Характеристика взаимодействия Na/K-АТРазы и NMDA-рецептора в гранулярных клетках мозжечка

Аккуратов, Евгений Евгеньевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Характеристика взаимодействия Na/K-АТРазы и NMDA-рецептора в гранулярных клетках мозжечка
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Характеристика взаимодействия Na/K-АТРазы и NMDA-рецептора в гранулярных клетках мозжечка"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

005010980

АККУРАТОВ Евгений Евгеньевич

ХАРАКТЕРИСТИКА ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ Ш/К-АТРазы И ^БА-РЕЦЕПТОРА В ГРАНУЛЯРНЫХ КЛЕТКАХ МОЗЖЕЧКА

На правах рукописи

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2012

005010980

Работа выполнена на кафедре биохимии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор

Болдырев Александр Александрович

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук,

профессор

Твердислов Всеволод Александрович

доктор биологических наук, профессор

Гривенников Игорь Анатольевич

Ведущая организация: Учреждение Российской Академии Наук

Институт Высшей Нервной Деятельности и Нейрофизиологии РАН (Москва)

Защита состоится 19 марта 2012 г. в 15 ч 30 мин на заседании диссертационного совета Д 501.001.71 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Биологический факультет, Большая биологическая аудитория (ББА).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Автореферат разослан <р/~» февраля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

___ Медведева М.В.

У '

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Na/K-АТРаза является одним из ключевых ферментов эукариотических клеток. Она долгое время была известна как фермент, способный поддерживать градиент ионов Na+ и К+, однако в 90-е годы XX века было установлено, что Na/K-АТРаза способна функционировать как рецептор, специфическим лигандом которого являются соединения класса кардиотонических стероидов (КТС) (Kometiani et al., 1998). Связывание Na/K-АТРазы с этими соединениями может регулировать экспрессию генов раннего и позднего ответов через активацию транскрипционных факторов (Xie et al., 1999). В литературе обсуждается, что данные процессы протекают без ингибирования ферментативной активности Na/K-АТРэзы. Несмотря на довольно длительный период, прошедший с момента этого открытия, данных об участии Na/K-АТРэзы в процессах сигнализации в нейрональных клетках известно очень мало, причем основные исследования ведутся с использованием кардиомиоцитов, почечного эпителия и фибробластов.

Na/K-АТРаза в нейрональной ткани поглощает огромное количество АТР - до 50% от общего уровня аденозинтрифосфата клетки, что связано с необходимостью восстанавливать исходное соотношение ионов Na и К после возбуждения нейрона. В нейрональных клетках а-субъединица Na/K-АТРазы представлена двумя изоформами -КТС-чувствительной аЗ-субъединицей и КТС-резистентной а1-субъединицей. В литературе активно обсуждается вопрос о том, каким образом разные изоформы способны вовлекаться в различные внутриклеточные сигнальные пути, а также ставится вопрос о наличии в тканях животных соединений класса кардиотонических стероидов и об их возможном синтезе de novo.

Недавно было показано, что белок агрин, участвующий в формировании нервномышечного синапса, способен специфически связываться с КТС-чувствительной аЗ-субъединицей Na/K-АТРэзы и вызывать эффекты, аналогичные действию КТС (Hilgenberg et al., 2006). Таким образом, был найден специфический «партнер» для КТС-чувствительной аЗ-субъединицы, которая представлена только в нейрональных клетках, что позволяет говорить о возможных путях регуляции именно КТС-чувствительной аЗ-субъединицы. Мутации в гене, который кодирует эту субъединицу, способны вызывать эпилепсию и паркинсонизм в моделях гетерозиготных мышей по данному гену (Clapcote et al., 2009).

В последнее время начали накапливаться данные о возможной взаимосвязи между Ыа/К-АТРазой и глутаматными рецепторами. Недавно показано, что связывание уабаина с Na/K-АТРэзой может влиять на стабильность ионотропных рецепторов АМРА-класса в

нейронах (Zhang et al., 2009), а также блокировать активность глутаматных переносчиков GLT-1 и GLAST в клетках глии (Rose et al., 2009). Все это позволяет говорить о возможном участии Na/K-АТРазы в функционировании глутаматной системы. Кроме того, накапливаются данные о предпосылках взаимодействия Na/K-АТРазы и ионотропного рецептора NMDA-класса (NMDA - N-метил-О-аспартат).

NMDA-рецепторы представляют собой ионотропные глутаматные рецепторы, которые участвуют в формировании синаптической пластичности и молекулярной памяти. Важным отличием NMDA-рецепторов от других ионотропных глутаматных рецепторов является то, что их канал проницаем не только для натрия и калия, но и для Са2 \ который является вторичным мессенджером и способен модулировать ответ клетки в зависимости от внешнего сигнала.

В литературе показано, что действие соединений класса кардиотонических стероидов приводит к проявлению экзайтотоксических эффектов глутамата (Stelmashook et al., 1999). Так как этот эффект снимается антагонистами NMDA-рецепторов, было выдвинуто предположение, что КТС способны влиять на функционирование NMDA-рецепторов. Было также показано, что активация NMDA-рецепторов может приводить к частичному ингибированию активности Na/K-АТРазы (Булыгина и соавт., 2003). Однако на сегодняшний день не установлено, способны ли они взаимодействовать между собой. Цель и задачи работы

Целью данной работы явилось выявление особенностей структурного и функционального взаимодействия Na/K-АТРазы и NMDA-рецептора в гранулярных клетках мозжечка крыс.

В соответствии с этой целью были поставлены и решены следующие задачи:

1. Исследовать возможное структурное взаимодействие и ко-локализацию Na/K-АТРазы и NMDA-рецептора в первичной культуре гранулярных клеток мозжечка.

2. Исследовать активацию Akt и ERK/4 киназ при действии различных концентраций уабаина и оценить возможное участие NMDA-рецептора в этих сигнальных каскадах.

3. Выявить механизмы «экзайтотоксического» действия глутамата на фоне действия уабаина.

4. Исследовать процессы долговременной регуляции NMDA-рецепторов под действием уабаина на клетки.

5. Оценить возможное влияние NMDA-рецептора на активность Na/K-АТРазы в первичной культуре гранулярных клеток мозжечка крыс и исследовать общие механизмы этого процесса.

Научная новизна и практическая значимость работы

В этом исследовании впервые показано, что Ка/К-АТРаза и ИМБА-рецептор могут формировать функциональный комплекс, в котором способны принимать участие как КТС-чувствительная аЗ-субъединица, так и КТС-резистентная а1-субъединица Ыа/К-АТРазы.

Показано, что кратковременное взаимодействие уабаина с аЗ-субъединицей Ыа/К-АТРазы приводит к активации ЕШС /г, а взаимодействие уабаина с а 1-субъединицей Иа/К-АТРазы - к активации АИ. КМОА-рсцепторы не участвуют в данных сигнальных каскадах. Связывание уабаина с а 1-субъединицей Иа/К-АТРазы приводит к усилению функции ИМБА-рецепторов за счет фосфорилирования тирозиновых остатков N1128-субъединицы. Долговременное действие уабаина на аЗ-субъединицу Ыа/К-АТРазы приводит к уменьшению количества ЫМОА-рсцепторои в первичной культуре гранулярных клеток мозжечка. Был установлен механизм ингибирования Ка/К-АТРазы при активации ЫМОА-рецепторов.

Полученные данные свидетельствуют о том, что ЫМБА-рецептор в гранулярных клетках мозжечка является объектом сложной регуляции, и на его активность могут влиять как а1-, так и аЗ-субъединицы Ыа/К-АТРазы. Полученные данные могут инициировать исследование причин, по которым недостаточность аЗ-субъединицы Иа/К-АТРазы приводит к дефициту деятельности мозга.

Апробация работы и публикации

Результаты диссертационной работы были представлены на II Международном семинаре по исследованию экспрессии, структуры и функции мембранных белков (Флоренция, Италия, 2009), XIII Международной конференции по АТРазам Р-типа, (Пасифик Гров, США, 2011). Диссертация апробирована на заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (2011). По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, среди которых 3 статьи в рецензируемых журналах, входящих в список ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

Работа изложена на 87 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы и 38 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 136 отечественных и зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования

Объектом исследования была выбрана первичная культура гранулярных клеток мозжечка, так как эта культура содержит функциональные NMDA-рецепторы, а также две изоформы а-субъединицы Na/K-АТРазы. Эти изоформы различаются по своей чувствительности к действию уабаина - аЗ-субъединица являются уабаин-чувствительной и связывается с уабаином в диапазоне концентраций от 1 нМ до 1цМ, а а1-субъединица является уабаин-резистентной и связывается с уабаином в диапазоне концентраций от 1 цМ до 1 мМ. Для приготовления первичной культуры гранулярных клеток мозжечка использовали 3-7 дневных крыс линии Wistar Kyoto. Крыс декапитировали, мозжечок измельчали и помещали на 20 минут в 0,05% раствор Трипсина-ЭДТА для разрушения межклеточных взаимодействий. Клетки промывали раствором Хенкса, затем диспергировали в свежей среде NBM (Neirobasal А-Medium) (Gibco, США) до получения однородной суспензии, которую центрифугировали 5 мин при 600g . Осаждённые клетки ресуспендировали в соответствующем объёме NBM , содержащем 2% Supplement В-27 (Gibco, США), 0,5 мМ GlutaMax (Gibco, США), 100 U/мл пенициллин/стрептомицин (Gibco, США) и 20 мМ КС1 (Sigma, США). Культивирование осуществляли в среде NBM в СОг инкубаторе при 37 С, 5% СОг и относительной влажности 98%. На 3-4 сутки культивирования среду меняли, и в добавленную среду добавляли 5 цМ арабинозинмоноцитозида (Sigma, США) для остановки пролиферации глиальных клеток. Эксперименты ставили с клеточной культурой через 7-10 дней.

Для оценки внутриклеточного уровня Са2+ использовали суспензию гранулярных клеток мозжечка крыс, которая подвергалась анализу непосредственно в день изоляции. Для этого 7-10 дневных крыс линии Wistar декапитировали, мозжечок измельчали на холоду и помещали в 2 мг/мл раствор коллагеназы (Wako, Япония), приготовленный на растворе Тироде (148 мМ NaCl, 5 мМ КС1, 2 мМ СаСЬ, 1 мМ MgCl2, 10 мМ глюкозы, 10 мМ HEPES, pH 7,4) для разрушения межнейронных контактов. Инкубацию с коллагеназой проводили в течение 30 мин при 32°С. Затем клеточную суспензию отмывали от коллагеназы в растворе Тироде, клетки суспендировали пастеровской пипеткой и фильтровали через тефлоновый фильтр с размером пор 53 мкм. Содержание клеток в суспензии определяли с помощью камеры Горяева. Перед инкубацией с различными веществами клетки оставляли на 30 мин при 37°С.

Для первичной культуры гранулярных клеток мозжечка за 4 ч перед экспериментом меняли среду на среду Хенкса (Sigma, США), не содержащую сыворотки (т. н. «голодающая среда»). Затем клетки преинкубировали с лигандами, время инкубации и концентрации уабаина и NMDA варьировали в зависимости от задач эксперимента, остальные лиганды преинкубировали с клетками в течение 30 мин. После инкубации реакцию останавливали различными способами, в зависимости от далее используемого метода: для Western blotting и иммунопреципитации - промывание холодным раствором Хенкса без Са2+ и Mg2+ (Sigma, США), затем добавляли лизирующий буфер. Для определения ферментативных активностей реакцию останавливали пятикратным замораживанием - оттаиванием, для определения насосной функции Na/K-АТРазы клетки троекратно промывали холодным раствором Хенкса без Са2+ и Mg2+ (Sigma, США), а затем добавляли холодную 5% трихлоруксусную кислоту (Sigma, США). Для проведения иммуноцитохимических методов клетки промывали раствором Хенкса без Са2+ и Mg2+ (Sigma, США) при комнатной температуре, а затем проводили иммуноцитохимическое окрашивание.

Иммунопоеципитирование

После приготовления лизатов измеряли концентрацию белка по методу Лоури, разводили RIPA буфером до 1 мг/мл, затем к 1 мл лизата добавляли 100 [лл протеин-А-сефарозы (Sigma, США), которую предварительно трижды промывали холодным раствором Хенкса, и инкубировали в течение 3 ч при +4 С. Затем центрифугировали при 8000 g 1 мин, к отобранному супернатанту добавляли антитела на NR1- или NR2B-субъединицы NMDA-рецептора и инкубировали в течение ночи при +4 С. После окончания инкубации добавляли 100 |лл протеин-А-сефарозу и инкубировали при +4 С в течении 4 ч. Затем трехкратно отмывали холодным раствором Хенкса без Са2+ и Mg2+ (Sigma, США) при помощи центрифугирования при 14000 g 30 сек и промывания осадка. К осадку добавляли двукратный объем буфера для образцов, инкубировали в течении 15 мин при 55 С для анализа мембранных белков или в течение 5 мин при 95 С для определения фосфотирозина, после чего центрифугировали и использовали супернатант для анализа образцов методом Western blotting.

Метод Western blotting

Вначале полученные образцы разделяли методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS, описанным Леммли. Затем производили перенос на нитроцеллюлозную или PVDF мембрану в камере BioRad в течение 40 мин при силе тока 200 А. После электропереноса мембрану промывали в растворе TBST (TBS +

0,1% Твин-20), затем блокировали в растворе TBST с сухим молоком или БСА от

специфического связывания, затем после трехкратного отмывания в TBST инкубировали вначале с первичными антителами, разведенными на растворе TBST+блокатор, при +4°С в течение ночи, а затем после трехкратного промывания в TBST - со вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена, также разведенными в растворе TBST+блокатор. Связывание первичных антител детектировали методом усиленной хемилюминесценции (ECL) с помощью набора «Amersham™ ECL Plus Western Blotting Detection Reagents» (GE Healthcare Life Sciences, Германия).

Определение активности Na/K-АТРэзы

В нашей работе активность Na/K-АТРазы мы регистрировали двумя способами: при определении неорганического фосфата, образовавшегося в ходе ферментативной реакции, и при регистрации количества уабаин-зависимого поглощения клетками Rb+. Для определения ферментативной активности Na/K-АТРэзы инкубировали клетки с лигандами, затем останавливали реакцию, однократно промывая клетки холодным бескальциевым и безмагниевым раствором Хенкса, затем разрушали клеточные мембраны пятикратным замораживанием-оттаиванием. Затем после проведения ферментативной реакции для определения неорганического фосфата использовали метод Ратбуна и Бетлах, основанный на использовании хлористого олова в качестве восстановителя. Для определения насосной функции Na/K-АТРэзы клетки инкубировали с лигандами, затем за 10 мин до остановки реакции добавляли 2,5 мМ RbCl и останавливали реакцию, 5 раз промывая в холодном бескальциевом и безмагниевом растворе Хенкса, затем лизировали клетки при помощи 5% трихлоруксусной кислоты. Далее центрифугировали при 10000 g 2 мин и в полученном супернатанте определяли количество ионов Rb+ при помощи атомноабсорбционного спектрометра (Интерфотофизика, Россия). В полученном осадке определяли концентрацию белка, нормируя по белку полученные данные. Иммуноцитохимия

Для приготовления иммуноцитохимических образцов клетки выращивали на стеклах для иммуноцитохимии. После инкубации клеток с лигандами препараты промывали в бескальциевой и безмагниевом растворе Хенкса при комнатной температуре, затем фиксировали в растворе 3,7% формальдегида в течение 20 мин. Затем образцы промывали фосфатно-солевым буфером (PBS), далее в течение 15 мин инкубировали в

0,01% Tritone Х-100 для пермеабмилизации клеток. Затем трехкратно отмывали в PBS и блокировали образцы в 10% БСА в течении 30 мин. После этого добавляли первичные антитела и инкубировали при +4°С в течении ночи. Затем промывали 3 раза теплым PBS и инкубировали в течение 1 ч в темноте с раствором вторичных антител, конъюгированных с флуоресцентной меткой, на PBS. Затем трехкратно отмывали и заключали препараты в

среду мовиол (Sigma, США). Препараты анализировали на конфокальном микроскопе при помощи объектива с увеличением 63х. Данные обрабатывали в Image!

Проточная иитометрия

Данным методом проводили детекцию уровня Са2+ в суспензии гранулярных клеток мозжечка. При анализе данных из общей популяции клеток выделяли клетки, по размерам соответствующие нейронам, таким образом выявляя изменение уровня Са2+ только в нейрональных клетках. Для измерения уровня Са2+ использовали флуоресцентный зонд Fluo-3-AM (пентаацетоксиметиловый эфир [2-амино-5-(2,7-дихлор-6-гидрокси-3-оксо-9-ксантенил)фенокси]-2-(2-амино-5-метилфенокси)этан-К,М,]Ч',>Г-теграуксусной кислоты) (Sigma, США) (Хе.х = 488 нм, Хеш = 530 нм). К исследуемой суспензии клеток добавляли Fluo-3-AM (конечная концентрация 20 рМ) и инкубировали 30 мин в темноте при 37°С. Затем суспензию инкубировали с лигандами в течение заданного времени, после инкубации добавляли PI и через 1 мин проводили анализ флуоресценции методом проточной цитометрии. Отсекая мертвые клетки, анализировали изменение концентрации внутриклеточного Са2+в популяции живых клеток. Статистическая обработка результатов

Статистическую обработку данных проводили с помощью компьютерной программы «GraphPadPrism4». Достоверную значимость отличий в экспериментах Western blot проверяли с помощью одностороннего непараметрического критерия Манна-Уитни и критерия Дунетта. Для статистической обработки результатов, полученных методом проточной цитометрии, использовали критерий Смирнова-Колмогорова (коэффициент D/S(n), который отражает достоверность различий двух гистограмм), а для результатов остальных экспериментов - t-критерий Стьюдента. Достоверность различий соответствовала р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика первичной культуры гранулярных клеток мозжечка крыс

Было показано, что наш объект - первичная культура гранулярных клеток мозжечка крыс - содержит как уабаин-чувствительную аЗ-субъединицу, так и уабаин-резистентную а1-субъединицу Na/K-АТРэзы, а также функционально активный NMDA-рецептор. Последнее обстоятельство было подтверждено наличием NR1- и КК2В-субъедшшц, необходимых для формирования функционального комплекса NMDA-рецептора (см. рис. 1).

Рис. 1. Анализ образцов первичной

культуры гранулярных клеток мозжечка крыс. Показано наличие в исследуемых образцах al- и аЗ-субъединиц Na/K-АТРазы, а также NR1- и NR2B-

субъединиц NMDA-рецептора.

Анализ структурного взаимодействия Na/K-АТРазы и NMDA-рецептора

Na/K-АТРаза зачастую образует белок-белковые взаимодействия с другими

мембранными и цитоплазматическими белками, влияя на их свойства. В литературе было показано, что при взаимодействии с соединениями класса кардиотонических стероидов Na/K-АТРаза способна активировать Src-киназу, которая непосредственно связана с а-субъединицей Na/K-АТРазы и путем структурных перегруппировок способна

автофосфорилироваться и становиться активной (Tian et al, 2006). Судя по обилию литературных данных, такие реакции представляют собой общий принцип регуляции других белков при помощи ингибирования Na/K-АТРэзы в нейрональной клетке.

В литературе также было показано, что связывание Na/K-АТРэзы с уабаином таким же образом может влиять на функциональные свойства участников глутаматного обмена в нейрональной ткани, например, на ионотропные глутаматные АМРА-рецепторы в нейронах (Zhang et al, 2009) и на глутаматные переносчики GLT-1 и GLAST в глиальных клетках (Rose et al, 2009).

Нашей задачей было проанализировать возможное структурное взаимодействие между интересующими нас белками методом ко-иммунопреципитации. Для этого мы провели серию экспериментов, в которых инкубировали клетки первичной культуры гранулярных клеток мозжечка с 1 цМ уабаина, затем лизировали клетки и проводили иммунопреципитацию с антителами на NR1- или КН2В-субъединицы. Затем в пробах анализировали наличие al- и аЗ-субъединиц методом Western blotting. Указанная концентрация уабаина была выбрана как минимальная концентрация, которая способна связываться как с высокочувствительной аЗ-субъединицей, так и с низкочувствительной al-субъединицей. Для положительного контроля методом Western blotting использовали NR1- и К112В-субъединицы, в качестве отрицательного контроля использовали лизат, проинкубированный только с протеин-А-сефарозой (рис. 2).

а1

a3 NR1 NR2B

WB: al-субъединица

WB: NRl-субъединица

кДа 110 —

ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЙ ЮН УАБ КОН УАБ КОНТРОЛЬ

кДа

120

КОН УАБ КОН УАБ

IP:NR1 IP-.NR2B А

WB: аЗ-субъединица

IP:NR1 IP:NR2B В

WB: МИгВ-субъединица

кДа

ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЙ КОН УАБ КОН УАБ КОНТРОЛЬ

кДа

180

КОН УАБ КОН УАБ

110

IP:NR1 IP:NR2B Б

IР: N R1 IP;NR2B Г

Рис. 2. Детекция al- (А) и аЗ-субъединиц (Б) Na/K-АТРазы методом Western blotting (WB) после проведения иммуннопредипитации (IP) с NR1- или 1\!112В-субъединицами NMDA-рецептора. В качестве положительного контроля мы детектировали NR1- (В) и NR2B-субъединицы (Г) NMDA-рецептора. «кон» - контроль, «уаб» - уабаин.

Из представленных данных видно, что обе изоформы а-субъединицы способны ко-иммунопреципитировать с 1ЧМОА-рецептором. Интересный факт заключается в том, что в наших условиях было показано возможное участие в процессах внутриклеточной сигнализации в нейронах как уабаин-чувствительной аЗ-субъединицы, так и уабаин-резистентной а 1-субъединицы. Это может служить основанием для предположения о том, что обе субъединицы способны участвовать в механизмах регуляции глутаматного обмена, хотя и различными способами. Действие специфического ингибитора Ыа/К-АТРазы - уабаина не выявило изменений в количестве молекул И]УГОА-рецептора, иммунопреципитирующих вместе с а-субъединицами Иа/К-АТРазы. Это обстоятельство свидетельствует, что белок связывается с интересующим нас рецептором вне зависимости от своего конформационного состояния (Е1 или Е2).

Однако использование данного метода не является доказательством

непосредственного взаимодействия между двумя белками, так как проведение иммунопреципитации способно «вытаскивать» целый пул других белковых молекул, особенно когда они находятся в солюбилизированном состоянии. Поэтому для анализа возможной ко-локализации между а-субъединицами Ка/К-АТРазы и ЫМОА-рецептором была произведена серия экспериментов, в которой мы инкубировали препараты с уабаином, затем проводили фиксацию клеток и последующее иммуноцитохимическое окрашивание на NR1-субъединицы ЫМПА-рецепторов (А1еха Р1иог 488) и а-субъединицы Ка/К-АТРазы (А1еха Р1иог 546). Анализ препаратов производили на конфокальном микроскопе.

На полученных после иммуноцитохимического окрашивания картинах видно, что как а 1-субъединица Na/K-АТРазы и NRl-субъединица NMDA-рецептора, так и аЗ-субъединица Na/K-АТРазы и NRl-субъединица NMDA-рецептора локализованы в одних и тех же частях тела клетки и аксональных отростков. Суммируя данные, полученные двумя различными методическими подходами, мы можем сделать вывод о том, что Na/K-АТРаза и NMDA-рецепторы ко-локализованы в нейрональных клетках и способны формировать комплексы, исследование функциональных свойств которых стало нашей следующей задачей.

Влияние уабаина на активацию сигнальных каскадов при кратковременной инкубации

На кардиомиоцитах и на фибробластах было показано, что действие уабаина способно приводить к активации митоген-активируемой киназы ERK 'A (Kometiani et al., 1998), а также протеинкиназы В (Akt) (Zhou et al., 2001). Активация ERK /г и Akt происходит по независимым сигнальным путям - если активация ERK Уг происходит при помощи активации Src-киназы, с последующей активацией рецептора эпидермального ростового фактора (EGFR), то Akt активируется по Src-независимому пути при помощи белок-белковых взаимодействий а-субъединицы Na/K-АТРазы с фосфоинозитол-3-киназой, которые и являются механизмом запуска сигнального каскада, приводящего к активации в том числе и Akt.

Фосфорилирование Akt и ERK1/2

кДа 50— I

44— 42— '

тубулин

pAkt

pERK 1/2

250-

200

150-

100

О-

I шш

ш ■

□ контроль О Б мин 10 мин 15 мин 20 мин

контр 5мин Юмин 15мин 20мин

1цМ уабаин

Рис. 3. Фосфорилирование АЙ и Е11К /г под действием 1 цМ уабаина в первичной культуре гранулярных клеток мозжечка. А - пример типичного эксперимента, Б -количественные данные. По оси ординат - процент выявляемых белков. * - соответствует достоверному различию от контроля с р<0,05.

Ранее в нашей лаборатории было показано, что а1- и аЗ-субъединицы Иа/К-АТРазы по-разному вовлечены в клеточный сигналинг в клетках нейробластомы 8К-№-Ав: связывание аЗ-субъединицы с уабаином через 180 мин инкубации приводило к

фосфорилированию ЕМС 'А, а аналогичное действие на а1-субъединицу Ыа/К-АТРазы за то же время не приводило к фосфорилированию ЕМС 'А. Первой нашей задачей стало исследовать, протекают ли схожие процессы на нашей модели первичной культуры нейрональных клеток мозжечка. Для этого была построена временная зависимость уровня фосфорилирования ЕМС А и АИ при действии 1 рМ уабаина (см. рис. 3).

Из полученных данных видно, что уровень фосфорилирования для ЕЛК 'А увеличивается и достигает своего максимума через 10 мин инкубации, затем до 20 мин инкубации уровень фосфорилироваиной формы не изменяется. Для А1а показано, что максимум активации наблюдается к 15 мин, затем происходит уменьшение сигнала. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что действие малых концентраций уабаина на клетки приводит к активации клеточных сигнальных каскадов, приводящих к активации протеинкиназы В (АкО и стресс-активируемой МАР-киназы ЕМС 'А, что позволяет говорить о сходстве внутриклеточных процессов с клетками других тканей (кардиомиоциты, фибробласты). Для проведения дальнейших экспериментов было выбрано время 10 минут, так как, исходя из полученных результатов, на 10 мин приходится максимум фосфорилирования ЕМС 'А киназы и при этом наблюдается статистически достоверное изменение фосфорилирования АИ.

Для установления того, какие изоформы фермента способны играть роль в данных процессах, мы провели измерение концентрационной зависимости активации АИ и ЕЮС 'А (см. рис. 4). Из полученных данных видно, что ЕКК 'А киназа активируется при действии на первичную культуру уабаином в наномолярных концентрациях, максимум достигается при концентрации 10 нМ, а затем идет снижение уровня фосфорилирования, и при концентрации 10 цМ фосфорилирования вообще не наблюдается. Это позволяет предположить, что активация ЕМС 'А киназы происходит при взаимодействии с уабаином уабаин-чувствительной аЗ-субъединицы, а при связывании уабаина с обеими субъединицами фосфорилирование снижается, достигая при 10 дМ контрольного значения.

Изменения уровня фосфорилирования АЙ при низких концентрациях уабаина (1-10 нМ) не выявлено, однако начиная с концентрации 100 нМ происходит нарастание уровня фосфорилирования АН, которое достигает максимума при 1 цМ, что позволяет утверждать: активация А& может быть обусловлена связыванием уабаина с уабаин-резистентной а1-субъединицей.

А Б юмин

Рис. 4. Фосфорилирование А1й и ЕМС 'А под действием различных концентраций уабаина в первичной культуре гранулярных клеток мозжечка. А - пример типичного эксперимента, Б - количественные данные. По оси ординат - процент выявляемых белков. * - соответствует достоверному различию от контроля с р<0,05, ** -ср<0,01.

Исходя из полученных результатов, мы считаем, что в нейронах эти процессы скорее всего также являются независимыми друг от друга и за них «ответственны» различные а-субъединицы 1Ча/К-АТРазы: если за активацию сигнального каскада, приводящего к активации БИС 'Л, ответственна аЗ-субъединица, то к активации сигнального каскада, вызывающего активацию АЙ, приводит взаимодействие уабаина с а1-субъединицей 1Ча/К-АТРазы.

В нашей лаборатории ранее было показано, что преинкубация нейрональных клеток с 0-АР5 (являющегося специфическим антагонистом ММБА-рецепторов) снижает активацию ЕМС 14 при долговременной инкубации клеток (180 мин) с различными концентрациями уабаина. Нашей задачей стало оценить, участвуют ли К1уГОА-рецепторы в передаче сигнала с Ка/К-АТРазы на Ак1 и ЕМС /г. Для этого мы инкубировали наши клетки с 1 |дМ уабаином в течение 10 мин, так как в этих условиях мы ранее наблюдали статистически достоверную активацию этих киназ (см. рис. 5).

Фосфорилирование Ак1 и ЕИК1/2 под 0/ действием 1цМ уабаина

кДа 50—‘ 6044-

42'

контроль уабаин уабаин 0-АР5 0-АР5

250

200

тубулин 150

рА№ 100

рЕРК 1/2 50

■1 контроль Ш1 уабаин ЕЗ уабаин + Р-АР5 □ О-АРБ

Рис. 5. Фосфорилирование АИ и ЕМС /г под действием 1 цМ уабаина в присутствии/отсутствии ЮцМ Б-АР5 в первичной культуре гранулярных клеток мозжечка. А - пример типичного эксперимента, Б - количественные данные. По оси ординат - процент выявляемых белков. * - соответствует достоверному различию от контроля с р<0,05.

Оказалось, что действие 0-АР5 не снимает активацию АЙ и ЕМС /г уабаином, причем сам 0-АР5 способен активировать Ак1 Таким образом, можно сделать вывод, что взаимодействие используемого КТС с уабаин-чувствительной аЗ-субъединицей приводит к активации ЕМС /2, а с уабаин-резистентной а1-субъединицей - к активации Акт киназы. Блокирование NMDA-peцeптopoв не влияет на процессы запуска сигнальных каскадов, приводящих к активации ЕМС /г и АЙ.

Влияние уабаина на активность КМРА-рецепторов

В литературе существуют данные о том, что действие кардиотонических стероидов приводит к глутаматной экзайтотоксичности и что данный процесс происходит при участии ИМВА-рецепторов, так как действие специфических антагонистов 1ЧМОА-рецепторов предохраняет клетки от нее (81е1та81юок е1 а1., 1999). Однако механизм данного процесса оставался непонятен.

Вначале мы убедились в том, что действие уабаина вызывало увеличение внутриклеточной концентрации ионов Са2+ при помощи использования метода проточной цитометрии, причем было показано, что 10 нМ уабаина не вызывает существенного увеличения ионов Са24 (после 20 мин инкубации), однако 1 цМ уабаина в этих условиях вызывает 50% увеличение уровня ионов Са2+ внутри клетки (рис. 6).

Изменение уровня внутриклеточного Са2+

Рис. 6. Изменение уровня внутриклеточного Са2+ под действием различных концентраций уабаина в первичной культуре гранулярных клеток мозжечка. * -соответствует достоверному

различию от контроля с р<0,05.

Из литературы известно, что одним из наиболее встречаемых механизмов регуляции активности NMDA-рецептора является тирозиновое фосфорилирование NR2-субъединицы. Было показано, что ключевую роль в данном процессе выполняет тирозиновая Src-киназа (Salter, Calia, 2004). Как было сказано ранее, для кардиомиоцитов и фибробластов установлено, что уабаин вызывает активацию Src-киназы за счет непосредственных белок-белковых взаимодействий. Мы предположили, что Src-киназа

может являться тем посредником между Na/K-АТРазой и NMDA-рецептором, о котором говорилось выше.

В наших экспериментах мы проанализировали действие двух концентраций уабаина: 10 нМ и 1 цМ (почему были выбраны именно эти концентрации - сказано выше) на активацию Src-киназы (см. рис. 7) и на тирозиновое фосфорилирование NR2B-субъединицы (см. рис. 8). Мы не выявили статистически достоверной активации Src-киназы (небольшое увеличение уровня фосфорилирования Src-киназы являлось недостоверным), однако действие 1 цМ уабаина приводило к увеличению степени тирозинового фосфорилирования МЫ2В-субъединицы и к увеличению входа Ca2t через NMDA-рецептор.

Действие 10 нМ уабаина такого эффекта не вызывало, что позволило нам предположить, что к усилению канальной функции NMDA-рецептора приводит связывание уабаин-резистентной а 1-субъединицы Na/K-АТРазы с уабаином. Мы предложили два возможных объяснения этому феномену. Либо Src-киназа активируется локально, что не вносит существенного вклада в суммарный уровень ее фосфорилирования во всей клеточной культуре, но локально фосфорилирует NR2B-субъединицу NMDA-рецептора, либо в данном процессе участвует другая, не выявленная еще тирозиновая киназа.

Фосфорилирование Src-киназы под действием уабаина

кДа

5° — | 64 — І

jтубулин Src

кон 10нМ 1 JLiM

■I контроль ЕЭ 10 нМ О 1цМ

Рис. 7. Фосфорилирование Эгс-киназы под действием различных концентраций уабаина в первичной культуре гранулярных клеток мозжечка. А - пример типичного эксперимента, Б - количественные данные. По оси ординат - процент выявляемых белков.

кДа

250

148

IP: NR2B

Контроль 10 нМ

1 (jM

Рис. 8. Тирозиновое фосфорилирование НЯ2В-субъединицы под действием различных концентраций уабаина в первичной культуре гранулярных клеток мозжечка.

Эффект долговременной инкубации нейронов с уабаином

Одним из наиболее важных механизмов долговременной регуляции активности ЫМИА-рецепторов является способность клетки изменять количество NMDA-peцenтopoв на клеточной поверхности. Ранее в литературе было показано, что введение эндобаина Е в кровь мышей приводило к увеличению экспрессии NMDA-peцeптopoв в кортексе через 2 дня (Вегаег е1 а1., 2008). Мы решили проанализировать, будет ли влиять на этот процесс инкубация первичной культуры гранулярных клеток мозжечка крыс с 1 цМ уабаином. Для этого мы инкубировали клетки с уабаином в диапазонах от 0,5 до 6 часов (см. рис. 9) и от

6 до 24 ч (см. рис. 10), затем клетки лизировали и анализировали наличие N111- и N11213-субъединиц ЫМБА-рецепторов, а также количество а1- и аЗ-субъединиц Ыа/К-АТРазы. В качестве положительного контроля мы использовали тубулин.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что долговременная регуляция с уабаином (1 ч и дольше) вызывает уменьшение количества ММОА-рецепторов в 2 раза, причем изменение КЯ2В-субъединицы происходит быстрее, нежели N111-субъединицы NMDA-peцeптopa. Мы связываем эти данные прежде всего с тем, что в нейрональной клетке представлено несколько изоформ NR2-cyбъeдиницы и их изменения зависят друг от друга, однако во всех случаях N111 -субъединица является необходимой для формирования функционального комплекса, поэтому можно с уверенностью сказать, что уабаин вызывает уменьшение количества NMDA-peцeптopoв.

кДа

Количество белка,

120

180

110

NR1

NR2B

а1

аЗ

тубулин

Рис. 9. Анализ методом Western blotting временной зависимости (6-24 ч) количества NMDA-рецепторов и Ыа/К-АТРазы при инкубации клеток с 1цМ уабаином. А - пример типичного эксперимента, Количественные данные: Б - NR1- и НК2В-субъединицы NMDA-рецептора, В - al- и аЗ-субъединицы Na/K-АТРазы. * - соответствует достоверному

различию от контроля с р<0,05, ** - с р<0,01.

ша б ч О 12ч О 24 ч

К>

120-

180-

110

50-

т. т ш. м» — NR1

■ШвМЬЯР NR2B

тубупин

контр 0,5 ч 1ч

Рис. 10. Анализ методом Western blotting временной зависимости (0 - 6 ч) количества NMDA-рецепторов и Na/K-АТРазы при инкубации клеток с 1 цМ уабаином. А -пример типичного эксперимента,

Количественные данные: Б - NR1- и NR2B-субъединицы NMDA-рецептора, В - al- и аЗ-субъединицы Na/K-АТРазы. * - соответствует достоверному различию от контроля с р<0,05, ** - с р<0,01.

Чтобы выявить вовлеченность в данный процесс различных изоформ Na/K-АТРазы, мы построили концентрационную зависимость падения количества NMDA-рецепторов от концентрации уабаина (в диапазоне от 1 нМ до 10 рМ) через 6 ч инкубации. Одновременно было проанализировано изменение количества белка а-субъединиц Na/K-АТРазы. В качестве положительного контроля мы измеряли количество тубулина в образцах (см. рис. 11).

кДа

120

180

110

110-

HKNR1 '§jjf NR2B

РР а1

ит аЗ

Цтубулин

1нМ ЮнМ ЮОнМ 1fiM 10fiM

Количество белка, 9

13й

■ контроль □ 1 нм

ГШ 10 нМ Ш 100 нМ

■ 1рМ Q 10^М

Рис. 11. Анализ методом Western blotting концентрационной зависимости количества NMDA-рецепторов и Na/K-АТРазы при инкубации клеток уабаином в течение 6 ч. А -пример типичного эксперимента,

Количество белка. У,

JU .Ц

■1 контроль

СП 1 нМ

m 10 нМ

ГГ1 100 нМ

т 1цМ

а 10^М

Полученные результаты свидетельствуют о том, что количество NR1 -субъединицы изменяется уже при инкубации клеток с уабаином в концентрации 1 нМ и дальнейший прирост его концентрации уже не выявляет существенных изменений.

Изменения количества №12В-субъединицы в диапазоне концентраций 1-100 нМ носят дозо-зависимый характер, достигая минимального уровня 54%, в дальнейшем прирост концентрации уабаина не влияет на изменение количества NR2B-cy6beflHi»mbi. Таким образом, можно сделать вывод, что связывание уабаина с уабаин-чувствительной аЗ-субъединицей Na/K-АТРэзы (в диапазоне 1 нМ - 1 цМ уабаина) приводит к уменьшению количества NMDA-рецепторов, а связывание уабаина с уабаин-резистентной а1-субъединицей (в диапазоне 1 цМ - 100 цМ уабаина) не влияет на данный процесс.

Что же происходит с NMDA-рецепторами? Для ответа на этот вопрос мы провели иммуноцитохимическое исследование, проанализировав распределение NMDA-рецепторов в контрольных образцах и в клетках, проинкубированных с 1 цМ уабаина в течение 90 мин. Из полученных фотографий видно, что NR1-субъединица, обнаруживающаяся в контрольных образцах как в теле нейрона, так и в аксональных отростках, после инкубации клеток с 1 цМ уабаином перемещается в тело клетки. Таким образом, можно сделать вывод, что при взаимодействии уабаина с аЗ-субъединицей Na/K-АТРазы происходит интернализация субъединиц NMDA-рецепторов в тело клетки, а впоследствии и деградация (что отражает уменьшение общего количества белка, полученное нами при помощи Western blotting).

Влияние NMDA-рецептора на активность ГУа/'К-АТРазы

Охарактеризовав влияние ингибирования Na/K-АТРазы на функциональные свойства NMDA-рецепторов, мы решили оценить значение активации NMDA-рецепторов для активности Na/K-АТРазы. Вначале мы построили концентрационную зависимость активности Na/K-АТРазы от концентрации NMDA (в диапазоне от 5 до 750 цМ NMDA). Время инкубации было ранее подобрано в нашей лаборатории, оно составило 30 мин. Данная зависимость была проанализирована двумя различными путями: оценкой насосной функции Na/K-АТРазы, а также прямым измерением ферментативной функции (см. рис. 12).

Оказалось, что активация NMDA-рецепторов при помощи NMDA в концентрациях свыше 0,1 мМ приводит к дозо-зависимому снижению активности Na/K-АТРазы. Таким образом, было выявлено наличие классического механизма обратной регуляции - при больших токсических концентрациях лиганда происходит ингибирование Na/K-АТРазы.

Рис. 12. Зависимость активности Ка/К-АТРазы от концентрации ИМОА. Данная зависимость исследована двумя методами -определением прижизненной

активности Иа-насоса и определением ферментативной активности Иа/К-АТРазы. * -

соответствует достоверному

различию от контроля с р<0,05.

РЧМБА], мкМ

Следующей нашей задачей стало установить возможный механизм ингибирования Иа/К-АТРазы. Для этого мы преинкубировали клетки с 0-АР5 (специфический блокатор 1ЯМВА-рецепторов), ВАРТА (хелатор ионов Са2+) и хелеритрин (ингибитор протеинкиназы С), так как из литературы известно, что активация М1УГОА-рецепторов приводит к входу в клетку ионов Са2+ и последующей активации различных Са-зависимых протеинкиназ, среди которых есть протеинкиназа С, способная фосфорилировать Ыа/К-АТРазу и приводить к снижению ее активности. Затем мы инкубировали клетки с ИМОА, затем пятикратно замораживали-оттаивали, затем проводили ферментативную реакцию и определяли нарастание в пробах неорганического фосфата (см. рис. 13).

Активность, %

й-й-і-Ій** ..

> II

■ Активность Иа-нясоса в Активность ^/К-АТРазы

О 25 5 10 100 250 500 750

Активность ^а/К-АТРазы, %

•контроль -ВАРТА а Хелеритрин

Рис. 13. Зависимость активности 1Ча/К-АТРазы от инкубации с КМОА (500 цМ) в присутствии/отсутствии ВАРТА (10 цМ) или хелеритрина (ЮцМ). * - соответствует

достоверному различию от контроля с р<0,05.

Оказалось, действие ИМБА снимается преинкубацией клеток с ВАРТА или хелеритрином. Таким образом, мы заключили, что ингибирование Ма/К-АТРазы,

Рис. 14. Предполагаемый механизм ингибирования активности »лч>*ч»»-1Ча/К-АТРазы при инкубации клеток с 0,5 мМ NMDA

РкС

' I

!Ча/К-АТРазя I

осуществляемое активацией ЯМБА-рецептора, происходит за счет увеличения внутриклеточной концентрации ионов Са2+, которые в свою очередь активируют протеинкиназу С, способную фосфорилировать Ка/К-АТРазу и снижать ее активность (см. рис. 14). Аналогичные примеры были известны из литературы (Лопина, 2001). Таким образом, данный процесс реализуется не за счет «белок-белковых» взаимодействий между Na/K-ATPaзoй и NMDA-peцeптopoм, а является сложным результатом регуляции через ряд посредников.

Активность Ыа/К-АТРазы (% от контроля)

120

100 80 80

аЗ = 3§8/„

20 -

-20 -

уабаин, -1д{М)

Рис. 15. Кривые ингибирования Na/K-ATPaзы, полученные при инкубации клеток без лигандов, с ЫМБА (0,5 мМ) и с КМЭА + 0-АР5 (10 рМ)

Нашей следующей задачей стало выяснение того, какая изоформа фермента ингибируется при действии NMDA. Для этого нами были проведены эксперименты, позволяющие построить кривую ингибирования Ыа/К-АТРазы уабаином, полученную

при помощи «ферментативного» подхода после пятикратного замораживания-оттаивания клеток, и оценить влияние на ход кривой преинкубации клеток с NMDA или с NMDA+D-АР5, проведенной до стадии разрушения клеток (см. рис. 15).

Из литературы известно, что уабаин-чувствительная аЗ-субъединица Na/K-АТРэзы ингибируется при действии на нее уабаина в диапазоне концентраций от 1 нМ до 1 цМ. Из рис. 17 видно, что действие NMDA (как индивидуальное, так и совместно с D-AP5) не приводит к существенному изменению активности аЗ-субъединицы, - в обоих случаях она составляет 30-35% от общей активности Na/K-АТРазы в контрольных образцах. Уабаин-резистентная а 1-изоформа ингибируется в диапазоне концентраций от 1 цМ до 1 мМ. Из полученного графика видно, что в контроле активность этой субъединицы составляла 70% от активности Na/K-АТРазы в контроле, при инкубации клеток с NMDA она снижается до 25% от общей активности фермента в контроле (снизив, таким образом, свою активность на 45% по сравнению с активностью а 1-субъединицы в контроле). При этом D-AP5 предотвращает действие NMDA, и активность а 1-субъединицы составляет до 70% от общей активности Na/K-АТРазы (то есть величину, примерно равную той, что имелась в контроле).

Таким образом, нами был сделан вывод, что инкубация клеток с NMDA приводит к ингибированию а 1-субъединицы и этот процесс опосредован входом ионов Са2+ при открытии ионного канала NMDA-рецептора и активации протеинкиназы С, способной фосфорилировать а 1-субъединицу Na/K-АТРазы и приводить к снижению ее активности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

До 50% АТР всей клетки тратит для своей работы Na/K-АТРаза в нервной ткани. Одной из функций, выполняемой Ка/К-АТРазой в гранулярных клетках мозжечка крысы, является регуляция работы NMDA-рецепторов. Действие кардиотонических стероидов, которые были найдены в мозге, способно влиять на функциональные свойства NMDA-рецептора через две изоформы а-субъединицы Na/K-АТРазы. Если взаимодействие уабаина с уабаин-чувствительной аЗ-субъединицей приводит к долговременной регуляции NMDA-рецептора и вызывает уменьшение молекул NMDA-рецептора в нейрональных клетках, то связывание уабаина с уабаин-резистентной а 1-субъединицей приводит к кратковременной регуляции NMDA-рецептора и приводит к тирозиновому фосфорилированию МИ-субъединицы и усилению функции NMDA-рецептора. В свою очередь, активация NMDA-рецепторов приводит к ингибированию а 1-субъединицы Na/K-АТРазы. Общая схема полученных результатов представлена на рис. 16.

В последние годы в различных лабораториях независимо было показано, что Na/K-АТРаза играет ключевую роль в поддержании внутриклеточных сигнальных процессов в нейрональных клетках. Так, мутации в аЗ-субъединице приводили к развитию эпилепсии у мышей. Недавние исследования выявили, что агрин (белок, синтезирующийся исключительно в ЦНС) способен специфически связываться с аЗ-субъединицей, вызывая при этом те же эффекты, что и уабаин (Hilgenberg et ah, 2006).

Чаще всего в литературе обсуждается вопрос о том, что взаимодействие уабаина с Na/K-АТРазой может включать различные сигнальные пути в нервной клетке. При этом упор в обсуждении делается на то, какие факторы являются специфическими или неспецифическими сигнальными молекулами для этого фермента (КТС, белки-партнеры или, возможно, неблагоприятные условия, например, недостаток АТР). Реже обращаетсявнимание на вероятность обратных взаимоотношений - невозможность развития сигнальных механизмов в нейроне в условиях активной Na/K-АТРазы. Этот аспект открывает совершенно новую страницу в изучении функции данного фермента и еще требует своего осмысления.

Так или иначе, результаты, полученные в нашей работе, представляются существенными для теоретической нейрохимии, так как они свидетельствуют о том, что организм способен через Na/K-АТРазу регулировать работу NMDA-рецепторов, играющих ключевую роль в синаптической пластичности и молекулярной памяти.

Рис. 16. Общая схема полученных результатов. Темными стрелками обозначено действие уабаина, светлыми - действие КМОА.

выводы

1. Методами ко-иммунопреципитации и иммуноцитохимии показано структурное взаимодействие между а1 - и аЗ-субъединицами Na/K-АТРэзы и NMDA-рецептором.

2. Показано, что связывание уабаина с аЗ-субъединицей Na/K-АТРазы приводит к активации ERK '/г, а связывание уабаина с а 1-субъединицей Na/K-АТРазы приводит к активации Akt. NMDA-рецепторы не принимают участие в данных процессах,

3. Показано, что инкубация клеток с 1 цМ уабаина приводит к фосфорилированию МК2В-субъединицы NMDA-рецептора и усилению функции NMDA-рецептора, обеспечивающему увеличение входа Са2+ в нейрональную клетку.

4. Долговременная инкубация (более 1 ч) гранулярных клеток мозжечка с низкими концентрациями уабаина ведет к деградации NMDA-рецепторов, что отражает участие аЗ-субъединицы Na/K-АТРазы в регуляции стабильности NMDA-рецепторов.

5. Показано, что активация NMDA-рецепторов в гранулярных клетках ведет к ингибированию а 1-субъединицы Na/K-АТРэзы через увеличение внутриклеточной концентрации ионов Са2+ и активацию протеинкиназы С.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах

1. Аккуратов Е.Е.. Карпова Л.В., Болдырев А.А. (2008). Значение конформационного состояния Na/K-АТФазы для ее устойчивости к окислению. Нейрохимт 25(1-2), 146-149.

2. Карпова Л.В., Аккуратов Е.Е.. Булыгина Е.Р., Болдырев А.А. (2008). Уабаин-чувствительная и уабаин-резистентная изоформы №,К-АТРазы гранулярных клеток мозжечка регулирует активность MAP-киназы. Биол. мембраны 25(2): 131-136.

3. Карпова Л.В., Аккуратов Е.Е.. Бродская О.М., Болдырев А.А. (2010). Na-нэсос и внутриклеточные сигнальные механизмы. Биофизика 55 (6), 1022-1029.

Тезисы докладов

1. Boldyrev A.A., Bulygina E.R., Karpova L.V., Akkuratov Е.Е. (2007). Involvement of different conformers of the neuronal Na,K-pump in cell signaling. 7th Int. Conf. on AAA proteins. England. Poster 10.

2. Аккуратов E.E. (2008). Исследование функционального взаимодействия между NMDA-рецепторами и Na/K-АТРэзой в нейронах мозжечка. Тезисы докладов

Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008», Москва, с. 28.

3. Akkuratov Е.Е.. Karpova L.V., Boldyrev А.А. (2008). К- and Na- conformers of Na/KATPase demonstrate different stability toward oxidation. Abstract of the 12th International ATPase Conference “Na/K-ATPase and Related Transport ATPases of P-type: Structures, Mechanisms, and Roles in Health and Disease”, August 2008, Aarhus, Denmark, p. 123.

4. Akkuratov E.E.. Karpova L.V., Boldyrev A.A. (2009). Rat brain Na,K-ATPase is a sensor of oxidative stress. 2nd Int. Workshop on expression, structure and function of membrane proteins, September 20-24,2009, Florence, Italy, p. 93.

5. Akkuratov E.. Karpova L., Liu L., Boldyrev A. (2011). Functional interaction between Na/KATPase and NMDA-receptor. Abstract of the 13th International ATPase Conference “Na/KATPase and Related Transport ATPases of P-type: Structures, Biology and Medicine”, September 2011, Pacific Grove, USA, p. 157.

6. Wu J., Akkuratov E.. Gable М., Miller C., Liu L. (2011). Ouabain-induced Src-indendent PI3K/Akt pathway in mouse embryonic fibroblast cells. Abstract of the 13th International ATPase Conference “Na/K-ATPase and Related Transport ATPases of P-type: Structures, Biology and Medicine”, September 2011, Pacific Grove, USA, p. 156.

7. Boldyrev A., Brodskaya O., Akkuratov E.. Karpova L. (2011). Na/K-pump and cell signaling. Abstract of the 13th International ATPase Conference “Na/K-ATPase and Related Transport ATPases of P-type: Structures, Biology and Medicine”, September 2011, Pacific Grove, USA, p. 47.

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Bersier MG et al., (2008). Neurochem. Res., 33(1): 66-72.

2. Clapcote SJ et al., (2009). Proc. Natl. AcadSci USA, 106(33): 14085-14090.

3. Hilgenberg LG et al., (2006). Cell, 125(2): 359-369.

4. Kometiani, P. et al., (1998). J. Biol. Chem., 273: 15249-15256.

5. Rose EM et al., (2009). J. Neurosci., 29(25): 8143-8155.

6. Salter MW, Kalia LV. (2004). Nat. Rev. Neurosci., 5(4): 317-328.

7. Stelmashook E.V. et al., (1999). FEBS Letters, 456: 41-44.

8. Tian J et al., (2006) Mol. Biol. Cell., 17(1): 317-326.

9. Xie, Z. et al., (1999). J.Biol.Chem., 274: 19323-19328.

10. Zhang D et al., (2009). J Neurosci., 29(14): 4498-4511.

11. Zhou, X. et al., (2001). Biochem. Biophys. Res. Commun., 285: 46-51.

12. Булыгина E.P. и соавт., (2002). Биохимия, 67, 1209-1214.

13. ЛопинаО.Д. (2001).Биохимия, 66 (10): 1122-1131

Заказ № 328-1 /02/2012 Подписано в печать 02.02.2012 Тираж 100 экз. Уел. п.л. 1

ООО “Цифровичок”, тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таП:zak@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Аккуратов, Евгений Евгеньевич, Москва

61 12-3/570

Московский Государственный Университет имени М.В.Ломоносова

Биологический факультет Кафедра биохимии

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Александр Александрович БОЛДЫРЕВ

На 1 жописи

АККУРАТОВ ЕВГЕНИЙ ЕВГЕНЬЕВИЧ

Характеристика взаимодействия ^/К-АТРазы и NMDA-peцeптopa в гранулярных клетках мозжечка

03.01.04 — «биохимия»

Москва - 2012

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ...........................................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ....................................................................................................................................5

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................................................................8

1.1. Общая характеристика Na/K-АТРазы..............................................................................8

1.2. Каталитический цикл Na/K-АТРазы...............................................................................12

1.3. Соединения класса кардиотонических стероидов........................................................14

1.4. Участие Na/K-АТРазы в клеточной сигнализации.......................................................17

1.5. NMDA-рецептор: общая характеристика.......................................................................25

1.6. Участие NMDA-рецептора в клеточной сигнализации................................................28

1.7.Предпосылки взаимодействия Na/K-АТРазы и NMDA-рецептора..............................32

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.................................................................33

2.1. Получение первичной культуры гранулярных клеток мозжечка крыс.......................33

2.2. Получение суспензии гранулярных клеток мозжечка крыс.........................................34

2.3. Инкубация первичной культуры и суспензии гранулярных клеток с лигандами......34

2.4. Иммунопреципитирование..............................................................................................35

2.5. Метод Western blotting.....................................................................................................36

2.6. Определение концентрации белка..................................................................................39

2.7. Определение активности Na/K-АТРазы по высвобождению неорганического фосфата.....................................................................................................................................40

2.8. Определение активности Na/K-АТРазы по измерению поглощенного иона Rb+.....40

2.9. Иммуноцитохимические методы....................................................................................41

2.10. Метод проточной цитометрии......................................................................................42

2.11. Статистическая обработка результатов........................................................................45

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.......................................................................................46

3.1. Характеристика первичной культуры гранулярных клеток мозжечка крыс..............46

3.2. Анализ структурного взаимодействия Na/K-АТРазы и NMDA-рецептора................48

3.3. Влияние уабаина на активацию сигнальных каскадов при кратковременной инкубации.................................................................................................................................51

3.4. Влияние уабаина на активность NMDA-рецепторов....................................................55

3.5. Эффект долговременной инкубации нейронов с уабаином.........................................57

3.6. Влияние ЫМБА-рецептора на активность Ыа/К-АТРазы............................................63

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ...........................................................................................68

ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................................................................................................................73

ВЫВОДЫ.....................................................................................................................................75

БЛАГОДАРНОСТИ....................................................................................................................76

ЦИТИРУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА................................................................................................77

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АФК — активные формы кислорода БСА — бычий сывороточный альбумин КТС — кардиотонические стероиды ПААГ - полиакриламидный гель Akt - протеинкиназа В

AMP А - 2-амино-3-(5-метил-3-оксо-1,2-оксазол-4-ил)пропановая кислота

ВАРТА - 1,2-ди(2-аминофенокси)этан-М,К,Ы,Ы-тетраацетат

ECL — усиленная хемилюминесценция

EGFR - рецептор эпидерального фактора роста

Fluo-3-AM - пентаацетоксиметиловый эфир [2-амино-5-(2,7-дихлор-6-гидрокси-3-оксо-9-

ксантенил)фенокси]-2-(2-амино-5-метилфенокси)этан-Ы,Н,М',К'-тетрауксусная кислота

FSC — прямое светорассеивание

МАРК - митоген-активируемые протеинкиназы

NAC - N-ацетилцистеин

NMDA - N-метил-О-аспартат

PBS - фосфатный буфер

PI - йодистый пропидий

PI3K - фосфоинозитол-3-киназа

РКС - протеинкиназа С

РКА - протеинкиназа А

SSC — боковое светорассеивание

TBS - трис-солевой буфер

ВВЕДЕНИЕ

Настоящая работа посвящена исследованию потенциального взаимодействия Na/K-АТРазы и NMDA-рецептора. Na/K-АТРаза долгое время была известна как фермент, способный поддерживать градиент ионов Na+ и К+, однако в 90-е годы XX века было установлено, что Na/K-АТРаза способна функционировать как рецептор, специфическим лигандом которого являются соединения класса кардиотонических стероидов (Kometiani et al., 1998). Было показано, что взаимодействие Na/K-АТРазы с этими соединениями может регулировать экспрессию генов раннего и позднего ответов через активацию транскрипционных факторов (Xie et al., 1999). Несмотря на довольно длительный период, прошедший с момента этого открытия, данных об участии Na/K-АТРазы в процессах сигнализации в нейрональных клетках известно очень мало, причем основные исследования ведутся с использованием кардиомиоцитов, почечного эпителия и фибробластов.

Na/K-АТРаза в нейрональной ткани поглощает огромное количество АТР - до 50% от общего уровня аденозинтрифосфата клетки. В нейрональных клетках а-субъединица Na/K-АТРазы представлена двумя изоформами - КТС-чувствительной аЗ-субъединицей и КТС-резистентной а 1-субъединицей. В литературе активно обсуждается вопрос о том, какими путями разные изоформы способны вовлекаться в различные внутриклеточные сигнальные пути, а также ставится вопрос о наличии в тканях животных соединений класса кардиотонических стероидов и о их возможном синтезе de novo.

Недавно было показано, что белок агрин, участвующий в формировании нервно-мышечного синапса, способен специфически связываться с КТС-чувствительной аЗ-субъединицей Na/K-АТРазы и вызывать эффекты, аналогичные действию КТС (Hilgenberg et al., 2006). Таким образом, был найден специфический «партнер» для КТС-чувствительной аЗ-субъединицы, которая представлена только в нейрональных клетках, что позволяет говорить о возможных путях регуляции именно КТС-чувствительной аЗ-субъединицы. Мутации в гене, который кодирует эту субъединицу, способны вызывать эпилепсию и паркинсонизм в моделях гетерозиготных мышей по данному гену (Clapcote et al., 2009).

В последнее время начали накапливаться данные о возможной взаимосвязи между

Na/K-АТРазой и глутаматными рецепторами. Недавно показано, что связывание уабаина с

Na/K-АТРазой способно влиять на стабильность ионотропных рецепторов АМРА-класса в

нейронах (Zhang et al., 2009), а также блокировать активность глутаматных переносчиков

GLT-1 и GLAST в клетках глии (Rose et al., 2009). Все это позволяет говорить о

возможном участии Ыа/К-АТРазы в функционировании глутаматной системы. Кроме того, накапливаются данные о предпосылках взаимодействия между Ка/К-АТРазой и ионотропными рецепторами КК/ГОА-класса.

ЫМОА-рецепторы представляют собой ионотропные глутаматные рецепторы, которые участвуют в формировании синаптической пластичности и молекулярной памяти. Важным отличием №УГОА-рецепторов от других ионотропных глутаматных рецепторов является то, что их канал проницаем не только для натрия и калия, но и для Са2+, который является вторичным мессенджером и способен модулировать ответ клетки в зависимости от внешнего сигнала.

В литературе показано, что действие соединений класса кардиотонических стероидов приводит к проявлению экзайтотоксических эффектов глутамата ^е^азЬоок е1 а1., 1999). Так как этот эффект снимается антагонистами ЫМОА-рецепторов, было выдвинуто предположение, что КТС способны влиять на функционирование ЫМ.ПА-рецепторов. Было также показано, что активация ЫМВА-рецепторов может приводить к частичному ингибированию активности Ыа/К-АТРазы (Bulygina е1 а1., 2003). Однако на сегодняшний день не установлено, способны ли они взаимодействовать между собой.

Цель и задачи работы

Целью данной работы явилось выявление особенностей структурного и функционального взаимодействия Ма/К-АТРазы и И]УЮА-рецептора в гранулярных клетках мозжечка крыс.

В соответствии с этой целью были поставлены и решены следующие задачи:

1. Исследовать возможное структурное взаимодействие и ко-локализацию Ка/К-АТРазы и ЫМОА-рецептора в первичной культуре гранулярных клеток мозжечка.

2. Исследовать активацию Ак1 и ЕЯК'/2 киназ при действии различных концентраций уабаина и оценить возможное участие КМБА-рецептора в этих сигнальных каскадах.

3. Выявить механизмы «экзайтотоксического» действия глутамата на фоне действия уабаина.

4. Исследовать процессы долговременной регуляции >ШГОА-рецепторов под действием уабаина на клетки.

Научная новизна и практическая значимость работы

В представленном исследовании впервые показано, что Na/K-АТРаза и NMDA-рецептор могут формировать функциональный комплекс, в котором могут принимать участие как КТС-чувствительная аЗ-субъединица, так и КТС-резистентная al-субъединица Na/K-АТРазы.

Показано, что кратковременное взаимодействие уабаина с аЗ-субъединицей Na/K-АТРазы приводит к активации ERK Vi, а с а 1-субъединицей Na/K-АТРазы - к активации Akt. NMDA-рецепторы не участвуют в данных сигнальных каскадах. Связывание уабаина с а 1-субъединицей Na/K-АТРазы приводит к усилению функции NMDA-рецепторов за счет фосфорилирования тирозиновых остатков МЯ2В-субъединицы. Долговременная связывание уабаина с аЗ-субъединицей Na/K-АТРазы приводит к уменьшению количества NMDA-рецепторов в первичной культуре гранулярных клеток мозжечка. Был установлен механизм ингибирования Na/K-АТРазы при активации NMDA-рецепторов.

Полученные данные свидетельствуют о том, что NMDA-рецептор в гранулярных клетках мозжечка является объектом сложной регуляции и на его активность могут влиять как al-, так и аЗ-субъединицы Na/K-АТРазы. Полученные данные могут инициировать исследование причин, по которым недостаточность аЗ-субъединицы Na/K-АТРэзы приводит к нейродегенеративным заболеваниям.

Апробация работы и публикации

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общая характеристика Na/K-АТРазы

Na/K-активируемая Mg-зависимая аденозинтрифосфат фосфогидролаза представляет собой интегральный белок плазматических мембран животных клеток (Skou, Esmann, 1992). Она принадлежит к классу АТРаз Р-типа (группа АТРаз, в каталитическом цикле которых обнаруживается фосфорилированный интермедиат), обеспечивающих активный транспорт различных ионов (Chan et al., 2010). Функция этого фермента заключается в поддержании градиента ионов Na+ и К+ между клеткой и внеклеточной средой. Таким образом, этот фермент является молекулярным насосом, который транспортирует ионы Na+ во внеклеточную среду и ионы К+ внутрь клетки. Перенос ионов происходит против электрохимического градиента, и на перенос трех ионов Na+ и двух ионов К+ расходуется энергия, освобождающаяся при гидролизе одной молекулы АТР.

Несмотря на то, что впервые кристаллическая структура представителя семейства АТРаз Р-типа была установлена в 2000 г. - это было сделано для Са-АТРазы саркоплазматического ретикулума (Toyoshima et al., 2000), первые данные о кристаллической структуре Na/K-АТРазы (из почек свиньи) были опубликованы только в 2007 г. (Shinoda et al., 2009). Это позволило получить информацию об упаковке Na/K-АТРазы в мембране (см. рис. 1).

Функционально активный протомер Na/K-АТРазы включает 2 субъединицы: а (каталитическая) и (3 (регуляторная), их содержание в очищенном ферменте эквимолярно. В центре комплекса между собой взаимодействуют две а-субъединицы, а Р-субъединицы расположены по бокам и между собой не взаимодействуют (Sarvazyan et al., 1997). В некоторых тканях комплекс включает и у-субъединицу, играющую регуляторную роль.

Методом аналитического ультрацентрифугирования было обнаружено, что молекулярная масса Na/K-АТРазы из солевых желез уток составляет величину свыше 300 кДа (Пиндель, 1992). Были также показаны АТР-индуцируемые переходы протомеров в дипротомеры (Hayashi et al., 1997). Выяснено, что участок P561-Q709 участвует в ассоциации а-субъединиц друг с другом (Koster et al., 1997). Показано, что связи между протомерами в Е2 форме являются более выраженными, чем в Е1 форме (Kunihiro et al., 1994).

мембрана

межклеточное пространство

Рис. 1. Кристаллическая структура Ла/К-АТРачы (8Ьто{1а с( а1., 2009), А, Б - вид с разных сторон. На данном рисунке представлены и-субъедииица (символ «), р-субъединица (символ р) и у-еубъединица (обозначение РХУ1))

а-субъединица имеет молекулярную массу ] 10 кДа. Она имеет ] 0 трансмембрапных доменов (MI-M10). причем петля М2-МЗ является активаторным доменом (осуществляет процесс дефосфорилирования фермента), а М4-М5 содержит нуклеотидсвязывающи й (связывает молекулу АТР) и фо сфорилирующийся (осуществляет перенос фоефорильной группы с АТР на белок) домены (Mortli et al., 2009). Домены. Пересекающие мембрану, являются a-спиралями и участвуют в формировании ионных центров (Jorgensen el al., 2003). На участках фермента, обнаруживаемых по внешнюю

сторону мембраны, расположены центры связывания специфических ингибиторов, относящихся к классу КТС (Ogawa et а!., 2009).

а-субьедипица фермента в тканях животных (растительные ткани этого фермента не содержат) представлена четырьмя изоформами а1-а4 (Dobretsov el al., 2005). Во всех тканях животных присутствует g]-субъединица, другие изоформы Na/K-АТРэзы являются тканеслецифичными: а2 экспресс и руется в сердце, скелетных мышцах и глиальных клетках, аЗ - в нейрональных клетках, а4 - в семенниках) (Dobretsov el al., 2005), Гомология в их аминокислотной последовательности составляет 85-97% (см. рис. 2). al- и <л2-субъединицы имеют сходные кинетические параметры, тогда как фермент, включающий аЗ-субъедииицу, имеет меньшее сродство к цито плазматическом у Na+ и большее сродство к внеклеточному К'(Blanco, Мсгссг, 1998).

межклеточное пространство

V>».< - «Л»..

ЗВ идентичности ■ 2/3 идентичности 9 нет идентичности

цитоплазма

; 4/4 идантичности • Э/4 идентичное™ 2/4 идентичности t нет идентичности

Рис. 2. Гомологии в аминокислотной последовательности Na/K-АТРазы (Blanco, Mercer, 1998). Для а-субъединицы: зеленый цвет - аминокислоты во всех четырех изоформах, синий - в трех, желтый - в двух, красный - только в одной. Для р-субъедипицы: зеленый - в трех изоформах, синий-в двух, красный - в одной.

Различаются изоформы а-субъединицы и по чувствительности к действию окислителей (Болдырев и соавт.., 1995), а также по сродству к кардиотоническим стероидам (Lucking, Nielsen, 1997). Последнее свойство имеет ярко выраженные видовые различия: у крыс и мышей al-субъединица резистентна к действию уабаина (относящемуся к классу кардиотонических стероидов), однако у человека, быка, собаки и кролика она является чувствительной к действию уабаина (Schoner, 2002). Кроме того, а2-и аЗ-субъединицы в клетках крыс более чувствительны к действию окислителей, нежели a 1 -субъединица (Xie et al., 1990; Kurella et al., 1999).

ß-субъединица представляет собой гликопротеид с молекулярной массой около 55 кДа (белковая часть имеет молекулярную массу 35 кДа). ß-субъединица имеет только один трансмембранный домен. Большая часть ее молекулы располагается с внешней стороны мембраны, там расположено 3 дисульфидных мостика. Их восстановление приводит к потере активности фермента.

ß-субъединица имеет три изоформы - ßl (содержится во многих типах тканей), ß2 (встречается в скелетной мускулатуре, эпифизе и нервной ткани) и ß3 (содержится в семенниках, сетчатке, печени и легких). Изоформы менее гомологичны между собой (5060% гомологии) (Blanco, Mercer, 1998). Их различия проявляются в количестве участков гликозилирования; кроме того, наличие той или иной изоформы определяет каталитические свойства а-субъединицы.

ß-субъединица участвует в доставке молекул каталитической субъединицы к мембране и в процессе ее встраивания в мембранный бислой. Кроме того, она вовлекается в связывание ионов К+. Показано, что ß2-субъединица участвует в адгезии клеток в нервной ткани (Gloor et al., 1990).

В ряде тканей в состав Na/K-АТРэзы может также входить также у-субъединица (Sweadner et al., 2000). Это полипептид массой около 10 кДа. Известно 7 различных изоформ, все они принадлежат к семейству FXYD белков (содержащих в своей структуре FXYD мотив) (Garty, Karlish, 2006). Эта субъединица содержит один трансмембранный участок, ее N-конец обращен в межклеточное пространство. Функция

Информация о работе

Аккуратов, Евгений Евгеньевич
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.04

Диссертация

Характеристика взаимодействия Na/K-АТРазы и NMDA-рецептора в гранулярных клетках мозжечка - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы