Модуляция никотином электрогенного вклада изоформ Na,K-ATФазы в скелетной мышце крысы

Прокофьев, Александр Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Модуляция никотином электрогенного вклада изоформ Na,K-ATФазы в скелетной мышце крысы
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Модуляция никотином электрогенного вклада изоформ Na,K-ATФазы в скелетной мышце крысы"

ПРОКОФЬЕВ АЛЕКСАНДР ВЛАДИМИРОВИЧ

Модуляция никотином электрогенного вклада изоформ Ма,К-АТФазы в скелетной мышце крысы

03.00.13 - физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2009

003476805

Работа выполнена в лаборатории нервно-мышечной физиологии Кафедры Общей физиологии

Санкт-Петербургского государственного университета

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Игорь Ильич Кривой

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Валерий Григорьевич Скопичев

доктор биологических наук, Ирина Ильинична Марахова

Ведущее учреждение - Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН

Защита состоится "_" _2009 г. в "_" часов на заседании Совета

Д 212.232.10 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете (199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, ауд. 90).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. A.M. Горького Санкт-Петербургского государственного университета (199034, Санкт-Петербург, Университетская набережная, 7/9).

Автореферат разослан "_"_2009 года

Ученый секретарь диссертационного Совета доктор биологических наук, профессор

Н.П. Алексеев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Никотиновые холинорецепторы (н-ХР) опосредуют в организме самые разнообразные эффекты нейромедиатора ацетилхолина (АХ). В ЦНС эти рецепторы участвуют во многих физиологических и поведенческих функциях (когнитивные процессы, память и обучение, нейрональное развитие, мозговой кровоток и метаболизм, формирование никотиновой зависимости и др.) (Jones et al., 1999; Paterson, Nordberg, 2000). В скелетной мышце н-ХР опосредуют синаптическую передачу сигнала от двигательного нерва к мышце.

Одним из физиологически активных компонентов табака является алкалоид никотин -специфический экзогенный лиганд н-ХР. Поскольку н-ХР регулируют нейрональную активность в структурах мозга, относящихся к системе естественного подкрепления, которая ответственна за формирование зависимости не только к никотину, но и к другим наркотикам (кокаин, амфетамин, морфин и др.) (Pierce et al., 2006), основное внимание исследователей во всем мире сосредоточено на роли никотина именно в ЦНС. Что касается скелетной мускулатуры, содержащей большой пул н-ХР, - потенциальных мишеней циркулирующего никотина, то имеются лишь единичные работы о влиянии хронической никотинизации на скелетные мышцы (Larsson et al., 1988; Price et al., 2003). Концентрация циркулирующего никотина при курении табака составляет порядка ста наномолей (Lester, Dani, 1995; Benowitz et al., 1997; Dani, De Biasi, 2001). Не известно, вызывает ли этот никотин какие-то изменения на уровне молекулярно-клеточных процессов, обеспечивающих электрогенез, возбудимость, сократимость и работоспособность скелетной мышцы. В частности, нет данных о влиянии наномолярных концентраций никотина на критически важный для функционирования скелетной мышцы фермент - Na.K-АТФазу, хотя известно о возможности холинергической модуляции этого белка (Кривой и др., 2004; 2006; Dlouha et al., 1979; Vyskocil et al., 1983; Nikolsky et al., 1994; Henning et al., 1994; Kragenbrink et al., 1996; Wang et al., 1994; Krivoi et al., 2006).

Na.K-АТФаза поддерживает трансмембранные градиенты Na+ и K+ за счет активного транспорта этих ионов, что обеспечивает мембранный потенциал и возбудимость, а также ряд других важных транспортных механизмов клетки. Каталитическая а-субъединица Na,K-АТФазы экспрессируется в виде четырех изоформ (al - a4). По ряду данных основную насосную функцию в клетке выполняет изоформа al, тогда как прочие являются регуляторными (Mobasheri et al., 2000; Lopina, 2001; Mijatovic et al. 2007). В возбудимых клетках экспрессируются al-, a2- и аЗ-изоформы №,К-АТФазы, в скелетных мышечных волокнах - al- и а2-изоформы (Lavoie et al., 1997; McDonough et al., 2002).

Имеются данные о негативном хроническом влиянии никотина на экспрессию а2-изоформы Na.K-АТФазы в мозге крысы (Wang et al., 1994). Множество данных свидетельствуют о влиянии холиномиметиков на активность и индукцию Na.K-АТФазы в зрелой скелетной мышце и в культуре скелетных мышечных клеток (Vyskocil et al., 1983; Henning et al., 1994; Nikolsky et al., 1994; Kragenbrink et al., 1996). Установлено, что АХ в наномолярном диапазоне концентраций активирует Na,K-ATOa3y, вызывая гиперполяризацию скелетных мышечных волокон (Vyskocil et al., 1983; Nikolsky et al., 1994), причем за счет увеличения электрогенной активности ее а2-изоформы (Кривой и др., 2006; Krivoi et al., 2006). Показано, что гиперполяризацию мышечных волокон вызывает и никотин в концентрации 100 нмоль/л (Krivoi et al., 2006), однако, как влияет при этом никотин на электрогенную активность Na.K-АТФазы и ее изоформ неизвестно.

В целом, в данный момент вопрос об остром и хроническом влиянии никотина в наномолярных концентрациях, сопоставимых с уровнем циркулирующего никотина у курильщиков табака, на Na.K-АТФазу и ее изоформы в скелетной мышце, а также электрогенез и работоспособность скелетной мускулатуры не изучен.

Цель работы: исследование влияния никотина в наномолярном диапазоне концентраций на электрогенную активность изоформ №,К-АТФазы и электрогенез скелетной мышцы.

Задачи исследования:

1) Провести анализ гиперполяризующего эффекта никотина в скелетной мышце крысы, включающий изучение действия специфических блокаторов Na.K-АТФазы, динамики развития эффекта и роли ионных токов через каналы н-ХР в его реализации.

2) Используя фармакологический подход с применением специфического блокатора Na.K-АТФазы уабаина сравнить влияние острого и хронического действия никотина в наномолярном диапазоне концентраций на электрогенные вклады уабаин-чувствительной (а2) и уабаин-резистентной (al) изоформ Na.K-АТФазы.

3) Провести сравнительный анализ хронического действия никотина в микромолярной концентрации при его локальной аппликации к мышце с помощью силиконовых имплантантов.

Положения, выносимые на защиту: 1. Никотин (100 нмоль/л) при остром действии вызывает гиперполяризацию мышечных волокон скелетной мышцы крысы величиной около 4 мВ за счет селективного увеличения электрогенного вклада а2-изоформы Na.K-АТФазы. Ионные токи через каналы н-ХР не являются фактором развития гиперполяризации, вызываемой никотином.

2. Локальная доставка никотина с помощью силиконовых имплантантов в течение 3-х суток приводит к деполяризации скелетных мышечных волокон, что подтверждает возможность хронических изменений в скелетной мышце при длительном воздействии на нее никотина.

3. Хроническое введение никотина крысам в течение 3 - 4.5 недель с помощью питьевой воды приводит к деполяризации мышечных волокон скелетной мышцы за счет существенного снижения электрогенного вклада а1-изоформы №,К-АТФазы при незначительном увеличении вклада а2-изоформы.

Научная новизна. Впервые установлено, что никотин, добавляемый в раствор в концентрации 100 нмоль/л, вызывает гиперполяризацию мышечных волокон изолированной скелетной мышцы крысы. Установлено, что причиной гиперполяризации является селективное увеличение электрогенной активности уабаин-чувствительной а2-изоформы Ыа,К-АТФазы без изменения электрогенной активности уабаин-резистентной а1-изоформы. Показано, что проадифен - неконкурентный блокатор открытого ионного канала н-ХР, не влияет на величину гиперполяризации, вызываемой 100 нмоль/л никотина, что свидетельствует о развитии этого эффекта и в условиях блокады ионных токов через каналы н-ХР. Установлено, что вызываемое никотином увеличение электрогенного вклада Ка,К-АТФазы не является следствием изменения входного сопротивления мембраны мышечных волокон. Впервые использован метод локальной доставки никотина к скелетной мышце с применением нетоксичных силиконовых имплантантов, содержащих никотин. Установлено, что никотин в микромолярном диапазоне концентраций при локальной доставке к камбаловидной мышце крысы в течение 3-х суток вызывает долговременную деполяризацию мышечных волокон. Впервые в условиях моделирования формирования никотиновой зависимости у крыс, хронически (в течение 3 - 4.5 недель) получавших никотин с питьевой водой, обнаружено снижение мембранного потенциала покоя (МПП) волокон диафрагмальной мышцы преимущественно за счет уменьшения электрогенного вклада а1-изоформы Ка,К-АТФазы, при незначительном увеличении электрогенного вклада а2-изоформы.

Практическая значимость работы.

Полученные данные свидетельствуют об изоформ-специфическом участии №,К-АТФазы в регуляции электрогенеза скелетной мышцы крысы никотином в наномолярном диапазоне концентраций, что раскрывает новый механизм модуляции скелетной мускулатуры циркулирующими холинергическими лигандами. Эти знания важны для более глубокого понимания механизмов побочных эффектов применяемых в клинике антихолинэстеразных препаратов (используемых как стимуляторы памяти, при лечении

ряда нейродегенеративных расстройств, миастении и др.), для выявления новых механизмов никотиновой интоксикации при табакокурении.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Российской медико-биологической конференции "Человек и его здоровье" (Санкт-Петербург, 2004); Всероссийской школе "Актуальные проблемы нейробиологии" (Казань, 2005); PENS Summer Course "Contemporary problems of Neurobiology: Molecular mechanisms of synaptic plasticity" (Kazan, Russia, 2007); 3rd HBGS Student Council Symposium "Cell Structure and Organelles" (Helsinki, Finland, 2008); International Symposium "Biological Motility: Basic Research and Practice" (Pushchino, Russia, 2008); 12th International ATPase Conférence "Na,K-ATPase and Related Transport ATPases of P-type: Structures, Mechanisms, and Rôles in Health and Disease" (Arhus, Denmark, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ, из них 4 статьи в рецензируемых изданиях.

Структура и объем диссертации. Диссертация объемом 118 страниц состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 172 источника, из которых 25 отечественных и 147 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 20 рисунками и 3 таблицами.

Работа поддержана грантами РФФИ 04-04-49535 и 07-04-01027.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Опыты были проведены на изолированных нервно-мышечных препаратах диафрагмальной и камбаловидной мышц белых крыс (самцы весом 180 - 200 г.). Применялся проточный аэрируемый карбогеном (95% 02 + 5% СОг) физиологический раствор следующего состава (в ммоль/л): NaCl-137; КС1-5; СаС12-2; MgCl2-2; NaHC03-24; NalhPC>4-l ; глюкоза-11; рН 7.4 - 7.5, температура 28°С. Величину МПП, параметры потенциалов действия (ПД) и величину входного сопротивления мышечных волокон регистрировали внутриклеточно во внесинаптическом районе волокон с помощью стандартной микроэлектродной техники. Мышечные сокращения регистрировали в изометрическом режиме при помощи механотрона FT03 С (Grass Instrument Со, USA). Прямое раздражение (длительность стимула 1 мс) осуществляли с помощью хлорсеребряных электродов, расположенных в безнервной части мышцы. Для непрямого раздражения нерв стимулировали через всасывающий электрод импульсами длительностью 0.1 мс. В опытах с утомлением применяли прямую тетаническую стимуляцию пачками стимулов с частотой 66 имп/с, длительность каждой пачки составляла 0.4 с, пачки следовали с частотой 1 в секунду.

Регистрируемые ответы оцифровывались аналого-цифровыми преобразователями (частота квантования для сокращений - 5000/с, для МПП и ПД - 44000/с) и далее анализировались на персональном компьютере с помощью специальных программ.

В опытах с исследованием хронического действия никотина использовали два различных метода. Для локальной доставки никотина к камбаловидной мышце был использован метод имплантации нетоксичного силиконового геля, заполненного исследуемым веществом (Connold et al., 1997). Для приготовления имплантантов использовался раствор силиконовой резины (3140 RTV, Dow Corning, USA), содержащий никотин. Размер имплантантов составлял ~1х2х5 мм. Применяли также метод потребления никотина с питьевой водой, содержащей 2% сахарина (Sparks, Pauly, 1999), в которую добавляли (-)никотин тартрат в концентрации 60 мг/л (Larsson et al., 1988).

Применяли АХ, никотин, проадифен и уабаин (Sigma), маринобуфагенин из паротидных желез Bufo marinus (предоставлен д-ром А.Я. Багровым, Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова, РАН). Результаты обрабатывали статистически с помощью программы Origin 6.1; достоверность различия оценивали по t-критерию Стьюдента. В работе приведены средние значения величин с их ошибками. Каждое значение получено в результате усреднения параметров МПП и ПД не менее чем в 100 волокнах 4-6 мышц.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Острое действие никотина

Ранее было показано, что АХ в концентрации 100 нмоль/л вызывает гиперполяризацию мышечных волокон диафрагмы крысы величиной около 4 мВ за счет увеличения электрогенной активности а2-изоформы №,К-АТФазы, предположительно за счет ее функционального взаимодействия с н-ХР (Krivoi et al., 2006). В настоящей работе мы проанализировали эффекты другого, негидролизуемого, агониста н-ХР - никотина в концентрации 100 нмоль/л, которая соответствует уровню циркулирующего никотина при курении (Lester, Dani, 1995; Benowitz et al., 1997; Dani, De Biasi, 2001). Таким образом, добавление в раствор никотина в данных опытах можно в определенной степени считать моделированием повышения концентрации никотина в физиологических условиях.

В наших экспериментальных условиях АХ (100 нмоль/л) через 1 ч действия вызывал увеличение МПП от исходного уровня -77.3 + 0.6 мВ (5 мышц, 160 волокон) до -83.2 ± 0.5 мВ (147 волокон), то есть, гиперполяризацию величиной 5.9 ± 0.8 мВ (р < 0.01). Этот эффект был обратим и через 30 мин отмывания физиологическим раствором уменьшался более чем в два раза (рис. 1), что соответствует данным, полученным ранее (Krivoi et al., 2006). Добавление в раствор никотина в концентрации 100 нмоль/л вызывало гиперполяризацию

мембраны волокон от исходного уровня -78.2 ± 0.6 мВ (5 мышц, 145 волокон) до -83.6 ± 0.6 мВ (150 волокон) через 1 ч действия никотина. Гиперполяризация составила 6.3 ± 0.8 мВ (р <

0.01). Как и в случае АХ, этот эффект был обратим при отмывании (рис. 1).

Рис. 1. Влияние АХ (темные кружки) или никотина (светлые кружки) в концентрациях 100 нмоль/л на МПП мышечных волокон диафрагмы крысы. Треугольники - динамика МПП в контрольных опытах. Горизонтальными полосками показано время присутствия АХ или никотина в растворе и время отмывания нормальным физиологическим раствором.

-76 -78

Ш S -80-С С 2 -82-84 ■

0 15 30 45 60 75 90 105 120 Время, мин

Чтобы проверить вовлечение №,К-АТФазы в реализацию гиперполяризующего эффект никотина, мы использовали специфические ингибиторы №,К-АТФазы (уабаин и маринобуфагенин), которые, по полученным ранее данным, в наномолярном диапазоне концентраций устраняли гиперполяризацию, вызываемую АХ (Кривой и др., 2006). Уабаин (50 нмоль/л) или маринобуфагенин (2 нмоль/л), добавляемые на фоне развившегося гиперполяризующего эффекта 100 нмоль/л никотина (при сохранении никотина в растворе), вызывали достоверное (р <0.01) снижение МПП до исходного уровня (рис. 2 А, Б). Наоборот, добавление никотина (100 нмоль/л) после 30 мин преинкубации мышц в растворе, содержащем уабаин (50 нмоль/л) или маринобуфагенин (2 нмоль/л), не вызывало достоверных изменений МПП (рис. 2 В). Таким образом, полученные данные свидетельствуют о вовлечении Ка,К-АТФазы в реализацию гиперполяризующего эффекта никотина в концентрации 100 нмоль/л.

Никотин

15 30 45 60 75 90 105 120 Время, МИН

30 45 60

Время, мин

15 30 45 60 75 90 105

Бремя,мин

Рис. 2. Влияние специфических ингибиторов На,К-АТФазы на гиперполяризующий эффект никотина (100 нмоль/л) в диафрагме крысы. А - добавление уабаина в концентрации 50 нмоль/л; Б - добавление маринобуфагенина (МБГ) в концентрации 2 нмоль/л; В -добавление никотина (100 нмоль/л) на фоне действия уабаина (50 нмоль/л, светлые кружки) или маринобуфагенина (2 нмоль/л, темные кружки). Горизонтальными полосками показано время присутствия в растворе никотина и ингибиторов №,К-АТФазы.

Ранее было показано, что гиперполяризующий эффект АХ реализуется за счет увеличения электрогенного вклада а2-изоформы Ка,К-АТФазы (Krivoi et al., 2006). В настоящей работе для выявления изоформы Ка,К-АТФазы, вовлеченной в развитие гиперполяризующего эффекта никотина, был применен уабаин. Известно, что у грызунов al-и а2-изоформы Ыа,К-АТФазы сильно отличаются по чувствительности уабаину (в 100 и более раз), что применяют для селективной блокады этих изоформ уабаином (Sweadner, 1995; Не et al., 2001; Krivoi et al., 2003). Установлено, что уабаин в концентрации 1 мкмоль/л полностью подавляет электрогенную активность а2-изоформы в мышечных волокнах диафрагмы крысы, не оказывая влияния на изоформу al; для полной блокады обеих изоформ требуется уабаин в концентрации 500 мкмоль/л (Krivoi et al., 2003; Кривой и др., 2006).

В наших экспериментах последовательно добавляли уабаин в концентрациях 1 мкмоль/л и далее - 500 мкмоль/л (рис. 3). Уже через 15 мин после добавления 1 мкмоль/л уабаина наблюдалась деполяризация мышечных волокон на ~5 мВ, далее величина МПП оставалась стабильной. Электрогенный вклад чувствительной к уабаину а2-изоформы определяли как разницу между значениями МПП перед и через 30 - 45 мин после добавления 1 мкмоль/л уабаина. Добавление уабаина в концентрации 500 мкмоль/л вызывало деполяризацию мышечной мембраны до уровня -62 мВ. Электрогенный вклад уабаин-резистентной al-изоформы определяли как разницу между величинами МПП через 30 - 45 мин действия 1 мкмоль/л уабаина и через 30 - 45 мин после добавления 500 мкмоль/л уабаина. В опытах с применением 100 нмоль/л никотина уабаин добавляли через 30 мин действия никотина, когда уже полностью развивался его гиперполяризующий эффект (при сохранении никотина в растворе в течение всего эксперимента) (рис. 3).

В присутствии никотина электрогенный вклад а2-изоформы Na,K-ATOa3bi составил 9.7 ± 0.6 мВ, что в два раза больше (р < 0.01) соответствующего вклада в мышцах контрольных крыс (5.0 ± 0.4 мВ). Вклад уабаин-резистентной al-изоформы в присутствии никотина (9.8 ± 0.6 мВ) достоверно не отличался от соответствующего вклада в контрольных мышцах (11.0 ± 0.4 мВ). Важно отметить, что после полной блокады №,К-АТФазы уабаином в концентрации 500 мкмоль/л уровень МПП в присутствии никотина не отличался от контрольного (около -62 мВ) (рис. 3). Таким образом, добавление 100 нмоль/л никотина не влияет на основные параметры мембраны, определяющие формирование потенциала покоя в отсутствие активного транспорта Na+ и К+.

0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 Время, мин

Рис. 3. Влияние добавления уабаина в концентрациях 1 мкмоль/л и 500 мкмоль/л на МПП мышечных волокон диафрагмы крысы. Светлые кружки - контрольные мышцы; темные кружки - опыты с применением никотина (100 нмоль/л). Время присутствия в растворе уабаина и никотина показано соответствующими горизонтальными полосками. Вертикальными стрелками отмечены моменты добавления соответствующих концентраций уабаина. Темные столбцы справа - электрогенный вклад а1-изоформы; светлые столбцы -вклад а2-изоформы.

Поскольку электрогенный вклад №,К-АТФазы зависит от помпового тока и входного сопротивления (Явх) волокон, наблюдаемая гиперполяризация могла бы отражать, например, увеличение ЯВх без каких-либо изменений в работе Ка,К-АТФазы. Однако никотин вызывал снижение Ящ на 21.5 % по сравнению с контролем, но никак не увеличение (рис. 4). Этот эффект скорее всего связан с активацией незначительной части н-ХР, поскольку на фоне проадифена, блокатора канала н-ХР, снижение КЕХ отсутствовало (рис. 4). Таким образом, вызываемая никотином гиперполяризация обусловлена увеличением электрогенного вклада а2-изоформы Иа.К-АТФазы, которое не является следствием увеличения Явх волокон.

п = 174

контроль

п = 196

*** 1

п = 130

100 нМ

проадифен 5 мкМ + никотин 100 нМ

Рис. 4. Влияние никотина (100 нмоль/л) на величину Явх мышечных волокон диафрагмы крысы. Светлый столбец -контроль; черный столбец - в течение 30 - 60 мин действия никотина; серый столбец - в течение 30 - 60 мин действия никотина на фоне 5 мкмоль/л проадифена. *** - р < 0.001 (по сравнению с контролем). Цифры вверху -количество волокон.

Далее в опытах на камбаловидной

мышце изучали динамику действия 100 нмоль/л никотина. Первые минуты действия никотина сопровождались незначительной

деполяризацией, которая затем сменялась фазой гиперполяризации (рис. 5 А). Аналогичные

эффекты вызывал и АХ в той же концентрации (рис. 5 Б). Фаза деполяризации, по-видимому, объясняется активацией части н-ХР. В связи с этим одним из объяснений наблюдаемой гиперполяризации могло быть увеличение внутриклеточного уровня входящего через каналы н-ХР и активирующего №,К-АТФазу. Однако на фоне неконкурентного блокатора канала н-ХР проадифена (5 мкмоль/л, 30 мин преинкубации) хотя фаза деполяризации и не наблюдалась, динамика и величина гиперполяризующего эффекта никотина и АХ не отличались от контрольных (рис. 5 А, Б). Эти данные позволяют предположить, что ионные токи через н-ХР не участвуют в реализации гиперполяризующего эффекта никотина.

Время, мин Время, мин

Рис. 5. Динамика МПП мышечных волокон камбаловидной мышцы крысы при действии 100 нмоль/л никотина (А) или АХ (Б). Светлые кружки - в отсутствие проадифена; темные кружки - в присутствии 5 мкмоль/л проадифена. Время присутствия в растворе никотина, АХ и проадифена показано соответствующими горизонтальными полосками.

Никотин (100 нмоль/л) достоверно увеличивал амплитуду ПД и уменьшал время нарастания и длительность их полуспада в диафрагмальной мышце. Механизм этого эффекта неясен, можно лишь предположить, что такие изменения ПД связаны с гиперполяризацией, которая приводит к дезинактивации части натриевых каналов в этих волокнах. Несмотря на наблюдаемые изменения электрогенеза, никотин не влиял на возбудимость, параметры одиночных сокращений и динамику утомления диафрагмальной мышцы.

Хроническое действие никотина при его локальной доставке к мышце

В данной части работы доставка никотина осуществлялась с помощью специального нетоксичного силиконового геля, подшиваемого к камбаловидной мышце на 3 суток. В этих опытах можно было проверить принципиальную возможность хронического влияния никотина на мышцу без побочных системных эффектов, которые неизбежно сопутствуют другим способам хронической никотинизации (инъекции, применение специальных помп, доставка с питьевой водой). Применяли гель с низким (0.1 мг на 350 мг геля) и с высоким (2 мг на 350 мг геля) содержанием никотина, а также гель без никотина (контроль).

Чтобы оценить диапазон концентраций никотина, диффундирующих из геля, мы предварительно провели физиологическое тестирование геля на изолированной диафрагмальной мышце. Полоски геля накладывали на мышцу, расположенную в экспериментальной камере с нормальным физиологическим раствором. Наложение геля без никотина (контроль, 6 мышц) не вызывало достоверных изменений МПП в течение 60 мин наблюдения. Гель с низким содержанием никотина (6 мышц) в течение первых 5 мин после наложения вызывал деполяризацию величиной 2.9 ± 0.8 мВ (р < 0.01) по сравнению с исходным уровнем МПП. В случае геля с высоким содержанием никотина (6 мышц) деполяризация достигала 5.0 ± 0.8 мВ (р <0.01) (рис. 6). Деполяризация снижалась уже через 15 мин после наложения геля с никотином и исчезала к 60-й мин действия геля. Полученные данные подтверждают, что никотин действительно диффундирует из приготовленных образцов геля. Наблюдаемая начальная деполяризация соответствуют эффектам микромолярных концентраций никотина, а ее последующее исчезновение объясняется десенситизацией н-ХР (Lester, Dani, 1997). Важно, что и через 3 суток непрерывного пребывания в физиологическом растворе в пробирке, наложение геля с никотином вызывало

сходное изменение МПП, то есть никотин все это время стабильно выделялся из геля.

-71 -72-73 -74 1 -75 С -76 1-77 -78 -79 -80

Гель никотин/контроль

Рис. 6. Влияние наложения образцов силиконового геля на МПП мышечных волокон диафрагмы крысы. Квадраты - контрольные опыты с гелем без никотина; кружки - опыты с гелем с низким содержанием никотина; треугольники - опыты с гелем с высоким содержанием никотина. Отметка «0 мин» -величина МПП непосредственно перед . наложением геля. Горизонтальной полоской

0 15 30 45 60 отмечено время присутствия геля на Время, мин поверхности диафрагмальной мышцы.

В последующих опытах гель на 3 суток имплантировали к камбаповидной мышце. В контрольной группе из 8 крыс величина МПП составила -64.1 ± 0.3 мВ (308 волокон). 3 суток действия геля с низким содержанием никотина не влияли на величину МПП и его распределение (рис. 7 А). Гель с высоким содержанием никотина снижал значение МПП на 2.4 ± 0.3 мВ (р < 0.01) до уровня -61.7 ± 0.3 мВ (290 волокон), распределение МПП было сдвинуто в сторону деполяризации по сравнению с контролем (рис. 7 Б). Деполяризация сопровождалась увеличением возбудимости мышц, возможно, в результате снижения порога возбудимости мышечных волокон в этих условиях. Достоверных изменений в динамике утомления мышц, в течение 3 суток подвергавшихся действию никотина, не наблюдалось.

Контроль -64,1 ± 0,3 (№308)

гнсн

-64,5 ± 0,4 (п«267)

Контроль -64,1 ± 0,3 (п=308)

ГВСН -61,7 ± 0,3 (п=290)

110-, 1009080: 7060-с 5040302010-О-

-80 -75 -70 -65 -60 -55 -50 МПП, МВ

Рис. 7. Гистограммы распределения МПП мышечных волокон камбаловидной мышцы у контрольных крыс (гель без никотина) и у опытных крыс (гель с никотином). А - гель с низким содержанием никотина (ГНСН); Б - гель с высоким содержанием никотина (ГВСН). Темные столбцы - контроль; заштрихованные столбцы - никотин.

-80 -75 -70 -65 -60 -55 -50 -45 МПП, мВ

Поскольку мы имели дело с локальной аппликацией никотина, результаты данных опытов позволяют предположить, что никотин при хроническом действии может изменять мышечный электрогенез без побочных системных эффектов.

Хроническое действие никотина, получаемого с питьевой водой

В данной части работы исследовали долговременные (3 - 4.5 недели) эффекты никотина при его введении с питьевой водой. При таком способе введения концентрация циркулирующего никотина соответствует наномолярному уровню (ЬагеБОП й а1., 1988).

Регистрацию электрогенеза и сократительных характеристик изолированной диафрагмы проводили с 22-го по 31-й день хронического действия никотина. В этот период времени в контрольной группе (10 крыс) и в группе (9 крыс), получавшей никотин, величины МПП составили -78.1 ± 0.3 мВ (676 волокон) и -75.0 ± 0.3 мВ (622 волокна), соответственно

(рис. 8). То есть у крыс, получавших никотин, величина МПП была достоверно на 3.1 ±0.4 мВ (р<0.01) меньше, нежели у контрольных крыс.

Никотин -75.0 ± 0.3 мВ

\ у/ (622 волокон)

Рис. 8. Гистограммы распределения МПП мышечных волокон диафрагмальной мышцы у контрольных крыс и у крыс, получавших никотин с питьевой водой.

-90 -80 -70 МПП, МВ

Электрогенный вклад изоформ ИаД-АТФазы определяли, как и в опытах с острым действием никотина, с помощью уабаина в концентрациях 1 мкмоль/л и 500 мкмоль/л (см. выше). В контрольных мышцах электрогенные вклады уабаин-чувствительной а2-изоформы и уабаин-резистентной а1-изоформы составили соответственно 5.0 ± 0.4 мВ и 11.0 + 0.4 мВ. У крыс, получавших никотин, электрогенный вклад а2-изоформы составил 6.8 ± 0.5 мВ, то

есть был на 1.8 мВ (р < 0.01) больше, чем у контрольных крыс. Вклад а1-изоформы,

напротив, составил 6.6 ± 0.5 мВ и был на 4.4 мВ (р < 0.001) меньше, чем в контроле (рис. 9).

Рис. 9. Влияние уабаина (1 мкмоль/л и 500 мкмоль/л) на МПП мышечных волокон диафрагмы у контрольных крыс (светлые кружки) и у крыс, получавших никотин с питьевой водой (темные кружки). Горизонтальная полоска - пребывание уабаина в растворе. Вертикальные стрелки - моменты добавления разных концентраций уабаина. Темные столбцы слева -электрогенный вклад а1-изоформы Ка,К-АТФазы; светлые столбцы -вклад а2-изоформы.

Важно, что после полной блокады На,К-АТФазы 500 мкмоль/л уабаина уровень МПП в обеих группах крыс был одинаковым (около -62 мВ, рис. 9). Таким образом, хроническая никотинизация не влияет на основные параметры, определяющие формирование потенциала покоя в отсутствие активного транспорта №+ и К+, а наблюдаемая при никотинизации деполяризация мышечных волокон является главным образом следствием существенного снижения электрогенного вклада уабаин-резистентной а1-изоформы №,К-АТФазы.

Чтобы проследить динамику изменений мышечного электрогенеза, мы разделили результаты экспериментов на две группы. Группа 1 - опыты, проведенные в период с 22-го по 28-й день воздействия никотина (5 контрольных крыс и 5 крыс, получавших никотин). Группа 2 - опыты, проведенные в период с 29-го по 31-й день воздействия никотина (5 контрольных крыс и 4 крысы, получавшие никотин).

В группах 1 и 2 контрольных крыс не было различий в исходном уровне МПП (около -78 мВ) и не отличались величины электрогенных вкладов а1- и а2-изоформ На,К-АТФазы. Это свидетельствует о стабильности электрогенеза в контрольной группе животных в течение 10 дней опытов с регистрацией МПП. В мышцах крыс, получавших никотин, исходный уровень МПП в обеих группах был в среднем на 3 мВ ниже по сравнению с контрольными и также не различался (около - 75 мВ). Однако электрогенные вклады изоформ Ка,К-АТФазы в группах достоверно отличались. В мышцах крыс из группы 1 (22-й - 28-й день никотинизации) наблюдалось незначительное снижение электрогенных вкладов а.1- и а2-изоформ по сравнению с их исходными значениями у контрольных крыс. В мышцах крыс, подвергавшихся более продолжительному воздействию никотина (группа 2, 29-й - 31-й день никотинизации), наблюдались увеличение вдвое вклада а2-изоформы и снижение более чем в три раза вклада а1-изоформы по сравнению с

Время, мин

контрольной группой (рис. 10). Таким образом, продолжительное воздействие никотина не только изоформ-специфично, но и зависит от времени действия никотина.

Рис. 10. Динамика изменений электрогенных вкладов а1- и а2- изоформ №,К.-АТФазы в разные периоды никотинизации (1 и 2 группы) по сравнению с исходными значениями в контрольной группе животных. Темные столбцы - вклад а1-изоформы; светлые столбцы - вклад а2-изоформы.

Несмотря на наблюдаемые изменения электрогенеза, никотин при хроническом введении с питьевой водой не влиял на силу и временные параметры одиночных мышечных сокращений при прямой и непрямой стимуляции. Это позволяет предположить, что несмотря на деполяризацию мышечных волокон, никотин не вызывал нарушений на уровне нервно-мышечной передачи.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты нашей работы демонстрируют, что наномолярные концентрации никотина избирательно влияют на электрогенные вклады изоформ №,К-АТФазы в скелетной мышце крысы, причем эффект зависит от способа применения никотина и времени его действия. Никотин в концентрации 100 нмоль/л при остром действии селективно увеличивает электрогенный вклад уабаин-чувствительной а2-изоформы Na.K-АТФазы без изменения соответствующего вклада уабаин-резистентной al-изоформы, вызывая обратимую гиперполяризацию мембраны. При хроническом действии наномолярных концентраций никотина наблюдается долговременное увеличение электрогенного вклада а2-изоформы при существенном снижении вклада al-изоформы, что приводит в к деполяризации волокон.

Хорошо известно, что АХ в наномолярном диапазоне концентраций активирует Na,K-АТФазу, вызывая гиперполяризацию скелетных мышечных волокон (Dlouha et al., 1979; Vyskocil et al., 1983; Nikolsky et al., 1994). Механизм холинергической регуляции Na,K-АТФазы до конца не ясен. По данным, полученным в культуре скелетных мышечных клеток С2С12, такая регуляция реализуется через н-ХР, причем эффект осуществляется без участия ионных токов через каналы н-ХР (Henning et al., 1994). Наши опыты с применением неконкурентного блокатора ионного канала н-ХР проадифена подтверждают это предположение, что позволяет говорить о новой функции н-ХР не только как лиганд-управляемого канала, но и как регулятора №,К-АТФазы. В основе такой регуляции может

Хроническое введение никотина

С С

-62 мВ

-75 мВ -78 мВ

Исходное значение в контроле

1 группа 2 группа 22-28 29-31 день день

лежать функциональная и физическая связь н-ХР и Na,K-ATOa3bi. В последнее время получены многочисленные доказательства прямого молекулярного взаимодействия Na,K-АТФазы с самыми разнообразными соседними белками (Xie, Askari, 2002; Schoner, Scheiner-Bobis, 2007; Hazelwood et al., 2008). В ряде случаев это взаимодействие осуществляется в кавеолах, небольших инвагинациях мембраны, покрытых в мышечных волокнах белком кавеолин-3 (Cav-3) (Parton, Simons, 2007). Все больше накапливается данных о возможном молекулярном взаимодействии Na.K-АТФазы и н-ХР. Так, при выделении н-ХР из мембраны электрического органа Torpedo в препаратах даже самой высокой степени очистки всегда присутствует Ыа,К-АТФаза (Blanton et al., 2001; Carr et al., 1989). Данные по ко-иммунопреципитации подтверждают связь н-ХР с Na.K-АТФазой и, что особенно важно, с Cav-3 в диафрагме крысы, что позволяет предположить локализацию комплекса этих белков в кавеолах (Prokofiev et al., 2008). Последнее означает, что с н-ХР связана лишь часть Na,K-АТФазы, что соответствует расчетам, в соответствии с которыми только ~25% а2-изоформы Na.K-АТФазы функционально связаны с н-ХР и вовлечены в реализацию гиперполяризующего эффекта АХ (Krivoi et al., 2006). Как конкретно может осуществляться передача сигнала от н-ХР к Na.K-АТФазе в случае их молекулярной связи, неизвестно. Предположительно, ключевым событием для реализации функционального сопряжения указанных белков является связывание наномолярных концентраций агонистов н-ХР (в том числе никотина) с их специфическими сайтами на этом рецепторе, что приводит к модуляции Na.K-АТФазы и, как следствие, к гиперполяризации мембраны мышечного волокна (Кривой и др., 2004; 2006; Krivoi et al., 2006).

Наши опыты с локальной доставкой никотина к камбаловидной мышце с помощью силиконового геля позволяют предположить, что никотин при хроническом действии может изменять мышечный электрогенез без побочных системных эффектов. Тем не менее, полностью исключить возможность каких-то системных эффектов никотина нельзя. Например, известно, что хронически циркулирующий никотин вызывает как активацию, так и десенситизацию нейрональных н-ХР, причем выраженность этих процессов зависит от подтипа рецептора (Lester, Dani, 1995; Pidoplichko et al., 1997). Хроническое действие никотина сопровождается увеличением количества н-ХР разных типов (Wang, Sun, 2005), включая рецепторы скелетно-мышечного типа (Ке et al., 1998). Не исключено, что перечисленные процессы прямо или косвенно модифицируют функциональную связь между н-ХР и №,К-АТФазой в скелетной мышце. Нельзя исключить изменения уровня эндогенных дигиталисоподобных ингибиторов №,К-АТФазы (Schoner, 2002; Schoner, Scheiner-Bobis, 2007), причем никотин сам по себе может стимулировать их секрецию (Gooz et al., 2004).

Что касается силы сокращений в ответ на прямое или непрямое раздражение, то она не изменялась ни при хроническом, ни при остром применении никотина. Не изменялась и

динамика утомления. Таким образом, несмотря на наблюдаемые изменения электрогенеза (деполяризация при хроническом действии никотина и гиперполяризация при остром его применении), указанные воздействия не сказываются критически на функциональных характеристиках мышцы при использованных в работе паттернах стимуляции. Вместе с тем вызываемая циркулирующим никотином хроническая деполяризация может негативно влиять на функцию скелетных мышц в условиях более интенсивной активности, чем применявшаяся в наших опытах и, тем более в физиологических условиях in vivo.

ВЫВОДЫ

1. Добавление никотина (100 нмоль/л) в раствор вызывало гиперполяризацию мышечных волокон диафрагмы крысы величиной 4.4 ± 0.7 мВ (р < 0.01). Эффект блокировался специфическими ингибиторами Ыа,К-АТФазы уабаином (50 нмоль/л) или маринобуфагенином (2 нмоль/л), что свидетельствует о вовлечении в его реализацию Na,K-АТФазы.

2. Никотин или АХ (100 нмоль/л) вызывали начальную деполяризацию волокон камбаловидной мышцы крысы, сменяемую гиперполяризацией величиной до 4 мВ (р < 0.01). На фоне проадифена (5 мкмоль/л), блокатора открытого канала н-ХР, деполяризация отсутствовала при сохранении фазы гиперполяризации. Данные свидетельствуют о том, что ионные токи через открытые каналы н-ХР не являются причиной гиперполяризации мышечных волокон при действии никотина или АХ.

3. Вызываемая никотином (100 нмоль/л) при его остром действии гиперполяризация обусловлена увеличением электрогенного вклада уабаин-чувствительной а2-изоформы ИаД-АТФазы без изменения вклада уабаин-резистентной al-изоформы. Никотин вызывал снижение входного сопротивления мышечных волокон диафрагмальной мышцы на 22 %, этот эффект отсутствовал на фоне проадифена (5 мкмоль/л). Следовательно, изменение входного сопротивления мышечных волокон не могло быть причиной вызываемого никотином увеличения электрогенного вклада Иа.К-АТФазы.

4. Никотин в микромолярной концентрации при локальной аппликации к камбаловидной мышце крысы в течение 3-х суток с помощью силиконовых имплантантов вызывал хроническую деполяризацию мышечных волокон на 2.4 ± 0.3 мВ (р < 0.01), что свидетельствует о прямом модулирующем влиянии никотина на электрогенез скелетных мышечных волокон.

5. Поддержание наномолярного уровня циркулирующего никотина при его введении крысам в течение 3 - 4.5 недель с помощью питьевой воды вызывало хроническую деполяризацию мышечных волокон диафрагмальной мышцы на 3.1 ± 0.4 мВ (р < 0.01). Основные параметры, определяющие формирование потенциала покоя мембраны в отсутствие активного транспорта Na+ и К+, при этом не изменялись. Деполяризация обусловлена существенным снижением электрогенного вклада al-изоформы Na.K-АТФазы при незначительном увеличении вклада а2-изоформы.

6. Никотин в наномолярном диапазоне концентраций по-разному модулирует электрогенные вклады изоформ №,К-АТФазы в скелетной мышце крысы в зависимости от продолжительности его действия и способа его применения.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Васильев А.Н., Кравцова В.В., Прокофьев A.B., Ващинкина Е.В., Кривой И.И.

Физиологическая модель тестирования сердечных гликозидов, специфичных к а2 изоформе

Ыа,К-АТФазы // Сердечно-сосудистая хирургия и ангиология - 2003. Санкт-Петербург. 2003.

С.107-109.

2. Васильев А.Н., Прокофьев А.В., Ващиикина Е.В. Действие ингибиторов Na.K-АТФазы на ее разные изоформы // Всероссийская конференция "Человек и его здоровье". Тез. докл. Санкт-Петербург. 2004. С.50-51.

3. Кривой И.И., Драбкина Т.М., Васильев А.Н., Прокофьев А.В., Ващинкина Е.В., Кравцова

B.В. Изоформы №,К-АТФазы в скелетной мышце: физиологическая роль и эндогенные ингибиторы // Физиологический съезд им. И.П. Павлова. Тез. докл. Екатеринбург. 2004.

C.378-379.

4. Васильев А.Н., Драбкина Т.М., Ващинкина Е.В., Прокофьев А.В., Кривой И.И. Положительный инотропный эффект сердечных гликозидов в скелетной мышце // Сердечнососудистая хирургия и ангиология - 2004. Санкт-Петербург. 2004. С.61-63.

5. Кривой И.И., Драбкина Т.М., Васильев А.Н., Ващинкина Е.В., Прокофьев А.В., Ващинкина Е.В., Кравцова В.В. Регуляция работоспособности скелетной мышцы эндогенными дигиталисоподобными факторами // 3-я Всеросс. школа-конференция с международным участием по физиологии мышц и мышечной деятельности. Тез. докл. Москва. 2005. С.20.

6. Драбкина Т.М., Ващинкина Е.В., Прокофьев А.В., Васильев А.Н., Кравцова В.В., Кривой И.И. Положительный инотропный эффект и изменения злектрогенеза в диафрагме крысы при частичной и полной блокаде уабаин-чувствительной изоформы Ыа,К-АТФазы // Вестник СПбГУ. Сер. 3. Вып. 2.2006. С.60-67.

7. Krivoi I.I., Drabkina Т.М., Kravtsova V.V., Vasiliev A.N., Vaschinkina E.V., Prokofiev A.V., Kubasov I.V. The role of the a2 isoform of the Na,K-ATPase in electrogenesis and contractility of the rat skeletal muscle // Int. Symp. Biological Motility: Basic Research and Practice. Pushchino, Russia (May 11-15, 2006). P.50-51.

8. Кривой И.И., Драбкина T.M., Кравцова B.B., Васильев А.Н., Ващинкина Е.В., Прокофьев А.В., Кубасов И.В. Роль а2-изоформы Ыа+,К+-АТФазы в положительном инотропном эффекте уабаина и маринобуфагенина в диафрагме крысы // Биофизика. 2006. Т.51, № 5. С.906-911.

9. Кривой И.И., Кравцова В.В., Прокофьев А.В., Ващинкина Е.В., Кубасов И.В., Драбкина Т.М. Влияние маринобуфагенина на электрофизиологические и сократительные характеристики диафрагмы крысы // Росс, физиол. журнал им. И.М.Сеченова. 2006. Т. 92, № 12. С.1463-1473.

10. Кривой И.И., Драбкина Т.М., Васильев А.Н., Кубасов И.В., Прокофьев А.В., Ващинкина Е.В., Кравцова В.В. Регуляторная функция а2-изоформы №,К-АТФазы в диафрагме крысы // XX Съезд Физиологического общества им. И.П. Павлова. Тез. докл. Москва, 4-8 июня, 2007. С.51.

11. Kravtsova V.V., Prokofiev A.V., Drabkina Т.М., Krivoi I.I. Chronic nicotine exposure affects contribution of Na,K-ATPase to rat skeletal muscle electrogenesis // PENS Summer Course "Contemporary problems of Neurobiology: Molecular mechanisms of synaptic plasticity". Abstr. Kazan, September 10-24,2007. P. 16.

12. Drabkina T.M., Kravtsova V.V., Prokofiev A.V., Krivoi I.I. Effect of chronic nicotine exposure on electrogenic contribution of Na,K-ATPase in the rat diaphragm // Biological motility: achievements and perspectives (Eds. Z.A.Podlubnaya and S.L.Malyshev). Pushchino, Foton-Vek. 2008. VI. P.146-149.

13. Кравцова B.B., Драбкина T.M., Прокофьев A.B., Кубасов И.В., Васильев А.Н., Кривой И.И. Действие никотина на электрогенный вклад изоформ Na.K-АТФазы и сократительные характеристики скелетной мышцы крысы // Росс, физиол. журн. им. И.М.Сеченова. 2008. Т.94, № 10. С.1181-1190.

14. Prokofiev A.V., Kravtsova V.V., Drabkina Т.М., Krivoi I.I. Effect of chronic nicotine exposure on electrogenic contribution of Na,K-ATPase in the rat diaphragm // 3rd HBGS Student Council Symposium "Cell Structure and Organelles". Abstr. Helsinki, Finland. May, 2008. C. 25.

15. Prokofiev A.V., Drabkina T.M., Kravtsova V.V., Chibalin A.V., Krivoi I.I. Nicotine in low doses modulates Na,K-ATPase in the rat diaphragm in a time-dependent and isoform-specific manner // 12th Int. ATPase Conf.: Na,K-ATPase and Related Transport ATPases of P-type: Structures, Mechanisms, and Roles in Health and Disease. Abstr. Aarhus, Denmark. August 5-10,2008. P.152.

Подписано в печать 19.05.2009 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 1202.

Отпечатано в ООО «Издательство "ЛЕМА"»

199004, Россия, Санкт-Петербург, В.О., Средний пр., д.24, тел./факс: 323-67-74 e-mail: izd_lema@mail.ru http://www.lemaprint.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Прокофьев, Александр Владимирович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.И

1.1. Никотиновый холинорецептор.

1.1.1. Никотиновый холинорецептор скелетной мышцы.

1.1.2. Молекулярное разнообразие никотиновых холинорецепторов.

1.1.3. Возможные пути модуляции никотинового холинорецептора.

1.1.4. Десенситизация никотинового холинорецептора.

1.1.5. Никотин и механизм никотиновой зависимости.

1.1.6. Хроническое влияние никотина на скелетную мышцу.

1.2. №,К-АТФаза.

1.2.1. №,К-АТФаза: строение и функциональная роль.

1.2.2. Электрогенный вклад Ка,К-АТФазы в мембранный потенциал покоя.

1.2.3. Изоформы субъединиц Ка,К-АТФазы.

1.2.4. Ыа,К-АТФаза и ее изоформы в скелетной мышце.

1.2.5. Сердечные гликозиды и эндогенные ингибиторы Ыа,К-АТФазы.

1.2.6. Холинергическая регуляция №,К-АТФазы в скелетной мышце.

1.2.7. Функциональная связь никотинового холинорецептора скелетной мышцы с Ыа,К-АТФазой.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Общая характеристика объекта.

2.2. Экспериментальная процедура и растворы.

2.3. Микроэлектродная регистрация.

2.4. Регистрация мышечных сокращений.

2.5. Хроническое введение никотина.

2.5.1. Метод локальной доставки никотина к скелетной мышце.

2.5.2. Хроническое введение никотина с питьевой водой.

2.6. Обработка результатов и применяемые вещества.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Острое действие никотина.

3.1.1. Действие никотина на МПП и параметры ПД мышечных волокон диафрагмы крысы.

3.1.2. Совместное действие на МПП мышечных волокон диафрагмы крысы никотина и специфических ингибиторов №,К-АТФазы.

3.1.3. Роль ионных токов через никотиновый холинорецептор в реализации гиперполяризующего эффекта никотина.

3.1.4. Действие никотина на возбудимость и сократительные характеристики диафрагмы крысы.

3.2. Хроническое действие никотина (локальная доставка к мышце с помощью силиконового геля).

3.2.1. Физиологическое тестирование образцов геля.

3.2.2. Влияние хронической локальной доставки никотина на электрогенез, возбудимость и динамику утомления камбаловидной мышцы крысы.

3.3. Хроническое действие на диафрагму крысы никотина, получаемого с питьевой водой.

3.3.1. Хроническое действие никотина на МПП мышечных волокон диафрагмы крысы.

3.3.2. Хроническое действие никотина на электрогенный вклад изоформ №,К-АТФазы.

3.3.3. Хроническое действие никотина на сократительные характеристики диафрагмы крысы.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

5. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Модуляция никотином электрогенного вклада изоформ Na,K-ATФазы в скелетной мышце крысы"

Одним из физиологически активных компонентов табака является алкалоид никотин — специфический экзогенный лиганд н-ХР. Поскольку н-ХР регулируют нейрональную активность в структурах мозга, относящихся к системе естественного подкрепления, которая ответственна за формирование зависимости не только к никотину, но и к другим наркотикам (кокаин, амфетамин, морфин и др.) (Pierce et al., 2006), основное внимание исследователей во всем мире сосредоточено на роли никотина именно в ЦНС. Что касается скелетной мускулатуры, содержащей большой пул н-ХР, -потенциальных мишеней циркулирующего никотина, то имеются лишь единичные работы о влиянии хронической никотинизации на скелетные мышцы (Larsson et al., 1988; Price et al., 2003). Концентрация циркулирующего никотина при курении табака составляет порядка ста наномолей (Lester, Dani, 1995; Benowitz et al., 1997; Dani, De Biasi, 2001). He известно, вызывает ли этот никотин какие-то изменения на уровне молекулярно-клеточных процессов, обеспечивающих электрогенез, возбудимость, сократимость и работоспособность скелетной мышцы. В частности, нет данных о влиянии наномолярных концентраций никотина на критически важный для функционирования скелетной мышцы фермент — №,К-АТФазу, хотя известно о возможности холинергической модуляции этого белка (Кривой и др., 2004; 2006; Dlouha et al., 1979; Vyskocil et al., 1983; Nikolsky et al., 1994; Henning et al., 1994; Kragenbrink et al., 1996; Wang et al., 1994; Krivoi et al., 2006).

Иа,К-АТФаза поддерживает трансмембранные градиенты Na+ и К+ за счет активного транспорта этих ионов, что обеспечивает мембранный потенциал и возбудимость, а также ряд других важных транспортных механизмов клетки. Каталитическая а-субъединица Na,K-ATOa3bi экспрессируется в виде четырех изоформ (al - a4). По ряду данных основную насосную функцию в клетке выполняет изоформа al, тогда как прочие являются регуляторными (Mobasheri et al., 2000; Lopina, 2001; Mijatovic et al. 2007). В возбудимых клетках экспрессируются al-, a2- и a3-изоформы Na,K-ATOa3bi, в скелетных мышечных волокнах - al- и а2-изоформы (Lavoie et al., 1997; McDonough et al., 2002).

Имеются данные о негативном хроническом влиянии никотина на экспрессию а2-изоформы 1Ма,К-АТФазы в мозге крысы (Wang et al., 1994). Множество данных свидетельствуют о влиянии холиномиметиков на активность и индукцию №,К-АТФазы в зрелой скелетной мышце и в культуре скелетных мышечных клеток (Vyskocil et al., 1983; Henning et al., 1994; Nikolsky et al., 1994; Kragenbrink et al., 1996). Установлено, что АХ в наномолярном диапазоне концентраций активирует Na,K-ATOa3y, вызывая гиперполяризацию скелетных мышечных волокон (Vyskocil et al., 1983; Nikolsky et al., 1994), причем за счет увеличения электрогенной активности ее а2-изоформы (Кривой и др., 2006; Krivoi et al., 2006). Показано, что гиперполяризацию мышечных волокон вызывает и никотин в концентрации 100 нмоль/л (Krivoi et al., 2006), однако, как влияет при этом никотин на электрогенную активность №,К-АТФазы и ее изоформ неизвестно.

В целом, в данный момент вопрос об остром и хроническом влиянии никотина в наномолярных концентрациях, сопоставимых с уровнем циркулирующего никотина у курильщиков табака, на Ка,К-АТФазу и ее изоформы в скелетной мышце, а также электрогенез и работоспособность скелетной мускулатуры не изучен.

Цель работы: исследование влияния никотина в наномолярном диапазоне концентраций на электрогенную активность изоформ ИаДО АТФазы и электрогенез скелетной мышцы.

Задачи исследования:

1) Провести анализ гиперполяризующего эффекта никотина в скелетной мышце крысы, включающий изучение действия специфических блокаторов Ка,К-АТФазы, динамики развития эффекта и роли ионных токов через каналы н-ХР в его реализации.

2) Используя фармакологический подход с применением специфического блокатора Ка,К-АТФазы уабаина сравнить влияние острого и хронического действия никотина в наномолярном диапазоне концентраций на электрогенные вклады уабаин-чувствительной (а2) и уабаин-резистентной (а1) изоформ Ка,К-АТФазы.

Положения, выносимые на защиту:

1. Никотин (100 нмоль/л) при остром действии вызывает гиперполяризацию мышечных волокон скелетной мышцы крысы величиной около 4 мВ за счет селективного увеличения электрогенного вклада ос2-изоформы Ыа,К-АТФазы. Ионные токи через каналы н-ХР не являются фактором развития гиперполяризации, вызываемой никотином.

3. Хроническое введение никотина крысам в течение 3 — 4.5 недель с помощью питьевой воды приводит к деполяризации мышечных волокон скелетной мышцы за счет существенного снижения электрогенного вклада а1-изоформы №,К-АТФазы при незначительном увеличении вклада а2-изоформы.

Научная новизна. Впервые установлено, что никотин, добавляемый в раствор в концентрации 100 нмоль/л, вызывает гиперполяризацию мышечных волокон изолированной скелетной мышцы крысы. Установлено, что причиной гиперполяризации является селективное увеличение электрогенной активности уабаин-чувствительной а2-изоформы №,К-АТФазы без изменения электрогенной активности уабаин-резистентной а1-изоформы. Показано, что проадифен — неконкурентный блокатор открытого ионного канала н-ХР, не влияет на величину гиперполяризации, вызываемой 100 нмоль/л никотина, что свидетельствует о развитии этого эффекта и в условиях блокады ионных токов через каналы н-ХР. Установлено, что вызываемое никотином увеличение электрогенного вклада №,К-АТФазы не является следствием изменения входного сопротивления мембраны мышечных волокон. Впервые использован метод локальной доставки никотина к скелетной мышце с применением нетоксичных силиконовых имплантантов, содержащих никотин. Установлено, что никотин в микромолярном диапазоне концентраций при локальной доставке к камбаловидной мышце крысы в течение 3-х суток вызывает долговременную деполяризацию мышечных волокон. Впервые в условиях моделирования формирования никотиновой зависимости у крыс, хронически (в течение 3 -4.5 недель) получавших никотин с питьевой водой, обнаружено снижение мембранного потенциала покоя (МПП) волокон диафрагмальной мышцы преимущественно за счет уменьшения электрогенного вклада а1-изоформы

NaJv-АТФазы, при незначительном увеличении электрогенного вклада а2-изоформы.

Практическая значимость работы. Полученные данные свидетельствуют об изоформ-специфическом участии Ыа,К-АТФазы в регуляции электрогенеза скелетной мышцы крысы никотином в наномолярном диапазоне концентраций, что раскрывает новый механизм модуляции скелетной мускулатуры циркулирующими холинергическими лигандами. Эти знания важны для более глубокого понимания механизмов побочных эффектов применяемых в клинике антихолинэстеразных препаратов (используемых как стимуляторы памяти, при лечении ряда нейродегенеративных расстройств, миастении и др.)3 для выявления новых механизмов никотиновой интоксикации при табакокурении.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Российской медико-биологической конференции "Человек и его здоровье" (Санкт-Петербург, 2004); Всероссийской школе "Актуальные проблемы нейробиологии" (Казань, 2005); PENS Summer Course "Contemporary problems of Neurobiology: Molecular mechanisms of synaptic plasticity" (Kazan, Russia, 2007); 3rd HBGS Student Council Symposium "Cell Structure and Organelles" (Helsinki, Finland, 2008); International Symposium "Biological Motility: Basic Research and Practice" (Pushchino, Russia, 2008); 12th International ATPase Conference "Na, K-ATPase and Related Transport ATPases of P-type: Structures, Mechanisms, and Roles in Health and Disease" (Arhus, Denmark, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ, из них 4 статьи в рецензируемых изданиях.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Прокофьев, Александр Владимирович

5. ВЫВОДЫ

3. Вызываемая никотином (100 нмоль/л) при его остром действии гиперполяризация обусловлена увеличением электрогенного вклада уабаин-чувствительной а2-изоформы Ыа,К-АТФазы без изменения вклада уабаин-резистентной а1-изоформы. Никотин вызывал снижение входного сопротивления мышечных волокон диафрагмальной мышцы на 22 %, этот эффект отсутствовал на фоне проадифена (5 мкмоль/л). Следовательно, изменение входного сопротивления мышечных волокон не могло быть причиной вызываемого никотином увеличения электрогенного вклада Ыа,К-АТФазы.

5. Поддержание наномолярного уровня циркулирующего никотина при его введении крысам в течение 3 — 4.5 недель с помощью питьевой воды вызывало хроническую деполяризацию мышечных волокон диафрагмальной мышцы на 3.1 ± 0.4 мВ (р < 0.01). Основные параметры, определяющие формирование потенциала покоя мембраны в отсутствие активного транспорта и К+, при этом не изменялись. Деполяризация обусловлена существенным снижением электрогенного вклада а1-изоформы №,К-АТФазы при незначительном увеличении вклада а2-изоформы.

6. Никотин в наномолярном диапазоне концентраций по-разному модулирует электрогенные вклады изоформ Ка,К-АТФазы в скелетной мышце крысы в зависимости от продолжительности его действия и способа его применения.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Прокофьев, Александр Владимирович, Санкт-Петербург

1. Болдырев A.A. Na/K-АТФаза свойства и биологическая роль // Соросовский образовательный журнал. — 1998. — Т. 4, № 29. — С. 2-9.

2. Веренинов A.A., Марахова И.И. Транспорт ионов у клеток в культуре. Л.: Наука. 1986. - 292 с.

3. Голиков С.Н., Долго-Сабуров В.Б., Елаев Н.Р., Кулешов В.И. Холинергическая регуляция биохимических систем клетки. М.: Медицина. - 1985.-224 с.

4. Гранит Р. Основы регуляции движений: Пер. с англ. М.: 1973. -289 с.

5. Драбкина Т.М., Кривой И.И. От разнообразия молекулярных форм к функциональной специализации олигомерных белков. Никотиновый холинорецептор, ацетилхолинэстераза и Na+,K+-AT<Da3a // Цитология. 2004. -Т. 46, №2.-С. 89-104.

6. Жуковский А.Н., Бродский А.К., Славинский Д.А. Природа и общество в цифрах на пороге нового тысячелетия. — СПб. 2004. — 66 с.

7. Кривой И.И., Драбкина Т.М., Васильев А.Н., Кравцова В.В. О роли уабаин-чувствительной а2 изоформы №+,К+-АТФазы в скелетной мышце крысы // Биол. мембраны. 2006 а. — Т. 23. № 2. — С. 139-147.

8. Крутецкая З.И., Лебедев O.E., Курилова Л.С. Механизмы внутриклеточной сигнализации. СПб.: Изд-во СПбГУ. — 2003. - 208 с.

9. Крылов Б.В., Дербенев A.B., Подзорова С.А., Людыно М.И., Кузьмин A.B., Изварина Н.Л. Морфин уменьшает чувствительность к потенциалу медленных натриевых каналов // Физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 1999. - Т. 85. - С. 225-236.

10. Марахова И.И. Ионный транспорт и пролиферация клеток // Цитология. 1991. - Т. 33, № 11. - С. 67-77.

11. Ноздрачев А.Д., Поляков Е.Л. Анатомия крысы. СПб.: Изд. «Лань».-2001.-464 с.

12. Николе Дж. Г., Мартин Ф.Р., Валлас Б. Дж. и др. От нейрона к мозгу. М.: УРСС, 2003. - 672 с.

13. Первис Р. Микроэлектродные методы внутриклеточной регистрации и ионофореза. М.: Мир, 1983. — 208 с.

14. Прозоровский В.Б., Скопичев В.Г. Морфологические изменения эритроцитов мышей и крыс при воздействии фосфорорганических ингибиторов холинэстераз // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 1993. - Т. 115, №4. - С. 443-445.

15. Скок В.И., Селянко А.А., Деркач В.А. 1987. Нейрональные холинорецепторы. — М.: Наука. 1987. — 343 с.

16. Скопичев В.Г., Прозоровский В.Б., Медведева С.В. Участие дистантного холинергического механизма в реакциях сосудистого русла на интоксикацию фосфорорганическими ингибиторами холинэстераз // Морфология. 2000. - Т. 118, № 4. - С. 66-69.

17. Федин А.Н., Ноздрачев А.Д., Бреслав И.С. Физиология респираторных систем. СПб.: Изд. СПбГУ. 1997. — 183 с.

18. Ходоров Б.И. Общая физиология возбудимых мембран (руководство по физиологии). М.: Наука. - 1975. - 406 с.

19. Чухловина M.JI. Миастения. Руководство по детской неврологии, (под ред. В.И. Гузевой). СПб.: Фолиант. - 1997. - 434-438 с.

20. Шмерлинг М.Д., Филюшина Е.Е., Бузуева И.И., Гребнева O.JL, Плотникова Н.А. Скелетная мышца. Структурно-функциональные аспекты адаптации. Под ред. акад. АМН СССР Ю.И.Бородина. Новосибирск: Наука. Сиб. отд-ние. - 1991. - 121 с.

21. Aizman О., Uhlen P., Lai М., Brismar Н., Aperia A. Ouabain, а steroid hormone that signals with slow calcium oscillations // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2001. - V.98. - P. 13420-13424.

22. Akk G., Auerbach A. Activation of muscle nicotinic acetylcholine receptor channels by nicotinic and muscarinic agonists // Br. J. Pharmacol. 1999. -V. 128.-P. 1467-1476.

23. Allard В., Bernengo J.C., Rougier O., Jacquemond V. Intracellular Ca2+ changes and Ca2+-activated K+ channel activation induced by acetylcholine atthe endplate of mouse skeletal muscle fibres // J. Physiol. 1996. - V. 494. - P. 337-349.

24. Arnon A., Hamlyn J.M., Blaustein M.P. Ouabain augments Ca2+ transients in arterial smooth muscle without raising cytosolic Na+ // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2000. - V. 279. - H679-H691.

25. Begyun P., Beggah A., Cotecchia S., Geering K. Adrenergic, dopaminergic, and muscarinic receptor stimulation leads to PKA phosphorylation of Na-K-ATPase // Am. J. Physiol. 1996. - V.270. - C131-C137.

26. Benowitz N.L., Zevin S., Jacob P. Sources of variability in nicotine and cotinine levels with use of nicotine nasal spray, transdermal nicotine, and cigarette smoking // Br. J. Clin. Pharmacol. 1997. - V. 43. - P.259-267.

27. Biser P.S., Thayne K.A., Fleming W.W. et al. Na,K-ATPase a-subunit isoform distribution and abundance in guinea-pig longitudinal muscle/myenteric plexus after exposure to morphine // Brain Res. 2002. - V.931. - P. 186-193.

28. Blanco G., Mercer R.W. Isozymes of the Na-K-ATPase: heterogeneity in structure, diversity in function // Am. J. Physiol. 1998. - V. 275. - F633-F655.

29. Blaustein M.P. Physiological effects of endogenous ouabain: control of intracellular Ca stores and cell responsiveness // Am. J. Physiol. (Cell Physiology 33). 1993. - V. 264. - C1367- C1387.

30. Blaustein M.P., Golovina V.A. Structural complexity and functional diversity of endoplasmic reticulum Ca2+ stores // Trends Neurosci. 2001. - V. 24. -P. 602-608.

31. Boyd N.D. Two distinct kinetic phases of desensiti-zation of acetylcholine receptors of clonal rat pcl2 cells // J. Physiol. 1987. - V. 389. - P. 45- 67.

32. Briggs C.A., Mckenna, D.G. Activation and inhibition of the human a7 nicotinic acetylcholine receptor by agonists // Neuropharmacology. 1998. — V. 37.-P. 1095-1102.

33. Carr C., Fischbach G.D., Cohen J.B. A novel 87,000-Mr protein associated with acetylcholine receptors "in Torpedo electric organ and vertebrate skeletal muscle // J. Cell Biol. 1989. -V. 109. - P. 1753-1764.

34. Changeux J., Edelstein S.J. Allosteric mechanisms in normal and pathological nicotinic acetylcholine1 receptors // Curr. Opin. Neurobiol. — 2001. — V. 11.-P. 369-377.

35. Chen Z., White M. Forskolin Modulates Acetylcholine Receptor Gating by Interacting with the Small Extracellular Loop Between the M2 and M3 Transmembrane Domains // Cellular and Molecular Neurobiology. 2000. — V. 20.-P. 569-577.

36. Clausen T. Long- and short-term regulation of the Na+-K+ pump in skeletal®muscle // News Physiol. Sci. 1996. - V. 11. - P. 24-30.

37. Clausen T. Clinical and therapeutic significance of the Na+,K+ pump // Clinical science. 1998. - V. 95. - P. 3-17.

38. Clausen T. Na+-K+ pump regulation and skeletal muscle contractility // Physiol. Rev. -2003. V.83. - P. 1269-1324.

39. Clausen T. Role of Na ,IC -pumps and transmembrane Na+,K+ distribution in muscle function // Acta Physiol. 2008. - V. 192. - P. 339-349

40. Connold A.L., Greensmith L., Tyc F., Vrbova G. A simple method for local delivery of various substances to. the rat neuromuscular system // Brain Research Protocols. 1997. - V. 1. - P. 79 - 82.

41. Cougnon M.H., Moseley A.E., Radzyukevich T.L., Lingrel J.B., Heiny J.A. Na,K-ATPase a- and (3-isoform expression in developing skeletal muscles: oco correlates with t-tubule formation // Eur. J. Physiol. — 2002. V. 445. -P. 123-131.

42. Curtis L., Buisson B., Bertrand S., Bertrand D. Potentiation of human alpha4beta2 neuronal nicotinic acetylcholine receptor by estradiol // Mol. Pharmacol. -2002. V. 61.-P. 127-135. ,

43. Dani J.A., De Biasi M: Cellular mechanisms of nicotine addiction // Pharmacol. Biochem. Behavior. 2001. - V. 70. - P. 439-446.

44. Dani J.A., Heinemann S. Molecular and cellular aspects of nicotine abuse // Neuron. 1996. - V. 16. - P. 905- 908.

45. Danilenko M.P., Turmukhambetova V.C., Yesirev O.V., Tkachuk V.A., Panchenko M.P. Na+-K+-ATPase-G protein coupling in myocardial sarcolemma: separation and reconstitution // Am. J. Physiol. 1991. - V. 261, № 4.-P. 87-91.

46. Dehkordi O., Millis R.M., Dennis G.C., Coleman B.R., Johnson S.M., Changizi L., Ovid Trouth C. Alpha-7 and 'alpha-4 nicotinic receptor! subunit immunoreactivity in genioglossus muscle motoneurons // Respir. Physiol. Neurobiol.-2005.-V. 145.-P. 153-61.

47. Dezaki K., Tsuneki H., Kimura I. Methyllycaconitine-sensitive neuronal nicotinic receptor-operated slow Ca2+signal by local application or perfusion of ACh at the mouse neuromuscular junction // Neurosci. Res. 1999. -V. 33.-P. 17-24.

48. Dlouha H., Teisinger J., Vyskocil F. Activation of membrane Na+/K+-ATPase of mouse skeletal muscle by acetylcholine and its inhibition by a-bungarotoxin, curare and atropine // Pflugers Arch. 1979. - V. 380, № 1. - P. 101-104.

49. Dobretsov M., Hastings S.L., Sims T.J., Stimers J.R., Romanovsky D. Stretch receptor-associated expression of a3 isoform of the Na+,K+-ATPase in rat peripheral nervous system //Neurosci. 2003. -V. 116. - P. 1069-1080.

50. Dobretsov M., Stimers J.R. Neuronal function and alpha3 isoform of the Na/K-ATPase // Front. Biosci. 2005. - V. 10. - P. 2373-2396.

51. Elfman L., Heilbronn E., Jorgensen P. Fraction of protein components of plasma membranes from the electric organ Torpedo marmorata // Biochim. Biophys. Acta. 1982. - V.693, № 2. - P.273-279.

52. Fenster C.P., Beckman M.L., Parker J.C., Sheffield E.B., Whitworth T.L., Quick M.W., Lester R.A. Regulation of alpha4beta2 nicotinic receptor desensitization by calcium and protein kinase C // Mol. Pharmacol. 1999. - V. 55.-P. 432-443.

53. Garbus I., Bouzat C., Ban-antes F.J. Steroids differentially inhibit the nicotinic acetylcholine receptor // Neuroreport. V. - 12. - P. 227-231.

54. Garland C.M., Foreman R.C., Chad J.E., Holden-Dye L., Walker R.J. The actions of muscle relaxants at nicotinic acetylcholine receptor isoforms // Eur. J. Pharmacol. 1998. - V.357. - P.83-92.

55. Glitsch H.G. Electophysiology of the sodium-potassium-ATPase in cardiac cells // Physiol. Rev. -2001. V. 81, № 4. - P. 1791 -1826.

56. Golden W.G., Martin L.J. Low-dose ouabain protects against excitotoxic apoptosis and up-regulates nuclear BCL-2 in vivo // Neurosci. 2006.- V.137. -P.133—144.

57. Gooz-M., Toth-M., VakkurifO. et al: Endogenous ouabain-like factor (OLF) secretion is modulated by nicotinic mechanisms in rat adrenocortical cells // Life Sci. 2004. - V.74, №17. - P.2111-21-28.

58. Gorman A., Marmor M. Steady-state1 contribution of the sodium pump to the resting potention of a molluscan neurone // J. Physiol. 1974. - V.242. - P. 35-48.

59. Grutter T., Changeux J.-P. Nicotinic receptors in wonderland.// Trends Biochem. Sci. -2001. -V. 26. P. 459-462.

60. Haber R.S., Loeb J.N. Selective induction of high- ouabain -affinity isoform of Na+-K+-ATPase by thyroid hormone // Am. J. Physiol. 1988. - V. 255. - E912-E919.'

61. Hartford A.K., Messer M.L., Moseley A.E., Lingrel J.B1., Delamere N.A. Na,K—ATPase a2 inhibition alters calcium responses in optic nerve astrocytes // Glia. 2004. - V. 45. - P. 229-237.

62. Hazelwood L.A., Free R.B., Cabrera D.M., Skinbjerg-M., Sibley D.R. Reciprocal modulation of function between the D1 and D2 dopamine receptors and1 the Na+,K+-ATPase // J. Biol. Chem. November 4, 2008, Manuscript M805520200.

63. He S., Shelly D.A., Moseley A.E., James P.F., James J:H., Paul R.J., Lingrel J.B. The ar and a2-isoforms of Na-K-ATPase play different roles in skeletal muscle contractility // Am. J. Physiol. Reg. Integ. Gomp. Physiol. -2001. -V. 281. R917-R925.

64. Henning R.H., Nelemans S.A., van» den Akker J. et al. Induction of Na,K-ATPase activity by long-term stimulation of nicotinic acetylcholine receptors in C2C12 myotubes // Br. J. Pharmacol. 1994. - V.l 11. -P.459-464.

65. Hicks A., McComas A.J. Increased sodium pump activity following repetitive stimulation of rat soleus muscles // J. Physiol. 1989. - V.414. - P.337-349.

66. Hsiao B., Dweck D., Luetje C.W. Subunit-dependent modulation of neuronal nicotinic receptors by zinc // J. Neurosci. — 2001. — V. 21. — P. 1848 — 1856.

67. Huganir R.L. Regulation of the nicotinic acetylcholine receptor by serine and tyrosine protein kinases // Adv. Exp. Med. Biol. 1991. - V. - 278. - P. 279-294.

68. Hundal H.S., Marette-A., Ramlal T., Liu Z., Klip A. Expression of (3 subunit isoforms of the Na+,K+-ATPase is muscle type-specific // FEBS Lett. -1993. V. 328. - P. 253-258.

69. James P.F., Grupp I.L., Grupp G., et al. Identification of a specific role for the Na,K-ATPase alpha 2 isoform as a regulator of calcium in the heart // Mol. Cell. 1999. - V.3. -P.555-563.

70. Jaworski A., Burden S.J. Neuromuscular synapse formation in mice lacking motor-neuron and skeletal- muscle-derived neuregelin-1 // J. Neurosci. -2006. V. - 26. - P. 655-661.

71. Jones S., Sterling S., Jerrel L.Y. Nicotinic receptors in the brain: correlating physiology with function// Trends Neurosci. 1999. - V.22. - P.555-561.

72. Karlin, A. On the application of "a plausible model" of allosteric proteins to the receptor for acetylcholine // J. Theor. Biol. 1967. - V. 16. - P. 306-320.

73. Karlin A. Emerging structure of the nicotinic acetylcholine receptors // Nat. Rev. Neurosci. 2002. - V. 3. - P. 102- 114.

74. Katz B., Miledi R. Transmitter leakage from motor nerve endings // Proc. Roy. Soc. B. 1977. - V.196. - P.59-72.

75. Katz B., Thesleff S. A study of the desensitization produced by acetylcholine at the motor end-plate // J. Physiol. 1957. - V. 138, №1. - P. 6380.

76. Koenen M., Peter C., Villaroel A., Witzemann V., Sakmann B. Acetylcholine receptor channel subtype directs the innervation pattern of skeletal muscle // EMBO Reports. 2005. - V. 6. - P. 570-576.

77. Kong J.-Q., Leedham J.A., Taylor D.A., Fleming W.W. Evidence that tolerance and dependence of guinea pig myenteric neurons to opioids is a function of altered electrogenic sodium-potassium» pumping // J. Pharmacol. Exp. Ther. -1997.-V. 280.-P. 593-599.

78. Kragenbrink R., Higham S.C., Sansom S.C., Pressley T.A. Chronic stimulation of acetylcholine receptors: differential effects on Na,K-ATPase isoforms in a myogenic cell line // Synapse. -1996. V. 23, № 3. - P. 219-223.

79. Kristensen M., Rasmussen M.K., Juel C. Na+-K+ pump location and translocation during muscle contraction in rat skeletal muscle // Pflugers Arch. — Eur. J. Physiol. 2008. - DOI 10.1007/s00424-008-0449-x.

80. Krivoi I.I., Drabkina T.M., Kravtsova V.V., Vasiliev A.N., Eaton M.J., Skatchkov S.N., Mandel F. On the functional interaction between nicotinicacetylcholine receptor and Na,K-ATPase // Pflug. Archiv Eur. J. Physiol. - 2006. - V.452, №6. - P.756-765.

81. Larsson L., Orlander J. Skeletal muscle morphology, metabolism and function in smokers and non-smokers. A study on smoking discordant monozygous twins. // Acta Physiol. Scand. 1984. - V. 10. - P. 343-352.

82. Larsson L., Orlander J., Ansved T. Effects of chronic nicotine exposure on contractile enzyme-histochemical and biochemical properties of fastand slow-twitch muscles in the rat//Acta Physiol. Scand. 1988. - V.134. - P.519-527.

83. Lavoie L., Levenson R., Martin-Vasallo P., Klip A. The molar ratios of a and (3 subunits of the Na+-K+-ATPase differ in distinct subcellular membranes from rat skeletal muscle // Biochem. 1997. - V. 36. - P. 7726-7732.

84. Le Novere N., Grutter T., Changeux J.-P. Models of the extracellular domain of the nicotinic receptors and of agonist- and Ca~ -binding sites. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. - V.99. -P. 3210-3215.

85. Lester R.A., Dani J.A. Acetylcholine receptor desensitization induced by nicotine in rat medial habenula neurons // J. Neurophysiol. 1995. - V. 74. - P. 195-206.

86. Lichtstein D., Rosen H. Endogenous digitalis-like Na,K-ATPase inhibitors, and brain function // Neurochem. Res. 2001. - V. 26, № 8/9. - P. 971978.

87. Lopina O.D. Interaction of Na,K-ATPase catalytic subunit with cellular proteins and other endogenous regulators // Biochemistry (Moscow). -2001.-V. 6.-P. 1122-1131.

88. Luetje C.W., Patrick J.P. Both-and-subunits contribute to the agonist sensitivity of neuronal nicotinic acetylcholine receptors // J. Neurosci. 1991. - V. 11.-P. 837-845.

89. Magazanik L.G., Vyskocil F. Desensitization at the neuromuscular junction / In: "Motor innervation of muscle", ed. Thesleff. 1976. - P. 151-176.

90. Marette A., Krischer J., Lavoie L., Ackerley C., Carpentier J-L., Klip A. Insulin increases the Na-K-ATPase a2-subunit in the surface of rat skeletal muscle: morphological evidence // Am. J. Physiol. 1993. - V. 265. - C1716-C1722.

91. Marques M.J., Pertille A., Carvalho C.L.T., Neto H.S. Acetylcholine receptor organization at the dystrophic extraocular muscle neuromuscular junction // Anatom. Record. 2007. - V. 290. - P. 846-854.

92. Mathias R.T., Cohen I.S., Gao J., Wang Y. Isoform-specific regulation-of the Na+-K+ pump in heart // News Physiol. Sci. 2000. - V. 15. - P. 176-180.

93. McDonough A.A., Thompson C.B., Youn J.H. Skeletal muscles regulates extracellular potassium // Am. J. Physiol. 2002. - V. 282 (Renal Physiol.). - F967-F974.

94. McGehee D.S., Role L.W. Physiological diversity of nicotinic acetylcholine receptors expressed by vertebrate neurons // Ann. Rev. Physiol. -1995.-V.57.-P. 521-546.

95. Metzger J.M., Scheidt K.B., Fitts R.N. Histochemicall and physiological characteristics of the rat diaphragm // J. Appl. Physiol. 1985. - V. 58, №4.-P. 1085-1091.

96. Mishina M., Takai T., Imoto K., Noda M., Takahashi T., Numa S., Methfessel C., Sakmann B. Molecular distinction between fetal' and adult forms of muscle acetylcholine receptor//Nature. 1986. -V. 321. - P. 406-411.

97. Missias A.C., Chu G.C., Klocke B.J., Sanes J.R., Merlie J.P. Maturation of the acetylcholine receptor in skeletal muscle: regulation of the AChR c-to-e switch // Dev. Biol. 1996. - V. 179. - P. 223-238.

98. Monod, J., Wyman, J., Changeux, J.P. On the nature of allosteric transitions: a plausible model // J. Mol. Biol. V. 12. - P. 88-118.

99. Mwenifumbo J. C., Sellers E. M., Tyndale R. F. Nicotine metabolism and CYP2A6 activity in a population of black African descent: Impact of gender and light smoking // Drug Alcohol Depend. 2007. - V. 89, № 1. - P. 24-33.

100. Nikolsky E.E., Zemkova H., Voronin V.A., Vyskocil F. Role of non-quantal acetylcholine release in surplus polarization of mouse diaphragm fibres at the endplate zone // J. Physiol. 1994. - V. 477, № 3. - P. 497-502.

101. Nisell M., Nomikes G.G., Chergui K., Grillner P., Svensson T.H. Chronic nicotine enhances basal and nicotine-induced Fos immunoreactivity preferentially in the medial prefrontal cortex of the rat // Neuropsychopharmacol. -1997. -V. 17. — P. 151-161.

102. Nishizaki T., Sumikawa K. Effects of PKC and PKA phosphorylation on desensitization of nicotinic acetylcholine receptors // Brain Res. 1998. - V. 812.-P. 242-245.

103. Paradiso K., Zhang J., Steinbach J.H. The C terminus of the human nicotinic alpha4beta2 receptor forms a binding site required for potentiation by an estrogenic steroid//J. Neurosci.-2001.-V. 21.-P. 6561-6568.

104. Parton R.G., Simons K. The multiple faces of caveolae // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2007. - V. 8. - P. - 185-194.

105. Paterson B., Nordberg A. Neuronal nicotinic receptors in the human brain // Progr. Neurobiol. 2000. - V.61. - P. 75-111.

106. Peper K., Bradley R.J., Dreyer F. The acetylcholine receptor at the neuromuscular junction // Physiol. Rev. 1982. - V.62, № 4. - P. 1271-1340.

107. Pidoplichko V.I., Noguchi J., Areola O.O., Liang Y., Peterson J., Zhang T., Dani J.A. Nicotinic cholinergic synaptic mechanisms in the ventral tegmental area contribute to nicotine addiction // Leam Mem. 2004. - V. 11, № l.-P. 60-69.

108. Pidoplichko V.I., De Biasi M., Williams, J.T. Dani J.A. // Nicotine activates and desensitizes midbrain dopamine neurons // Nature. — 1997. V.390. -P. 401-404.

109. Price T.B., Krishnan-Sarin S., Rothman D.L. Smoking impairs muscle recovery from exercise // Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2003. - V.285. -P.l 16-122.

110. Prince R.J., Sine S.M. Acetylcholine and epibatidine binding to muscle acetylcholine receptors distinguish between concerted and uncoupled models // J. Biol. Chem. 1999. - V. 274. - P. 19623-19629.

111. Raftery M.A., Hunkapiller M.W., Strader C.D., Hood L.E. Acetylcholine receptor: complex of homologous subunits // Science. 1980. — V. 208.-P. 1454-1456i

112. Reitstetter R., Lukas R.J., Gruener R. Dependence of nicotinic acetylcholine receptor recovery from desensitization on the duration of agonist exposure // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1999. - V. 289. - P. 656-660.

113. Rowell P.P., Duggan D.S. Long-lasting inactivation of nicotinic receptor function in vitro by treatment with high concentrations of nicotine // Neuropharmacology. 1998. - V. 37. - P. 103-111.

114. Ryan S.E., Blanton M.P., Baenziger J.E. A conformational intermediate between the resting and desensitized states of the nicotinic acetylcholine receptor // J. Biol. Chem. 2001. - V. 276, № 7. - P.4796^803.

115. Qu Z.C., Moritz E., Huganir R.L. Regulation of tyrosine phosphorylation of the nicotinic acetylcholine receptor at the rat neuromuscular junction // Neuron. 1990. V. 4. - P. 367-378.

116. Quick M.W., Lester R.A. Desensitization of neuronal, nicotinic receptors // J. Neurobiol. 2002. - V. 53. - P. 457-478.

117. Salamone F., Zhou M. Aberrations in nicotinic acetylcholine receptor structure, function, and expressions: implications in disease // MJM. 2000. — V. 5.-P. 90-97.

118. Sanes J.R., Lichtman J.W. Development of the vertebrate neuromuscular junction // Ann. Rev. Neurosci. 1999. - V.22. - P.389-442.

119. Sejersted O.M., Sjogaard G. Dynamics and consequences of potassium shifts in skeletal muscle and heart during exercise // Physiol. Rev. -2000.-V. 80.-P. 1411-1481.

120. Scheiner-Bobis G., Schoner W. A fresh facet for ouabain action // Nat. Med.-2001.-V. 7.-P. 1288-1289.

121. Schoner W. Endogenous cardiac glycosides, a new class of steroid hormones // Eur. J.Biochem. 2002. - V. 269. - P. 2440-2448.

122. Schoner W., Scheiner-Bobis G. Endogenous and Exogenous Cardiac Glycosides and their Mechanisms of Action// Am. J. Cardiovasc. Drugs. 2007. -V.7, № 3. - P. 173-189.

123. Sejersted O.M., Sjogaard G. Dynamics and consequences of potassium shifts in skeletal muscle and heart during exercise // Physiol. Rev. -2000.-V. 80;-P. 1411-1481.

124. Shallom J.M., Katyare S.S. Altered synaptosomal ATPase activity in rat brain following prolonged in vivo treatment with nicotine // Biochem. Pharmacol. 1985. -V. 34, № 19. - P. 3445-3449.

125. Sharma G., Vijayaraghavan; S. Nicotinic cholinergic signaling, in hippocampal astrocytes involves calcium-induced calcium release fromintracellular stores // Proc. Natl. Acad. Sci. 2001. - V. 98. - P. 4148-4153.

126. Simasko S.M., Soares J.R., Weiland G.A. Two components of carbamylcholine-induced loss of nicotinic acetylcholine receptor function in the neuronal cell line PCI2 // Mol. Pharmacol. 1986. - V. 30. - P. 6-12.

127. Skou J.C. The influence of some cations on an adenosine triphosphatase from peripherical nerves // Biochem. Biophys. Acta. 1957. - V. 23.-P. 394^401.

128. Song X.Z., Pedersen S.E. Electrostatic interactions regulate desensitization of the nicotinic acetylcholine receptor // Biophys. J. 2000. — V.78. -P.1324-1334.

129. Sparks J.A., Pauly J.R. Effects of continuous oral nicotine administration on brain nicotinic receptors and responsiveness to nicotine in C57B1/6 mice// Psychopharmacology. 1999. - V. 141. - P. 145-153.

130. Sweadner K.J. Na,K-ATPase and its isoforms // In: Neuroglia (eds. Kettenmann H., Ransom B.R.). Oxford University Press. New York, Oxford. -1995.-P. 259-272.

131. Tanaki H., Klink R., Lena C., Korn H., Changeux J.-P. Calcium mobilization elicited by two types of nicotinic acetylcholine receptors in mouse substantia nigra pars compacta // Eur. J. Neurosci. 2000. - V. 12. - P. 24752485.

132. Thesleff S. Different kinds of acetylcholine release from the motor nerve // Int. Rev. Neurobiol. 1986. - V.28. - P.59-88.

133. Thomas R. Electrogenic sodium pump in nerve and muscle cells // Physiol. Rev. 1972. - V.52. - P.563-594.

134. Thompson C.B., Choi C., Youn J.H., McDonough A.A. Temporal responses of oxidative vs. glycolytic skeletal muscles to K+ deprivation: Na+ pumps and cell cations // Am. J. Physiol. 1999. - V.276. - P. 1411-1419:

135. Thompson C.B., Dorup I., Ahn J., Leong P.K.K., McDonough A.A. Glucocorticoids increase sodium pump a2- and prsubunit abundance and mRNA in rat skeletal muscle // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2001. - V. 280. - C509-C516.

136. Thompson C.B., McDonough A.A. Skeletal muscle Na,K-ATPase a and p subunit protein levels respond to hypokalemic challenge with isoform and muscle type specificity // J. Biol. Chem. 1996. - V. 271. - P. 32653-32658.

137. Tribollet E., Bertrand D., Raggenbass M. Role of neuronal nicotinic receptors in the transmission and processing of information in neurons of the central nervous system // Pharmacol. Biochem. Behav. 2001. - V. 70. - P. 457466.

138. Vincent A., Newland C., Croxen'R., Beeson D. Genes at the junction candidates for congenital myasthenic syndromes // Trends Neurosci. - 1997. - V. 20.-P. 15-22.

139. Vyskocil F., Nikolsky E., Edwards C. An analysis of the mechanisms underlying the non-quantal release of acetylcholine at the mouse neuromuscular junction //Neurosci. 1983. - V.9, № 2. - P. 429-435.

140. Wagner K., Edson K., Heginbotham L., Post M., Huganir R.L., Czernik A.J. Determination of the tyrosinephosphorylation sites of the nicotinic acetylcholine receptor // J. Biol. Chem. 1991. - V. 266. - P. 23784-23789.

141. Wang L., McComb J.G., Weiss M.H. et al. Nicotine downregulates a2 isoform of Na,K-ATPase at the blood-brain barrier and brain in rats // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1994.- V. 199. -P. 1422-1427.

142. Wang H., Sun X. Desensitized nicotinic receptors in brain // Brain Research Reviews. 2005. - V. 48. - P. 420- 437.

143. Willmann R., Fuhrer C. Neuromuscular synaptogenesis: clustering of acetylcholine receptors revisited // Cell. Mol. Life. Sci. 2002. - V. 59. - P. 12961316.

144. Wilson, G.G., Karlin, A. Acetylcholine receptor channel structure in the resting, open, and desensitized states probed with the substituted cysteine-accessibility method//PNAS.-2001.-V. 98.-P. 1241-1248.

145. Witzemann V., Barg B., Nishikawa Y., Sakmann B., Numa S. Differential regulation of muscle acetylcholine receptor gamma- and epsilon-subunit mRNAs // FEBS Lett. 1987. - V. 223. - P. 104-112.

146. Woo A.L., James P.F., Lingrel J.B. Sperm motility is dependent on a unique isoform of the Na,K-ATPase // J. Biol. Chem. 2000. - V. 275. - P. 20693-20699.

147. Xie Z., Askari A. Na+/K+-ATPase as a signal transducer // Eur. J. Biochem. 2002. - V. 269. - P. 2434-2439.

148. Xie Z., Cai T. Na+-K+-ATPase-mediated signal transduction: from protein interaction to cellular function // Mol. Interv. 2003. - V. 3. - P. 157-168.

149. Zahler R., Sun W., Ardito T., Zhang Z., Kocsis J.D., Kashgarian M. The a3 isoform protein of the Na+,K+-ATPase is associated with the sites of cardiac and neuromuscular impulse transmission // Circulation Res. — 1996. — V. 78.-P. 870-879.

150. Zhang X., Gong Z.H., Hellstrom-Lindahl E., Nordberg A., Regulation of alpha-4 beta-2 nicotinic acetylcholine receptors in M10 cells following treatment with nicotinic agents //NeuroReport. 1995. - V. 6. - P. 313-317.

151. Zolovick A.J., Norman R.L., Fedde M.R. Membrane constants of muscle fibers of rat diaphragm // Amer. J. Physiol. 1970. - V. 219. - P. 654-657.

Информация о работе

Прокофьев, Александр Владимирович
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2009
ВАК 03.00.13

Диссертация

Модуляция никотином электрогенного вклада изоформ Na,K-ATФазы в скелетной мышце крысы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы