Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изоформы α-субъединицы Na+,K+-ATФазы и электрогенез скелетной мышцы крысы

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Изоформы α-субъединицы Na+,K+-ATФазы и электрогенез скелетной мышцы крысы"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи КРАВЦОВА ВИОЛЕТТА ВАСИЛЬЕВНА

Изоформы (Х- субъединицы Мй+,/(Г,-А ТФазы и электрогенез скелетной мышцы крысы

03.00.13 - физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2005

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Направахрукописи КРАВЦОВА ВИОЛЕТТА ВАСИЛЬЕВНА

Изоформы а-субъединицы Ма^^-АТФазы и электрогенез скелетной мышцы крысы

03.00.13 - физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2005

Работа выполнена в лаборатории нервно-мышечной физиологии НИИ физиологии им. акад. А.А. Ухтомского Санкт-Петербургского государственного университета.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Игорь Ильич Кривой

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Григорий Александрович Наследов

доктор медицинских наук, профессор Валерий Борисович Долго-Сабуров

Ведущее учреждение - Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН

Защита состоится 11 ^^ " iM^^Kij^ 2005 г. в'" " часов на заседании диссертационного Совета Д 212.232.10 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Санкт-Петербургском государственном университете (199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, ауд. 90).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. А.М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан

„ д п

2005 года

Ученый секретарь диссертационного Совета доктор биологических наук

Н.П. Алексеев

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. Na+,K+-ATd>a3a является интегральным мембранным ферментом, функционирующим как Na+,K+-Hacoc, и обнаружена в плазматической мембране практически всех животных клеток. Основная функция №*,К+-АТФазы заключается в поддержании трансмембранных градиентов Na+ И К+ за счет активного транспорта этих ионов. Эти градиенты обеспечивают необходимый уровень мембранного потенциала и возбудимость клеток, а также ряд других важных транспортных механизмов клетки. Таким образом, Na*,K+-AT<i>a3a является важнейшим регулятором клеточных функций, который обеспечивает способность возбудимых клеток воспринимать и передавать сигналы, а также поддерживает ионный гомеостазис организма в целом (Болдырев, 1985; 1998; Clausen, 1998; Sejersted, Sjogaard, 2000; Glitsch, 2001; Lichtstein, Rosen, 2001; Schoner, 2002).

№+,К*-АТФаза представляет собой димер, состоящий из а- И ß-субъединиц, в некоторых тканях включает также т~субъединицу. Субъединица а, содержащая места связывания с АТФ и ионами Na+ И К+, отвечает за каталитические и транспортные свойства Иа^К^-АТФазы. Кроме того, ОС-субъединица содержит участок, являющийся специфическим рецептором для сердечных гликозидов. Для позвоночных в настоящее время известны четыре изоформы субъединицы каждая из которых кодируется

собственным геном. Физиологическая роль изоформ Ыа+,К+-АТФазы во многом остается неясной. По ряду данных основную насосную функцию в клетке выполняет изоформа al, тогда как прочие являются вспомогательными (регуляторными) (Blanco, Mercer, 1998; Mobasheri et al., 2000; Lopina, 2001).

В скелетных мышцах активность Na+,K+-AT®a3U является принципиально важным фактором для поддержания сократительной функции и работоспособности нервно-мышечного аппарата (Clausen, 1998, Sejersted, Sjogaard, 2000). Установлено, что скелетные мышечные волокна млекопитающих экспрессируют две изоформы субъединицы

Ыа+,К+-АТФаЗЫ, причем фракция изоформы Ct2 составляет до 50 % и более (Lavoie et al., 1997; Thompson et al., 1999; He et al., 2001). Механизмы регуляции данных изоформ и их роль в поддержании электрогенеза и сократительных свойств скелетных мышечных волокон не выяснены, причем исследовались лишь в опытах на мышцах эмбрионов (Radzyukevich et al., 2004) и мутантных животных (Не et al., 2001). Эти работы в данном направлении, по сути, являются единственными.

Хорошо известно, что ряд гормонов и медиаторов, в том числе ацетилхолин (АХ), способны регулировать Na+,K+-AT®a3y (Елаев, 1980; Голиков и др., 1985; Danilenko et al., 1990; Begyun et al., 1996; Mathias et al., 2000). Это свойство АХ имеет непосредственное отношение к классической проблеме немедиаторной, регуляторной функции медиаторов,

сохраняющей свою актуальность и в настоящее время (Ухтомский, 1940; Гинецинский, Михельсон, 1937; Зефиров, 1967; Полетаев, 1974). Влияние АХ и его миметиков наМа+,К+-АТФазу показано и в сердечной (Danilenko et al, 1990; Mathias et al., 2000), и в скелетной мышцах (Платонова и др., 1986; Dlouha et al., 1979; Vyskocil et al., 1983; Henning et al., 1993; Nikolsky et al., 1994; Kragenbrink et al., 1996). В частности, обнаружено, что в отличие от квантового АХ, деполяризующего постсинаптическую мембрану, неквантовый АХ (присутствующий в синаптической щели в наномолярных концентрациях) вызывает гиперполяризацию мембраны скелетных мышечных волокон за счет активации электрогенного насоса (Dlouha et al., 1979; Vyskocil et al., 1983; Nikolsky et al., 1994).

Этому эффекту неквантового АХ придается большое физиологическое значение как важному фактору нейронального контроля электрогенеза скелетной мышцы (Волков, Полетаев, 1988; Vyskocil et al., 1983; Nikolsky et al., 1994). Гиперполяризующим эффектом обладает и экзогенный АХ в сходных концентрациях (см. обзор: Кривой, 2000). Однако ни мишень АХ, ни тип изоформы в его гиперполяризующем действии не были

установлены.

Цель и основные задачи исследования: целью данной работы было выявление роли al И а2 изоформ a-субъединицы Ка+,К*-АТФазы в поддержании и холинергической регуляции электрогенеза зрелых скелетных мышечных волокон нормальных (не мутантных) крыс.

В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. Оценить вклад изоформ al И 0(2 в мембранный потенциал покоя (МПП) мышечных волокон диафрагмы крысы, а также роль изоформы в поддержании их электрогенеза.

2. Выявить участие

АТФазы в гиперполяризующем эффекте наномолярных концентраций АХ в диафрагме крысы и определить тип изоформы ее субъединицы, вовлеченной в этот эффект.

3. Исследовать характеристики мишени АХ в его гиперполяризующем действии; проверить роль никотинового холинорецептора в качестве такой мишени.

Положения, выносимые на защиту:

1. Основную "насосную" функцию, обеспечивающую МПП мышечных волокон диафрагмы крысы в покое, выполняет изоформа роль изоформы в поддержании МПП относительно невелика, однако ее активность важна для генерации нормальных мышечных потенциалов действия (ПД).

2. Гиперполяризация мышечных волокон диафрагмы крысы при действии АХ в наномолярных концентрациях обусловлена существенным увеличением вклада изоформы Ыа+,К+-АТФазы в величину МПП.

3. Холинергическая регуляция электрогенеза мышечных волокон диафрагмы крысы при участии сх2 изоформы Ыа+,К+-АТФазы осуществляется за счет связывания АХ с никотиновым холинорецептором в конформационном состоянии со сверхвысокой аффинностью к АХ.

Научная новизна работы. Впервые исследована роль а1 И а2 изоформ АТФазы в поддержании электрогенеза мышечных волокон скелетной мышцы нормальных (не мутантных) взрослых крыс. Анализ зависимости МПП мышечных волокон диафрагмы крысы от концентрации специфического ингибитора №+,К+-АТФазы оуабаина впервые показал, что основной электрогенный вклад в МПП вносит изоформа а1. Вклад 0.2 изоформы в МПП относительно невелик, однако ее селективная блокада оуабаином вызывает нарушения в механизме генерации мышечных ПД (снижение амплитуды и увеличение длительности). Установлено, что гиперполяризующее действие наномолярных концентраций экзогенного АХ в диафрагме крысы реализуется за счет существенного увеличения вклада в МПП именно а2 изоформы (без влияния на изоформу

Применение агонистов и антагонистов никотинового холинорецептора, а также анализ концентрационной зависимости для гиперполяризующего эффекта АХ показал, что этот эффект реализуется при участии никотинового холинорецептора в конформационном состоянии со сверхвысокой аффинностью к АХ, предположительно, в состоянии десенситизации. Впервые выдвинута гипотеза о том, что в скелетной мышце изоформа выполняет регулирующую функцию и за счет функциональной связи с никотиновым холинорецептором участвует в холинергическом контроле электрогенеза мышечных волокон.

Практическая значимость работы. Полученные данные раскрывают новый механизм регуляции скелетной мышцы циркулирующими эндогенными и экзогенными холинергическими лигандами и дигиталисоподобными ингибиторами №*,К+-АТФаЗЫ. Эти знания важны также для понимания механизмов побочных эффектов применяемых в клинике сердечных гликозидов, холинопозитивных препаратов (применяемых как стимуляторы памяти, при лечении ряда нейродегенеративных расстройств, миастении и др.), а также негативных последствий курения. Предлагаемый принцип регуляции за счет функциональной связи никотинового холинорецептора с возможно

действует и в ЦНС, где важнейшей функцией никотиновых холинорецепторов является модуляция эффективности синаптических связей.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на конкурсах молодых ученых СПбГУ (1998, 2000), на заседаниях секции общей физиологии Санкт-Петербургского общества физиологов, биохимиков и фармакологов им. И.М. Сеченова (2001, 2004),

Всероссийских школах "Актуальные проблемы нейробиологии" (Казань, 1999, 2000, 2001), Российской медико-биологической конференции "Человек и его здоровье" (Санкт-Петербург, 1999, 2000, 2001), Международной междисциплинарной конференции "Человек. Природа. Общество. Актуальные проблемы" (Санкт-Петербург, 1998, 2000), конференции молодых ученых России с международным участием "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины" (Москва, 2001), "32 Annual Meeting Society for Neuroscience", Orlando, Florida (2002), "10 International Conference on Na,K-ATPase and Related Cation Pumps", Elsinore, Denmark (2002), International Symposium "Biological Motility" dedicated to the memory ofacad. G.M. Frank Pushchino, Russia (2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 32 работы.

Структура и объем диссертации. Диссертация объемом 116 страниц состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 157 источников, из которых 120 - иностранных авторов. Диссертация иллюстрирована 19 рисунками и 2 таблицами.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В электрофизиологических исследованиях опыты проводили на изолированных френико-диафрагмальных препаратах белых крыс (самцы весом 150 - 200 г.) с использованием проточного аэрируемого карбогеном физиологического

раствора при температуре 28°С. Состав раствора (в ммоль/л):

MgClr-2; NaHCOj—24; Nal^POí— 1; глюкоза-11; рН всех растворов составлял 7.4 - 7.6. Величину МПП и параметры ПД (максимальная амплитуда, время и скорость нарастания, длительность полуспада, площадь под кривой ПД) регистрировали внутриклеточно во внесинаптическом районе мышечных волокон с помощью стандартной микроэлектродной техники. Все регистрируемые сигналы (МПП, ПД) оцифровывались аналого-цифровым преобразователем (частота квантования 44000 Гц) и далее анализировались на персональном компьютере с помощью специальной программы.

Транспортную активность №+,К+-АТФазы оценивали по оуабаин-чувствительному входу нерадиоактивного в эритроциты крысы методом эмиссионной пламенной

фотометрии с помощью атомно-абсорбционного спектрофотометра Perkin Elmer 306. Оценку каталитической активности проводили в препаратах очищенной

АТФазы из почек овцы спектрофотометрическим методом с использованием системы сопряженных ферментов (пируваткиназа-лактатдегидрогеназа) при длине волны 340 нм с помощью спектрофотометра Beckman DU-7. Опыты проводили при комнатной температуре.

Применяли агонисты и антагонисты никотинового холинорецептора АХ, карбахолин, никотин, с1^губокурарин, а-бунгаротоксин, проадифен; мускаринового холинорецептора -атропин (все Sigma); специфические ингибиторы Na+,K+-ATÍ>a3bI оуабаин, дигоксин (Sigma) и маринобуфагенин из паротидных желез Bufo marinus (предоставлен д-ром АЛ. Багровым, Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова, РАН). Для угнетения ацетилхолинэстеразы (АХЭ) использовали ее фосфорорганический ингибитор армии.

Для статистической обработки результатов применяли программы EXCEL (Microsoft Office XP) и Origin 6.1; достоверность различия оценивали по í-критерию Стьюдента. В тексте, таблицах и на рисунках приведены средние значения величин с их ошибками (М ±т). Каждое значение получено в результате усреднения параметров МПП и ПД не менее чем в 100 волокнах 4-6 мышц и измерения активности Ка+,К*-АТФазы в 3-4 опытах в триплетах.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Вклад al и а2 и з в величину МПП мышечных волокон

Для ингибирования применяли ее специфический блокатор оуабаин в

диапазоне концентраций от 1 нмоль/л до 500 мкмоль/л. Было установлено, что в контрольных мышцах величина МПП достоверно не изменялась в течение 1-2 часов регистрации, тогда как оуабаин в течение 1 часа действия вызывал дозо-зависимую деполяризацию мышечных волокон. Математический анализ зависимости величины МПП от концентрации оуабаина (1 час действия) показал, что эта зависимость наилучшим образом описывается с помощью модели, предполагающей существование 2-х независимых сайтов связывания оуабаина (рис. 1, А; табл. 1). Для аппроксимации зависимости использовали следующую формулу:

где МППо - уровень МПП, когда ингибированы оба сайта связывания; I - концентрация оуабаина; К) и Кг - константы диссоциации оуабаина для этих сайтов; - соответствующие электрогенные вклады

данных сайтов в МПП.

Предсказываемые моделью константы для двух сайтов связывания оуабаина различались в ~300 раз и составили 17.6 мкмоль/л и 63 нмоль/л. Поскольку полученные значения совпадают с известными аффинностями а1иа2 изоформ+,-АТФазы у крысы, соответственно (Sweadner, 1989; 1995; Blanco, Mercer, 1998), можно предположить, что данные сайты в нашем случае принадлежат этим изоформам. Величины вкладов в МПП этих сайтов с низкой (изоформа и высокой (изоформа аффинностью к оуабаину составили, соответственно 14.5+1.3 и 4.5+1.2 мВ.

А Б

Оуабаии, моль/л Оуэбаин, моль/л

Рис. 1. Л. Зависимость MПП мышечных волокон диафрагмы крысы от концентрации оуабаина. Светлые кружки - через 1 час действия оуабаина; темные кружки - через 15 мин после добавления АХ (100 нмоль/л). Вертикальными стрелками показаны рассчитанные величины вкладов в МПП сайтов с низкой и высокой аффинностью к оуабаину (а1 И а2 изоформы На*,К+-АТФазы, соответственно). Б. Зависимости от концентрации оуабаина вкладов в МПП сс1 И а2 изо ф Кар,К%АТФасы, и т а н н ы е на основе моделирования. Сплошные линии - через 1 час действия оуабаина (перед добавлением АХ); пунктирные линии - через 15 мин после добавления АХ (100 нмоль/л).

Таблица 1. Параметры, предсказываемые моделью с 2-мя независимыми сайтами связывания оуабаина.

Параметры Через 1 час действия оуабаина Через 15 мин после добавления АХ (100 нмоль/л) на фоне оуабаина

МППо(мВ) -60.0 ± 0.9 -59.4 ± 1.0

А1 (мВ) -14.5 ± 1.3 -15.7 ± 1.2

К1 (мкмоль/л) 17.6 ±7.2 12.8 ± 4.4

А2 (мВ) -4.5 ± 12 -9.0 ±1.2

К2 (нмоль/л) 63 ±84 8.0 ±3.9

В целом, данное исследование показало, что величина МПП в покое, если обе изоформы Иа^.К^-АТФазы блокированы оуабаином, составляет около -60 мВ. По-видимому, это величина, в основном определяемая ионными градиентами. Отметим, что сходное значение МПП было получено в диафрагмальных мышцах при блокировании АТФазы и другими способами (Л^косП е1 а1., 1985; Бе1Ъопо, 1988). Вклад в МПП а1

изоформы составляет в покое около 15 мВ (~80% общего электрогенного компонента МПП) и когда активна только эта изоформа, величина МПП достигает -75 мВ. Электрогенный вклад «2 изоформы в покое составляет 4-5 мВ (~20%); за счет этого МПП дополнительно повышается ДО —78 + —79 мВ.

Расчеты показали также, что оуабаин в концентрации 1 мкмоль/л полностью подавляет вклад изоформы а2, не влияя на изоформу а1 (рис. 1, Б). Далее мы использовали этот факт для оценки влияния селективного подавления а2 изоформы №*,К+-АТФазы оуабаином в этой концентрации на генерацию мышечных ПД.

Параметры ПД мышечных волокон при блокаде а2 изоформы Ка\К*-АТФазы оуабаином

В этих опытах сразу после регистрации МПП до добавления оуабаина (контроль) и через 1 час его действия регистрировали ПД в ответ на стимуляцию нерва. В каждом мышечном волокне регистрировали один ПД, предшествовавший сокращению; затем микроэлектрод выводили из данного волокна, и процедуру повторяли с другими волокнами.

Через 1 час оуабаин (1 мкмоль/л) вызывал деполяризацию мембраны (на ~3-4 мВ), снижение амплитуды ПД мышечных волокон (вплоть до потери овершута), а также затягивание их восходящей и нисходящей фаз (табл. 2). В мышцах без применения оуабаина параметры ПД в течение 1 часа эксперимента достоверно не изменялись.

Таблица 2. Параметры ПД мышечных волокон диафрагмы крысы в контроле и через 1 час действия оуабаина 1 мкмоль/л.

Параметры ПД Контроль Оуабаин (1 мкмоль/л)

МПП, мВ -76.2 ±0.6 -73.0 ± 0.5*

Максимальная амплитуда, мВ 84.0 ± 1.2 69.8 ±1.2*

Латентный период, мс 3.66 ± 0.07 3.86 ± 0.07

Время нарастания, мс 0.30 ± 0.01 0.36 ±0.01*

Скорость нарастания, мВ/мс 306 ±9 220 ±8*

Длительность полуспада, мс 0.61 ± 0,01 0.67 ± 0,01*

Площадь под кривой, мВ х мс 115 ±3 99 ±3*

Число исследованных волокон 136 166

Примечание: * - достоверность отличий от контроля р<0.01.

Таким образом, селективное блокирование а2 изоформы оуабаином

вызывает нарушения механизма генерации мышечных ПД. Снижение амплитуды и затягивание восходящей фазы ПД может быть результатом частичной инактивации потенциалозависимых каналов вследствие стационарной деполяризации мембраны, а также снижения градиента из-за накопления внутриклеточного при блокировании На+,К+-АТФазы. Затягивание фазы спада ПД при одновременном падении их амплитуды может также свидетельствовать о снижении скорости распространения ПД по мембранам Т-системы мышечных волокон.

Роль а1 И а2 и з ^я^К^'ДОаш в гиперполяризующем эффекте АХ

Ранее было показано, что гиперполяризующее действие неквантового АХ (в синаптическом районе скелетных мьппечных волокон) обусловлено активацией электрогенного насоса (Э1оиЬа е1 а1, 1979; Vyskocil е1 а1., 1983; Nikolsky е1 а1., 1994). Для установления типа изоформы а-субъединицы №*,К+-АТФазы, участвующей в гиперполяризующем эффекте наномолярных концентраций АХ в скелетной мышце, мы моделировали действие неквантового АХ, добавляя экзогенный АХ в раствор и регистрируя изменение МПП во внесинаптическом районе мышечных волокон.

Добавление АХ (100 нмоль/л) на 15 мин вызывало гиперполяризацию величиной которая воспроизводилась в течение длительного времени (при добавлении АХ в самом начале опытов, либо через 2-3 часа). После преинкубации в течение 1 часа в растворе с разными специфическими ингибиторами оуабаином, дигоксином или маринобуфагенином (в концентрации 100 нмоль/л каждый) гиперполяризующий эффект АХ не наблюдался (рис. 2, В), что указывает на вовлечение в его реализацию во внесинаптическом районе мышечных волокон.

Далее мы исследовали развитие гиперполяризующего эффекта АХ на фоне оуабаина в концентрациях от 1 нмоль/л до 500 мкмоль/л. АХ (100 нмоль/л) добавляли в раствор на 15 мин через 1 час действия оуабаина в данной концентрации, когда стабилизировалось его деполяризующее действие.

Оуабаин в диапазоне концентраций до 100 нмоль/л дозо-зависимым образом устранял вызываемую АХ гиперполяризацию. Зависимость величины МПП от концентрации оуабаина в присутствии АХ также наилучшим образом описывалась с помощью модели 2-х независимых сайтов связывания оуабаина (а1 и а2 изоформы №*,К+-АТФазы) (рис. 1, А). Предсказываемые моделью величины аффинностей для этих сайтов в присутствии АХ составили 12.8 мкмоль/л и 8 нмоль/л, соответственно (табл. 1). Полученные кривые в обоих случаях (до и после добавления АХ) полностью совпадали в области концентраций оуабаина 100 нмоль/л-500 мкмоль/л. В области же низких концентраций оуабаина (1-100 нмоль/л) эти кривые существенно различались за счет гиперполяризации, вызываемой АХ (рис. 1, А). Электрогенный вклад в МПП сайта с низкой аффинностью к оуабаину (а1 изоформа) составил то есть не изменялся после добавления АХ. В то же время вклад сайта

с высокой аффинностью к оуабаину изоформа) составил уже то есть

вырос по сравнению с исходным значением в два раза (рис. 1, Б).

Таким образом, АХ вызывает гиперполяризацию мышечных волокон диафрагмы крысы за счет вовлечения именно оуабаин-чувствительной изоформы

Оценка возможности прямого действия АХ на Ка+,К*-АТФазу

Следующей целью работы была характеристика мишени АХ в его гиперполяризующем эффекте. Мы исследовали действие АХ на активность очищенной №+,К+-АТФазы из почек овцы и в эритроцитах крысы (в почках и эритроцитах отсутствуют рецепторы к АХ). Было установлено, что АХ (от 100 нмоль/л до 100 мкмоль/л) не влияет ни на транспортную активность в эритроцитах крысы, ни на каталитическую активность

АТФазы из почек овцы. Кроме того, мы оценили влияние оуабаина на активность Ка+,К*-АТФазы из почек овцы и действие АХ (100 нмоль/л) на зависимость доза-ответ для оуабаина. В этих опытах величины ИК50 для оуабаина в контроле (без АХ) и в присутствии АХ не отличались и составили 20±3 мкмоль/л и 18±3 мкмоль/л, соответственно. Таким образом, результаты этих опытов свидетельствуют против возможности прямого действия АХ наЫа+,К+-АТФазу.

Роль никотинового холинорецептора в гиперполяризующем эффекте АХ

Данные об отсутствии прямого действия АХ на Ка+,К+-АТФазу позволяют предположить, что гиперполяризующий эффект АХ реализуется через соответствующий рецептор. Поскольку этот эффект АХ полностью воспроизводился на фоне общего блокатора мускариновых холинорецепторов атропина (5 мкмоль/л), какое-либо участие данных рецепторов маловероятно.

Для характеристики роли никотиновых холинорецепторов (н-ХР) в гиперполяризующем эффекте АХ мы использовали различные лиганды, являющиеся агонистами или антагонистами специфических мест связывания н-ХР. Как и АХ, никотин или карбахолин (100 нмоль/л) вызывали гиперполяризацию величиной 2.0*0.8 мВ (р<0.05) и 1.3±0.8 мВ (р<0.05), соответственно, хотя и меньшую по сравнению с эффектом АХ (рис. 2, А). Конкурентные антагонисты н-ХР тубокурарин (2 мкмоль/л) или бунгаротоксин (5 нмоль/л, 2 часа преинкубации) блокировали гиперполяризующее действие АХ (рис. 2, Б). Для проверки роли в гиперполяризующем эффекте АХ специфического связывания агонистов с н-ХР мы использовали также проадифен, являющийся неконкурентным антагонистом н-ХР, блокирующим его открытый ионный канал (особенно в присутствии АХ). Через 30-60 мин инкубации мышц с проадифеном (5 мкмоль/л) гиперполяризующий эффект АХ воспроизводился полностью (рис. 2, Б).

Таким образом, данные опыты показывают, что в гиперполяризующий эффект АХ вовлечен н-ХР, причем эффект реализуется за счет связывания агонистов именно со специфическими сайтами н-ХР. Опыты с проадифеном доказывают, что ионные токи через открытый канал н-ХР не участвуют в реализации гиперполяризующего эффекта АХ.

Рис. 2. Роль никотинового холинорецептора и №+,К*-АТФазы в вызываемой АХ гиперполяризации мышечных волокон диафрагмы крысы.

А - гиперполяризующий эффект агонистов н-ХР: АХ, карбахолина или никотина (100 нмоль/л). Б - вызываемое АХ (100 нмоль/л) изменение МПП в присутствии специфических конкурентных антагонистов н-ХР ё-тубокурарина (2 мкмоль/л) или сс-бунгаротоксина (5 нмоль/л), а также неконкурентного блокатора проадифена (5 мкмоль/л). В - вызываемое АХ (100 нмоль/л) изменение МПП в присутствии специфических блокаторов оуабаина, дигоксина или маринобуфагенина (все в концентрации 100 нмоль/л, 1 час преинкубации). Изменение МПП в негативную сторону соответствует гиперполяризации.

Зависимость доза - ответ для гиперполяризующего эффекта АХ

В условиях ингибирования АХЭ армином (0,4 мкмоль/л) АХ (100 нмоль/л) вызывал гиперполяризацию величиной 4.1±0.5 мВ (р< 0.01), что не отличалось от эффекта АХ при интактной АХЭ. Из этого следует, что при интактной АХЭ гиперполяризацию вызывает сам АХ, а не продукты его гидролиза (например, холин), что подтверждается и данными о гиперполяризующем действии карбахолина и никотина (см. выше). Это означает также, что эффективная концентрация АХ в зоне регистрации МПП не снижается при интактной АХЭ, что объясняется ее относительно низкой плотностью во внесинаптическом районе и достаточно свободной диффузией АХ из перфузирующего раствора.

Для характеристики свойств сайта связывания АХ с н-ХР мы исследовали зависимость доза-ответ для гиперполяризующего эффекта АХ. Вызываемая АХ гиперполяризация увеличивалась дозо-зависимым образом (величина ЭКзо=28.3±3.6 нмоль/л); максимальный эффект наблюдался при концентрации АХ 100 нмоль/л (рис. 3). Важно, что проадифен (5 мкмоль/л, 30-60 мин преинкубации), не только блокирующий открытый ионный канал н-ХР, но и усиливающий его десенситизацию, существенно сдвигал кривую доза-ответ для гиперполяризующего эффекта АХ в область меньших концентраций АХ (до величины ЭКл)=7.1±2.3 нмоль/л).

Рис. 3. Влияние АХ в разных концентрациях на МПП мышечных волокон в контроле (светлые кружки) и в присутствии проадифена (5 мкмоль/л) (темные кружки). По оси абсцисс - концентрация АХ, нмоль/л; по оси ординат - изменение МПП, мВ. Изменения значений МПП в негативную сторону соответствуют гиперполяризации.

Известные константы активации н-ХР скелетной мышцы для АХ порядка 10 мкмоль/л. Наши данные свидетельствуют об участии в гиперполяризующем эффекте АХ рецепторов, характеризующихся сверхвысокой аффинностью к АХ. В соответствии с общепринятыми моделями н-ХР существует в закрытом, открытом и десенситизированном состояниях, причем именно в состоянии десенситизации аффинность н-ХР к АХ повышена на 2-4 порядка и лежит в наномолярном диапазоне (Heidmann, Changeux, 1980; Prince, Sine, 1999). Таким образом, наши данные и анализ литературы показывают, что сигналом для индукции гиперполяризации мышечных волокон является высокоаффинное связывание АХ со специфическими сайтами н-ХР, по-видимому, в десенситизированном состоянии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Впервые в опытах на нормальных (не мутантных) взрослых крысах показано существенное различие функциональной роли а1 И а2 изоформ №*,К+-АТФазЫ в скелетной мышце. Изоформа с низкой чувствительностью к оуабаину является основной в

поддержании МПП мышечных волокон, тогда как оуабаин-чувствительная изоформа в покое малоактивна, но становится важным фактором поддержания МПП при действии АХ в наномолярных концентрациях. Показано также, что подавление изоформы АТФазы вызывает ряд нарушений в процессе генерации мышечных ПД, что свидетельствует о возможной роли этой изоформы в механизме электромеханического сопряжения. Впервые показано вовлечение н-ХР в реализацию гиперполяризующего эффекта АХ в скелетных мышечных волокнах. Продемонстрировано, что АХ вызывает гиперполяризацию за счет связывания со специфическими сайтами н-ХР, характеризующихся повышенной аффинностью к АХ (предположительно в непроводящем десенситизированном состоянии). Эти данные указывают на новую роль н-ХР как модулятора Ыа^К^-АТФазы, не связанную с

его основной функцией лиганд-управляемого ионного канала, и свидетельствуют о существовании в зрелых мышечных волокнах диафрагмы крысы функциональной связи между н-ХР и а2 изоформой Ма+,К*-АТФазы.

выводы

1) Анализ зависимости доза-ответ деполяризующего действия оуабаина показал, что основной вклад в поддержание МПП мышечных волокон диафрагмы крысы

вносит оуабаин-резистентная изоформа электрогенный вклад оуабаин-

чувствительной изоформы в покое относительно мал Селективная блокада

изоформы оуабаином (1 мкмоль/л) вызывает нарушения в механизме генерации мышечных ПД, проявляющиеся в снижении их амплитуды и увеличении длительности.

2) Добавление в раствор АХ (100 нмоль/л) вызывает гиперполяризацию внесинаптической мембраны мышечных волокон величиной Эффект блокируется специфическими ингибиторами (оуабаин, дигоксин, маринобуфагенин) в наномолярном диапазоне, что свидетельствуют об участии №+,К+-АТФазы в этом эффекте АХ. В присутствии АХ электрогенный вклад изоформы в МПП возрастает до

вклад изоформы при этом не изменяется.

3) АХ в диапазоне концентраций от 100 нмоль/л до 100 мкмоль/л не влияет на транспортную активность в эритроцитах крысы и на каталитическую активность очищенной из почек овцы, то есть не оказывает прямого действия на этот фермент.

4) Вызываемая АХ гиперполяризация воспроизводится агонистами никотинового холинорецептора карбахолином или никотином и блокируется специфическими конкурентными антагонистами губокурарином или бунгаротоксином, но не проадифеном - неконкурентным антагонистом, блокатором открытого канала рецептора. Результаты показывают, что АХ вызывает гиперполяризацию за счет связывания со специфическими сайтами никотиновых холинорецепторов, причем эффект не опосредуется ионными токами через их каналы.

5) Величина для гиперполяризующего эффекта АХ составляет нмоль/л. Десенситизирующий агент проадифен не влияет на максимальную величину гиперполяризации, но сдвигает кривую доза-ответ для АХ до ЭК5о=7.1±2.3 нмоль/л. В гиперполяризующем эффекте АХ участвуют никотиновые холинорецепторы в конформационном состоянии, характеризующемся сверхвысокой аффинностью к АХ, предположительно в состоянии десенситизации.

б) В мышечных волокнах диафрагмы крысы существует функциональная связь между никотиновыми холинорецепторами и Ct2 изоформой Ка+,К+-АТФаэы, Это указывает на новый (холинергический) путь регуляции Na+,K+-ATOa3M и на новую роль никотинового холинорецептора как модулятора этого фермента.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кривой И.И., Кубасов И.В., Лопатина Е.В., Сей Т.П., Кравцова В.В. Холинергическая модуляция нервно-мышечной передачи в диафрагме крысы // XVII Съезд физиологов России. -Тездокл. - Ростов-на-Дону. -1998. - С. 151.

2. Krivoi I.I., Lopatina E.V., Kravtsova V.V. Cholinergic regulation of rest membrane potential in rat diaphragm muscle fibres // Biological Motility: Modern methods for studying. Int.symp. ♦ Abstracts. -Pushchino.-1998.-P.70.

3. Лопатина Е.В., Кравцова В.В. Следовые эффекты ацетилхолина в нервно-мышечном аппарате // IV Международная междисциплинарная конференция "ЧЕЛОВЕК. ПРИРОДА. ОБЩЕСТВО. АКТУАЛЬНЫЕ ПРОБЛЕМЫ". - Тез. докл. - СПбГУ. -1998. - С. 271-272.

4. Кравцова В.В.. Прытков А.Е. Роль К*-каналов в холинергической регуляции мембранного потенциала покоя мышечных волокон диафрагмы крысы // Российская медико-биологич. конференция "Человек и его здоровье". - Тез. докл. - С.-Петербург. -1999. - С. 36.

5. Кривой ИИ., Кубасов И.В., Лопатина Е.В., Кравцова В.В.. Сей Т.П. Ионные механизмы холинергической модуляции синаптической передачи // II Съезд биофизиков России. - Тез.докл. -Москва. - 23-27 августа 1999. - Т. II. - С. 525-526.

6. Kravtsova V.V.. Lopatina E.V., Krivoi I.I. The mechanism of cholinergic regulation of the rest membrane potential in skeletal muscle fibres // 27th Gottingen Neurobiology Conference. - Abstracts. -Gottingen (May 27-30,1999). - P. 653.

7. Лопатина Е.В., Кравцова В.В.. Кривой И.И. Вызываемая ацетилхолином гиперполяризация мембраны скелетных мышечных волокон // Актуальные проблемы нейробилогии. VIII Всерос. школа молодых ученых. - Тез.докл. - Казань. - 26-28 октября 1999. - С. 78-80.

8. Кривой И.И., Кубасов И.В., Лопатина Е.В., Кравцова В.В.. Громова В.В., Сей Т.П. Следовые немедиаторные эффекты ацетилхолина в нервно-мышечном аппарате // Механизмы адаптивного поведения. Междунар.симп., посвящ. 150-летию со дня рожд. И.П. Павлова. - Тез.докл. - С-Петербург-Колтуши. 7-9 декабря 1999. - С. 41.

9- Кравцова В.В. Участие оуабанн-чувствительной изоформы Ыа,К-АТФазы в холинергической регуляции электрогенеза мышечных волокон диафрагмы крысы // III Всеросс.мед.-биол.конф. "Человек и его здоровье". - Тез. докл. - С.-Петербург. - 2000. - С. 81-82.

10. Кравцова В.В.. Кривой И.И. Роль оуабаин-чувствительной изоформы №7К+-АТФазы в холинергической регуляции электрогенеза скелетных мышечных волокон // Актуальные проблемы нейробиологии. VIII Всерос. школа молодых ученых. - Тез.докл. - Казань. - 27-29 сентября 2000. - С. 57-58.

И. Кривой И.И., Сей Т.П., Лопатина Е.В., Кравцова В.В.. Громова В.В., Васильев А.Н. Немедиаторная функция ацетилхолина в нервно-мышечном аппарате // Всеросс.науч. конф. "Учение А. А. Ухтомского и современная наука", посвящ. 125-летию со дня рождения академика А. А. Ухтомского - Тез. докл. - С.-Петербург. -17-18 октября 2000. - С.53-54.

12. Krivoi I.I., Dobretsov M., Stimers J.R., Kravtsova V.V. Na+/K+pump isoforms and acetylcholine-induced hyperpolarization in rat skeletal muscle // Soc. Neurosci. 30th Ann. Meeting. - Abstr. - New Orleans (November 4-9,2000). - V. 30, Part 2. - P.2142.1.

13. Лопатина Е.В., Коавиова В.В.. Васильев А.Н., Громова В.В. Антиутомляющее действие ацетилхолина в низкой концентрации // Сб. "ЧЕЛОВЕК. ПРИРОДА- ОБЩЕСТВО. АКТУАЛЬНЫЕ ПРОБЛЕМЫ". - СПбГУ. - 2000. - С. 689-694.

14. Кривой И.И., Кравцова В.В., Лопатина Е.В. Гиперполяризующий эффект ацетилхолина в скелетной мышце с различным типом мышечных волокон // Журн. эволюц. биохим. и физиол. - 2000. -Т.36,№4.-С.377-379.

15. Лопатина Е.В., Кравцова В.В.. Громова В.В., Васильев А.Н., Кривой И.И., Восстановление работоспособности утомляемой диафрагмы крысы при действии экзогенного ацетилхолина // Сб. "Проблемы экологии человека". - Архангельск. 2000. - С. 118-123.

16. Кравцова В.В. Роль изоформ ЫаТК'-АТФазы в регуляции электрогенеза скелетных мышечных волокон // II Рос. конф. молодых ученых России с международным участием "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины". - Тез. докл. - Москва. - 24-28 апреля 2001.-Т. II.-С. 292-293.

17. Кривой И.И., Лопатина Е.В., Кравцова В.В. Роль К*-каналов и Ка'ЛС-АТФазы в гиперполяризации мембраны скелетных мышечных волокон, вызываемой ацетилхолином // Биол. мембраны. -2001. - Т. 18, № 1. - С. 10 -15.

18. Kravtsova V.V.. Krivoi LI. The role of NaVK*-ATPase isoforms in the maintenance and cholinergic regulation of skeletal muscle fibres electrogenesis // 28th Gottingen Neurobiology Conference. - Abstracts. -Gottingen (June 7-10,2001). - P. 341.

19. Kravtsova V.V.. Prytkov A.E., Krivoi LI. Mechanism of acetylcholine-induced hyperpolarization in rat skeletal muscle fibres // Biological Motility: New trends in Research. Intsymp. - Abstracts. - Pushchino (August, 20-26,2001). - P. 77-78.

20. Кравцова В В.. Прытков А.Е., Кривой И.И. Механизмы вызываемой ацетилхолином гиперполяризации скелетных мышечных волокон // Актуальные проблемы нейробиологии. VIII Всероссийская школа молодых ученых. - Тез.докл. - Казань (25-28 сентября 2001). - С. 37-38.

21. Krivoi LI., Dobretsov M., Stimers J.R., Kravtsova V.V. Na+/K* ATPase isoforms and cholinergic regulation of skeletal muscle electrogenesis // Soc.Neurosci.Abstr. - San Diego (October, 2001). - V. 27, Part 1. - P. 326.

22. Кравцова В В.. Прытков А.Е. Участие никотинового холинорецептора в регуляции оуабаин-чувствительной изоформы NaVK*-AT®a3bl //V Всероссийская конф. "Человек и его здоровье". - Тез. докл. - С.-Петербург. - 2002. - С. 131-132.

23. Васильев А.Н., Кравиова В.В. Изоформы Na*/K*-AT®a3bi и их эндогенные ингибиторы // V Всероссийская конф. "Человек и его здоровье". - Тез. докл. - С.-Петербург. - 2002. - С. 34-35.

24. Krivoi I.I., Vasiliev A.N., Kravtsova V.V.. Dobretsov M., Mandel F. Porcine kidney extract contains factors) that inhibit the ouabain-sensitive isofonn of Na,K-ATPase (a2) in rat skeletal muscle: a convenient electrophysiological assay // 10lh Int. Conf. on Na,K-ATPase and Related Cation Pumps. -Abstract., Elsinore, Denmark (August 8-14,2002). - P. 4.1.35.

25. Krivoi I.I., Kravtsova V.V.. Dobretsov M., Skatchkov S.N., Eaton MJ., Meltzer R., Mandel F. Functional interactions between nicotinic acetylcholine receptor and Na,K-ATPase // 32 Ann.Meet.Soc.Neurosd. - Abstract. - Orlando, Florida (November 2-7,2002). - P. 538.6.

26. Кравцова В.В.. Прытков А.Е., Добрецов М.Г., Кривой И.И. Механизм вызываемой ацетилхолином гиперполяризации мышечных волокон диафрагмы крысы // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер.З. - 2002. - Вып.З (N 19). - С. 71-79.

27. Krivoi I.I., Vasiliev A.N., Kravtsova V.V.. Dobretsov M., Mandel F. Porcine kidney extract contains factors) that inhibit the ouabain-sensitive isoform of Na,K-ATPase (a2) in rat skeletal muscle: a convenient electrophysiological assay // Ann. N.Y. Acad. Sci. - 2003. - V. 986. - P. 639-641.

28. Кривой И.И., Васильев А.Н., Громова В.В., Прытков А.Е., Марахова И.И., Кравцова В.В.. Добрецов М.Г., Мандел Ф. Экстракт почек свиньи содержит специфический ингибитор оуабаин-чувствительной а2 изоформы Na.K-АТФазы мышечных волокон диафрагмы крысы // Росс.физиол.журн. им. И.М. Сеченова. - 2003. - Т. 89, № 11. - С. 1340-1351.

29. Васильев А.Н., Кравиова В.В.. Прокофьев А.В., Ващинкина Е.В., Кривой И.И. Физиологическая модель тестирования сердечных гликозидов, специфичных к а2 изоформе Na,K-АТФазы // Сб. "Сердечно-сосудистая хирургия и ангиология - 2003". - Санкт-Петербург. - 2003. - С. 107-109.

30. Krivoi I.I., Drabkina T.M., Vasiliev A.N., Kravtsova V.V.. Mandel F. Novel principle of regulation of the Na,K-ATPase in skeletal muscle: functional coupling with nicotinic acetylcholine receptor // Intern. Symp. "Biological Motility" dedicated to the memory of academician G.M. Frank (1904-1976). - Pushchino, Moscow region, Russia (May 23 -June 1,2004). - P. 39-40.

31. Кривой И.И., Драбкина Т.М., Добрецов М.Г., Васильев А.Н., Кравиова В.В.. Итон М., Скачков С.Н, Мандел Ф. Функциональная связь никотиновых холинорецепторов и №,К-АТФазы в скелетной мышце // Росс.физиол.журн. им.И.М.Сеченова. - 2004. - Т. 90, № 1. - С. 59-72.

32. Кривой И.И., Драбкина Т.М., Васильев А.Н., Прокофьев А.В., Ващинкина Е.В., Кравцова В.В. Изоформы Ыа,К-АТФазы в скелетной мышце: физиологическая роль и эндогенные ингибиторы // XIX съезд физиологического общества им. И.П. Павлова. 20-24 сентября 2004. - Екатеринбург, Россия. Рос. физиол. журн. им. И. М. Сеченова. - 2004. - Т. 90, № 8. - С. 378-379.

КРАВЦОВАВИОЛЕТТАВАСИЛЬЕВНА

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Отпечатано с готового оригинал-макета В МЕДИА-ЦЕНТРЕ Факультета безопасности ИВТОБ СПбГПУ

Формат: обрезной 205x145. Гарнитура «Таймс» Объем 1,0 п.л. Заказ № 06/05-п. Тираж 120 экз.

С(0Л

ZU

16 ФЕ8 2005

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кравцова, Виолетта Васильевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Функциональная роль и регуляция Na+,K+-АТФазы.

1.2. Изоформы субъединиц Na+,K+-АТФазы.

1.3. Изоформы а-субъединицы и эндогенные ингибиторы №+,К+-АТФазы.

1.4. Ыа+,К+-АТФаза и ее изоформы в скелетных мышцах.

1.5. Холинергическая регуляция Na+,K+-АТФазы в скелетной мышце.

1.6. Никотиновый холинорецептор скелетной мышцы: связь с Na+,K+-АТФазой.

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Электрофизиологические исследования.

2.1.1. Характеристика экспериментального объекта.

2.1.2. Характеристика экспериментальных условий.

2.2. Оценка транспортной активности Na+,K+-АТФазы.

2.3. Оценка каталитической активности Na+,K+-АТФазы.

2.4. Обработка результатов.

2.5. Применяемые вещества.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Ш 3.1. Роль изоформ а-субъединицы Na+,K+-АТФазы в электрогенезе мышечных волокон диафрагмы крысы.

3.1.1. Вклад изоформ Na+,K+-АТФазы в мембранный потенциал покоя мышечных волокон.

3.1.2. Параметры потенциалов действия мышечных волокон ф при блокаде а2 изоформы Na+,K+-АТФазы.

3.2. Роль изоформ а-субъединицы Na+,K+-АТФазы в гиперполяризующем эффекте ацетилхолина в диафрагме крысы.

3.2.1. Гиперполяризующий эффект ацетилхолина и роль Ыа+,К+-АТФазы.

3.2.2. Роль al и а2 изоформ №+,К+-АТФазы в гиперполяризующем эффекте ацетилхолина.

3.2.3. Влияние экстракта почек свиньи на гиперполяризующий эффект ацетилхолина. ф 3.3. Роль никотинового холинорецептора в гиперполяризующем эффекте ацетилхолина в диафрагме крысы.

3.3.1. Оценка возможности прямого действия ацетилхолина на Na+,K+-ATOa3y.

3.3.2. Гиперполяризующий эффект ацетилхолина в условиях ингибирования ацетилхолинэстеразы.

3.3.3. Зависимость доза - ответ для гиперполяризующего эффекта ацетилхолина.

3.3.4. Роль никотинового холинорецептора в гиперполяризующем эффекте ацетилхолина.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

4.1. Изоформы а-субъединицы Ыа+,К+-АТФазы и электрогенез скелетных мышечных волокон.

4.2. Роль изоформ а-субъединицы Ыа+,К+-АТФазы в гиперполяризующем эффекте ацетилхолина в диафрагме крысы.

4.3. Роль никотинового холинорецептора в гиперполяризующем эффекте ацетилхолина в диафрагме крысы.

5. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изоформы α-субъединицы Na+,K+-ATФазы и электрогенез скелетной мышцы крысы"

Актуальность исследования. №+,К+-зависимая АТФаза, гидролизующая АТФ в присутствии Na+ и К+, является интегральным мембранным ферментом, функционирующим как Na+,K+-Hacoc, и обнаружена в плазматической мембране практически всех животных клеток. Основная функция Ыа+,К+-АТФазы заключается в поддержании трансмембранных градиентов Na+ и К+ за счет активного транспорта этих ионов. Эти градиенты обеспечивают необходимый уровень мембранного потенциала и возбудимость клеток, а также ряд других важных транспортных механизмов клетки. Таким образом, Na+,K+-АТФаза является важнейшим регулятором клеточных функций, который обеспечивает способность возбудимых клеток воспринимать и передавать сигналы, а также поддерживает ионный гомеостазис организма в целом (см. обзоры: Болдырев, 1985; 1998; Blaustein, 1993; Clausen, 1998; Sejersted, Sjogaard, 2000; Glitsch, 2001; Lichtstein, Rosen, 2001; Schoner, 2002).

Na+,К -АТФаза представляет собой димер, состоящий из а- и (3-субъединиц, в некоторых тканях включает также у-субъединицу. Субъединица ос, содержащая места связывания с АТФ и ионами Na+ и К+, отвечает за каталитические и транспортные свойства Ка+,К+-АТФазы. Кроме того, а-субъединица содержит участок, являющийся специфическим рецептором для сердечных гликозидов. Для позвоночных в настоящее время известны четыре изоформы а-субъединицы №+,К+-АТФазы (al - a4), каждая из которых кодируется собственным геном. Физиологическая роль изоформ Ыа+,К+-АТФазы во многом остается неясной. По ряду данных основную насосную функцию в клетке выполняет изоформа al, тогда как прочие являются вспомогательными (регуляторными) (см. обзоры: Blanco, Mercer, 1998; Mobasheri et al., 2000; Lopina, 2001).

В скелетных мышцах активность №+,К+-АТФазы является принципиально важным фактором для поддержания сократительной функции и работоспособности нервно-мышечного аппарата (Clausen, 1998, Sejersted, Sjogaard, 2000). Установлено, что скелетные мышечные волокна млекопитающих экспрессируют две изоформы (al и а2) а-субъединицы Na+,K+-ATOa3bi, причем фракция изоформы а2 составляет до 50 % и более (Lavoie et al., 1997; Thompson et al., 1999; He et al., 2001). Механизмы регуляции данных изоформ и их роль в поддержании электрогенеза и сократительных свойств скелетных мышечных волокон не выяснены, причем исследовались лишь в опытах на мышцах эмбрионов (Radzyukevich et al., 2004) и мутантных животных (Не et al., 2001). Эти работы в данном направлении, по сути, являются единственными.

Хорошо известно, что ряд гормонов и медиаторов, в том числе ацетилхолин (АХ), способны регулировать Ыа+,К+-АТФазу (Елаев, 1980; Голиков и др., 1985; Begyun et al., 1996; Clausen, 1998; Glitsch, 2001; Gloor, 1997; Mathias et al., 2000). Это свойство AX имеет непосредственное отношение к классической проблеме немедиаторной, регуляторной функции медиаторов, сохраняющей свою актуальность и в настоящее время (Ухтомский, 1940; Гинецинский, Михельсон, 1937; Коштоянц, 1951; Беритов, 1959; Зефиров, 1967; Полетаев, 1974).

Влияние АХ и его миметиков на Ыа+,К+-АТФазу показано и в сердечной (Danilenko et al., 1990; 1991; Mathias et al., 2000), и в скелетной мышцах (Платонова и др., 1986; Dlouha et al., 1979; Vyskocil et al., 1983; Henning et al., 1993; Nikolsky et al., 1994; Kragenbrink et al., 1996). В частности, обнаружено, что в отличие от квантового АХ, деполяризующего постсинаптическую мембрану, неквантовый АХ (присутствующий в синаптический щели в наномолярных концентрациях) вызывает гиперполяризацию мембраны скелетных мышечных волокон за счет активации электрогенного Na+,K+-Hacoca (Dlouha et al., 1979; Vyskocil et al., 1983; Nikolsky et al., 1994). Этому эффекту неквантового AX придается большое физиологическое значение как важному фактору нейронального контроля электрогенеза скелетной мышцы (Волков, Полетаев, 1988; Vyskocil et al., 1983; Nikolsky et al., 1994). Гиперполяризующим эффектом обладает и экзогенный АХ в сходных концентрациях (см. обзор: Кривой, 2000). Однако ни мишень АХ, ни тип изоформы Ыа+,К+-АТФазы в его гиперполяризующем действии не были установлены.

Цель и основные задачи исследования: целью данной работы было выявление роли al и a2 изоформ a-субъединицы Ыа+,К+-АТФазы в поддержании и холинергической регуляции электрогенеза зрелых скелетных мышечных волокон нормальных (не мутантных) крыс.

В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. Оценить вклад изоформ al и a2 в мембранный потенциал покоя (Ml Ш) мышечных волокон диафрагмы крысы, а также роль изоформы а2 в поддержании их электрогенеза.

2. Выявить участие Ыа+,К+-АТФазы в гиперполяризующем эффекте наномолярных концентраций АХ в диафрагме крысы и определить тип изоформы ее a-субъединицы, вовлеченной в этот эффект.

3. Исследовать характеристики мишени АХ в его гиперполяризующем действии; проверить роль никотинового холинорецептора в качестве такой мишени.

Положения, выносимые на защиту:

1. Основную "насосную" функцию, обеспечивающую МПП мышечных волокон диафрагмы крысы в покое, выполняет al изоформа Ыа+,К+-АТФазы; роль а2 изоформы в поддержании Ml 111 относительно невелика, однако ее активность важна для генерации нормальных мышечных потенциалов действия (ПД).

2. Гиперполяризация мышечных волокон диафрагмы крысы при действии АХ в наномолярных концентрациях обусловлена существенным увеличением вклада а2 изоформы Na+,K+-AT<X>a3bi в величину МПП.

3. Холинергическая регуляция электрогенеза мышечных волокон диафрагмы крысы при участии а2 изоформы №+,К+-АТФазы осуществляется за счет связывания АХ с никотиновым холинорецептором в конформационном состоянии со сверхвысокой аффинностью к АХ.

Научная новизна работы. Впервые исследована роль al и a2 изоформ Na+,K+-ATOa3bi в поддержании электрогенеза мышечных волокон скелетной мышцы нормальных (не мутантных) взрослых крыс. Анализ зависимости МПП мышечных волокон диафрагмы крысы от концентрации специфического ингибитора Na+,K+-ATOa3bi оуабаина впервые показал, что основной электрогенный вклад в МПП вносит изоформа al. Вклад а2 изоформы в МПП относительно невелик, однако ее селективная блокада оуабаином вызывает нарушения в механизме генерации мышечных ПД (снижение амплитуды и увеличение длительности). Установлено, что гиперполяризующее действие наномолярных концентраций экзогенного АХ в диафрагме крысы реализуется за счет существенного увеличения вклада в Ml 111 именно а2 изоформы Na+,K+-ATOa3bi (без влияния на изоформу al). Применение агонистов и антагонистов никотинового холинорецептора, а также анализ концентрационной зависимости для гиперполяризующего эффекта АХ показал, что этот эффект реализуется при участии никотинового холинорецептора в конформационном состоянии со сверхвысокой аффинностью к АХ, предположительно, в состоянии десенситизации. Впервые выдвинута гипотеза о том, что в скелетной мышце а2 изоформа Na+,K+-ATOa3bi выполняет регулирующую функцию и за счет функциональной связи с никотиновым холинорецептором участвует в холинергическом контроле электрогенеза мышечных волокон.

Практическая значимость работы. Полученные данные раскрывают новый механизм регуляции скелетной мышцы циркулирующими эндогенными и экзогенными холинергическими лигандами и дигиталисоподобными ингибиторами Na+,K+-ATOa3bi. Эти знания важны также для понимания механизмов побочных эффектов применяемых в клинике сердечных гликозидов, холинопозитивных препаратов (применяемых как стимуляторы памяти, при лечении ряда нейродегенеративных расстройств, миастении и др.), а также негативных последствий курения. Предлагаемый принцип регуляции за счет функциональной связи никотинового холинорецептора с Иа+,К+-АТФазой возможно действует и в ЦНС, где важнейшей функцией никотиновых холинорецепторов является модуляция эффективности синаптических связей.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на конкурсах молодых ученых СПбГУ (1998, 2000), на заседаниях секции общей физиологии Санкт-Петербургского общества физиологов, биохимиков и фармакологов им. И.М. Сеченова (2001, 2004), Всероссийских школах "Актуальные проблемы нейробиологии" (Казань, 1999, 2000, 2001), Российской медико-биологической конференции "Человек и его здоровье" (Санкт-Петербург, 1999, 2000, 2001), Международной междисциплинарной конференции "Человек. Природа. Общество. Актуальные проблемы" (Санкт-Петербург, 1998, 2000), конференции молодых ученых России с международным участием "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины" (Москва, 2001), "32 Annual Meeting Society for Neuroscience", Orlando, Florida (2002), "10 International Conference on Na,K-ATPase and Related Cation Pumps", Elsinore, Denmark (2002), International Symposium "Biological Motility" dedicated to the memory of acad. G.M. Frank Pushchino, Russia (2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 32 работы.

Структура и объем диссертации. Диссертация объемом 116 страниц состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 157 источников, из которых 120 -иностранных авторов. Диссертация иллюстрирована 19 рисунками и 2 таблицами.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Кравцова, Виолетта Васильевна

ВЫВОДЫ

1) Анализ зависимости доза-ответ деполяризующего действия оуабаина показал, что основной вклад в поддержание МПП мышечных волокон диафрагмы крысы (-14.5±1.3 мВ) вносит оуабаин-резистентная al изоформа Na+,K+-АТФазы; электрогенный вклад оуабаин-чувствительной а2 изоформы в покое относительно мал (-4.5±1.2 мВ). Селективная блокада а2 изоформы оуабаином (1 мкмоль/л) вызывает нарушения в механизме генерации мышечных ПД, проявляющиеся в снижении их амплитуды и увеличении длительности.

2) Добавление в раствор АХ (100 нмоль/л) вызывает гиперполяризацию внесинаптической мембраны мышечных волокон величиной 4.2±0.5 мВ. Эффект блокируется специфическими ингибиторами Na+,K+-АТФазы (оуабаин, дигоксин, маринобуфагенин) в наномолярном диапазоне, что свидетельствуют об участии Na+,K+-АТФазы в этом эффекте АХ. В присутствии АХ электрогенный вклад а2 изоформы Na+,K+-АТФазы в МПП возрастает до -9.0±1.2 мВ; вклад al изоформы (-15.7±1.2 мВ) при этом не изменяется.

3) АХ в диапазоне концентраций от 100 нмоль/л до 100 мкмоль/л не влияет на транспортную активность Na+,K+-АТФазы в эритроцитах крысы и на каталитическую активность очищенной Na+,K+-АТФазы из почек овцы, то есть не оказывает прямого действия на этот фермент.

4) Вызываемая АХ гиперполяризация воспроизводится агонистами никотинового холинорецептора карбахолином или никотином и блокируется специфическими конкурентными антагонистами d-тубокурарином или а-бунгаротоксином, но не проадифеном - неконкурентным антагонистом, блокатором открытого канала рецептора. Результаты показывают, что АХ вызывает гиперполяризацию за счет связывания со специфическими сайтами никотиновых холинорецепторов, причем эффект не опосредуется ионными ^ токами через их каналы.

5) Величина ЭК5о для гиперполяризующего эффекта АХ составляет 28.3±3.6 нмоль/л. Десенситизирующий агент проадифен не влияет на максимальную величину гиперполяризации, но сдвигает кривую доза-ответ для АХ до ЭК5о=7.1±2.3 нмоль/л. В гиперполяризующем эффекте АХ участвуют никотиновые холинорецепторы в конформационном состоянии, характеризующемся сверхвысокой аффинностью к АХ, предположительно в состоянии десенситизации.

6) В мышечных волокнах диафрагмы крысы существует функциональная связь между никотиновыми холинорецепторами и а2 изоформой Na+,K+

АТФазы. Это указывает на новый (холинергический) путь регуляции Na+,K+-АТФазы и на новую роль никотинового холинорецептора как модулятора этого фермента.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кравцова, Виолетта Васильевна, Санкт-Петербург

1. Беритов И.С. Физиология нервной и мышечной системы. M.-JL: Изд-во АН СССР. - 1959. -Т.1.-600 с.

2. Болдырев А.А. Биологические мембраны и транспорт ионов. -М.: Изд-во МГУ, 1985. - 208 с.

3. Болдырев А.А. Na/K-АТФаза свойства и биологическая роль // Соросовский образовательный журнал. - 1998. - Т.4, №29. - С.2-9.

4. Веренинов А.А., Виноградова Т.А., Ивахнюк И.С., Марахова И.И., Торопова Ф.В. Применение пламенно-эмиссионного анализа для измерения потоков щелочных катионов через клеточную мембрану // Цитология. 1982. -Т. 14, №1. - С. 98-103.

5. Волков Е.М., Полетаев Г.И. Нейротрофический контроль функциональных свойств поверхностной мембраны мышечного волокна // Механизмы нейрональной регуляции мышечной функции / Под ред. Г.А. Наследова . Л.: Наука. - 1988. - С.5-26.

6. Воронин В.А., Никольский Е.Е. Исследование температурной зависимости неквантового освобождения ацетилхолина // Физиология медиаторов. Периферический синапс. Тез. докл. - Казань - 1984. - С.57-58.

7. Гинецинский А.Г., Михельсон Н.И. О гуморальной передаче нервного возбуждения в двигательных окончаниях соматического нерва // Успехи совр. биол. 1937. - Т.6. - С.399-431.

8. Голиков С.Н., Долго-Сабуров В.Б., Елаев Н.Р., Кулешов В.И. Холинергическая регуляция биохимических систем клетки. М.: Медицина. -1985.-224 с.

9. Долго-Сабуров В.Б. Холинергическая импульсация и некоторые ^ биохимические системы / В кн.: Холинергическая регуляция биохимическихсистем клетки. М.: Медицина. - 1985. - С.86-158.

10. Долго-Сабуров В.Б. Молекулярные механизмы нейромедиаторных эффектов ацетилхолина // Нейрохимия. 1987. - Т.6, № 4. - С.611-621.

11. Драбкина Т.М., Кривой И.И. От разнообразия молекулярных форм 01 к функциональной специализации олигомерных белков. Никотиновыйхолинорецептор, ацетилхолинэстераза и Ыа+,К+-АТФаза // Цитология. 2004. - Т.46, №2. - С.89-104.

12. Елаев Н.Р. Активация Ыа+,К+-АТФазы микросом нервных клеток ацетилхолином в модельной системе // Биохимия. 1980. - Т.20, №10.1. С.1173-1178.

13. Зефиров JI.H. О значении ацетилхолинового обмена в механизме деятельности соматической нервной системы // Автореф. докт. дис. Казань. -1967.-37 с.

14. Казеннов A.M., Маслова М.Н., Савина Г.В. Сравнительная характеристика свойств ИаД-АТФазы эритроцитов человека и карпащ

15. Cyprinus Carpio II Журн.эволюц.биохим.физиол. 1984. - Т.20, №2. - С. 167172.

16. Коштоянц Х.С. Белковые тела, обмен веществ и нервная регуляция. -М.: Изд-во АН СССР. 1951. - 100 с.

17. Ф 17. Кривой И.И. Механизмы немедиаторного действия ацетилхолина внервно-мышечном аппарате // Росс, физиол. журн. им. И.М. Сеченова. -2000. Т.86, № 8. - С.1019-1029.

18. Кривой И.И., Драбкина Т.М., Добрецов М.Г., Васильев А.Н., Кравцова В.В., Итон М.Дж., Скачков С.Н., Мандел Ф. Функциональная связь никотиновых холинорецепторов и Ыа,К-АТФазы в скелетной мышце // Физиол.журн.им.И.М.Сеченова. 2004. -Т.90, № 1. С.59-72.

19. Кривой И.И., Кубасов И.В., Лопатина Е.В. Исследование восстановления работоспособности утомляемой диафрагмы крысы после применения экзогенного ацетилхолина // Физиол.журн.им.И.М.Сеченова. -1994. Т.80, №9. - С.61-66.

20. Кривой И.И., Кулешов В.И., Матюшкин Д.П. Нервно-мышечный синапс и антихолинэстеразные вещества. JL: Издательство ЛГУ - 1987. -240 с.

21. Крылов Б.В., Дербенев А.В., Подзорова С.А., Людыно М.И., Кузьмин А.В., Изварина Н.Л. Морфин уменьшает чувствительность к потенциалу медленных натриевых каналов // Физиол.журн.им.И.М.Сеченова. 1999. -Т.85, № 2. С.226-236.

22. Лопатина Е.В., Кривой И.И. Механизм вызываемой ацетилхолином долговременной следовой гиперполяризации мышечных волокон диафрагмы крысы // Вестник СПбГУ. 1997. - Сер.З, вып.4 (№ 24). -С. 72-79.

23. Матюшкин Д.П. Функциональные клеточные взаимодействия в нервно-мышечном аппарате. Л.: Наука, 1980. - 184 с.

24. Мустафин A.M. Принцип динамической полифункциональности белков на примере системы холинэстераза-холинорецептор-Ыа+/К+-АТФаза // Успехи, соврем, биол. 1976 - Т.87. - С.76-282.

25. Наследов Г.А. Тоническая мышечная система позвоночных. Л.: Наука.-1981.-187 с.

26. Наследов Г.А., Катина И.Е., Кобзева М.А. О функционировании электромеханической связи на разных стадиях контрактурного сокращения // Физиол. журн. им. И.М.Сеченова. 2004. - Т.90, № 32. - С.327-338.

27. Николе Дж. Г., Мартин Ф.Р., Валлас Б. Дж., Фукс П.А. От нейрона к мозгу. М.: УРСС - 2003. - 672 с.

28. Ноздрачев А.Д., Поляков E.JI. Анатомия крысы. СПб.: Изд. «Лань».-2001.-464 с.

29. Платонова Р.Д., Посконова М.А., Родионов И.М. Активация ацетилхолином натриевого насоса в мышце лягушки // Физиол.журн. СССР им. И.М.Сеченова. 1986. - Т.72, №7. - С.921-925.

30. Полетаев Г.И. Значение гуморальных факторов в механизме передачи возбуждения с нерва на скелетную мышцу // Автореф. дисс. д-ра биол. наук. Казань. - 1974. - 28 с.

31. Скок В.И., Селянко А.А., Деркач В.А. Нейрональные холиноре-цепторы. М.: Наука. - 1987. - 344 с.

32. Уразаев А.Х. Роль активного хлорного транспорта в поддержании мембранного потенциала и объема мышечных волокон // Автореф. дисс.д-ра биол. наук. Казань. - 1997. - 40 с.

33. Ухтомский А.А. (1940). Очерк физиологии нервной системы // Собр.соч. Л.: Изд-во ЛГУ. - 1954. - Т.4. - 231 с.

34. Федин А.Н., Ноздрачев А.Д., Бреслав И.С. Физиология респираторных систем. СПб.: Изд.СПбГУ, - 1997 - 183 с.

35. Ходоров Б.И. Общая физиология возбудимых мембран (руководство по физиологии). М.: Наука. - 1975. - 406 с.

36. Шмерлинг М.Д., Филюшина Е.Е., Бузуева И.И., Гребнева О.Л., Плотникова Н.А. Скелетная мышца. Структурно-функциональные аспекты адаптации. Под ред. акад. АМН СССР Ю.И.Бородина. Новосибирск: Наука. Сиб.отд-ние. - 1991. - 121 с.

37. Aizman О., Uhlen P., Lai М., Brismar Н., Aperia A. Ouabain, a steroid hormone that signals with slow calcium oscillations // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2001. - V.98. - P.13420-13424.

38. Arnon A., Hamlyn J.M., Blaustein M.P. Ouabain augments Ca2+ transients in arterial smooth muscle without raising cytosolic Na+ // Am.J.Physiol. Heart Circ.Physiol. 2000. - V .279. - H679-H691.

39. Balzan S., D'Urso G., Ghione S., Martinelli A., Montali U. Selective inhibition of human erythrocyte Na+/K+ ATPase by cardiac glycosides and by a mammalian digitalis like factor // Life Sci. 2000. - V.67. - P.1921-1928.

40. Begyun P., Beggah A., Cotecchia S., Geering K. Adrenergic, dopaminergic, and muscarinic receptor stimulation leads to PKA phosphorylation of Na-K-ATPase //Am.J.Physiol. 1996. - V.270. - C131-C137.

41. Bennett M.R. Development of neuromuscular synapse // Physiol. Rev.- 1983. V.63, № 3. - P.915-1048.

42. Blanco G., Mercer R.W. Isozymes of the Na-K-ATPase: heterogeneity in structure, diversity in function // Am.J.Physiol. 1998. - V. 275. - F633-F655.

43. Blaustein M.P. Physiological effects of endogenous ouabain: control of intracellular Ca2+ stores and cell responsiveness // Am. J. Physiol. (Cell Physiology 33).- 1993. -V. 264 -C1367-C1387.

44. Boulter J., Evans K., Goldman G., Martin G., Trecco D., Heinemann S., Patrick J. Isolation of a cDNA clone coding for a possible neural nicotinic acetylcholine receptor a-subunit // Nature. 1986. - V. 319. - P. 368-374.

45. Bray J.J., Forrest J.W., Hubbard J.I. Evidence for the role of non-quantal acetylcholine in the maintenance of the membrane potential of rat skeletal muscle // J.Physiol. 1982. - V.326. - P.285-296.

46. Butt A.N., Tennant B.P., Gillingwater S.D., Shepherd P.S., Swaminathan R. Binding of ouabain and human ouabainlike substance to different Na+,K+-ATPase isoforms // Hypertens.Res. 2000. - V.23. - P.45-50.

47. Changeux J.-P., Edelstein SJ. Allosteric mechanisms in normal and pathological nicotinic acetylcholine receptors // Curr. Opin. Neurobiol. 2001. -V.ll.-P. 369-377.

48. Clausen T. Clinical and therapeutic significance of the Na+,K+ pump // Clinical science. 1998. - V.95. - P.3-17.

49. Clausen T. Long- and short-term regulation of the Na+-K+ pump in skeletal muscle //News Physiol.Sci. 1996. - V.l 1. -P.24-30.

50. Clausen T. The Na+,K+ pump in skeletal muscle: quantification, regulation and functional significance // Acta Physiol. Scand. 1996. - V.l56. -P.227-235.

51. Clausen Т., Andersen S.L.V., Flatman J.A. Na+-K+-pump stimulation elicits recovery of contractility in K+-paralysed rat muscle // J.Physiol. 1993. -V.472. - P.521-536.

52. Cougnon M.H., Moseley A. E., Radzyukevich T.L., Lingrel J.B., Heiny J.A. Na,K-ATPase a- and (3-isoform expression in developing skeletal muscles: a2 correlates with t-tubule formation // Eur. J. Physiol. 2002. - V. 445. - P. 123-131.

53. Danilenko M.P., Turmukhambetova V.C., Yesirev O.V., Tkachuk V.A., Panchenko M.P. Na+-K+-ATPase-G protein coupling in myocardial sarcolemma: separation and reconstitution // Am. J. Physiol. 1991. - V. 261, № 4. - P. 87-91.

54. Delbono O, Kotsias B.A. Hyperpolarizing effect of aminophylline, theophylline, and cAMP on rat diaphragm fibers // J. Appl. Physiol. 1988. - V. 65, №5. -P. 1893-1899.

55. Dezaki К., Tsuneki H., Kimura I. Methyllcaconitine-sensitive neuronalnicotinic receptor-operated slow Ca2+ signal by local application or perfusion of1. W1

56. ACh at the mouse neuromuscular junction // Neurosci.Res. 1999. - V.33, № 1-P. 17-24.

57. Dlouha H., Teisinger J., Vyskocil F. Activation of membrane Na+/K+-ATPase of mouse skeletal muscle by acetylcholine and its inhibition by aщ bungarotoxin, curare and atropine // Pflugers Arch. 1979. - V.380, № 1. 1. P.101-104.

58. Dobretsov M., Hastings S.L., Sims T.J., Stimers J.R., Romanovsky D. Stretch receptor-associated expression of аз isoform of the Na+,K+-ATPase in rat peripheral nervous system //Neuroscience. 2003. - V. 116. -P.l069-1080.

59. Doris P.A., Bagrov A.Y. Endogenous sodium pump inhibitors andblood pressure regulation: an update on recent progress // Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 1998. - V.218. - P.156-167.

60. Duclert A., Changeux J.P. Acetylcholine receptor gene expression at the developing neuromuscular junction // Physiol.Rev. 1995. - V.75, №2. -P.339-368.

61. Elfman L., Heilbronn E., Jorgensen P. Fraction of protein components of plasma membranes from the electric organ Torpedo marmorata И Biochim.Biophys.Acta. 1982. - V.693, № 2. - P.273-279.

62. Farr C.D., Burd C., Tabet M., Wang X., Welsh W.J., Ball W.J. Three-^ dimensional quantitative structure activity relationship study of the inhibition of

63. Na+,K+-ATPase by cardiotonic steroids using comparative molecular field analysis // Biochemistry. 2001. - V.41, № 4. - P.l 137-1148.

64. Fedorova O.V., Bagrov A.Y. Inhibition of Na/K ATPase from rat aorta by two Na/K pump inhibitors, ouabain and marinobufagenin; (evidence ofinteraction with different а-subunit isoforms) // Am. J. Hypertens. 1997. - V.10. -P.929-935.

65. Fedorova O.V., Lakatta E.G., Bagrov A.Y. Endogenous Na,K pump ligands are differentially regulated during acute NaCl loading of Dahl rats // Circulation. 2000. - V.102. - P.3009-3014.

66. Fletcher P., Forrester T. The effect of curare on the release of acetylcholine from mammalian motor nerve terminals and an estimate of quantum content // J. Physiol. 1975. - V.251. - P. 131-144.

67. Fossier P., Baux G., Tauc L. Direct and indirect effects of an organophosphorus acetylcholinesterase inhibitor and of oxime on a neuro-neuronal synapse // Pflugers Arch. 1983. - V.396, № 1 - P. 15-22.

68. Foster R.H., Prat H., Rothman I. Is ouabain produced by the adrenal gland? // Gen.Pharmac. 1998. - V.31, №4. - P.499-501.

69. Gao J., Wymore R.S., Wang Y., Gaudette G.R., Krukenkamp I.B., Cohen I.S., Mathias R.T. Isoform-specific stimulation of cardiac Na/K pumps by nanomolar concentrations of glycosides // J.Gen.Physiol. 2002. - V.119. - P. 297-312.

70. Garland C.M., Foreman R.C., Chad J.E., Holden-Dye L., Walker R.J. The actions of muscle relaxants at nicotinic acetylcholine receptor isoforms // Eur. J. Pharmacol. 1998. - V.357. - P.83-92.

71. Giniatullin R.A., Khazipov R.N., Oranska T.I., Nikolsky E.E., Voronin V.A., Vyskocil F. The effect of non-quantal acetylcholine release on quantal miniature currents at mouse diaphragm // J. Physiol. 1993. - V. 466. - P. 105114.

72. Glitsch H.G. Electrophysiology of the sodium-potassium-ATPase in cardiac cells // Physiol.Rev. 2001. - V.81, № 4. - P.1791-1826.

73. Gloor S.M. Relevance of Na,K-ATPase to local extracellular potassium homeostasis and modulation of synaptic transmission // FEBS Letters. 1997. -V.412. -P.l—4.

74. Gorman A., Marmor M. Steady-State contribution of the sodium pump to the resting potention of a molluscan neurone // J.Physiol. 1974. - V.242. -P.35-48.

75. Grutter Т., Changeux J.-P. Nicotinic receptors in wonderland // Trends Biochem. Sci. 2001. - V.26. - P.459-462.

76. Haber R.S., Loeb J.N. Selective induction of high- ouabain -affinity isoform of Na+-K+-ATPase by thyroid hormone // Am. J. Physiol. 1988. - V. 255. -E912-E919.

77. Hamilton S.L., Serysheva I., Strasburg G.M. Calmodulin and excitation-contraction coupling // News Physiol Sci. 2000. - V.15 - P.281-284.

78. Hamlyn J.M. Observation of the nature, biosynthesis, secretion and significance of endogenous ouabain // Clin.Exp.Hypertens. 1998. - V.20. - P. 523-533.

79. Hansen O. The c*i isoform of Na+,K+ ATPase in rat soleus and extensor digitorum longus // Acta Physiol. Scand. 2001. - V. 173. - P. 335-341.

80. Hartford A.K., Messer M.L., Moseley A.E., Lingrel J.B., Delamere N.A. Na,K-ATPase a2 inhibition alters calcium responses in optic nerve astrocytes // Glia. 2004. - V. 45. - P. 229-237.

81. He S., Shelly D.A., Moseley A.E., James P.F., James J.H., Paul R.J., Lingrel J.B. The oti- and a2-isoforms of Na-K-ATPase play different roles in skeletal muscle contractility // Am. J. Physiol. Reg. Integ. Сотр. Physiol. 2001. -V. 281. - R917-R925.

82. Henning R.H., Nelemans S.A., van den Akker J., den Hertog A. Induction of Na+/K+-ATPase activity by long-term stimulation of nicotinic acetylcholine receptors in C2C12 myotubes // Br. J. Pharmacol. 1994. - V.l 11.- P.459-464.

83. Hicks A., McComas A.J. Increased sodium pump activity followingrepetitive stimulation of rat soleus muscles // J. Physiol. 1989. - V.414. - P.337-349.

84. Higham S.C., Melikian J., Karin N.J., Ismail-Beigi F., Pressley T.A. Na,K-ATPase expression in C2C12 cells during myogenesis: minimal contributionof a2 isoform to Na,K transport // J.Membrane Biol. 1993. - V.l31. - P. 129-136.

85. Hobbiger F. Pharmacology of anticholinesterase drugs // In: Handbook of experimental pharmacology. New York. Springer-Verlag. 1976. - V.42. -P.487-581.

86. Horisberger J.D., Kharoubi-Hess S. Functional differences between a ^ subunit isoforms of the rat Na,K-ATPase expressed in Xenopus oocytes // J.

87. Physiol. 2002. - V.539. - P.669-680.

88. Ishida Y., Dal Ri H., Schmidt G., Vetterlein F. Actions of diazepam on the discharge pattern of phrenic motoneurons in rats // Neuropharmacology. -1979. V. 18. - P.679-687.

89. James P.F., Grupp I.L., Grupp G., Woo A.L., Askew G.R., Croule

90. M.L., Walsh R.A., Lingrel J.B. Identification of a specific role for the Na,K

91. ATPase alpha 2 isoform as a regulator of calcium in the heart // Mol. Cell. 1999.- V.3. -P.555-563.

92. Juhaszova M., Blaustein M.P. Na+ pump low and high ouabain affinity a subunit isoforms are differently distributed in cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1997. V.94. -P.1800-1805.

93. Katz В., Miledi R. Transmitter leakage from motor nerve endings // Proc.Roy.Soc.B. 1977. - V.196. - P.59-72.

94. Kragenbrink R., Higham S.C., Sansom S.C., Pressley T.A. Chronic stimulation of acetylcholine receptors: differential effects on Na,K-ATPase isoforms in a myogenic cell line // Synapse. 1996. - V.23. - P.219-223.

95. Lavoie L., Levenson R., Martin-Vasallo P., Klip A. The molar ratios of a and p subunits of the Na+-K+-ATPase differ in distinct subcellular membranes from rat skeletal muscle // Biochem. 1997. - V. 36. P. 7726-7732.

96. Lichtstein D., Rosen H. Endogenous digitalis-like Na,K-ATPase inhibitors, and brain function // Neurochem. Res. 2001. - V.26, №(8/9). - P. 971-978.

97. Longo N., Scaglia F., Wang Y. Insulin increases the turnover rate of Na+-K+-ATPase in human fibroblasts // Am. J. Physiol. (Cell Physiol.). 2001. -V.280. - C912-C919.

98. Lopina O.D. Interaction of Na,K-ATPase catalytic subunit with cellular proteins and other endogenous regulators // Biochemistry (Moscow). -2001.-V.6. -P.l 122-1131.

99. Magazanik L.G., Vyskocil F. Desensitization at the neuromuscular junction / In: "Motor innervation of muscle", ed. Thesleff. 1976. - P. 151-176.

100. Mandel F., Vasiliev A.N., Krivoi I.I. Using the Na,K-ATPase itself for the large scale isolation and purification of endogenous digitalis-like factors // Ann. N.Y. Acad. Sci. -2003. V.986. - P 617-619.

101. Marette A., Krischer J., Lavoie L., Ackerley C., Carpentier J-L., Klip A. Insulin increases the Na-K-ATPase a2-subunit in the surface of rat skeletal muscle: morphological evidence // Am.J.Physiol. 1993. - V. 265. - C1716-C1722.

102. Mathias R.T., Cohen I.S., Gao J., Wang Y. Isoform-specific regulation of the Na+-K+pump in heart // News Physiol.Sci. 2000. -V. 15. -P. 176-180.

103. Massoulie J., Bon S. The molecular form of cholinesterase in vertebrates // Ann. Rev. Neurosci. 1982. - V. 5. - P.57-106.

104. Matyushkin D.P., Krivoi I.I., Drabkina T.M. Synaptic feed-backs mediated by potassium ions // Gen.Physiol.Biophys. 1995. - V.14. - P.369-381.

105. McDonough A.A., Thompson C.B., Youn J.H. Skeletal muscles regulates extracellular potassium // Am. J. Physiol. 2002. - V. 282 (Renal Physiol.).-F967-F974.

106. McGehee D.S., Role L.W. Physiological diversity of nicotinic acetylcholine receptors expressed by vertebrate neurons // Ann.Rev.Physiol. — 1995. V.57. - P.521-546.

107. Metzger J.M., K.B. Scheidt and R.N. Fitts Histochemicall and physiological of the rat diaphragm // J. Appl. Physiol. 1985. - V. 58, №4. - P. 1085-1091.

108. Mukhtarov M.R., Vyskocil F., Urazaev A.Kh., Nikolsky E.E. Non-quantal acetylcholine release is increased after nitric oxide synthase inhibition // Physiol.Res. 1999. - V.48. - P.315-317.

109. Nakazawa K., Fujimori K., Takanaka A., Inoue K. Comparison of ф, adenosine triphosphate- and nicotine-activated inward currents in ratphaeochromocytoma cells // J. Physiol. 1991. - V.434. - P.647-660.

110. Nikolsky E.E., Zemkova H., Voronin V.A., Vyskocil F. Role of non-quantal acetylcholine release in surplus polarization of mouse diaphragm fibres at the endplate zone // J.Physiol. 1994. - V.477, № 3. - P.497-502.

111. Noble D. Mechanism of action of therapeutic levels of cardiac glycosides // Cardiovasc. Res. 1980. - V.14. - P.495-514.

112. Paterson В., Nordberg A. Neuronal nicotinic receptors in the human brain // Progr. Neurobiol. 2000. - V.61. - P.75-111.

113. Pellerin L., Magistretti P.J. Glutamate uptake stimulates Na+,K+-ATPase activity in astrocytes via activation of a distinct subunit highly sensitive to ouabain // J.Neurochem. 1997. - V.69. - P.2132-2137.

114. Peper K., Bradley R.J., Dreyer F. The acetylcholine receptor at the neuromuscular junction // Physiol.Rev. 1982. - V.62, № 4. - P. 1271-1340.

115. Prince R.J., Sine S.M. Acetylcholine and epibatidine binding to Ъ muscle acetylcholine receptors distinguish between concerted and uncoupledmodels // J. Biol. Chem. 1999. -V.274. - P. 19623-19629.

116. Radzyukevich T.L., Moseley A.E., Shelly D.A., Redden G.A., Behbehani M.M., Lingrel J.B., Paul R.J., Heiny J.A. The Na,K-ATPase al subunit isoform modulates contractility in the perinatal mouse diaphragm // Am. J. Physiol.

117. Cell. Physiol.-2004.-V.287,№ 5.- C1300-C1310.

118. Reines А., Репа С., Rodriguez de Lores Arnaiz G. Kinetics of Na+, K+-ATPase inhibition by an endogenous modulator (II-A) // Neurochem.Res. -2000. V.25, №1. - P. 121-127.

119. Reyes R., Jaimovich E. Functional muscarinic receptors in cultured skeletal muscle //Arch.Biochem.Biophys. 1996. - V.331., № 1. - P.41-47.

120. Ryan S.E., Blanton M.P., Baenziger J.E. A conformational intermediate between the resting and desensitized states of the nicotinic acetylcholine receptor // J. Biol. Chem. 2001. - V. 276, № 7. - P.4796-4803.

121. Sanes J.R., Lichtman J.W. Development of the vertebrate neuromuscular junction // Annu. Rev. Neurosci. 1999. - V.22. - P.389-442.

122. Scheiner-Bobis G., Schoner W. A fresh facet for ouabain action // Nat. Med. 2001. - V.7. - P.1288-1289.

123. Schmalzing G., Ruhl K., Gloor S.M. Isoform-specific interactions of Na,K-ATPase subunits are mediated via extracellular domains and carbohydrates // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - V. 94. - P.l 136-1141.

124. Schneider R., Wray V., Nimtz M„ Lehmann W.D., Kirch U., Antolovic R., Schoner W. Bovine adrenals contain, in addition to ouabain, a second inhibitor of the sodium pump // J.Biol.Chem. 1998. - V.273, № 3. - P. 784-792.

125. Schoner W. Endogenous cardiac glycosides, a new class of steroid hormones // Eur. J.Biochem. 2002. - V. 269. - P. 2440-2448.

126. Sejersted O.M., Sjogaard G. Dynamics and consequences of potassium shifts in skeletal muscle and heart during exercise // Physiol. Rev. 2000. -V. 80. -P.1411—1481.

127. Sine S.M., Taylor P. Local anesthetics and histrionicotoxin are allosteric inhibitors of the acetylcholine receptor. Studies of clonal muscle cells // J. Biol. Chem. 1982. - V.257, № 14. - P.8106-8114.

128. Skou J.C. The influence of some cations on an adenosine triphosphatase from peripherical nerves // Biochem. Biophys. Acta. 1957. — V. 23.-P.394^01.

129. Song X.Z., Pedersen S.E. Electrostatic interactions regulate desensitization of the nicotinic acetylcholine receptor // Biophys. J. 2000. - V. 78.- P. 1324-1334.

130. Stimers J.R., Lobaugh L.A., Liu S., Shigeto N. Lieberman M. Intracellular sodium affects ouabain interaction with the Na/K pump in cultured chick cardiac myocytes // J.Gen.Physiol. 1990. - V.95. - P.77-95.

131. Sweadner K.J. Isozymes of the Na+/K+-ATPase // Biochim. Biophys. Acta. 1989. - V.988. - P. 185-220.

132. Sweadner K.J. Na,K-ATPase and its isoforms / In: Neuroglia (eds. Kettenmann H., Ransom B.R.). Oxford University Press. - New York, Oxford. -1995. -P.259-272.

133. Tamura M., Landon E.J., Inagami T. Na+, K+ ATPase inhibitors in rat urine: origins and physiological significance // Clinic. Exp. Hypertens. - 1998. - V.20. - P.543-550.

134. Tao Q.F., Hollenberg N.K., Price D.A., Graves S.W. Sodium pump isoform specificity for the digitalis-like factor isolated from human peritoneal dialysate // Hypertension. 1997. - V.29. - P.815-821.

135. Thesleff S. Different kinds of acetylcholine release from the motor nerve // Int.Rev.Neurobiol. 1986. - V.28. - P.59-88.

136. Thomas R. Electrogenic sodium pump in nerve and muscle cells // Physiol.Rev. 1972. - V.52. - P.563-594.

137. Thompson C.B., Choi C., Youn J.H., McDonough A.A. Temporal responses of oxidative vs. glycolytic skeletal muscles to K+ deprivation: Na+ pumps and cell cations // Am.J.Physiol. 1999. - V.276 (Cell Physiol. 45). -C1411-C1419.

138. Thompson C.B., McDonough A.A. Skeletal muscle Na,K-ATPase a and P subunit protein levels respond to hypokalemic challenge with isoform and muscle type specificity // J.Biol.Chem. 1996. - V.271. - P.32653-32658.

139. Urazaev A., Naumenko N., Malomough A., Nikolsky E., Vyskocil F. Carbachol and acetylcholine delay the early postdenervation depolarization of muscle fibres through Ml-cholinergic receptors // Neuroscience Research. 2000.- V.37. P.255-263.

140. Urazaev A.Kh., Naumenko N.V., Poletaev G.I., Nikolsky E.E., Vyskocil F. Acetylcholine and carbachol prevent muscle depolarization in denervated rat diaphragm // NeuroReport 1997. - V.8, №2. - P.403-406.

141. Vizi E.S., Torok Т., Seregi A., Serfozo P., Adam-Visi V. Na+K+-activated ATP-ase and the release of acetylcholine and noradrenaline // J. Physiol.- 1982. V.78, № 4. - P.399-406.

142. Vyskocil F., De Gregorio F., Gorio A. The facilitating effect of gangliosides on the electrogenik (Na+/K+) pump and on the resistance of the membrane potential to hypoxia in neuromuscular preparation // Pflugers Arch. -1985.-V.403.-P.1-6.

143. Vyskocil F., Illes P. Non-quantal release of transmitter at mouse neuromuscular junction and its dependence on the activity of Na+K+-ATPase // Pflugers Arch. 1977. - V.370, № 3. - P.271-273.

144. Vyskocil F., Nikolsky E., Edwards C. An analysis of the mechanisms underlying the non-quantal release of acetylcholine at the mouse neuromuscular junction // Neurosci. 1983. - V.9, № 2. - P. 429-435.

145. Vyskocil F., Teisinger J., Dlouha H. Effect of acetylcholine, a-bungarotoxin, atropine and curare on biochemically and electrophysiologically estimated Na+K+-pump in the mouse diaphragm / Proceed. Czechoslovak Physiol. Society. -1979. -P.285-286.

146. Wessler I. Control of transmitter release from the motor nerve by presynaptic nicotinic and muscarinic autoreceptors // Trends Pharmacol. Sci. -1989.-V.10.-P.110-114.

147. Wessler I., Kilbinger H. Presynaptic nicotinic cholinoceptors mediate facilitation of acetylcholine release from the rat phrenic nerve / In: Cellular and molecular basis of cholinergic function. N.J., - 1987. - P.152-158.

148. Wilson G.G., Karlin A. Acetylcholine receptor channel structure in the resting, open, and desensitized states probed with the substituted-cysteine-accessibility method // PNAS. 2001. - V. 98. - P. 1241-1248.

149. Woo A.L., James P.F., Lingrel J.B. Sperm motility is dependent on a unique isoform of the Na,K-ATPase // J. Biol. Chem. 2000. - V. 275. - P. 20693-20699.

150. Xie Z., Askari A. Na /K -ATPase as a signal transducer // Eur. J. Biochem. 2002. - V.269. - P.2434-2439.

151. Zahler R., Sun W., Ardito Т., Zhang Z., Kocsis J.D., Kashgarian M. The a3 isoform protein of the Na+,K+-ATPase is associated with the sites of cardiac and neuromuscular impulse transmission // Circulation Res. 1996. - V. 78. - P.870-879.

152. Zolovick A.J., Norman R.L., Fedde M.R. Membrane constants of muscle fibers of rat diaphragm // Amer.J.Physiol. 1970. - V.219. - P.654-657.1. БЛАГОДАРНОСТИ

153. Также я глубоко признательна д-ру М.Г. Добрецову (Медицинский университет, Арканзас, США) за тесное и плодотворное научное сотрудничество.