОВА Анастасия Владимировна

НАТРИЕВЫЕ КАНАЛЫ В КЛЕТКАХ ЛЕЙКЕМИИ ЧЕЛОВЕКА К562 И ЛИМФОМЫ Ш37: ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ОСОБЕННОСТИ РЕГУЛЯЦИИ

03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 з ОНТ 2011

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2011

4857312

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт цитологии РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук

Юрий Алексеевич Негуляев

Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Зоя Иринарховна Крутецкая

Санкт-Петербургский государственный университет

доктор биологических наук Ирина Ильинична Марахова

Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Ведущая организация: Институт физиологии им. И.П.Павлова

РАН, Санкт-Петербург

Защита состоится «28» октября 2011 года в 13 часов на заседании Диссертационного совета Д.002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д.4

Сайт института: www.cytspb.rssi.ru

Адрес электронной почты института: celIbio@rnail.cytspb.rssi.ru Факс института (812) 297-03-41

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН Реферат разослан « » сентября 2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук ,,

'Щ^М^ Е.В. Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования.

Транспорт ионов через плазматическую мембрану представляет необходимое условие жизнедеятельности всех клеток. Быстрые изменения входного потока катионов (Na+, Са+2, Mg+:) связаны, в первую очередь, с функционированием ионных каналов. До недавнего времени ионные каналы принято было разделять на лиганд- и потенцлал-управляемые. В настоящее время такая трактовка является весьма упрощенной. В последние десятилетия сформировались представления о семействах потенциал-независимых (non-voltage-gated) ионных каналов клеточных мембран. Актуальной задачей становится молекулярная и функциональная идентификация таких каналов в различных типах клеток. Как вероятные молекулярные корреляты потенциал-независимых катионных каналов рассматриваются белки суиерсемейств TRP (transient receptor potential) и DEG/ENaC (дегенерины/эпителиальные натриевые каналы).

Катионные каналы, характеризующиеся натриевой селективностью и отсутствием потенциал-управляемого воротного (gating) механизма, были обнаружены в клетках различного происхождения и специализации. Потенциал-независимые натриевые каналы были описаны в транспортных эпителиях, а также в гладкомышечных клетках [1], перитонеальных макрофагах [2], клетках карциномы А431 [3] и миелоиднон лейкемии К562 [4, 5]. Кроме того, клетки К562, имеющие свойства мультипотентного предшественника клеток крови, оказались удобной моделью для изучения путей активации каналов в электроневозбудимых клетках [6, 7]. В то же время молекулярная природа данных каналов до сих нор не установлена.

Судя по биофизическим характеристикам, Na-селективные каналы в различных электроневозбудимых клетках, в том числе в клетках К562, близки к каналам семейства DEG/ENaC [8], за исключением чувствительности к диуретику амилориду. Ингибирование ионных токов и каналов амилоридом или его производными традиционно рассматривается как главный критерий, доказывающий их принадлежность к этому семейству. Однако недавно появились сведения о каналах, гомологичных ENaC, но имеющих пониженную чувствительность к амилориду [9, 10]. В отличие от каналов почечного эпителия

идентификация натриевых каналов, обнаруженных в других специализированных тканях и клетках, остается нерешенной проблемой.

Транспорт натрия и регуляция каналов в реабсорбирующем эпителии почки исследуются достаточно давно, однако внутриклеточные механизмы модуляции активности Е№С по-прежнему вызывают много вопросов. Многочисленные дискуссии касаются возможного участия цитоскелета в функционировании эпителиальных каналов Е№аС. В связи с этим интересно отметить, что, как ранее было показано, активность натриевых каналов в клетках К562 критически зависит от состояния примембранного актинового цитоскелета [4-7]. Согласно современным представлениям, для связи плазматической мембраны и актинового цитоскелета существенны богатые холестерином липидные микродомены (рафты). Ряд данных свидетельствует, что ассоциация с микродоменами может быть решающим фактором, определяющим активность интегральных мембранных белков, в том числе ионных каналов [11]. Появились работы, посвященные исследованию возможной связи каналов ЕЫаС с липидными доменами, однако данные весьма противоречивы [12-16]. Поэтому специального внимания заслуживает изучение роли липидного окружения в функционировании потенциал-независимых натриевых каналов.

Цели и задачи исследования.

Цель работы - функциональная и молекулярная идентификация потенциал-независимых натриевых каналов и анализ механизмов их регуляции.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Оценить проницаемость натриевых каналов для двухвалентных катионов (Са+2, М8+2) в широком диапазоне концентраций.

2. Исследовать экспрессию а-, Р-, у-субъединиц ИЕ№С в клетках миелоидной лейкемии человека К562 и лимфомы 11937 методом ОТ-ПЦР.

3. Охарактеризовать чувствительность потенциал-независимых натриевых каналов к амилориду; определить, присутствует ли амилорид-чувствительная компонента в составе интегральных натриевых токов в клетках К562 и Ш37.

4. Исследовать состояние актинового цитоскелета в клетках К562 и 11937 в

различных условиях, в том числе при снижении уровня мембранного холестерина.

5. Выяснить особенности регуляции натриевых каналов и их связи с динамикой актина в клетках с пониженным содержанием холестерина.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В клетках К562 и 17937 экспрессируются потенциал-независимые натриевые каналы, принадлежащие к семейству ЕЫаС.

2. Потенциал-независнмые натриевые каналы в клетках К562 и Ш37 не блокируются амилоридом. Фармакологическая чувствительность, в частности ннгибнрованне амилоридом, по-видимому, не может рассматриваться как необходимый и достаточный аргумент, доказывающий принадлежность каналов к семейству ЭЕО/ЕЫаС.

3. Контролируемая сборкой н разборкой микрофиламентов активация и инактивация является отличительной особенностью регуляции натриевых каналов в клетках К562 и Ш37.

4. Потенциал-независимые натриевые каналы не ассоциированы с богатыми холестерином мембранными микродоменами.

Научная новизна работы.

Впервые получены данные о молекулярной природе потенциал-независимых натриевых каналов, идентифицированных в клетках К562 и Ш37. Показана экспрессия субъединиц эпителиального натриевого канала Е№С в этих клетках. С помощью различных вариантов метода патч-клами детально исследовано действие диуретика амилорида на одиночные каналы и интегральные натриевые токи; установлено отсутствие амилорид-чувствительной компоненты. Впервые показано, что натриевые каналы в клетках К562 непроницаемы для физиологически значимых двухвалентных катионов - кальция и магния в широком диапазоне концентраций. Сделан вывод, что в плазматической мембране клеток К562 и Ш37 функционируют амилорид-нечувствительные каналы ЕЫаС.

Впервые показано, что натриевые каналы в клетках 11937 активируются при действии деструкторов актинового цитоскелета; сборка актина на цитоплазматической стороне мембраны приводит к инактивации каналов.

активации катионных каналов клеточной мембраны в клетках К562 при частичной экстракции мембранного холестерина.

Теоретическое и практическое значение работы.

Молекулярная идентификация потенциал-независимых натриевых каналов способствует пониманию механизмов регуляции каналов семейства Е!\гаС и их связи с цитоскелегом. Выявление амилорнд-нечувствительного натриевого канала Е№С имеет принципиальное значение для анализа транспорта ионов и идентификации каналов в различных типах клеток. Полученные результаты демонстрируют, что блокирование ионных токов амилорндом или его аналогами не может использоваться как исчерпывающий критерий, определяющий принадлежность каналов к семейству ЕЫаС. Результаты, свидетельствующие о связи уровня мембранного холестерина с перестройками актиновой сети и активностью каналов, представляют теоретический интерес для понимания механизмов регуляции транспортных белков. Данные по действию различных агентов, в том числе амилорида, циклодекстрина, цитохалазинов, на функциональные свойства каналов могут быть применены при разработке и тестировании новых лекарственных препаратов. Полученные результаты используются в курсах лекций для студентов факультета медицинской физики и биоинженерии Санкт-Петербургского государственного политехнического университета.

Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 11 работ (3 статьи и 8 тезисов) в отечественных и зарубежных изданиях. Материалы работы доложены и обсуждены на Международном симпозиуме «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия» (Санкт-Петербург, 2004), Межвузовской научно-технической конференции «XXXIII неделя науки СПбГПУ» (Санкт-Петербург, 2004), 10-й Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006), Всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2006), конференциях Британского физиологического общества (Лондон, 2006; Дублин, 2009), на семинарах ИНЦ РАН.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов,

обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 179 ссылок. Диссертация изложена на 106 страницах и иллюстрирована 33 рисунками и 2 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клеточные культуры. Основными объектами исследования служили клетки миелоиднон лейкемии человека К562 и гистиоцитарной лимфомы U937, полученные из Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН). Клетки культивировали на среде RPMI-1640 с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки и 80 мкг/мл гентамицина.

Электрофизиология. С помощью метода локальной фиксации потенциала (патч-кламп) регистрировали ионные токи через одиночные каналы на участке мембраны нативной клетки (конфигурация cell-attached) и в изолированных фрагментах мембран (конфигурации inside-out и outside-out). При отведении сигнала "от целой клетки" (whole-cell) измеряли токи через всю клеточную мембрану. Трансмембранные ионные токи регистрировали с помощью высокоточного измерительного усилителя ЕРС8 (НЕКА, Germany). Сигналы из усилителя в реальном масштабе времени через 12-разрядный аналого-цифровой преобразователь (L-card, Москва) записывали на диск компьютера для последующего анализа. Пипетки изготавливали из стеклянных капилляров на горизонтальной микрокузнице Р-97 (Sutter Instrument, USA). Сопротивление пипеток, заполненных стандартным раствором, составляло около 2-4 МОм (конфигурация whole-cell) и 5-15 МОм в остальных режимах. Мембранный потенциал определяли как потенциал раствора с внутренней стороны мембраны относительно наружного раствора. Для оценки механочувствительности использовали известный способ механической стимуляции участка мембраны -локальное растяжение посредством уменьшения (ДР<0) гидростатического давления в регистрирующей пипетке.

Растворы. Стандартный наружный раствор содержал (мМ): 145 NaCl, 2 СаСЬ, 1 MgCb, 10 HEPES/TrisOH. При отведении cell-attached использовали калиевый внеклеточный раствор, содержащий (мМ): 145 КС1, 2 СаСЬ, 1 MgCI2, 10 HEPES/KOH. Раствор, контактирующий с внутриклеточной стороной мембранного фрагмента, содержал (мМ): 140 KAspartate, 5 NaCl, 2 EGTA, 1 MgCb, 20 HEPES/TrisOH и соответствующее количество СаСЬ (0.176 мМ) для установления

свободной концентрации ионов кальция на уровне 0.01 мкМ (рСа=8). При исследовании проницаемости каналов для двухвалентных катионов использовали наружные растворы с различными концентрациями Mg1+ (Са2+): 90, 20, 10, 2, 1 мМ. Остальные катионы были заменены на непроникающие Tris+ и N-mctiíji-D-глюкамин (NMDG+). pH всех растворов составлял 7.3. Очищенный G-актин, выделенный из скелетных мышц кролика [17], хранили в растворе низкой ионной силы (2 мМ Tris-HCl, 0.1 мМ СаС12, 0.2 мМ АТР и 0.02 % NaN3, рН=7.5) и использовали в течение 5 сут.

Обработка результатов. Для количественной оценки уровня активности каналов в мембранном фрагменте использовали значение вероятности их открытого состояния Р0 = I/Ni, где N - число работающих каналов в патче, I -средний ток для заданного временного интервала, i - средний ток через открытый канал. Амплитуды токов, протекающих через одиночные каналы, рассчитывали из амплитудных гистограмм, описанных функцией Гаусса, или оценивали непосредственно из записей токов. Обработку экспериментальных данных проводили с использованием программных пакетов pCLAMP 10.2 (Axon Instruments Inc., USA), Microcal Origin 6.1 (Microcal Software, USA). Результаты представлены как среднее ± средняя ошибка.

Модификация липндного состава. Для снижения уровня мембранного холестерина клетки инкубировали (1 ч, 37 °С, 5% С02) в среде RPMI-1640 без сыворотки в присутствии 2.5-5.0 мМ метил-р-циклодекстрина (MßCD), циклического олигосахарида, избирательно связывающего стеролы. Контрольными являлись клетки, переведенные на среду, не содержащую сыворотки и MßCD. Снижение уровня холестерина в клетках К562 после обработки MßCD было подтверждено энзиматическим колориметрическим методом.

Флуоресцентная микроскопия. Для оценки состояния актинового цитоскелета применяли стандартные методики фиксации клеток и окраски F-актина с помощью флуоресцентного красителя родамин-фаллоидина (TRITC-phalloidin, 2 мкМ). Для получения изображений использовали конфокальный микроскоп LSM 5 Pascal либо флуоресцентный микроскоп «Carl Zeiss IM 35».

Обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР).

Общую РНК из клеток К562 выделяли с помощью гуанидин-тиоцианатного метода

[18], с небольшими модификациями. Обратную транскрипцию проводили с использованием MMLV-обратной транскриптазы (Силекс, Россия) согласно инструкции фирмы-изготовителя. ПЦР проводили с использованием Hot-taj полпмеразы (Силекс, концентрация 5 ед/мкл), 0.5 мкМ прямых и обратных праймеров и 0.5-2 мкл кДНК. Праймсры для ОТ-ПЦР были синтезированы согласно опубликованным последовательностям [19]. aENaC (ген SCNN1A): прямой 5'-GGGTCTTCCAGATGCTATCG-3', обратный 5'-AAGGACAG-AGACATGGGGTG-3', размер продукта 376 п.н.; pENaC (ген SCNNJB): прямой 5'-AATACTGCAACAACCGGGAC -3', обратный 5'-GATCTCCCCAAACTCGATGA -3', размер продукта 392 п.н.; yENaC (ген SCNN1G): прямой 5'-AGATGGTGGAGAAATGTGGG-3обратный 5'-ATACTGTTGGCTGGGCTCTC-3', размер продукта 367 п.н. Условия амплификации: 94 °С - 9 мин 30 с, затем 38 циклов (94 °С - 30 с, 58 °С - 40 с, 72 °С - 40 с) и 72 °С - 5 мин. Продукты ПЦР электрофоретически разделяли в 6 %-ном нолиакриламидном геле, окрашивали бромистым этидием (0.5 мкг/мл).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Функциональная идентификация потенциал-независнмых натриевых каналов в клетках К562. С помощью различных вариантов метода патч-кламп исследовали функциональные свойства натриевых каналов в плазматической мембране клеток К562. В контрольных условиях унитарные токи измеряли в присутствии натрия (145 мМ Na+) как основного проникающего катиона в растворе с внеклеточной стороны мембраны. На рис. 1 представлен пример высокой фоновой активности натриевых каналов в участке мембраны нативной клетки (cell-attached). Характеристики потенциал-независимых натриевых каналов (проводимость 12-13 пСм, потенциал реверсии 20-25 мВ) сходны с полученными ранее в экспериментах на клетках К562 [4, 6].

Известно, что некоторые представители семейства DEG/ENaC проводят двухвалентные катионы; в частности, каналы ASIC 1а и механочувствительные каналы МЕС-4 проницаемы для ионов Са2+ [20]. Поэтому для функциональной идентификации натриевых каналов необходимы данные об их проницаемости для двухвалентных катионов в широком диапазоне концентраций.

-10 мВ

0,4

0,2

Е, мВ

(

____/ -

-40 -20 /20

-0,2

12.7 пСм

-30 мВ

500 мс

Рис. 1. Активность натриевых каналов в эксперименте на участке мембраны нативной клетки (cell-attached). Записи токов при различных значениях мембранного потенциала (указаны справа около каждой записи) и соответствующая волып-амперная характеристика. Значение проводимости каналов составляет 12.7 пСм.

В экспериментах с заменой ионов во внешнем растворе (конфигурация outside-out) исследовали проницаемость натриевых каналов в клетках К562 для двухвалентных катионов (Са+2, Mgt2). Раствор в пипетке, имитирующий внутриклеточный, содержал 140 мМ KAspartate в качестве основного электролита. Для поддержания тоничности и ионной силы наружных растворов, содержащих 2, 20 мМ MgCb или 10 мМ СаСЬ, остальные катионы были заменены на непроникающие катионы -Tris+ и N-MeTiui-D-niiOKaMHH (NMDG+). Активность натриевых каналов наблюдали в 40 % экспериментов (п=32). На рис. 2 представлен эксперимент (конфигурация outside-out), в котором удалось провести несколько смен раствора с внешней стороны мембраны с последующими отмывками (обратными заменами раствора на контрольный). Показано, что токи, регистрируемые в контрольном Na-содержэщем растворе, обратимо устранялись при замене ионов Na на ионы или Са4~

(п=14) в различных концентрациях (2-20 мМ). Таким образом, натриевые каналы в клетках К562 не проводят двухвалентные катионы в широком диапазоне концентраций.

В клетках К562 помимо натриевых каналов были зарегистрированы катионные каналы, обладающие механочувствительностью и, возможно, также принадлежащие к семейству DEG/ENaC (рис. 3). Выявлена проницаемость механочувствительных каналов для кальция [21] и магния при физиологических концентрациях (Staruschenko, Sudarikova et al., 2006).

контроль отмывка

145мМ NaCI ЮмМСаС!, ^ 145мМ№С| ^ 2 мМ MgCI2 -^- ............

|l пА

500 мс

Рис. 2. Исследование проницаемости натриевых каналов для ионов кальция и магния. Записи токов в контрольном Na-содержащем растворе и при последовательных заменах наружного раствора; эксперимент на изолированном фрагменте мембраны outside-out, поддерживаемый потенциал -40 мВ.

Проведенные эксперименты позволяют на уровне функциональных характеристик четко отделить исследуемые натриевые каналы в клетках К562 от обнаруженных ранее механочувствигельных каналов. На рис. 3 показаны механоакгивируемые токи, переносимые ионами Mg~ .

Суммируя полученные данные, можно сделать вывод о том, что, в отличие от механочувствительных каналов и ряда каналов семейства DEG/ENaC, натриевые каналы в клетках К562 непроницаемы для двухвалентных катионов, причем как при физиологических (I-2 мМ), так и при более высоких концентрациях в растворе с наружной стороны мембраны (10-20 мМ). Судя по таким биофизическим характеристикам, как проводимость, селективность, кинетические свойства, обнаруженные каналы близки к каналам ENaC. Возникает вопрос относительно идентификации этих каналов на молекулярном уровне.

145 мМ NaCI

Рис. 3. Механочувствительные каналы в клетках К562 проводят двухвалентные

_____ "ill_______М -50 мВ ка,ио,1ы- Активация каналов при

| fl(li|i| I механической стимуляции в

Г I Шиш! экспериментах на нашивных

V клетках (cell-attached) (А) в

j 20 мМ МдС12 контрольных условиях (145 мМ ........-50мВ NaC/ в ттетке)- <Б) в

L ~ ' ТОРГ присутствии магния как

I— единственного проникающего

1 с

катиона с наружной стороны мембраны (20 мМ Mg в пипетке).

Исследование экспрессии а-, у-ЬЕ№С в клетках К562. Экспрессию ЬЕЫаС в клетках К562 оценивали методом ОТ-ГТЦР с праймерами, специфичными к генам БСИША (а-субъединица ЬЕЫаС), БСИЫШ ((3-субъединица ЬЕЫаС), БСЫИЮ (у-субъединица ЬЕЫаС). Размеры продуктов амплификации соответствовали расчетным (рис. 4А), а также размерам, полученным на используемых в качестве положительного контроля клетках линии НЕК293-Т, трансфицированных плазмидами, кодирующими три субъединицы ЬЕКаС (рис. 4Б).

500 ц.н. -250 п.н,—

Рис. 4. Экспрессия a-, ß-, у-субъединиц hENaC в клетках К562.

Электрофореграммы продуктов ПЦР, полученных ни кДНК клеток К562(А) и НЕК293-Т (Б) с праймерами, специфичными к субъединицам ENaC. Дорожки: 1 -aENaC (376 п.н.); 2 - ßENaC (392 п.н.); 3 - yENaC (367 пл.); M - маркер длин фрагментов ДНК (О'Gene Ruler, Fermentas, USA).

Как показывают результаты ОТ-ПЦР анализа, в клетках К562 присутствуют a-, ß-, у-субъединицы эпителиального натриевого канала ENaC (рис. 4). Согласно современным представлениям, для формирования функционально активного канала ENaC в клеточной мембране необходимо наличие всех трех субъединиц [8]. Эти данные позволяют ставить вопрос о принадлежности исследуемых натриевых каналов к семейству ENaC.

Оценка чувствительности натриевых каналов к амилориду. Поскольку ОТ-ПЦР-анализ показал, что в клетках К562 экспрессируются три субъединицы ENaC, с помощью метода патч-кламп проверили действие диуретика амилорида на натриевые токи. Ингибирование ионных токов и каналов амилоридом (в субмикромолярных концентрациях) или его производными традиционно рассматривается как главный критерий, доказывающий их принадлежность к

семейству ENaC. Для ответа на вопрос о том, присутствует ли амилорид-чувствительная компонента в составе интегральных токов в клетках К562, провели эксперименты в варианте регистрации токов от всей мембраны клетки (конфигурации whole-cell). Так как известно, что исследуемые натриевые каналы активируются при разборке актинового цитоскелета [4, 6], в части опытов для повышения суммарной активности каналов и амплитуды токов использовали цитохалазин Д (ЦитД). Обнаружили, что добавление амилорида в камеру в концентрациях 0.01 или 0.1 мМ не приводило к существенному изменению тока. Таким образом, на уровне интегральных токов мы не выявили компоненты, которая могла бы отражать активность амилорид-чувствительных натриевых каналов (ENaC) в клетках К562.

В следующих сериях экспериментов мы исследовали влияние амилорида на работу одиночных каналов как в экспериментах на мембранных фрагментах (конфигурация outside-out), так и при отведении от «целой клетки» (конфигурация whole-cell). Как известно, в режиме whole-cell мы регистрируем токи, отражающие активность каналов в мембране всей клетки. При достижении высокоомного контакта (10 ГОм и более) измерительной пипетки и поверхности мембраны в части экспериментов удалось измерить токи через одиночные каналы (рис. 5). Регистрировали активность одиночных каналов до и после аппликации амилорида (0.1 мМ) к внешней поверхности мембраны. Наблюдали, по крайней мере, 4 устойчивых уровня, соответствующих функционированию 4 каналов. Амилорид в концентрациях 0.01 или 0.1 мМ не оказывал действия на амплитуду и кинетику открываний и (или) закрываний каналов. Отсутствие ингибирующего действия амилорида на натриевые токи было также показано в экспериментах на изолированных фрагментах мембран (конфигурация outside-out), что согласуется с предшествующими результатами исследований в лаборатории [4]. Биофизические свойства натриевых каналов после обработки амилоридом (outside-out) были близки к таковым в контроле, а также к полученным в опытах whole-cell: проводимость составляла 12-13 пСм. Важно отметить, что, как видно из записей токов в экспериментах whole-cell, выявляются только натриевые каналы, не обладающие чувствительностью к амилориду (рис. 5).

контрольный раствор

-зо мв Рис- Амилорид-нечувстви-

+ 0.1 мМ амилорид

-30 мВ

тельные натриевые каналы в клетках К562. Регистрация токов в эксперименте от «целой» клетки (whole-cell) при потенциале -30 мВ в контроле, после подачи амилорида и соответствующие вольт-амперные характеристики.

1 с

Е, мВ

-40 -20

20 40

12.7 пСМ -0 4 У

ЛГ

• контроль

* амилорид

,4"

-0,8

Методом ОТ-ПЦР мы установили, что в клетках линии К562 экспрессируются а-, р-, у-субъединицы ENaC (рис. 5). В то же время в электрофизиологических экспериментах мы не наблюдали типичных каналов ENaC, характерным признаком которых является блокирование амилоридом в микромолярных концентрациях. В связи с этим, имеющиеся данные позволяют заключить, что в клетках линии К562 экспрессируется амилорид-нечувствительный канал семейства ENaC.

Идентификация натриевых каналов в клетках U937; связь с динамикой актина. С использованием апробированных экспериментальных подходов исследовали активность натриевых каналов в клетках лимфомы U937, имеющих свойства премоноцитов. В опытах на изолированных фрагментах мембран (конфигурация inside-out) была обнаружена активация натриевых каналов при действии ЦитД, деструктора актиновых филаментов. Типичный эффект ЦитД иллюстрирует рис. 6.

Мы проверили влияние глобулярного (G) актина на активность натриевых каналов, вызванную разрушением F-актина в клетках U937. Как показано на рис. 6, активность натриевых каналов ингибируется через 2-3 мин после добавления G-актина в раствор (140 мМ КС1, 1мМ MgCl2).

до подачи ЦитД

-20 мВ

через 2 мин после ЦитД

-20 мВ

после G-актина

-30 мВ

-40 мВ

0,4 0,2

-60 -40 -20

10.8

I, ПА

Е, мВ

20 40 60

Рис. 6. Активация и инактивация натриевых каналов в эксперименте inside-out на клетках U937. Регистрация токов в контроле; после подачи ЦитД при различных значениях мембранного потенциала; после добавления G-актина (300 мкг/мл) в раствор с цитоплазматической стороны мембранного фрагмента; вольт-амперная характеристика; проводимость 10.8 пСм.

Можно заключить, что инактивация каналов обусловлена полимеризацией актина на цитоплазматической стороне мембраны; аналогичные эффекты наблюдали на клетках К562. Таким образом, активация и инактивация натриевых каналов в клетках U937, как и в клетках К562, коррелирует с разборкой и сборкой актинового цитоскелета.

Влияние амилорида, блокатора каналов ENaC, на интегральную проводимость плазматической мембраны клеток U937 исследовали путем регистрации токов от целой клетки (конфигурация whole-cell). На рис. 7 представлены записи интегральных токов в контрольном растворе до и после действия ЦитД (10 мкг/мл) и затем после аппликации амилорида (0.01 мМ, 0.1 мМ). Активацию тока наблюдали через несколько минут после подачи ЦитД в камеру. Обнаружено, что добавление амилорида в концентрациях 0.01 или 0.1 мМ не приводило к подавлению натриевого тока (рис. 7). Таким образом, проведенные эксперименты свидетельствуют об отсутствии амилорид-чувствительной компоненты интегральных токов в клетках U937.

А I, пА

I, пАГ 5

-80

-60 -40 -20 20

-10

-20

-Д<

— Ц

— о.

-0.

-О"

-30

- до ЦитД

- ЦитД

-15

-NMDGCI

— амилорид

-40

-20

Рис. 7. Тестирование действия амилорида (0.01 мМ, 0.1 мМ) в эксперименте whole-cell на клетках U937. (А) Регистрация интегрального тока в контрольном натриевом растворе (до ЦитД), после подачи ЦитД (10 мкг/мл), последующей аппликации амилорида (0.01 мМ, 0.1 мМ), обратной замены раствора на контрольный (отмывка) и после замены катионов на непроникающие NMDG+. (Б) Данные рис. А после вычитания тока утечки (NMDG) демонстрируют отсутствие амилорид-чувствителъной компоненты.

Кроме того, в опытах whole-cell, т.е. при регистрации токов от «целой клетки», удалось проверить действие амилорида на работу одиночных каналов. На рис. 8 представлены результаты типичного эксперимента; активность каналов регистрировали через 2 мин после подачи ЦитД во внеклеточный раствор. Установлено, что амилорид в концентрациях 0.01 или 0.1 мМ не оказывал влияния на активность натриевых каналов. Таким образом, как регистрация одиночных каналов (рис. 8), так и анализ интегральных токов (рис. 7) демонстрируют, что натриевые каналы в клетках U937 не ингибируются амилоридом. Следовательно, свойства натриевых каналов в клетках U937 близки к обнаруженным ранее в клетках К562.

Экспрессия hENaC в клетках U937 исследована нами методом ОТ-ПЦР с использованием праймеров для а-, (3-, у- субъединиц hENaC. Ha рис. 9 представлены результаты ОТ-ПЦР-анализа, которые показывают, что в клетках U937 экспрессируются а-, (5-, у- субъединицы эпителиального натриевого канала

На основании функциональных характеристик и данных ОТ-ПЦР можно сделать вывод, что натриевые каналы, идентифицированные в клетках Ш37, принадлежат к семейству Е№С, но не блокируются амилоридом.

ENaC.

А контроль

.г I:

0.01 мМ амилорид

0.1 мМ амилорид

HiTWTlJff^

ЧИСЛО 200 число

250 событий событий

200 Ä 150 'Ж л рт\

150 1 1 100

100 50 1LÁ 50 Jill

■20 мВ

-30 мВ

-40 мВ

0 I, пА

°l, пА

1 пА |

200п ЧИСЛО

событий 500 мс

150 100 50

0 I, пА

Рис. 8. Амилорид не блокирует натриевые каналы в клетках U937. (А)

Затки токов (whole-cell) через натриевые каналы, активированные ЦитД (контроль), и после подачи амилорида (0.QI и 0.1 мМ). (Б) Соответствующие амплитудные гистограммы, полученные для потенциала -40 мВ; расстояние между пиками соответствует амплитуде одиночного открывания канала.

М 1 М 2 A4 з

Рис. 9. Экспрессия a-, ß-, у-субъединиц hENaC в клетках U937.

Электрофореграммы продуктов ПЦР, полученных на кДНК клеток U937 с праймерами, специфичными к субъединицам ENaC. Дорожки: 1 - aENaC (376 п.н.). 2 - ßENaC (392 п.н.). 3 - yENaC (367 п.н.). М - маркер длин фрагментов ДНК (О'Gene Ruler, Fermentas, USA).

Следующая часть работы посвящена анализу механизмов регуляции натриевых потенциал-независимых каналов, в частности, роли липидного окружения. Наши данные и результаты предшествующих работ показывают, что активность натриевых каналов в клетках К562 и U937 критически зависит от состояния актинового цитоскелета. Механизмы взаимосвязи каналов и цитоскелета остаются неясными. Есть предположения, что для связи кортикального актина и ионных каналов важное значение могут иметь богатые холестерином липидные микродомены (рафты). Для выяснения физиологических путей модуляции активности натриевых каналов мы исследовали влияние холестерина на ионные токи и актиновый цитоскелет.

Организация актинового цитоскелета в клетках с пониженным содержанием холестерина. С использованием флуоресцентной микроскопии оценили состояние и перестройки актинового цитоскелета в клетках К562 при экстракции холестерина, т.е. в условиях деструкции рафтов. Для частичной экстракции холестерина клетки инкубировали с метил-бета-циклодекстрином (M(5CD, 2.5 или 5 мМ, 37 °С, С02) в среде RPMI, не содержащей сыворотки.

На рис. 10 показаны результаты флуоресцентного окрашивания F-актина в клетках К562 в норме и после снижения уровня мембранного холестерина. В контрольных препаратах при окрашивании родамин-фаллоидином наблюдали типичный для суспензионных клеток кортикальный актиновый слой в виде четкого кольца под мембраной. После обработки MfiCD в клетках К562 обнаружены изменения актиновых элементов цитоскелета, вероятно, отражающие развитие фибриллярной сети (Сударикова и др., 2006).

Об изменении состояния F-актина в клетках К562 с пониженным содержанием холестерина свидетельствуют также изменения механических свойств клетки, оцененные с помощью электрофизиологических подходов. В клетках К562 наблюдали активацию механочувствительных каналов при локальном растяжении (stretch) мембраны (Sudarikova et al, 2006). В опытах cell-attached исследовали свойства механочувствительных каналов в контроле и после инкубации клеток с MPCD (рис. 11).

Интервал {в йлксблвх;

'Л «к т ж КС йктераав ia

Рис. 10. Снижение уровня мембранного холестерина приводит к реорганизации F-актина в клетках К562. Визуализация F-актина (А) в контроле и (Б) после инкубации с MpCD (5 мМ, 60 мин). Окраска родамин-фаллоидином (2 мкМ). Об. 100 х. Справа - профили интенсивности (Pixel Intensity Profile).

В клетках с пониженным уровнем холестерина (обработка M(3CD) обнаружили повышение порога активации и снижение вероятности открытого состояния (Р0) механочувствигельных каналов; проводимость одиночного канала оставалась без изменений (16 пСм) (Morachevskaya, Sudarikova, Negulyaev, 2007). Таким образом, частичная экстракция холестерина приводит к подавлению механозавнсимой активации каналов. Скорее всего, влияние экстракции холестерина связано с нарушением целостности рафтов и обусловлено участием внутриклеточных структур, в первую очередь актинового цитоскелета [22].

Таким образом, результаты исследований механочувствительных каналов в клетках К562 подтверждают, что снижение уровня холестерина приводит к перестройкам актиновой сети, возможно включающим сборку микрофиламентов.

контроль

-40 мВ

мрср

Б 600

500 400 300 200 1 ООО-

Число событий

-1,2 -0.8 -0,4 0,0 0,4 I, пА

1,2 0,8 0,4

■ -мрсэ

▼ -Контроль

800 600 4002000

0,20 0,15 0,10 0,05 0,00

Число событий

-0,8 -0,4 0,0 0,4 I, пА

■к

! п=12

л=9

Контроль М|5СР

Рис. 11. Частичная экстракция холестерина приводит к подавлению активности механочувствительпых каналов (МрСЭ, 2.5 мМ, 60 мин). (А)

Записи токов при потенциале -40 мВ. Стрелками показаны подача и снятие механического стимула: 25 мм рт. ст. в контроле и 70 мм рт. ст. после инкубации клеток с метил-бета-циклодекстрином (МРСЩ (Б) Соответствующие амплитудные гистограммы. (В) Усредненные вольт-амперные характеристики. (Г) Средние значения вероятности открытого состояния (Р„) для потенциала -40мВ.

Активация и инактивация натриевых каналов в клетках с пониженным содержанием холестерина. В параллельных сериях опытов проведено сопоставление свойств натриевых каналов в клетках К562 в контрольных условиях и после инкубации с акцептором стеролов М|ЗСБ. Тестировали также действие деструкторов Р-актина цитохалазинов Б или Д (ЦитД или ЦитБ). На начальном этапе работы было обнаружено, что после длительной инкубации (12-24 ч) клеток в среде без сыворотки активация каналов в ответ на разборку Р-актина отсутствовала. Поэтому эффекты цитохалазина исследовали в экспериментах на контрольных и модифицированных клетках в течение 3^1 ч, избегая более длительного нахождения клеток в бессывороточной среде. Результаты показывают,

что снижение уровня мембранного холестерина не оказывает существенного влияния на характеристики натриевых каналов, как в случае спонтанной активности, так и после активации в ответ на разборку актинового цитоскелета (рис. 12). Во всех сериях экспериментов не было различий в действии ЦитБ или ЦитД. Биофизические характеристики натриевых каналов в модифицированных клетках близки к таковым в контроле и типичны для исследуемых каналов [4, 6]. Так, в опытах на модифицированных клетках средние значения проводимости одиночного канала составляли 12.1 ± 0.6 (cell-attached) и 11.1 ± 0.7 пСм (inside-out); после действия цитохалазина (эксперименты inside-out) значение проводимости составляло 11.6 ± 0.1 пСм. Суммируя результаты, полученные на целых клетках и на мембранных фрагментах, можно сделать вывод, что при пониженном содержании холестерина в клетках К562 сохраняется цитоскелет-зависимый механизм активации натриевых каналов, несмотря на обнаруженные изменения актиновой сети (см. рис. 10). В опытах cell-attached развитие эффекта было несколько замедлено по сравнению с типичной кинетикой для нормальных клеток.

Рис. 12. Активация натриевых каналов при действии цитохалазина Б (ЦитБ, 10 мкг/мл) в контроле и в клетках с пониженным содержанием холестерина (обработка MpCD). (А) Записи токов (inside-out) при потенциале -20 мВ до и через 3 мин после подачи ЦитБ в раствор с цитоплазматической стороны мембраны (Б) Волып-амперные характеристики каналов, активируемых ЦитБ.

А контроль до подачи ЦитБ MpCD

-20 MB

через 3 мин после ЦитБ

-20 мВ

300 мс

Далее мы исследовали влияние О-актина на активность натриевых каналов, вызванную действием цитохалазина в клетках с пониженным содержанием холестерина. При добавлении в экспериментальную камеру О-актина, который, как известно, полимеризуется при повышении ионной силы раствора, наблюдали снижение активности каналов и, соответственно, вероятности открытого состояния (Р0) до нулевого значения (рис. 13).

Процесс инактивации, по-видимому обусловленный сборкой филаментов на цитоплазматической стороне мембраны, развивался в течение 5-6 мин. Как видно (рис. 14), в-актин ингибировал не только индуцированную цитохалазином, но также и спонтанную активность натриевых каналов в клетках К562 (БшЗапкоуа й а!., 2009).

контроль

цд

^ G-актин

j^MlA 300 мс

0,4

0,2

0,0

Контр. ЦЦ G-актин

Рис. 13. Инактивация натриевых токов, индуцироваиных цитохалазином Д (ЦД), при добавлении G-актина. Эксперимент insidc-out на клетках с пониженным содержанием холестерина. Регистрация токов до (контроль) и после подачи ЦД, затем после добавления G-актина (300 мкг/мл) в раствор с цитоплазматической стороны мембранного фрагмента; поддерживаемый потенциал -30 мВ. Справа показаны соответствующие значения вероятности открытого состояния каналов (Ра).

контроль G-актин

Контр. G-актин

Рис. 14. Подавление споптаппой активности натриевых каналов в клетках, модифицированных M0CD, при подаче G-актина. Записи токов в эксперименте inside-out при потенциале -30 мВ в контроле и после добавления G-актина (300 мкг/мл) в растворе с цитоплазматической стороны мембранного фрагмента. Справа показаны соответствующие значения вероятности открытого состояния каналов (Р„).

Таким образом, в модифицированных по липидному составу клетках наблюдается подавление активности натриевых каналов при полимеризации актина. В клетках К562 и U937 сборка филаментов на цитоплазматической стороне мембраны приводит к единообразному эффекту - инактивации натриевых каналов.

Обобщая результаты исследования регуляции натриевых каналов, можно заключить, что в клетках с пониженным содержанием холестерина сохраняется активация и инактивация, контролируемая разборкой и сборкой примембранного актина. Результаты позволяют полагать, что амилорид-нечувствительные натриевые каналы ENaC не ассоциированы с богатыми холестерином мембранными микродоменами.

ВЫВОДЫ

1. В клетках миелоидной лейкемии человека К562 и лимфомы U937 экспрессируются a-, ß-, у-субъединицы hENaC.

2. Потенциал-независимые натриевые каналы непроницаемы для катионов Са+2 и Mg+2' причем как при физиологических, так и при более высоких концентрациях.

3. Активация и инактивация натриевых каналов в клетках U937, как и в клетках К562, коррелирует с разборкой и сборкой актинового цитоскелета.

4. Натриевые каналы в клетках К562 и U937 не блокируются амилоридом, специфическим ингибитором эпителиальных натриевых каналов ENaC. Показано отсутствие амилорид-чувствительной компоненты, как на уровне одиночных каналов, так и на уровне интегрального натриевого тока.

5. Судя по функциональным характеристикам и результатам ОТ-ПЦР-анализа, амилорид-нечувствительные натриевые каналы в плазматической мембране клеток К562 и U937 принадлежат к семейству ENaC.

6. В клетках с пониженным уровнем холестерина наблюдается реорганизация актиновой сети, однако сохраняется основной механизм регуляции натриевых каналов, сопряженный с динамикой примембранного актина.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сударикова А.В., Сырникова С.С., Морачевская Е.А. 2004. Влияет ли уровень холестерола на активацию ионных каналов и состояние актинового цитоскелета в клетках К562? Цитология. 46 (10): 943.

2. Сударикова А.В., Негуляев Ю.А., Морачевская Е.А. 2005. Проницаемость механочувствительных каналов для ионов магния. Сб. материалов межвузовской научно-технической конференции «XXXIII неделя науки СПбГПУ», Санкт-Петербург, 196-198.

3. Staruschenko A.V., Sudarikova A.V. (equal contribution). Negulyaev Y.A., Morachevskaya E.A. 2006. Magnesium permeation through mechanosensitive channels: single-current measurements. Cell Research. 16: 723-730.

4. Sudarikova A.V., Negulyaev Y.A., Morachevskaya E.A. 2006. Cholesterol depletion affects mechanosensitive channel gating coupled with F-actin rearrangement. Proceedings of the Physiological Society, London, 95P-96P.

5. Сударикова A.B., Морачевская E.A., Негуляев Ю.А. 2006. Состояние кортикального актина в клетках К562 и U937 при частичной экстракции холестерина. Цитология. 48 (9): 803-804.

6. Сударикова А.В., Негуляев Ю.А., Морачевская Е.А. 2006. Роль липидного бислоя и кортикального цитоскелета в функционировании ионных каналов в клетках К562. Сб. «Биология-наукаXXIвека», Пущино, 119-120.

7. Morachevskaya Е.А., Sudarikova A.V., Negulyaev Y.A. 2007. Mechanosensitive channel activity and F-actin organization in cholesterol-depleted human leukaemia cells. Cell Biol. Int. 31: 374-381.

8. Sudarikova A., Negulyaev Y.A., Morachevskaya E.A. 2009. Cholesterol depletion does not prevent actin-based activation of non-voltage-gated sodium channels. Abstracts of the Main meeting of the Physiological society, Dublin, 148-149.

9. Сударикова A.B., Чубинский-Надеждин В.И., Негуляев Ю.А., Морачевская Е.А. 2009. Функциональные свойства натриевых каналов в клетках К562 после экстракции холестерина. Цитология. 51 (8): 676-683.

10. Сударикова А.В. 2009. Роль холестерина в регуляции натриевых каналов и нх связи с перестройками цитоскелета в клетках крови. 14-ая ассамблея молодых-ученых и специалистов, Санкт-Петербург, 67-68.

11. Сударикова А.В. 2010. Молекулярная и функциональная организация потенциал-независимых натриевых каналов в клетках крови. 15-ая ассамблея молодых ученых и специалистов, Санкт-Петербург, 101.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Van Renterghem С., Lazdunski М. 1991. Pflugers Arch. 419: 401-408. 2. Negulyaev Yu.A., Vedernikova E.A. 1994. J. Membr. Biol. 138: 37-45. 3. Negulyaev Y.A. et я/. 1994. Biochim. Biophys. Acta. 1194: 171-175. 4. Ведерникова E.A. и др. 1997. Цитология. 39: 1142-1151. 5. Negulyaev Y.A. et al. 1996. Mol. Biol. Cell. 7: 1857-1864. 6. Negulyaev Y.A. et al. 2000. J. Biol. Chem. 275: 40933^40937. 7. Shumilina E. V. et al. 2003. Mol. Biol. Cell. 14: 1709-1716. 8. Kellenherger S„ Schild L. 2002. Physiol. Rev. 82: 735-767. 9. Folkesson H.G. 2008. Am. J. Physiol. 294: 399-400. 10. O'Brodovich H.

et al. 2008. Am. J. Physiol. 294: 401-408. 11. Levitan I. et al. 2010. Subcell. Biochem. 51: 509-549. 12. Hamvell D. et al, 2002. J. Biol. Chem. 277: 9772-9779. 13. Hill W.G. et al. 2002. J. Biol. Chem. 277: 33541-33544. 14. Hill W.G. et al. 2007. J. Biol. Chem. 282 (52): 37402-37411. 15. Shlyansky V.G. et al. 2003. Am. J. Physiol. 284: 182-188. 16. Krueger B. et al. 2009. Cell. Physiol. Biochem. 24: 605-618. 17. Spudich J.A., Watt S. 1971. J. Biol. Chem. 246: 4866-4871. 18. Chomczynski P., Sacchi N. 1987. Anal. Biochem. 162: 156-159. 19. Gamper N. et al., 2000. Pflugers Arch. 441: 281-286. 20. BumchiL. etal. 2004. NatNeurosci. 7: 1337-1344. 21. Staruschenko A.V. et al. 2002. J. Physiol. 541: 81-90. 22. Chubinskiy-Nadezhdm V.I. et al. 2011. Biochem. Biophys. Res. Commun. 412: 80-85.

Подписано в печать 20.09.2011. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 8043Ь.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в типографии Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.:(812)550-40-14 Тел./факс: (812) 297-57-76

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сударикова, Анастасия Владимировна

1 ВВЕДЕНИЕ

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Семейство катионных каналов ОЕв/ЕШС (дегенерины/ 10 эпителиальные натриевые каналы)

2.1.1 Молекулярная организация БЕв/ЕКаС и их топология в 13 мембране

2.2 Эпителиальные натриевые каналы Е№С и роль актинового 15 цитоскелета в их регуляции

2.2.1 Структура и стехиометрия субъединиц Е№С

2.2.2 Биофизические характеристики и фармакологическая 21 чувствительность ЕКаС

2.3 Натриевые каналы в тканях различной специализации

2.3.1 Роль кортикального актина в регуляции натриевых каналов в 29 клетках миелоидной лейкемии К

2.4 Взаимосвязь белков цитоскелета с плазматической мембраной: 32 роль богатых холестерином липидных микродоменов

2.5 Холестерин и его роль в функционировании ионных каналов

2.5.1 Участие холестерина и микродоменов в регуляции каналов ЕМаС

Введение Диссертация по биологии, на тему "Натриевые каналы в клетках лейкемии человека К562 и лимфомы U937: идентификация и особенности регуляции"

Актуальность исследования.

Транспорт ионов через плазматическую мембрану представляет необходимое условие жизнедеятельности всех клеток. Быстрые изменения входного потока катионов (Na+, Са+2, Mg+2) связаны, в первую очередь, с функционированием ионных каналов. До недавнего времени ионные каналы принято было разделять на лиганд- и потенциал-управляемые. В настоящее время такая трактовка является весьма упрощенной. В последние десятилетия сформировались представления о семействах потенциал-независимых (non-voltage-gated) ионных каналов клеточных мембран. Актуальной задачей становится молекулярная и функциональная идентификация таких каналов в различных типах клеток. Как вероятные молекулярные корреляты потенциал-независимых катионных каналов рассматриваются белки суперсемейств TRP (transient receptor potential) и DEG/ENaC (дегенерины/эпителиальные натриевые каналы).

Катионные каналы, характеризующиеся натриевой селективностью и отсутствием потенциал-управляемого воротного (gating) механизма, были обнаружены в клетках различного происхождения и специализации. Потенциал-независимые натриевые каналы были описаны в транспортных эпителиях, а также в гладкомышечных клетках (Van Renterghem, Lazdunski, 1991), перитонеальных макрофагах (Negulyaev, Vedernikova., 1994), клетках карциномы А431 (Negulyaev et al., 1994) и миелоидной лейкемии К562 (Ведерникова и др., 1997; Negulyaev et al., 1996). Кроме того, клетки К562, имеющие свойства мультипотентного предшественника клеток крови, оказались удобной моделью для изучения путей активации каналов в электроневозбудимых ¡тетках (Negulyaev et al., 2000; Shumilina et al., 2003). В то же время молекулярная природа данных каналов до сих пор не установлена.

Судя по биофизическим характеристикам, Na-селективные каналы в различных электроневозбудимых клетках, в том числе в клетках К562, близки к каналам семейства DEG/ENaC (Kellenberger, Shild, 2002), за исключением чувствительности к диуретику амилориду. Ингибирование ионных токов и каналов амилоридом или его производными традиционно рассматривается как главный критерий, доказывающий их принадлежность к этому семейству. Однако недавно появились сведения о каналах, гомологичных Е№С, но имеющих пониженную чувствительность к амилориду (РоІкеББОп, 2008; О'ВгосіоуісЬ еі-аі., 2008). В отличие от каналов почечного эпителия идентификация натриевых каналов, обнаруженных в других специализированных тканях и клетках, остается нерешенной проблемой.

Транспорт натрия и регуляция каналов в реабсорбирующем эпителии почки исследуются достаточно давно, однако внутриклеточные механизмы модуляции активности ЕИаС по-прежнему вызывают много вопросов. Многочисленные дискуссии касаются возможного участия цитоскелета в функционировании эпителиальных каналов Е№С. В связи с этим интересно отметить, что, как ранее было показано, активность натриевых каналов в клетках К562 критически зависит от состояния примембранного актинового цитоскелета (Negulyaev еі аі., 1996; Ведерникова и др., 1997; 81іиті1іпа еі аі., 2003). Согласно современным представлениям, для связи плазматической мембраны и актинового цитоскелета существенны богатые холестерином липидные микродомены (рафты). Ряд данных свидетельствует, что ассоциация с микродоменами может быть решающим фактором, определяющим активность интегральных мембранных белков, в том числе ионных каналов (Ьеуіїап еі аі., 2010). Появились работы, посвященные исследованию возможной связи каналов ЕЫаС с липидными доменами, однако данные весьма противоречивы (Нап\уе11 еі аі., 2002; НІН еі аі, 2002, 2007; ЗЫуопэку еі аі, 2003, Кп^ег сі аі., 2009). Поэтому специального внимания заслуживает изучение роли липидного окружения в функционировании потенциал-независимых натриевых каналов.

Цели и задачи исследования.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Оценить проницаемость натриевых каналов для двухвалентных катионов (Са , М^ ) в широком диапазоне концентраций.

2. Исследовать экспрессию а-, 0-, у-субъединиц ИЕЫаС в клетках миелоидной лейкемии человека К562 и лимфомы Ш37 методом ОТ-ПЦР.

4. Исследовать состояние актинового цитоскелета в клетках К562 и Ш37 в различных условиях, в том числе при снижении уровня мембранного холестерина.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В клетках К562 и \J937 экспрессируются потенциал-независимые натриевые каналы, принадлежащие к семейству ЕЫаС.

2. Потенциал-независимые натриевые каналы в клетках К562 и Ш37 не блокируются амилоридом. Фармакологическая чувствительность, в частности ингибирование амилоридом, по-видимому, не может рассматриваться как необходимый и достаточный аргумент, доказывающий принадлежность каналов к семейству ОЕС/Е№С.

3. Контролируемая сборкой и разборкой микрофиламентов активация и инактивация является отличительной особенностью регуляции натриевых каналов в клетках К562 и Ш37.

Научная новизна работы.

Впервые получены данные о молекулярной природе потенциал-независимых натриевых каналов, идентифицированных в клетках К562 и Ш37. Показана экспрессия субъединиц эпителиального натриевого канала ЕИаС в этих клетках. С помощью различных вариантов метода патч-кламп детально исследовано действие диуретика амилорида на одиночные каналы и интегральные натриевые токи; установлено отсутствие амилорид-чувствительной компоненты. Впервые показано, что натриевые каналы в клетках К562 непроницаемы для физиологически значимых двухвалентных катионов - кальция и магния в широком диапазоне концентраций. Сделан вывод, что в плазматической мембране клеток К562 и 11937 функционируют амилорид-нечувствительные каналы Е№С.

Впервые показано, что натриевые каналы в клетках Ш37 активируются при действии деструкторов актинового цитоскелета; сборка актина на цитоплазматической стороне мембраны приводит к инактивации каналов.

Впервые выявлены особенности поведения натриевых каналов в зависимости от содержания холестерина, обязательного липидного компонента клеточных мембран. Обнаружена реорганизация Р-актина и ингибирование механозависимой активации катионных каналов клеточной мембраны в клетках К562 при частичной экстракции мембранного холестерина.

Теоретическое и практическое значение работы.

Молекулярная идентификация потенциал-независимых натриевых каналов способствует пониманию механизмов регуляции каналов семейства Е№С и их связи с цитоскелетом. Выявление амилорид-нечувствительного натриевого канала ЕЫаС, имеет принципиальное значение для анализа транспорта ионов и идентификации каналов в различных типах клеток. Полученные результаты демонстрируют, что блокирование ионных токов амилоридом или его аналогами не может использоваться как исчерпывающий критерий, определяющий принадлежность каналов к семейству ЕЫаС. Результаты, свидетельствующие о связи уровня мембранного холестерина с перестройками актиновой сети и активностью каналов, представляют теоретический интерес для понимания механизмов регуляции транспортных белков. Данные по действию различных агентов, в том числе амилорида, циклодекстрина, цитохалазинов, на функциональные свойства каналов могут быть применены при разработке и тестировании новых лекарственных препаратов. Полученные результаты используются в курсах лекций для студентов факультета медицинской физики и биоинженерии Санкт-Петербургского государственного политехнического университета.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Сударикова, Анастасия Владимировна

ВЫВОДЫ

1. В клетках миелоидной лейкемии человека К562 и лимфомы Ш37 экспрессируются а-, Р-, у-субъединицы hENaC.

2. Потенциал-независимые натриевые каналы непроницаемы для катионов +2 +2

Са и Mg , причем как при физиологических, так и при более высоких концентрациях.

3. Активация и инактивация натриевых каналов в клетках 11937, как и в клетках К562, коррелирует с разборкой и сборкой актинового цитоскелета.

4. Натриевые каналы в клетках К562 и 11937 не блокируются амилоридом, специфическим ингибитором эпителиальных натриевых каналов ЕЫаС. Показано отсутствие амилорид-чувствительной компоненты, как на уровне одиночных каналов, так и на уровне интегрального натриевого тока.

5. Судя по функциональным характеристикам и результатам ОТ-ПЦР-анализа, амилор ид-нечувствительные натриевые каналы в плазматической мембране клеток К562 и ІІ937 принадлежат к семейству ЕЫаС.

Судя по нашим данным, свойства и основные пуш активации потенциал-независимых натриевых каналов в клетках лимфомы U937 близки к таковым в клеп<ах К562. Наши выводы о молекулярной природе натриевых каналов согласуются с данными японских авторов (Mirshahi М., Mirshahi S., 2000), показавшими экспрессию а-субъединицы ENaC в различных клеточных линиях лейкемии человека, в том числе и в U937. Остается неясным, как трактовать результаты работы Гампера и соавторов на клетках U937, в которой сообщалось о натриевых каналах, по некоторым свойствам схожих с эпителиальными каналами ENaC (Gamper et al., 2000). Интегральные токи блокировались амилоридом в микромолярном диапазоне концентраций, в то же время па уровне одиночных каналов показано ишибирование токов только при высокой концентрации амилорида - 100 мкМ. Поскольку авторы не обнаружили экспрессии а- и ß-субъедипиц ENaC, было сделано заключение о том, что в клетках U937, а возможно и в других клетках крови, функционируют натриевые каналы, отличные от ENaC. Проведенный нами 01-ПЦР анализ субъединиц ENaC свидетельствует о довольно низком уровне экспрессии каналов в клетках U937, что может объяснить данные авторов. По нашему мнению, имеющиеся данные согласуются с выводом о том, что амилорид-нечувствительные натриевые каналы принадлежат к семейству ENaC.

Как показано ранее и подтверждено в наших исследованиях активация и инактивация натриевых каналов в клетках К562 контролируется процессами разборки и сборки примембранного цитоскелета. В нашей работе впервые показана активация натриевых каналов в клетках U937 (проводимость 11-12 пСм) при разборке цитоскелета (при действии деструктора актиновых филаментов ЦитД, 10 мкг/мл). Добавление к цитоплазматической стороне мембраны (конфигурация inside-out) G-актина, который полимеризуется при повышении ионной силы раствора, приводило к инактивации каналов. Таким образом, основные пути регуляции потенциал-независимых натриевых каналов в клетках U937 близки к механизмам, исследованным ранее в клетках К562.

В целом, наблюдаемый феномен роста активности натриевых каналов клеток К562 и U937 при действии цитохалазина близок к аналогичным эффектам, описанным для натриевых каналов апикальных мембран почечного эпителия ENaC (Cantiello et al., 1991; Prat et al., 1993; Karpushev et al., 2010). Однако, несмотря на обилие данных, полученных за последние десятилетия (см. Обзор литературы), механизмы регуляции активности каналов ENaC через актиновый цитоскелет остаются неясными. В частности, предполагается прямое связывание F-актина с мембраной, что маловероятно. В связи с этим развивается гипотеза «коротких филаментов» (рис. 32), предложенная ранее Кантиелло и соавторами. Дальнейшие исследования возможной роли линкерпых белков (например, кортактина) пока не привели к появлению логичной модели регуляции канала (см. Ilatovskaya et al., 2011). Поскольку показано, что исследуемые натриевые каналы в клетках К562 и U937 принадлежат к семейству ENaC, можно предложить конкретный механизм участия системы микрофиламеитов в регуляции транспорта натрия через каналы ENaC. Активация (открывание) натриевых каналов происходит при разборке кортикального цитоскелета, а сборка актина приводит к инактивации (закрыванию) каналов (рис. 33). Доказательства в пользу такого механизма регуляции каналов ENaC могли бы быть получены в экспериментах па мембранных фрагментах (метод патч-кламп) с использованием G-актина. Такой подход мы использовали в нашей работе на клетках К562 и U937 (см. Результаты, рис. 19, 30, 31). При этом надо отметить, что вопросы о линкерпых белках, обеспечивающих структурно-функциональную связь канала с микрофиламентами, остаются открытыми.

Actin Regulatory Protein

F-actin

Cytoplasma

Apical

Рис. 32. Гипотетическая модель активации эпителиальных натриевых каналов ENaC посредством коротких филаментов (по Mazzochi, Beños and Smith, 2006). (А) Канал ENaC в плазматической мембране не ассоциирован с актином. (В) При формировании коротких актиновых филаментов происходит их связывание с а-субъединицей ENaC, что приводит к активации каналов и увеличению входа натрия в клетку. (С) Повышении внутриклеточной концентрации натрия влияет на электростатическое взаимодействие актина с а-субъединицей ENaC, что приводит к их диссоциации.

Na+

G-актин

Рис. 33. Предполагаемая модель активации и инактивации натриевых каналов при разборке и сборке микрофиламентов.

Результаты, полученные на клетках К562 ранее, позволяют полагать, что реорганизация примембранного цитоскелета с участием актин-связывающих белков - необходимое промежуточное звено, опосредующее влияние на активность каналов ряда физиологически значимых вне- и внутриклеточных факторов, таких как двухвалентные катионы и ГТФ-связывающие белки.

Заключительная часть экспериментальной работы была направлена на выявление возможной роли мембранного холестерина и структуры бислоя в регуляции потенциал-независимых натриевых каналов в клетках лейкемии человека К562. Функционирование каналов анализировали после частичной экстракции холестерина с использованием циклического олигосахарида метил-бета-циклодекстрина (MpCD), избирательно связывающего стеролы в стехиометрическом отношении 2:1 (Christian et al., 1997; Zidovetzki, Levitan, 2007). Обработка клеток MpCD является наиболее эффективным и адекватным методом для модификации стеролыюго состава мембран. Эффективность экстракции холестерина с помощью MpCD была подтверждена для клеток различных типов (Zidovetzki, Levitan, 2007), в том числе и для клеток К562. Проведенные в нашей работе измерения уровня холестерина в клетках К562 в контроле и после частичной экстракции метил-бета-циклодекстрином согласуются с данными Маннечеза и соавторов (Mannechez et al., 2005)

В наших исследованиях регистрировали электрическую активность с использованием двух основных вариантов метода патч-кламп - cell-attached и inside-out. В параллельных сериях опытов проведено сопоставление свойств каналов в клетках К562 в контрольных^условиях, после инкубации с акцептором стеролов MpCD, а также после действия ЦитБ или ЦитД. Результаты показывают, что снижение уровня мембранного холестерина не оказывает существенного влияния на характеристики натриевых каналов, как в случае спонтанной активности, так и после активации, вызванной разборкой кортикального цитоскелета. Проводимость каналов во всех сериях опытов составляла около 11-12 пСм, что является одним из характеристических признаков исследуемых каналов (Ведерникова и др., 1997; Negulyaev et al, 2000). Судя по результатам нашей работы, потенциал-независимые натриевые каналы в клетках К562, А431, U937, макрофогах принадлежат к семейству ENaC (Ведерникова и др., 1999; Kleyman et участки служат так называемыми фокальными точками (focal points) для прикрепления микрофиламентов к цитоплазматической поверхности мембраны (Nebl et. al., 2002). Обоснованием служили, в частности, данные о том, что экстракция холестерина и предполагаемая деструкция рафтов приводит к структурному разобщению белков цитоскелета и мембраны (Harder, Simons, 1999). Эта распространенная точка зрения рассматривалась нами в качестве рабочей гипотезы на начальном этапе исследований. Однако, как показали проведенные эксперименты, реальная картина не соответствует столь упрощенной трактовке. Анализ литературы и собственных результатов позволяет полагать, что экстракция холестерина действительно инициирует перестройки актиновой сети, но их характер может быть различен. В пашей работе было обнаружено подавление активности механочувствительных катионных каналов в клетках К562 при снижении уровня мембранного холестерина (Morachevskaya, Sudarikova et al., 2007), Данные флуоресцентной микроскопии подтверждают предположение, что эффект обусловлен реорганизацией F-актина, включающей сборку филаментов, причем не только в кортикальной области. Что касается примембранного цитоскелета, то, судя по нашим электрофизиологичеким данным для модифицированных клеток, процессы реорганизации актина преимущественно локализованы в зоне рафтов и в значительно меньшей степени затрагивают межрафговые участки, включающие натриевые каналы.

При объяснении механизмов, обеспечивающих связь актинового цитоскелета с плазматической мембраной в клетках крови, как правило, предполагается участие линкерных белков семейства ERM (Denker, Barber, 2002). Менее известны потенциальные участники среди интегральных мембранных белков, особенно в миелоидных клетках. Как уже отмечалось, первоначально эта функция приписывалась богатым холестерином липидным микродоменам и входящим в их состав белкам (Nebl et al., 2002). Придерживаясь данной точки зрения, следовало бы ожидать, что при нарушении целостности рафтов нарушается и сопряжение мембранных белков с примембранным актином. Наши данные, напротив, демонстрируют функциональную связь актиновых элементов цитоскелета с ионными каналами, сохраняющуюся при нарушении целостности рафтов. Полученные в работе результаты позволяют полагать, что белки, формирующие натрий-проводящие каналы в клетках К562, могут быть компонентами заякоривающих структур актинового цитоскелета. Подобная гипотеза была предложена для Ыа+/Н+-обменника (Denker et al., 2000). Таким образом, нельзя исключить, что основная функция этих белков связана с организацией и динамикой актинового цитоскелета в нативных клетках, а ионофорные свойства являются вторичными или сопутствующими. В связи с этим надо отметить, что в настоящее время обсуждаются так называемые «неканальные» функции (non-channel function) каналообразующих белков в нативных клетках.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сударикова, Анастасия Владимировна, Санкт-Петербург

1. Adams С.М., Anderson M.G., Motto D.G., Price M.P., Johnson W.A., Wolsh M.J. 1998. Ripped pocket and pickpocket, novel Drosophila DEG/ENaC subunits expressed in early development and it mechanosensory neurons. J. Cell Biol. 140: 143-152.

2. Ahn Y.J., Brooker D.R., Kosari F. 1999. Cloning and functional expression of the mouse epithelial sodium channel. Am. J. Physiol. 277: 121-129.

3. Albert A.P., Woollhead A.M., Mace O.J., Baines D.L. 2008. AICAR decreases the activity of two distinct amiloride-sensitive Na+-permeable channels in H441 human lung epithelial cell monolayers. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 295: L837-L848.

4. Alonso M.A., Millón J. 2001. The role of lipid rafts in signalling and membrane trafficking in T lymphocytes. J. Cell Sci. 114: 3957-3965.

5. Alvarez de la Rosa D., Canessa C.M., Fyfe G.K., Zhang P. 2000. Structure and regulation of amiloride-sensitive sodium channels. Annu. Rev. Physiol. 62: 573-94.

6. Anantharam A., Palmer L.G. 2007. Determination of epithelial Na+ channel subunit stoichiometry from single-channel conductances. J. Gen. Physiol 130: 55-70.

7. Babinski K., Catarsi S., Biagini G., Seguela P. 2000. Mammalian ASIC2a and ASIC3• • • 3+subunits co-assemble into heteromeric proton- gated channels sensitive to GdJ\ J. Biol. Chem. 275:28519-28525.

8. Balut C., Steels P., Radu M., Ameloot M., Van Driessche W., Jans D. 2006. Membrane cholesterol extraction decreases Na+ transport in A6 renal epithelia. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 290: C87-C94.

9. Barrantes F.J. 1993. Structural-functional correlates of the nicotinic acetylcholine receptor and its lipid microenvironment. FASEB J. 7: 1460-1467.

10. Bassler E.L., Ngo-Anh T.J., Geisler H.S., Ruppersberg J.P., Grunder S. 2001. Molecular and functional characterization of acid-sensing ion channel (ASIC) lb. J. Biol. Chem. 276: 33782-33787.

11. Benos D.J., Awayda M.S., Ismailov /./, Johnson J.P. 1995. Structure and function of amiloride-sensitive Na+ channels. J. Membr. Biol. 143: 1-18.

12. Benos D.J., Stanton B.A. 1999. Functional domains within the degenerin/epithelial sodium channel (Deg/ENaC) superfamily of ion channels. J. Physiol. 520: 633-644.

13. Berdiev B.K., PratA.G., Cantiello H.F., Ausiello D.A., Fuller C.M., Jovov B., Benos D.J., Ismailov I.I. 1996. Regulation of epithelial sodium channels by short actin filaments. J. Biol. Chem. 271: 17704-17710.

14. Bhalla V., Hallows K.R. 2008. Mechanisms of ENaC regulation and clinical implications. J. Am. Soc. Nephrol. 19: 1845-1854.

15. Bianchi L., Driscoll M. 2002. Protons at the Gate: DEG/ENaC Ion Channels Help Us Feel and Remember. Neuron. 34: 337-340.

16. Bock J., Szabo /., Gamper N., Adams C, Gulbins E. 2003. Ceramide inhibits the potassium channel Kvl.3 by the formation of membrane platforms. Biochem. Biophys. Res. Commun. 305: 890-897.

17. Bolotina V, Omelyanenko V, Heyes B, Ryan U, Bregestovski P. 1989. Variations of membrane cholesterol alter the kinetics of Ca dependent K channels and membrane fluidity in vascular smooth muscle cells. Pflugers Arch. 415: 262—268.

18. Botero-Velez M., Curtis J. J., Warnock D. G. 1994. Brief Report: Liddle's syndrome revisited a disorder of sodium reabsorption in the distal tubule. New Engl. J. Mad. 330: 178-181.

19. Brown D.A. 2006. Lipid rafts, detergent-resistant membranes, and raft targeting signals. Am. J. Physiol. 21: 430-439.

20. Brown D.A., London E. 2000. Structure and function of sphingolipid- and cholesterol-rich membrane rafts. J. Biol. Chem. 275: 17221-17224.

21. Brownlow S.L., Sage S.O. 2005. Transient receptor potential protein subunit assembly and membrane distribution in human platelets. Thromb. Haemost. 94: 839-845.

22. Bubien J. K., Warnock D. G. 1993. Amiloride-sensitive sodium conductance in human B lymphoid cells. Am. J. Physiol. 265: 1175-1183.

23. Bubien J.K., Jope R.S., Warnock D.G. 1994. G-proteins modulate amiloride-sensitive sodium channels. J. Biol. Chem. 269: 17780-17783.

24. Byfield F.J., Aranda-Espinoza H., Romanenko V.G., Rothblat G.H., Levitan I. 2004. Cholesterol depletion increases membrane stiffness of aortic endothelial cells. Biophys. J. 87: 3336-3343.

25. Canessa C.M., Horisberger J.D., Rossier B.C. 1993. Epithelial sodium channel related to proteins involved in neurodegeneration. Nature. 361: 467-470.

26. Canessa CM., Merillat A.M., Rossier B.C. 1994. Membrane topology of the epithelial sodium channel in intact cells. Am. J. Physiol. 267: 1682-1690.

27. Cantiello H.F., Prat A.G., Bonventre J.V., Cunningham C.C., Hartwig J.H., Ausiello D.A. 1993. Actin-binding protein contributes to cell volume regulatory ion channel activation in melanoma cells. J. Biol. Chem. 268: 4596-4599.

28. Cantiello H.F., Stow J.L., Prat A.G., Ausiello D.A. 1991. Actin filaments regulate epithelial Na+ channel activity. Am. J. Physiol. 261: 882-888.

29. Chang H.M., Reitstetter R., Mason R.P., Gruener R. 1995. Attenuation of channel kinetics and conductance by cholesterol: an interpretation using structural stress as a unifying concept. J. Membr. Biol. 143: 51-63.

30. Chen S.Y., Bhargava A., Mastroberardino L., Meijer O.C., Wang J., Buse P., Firestone G.L., Verrey F., Pearce D. 1999. Epithelial sodium channel regulated by aldosterone-induced protein sgk. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96: 2514-2519.

31. Chomczynski P., Sacchi N., 1987. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162: 156-159.

32. Christian A.E., Haynes M.P., Phillips M.C., Rothblat G.H. 1997. Use of cyclodextrins for manipulating cellular cholesterol content. J. Lipid Res. 38: 2264-2272.

33. Chubinskiy-Nadezhdin V.I., Negulyaev Y.A., Morachevskaya E.A. 2011. Cholesterol depletion-induced inhibition of stretch-activated channels is mediated via actin rearrangement. Biochem. Biophys. Res. Commun. 412: 80-85.

34. Collier D.M., Snyder P.M., 2011. Identification of ENaC inter-subunit CI" inhibitory residues suggests a trimeric channel architecture. J. Biol. Chem. 286: 6027-6032.

35. Cooper J.A. 1987. Effects of cytochalasin and phalloidin on actin. J. Cell Biol. 105: 1473-1478.

36. Copeland S.J., Berdiev B.K., Ji H.-L., Lockhart J., Parker S., Fuller C.M., Benos D.J. 2001. Region in the carboxy terminus of a-(3-ENaC involved in gating and functional effect of actin. Am. J. Physiol. 281: C231-C240.

37. De Weille J., Bassilana F., Lazdunski M., Waldmann R. 1998. Identification, functional expression and chromosomal localization of a sustained human proton-gated cation channel. FEBS Lett. 433:257-260.

38. Denker S.P., Barber D.L. 2002. Ion transport proteins anchor and regulate the cytoskeleton. Curr. Opin. Cell Biol. 14: 214-220.

39. Denker S.P., Huang D.C., Orlowski J., Furthmayr H., Barber D.L. 2000. Direct binding of the Na-H exchanger NHE1 to ERM proteins regulates the cortical cytoskeleton and cell shape independently of H+ translocation. Mol. Cell. 6: 1425-1436.

40. Driscoll M.t Chalfie M. 1991. The mec-4 gene is a member of a family of C. elegans genes that can mutate to induce neuronal degeneration. Nature. 349: 588-593.

41. Edidin M. 2003. The state of lipid rafts: from model membranes to cells. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32: 257-283.

42. Eskcindari S., Snyder P. M., Kreman M., Zampighi G. A., Welsh M. J., Wright E. M. 1999. Number of subunits compresing the epithelial sodium channel. J. Biol. Chem. 274:27281-27286.

43. Folkesson H.G. 2008. Variations in ENaC subunit composition may determine amiloride sensivity and P-adrenergic stimulation of lung fluid absorption. Am. J. Physiol. 294: 399-400.

44. Foller M., Kasinathan R.S., Duranton C., Wieder T., Huber S.M., Lang F. 2006. PGE2-induced apoptotic cell death in K562 human leukaemia cells. Cell Physiol. Biochem. 17:201-210.

45. Gamper N.,Iiuber S.M., Badawi K., Lang F. 2000. Cell volume-sensitive sodium channels upregulated by glucocorticoids in U937 macrophages. Pflugers Arch. 441: 281-286.

46. Garty H. 1994. Molecular properties of epithelial amiloride-blockable Na+ channels. FASEB J. 8: 522-528.

47. Garty H., Benos D.J. 1988. Characteristics and regulatory mechanisms of the amiloride-blockable Na+ channel. Physiol. Rev. 68: 309-373.

48. Garty H., Palmer L.G. 1997. Epithelial sodium channel: functions, structure, regulation. Physiol. Rev. 77: 359-396.

49. Goddette D.W., Frieden C. 1987. The kinetics of cytochalasin D binding to monomeric actin. J. Biol. Chem. 261: 15970-15973.

50. Gonzales E.B., Kawate Т., Gouaux E. 2009. Pore architecture and ion sites in acid-sensing ion channels and P2X receptors. Nature. 460: 599-604.

51. Haerteis S., Krueger В., Korbmacher C., Rauh R. 2009. The 5-subunit of the epithelial sodium channel (ENaC) enhances channel activity and alters proteolytic ENaC activation . J. Biol. Chem. 284: 29024-29040.

52. Hanwell D., Ishikawa Т., Saleki R., Rotin D. 2002. Trafficking and cell surface stability of the epithelial Na+ channel expressed in epithelial Madin-Darby canine kidney cells. J. Biol. Chem. 277: 9772-9779.

53. Harder Т., Simons K. 1999. Clusters of glycolipid and glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins in lymphoid cells: accumulation of actin regulated by local tyrosine phosphorylation. Eur. J. Immunol. 29: 556-562.

54. Henderson R.M., Edwardson J.M., Geisse N.A., Saslowsky D.E. 2004. Lipid rafts: feeling is believing. News Physiol. Sci. 19: 39-43.

55. Hill W.G., An В., Johnson J.P. 2002. Endogenously expressed epithelial sodium channel is present in lipid rafts in A6 cells. J. Biol. Chem. 277: 33541-33544.

56. Jasti J., Furukawa H., Gonzales E.B., Gouaux E. 2007. Structure of acidsensing ion channel 1 at 1.9 A resolution and low pEI. Nature. 449: 316-323.

57. Jennings L.J., Xu Q.W., Firth T.A., Nelson M.T., Mawe G.M. 1999. Cholesterol inhibits spontaneous action potentials and calcium currents in guinea pig gallbladder smooth muscle. Am. J. Physiol. 277: G1017-G1026.

58. Johnson M.D., Bao H.F., Helms M.N., Chen X.J., Tigue Z., Jain L., Dobbs L.G., Eaton D.C. 2006. Functional ion channels in pulmonary alveolar type I cells support a role for type I cells in lung ion transport. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103: 4964-4969

59. Karpushev A. V., Ilatovskaya D.V., Pavlov T.S., Negulyaev Y.A., Staruschenko A. 2010. Intact cytoskeleton is required for small G protein dependent activation of the epithelial Na channel. PLoS ONE. 5, e8827.

60. Kashlan O.B., ShengS-, Kleyman T.R. 2005. On the interaction between amiloride and its putative alpha-subunit epithelial Na+ channel binding site. J. Biol. Chem. 28:2620626215.

61. Kellenberger S. 2008. Epithelial Sodium and Acid-Sensing Ion Channels. In: Sensing with Ion Channels. Springer Series in Biophys., Vol. 11. XXIV, 304 p.

62. Kellenberger S., Gautschi I., Schild L. 2003. Mutations in the epithelial Na+ channel ENaC outer pore disrupt amiloride block by increasing its dissociation rate. Mol Pharmacol. 64: 848-856.

63. Kellenberger S., Hoffmann-Pochon N., Gautschi I., Schneeberger E., Schild L. 1999. On the molecular basis of ion permeation in the epithelial Na+ channel. J. Gen. Physiol. 114: 13-30.

64. Kellenberger S., Schild L. 2002. Epithelial Sodium Channel/Degenerin family of ion channels: a variety of functions for a shared structure. Physiol. Rev. 82: 735-767.

65. Kellner-Weibel G, Geng YJ, Rothblat GH. 1999. Cytotoxic cholesterol is generated by the hydrolysis of cytoplasmic cholcsteryl ester and transported to the plasma membrane. Atherosclerosis. 146: 309-319.

66. Kelly 0., Lin C., Ramkumar M., Saxena N.C., Kleyman T.R., Eaton D.C. 2003. Characterization of an amiloride binding region in the alpha-subunit of ENaC. Am. J. Physiol. 285: 1279-1290.

67. Kieber-Emmons Т., Lin C., Foster M.H., Kleyman T.R. 1999. Antiidiotypic antibody recognizes an amiloride binding domain within the alpha subunit of the epithelial Naf channel. J. Biol. Chem. 274: 9648-9655.

68. Kizer N., Gno X-L., Hruska K. 1997. Reconstitution of stretch-activated cation channels by expression of the a-subunit of the epithelial sodium channel cloned from osteoblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94: 1013-1018.

69. Kleyman T.R., Sheng S., Kosari F., Kieber-Emmons T. 1999. Mechanism of action of amiloride: a molecular prospective. Semin. Nephrol. 19: 524-532.

70. Koefoed-Johnsen V., Ussing H. H. 1958.TY\q nature of the frog skin potential. Acta physiol. Scand. 42: 298-308.

71. Krueger В., Haerteis S., Yang L., Hartner A., Rauh R., Korbmacher C., Diakov A. 2009. Cholesterol depiction of the plasma membrane prevents activation of the epithelial sodium channel (ENaC) by SGK1. Cell. Physiol. Biochem. 24: 605-618.

72. Kusche-Vihrog, K., SobczakK., BangelN., Wilhelmi M., Nechyporuk-Zloy V., Schwab A., Schillers #., Oberleithner H. 2008. Aldosterone and amiloride alter ENaC abundance in vascular endothelium. Eur. J. Physiol. 455: 849-857.

73. MacGregor G.G., Olver R.E., Kemp P.J. 1994. Amiloride-sensitive Na+ channels in fetal type II pneumocytes are regulated by G proteins. Am. J. Physiol. 267: L1-L8.

74. Manes S., Mira E., Gomez-Mouton C., Lacalle R.A., Keller P., Labrador H.P., Martinez-A C. 1999. Membrane raft microdomains mediate front-rear polarity in migrating cells. EMBO J. 18: 6211-6220.

75. Mannechez A., Reungpatthanaphong P., de Certaines J.D., Leray G., Le Moyec L. 2005. Proton NMR visible mobile lipid signals in sensitive and multidrug-resistant K562 cells are modulated by rafts. Cancer Cell Int. 5: 2.

76. Mano /., Driscoll M. 1999. DEG/ENaC channels: a touchy superfamily that watches its salt. Bioessays. 21: 568-578.

77. Martens J.R., Sakamoto N., Sullivan S.A., Grobaski T.D., Tamkun M.M. 2001. Isoform-specific localization of voltage-gated K+ channels to distinct lipid raft populations. Targeting of Kvl5 to caveolae. J. Biol. Chem. 276: 8409-8414.

78. Martens JR, Navarro-Polanco R, Coppock EA, Nishiyama A, Parshley L, Grobaski TD, Tamkun MM. 2000. Differential targeting of Shaker-like potassium channels to lipid rafts. J. Biol. Chem. 275: 7443-7446.

79. Matalon S., O'Brodovich H. 1999. Sodium channels in alveolar epithelial cells: molecular characterization, biophysical properties, and physiological significance. Annu. Rev. Physiol. 61: 627-61.

80. Maximov A.V., Vedernikova E.A., Hinssen H., Khaitlina S.Y. Negulyaev Yu.A. 1997. Ca-dependent regulation of Na+-selective channels via actin cytoskeleton modification in leukemia cells. FEBS Letters. 412: 94-96.

81. Mazzochi C, Benos D.J., Smith P.R. 2006. Interaction of epithelial ion channels with the actin-based cytoskeleton. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291: F1113-F1122.

82. Mazzochi C, Bubien J.K., Smith P.R., Benos D.J. 2006. The carboxyl terminus of the alpha-subunit of the amiloride-sensitive epithelial sodium channel binds to F-actin. J. Biol. Chem. 281: 6528-6538.

83. McNicholas C.M., Canessa C.M. 1997. Diversity of channels generated by different combinations of epithelial sodium channel subunits. J Gen Physiol 109(6): 681-692.

84. Mirshahi M., Mirshahi S., Golestaneh N. Mishal Z, Nicolas C, Hecquet C, Agarwal M.K. 2000. Demonstration of the mineralocorticoid hormone receptor and action in human leukemic cell lines. Leukemia. 14: 1097-1104.

85. Morachevskaya E.A., Sudarikova A.V., Negulyaev Y.A. 2007. Mechanosensitive channel activity and F-actin organization in cholesterol-depleted human leukaemia cells. Cell Biol. Int. 31: 374-381.

86. Neurobiol. 69: 169-203. Palade GE. 1953. Fine Structure of Blood Capillaries. J. Appl. Phys. 24: 1424-1436 Palmer L.G. 1992. Epithelial Na channels: function and diversity. Annu. Rev. Physiol. 54: 51-66.

87. Prat A.G., Bertorello A.M., Ausiello D.A., Cantiello H.F. 1993. Activation of epithelial Na+ channels by protein kinase A requires actin filaments. Am. J. Physiol. 265: 224233

88. Price M.P., Snyder P.M., Welsh M.J. 1996. Cloning and expression of a novel human brain Na+ channel. J. Biol. Chem. 271: 7879-7882.

89. Prince LS, Welsh MJ. 1999. Effect of subunit composition and Liddle's syndrome mutations on biosynthesis of ENaC. vim. J. Physiol. Cell Physiol. 276: C1346-C1351.

90. Rajendran L., Simons K. 2005. Lipid rafts and membrane dynamics. J. Cell Scie. 118: 1099-1102.

91. Renard S., Lingueglia E., Voilley N., Lazdunski M., Barbry P. 1994. Biochemical analysis of the membrane topology of the amiloridesensitive Na+ channel. J. Biol. Chem. 269: 12981-12986.

92. Romanenko V.G., Fang Y., Byfield F., Travis A.J., Vandenberg C.A., Rothblat G.H., Levitan I. 2004. Cholesterol Sensitivity and Lipid Raft Targeting of Kir2.1 Channels. Biophys. J. 87: 3850-3861.

93. Romanenko V.G., Rothblat G.H., Levitan I. 2002. Modulation of endothelial inward rectifier K1 current by optical isomers of cholesterol. Biophys. J. 83: 3211-3222.

94. Rossier B., Schild L. 2008. Epithelial Sodium Channel: Mendelian Versus Essential Hypertension. Hypertension. 52: 595-600.

95. Rossier B.C., Canessa C.M., Schild L., Horisberger J.D. 1994. Epithelial sodium channels. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 3: 487-496.

96. RotinD., Bar-Sagi D., O'Brodovich H., Merilainen J., Lehto V.P., Canessa C.M., Rossier B.C., Downey G.P. 1994. An SH3 binding region in the epithelial Na+ channel (alpha rENaC) mediates its localization at the apical membrane. EMBO J. 13: 4440-4450.

97. Schild L. 2004. The epithelial sodium channel: from molecule to disease. Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 151: 93-107.

98. Schild L., Schneeberger E., Gautschi L, Firsov D. 1997. Identification of amino acid residues in the a, (3, y subunits of the epithelial sodium channel (ENaC) involved in amiloride block and ion permeation. J. Gen. Physiol. 109: 15-26.

99. Segal A., Cucu D., Van D. W., Weber W.M. 2002. Rat ENaC expressed in Xenopus laevis oocytes is activated by cAMP and blocked by Ni2+. FEBS Lett. 515: 177-183.

100. Shumilina E.V., Negulyaev Y.A., Morachevskaya E.A., Hinssen H., Khaitlina. S.Y. 2003b. Regulation of sodium channel activity by capping of actin filaments. Mol. Biol. Cell. 14: 1709-1716.

101. Simons K., Ehehalt R. 2002. Cholesterol, lipid rafts, and disease. J. Clin, invest. 110: 597-603.

102. Simons K., Ikonen E. 1997. Functional rafts in cell membranes. Nature. 387: 569-572.

103. Simons K., van Meer G. 1988. Lipid sorting in epithelial cells. Biochemistry 27: 61976202.

104. Smith P.R., Saccomani G., Joe E.H., Angelides K.J., Benos D.J. 1991. Amiloride-sensitive sodium channel is linked to the cytoskeleton in renal epithelial cells. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 88: 6971-6975.

105. Snyder P.M., Cheng C., Prince L.S., Rogers J.C., Welsh M.J. 1998. Electrophysiological and biochemical evidence that DEG/ENaC cation channels are composed of nine subunits. J. Biol. Chem. 273: 681-684.

106. Spudich J.A., Watt S. 1971. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. 1. Biochemical studies of the interactions of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. J. Biol. Chem. 246: 4866-4871.

107. Staruschenko A., Adams E., Booth R.E., Stockand J.D. 2005. Epithelial Na+ channel subunit stoichiometry. Biophys. J. 88: 3966-3975.

108. Staruschenko A., Medina J.L., Patel P., Shapiro M.S., Booth R.E., Stockand J.D. 2004. Fluorescence resonance energy transfer analysis of subunit stoichiometry of the epithelial Na+ channel. J. Biol. Chem. 279: 27729-27734.

109. Staruschenko A.V., Sitdarikova A.V., Negulyaev Y.A., Morachevskaya E.A. 2006. Magnesium permeation through mechanosensitive channels: single-current measurements. Cell Res. 16: 723-730.

110. Staruschenko A. V., Vedemikova E.A. 2002. Mechanosensitive cation channels in human leukemia cells: calcium permeation and blocking effect. J. Physiol. 541: 81-90.

111. Sudarikova A.V., Negulyaev Y.A., Morachevskaya E.A. 2006. Cholesterol depletion affects mechanosensitive channel gating coupled with F-actin rearrangement. Proceedings of the Physiological Society, London, 95P-96P.

112. Sudarikova A., Negulyaev Y.A., Morachevskaya E.A. 2009. Cholesterol depletion does not prevent actin-based activation of non-voltage-gated sodium channels. Abstracts of the Main meeting of the Physiological society, Dublin, 148-149.

113. Sundivakkam P.C., Kwiatek A.M., Sharma T.T., Minshall R.D., Malik A.B., Tiruppathi C. 2009. Caveolin-1 scaffold domain interacts with TRPC1 and IP(3)R3 to regulate Ca store release-induced Ca2+ entry in endothelial cells. Am. J. Physiol. 296: C403-C413.

114. Taverna E., Saba E., Rowe J., Francolini M., Clementi F., Rosa P. 2004. Role of lipid microdomains in P/Q-type calcium channel (Cav 2.1) clustering and function in presynaptic membranes. J. Biol. Chem. 279: 5127-5134.

115. Thomas C.P., Campbell J.R., Wright P.J., Husted R.F. 2004. cAMP-stimulated Na+ transport in H441 distal lung epithelial cells: role of PKA, phosphatidylinositol 3-kinase, and sgkl. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 287: L843-51.

116. Ugawa S., Yamamoto T., Ueda T., Ishida Y., Inagaki A., Nishigaki M., Shimada S. 2003. Amiloride-insensitive currents of the acid-sensing ion channel-2a (ASIC2a)/ASIC2b heteromeric sour-taste receptor channel. J. Neurosci. 23: 3616-3622.

117. Urbanik E., Ware B.R. 1989. Actin filament capping and cleaving activity of cytochalasins B, D, E, and H. Arch. Biochem. Biophys. 269: 181-187.

118. Van Renterghem C., Lazdunski M. 1991. A new non-voltage-dependent, epithelial-like Na+ channel in vascular smooth muscle cells. Pfliigers Arch. 419: 401-408.

119. Waldmann R., Champigny G., Bassilana F., Heurteaux C., Lazdunski M. 1997. A protongated cation channel involved in acid-sensing. Nature. 386: 173-177.

120. Waldmann R., Champigny G., Bassilana F., Voilley N., Lazdunski M. 1995. Molecular cloning and functional expression of a novel amiloride-sensitive Na+ channel. J. Biol. Chem. 270: 27411-27414.

121. Wang J., Zhang Z., Chou C„ Liang Y., Gu Y., Ma H. 2009. Cyclosporine stimulates the renal epithelial sodium channel by elevating cholesterol. Am. J. Physiol. 296: 284290.

122. WangX.L., Ye D., Peterson T.E., Cao S., Shah V.H., Katusic Z.S., Sieck G.C., Lee H.C. 2005. Caveolae targeting and regulation of large conductance Ca2+-activated K+ channels in vascular endothelial cells. J. Biol. Chem. 280: 11656-11664.

123. Weaver A.K., Olsen M.L., McFerrin M.B., Sontheimer H. 2007. BK channels are linked to inositol 1,4,5-triphosphate receptors via lipid rafts: a novel mechanism for coupling Ca2+. (i) to ion channel activation. J. Biol. Chem. 282: 31558-31568.

124. Wei S.P., Li X.Q., Chou C.F., Liang Y.Y., Peng J.B., Wamock D., Ma H.P. 2007. Membrane tension modulates the effects of apical cholesterol on the renal epithelial sodium channel. J. Membr. Biol. 220: 21-31.

125. West T.A., Blazer-Yost B.L. 2005. Modulation of basal and peptide hormone-stimulated Na+ transport by membrane cholesterol content in the A6 epithelial cell line. J. Cell. Physiol. Biochem. 16: 263-270.

126. Woodhull A.M. 1973. Ionic blockage of sodium channels in nerve. J. Gen. Physiol. 61: 687-708.

127. Xiong Z.-G., ChuX.-P., Simon R.P. 2006. Ca2+-permeable acid-sensing ion channels and ischemic brain injury. J. Membr. Biol. 209: 59-68.

128. Yang L.M., Rinke R., Korbmacher C. 2006. Stimulation of the epithelial sodium channel (ENaC) by cAMP involves putative ERK phosphorylation sites in the C termini of the channel's beta- and gamma-subunit. J. Biol. Chem. 281: 9859-68.

129. Yarbrough T.L., Lu T., Lee H-C., Shibata E.F. 2002. Localization of cardiac sodium channels in caveolin-rich membrane domains: regulation of sodium current amplitude. Circ. Res. 90:443-449.

130. Yeagle P.L. 1985. Cholesterol and the cell membrane. Biochim. Biophys. Acta. 822: 267-287.

131. Yermolaieva ()., Leonard A.S., Schnizler M.K., Abboud F.M., Welsh M.J. 2004. Extracellular acidosis increases neuronal cell calcium by activating acid-sensing ion channel la. PNAS. 101: 6752-6757.

132. Yin H.L., Janmey P.A. 2003. Phosphoinositide regulation of the actin cytoskeleton. Annu. Rev. Physiol. 65:761-789.

133. Zidovetzki R., Levitan I. 2007. Use of cyclodextrins to manipulate plasma membrane cholesterol content: evidence, misconceptions and control strategies. Biochim. Biophys. Acta 1768: 1311-1324.

134. Zuckerman J.B., Chen X., Jacobs J.D., Ни В., Kleyman T.R., Smith P.R. 1999. Association of the epithelial sodium channel with Apx and alpha-spectrin in A6 renal epithelial cells. J. Biol. Chem. 274: 23286-23295.

135. Вачугова Д.В., Морачевская E.A. 2009. Механочувствительность катионных каналов семейства DEG/ENaC. Цитология. 51 (10): 806-814.

136. Ведерникова Е.А., Максимов А.В., Негуляев IO.A. 1997. Функциональные свойства и цитоскелет-зависимая регуляция натриевых каналов в плазматической мембране лейкозных клеток. Цитология. 39 (12): 1142-1151.

137. Ведерникова Е.А., Максимов А.В., Негуляев Ю.А. 1999. Функциональная характеристика и молекулярная топология потенциал-независимых натриевых каналов. Цитология. 41 (8): 658-666.

138. Ведерникова Е.А., Негуляев, Ю.А. 1995. Новый тип натрий-селективных каналов в плазматической мембране невозбудимых клеток. Цитология. 37 (4): 364-365.

139. Марголис Л.Б, Бергельсон Л.Д. 1986. Липосомы и их взаимодействие с клетками. -М.: Наука. 240 с.

140. Мельницкая А.В., Крутецкая З.И., Лебедев О.Е. 2006. Структурно-функциональная организация транспорта Na+ в эпителиальных системах. I. Эпителиальные натриевые каналы. Цитология. 48 (10): 817-840.

141. Сударикова А.В., Морачевская Е.А., Негуляев Ю.А. 2006. Состояние кортикального актина в клетках К562 и U937 при частичной экстракции холестерина. Цитология. 48 (9): 803-804.

142. Сударикова A.B., Чубинский-Надеждин В.И., Негуляев Ю.А., Морачевская Е.А. 2009. Функциональные свойства натриевых каналов в клетках К562 после экстракции холестерина. Цитология. 51 (8): 676-683.

Информация о работе

Сударикова, Анастасия Владимировна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2011
ВАК 03.03.04

Диссертация

Натриевые каналы в клетках лейкемии человека К562 и лимфомы U937: идентификация и особенности регуляции - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы