Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование NMDA-рецепторов лимфоцитов человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование NMDA-рецепторов лимфоцитов человека"

На правах рукописи

Давыдова Ольга Николаевна Исследование ^ГОА-рецепторов лимфоцитов человека

03 00 04-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2007 г

003058674

Работа выполнена в ГУ НИИ неврологии РАМН

Научный руководитель:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор

Официальные оппопенты:

доктор биологических наук профессор

доктор биологических наук

Болдырев Александр Александрович

Муронец Владимир Израилевич Орлова Валентина Сергеевна

Ведущая организация:

ГУ Гематологический научный центр РАМН

Защита состоится «¿£> .

_2007 г в «_^>> часов на заседании

диссертационного совета Д 212 203 13 при Российском университете дружбы народов по адресу 117198, ГСП, г Москва, ул Миклухо-Маклая,

Д8

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу 117198, ГСП, г Москва, ул Миклухо-Маклая, д 6

Автореферат разослан « 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета Д 212 203 13 доктор биологических наук,

профессор ^ Лукашева Е В

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

В современном естествознании сложилось устойчивое представление о взаимосвязи нервной и иммунной систем, совместную работу которых можно рассматривать как единый защитный механизм, обеспечивающий адаптационные реакции организма Показано, что клетки иммунной системы человека экспрессируют ряд рецепторов, чувствительных к нейромедиаторам, что позволяет им воспринимать информацию, получаемую от клеток нервной системы В частности, известно, что в поддержании гомеостаза лимфоцитов важную роль играет глутаминовая кислота, однако механизмы, опосредующие ее действие на клетки белой крови, до сих пор недостаточно изучены

Необходимым условием для понимания процессов, лежащих в основе «диалога» между нервной и иммунной системами, как в норме, так и при патологии, является изучение тонких механизмов их взаимодействия на клеточном и молекулярном уровнях Проблема регуляции межклеточных взаимодействий такого рода до сих пор остается открытой, поэтому актуальность проведения подобных исследований трудно переоценить Возможно, выяснение регуляторных взаимосвязей между нервной и иммунной системами позволит выявить новые подходы в лечении ряда заболеваний В первую очередь это относится к патологическим состояниям, характеризующимся воспалительными процессами в ЦНС, в частности, ишемии головного мозга, рассеянному склерозу, болезни Альцгеймера и другим патологиям, протекающим на фоне выраженного окислительного стресса Общей чертой в развитии таких заболеваний является значительное повышение уровня глутаминовой кислоты, что приводит к нейрональной смерти вследствие развития экзайтоксических механизмов Поскольку в процессе нейровоспаления активированные клетки белой крови проникают в ткани мозга, оказывая на них повреждающее воздействие, исследование механизмов воздействия глутаминовой кислоты на лимфоциты и другие клетки иммунной системы может способствовать лучшему пониманию патогенеза воспаления нервной ткани

С другой стороны, уровень глутаминовой кислоты в плазме крови существенно повышается у больных с опухолевыми заболеваниями Известно, что это коррелирует с подавлением иммунной системы, в частности, со снижением числа лимфоцитов и их функциональной активности, однако механизмы, обуславливающие эти эффекты, мало исследованы

В связи с вышесказанным, изучение влияния глутаминовой кислоты на клетки иммунной системы представляется весьма актуальной проблемой как для теоретической, так и для практической медицины

Цель и задачи исследования Целью настоящей работы явилось изучение действия агониста глутаминовой кислоты К-метил-Б-аспартата (ЫМРА) на лимфоциты человека и поиск в этих клетках ММБА-рецепторов как молекулярной основы, обеспечивающей наблюдаемые эффекты

Исходя из цели исследования были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1 Исследовать продукцию свободнорадикальных соединений в суспензии лимфоцитов человека в присутствии глутаминовой кислоты и ее агониста >ПУПЭА с применением метода люминол-зависимой хемилюминесценции

2 Охарактеризовать действие 1ЧЖ)А на состояние лимфоцитов человека при помощи метода проточной цитометрии

3 Исследовать в лимфоцитах экспрессию мРНК, кодирующей белок ЫМОА-рецепторного комплекса методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР)

4 Исследовать экспрессию белковой субъединицы (N111) №>ГОА-рецептора на клеточной поверхности лимфоцитов методом флуоресцентного окрашивания антителами, специфичными к внеклеточному участку аминокислотной последовательности этого белка

Научная новизна и практическая ценность работы

В работе охарактеризовано влияние агониста глутаматных рецепторов >ПУЮА-класса, М-метил-Б-аспартата, на лимфоциты периферической крови человека Впервые было продемонстрировано усиление люминол-зависимой хемилюминесценции суспензии клеток в ответ на их инкубацию в присутствии КГуГОА, а также ингибирование этого эффекта в присутствии антагониста NMDA-peцeптopoв дизоцилпина (МК-801) Это позволяет сделать заключение о специфическом рецепторном действии ИМОА на лимфоциты, проявляющемся в усилении продукции свободных радикалов этими клетками

Методом проточной цитометрии продемонстрировано увеличение внутриклеточного уровня активных форм кислорода (АФК) в присутствии NMDA При помощи иммунофлуоресцентного окрашивания показано связывание антител к внешнему домену рецепторного белка с мембраной лимфоцитов, а также усиление экспрессии данного антигена в результате инкубации клеток с ЫМЭА Наконец, в работе была показана экспрессия в лимфоцитах периферической крови человека мРНК, кодирующей основную белковую субъединицу ИМБА-рецепторного комплекса (N111) Полученные в работе данные позволяют считать доказанной экспрессию на внешней мембране лимфоцитов №кША-рецепторов, ранее считавшихся специфическими компонентами нейрональных клеток Полученные результаты расширяют представления о молекулярных механизмах взаимодействия глутаминовой кислоты с лимфоцитами человека, что существенно для понимания функции этого медиатора в иммунной системе Положения, выносимые на защиту

Лимфоциты человека экспрессируют глутаматные рецепторы >ПШ}А-класса, активация которых приводит к изменению внутриклеточного уровня АФК Этот процесс является составной частью специфического действия глутаминовой кислоты на клетки белой крови

Апробация работы

Результаты исследований были доложены на XIII международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии» (Украина, Крым, 2005), на XXIX ежегодном собрании Японского нейрохимического общества (Япония, Киото, 2006) Апробация работы прошла 25 декабря 2006 г на заседании ученого совета ГУ НИИ неврологии РАМН

Публикации

По теме диссертации опубликовано 5 работ

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и используемых методов, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы Диссертация изложена на 110 стр печатного текста, содержит 18 рисунков и 1 таблицу Список литературы включает 265 наименований

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качества объекта исследования в работе использовались гранулярные клетки мозжечка и лимфоциты периферической крови крыс и человека

Получение ткани мозжечка крыс и выделение гранулярных клеток. Для получения гранулярных клеток мозжечка использовали 10-дневных крыс линии \Yistar После декапитации животных выделяли мозжечок, помещали его на льду в чашку Петри, измельчали и добавляли диспазу (1,66 Ш/мл)

Пробы инкубировали 30 мин при 34°С в растворе Тироде (№С1 148 мМ, КС1 5 мМ, СаС12 2 мМ, Г^С12 1 мМ, Б-глюкоза 10 мМ, НЕРЕБ 10 мМ, рН 7 3) После инкубации кусочки ткани трижды промывали раствором Тироде и аккуратно пертурбировали клетки при помощи пастеровской пипетки

Суспензию клеток фильтровали через нейлоновый фильтр с диаметром пор 60 цм для удаления крупных кусков ткани Подсчет клеток проводили в камере Горяева Полученную суспензию инкубировали 60 мин при 37°С в растворе Тироде В каждую пробу для измерений брали в среднем (1-2)х106 клеток

Отбор крови. В работе использовалась кровь доноров без выраженных патологий, которая отбиралась у каждого донора многократно Забор крови осуществляли из локтевой вены с утра, натощак Кровь собирали в полистироловую пробирку с гепарином (конечная концентрация гепарина составляла 100 ед/мл) При выделении клеток для последующего роста в культуре отбор крови осуществляли в стерильных условиях с использованием вакуумтейнеров

Отбор крови у крыс проводили следующим образом Взрослых животных перед опытом усыпляли хлоралгидратом, взятым из расчета 400-600 мг вещества на 1 кг веса животного и отбирали кровь из яремной вены с помощью шприца, содержащего раствор гепарина (50 ед/мл крови)

Выделение лимфоцитов. Процедуру выделения лимфоцитов проводили не позднее 2 часов с момента отбора крови Выделение периферических мононуклеарных клеток проводили в градиенте фикол-гипака (плотность 1,077±0,001), используя стандартную среду выделения «LymphoSep» (ICN Biomedicals) и следуя указанному производителем протоколу Собранные после выделения клетки дважды отмывали, и полученный осадок ресуспендировали в изотоническом растворе Хенкса (pH 7,2) Когда было необходимо, от моноцитов избавлялись путем «приплэйтинга» - адгезии на пластике при 37°С в течение 40 мин Подсчет клеток проводили в камере Горяева

Первичная культура периферических лимфоцитов. Клетки выделяли описанным выше способом, избавляясь от моноцитарной фракции Все работы проводили в стерильном ламинарном боксе После отмывки клетки суспендировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% инактивированную телячью эмбриональную сыворотку, глутамин (2 шМ), пенициллин (100 ед /мл), стрептомицин (100 мг/мл), и инкубировали в 5% С02-инкубаторе

Плотность клеточной суспензии составляла 10б кл/мл О количестве мертвых клеток в ходе эксперимента судили по окраске проб трипановым голубым Активированные лимфоциты получали в результате инкубации с фитогемагглютинином (ФГА-П, ПанЭко, Россия) (10 мкг/мл) в течение 72 часов

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ПОДХОДЫ И РЕГИСТРИРУЕМЫЕ ПАРАМЕТРЫ Хемилюминесцентный анализ АФК. Регистрацию продукции АФК в клеточной суспензии проводили в присутствии 50 цМ химического активатора хемилюминесценции люминола (5-амино-1,2,3,4-тетрагидро-1,4-фталазиндиона) на жидкостном сцинтилляционном счетчике «Mark III» («Searle Analytic Ine », The Netherlands) Люминол растворяли в DMSO так, чтобы концентрация растворителя в образце не превышала 0,1% Регистрацию интенсивности люминесценции проводили в течение 200-250 мин с момента добавления реактивов к клеточной суспензии Плотность клеточной суспензии составляла (5-10)х104 кл/мл Все опыты с клеточной суспензией проводили при рассеянном освещении

Стационарный уровень свечения клеток, определенный в присутствии люминола, отражал исходную скорость образования АФК, а увеличение числа регистрируемых импульсов в минуту - увеличение скорости накопления АФК В качестве положительного контроля активации к клеточной суспензии добавляли 1 цМ форболмиристат ацетат (ФМА) Для оценки специфичности действия в пробы одновременно с NMDA вносили МК-801 (антагонист NMDA-рецепторов) в конечной концентрации 10 цМ

Проточная цитометрия. Измерения проводили на приборе «Beckman Coulter, EPICS» (USA), оснащенном аргоновым лазером с длиной волны возбуждения 485 нм В каждой пробе анализировали 10000 событий В качестве параметра, характеризующего интенсивность фчуоресценции внутриклеточного маркера АФК (DCFH-DA) использовали среднее значение флуоресценции (Mean fluorescence), которое отражает уровень АФК При

анализе апсштоза, некроза или взаимодействия клеток со специфическими антителами, определяли процент клеток, имеющих положительную флуоресценцию в результате взаимодействия с соответствующими красителями, по отношению к контролю

Определение внутриклеточного уровня АФК Для определения внутриклеточного уровня АФК клетки нагружали флуоресцентным красителем DCFH-DA (2,7-дихлордигидрофлуоресцеин-диацетатом, >.ех=485 нм, и >.ет=535 нм) в конечной концентрации 100 мкМ в течение 40 мин Краситель растворяли в DMSO так, чтобы концентрация растворителя в образце была не выше 0,1%

Определение доли мертвых клеток. Для идентификации некроза в клеточной популяции лимфоциты или нейроны окрашивали иодидом пропидия (PI, Хсх=485 нм, и />.ст=610 нм) в конечной концентрации 10 мкМ Краситель добавлялся к клеточной суспензии за 5 мин до измерения, окраска оставалась стабильной в течение по крайней мере 30 мин

Определение доли апоптотических клеток Степень апоптоза в клеточной суспензии определяли с помощью окраски внутриклеточной ДНК йодидом пропидия следующим образом Исследуемые пробы, содержащие 1 х 10б клеток в объеме 0,5 мл, отмывали от культуральной среды буферно-солевым раствором стандартного состава (PBS), осадок после центрифугирования осторожно ресуспендировали в 1 мл охлажденного (-20°С) 70% этанола и оставляли от 12 до 48 ч при -20°С Затем его дважды отмывали от этанола раствором PBS, осадок ресуспендировали в 1 мл гипотонического раствора флуорофора (5 мкг/мл PI, 0,1% цитрата натрия, 0,1% Тритон Х-100), и инкубировали в течение 20 мин при 4°С в темноте Подготовленные пробы анализировали методом проточной цитометрии

Илшунофенотипирование Клеточную суспензию окрашивали моноклональными антителами к CD-маркерам поверхности лимфоцитов (CD45, CD3, CD 19), конъюгированными с флуоресцентными красителями флуоресцеинизотиоционатом (FITC) или фикоэритрином (РЕ) Преципитацию антител проводили следующим образом К 50 мкл суспензии, содержащей 500 тысяч клеток, добавляли 5 мкл антител («Сорбент» Россия), инкубировали 45 мин при +4°С, дважды отмывали, а осадок ресуспендировали в 50 мкл среды Хенкса Анализ проводили методом проточной цитометрии

Определение экспрессии NR1-субъединицы Определение экспрессии NMDA-рецепторного белкового комплекса на поверхности лимфоцитов проводили методом непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания с двумя видами антител к NR1 -субъединице NMDA-рецептора

1) специфичными поликлональными (rabbit anti-rat) антителами ab6483 («Abcam», USA) к внеклеточному домену NR1-субъединицы, с последующей окраской поликлональными (goat anti-rabbit) FITC-коньюгированными антителами ab 6717 («Abcam», USA)

2) специфичными моноклональными (mouse anti-rat) антителами (GTX30182, GenTex, USA) с последующей окраской FITC-коньюгированными поликлональными козьими Fab-фрагментами к IgG мыши (ab 6669, Abcam, USA)

В качестве положительного контроля использовали связывание анти-NRl антител с гранулярными клетками мозжечка крысы

Для нейронов и лимфоцитов процедуру окрашивания проводили сходным образом Клетки после отмывки от среды выделения разводили в растворе Хенкса до концентрации (1-5)х106 кл/мл и инкубировали 40 мин при комнатной температуре в присутствии первичных антител После этого клетки отмывали в растворе Хенкса при 400 g в течение 10 мин и окрашивали вторичными антителами, меченными флуоресцентным красителем (FITC) Инкубацию проводили в течение 30 мин в темноте, после чего клетки отмывали в тех же условиях Для того чтобы исключить неспецифическую флуоресценцию вторичных антител, контрольные пробы прокрашивались с ними без предварительной инкубации с первыми антителами

Чтобы исключить неспецифическое связывание поликлональных первых антител (аЬ6483), а также возможное связывание с Fc-рецептором клеточной поверхности, дополнительно ставили изотипический контроль с очищенной фракцией иммуноглобулинов (IgG) кролика («Имтек», Россия), поскольку первичные антитела (ab 6483) относились к тому же изотипу иммуноглобулинов Пробы подготавливали по описанному' выше протоколу, концентрации IgG в изотипическом контроле были равны концентрациям первичных антител После титрования первых антител в диапазоне концентраций 0,1-10 мкг/мл была выбрана оптимальная рабочая концентрация 3 мкг/мл Концентрация FITC-коньюгированных антител составляла 10 мкг/мл Анализ образцов проводили на проточном цитофлуориметре в течение 2 ч с момента приготовления образцов

Дизайн праймеров для полимеразной цепной реакции. Дизайн праймеров для полимеразной цепной реакции (ПЦР) проводили на основании базы данных «Gene NCBI» с использованием программ «Vector NTI Suite 8» и «Oligo 631» Специфичность выбираемых праймеров дополнительно проверяли при помощи программы «NCBI Blast» Оценку температуры отжига проводили с использованием программы «HyTher»

В связи с тем, что в качестве положительного контроля экспрессии мРНК NMDA-рецелтора был взят мозжечок крысы, для постановки реакции были выбраны следующие универсальные праймеры, в равной степени гомологичные к кДНК и крысы, и человека прямой праймер «TTCACTCCCACCCCTGTCTCCTAC», обратный праймер «CAGCACCT-TCTCTGCCTTGGACT» Длина получаемого продукта составляет 282 п о.

В качестве положительного контроля выделения РНК и проведения ОТ-ПЦР проводили реакцию с праймерами к гену GAPDH (глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназе) прямой праймер «CAGCCTCAAGATCATCA-GCAATGCC», обратный праймер «GGGTGTCGCTGTTGAAGTCAGAGGA», длина получаемого продукта 446 п о Все использовавшиеся в работе праймеры были составлены с учетом интрон-экзонной структуры таким образом, чтобы избежать юс специфического отжига на геномной ДНК

Выделение РНК и обратная транскрипция. Выделение тотальной РНК из мозжечка крыс линии Wistar и лимфоцитов периферической крови человека

проводили с использованием стандартного набора для выделения РНК «RNeasy MicroKit» («Qiagen», USA) Количество ткани мозжечка, использовавшегося для выделения, составляло 7 мг, количество лимфоцитов - 5х 106 клеток

Обратную транскрипцию проводили следующим образом Смесь объемом 20 мкл, содержащую 10 мкг тотальной РНК, 40 ед ингибитора РНКаз IRNase («Синтол», Россия), 1 мкл Random-нуклеотидов (исходная концентрация 0,5 мг/мкл, «Синтол», Россия), инкубировали в течение 1 мин при 94таС для отжига праймеров и мгновенно охлаждали до 4°С После этого в инкубационную смесь вносили 5 ед IRNase, 6 мкл 5><кратного MLV-буфера («Синтол», Россия), 1 мкл дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTP, концентрация 10 мМ, «Синтол», Россия), 1 мкл фермента MLV-ревертазы («Синтол», Россия) и проводили реакцию обратной транскрипции при 42°С в течение 40 мин, после чего смесь инкубировали 3 мин при 93 °С для остановки реакции

Полимеразная цепная реакция. Для постановки полимеразной реакции использовали набор «PCR-Core» для проведения ПНР фирмы «ИзоГен» (Россия), рассчитанный на проведение реакции в объеме 20 мкл Конечные концентрации реагентов в одной пробе составляют 1 ед Taq-полимеразы, 20 мМ KCl, 15 мМ сульфата аммония, 65 мМ Трис-HCl- буфера (pH 8,8), 2,5 мМ MgCl2, 200 мкМ дезоксинуклеотидтрифосфатов

В качестве затравочных нуклеотидов использовали уникальные пары праймеров к субъединице NR1 NMDA-рецепторного комплекса или к GAPDH, описанные выше В пробирку вносили 2 мкл ДНК-матрицы и праймеры (в концентрации 1 мкМ), наслаивали на реакционную смесь 30 мкл минерального масла во избежание испарения жидкости, и проводили амплификацию в амплификаторе «Терцог» (Россия)

Отрицательным контролем служили пробы, в которые в качестве матрицы вносили продукт выделения тотальной РНК без последующей реверсии, все остальные компоненты присутствовали в тех же количествах

ПЦР проводили в следующем режиме исходная денатурация матрицы -95°С, 5 мин, денатурация - 94°С, 30 сек, отжиг праймеров - 60°С, 60 сек, элонгация - 72°С, 60 сек Заключительная достройка продуктов реакции -72°С, 10 мин Реакцию проводили в течение 36 циклов Визуализацию продукта ПЦР проводили методом электрофореза в 1,5% агарозном геле при напряжении поля 10 В/см

Статистическая обработка результатов. Измерение люминол-зависимой хемилюминесценции проводили не менее чем в 5 параллельных пробах для каждого данного образца клеточной суспензии Результаты представлены в виде «среднее значение ± стандартное отклонение» для каждого фиксированного момента времени В экспериментах с использованием методов проточной цитометрии измерялось не менее 3 параллельных проб Обработку результатов проводили при помощи программы «Biostatistika», используя для сравнения полученных выборок парный критерий Стьюдента Достоверными считали различия при t<0 05

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Влияние NMDA на хемилюминесиениию суспензии лимфоцитов периферической крови человека Известно, что люминол-зависимая люминесценция является индикатором суммарного уровня образования свободнорадикальных соединений, поскольку высвобождение квантов света имеет место при действии на люминол ряда различных окислителей гидроксид-радикала, гипохлорита, окиси азота В связи с этим метод люминол-зависимой хемилюминисценции широко применяется для исследования дыхательного взрыва лейкоцитов (в частности, нейтрофилов) (Владимиров и соавт, 1989) Мы применили этот подход для изучения состояния суспензии периферических мононуклеарных клеток крови (ПМК)

Для определения уровня активных форм кислорода анализировали ответ суспензии клеток, выделенных из образцов крови разных доноров Следует отметить, что от опыта к опыту наблюдались отличия в стационарном уровне свечения клеток, отражающем исходную скорость образования АФК, что может объясняться как различиями в функциональном состоянии клеток белой крови разных доноров, так и возможной активацией лимфоцитов в процессе выделения По этой причине действие исследуемых лигандов определяли как уровень детектируемого сигнала по отношению к базовому уровню

В предварительных экспериментах, проведенных на образцах клеток, выделенных из крови разных доноров, рассматривалось действие NMDA в концентрациях 10, 100, 250, 500 мкМ Эти опыты показали, что 10 мкМ NMDA не вызывал достоверно значимых изменений, а возрастающие концентрации в диапазоне от 100 мкМ до 500 мкМ вызывали дозозависимое усиление люминесценции для каждого исследовавшегося образца крови Для дальнейшей оценки была выбрана минимальная эффективная концентрация, равная 100 мкМ В большинстве экспериментов внесение 100 мкМ NMDA к суспензии лимфоцитов сопровождалось усилением люминесценции по отношению к контролю По сравнению с активацией, вызываемой ФМА, эффект NMDA был выражен существенно слабее и пролонгирован во времени (рис 1) Характерное время начала повышения уровня люминесценции под действием NMDA наступало через 30—50 мин с момента начала инкубации В процессе регистрации (в течение, по крайней мере, 2 часов) происходило прогрессивное нарастание интенсивности люминесценции

Эффективность клеточного ответа на NMDA оценивали в процентах по отношению к максимуму усиления люминесценции суспензии в присутствии ФМА Интенсивность активации при этом варьировала в пределах от 5 до 20%, в некоторых экспериментах NMDA не оказывал достоверно значимого влияния на изменение люминесценции клеточной суспензии, такие образцы не подвергали дальнейшему анализу

Различия в реакции ПМК из крови разных доноров на действие лиганда могли быть вызваны как индивидуальными особенностями и общим состоянием организма доноров, так и методическими особенностями эксперимента Возможно, в наших условиях частичная активация клеток могла

происходить без значительного роста свободнорадикальных соединений Как известно из литературы, глутамат не вызывает активации покоящихся клеток, однако стимулирует реакцию лимфоцитов на митоген-стимулирующие факторы (ЬотЬагсЬ е1 а1, 2001) Поэтому можно предположить, что в эксперименте активация клеток КТМБА имеет место, когда лимфоциты находятся в «подпороговом» состоянии

30000,

15о 13Г

время инкубации, №н

200

250

Рис. 1. Хемилюминесценция ПМК: 1 - в контроле (клетки+люминол), 2 -в присутствии 100 мкМ NMDA, 3 - в присутствии 1 мкМ ФМА.

Для оценки специфичности действия NMDA к клеточной суспензии одновременно с лигандом вносили его антагонист МК-801 Оказалось, что МК-801 снижает люминесценцию клеток, активированных NMDA, до контрольных значений (пример типичного эксперимента показан на рис 2) В качестве дополнительного контроля мы использовали пробы, инкубировавшиеся с МК-801 в отсутствие NMDA Во всех рассмотренных случаях МК-801 не оказывал достоверных изменений уровня АФК по сравнению с контрольными значениями (пробы «клетки+люминол») Этот факт, несмотря на различие в интенсивности наблюдаемого эффекта NMDA, позволяет предположить, что действие изучаемого лиганда является рецептор-опосредованным

Таким образом, в описанной модельной системе, позволяющей охарактеризовать продукцию свободнорадикальных соединений, было показано, что NMDA специфическим образом повышает уровень активных форм кислорода в суспензии ПМК человека Одновременная инкубация клеток

в присутствии NMDA и его антагониста предотвращала рост люминол-зависимой люминесценции.

кххюг—..............- .......———-—----

время ижубации, nvh

Рис. 2. Подавление эффекта NMDA (100 мкМ) в присутствии МК-801 (J0 мкМ): 1-контроль, 2 - NMDA, 3 - NMDA+MK-8G1,4 - МК-801. *-р<0,01 по отношению к контролю, **-р<0,05 по отношению к пробам, инкубировавшимся с

NMDA.

В отличие от нейтрофилов и клеток моноцитарно-макрофагалького ростка дифференцировки, использующих генерацию свободнорадикальных соединений для защиты органиша от инфекций, образование лимфоцитами активных форм кислорода (АФК) не является их специфической функцией. Тем не менее, в литературе имеются многочисленные данные о генерации АФК лимфоидными клетками. Известно, что лимфоциты продуцируют супероксид (Pañi er al., 2000), и их пролиферация и дифференцировка протекают с участием Redox-чувствительных процессов (Kaisho et al., 2001), хотя источники АФК в этих клетках до сих пор недостаточно изучены (Williams and Kwon, 2004). В связи с этим, повышение продукции свободно-радикальных соединений лимфоидными клетками можно рассматривать как один из критериев их активации, что согласуется со сложившимся на сегодняшний день представлением о свободных радикалах как своеобразных вторичных мессенджерах, играющих важную роль в процессах меж- и внутриклеточной сигнализации (Kamata and Hirata, 1999; Dr6dge, 2002).

В описанных экспериментах мы анализировали всю мононуклеарную фракцию периферических клеток крови, поэтому нельзя однозначно утверждать, что наблюдаемый ответ на NMDA не был (по крайней мере, отчасти) опосредован присутствием моноцитарных клеток. В экспериментах с

применением метода проточной цитометрии было проведено уточнение этого вопроса

2. Исследование действия NMDA на функциональное состояние лимфоцитов методом проточной цитометрии

Используемый в работе метод выделения клеток позволяет выделять фракцию мононуклеаров периферической крови человека, содержащую некоторый процент моноцитов, а также возможную примесь гранулоцитов В связи с этим, в первую очередь мы решили проверить степень контаминации получаемой суспензии этими клетками, которые, как известно, являются активными продуцентами АФК, и, следовательно, могут обусловливать наблюдаемые эффекты

Чтобы ответить на этот вопрос, на начальном этапе анализа мы осуществлялся выбор анализируемой области (гейта) из всего диапазона событий, регистрируемых прибором, которая соответствовала бы положению субпопуляции лимфоцитов в координатах светорассеяния SS (side scattering, боковое рассеяние) versus FS (forward scattering, малоугловое рассеяние) Для этого клеточную суспензию окрашивали моноклональными антителами к клеточным маркерам лимфоцитов, конъюгированными с флуоресцентными красителями (FITC или РЕ) Окраску проводили с антителами к панлейкоцитарному маркеру CD45, не экспрессирующемуся на тромбоцитах, антителами к лимфоцитарным маркерам CD3 (маркер Т-клеток) и CD 19 (маркер В-клеток)

Исходя из логических ограничений, накладываемых видом клеток в координатах «SS-FS» и результатов окрашивания клеток анти-CD антителами, для дальнейшей работы мы выбрали гейт, однозначно соответствующий популяции лимфоцитов В дальнейшем именно эти клетки были использованы для анализа эффекта NMDA В проведенных экспериментах было показано, что количество моноцитарных клеток в пробах незначительно (в пределах 2%), а гранулоциты отсутствуют

Таблица 1. Изменение клеточных характеристик под действием 1 тМ NMDA (FS - малоугловое рассеяние, SS - боковое рассеяние, Mean FL-DCF -

среднее значение флуоресценции DCF) (величины представлены как среднее ± ст. откл. в процентах по отношению к контрольным пробам, п=3, * соответствует величине р<0,01 по отношению к контролю)

Условия FS,% SS,% Mean FL-DCF,%

контроль 100±0,18 100±0,36 100±2,15

+ NMDA 96,76±0.26* 105,34±0,9* 218,9±4,1*

Анализ клеток методом проточной цитометрии позволил выявить влияние КМБА на ряд клеточных характеристик Оказалось, что 30 мин инкубация с высокими концентрациями ИМТОА (0,5—1тМ) приводит к усилению флуоресценции ОСР-ОА, что свидетельствует о накоплении АФК внутри клеток (результат типичного эксперимента приведен на рис 3) Этот

феномен сопровождается изменением параметров светорассеяния клеток FS и SS, характеризующих размеры и гранулярность клеток соответственно. Под действием i мМ NMDA происходит смещение положения клеток в координатах «SS-FS» в сторону больших значений SS и меньших значений FS. Результаты типичного эксперимента приведены в таблице 1. Концентрации лиганда, меньшие 0,5 мМ, не оказывали эффекта на изменение параметров

Данные Таблицы 1 иллюстрируют, что даже кратковременная инкубация клеток с высокой концентрацией №ЛОА приводит к сжатию клеток и увеличению их гранулярности, что косвенно свидетельствует об изменении метаболического состояния клеток. Данные изменения могут соответствовать начальным стадиям активации клеток или их возможной подготовке к апоптозу: перестройке цитоскелета и поверхностному сжатию (зЬгткт^).

Окрашивание клеток иодидом пропидия показало, что процент мертвых клеток как в контроле, так я в пробах, прошедших инкубацию с NMDA, был незначителен (никогда не превышал 1%), В ходе инкубации клеток с лигандами количество клеток, окрашиваемых иодидом пропидия, не увеличивалось. Таким образом, несмотря на вызываемые эффекты, инкубация с NMDA не приводила к клеточной гибели в рассматриваемом временном диапазоне (до 1,5 ч инкубации).

Так же, как и при исследовании люминол-зависимой хемилюминесценции, наблюдаемый эффект был выражен в разной степени для клеток разных доноров. Более того, препараты, выделенные из образцов крови разных доноров, обладали разной пороговой чувствительностью по отношению к концентрации лиганда, в связи с чем в экспериментах этой серии мы исследовали действие NMDA в достаточно высоких концентрациях (0,5 - I мМ).

Поскольку люминол, использовавшийся при изучении влияния NMDA на лимфоциты в первой части экспериментальной работы, является индикатором преимущественно внутриклеточного уровня свободнорадикальных соединений (Caldefie-Che 'zet et al., 2002), можно предположить, что наблюдаемый эффект был опосредован усилением продукции АФК внутри клетки. Наличие корреляции в результатах, полученных при использовании двух независимых

FS/SS,

Рис. 3. Изменение

флуоресценции суспензии лимфоцитов под действием NMDA (светлый коа typ -контроль, насыщенный контур - 1 мМ NMDA).

подходов - хемилюминесцентного анализа и флуоресцентного анализа методом проточной цитометрии - отчасти подтверждает это предположение

3. Определение экспрессии мРНК к N111 субъединице ММРА-

рецепторного комплекса Доказательство экспрессии мРНК, кодирующей субъединицу ИМОА-рецептора, проводили методом обратной транскрипции (ОТ) и последующей ПЦР с нуклеотидными праймерами, специфическими к определенному участку искомой последовательности

Основной задачей проводимого исследования было обнаружение мРНК, кодирующей субъединицу N111 ]ММБА-рецепторного комплекса (далее -мРНК-М11) в лимфоцитах человека В качестве положительного контроля (ткани с высоким уровнем экспрессии ММБА-рецепторов) был взят мозжечок крысы Такая постановка эксперимента накладывала определенные требования к дизайну праймеров они должны быть универсальны, то есть в равной степени комплементарны к кДНК как крысы, так и человека

В связи с вышеуказанными обстоятельствами, выбор праймеров для ПЦР проводили на основании выравниваний различных сплайс-вариантов мРНК-N111 человека и крысы Степень гомологии, определяемая как отношение числа парных совпадений к длине последовательности, для мРНК-ЫШ у данных видов составляет 89%

Проведенный анализ показал наличие в пробах кДНК, полученной из лимфоцитов периферической крови человека, соответствующего продукта ПЦР длиной 282 по, что является доказательством экспрессии мРНК к N111-субъединице (Рис 4) Практически одновременно и независимо аналогичные результаты были описаны в литературе (М^1ю е! а1, 2005), где показали экспрессию мРНК к N111 и NR2-cyбъeдиницaм в лимфоцитах человека Поэтому, опираясь на их данные, мы не стали изучать экспрессию различных изоформ NR2-cyбъeдиницы, хотя ее коэкспрессия с N111 и является необходимым условием для формирования функционального рецепторного комплекса

Поскольку функциональное значение экспрессии NMDA-peцeптopoв в лимфоцитах неизвестно, нас интересовало, изменяется ли уровень экспрессии мРНК к N111 в результате активации клеток

Состояние ФГА-активированных лимфоцитов, а также клеток, инкубировавшихся в контрольных условиях, оценивали с помощью анализа ДНК методом проточной цитометрии Для этого после 48 и 72 ч инкубации проводили фиксацию клеток 70% этанолом и окрашивали иодидом пропидия Данный метод позволяет оценить процент клеток, находящихся в различных фазах клеточного цикла, а также процент апоптотических клеток В наших условиях инкубация с ФГА (10мкг/мл) приводила к изменению морфологии клеток (изменению параметров светорассеяния Б 8 и РЭ) в анализируемых пробах Одновременно были обнаружены существенные изменения в содержании ДНК сокращалось число клеток с диплоидным количеством ДНК (клетки в фазе О0/О1 клеточного цикла), и увеличивалось число апоптотических клеток (фракция с гиподиплоидным содержанием ДНК) Увеличение по

сравнению с контролем числа гиподиплоидных клеток является косвенным свидетельством их активации: стимуляция периферических мононуклеаров митогенами неизбежно приводит к запуску процесса алоптоза в части клеточной популяции, поскольку в обоих процессах задействованы общие внутриклеточные сигнальные системы.

Сопоставление уровня экспрессии mPHR-NRI с экспрессией мРНК к GAPDH (house keeping gene) обнаружило некоторое усиление экспрессии мРНК исследуемого гена в клетках, подвергшихся 72 ч инкубации с ФГА, по сравнению с контрольными пробами (пример типичного эксперимента приведен па рис. 4). В связи с этим мы предположили возможное участие NMDAR в процессе активации лимфоцитов.

Рис. 4. Анализ экспрессии мРНК N МБ А-рецептора. 1 - экспрессия МШ, мозжечок крысы, 2 - экспрессия N111, лимфоциты человека после 72 ч инкубации в среде, 3 - то же в присутствии ФГА, 4 - экспрессия САРОН, лимфоциты человека после 72 ч инкубации в среде, 5 — то же в присутствии ФГА, 6 - отрицательный контроль, 7 - маркеры ДНК (опыты поставлены совместно с А.Н. Иеговой, МВЦ МГУ им. Ломоносова).

4. Определение экспрессии субъединииы /УД/ !УМРЛ-рецепторного комплекса на поверхности лимфоцитов

Экспрессия N111 субъединицы является необходимым условием для формирования NMDA-peцeптopнoгo комплекса вне зависимости от того, в сочетании с какими субъединицами (N142 и/или N143), коэкспрессирующимися в конкретных условиях, формируется ионный канал. Поэтому в проведенном эксперименте мы определяли уровень экспрессии N5.1 на клеточной поверхности лимфоцитов методом окраски антителами, специфичными к внеклеточному участку аминокислотной последовательности этого белка.

4.1 Окраска клеток поликлоналъньши антителами (аЬ6483) к N111-субъедынице. Использовавшиеся в эксперименте антитела к N8.1 были специфичны к белку крысы. Сравнение аминокислотной последовательности участка (порядка 20 аминокислот), к которому специфичны поликлональные антитела аЬб483, у человека и крысы показывает 100% гомологию. Кроме того, высокий консерватизм белковой последовательности №4.1 в области И-конца (гомология 99%) позволяет предположить очень близкую или даже идентичную конформацию белка для этих видов, что послужило основанием для использования данных антител на лимфоцитах человека.

В качестве положительного контроля было проведено окрашивание суспензии нейронов мозжечка крысы. Клеточную суспензию окрашивали иод ид ом пропидия для д и скри м и н и на ц ии между живыми и мертвыми клетками, и в процессе дальнейшего анализа окраски антителами рассматривали популяцию клеток, не окрашиваемых эти красителем. Такой подход необходим при анализе связывания антител с внешней мембраной клеток, поскольку положительно окрашенные по Р1 клетки имеют поврежденную клеточную мембрану, и, соответственно, более высокий уровень неспецифического связывания (background staining). Эксперименты показали окрашивание 50 % живых нейронов в суспензии анти-NRl антителами.

Рис. 5. Определение экспрессии субъединицы N111 на поверхности

лимфоцитов человека методом непрямого нммунофлуоресцентного окрашивания: 1 -изотопический контроль» 2 - окраска аяти-КБ11 антителами л Ь6483. Результат представлен как среднее значение ± стандартное отклонение, р<0,05.

Далее мы провели окрашивание данными антителами лимфоцитов крысы. Анализ показал увеличение количества окрашенных лимфоцитов крысы в пробах, инкубировавшихся в присутствии №1 -специфичных антител, по отношению к пробам, инкубировавшимся с изотипическими антителами, на 5%. Те же результаты были получены при анализе связывания антител с поверхностью лимфоцитов человека (рис. 5).

Таким образом, нам удалось показать, что в исходной популяции лимфоцитов около 5% клеток связывают антитела к МЯ1 -субъединице.

4.2 Окраска клеток моноклональпыми антителами (СТХ30182) к N111-субъединице. В качестве дополнительного доказательства экспрессии ГчЮ -субъединицы на поверхности мононуклеарных клеток человека мы решили также исследовать связывание других антител к с поверхностью этих клеток - моноклональных антител (СТХ30182), специфичных к внеклеточному домену рецепторного белка. Анализ показал окраску 5,5±1 % периферических лимфоцитов, выделенных из крови 3 здоровых доноров, что коррелирует с данными, полученными в эксперименте с поликлональными антителами, и является дополнительным доказательством экспрессии белковой субъединицы NR1 >ЙГОА-рецеигорного комплекса на внешней мембране субпопуляции лимфоцитарных клеток. Полученные результаты соответствует данным, недавно опубликованным в литературе (М1§Но & а!., 2005).

Таким образом, результат исследований, проведенных с использованием специфических антител к NR1-субъединице NMDA-рецептора, доказывает поверхностную экспрессию белковой субъединицы NR1 NMDA-рецепторного комплекса на внешней мембране субпопуляции лимфоцитарных клеток.

Несмотря на то, что мы не анализировали экспрессию остальных белковых субъединиц NMDA-рецепторного комплекса, комплексный анализ полученных данных свидетельствует об экспрессии данного рецептора в лимфоидных клетках, хотя не исключено, что его структура и функциональные свойства у лимфоцитов могут отличаться от таковых для NMDА-рецепторов, экспрессируемых в нейроналшых тканях.

4.3 Изменение экспрессии NRJ в результате инкубации клеток с NMDA. Поскольку мсиоклокальные антитела, связываются с единственной антигенной детерминантом и, следовательно, обладают более высокой специфичностью по сравнению с поликлональньши антителами, они, как правило, характеризуются меньшей степенью неспецифического связывания (background staining) и лучше подходят для исследования методом проточной цитометрии. Поэтому в дальнейших экспериментах мы решили использовать именно моноклональные антитела для оценки степени экспрессии NR1-субъединицы на поверхности мононуклеаров периферической крови человека в процессе их активации.

Рис.Определение NR1-позитивных клеток в культуре периферических лимфоцитов. А — доли окрашенных клеток, выявляемых после совместной инкубации с ФГА (10 мкг/мл) и NMDA (500 мкМ): 0 ч - 1 (5,5% окрашенных клеток); 48 ч - 2 (28,5%); 72 ч -3 (85%). Б-доля окрашенных клеток, выявляемых после инкубации в присутствии агонистов и антагонистов NMDA-рецепторов в течение 72 часов: 1 - контроль, 2 - ФГА (10 мкг/мл), 3 - NMDA {500 мкМ), 4 - MK-S01 (25 мкМ), 5 - ФГА + NMDA, 6 - ФГА + NMDA + МК-80 ( (опыты проведены совместно с А,П. Мишкиной, кафедра биохимии МГУ им.

Ломоносова).

Исходя из данных, полученных в экспериментах с определением экспрессии мРНК к NR1-субъединице, мы ожидали, что процент клеток, экспрессирующих NR1 на своей поверхности, будет расти в результате инкубации клеток в присутствии ФГА Тем не менее, в экспериментах с окрашиванием лимфоцитов моноклональными антителами оказалось, что достоверно значимых изменений уровня экспрессии не происходит Однако мы обнаружили другой любопытный эффект инкубация ФГА-стимулированных мононуклеаров с NMDA (500 мкМ) приводит к резкому увеличению процента позитивно окрашенных NR1-антителами клеток (Рис 6) Таким образом, с увеличением времени инкубации активированных лимфоцитов с NMDA усиливается экспрессия клетками субъединицы NR1, при этом число NR1-позитивных клеток в контроле (инкубировавшихся без NMDA), не изменяется Оказалось, что антагонист NMDA-рецепторов МК-801 (25 мкМ) полностью нивелирует этот эффект При этом инкубация клеток с одними агонистами и/или антагонистами NMDA-рецепторов в отсутствие ФГА не вызывала достоверных изменений экспрессии

Различие между увеличением экспрессии мРНК к NR1 в клетках, активированных ФГА, качественная оценка которой была дана в предыдущем разделе работы, и отсутствием изменений в экспрессии самого белка, выявляемого при окраске клеток антителами, может объясняться как различной чувствительностью применяемых методов, так и неполной экстернализацией синтезированных белковых субъединиц на внешней мембране клетки Так, известно, что в нейронах, экспрессирующих NMDA-рецепторы, идет конститутивный синтез субъединиц NR1, которые могут длительное время удерживаться в эндоплазматическом ретикулуме, избегая встраивания в цитоплазматическую мембрану В результате, в нейронах обнаруживается большой пул свободных NR1-субъединиц, (неассоциированных с NR2-субъединицами), что позволяет быстро регулировать численность и функциональную активность рецепторов в синапсе (Prybylowski and Wenthold, 2004) Таким образом, можно предположить, что, в проведенных нами экспериментах инкубация активированных периферических лимфоцитов с агонистом глутаматных рецепторов NMDA ведет к запуску процессов, приводящих либо к усилению синтеза рецепторных субъединиц, либо к активации процессов их экстернализации и сборки функционально активных рецепторов

Несмотря на то, что механизмы, лежащие в основе наблюдаемого феномена, требуют дальнейшего изучения, проведенное исследование показывает, что существует положительная обратная связь между воздействием NMDA на периферические лимфоциты и экспрессией клетками рецепторов к этому лиганду, что может служить свидетельством вовлечения глутаматных рецепторов NMDA-класса в регуляцию процессов клеточной активации

выводы

1 Инкубация лимфоцитов периферической крови человека с агонистом ионотропных глутаматных рецепторов М-метил-Э-аспартатом (в диапазоне концентраций 0,1-1 мМ) приводит к усилению люминол-индуцируемой хемшпоминесценции клеточной суспензии, что свидетельствует о повышении уровня продукции свободнорадикальных соединений этими клетками Этот эффект снимается при одновременной инкубации клеток в присутствии ЫМБА и его антагониста МК-801

2 Анализ лимфоцитов методом проточной цитометрии показал изменение параметров светорассеяния клеток, а также увеличение уровня внутриклеточных АФК в результате инкубации с ИМБА, что свидетельствует об изменении метаболического состояния клеток

3 Показано, что в лимфоцитах человека экспрессируется мРНК к облигатной субъединице N111

4 Антитела, специфичные к внеклеточному домену ММБА-рецептора, связываются с клеточной поверхностью лимфоцитов человека, что свидетельствует об экспрессии рецепторного белка на лимфоцитарной мембране

5 Показано, что экспрессия >ГО.1-субъединицы №ИЮА-рецептора в лимфоцитах человека, активированных ФГА, увеличивается в результате инкубации с >1МБА

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Тюлина ОВ, Бычкова О.Н., Прокопьева ВД, Болдырев А А Гистидинсодержащие дипептиды и форменные элементы крови // Проблемы гематологии, 2002, 4, с 53-63

2 Тунева Е О, Бычкова О.Н., Болдырев А А Влияние NMDA на продукцию активных форм кислорода лимфоцитами человека // Бюлл. эксп биол мед, 2003, т 36, №8, с 184-186

3. Бычкова О.Н. Влияние NMDA на образование свободных радикалов в лимфоцитах человека // В книге «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии», Украина, Крым, 2005, с 260-262

4 Boldyrev А А, Bulygma Е R, Davydova O.N., Mashkina А Р, Vladychenskaya ЕА Tyulma OV Functional role of glutamate receptors of NMD A-class m immune system //Neurosa Res, 2006, Vol 55 (Suppl 1), p 67

5 Болдырев A A, Давыдова O.H., Машкина А П Глутаматные рецепторы и регуляция окислительного стресса в нервной и иммунной системах XX съезд физиологического общества им И П Павлова, M 2007, в печати

Давыдова Ольга Николаевна (Российская Федерация) «Исследование NMDA-рецепторов лимфоцитов человека» В работе охарактеризовано влияние агониста глутаматных рецепторов NMDA-класса, N-метил-О-аспартата, на лимфоциты периферической крови человека Показано, что NMDA вызывает усиление люминол-зависимой хемилюминесценции суспензии клеток, а антагонист NMDA-рецепторов МК-801 ингибирует этот эффект Методом проточной цитометрии продемонстрировано увеличение внутриклеточного уровня активных форм кислорода в лимфоцитах в присутствии NMDA, свидетельствующее об активации этих клеток Методом ОТ-ПЦР была показана экспрессия в лимфоцитах периферической крови человека мРНК, кодирующей белковую субъединицу NR1 NMDA-рецепторного комплекса, синтез которой необходим для формирования функционально активного рецепторного комплекса При помощи иммунофлуоресцентного окрашивания обнаружено, что около 5% нативных лимфоцитов периферической крови связывают антитела, специфичные к внешнему домену субъединицы NR1 NMDA-рецептора Экспрессия данного антигена на лимфоцитарной мембране возрастает при инкубации ФГА-стимулированных клеток в присутствии 0,5 мМ NMDA (до 90% после 72 ч инкубации), а антагонист NMDA-рецепторов МК-801 полностью ингибирует наблюдаемый эффект Полученные данные свидетельствуют о том, что NMDA-рецепторы участвуют в регуляции функционального состояния лимфоцитов, и их активация лигандами глутамата приводит к усилению экспрессии глутаматных рецепторов NMDA-класса в активированных клетках

Davydova Olga Nikolaevna (Russian Federation) "Characterization of NMDA-receptors in human lymphocytes» Effect of glutamate agonist, N-methyl-D-aspartic acid, NMDA on human peripheral blood lynihocytes was studied NMDA was found to induce lummal-dependent chemilummescence of lymphocyte suspension and NMDA antagonist, MK-801 suppressed this action Using flow cytometric analysis, increase m intracellular level of reactive oxygen species was demonstrated in lymphocytes activated by NMDA RT-PCR technique was used to monitor in human peripheral blood lymphocytes an mRNA coding the NR1 protein subumt of NMDA receptor complex, which formation is necessary to form functionally active receptor Immunofluorescent test was used to show that about 5% of native lymphocytes bind the antibodies to outer domain of NR1 subunit of NMDA receptor After activation of the cells with phytohemagglutimn, PHA in the presence of 05 mM NMDA, amount of NMDA-positive cells is increased (till 90% after 72 hrs incubation) and MK-801 totally prevented this effect The data presented demonstrate that NMDA-receptors in lymphocytes regulate their immune function and incubation of PHA-activated lymphocytes with glutamate agonists elevates an expression of glutamate receptors of NMDA-class

Подписано в печать 12 04 2007 г Исполнено 13 04 2007 г Печать трафаретная

Заказ № 292 Тираж 100 экз

Типография «И-й ФОРМА Г» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (495) 975-78-56 www autoreferat га

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Давыдова, Ольга Николаевна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава I. Взаимосвязь иммунной и нервной систем.

1.1. Взаимная регуляция иммунной и нервной систем.

1.1.1. Нервная регуляция иммунной системы.

1.1.2. Иммунная регуляция нервной системы.

1.1.3. Нейровоспаление.

I.2 Глутамат в иммунной системе.

И. Распространение и функции глутаматных рецепторов в организме.

II.1. Глутаматные рецепторы в мозге.

11.1.1. Классификация глутаматных рецепторов.

11.1.2. Взаимодействие глутаматных рецепторов разных классов.

II. 1.3. Экзайтотксичностъ.

II.2. Глутаматные рецепторы в периферических тканях и органах.

Н.Э. Глутаматные рецепторы при неопластических процессах.

II.4. Глутаматные рецепторы лимфоцитов.

III. NMDA-рецептор: структура и функции.

III.1. Структура NMDA-рецептора: субъединичный состав и лигандная специфичность.

Ш.2.Регуляция функционирования рецепторов.

Ш.2.1. Десенсибилизация.

III.2.2. Фосфорилирование.

III.2.3. Встраивание в мембрану и формирование функционально активного рецепторного комплекса.

IV. Механизмы клеточной активации.

IV.1. Общие представления о механизмах клеточной активации.

IV.2. АФК и их участие в механизмах сигнальной трансдукции.

IV.2.1. АФК, источники их образования в организме, система антиоксидантной защиты.

IV.2.2. Биологическая роль АФК и участие в сигнальной трансдукции.

IV.3. Активация лимфоцитов.

IV.3.1 Роль кальция в активации лимфоцитов.

IV.3.2. Участие АФК в активации лимфоцитов.

IV.4. NMDA-рецептор и механизмы внутриклеточной сигнализации.

Цель и задачи исследования.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Положения, выносимые на защиту.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

I. Материалы и методы исследования.

1.1. Получение клеточных препаратов.

1.1.1. Получение ткани мозжечка крыс и выделение гранулярных клеток.

1.1.2. Отбор крови.

1.1.3 Выделение лимфоцитов.

1.1.4. Первичная культура периферических лимфоцитов.

1.2. Определение уровня свободных радикалов хемилюминесцентным методом.

1.3. Проточная цитометрия.

1.3.1. Принцип метода проточной цитометрии.

1,3.2.Определение внутриклеточного уровня АФК.

ЬЗ.З.Определение доли мертвых клеток.

1.3.4.0пределение доли апоптотических клеток.

1.3.5.Иммунофенотипировани е.

1.3.6.0пределение экспрессии NRl-субъединицы.

1.4. Определение экспрессии гена GRIN1.

1.4.1. Дизайн праймеров для полимеразной цепной реакции.

1.4.2. Выделение РНК и обратная транскрипция.

1.4.3. Полимеразная цепная реакция.

1.5. Статистическая обработка данных

II. Результаты исследования и их обсуждение.

11.1. Влияние NMDA на хемилюминесценцию суспензии лимфоцитов периферической крови человека.

11.2. Исследование действия NMDA на функциональное состояние лимфоцитов методом проточной цитометрии.

11.3. Определение экспрессии мРНК к NR1 субъединице NMDA-рецепторного комплекса.

11.4. Определение экспрессии субъединицы NR1 NMDA-рецепторного комплекса на поверхности лимфоцитов.

11.4.1. Окраска клеток политональными антителами (ab6483) kNRI-субъединице.

11.4.2. Окраска клеток моноклональными антителами (GTX30182) к NR1-су&ъединице.

11.4.3. Изменение экспрессии NR1 в результате инкубации клеток с NMDA.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование NMDA-рецепторов лимфоцитов человека"

В современном естествознании сложилось устойчивое представление о взаимосвязи нервной и иммунной систем, совместную работу которых можно рассматривать как единый защитный механизм, обеспечивающий адаптационные реакции организма. Показано, что клетки иммунной системы человека экспрессируют ряд рецепторов, чувствительных к нейромедиаторам, что позволяет им воспринимать информацию, получаемую от клеток нервной системы. В частности, известно, что в поддержании гомеостаза лимфоцитов важную роль играет глутаминовая кислота, однако механизмы, опосредующие ее действие на клетки белой крови, до сих пор недостаточно изучены.

Необходимым условием для понимания процессов, лежащих в основе «диалога» между нервной и иммунной системами как в норме, так и при патологии, является изучение тонких механизмов их взаимодействия на клеточном и молекулярном уровнях. Проблема регуляции межклеточных взаимодействий такого рода до сих пор остается открытой, поэтому актуальность проведения подобных исследований трудно переоценить. Возможно, выяснение регуляторных взаимосвязей между нервной и иммунной системами позволит выявить новые подходы в лечении ряда заболеваний. В первую очередь это относится к патологическим состояниям, характеризующимся воспалительными процессами в ЦНС, в частности, ишемии головного мозга, рассеянному склерозу, болезни Альцгеймера и другим патологиям, протекающим на фоне выраженного окислительного стресса.

Общей чертой в развитии таких заболеваний является значительное повышение уровня глутаминовой кислоты, что приводит к нейрональной смерти вследствие развития экзайтоксических механизмов. Поскольку в процессе нейровоспаления активированные клетки белой крови проникают в ткани мозга, оказывая на них повреждающее воздействие, исследование механизмов воздействия глутаминовой кислоты на лимфоциты и другие клетки иммунной системы может способствовать лучшему пониманию патогенеза воспаления нервной ткани.

С другой стороны, уровень глутаминовой кислоты в плазме крови существенно повышается у больных с опухолевыми заболеваниями. Известно, что это коррелирует с подавлением иммунной системы, в частности, со снижением числа лимфоцитов и подавлением их функциональной активности, однако механизмы, обусловливающие эти эффекты, еще не исследованы.

В связи с вышесказанным, изучение способов воздействия глутаминовой кислоты на клетки иммунной системы представляется весьма актуальной проблемой как для теоретической, так и для практической медицины.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Давыдова, Ольга Николаевна

выводы

1. Инкубация лимфоцитов периферической крови человека с агонистом ионотропных глутаматных рецепторов Ы-метил-О-аспартатом (в диапазоне концентраций 0,1-1 мМ) приводит к усилению люминол-индуцируемой хемилюминесценции клеточной суспензии, что свидетельствует о повышении уровня продукции свободнорадикальных соединений этими клетками. Этот эффект снимается при одновременной инкубации клеток в присутствии NMDA и его антагониста МК-801.

2. Анализ лимфоцитов методом проточной цитометрии показал изменение параметров светорассеяния клеток, а также увеличение уровня внутриклеточных АФК в результате инкубации с NMDA, что свидетельствует об изменении метаболического состояния клеток.

3. Показано, что в лимфоцитах человека экспрессируется мРНК к облигатной субъединице NR1 NMDA-рецептора.

4. Антитела, специфичные к внеклеточному домену NMDA-рецептора, связываются с клеточной поверхностью лимфоцитов человека, что свидетельствует об экспрессии рецепторного белка на лимфоцитарной мембране.

5. Показано, что экспрессия NRl-субъединицы NMDA-рецептора в лимфоцитах человека, активированных ФГА, увеличивается в присутствии NMDA.

Благодарности

Выражаю искреннюю благодарность всем сотрудникам лаборатории нейрохимии Института неврологии РАМН, а также сотрудникам кафедры биохимии животных биологического факультета МГУ, за их доброжелательное отношение и участие в обсуждении данной работы: А.А. Болдыреву, C.JI. Стволинскому, О.В. Тюлиной, Т.Н.Федоровой, Е.Р. Булыгиной. Особую благодарность я приношу коллегам, принимавшим совместное участие в экспериментах по исследованию экспрессии NMDA-рецепторов: А.П. Машкиной, А.Н. Пеговой.

Я очень благодарна своему научному руководителю А.А. Болдыреву за руководство, внимание и терпение, проявленные по отношению ко мне за время проведения данной работы, за полученную мною возможность участвовать в интересном, поисковом по своей сути исследовании и преобретенный ценный экспериментальный опыт.

Также я хочу поблагодарить всех, без чьей дружеской заботы и поддержки данная работа не могла бы состояться - моих друзей, а также самых родных и близких мне людей: родителей, мужа и мою дочку, за то, что благодаря их помощи и терпению у меня была возможность осуществить эту работу.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Глутаматные ионотропные рецепторы NMDA-клаеса представляют собой ионные каналы, для активации которых, помимо связывания лигандов, необходима частичная деполяризация плазматической мембраны для снятия блока канала, создаваемого ионами магния. Проницаемость NMDA-рецепторов для ионов кальция, а также замедленная кинетика активации лежат в основе способности данного вида рецепторов участвовать не только в передаче, но и в модуляции возбуждающих потенциалов, и изменении метаболизма нейрональной клетки. Несмотря на то, что NMDA-рецепторы традиционно рассматривались как компонент нервной ткани, исследования последних лет обнаружили их экспрессию в периферических тканях и органах, где их функции пока мало изучены.

В представленной работе приведены разносторонние доказательства экспрессии NMDA-рецепторов в лимфоцитах периферической крови человека, и показано их участие в процессах клеточной активации.

Мы показали, что под действием NMDA наблюдается усиление люминол-зависимой люминесценции суспензии периферических мононуклеаров крови человека, что свидетельствует об усилении продукции свободнорадикальных соединений этими клетками. Данный эффект был дозо-зависимым и специфичным, поскольку снимался в присутствии антагониста NMDA-рецепторов МК-801. Характерное время начала усиления люминесценции клеток под действием NMDA составляло 30 мин, после чего наблюдалось плавное нарастание интенсивности сигнала. На основании данной части исследования мы сделали вывод об активации периферических мононуклеаров под действием NMDA.

Для того чтобы более детально охарактеризовать влияние NMDA на лимфоциты, мы провели исследование с применением метода проточной цитометрии ряда клеточных характеристик. Оказалось, что получасовая инкубация с NMDA приводит к изменению размера и гранулярности лимфоцитов, а также росту АФК в клетках, о чем судили по увеличению флуоресценции внутриклеточного красителя дихлордигидрофлуоресцеина, являющегося маркером АФК. Полученные результаты подтверждают предположение об активации лимфоцитов под действием NMDA. При этом усиление продукции активных метаболитов кислорода лимфоцитами может рассматриваться как критерий их активации.

Для определения молекулярных механизмов, обеспечивающих действие NMDA, мы решили провести анализ экспрессии NMDA-рецепторов в лимфоцитах как на уровне мРНК, так и на уровне белка. Следует отметить, что на момент проведения наших исследований в литературе не было опубликовано прямых данных об экспрессии NMDA-рецепторов в лимфоидных клетках.

Для определения экспрессии мРНК, кодирующей облигатную субъединицу NR1 NMDA-рецептора в лимфоцитах, были подобраны последовательности нуклеотидных праймеров, специфичные определенному участку последовательности мРНК NR1. С данными праймерами была проведена полимеразная цепная реакция (ПЦР) на матрице ДНК, полученной при обратной транскрипции РНК, выделенной из лимфоцитов периферической крови человека. Эксперимент показал экспрессию NR1 в исследуемых клетках.

Исследования экспрессии белка NMDA-рецепторного комплекса на поверхности лимфоцитов человека проводили с использованием метода непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания антителами, специфичными к внеклеточному домену NR1-субъединицы рецептора. В результате проведенного исследования выяснилось, что около 5% популяции периферических лимфоцитов человека связывают данные антитела, что свидетельствует об экспрессии NR1-субъединицы этими клетками.

Для того, чтобы понять, изменяется ли процент NR1 -позитивных клеток в процессе клеточной активации, мы инкубировали клетки в течение 72 ч с растительным лектином ФГА, и обнаружили, что при совместной инкубации с 0,5 мМ NMDA в стимулированных лимфоцитах уровень экспрессии NR1 на клеточной поверхности увеличивается с 5 до 90%, в то время как сама по себе инкубация только с NMDA или только с ФГА не изменяет числа NR1 -позитивных клеток.

Таким образом, в описанном эксперименте наблюдается положительная обратная связь между воздействием NMDA на лимфоциты и экспрессией клетками NMDA-рецепторов. Внесение МК-801 в среду инкубации препятствовало росту числа NR1-позитивных клеток, что доказывает специфичность действия NMDA. Полученные данные свидетельствуют об участии NMDA-рецепторов в процессах активации лимфоцитов, поскольку увеличение поверхностной экспрессии рецепторов, способствующих клеточной активации, может служить механизмом усиления ответа клетки на начальный стимул.

Результаты проведенного исследования расширяют представления о молекулярных механизмах воздействия глутамата на лимфоциты, что важно для понимания роли этого медиатора в иммунной системе. Полученные данные могут послужить основой для дальнейшего изучения функции и механизмов действия NMDA-рецепторов в клетках иммунной системы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Давыдова, Ольга Николаевна, Москва

1. Болдырев А.А. Функциональные взаимодействия между глутаматными рецепторами разных классов. //Бюлл. эксп. биол. мед. 2000; 130(7):823-829.

2. Владимиров Ю.А. Активированная хемилюминесценция и биолюминесценция как инструмент в медико-биологических исследованиях. //Соросовский образовательный журнал 2001; 7(1):16-23.

3. Гибанова Н.В., Ракитина Т.В., Жохов С.С., и др. I-глутаминовая кислота модулирует цитотоксический эффект фактора некроза опухоли в клетках линии HL-60. //Биоорганическая химия 2005; 31(6):602-608.

4. Дамбинова С.А., Изыкенова Г.А. Аутоантитела к глутаматным рецепторам -маркеры функционального повреждения мозга. Диагностическое значение при определении пароксизмальной активности и ишемии. //Журнал высш. нервн. деят. 1997; 47(2):439-446.

5. Даньшина П.В., Шмальгаузен Е.В., Арутюнов Д.Ю. и др. Ускорение гликолиза нефосфорилирующей и окисленной фосфорилирующей глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназами. //Биохимия 2003; 68:725-733.

6. Зинченко В.П., Долгачева Л.П. Внутриклеточная сигнализация. //Электронное издательство "Аналитическая микроскопия", Пущино, 2003.

7. Костанян И.А., Наволоцкая Е.В., Нуриева Р.И. и др. Взаимодействие L-глутаминовой кислоты с Т-лимфоцитами человека. //Биоорганическая химия 1997; 23(10):805-808.

8. Крыжановский Г.Н., Магаева С.В., Макаров С.В., Сепиашвили Р.И. Нейроиммунопатология. Руководство. //М.: Изд-во НИИ общей патологии и патофизиологии, 2003. -438 с.

9. Полетаев А.Б., Морозов С.Г., Ковалев И.Е. Регуляторная метасистема: Иммунонейроэндокринная регуляция гомеостаза. //М.: Медицина, 2002. -168 с.

10. Рассанов С.П., Маянский А.Н., Чеботарь И.В. Хемилюминесценция лимфоцитов человека в процессе стимуляции фитогемагглютинином. //Журн. микробиол. иммунобиол. 1987; 5:.64-67.

11. Сорокина Е.Г., Сторожевых Т.П., Сенилова Я.Е. и др. Действие антител к АМРА-рецепторам глутамата на нейроны мозга в первичных культурах мозжечка и гиппокампа. //Бюлл. эксп. биол. мед. 2006; 142(7):59-62.

12. Abe М.К., Kartha S., Karpova A.Y., et. al. Hydrogen peroxide activates extracellular signal-regulated kinase via protein kinase C, Raf-1, and MEK1. //Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 1998; 18(4):562-569.

13. Acuto 0., Cantrell D. T cell activation and the cytoskeleton. //Annu. Rev. Immunol. 2000; 18:165-184.

14. Ader R., Felten D., Cohen N. Interactions between the brain and the immune system. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1990; 30:561-602.

15. Ali D.W., Salter M.W. NMDA receptor regulation by Src kinase signalling in excitatory synaptic transmission and plasticity. //Curr. Opin. Neurobiol. 2001; 11(3):336-342.

16. Andersson O., Stenqvist A., Attersand A., von Euler G. Nucleotide sequence, genomic organization, and chromosomal localization of genes encoding the human NMDA receptor subunits NR3A and NR3B. //Genomics. 2001; 78(3): 178-184.

17. Armstrong J.S., Steinauer K.K., Hornung В., et al. Role of glutathione depletion and reactive oxygen species generation in apoptotic signaling in a human В lymphoma cell line. //Cell Death Differ. 2002; 9(3):252-263.

18. Balazs R., Jorgensen O.S., Hack N. N-methyl-D-aspartate promotes the survival of cerebellar granule cells in culture. //Neuroscience. 1988; 27(2):437-451.

19. Banfi В., Molnar G., Maturana A, et. al., A Ca(2+)-activated NADPH oxidase in testis, spleen, and lymph nodes. //J. Biol. Chem. 2001; 276(40):37594-37601.

20. Beal M.F. Aging, energy, and oxidative stress in neurodegenerative diseases. //Ann. Neurol. 1995; 38(3):357-366.

21. Bertrand G, Gross R., Puech M.M., et al. Evidence for a glutamate receptor of the AMPA subtype which mediates insulin release from rat perfused pancreas. //Br. J. Pharmacol. 1992;106(2):354-359.

22. Bhave S.V., Ghoda L., Hoffman P.L. Brain-derived neurotrophic factor mediates the anti-apoptotic effect of NMDA in cerebellar granule neurons: signal transduction cascades and site of ethanol action. //J. Neurosci. 1999; 19(9):3277-3286.

23. Bishopric N.H., Cohen H.J., Lefkowitz R.J. Beta adrenergic receptors in lymphocyte subpopulations. //J. Allergy Clin. Immunol. 1980; 65(l):29-33.

24. Blalock J.E. The immune system as the sixth sense. //J Intern Med. 2005; 257(2): 126138.

25. Bliss Т.V., Collingridge G.L. A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. //Nature. 1993; 361(6407):31-39.

26. Blondeau N., Widmann C., Lazdunski M., and Heurteaux C. Activation of the nuclear factor-kappaB is a key event in brain tolerance. //J. Neurosci. 2001;21(13):4668-4677.

27. Boeck C.R., Ganzella M., Lottermann A., and Vendite D. NMDA preconditioning protects against seizures and hippocampal neurotoxicity induced by quinolinic acid in mice. //Epilepsia. 2004;45(7):745-750.

28. Boldyrev A.A, Kazey V.I., Leinsoo T.A., et. al., Rodent lymphocytes express functionally active glutamate receptors. //Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004; 324(1): 133139.

29. Boldyrev A.A., Carpenter D.O., Johnson P. Emerging evidence for a similar role of glutamate receptors in the nervous and immune systems. //J. Neurochem. 2005; 95(4):913-918.

30. Boveris A. Determination of the production of superoxide radicals and hydrogen peroxide in mitochondria. //Methods Enzymol. 1984; V.105,429-435.

31. Boyum A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood.// Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 1968; 97:77-89.

32. Cahalan M.D., Wulff H., Chandy K.G. Molecular properties and physiological roles of ion channels in the immune system. //J. Clin. Immunol. 2001; 21(4):235-252.

33. Carroll R.C., Zukin R.S. NMDA-receptor trafficking and targeting: implications for synaptic transmission and plasticity. //Trends Neurosci. 2002; 25(11):571-577.

34. Celli A., Treves C., Nassi P. & Stio M. (1999). //Role of 1,25-dihydroxyvitamin D3 and extracellular calcium in the regulation of proliferation in cultured SH-SY5Y human neuroblastoma cells Neurochem. Res. 24; 691-698.

35. Chance В., Sies H., and Boveris A. Hydroperoxide metabolism in mammalian organs// Physiol. Rev. 1979; 59(3):527-605.

36. Chatterton J.E., Awobuluyi M., Premkumar L.S., et al. Excitatory glycine receptors containing the NR3 family of NMDA receptor subunits. //Nature. 2002; 415(6873):793-798.

37. Chen L., Huang L.Y. Protein kinase С reduces Mg2+ block of NMDA-receptor channels as a mechanism of modulation. //Nature. 1992; 356(6369):521-523.

38. Chenu C., Serre C.M., Raynal C., et al. Glutamate receptors are expressed by bone cells and are involved in bone resorption. //Bone. 1998; 22(4):295-299.

39. Choi D.W., Rothman S.M. The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death. //Annu. Rev. Neurosci. 1990; 13:171-182.

40. Choi S.W., Park S.Y, Hong S.P. et al. The expression of NMDA receptor 1 is associated with clinicopathological parameters and prognosis in the oral squamous cell carcinoma. //J. Oral. Pathol. Med. 2004; 33(9):533-537.

41. Crabtree G.R. Calcium, calcineurin, and the control of transcription. //J. Biol. Chem. 2001; 276(4):2313-2316.

42. Craig A.M., Banker G. Neuronal polarity. //Annu. Rev. Neurosci. 1994; 17:267-310.

43. Cross A.R., Jones O.T. Enzymic mechanisms of superoxide production. //Biochim. Biophys. Acta. 1991; 1057(3):281-298.

44. Crump F.T., Dillman K.S., Craig A.M. cAMP-dependent protein kinase mediates activity-regulated synaptic targeting of NMDA receptors. //J. Neurosci. 2001; 21(14):5079-5088.

45. Cui X.L., Douglas J.G. Arachidonic acid activates c-jun N-terminal kinase through NADPH oxidase in rabbit proximal tubular epithelial cells. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997; 94(8):3771-6.

46. Cull-Candy S., Brickley S., Farrant M. NMDA receptor subunits: diversity, development and disease. //Curr. Opin. Neurobiol. 2001; 11(3):327-35.

47. Dambinova S.A., Izykenova G.A., Burov S.V., et al. The presence of autoantibodies to N-terminus domain of GluRl subunit of AMP A receptor in the blood serum of patients with epilepsy. //J. Neurol Sci. 1997; 152(l):93-97.

48. Dambinova S.A., Khounteev G.A., Izykenova G.A., et al. Blood test detecting autoantibodies to N-methyl-D-aspartate neuroreceptors for evaluation of patients with transient ischemic attack and stroke. //Clin. Chem. 2003; 49(10): 1752-1762.

49. Danysz W., Parsons C.G. Glycine and N-methyl-D-aspartate receptors: physiological significance and possible therapeutic applications. //Pharmacol Rev. 1998; 50(4):597-664.

50. Danshina P.V., Schmalhausen E.V., Avetisyan A.V. and Muronetz V.I. Mildly oxidized glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase as a possible regulator of glycolysis. //IUBMB Life. 2001;51(5):309-314.

51. Delgado M., Pozo D., Ganea D. The significance of vasoactive intestinal peptide in immunomodulation. //Pharmacol. Rev. 2004; 56(2):249-290.

52. Dickman K.G., Youssef J.G., Mathew S.M. and Said S.I. Ionotropic glutamate receptors in lungs and airways: molecular basis for glutamate toxicity. //Am. J. Respir. Cell Mol Biol. 2004; 30(2): 139-144.

53. Dingledine R., Borges K., Bowie D and Traynelis S.F. The glutamate receptor ion channels. // Pharmacol. Rev. 1999; 51(1):7-61.

54. D'Onofrio M., de Grazia U., Morrone S., Cuomo L., Spinsanti P., Frati L., Gulino A., Ragona G. Expression of neurotrophin receptors in normal and malignant В lymphocytes. //Eur. Cytokine Netw. 2000; 11(2):283-291.

55. Droge W. Free radicals in the physiological control of cell function. //Physiol. Rev. 2002; 82(l):47-95.

56. Droge W., Eck H.P., Betzler M., et al. Plasma glutamate concentration and lymphocyte activity. // J. Cancer Res. Clin. Oncol. 1988; 114(2): 124-128.

57. Eck H.P., Frey H., Droge W. Elevated plasma glutamate concentrations in HIV-1-infected patients may contribute to loss of macrophage and lymphocyte functions. //Int. Immunol. 1989; l(4):367-372.

58. Eck H.P., Mertens Т., Rosokat H., et al., T4+ cell numbers are correlated with plasma glutamate and cystine levels: association of hyperglutamataemia with immunodeficiency in diseases with different aetiologies. //Int. Immunol. 1992; 4(1):7-13.

59. Ekejindu G.O., Shifrine M., Misra H.P. Chemiluminescence of canine peripheral blood lymphocytes stimulated by mitogens, //Vet. Immunol. Immunopathol. 1986;11(2):175-192.

60. Eriksson M., Nilsson A., Froelich-Fabre S., et al. Cloning and expression of the human N-methyl-D-aspartate receptor subunit NR3A.//Neurosci. Lett. 2002; 321(3):177-181.

61. Espinosa L., Itzstein C., Cheynel H., et al. Active NMDA glutamate receptors are expressed by mammalian osteoclasts. //J. Physiol. 1999; 518 (Pt l):47-53.

62. Fanger C.M., Rauer H., Neben A.L., et al. Calcium-activated potassium channels sustain calcium signaling in T lymphocytes. Selective blockers and manipulated channel expression levels. //J. Biol. Chem. 2001; 276(15): 12249-12256.

63. Finkel Т., Gutkind J.S. Signal transduction and human disease, John Wiley&Sons, Inc., Hoboken, New Jersey, 2003.

64. Fiorica-Howells E., Gambale F., Horn R., et. al., Phencyclidine blocks voltage-dependent potassium currents in murine thymocytes. //J. Pharmacol. Exp. Ther. 1990; 252(2):610-615.

65. Fischer E.H., Charbonneau H., Tonks N.K. Protein tyrosine phosphatases: a diverse family of intracellular and transmembrane enzymes. //Science. 1991; 253(5018):401-406.

66. Flanagan W.M., Corthesy В., Bram R.J., &Crabtree G.R. Nuclear association of a T-cell transcription factor blocked by FK-506 and cyclosporin A. //Nature. 1991; 352(6338):803-807.

67. Franconi F., Miceli M., De Montis M.G., et al. NMDA receptors play an anti-aggregating role in human platelets. //Thromb. Haemost. 1996; 76(l):84-87.

68. Franconi F., Miceli M., Alberti L. et al. Further insights into the antiaggregating activity of NMDA in human platelets. // Br. J. Pharmacol. 1998; 124(l):35-40.

69. Freeman B.A., Crapo J.D. Biology of disease: free radicals and tissue injury. //Lab. Invest. 1982; 47(5):412-426.

70. Fukunaga K., Stoppini L., Miyamoto E. and Muller D.: Long-term potentiation is associated with an increased activity of Ca2+/ calmodulin-dependent protein kinase II. // J. Biol. Chem. 1993,268:7863-7867.

71. Galant S.P., Remo R.A. Beta-adrenergic inhibition of human T lymphocyte rosettes. //J. Immunol. 1975 Jan; 114(1 Pt 2):512-513.

72. Gardner P. Calcium and T lymphocyte activation. //Cell. 1989; 59:15-20.

73. Gaveriaux C., Peluco J., Simonin F., et al. Identification of kappa- and delta-opioid receptors transcripts in immune cells. // FEBS Lett. 1995; 369:272-276.

74. Genever P.G., Wilkinson D.J., Patton, A.J., et al. Expression of a functional N-methyl-D-aspartate-type glutamate receptor by bone marrow megakaryocytes. //Blood. 1999; 93(9):2876-2883.

75. Genever P.G., Skerry T.M. Regulation of spontaneous glutamate release activity in osteoblastic cells and its role in differentiation and survival: evidence for intrinsic glutamatergic signaling in bone. //FASEB J. 2001; 15(9): 1586-1588.

76. Gerber G., Kangrga I., Ryu P.D., et. al., Multiple effects of phorbol esters in the rat spinal dorsal horn. //J. Neurosci. 1989; 9(10):3606-3617.

77. Ghanshani S., Wulff H., Miller M.J., et al. Up-regulation of the IKCal potassium channel during T-cell activation. Molecular mechanism and functional consequences. //J. Biol. Chem. 2000; 275(47):37137-37149.

78. Gill S.S., Pulido O.M., Mueller R.W. and McGuire P.F. Molecular and immunochemical characterization of the ionotropic glutamate receptors in the rat heart. //Brain. Res. Bull. 1998;46(5):429-434.

79. Gill S.S., Pulido O.M., Mueller R.W. & MeGuire P.F. Immunochemical localization of the metabotropic glutamate receptors in the rat heart. //Brain. Res. Bull. 1999; 48(2): 143-146.

80. Gill S.S., Mueller R.W., MeGuire P.F. and Pulido O.M. Potential target sites in peripheral tissues for excitatory neurotransmission and excitotoxicity. //Toxicol Pathol. 2000; 28(2):277-284.

81. Gill S.S., Pulido O.M. Glutamate receptors in peripheral tissues: current knowledge, future research, and implications for toxicology. //Toxicol. Pathol. 2001; 29(2):208-223.

82. Goldman R., Ferber E., Zort U. Reactive oxygen species are involved in the activation of cellular phospholipase A2.//FEBS Lett. 1992; 309(2): 190-192.

83. Gonzalez M.P., Herrero M.T., Vicente S., and Oset-Gasque M.J. Effect of glutamate receptor agonists on catecholamine secretion in bovine chromaffin cells. //Neuroendocrinology. 1998; 67(3):181-189.

84. Gordon M.A., Cohen J.J., Wilson I.B. Muscarinic cholinergic receptors in murine lymphocytes: demonstration by direct binding. //PNAS. 1978; 75(6):2902-2904.

85. Grant S.G. Synapse signalling complexes and networks: machines underlying cognition. //Bioessays. 2003; 25(12):1229-1235.

86. Griendling K.K., Sorescu D., Ushio-Fukai M. NAD(P)H oxidase: role in cardiovascular biology and disease. //Circ. Res. 2000b; 86(5):494-501.

87. Griendling K.K., Ushio-Fukai M. Redox control of vascular smooth muscle proliferation. III. Lab. Clin. Med. 1998; 132(1):9-15.

88. Grimwood S., Lebourdelles В., Whiting P.J. Recombinant human NMDA homomeric NR1 receptors expressed in mammalian cells form a high-affinity glycine antagonist binding site. //J. Neurochem. 1995; 64(2):525-530.

89. Gu Y., Publicover S.J. Expression of functional metabotropic glutamate receptors in primary cultured rat osteoblasts. Cross-talk with N-methyl-D-aspartate receptors. //J. Biol. Chem. 2000; 275(44):34252-34259.

90. Gu Y., Genever P.G., Skerry T.M., et al. The NMDA type glutamate receptors expressed by primary rat osteoblasts have the same electrophysiological characteristics as neuronal receptors. //Calcif. Tissue Int. 2002; 70(3): 194-203.

91. Gurd J.W. Protein tyrosine phosphorylation: Implications for synaptic function. //Neurochem. Int. 1997; 31(5):635-649.

92. Gushchin G.V., Jakovleva E.E., Kataeva G.V., Korneva E.A., Gajewski M., Grabczewska E. Muscarinic cholinergic receptors of rat lymphocytes: effect of antigen stimulation and local brain lesion. //Neuroimmunomodulation. 1994; l(4):259-264.

93. Haddad J.J. N-methyl-D-aspartate (NMDA) and the regulation of mitogen-activated protein kinase (МАРК) signaling pathways: a revolving neurochemical axis for therapeutic intervention?//Prog. Neurobiol. 2005; 77(4):252-282.

94. Halliwell В., Getteridge J.M.C. Free radicals, antioxidants and human disease where we are now? // J. Lab. Clin. Med. 1992; 119(6):598-620.

95. Hartley Z., Dubinsky J.M. Changes in intracellular pH associated with glutamate excitotoxicity.//J. Neurosci. 1993; 13(ll):4690-4699.

96. Herbert T.B, Cohen S. Depression and immunity: a meta-analytic review. //Psychol Bull. 1993; 113(3):472-86.

97. Hildeman D.A., Mitchell Т., Teague Т.К., et al., Reactive oxygen species regulate activation-induced T cell apoptosis. //Immunity. 1999; 10(6):735-744.

98. Hinoi E., Fujimori S., Nakamura Y., and Yoneda Y. Group III metabotropic glutamate receptors in rat cultured calvarial osteoblasts. //Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001; 281(2):341-346.

99. Hinoi E, Fujimori S, Nakamura Y, et al. Constitutive expression of heterologous N-methyl-D-aspartate receptor subunits in rat adrenal medulla. //J. Neurosci. Res. 2002a; 68(1):36-45.

100. Hinoi E., Fujimori S., Yoneyama M., Yoneda Y. Blockade by N-methyl-D-aspartate of elevation of activator protin-1 binding after stress in rat adrenal gland. // J. Neurosci. Res. 2002b;70(2):161-171.

101. Hinoi E., Fujimori S., Yoneda Y. Modulation of cellular differentiation by N-methyl-D-aspartate receptors in osteoblasts. //FASEB J. 2003; 17(11):1532-1534.

102. Hinoi E., Takarada Т., Yoneda Y. Glutamate signaling system in bone. //J. Pharmacol. Sci. 2004a; 94(3):215-220.

103. Hinoi E., Takarada Т., Ueshima Т., et al.Glutamate signaling in peripheral tissues //Eur. J. Biochem. 2004b; 271(1):1-13.

104. Hitchcock I.S., Skerry T.M., Howard M.R. and Genever P.G. NMDA-receptor-mediated regulation of human megakaryocytopoiesis. //Blood. 2003; 102(4): 1254-1259.

105. Hollmann M., Heinemann S. Cloned glutamate receptors. //Annu. Rev. Neurosci. 1994; 17:31-108.

106. Hume D.A., Wrogemann К., Ferber E. et al. Concanavalin A-induced chemiluminescence in rat thymus lymphocytes. Its origin and role in mitogenesis. //Biochem. J. 1981; 198(3):661-667.

107. Inagaki N., Kuromi H., Gonoi Т., et al. Expression and role of ionotropic glutamate receptors in pancreatic islet cells. //FASEB J. 1995; 9(8):686-691.

108. Jackson S.H., Devadas S., Kwon J., et al. T cells express a phagocyte-type NADPH oxidase that is activated after T cell receptor stimulation. //Nat. Immunol. 2004; 5(8):818-827.

109. Jiang X., Zhu D., Okagaki P., N-methyl-D-aspartate and TrkB receptor activation in cerebellar granule cells: an in vitro model of preconditioning to stimulate intrinsic survival pathways in neurons. //Ann. N. Y. Acad. Sci. 2003; 993:134-145.

110. Jiang X., Tian F., Mearow K., et al. The excitoprotective effect of N-methyl-D-aspartate receptors is mediated by a brain-derived neurotrophic factor autocrine loop in cultured hippocampal neurons. //J. Neurochem. 2005; 94(3):713-722.

111. Kalariti N., Pissimissis N., Koutsilieris M. The glutamatergic system outside the CNS and in cancer biology. //Expert. Opin. Investig. Drugs. 2005; 14(12):1487-1496.

112. Kamata H., Hirata H. Redox regulation of cellular signalling. //Cell Signal. 1999; 11(1): 1-14.

113. Kang S.W., Chae H.Z., Seo M.S., et al. Mammalian peroxiredoxin isoforms can reduce hydrogen peroxide generated in response to growth factors and tumor necrosis factor-alpha. //J. Biol. Chem. 1998; 273(11):6297-6302.

114. Kato H., Liu Y., Araki Т., and Kogure К. MK-801, but not anisomycin, inhibits the induction of tolerance to ischemia in the gerbil hippocampus. //Neurosci. Lett. 1992; 139(1): 118121.

115. Kehrer J.P., Piper H.M., Sies H. Xanthine oxidase is not responsible for reoxygenation injury in isolated-perfused rat heart. //Free Radic. Res. Commun. 1987; 3(l-5):69-78.

116. Kemp J. A., Leeson P.D. The glycine site of the NMDA receptor-five years on. //Trends Pharmacol. Sci. 1993; 14(l):20-25.

117. Khansari N., Whitten H.D., Fudenberg H.H., Phencyclidine-induced immunodepression. //Science. 1984; 225(4657):76-78.

118. Khodorov B. Glutamate-induced deregulation of calcium homeostasis and mitochondrial dysfunction in mammalian central neurones. //Prog. Biophys. Mol. Biol. 2004; 86(2):279-351.

119. Komuro H., Rakic P. Modulation of neuronal migration by NMDA receptors. //Science. 1993; 260(5104):95-97.

120. Kostanuan I.A., Merkulova M.I., Navolotskaya E.V. and Nurieva R.I. Study of interaction between L-glutamate and human blood lymphocytes. //Immunol. Lett. 1997; 58(3), 177-180.

121. Krieger P., Hellgren-Kotaleski J., Kettunen P., et al. Interaction between metabotropic and ionotropic glutamate receptors regulates neuronal network activity. //J. Neurosci. 2000; 20(14):5382-5391.

122. Kristensen P. Differential expression of AMPA glutamate receptor mRNAs in the rat adrenal gland. //FEBS Lett. 1993; 332(1-2): 14-18.

123. Kuryatov A., Laube В., Betz H and Kuhse J. Mutational analysis of the glycine-binding site of the NMDA receptor: Structural similarity with bacterial amino acid-binding proteins. //Neuron 1994; 12(6): 1291-1300.

124. Lai J.P., Douglas S.D., Ho W.Z. Human lymphocytes express substance P and its receptor. //J. Neuroimmunol. 1998; 86(l):80-86.

125. Lan J.Y., Skeberdis V.A., Jover Т., et al. Protein kinase С modulates NMDA receptor trafficking and gating. //Nat. Neurosci. 2001; 4(4):382-390.

126. Lander H.M., Ogiste J.S., Teng K.K. and Novogrodsky A. p21ras as a common signaling target of reactive free radicals and cellular redox stress. //J. Biol. Chem. 1995; 270 (36):21195-21198.

127. Laube В., Kuryatov A., Kuhse J. and Betz H. Glycine-glutamate interactions at the NMDA receptor: role of cysteine residues. //FEBS. Lett. 1993; 335(3):331-334.

128. Lau L.F., Huganir R.L. Differential tyrosine phosphorylation of N-methyl-D-aspartate receptor subunits. //J. Biol Chem. 1995; 270(34):20036-20041.

129. Le Fur G., Phan Т., Canton Т., et al. Evidence for a coupling between dopaminergic receptors and phospholipid methylation in mouse В lymphocytes. //Life Sci. 1981; 29(26):2737-2749.

130. Lee J.R. Reactive oxygen species play roles on В cell surface receptor CD40-mediated proximal and distal signaling events: effects of an antioxidant, N-acetyl-L-cysteine treatment. //Mol. Cell Biochem. 2003; 252(1-2): 1-7.

131. Lee S.B., Bae I.H., Bae Y.S., and Um H.D. Link between mitochondria and NADPH oxidase 1 isozyme for the sustained production of reactive oxygen species and cell death. //J. Biol. Chem. 2006; 281(47):36228-36235.

132. Leonard A.S., Hell J.W. Cyclic AMP-dependent protein kinase and protein kinase С phosphorylate N-methyl-D-aspartate receptors at different sites. //J. Biol. Chem. 1997; 272(18):12107-12115.

133. Levite M., Chowers Y., Ganor Y., et al. Dopamine interacts directly with its D3 and D2 receptors on normal human T cells, and activates betal integrin function. //Eur. J. Immunol. 2001;31:3504-3512.

134. Lewis R.S. Calcium signaling mechanisms in T lymphocytes. //Annu. Rev. Immunol. 2001; 19:497-521.

135. Lieberman D.N., Mody I. Regulation of NMDA channel function by endogenous Ca2+-dependent phosphatase. //Nature. 1994; 369(6477):235-239.

136. Lin C.H., Yeh S.H., Lin C.H., et al. A role for the PI-3 kinase signaling pathway in fear conditioning and synaptic plasticity in the amygdale. //Neuron. 2001 13; 31(5):841-851.

137. Lin C.S., Boltz R.C., Blake J.T. et al. Voltage-gated potassium channels regulate calcium-dependent pathways involved in human T lymphocyte activation. Hi. Exp. Med. 1993; 177(3):637-645.

138. Lipsky R.H., Xu K., Zhu D., et al. Nuclear factor kappaB is a critical determinant in N-methyl-D-aspartate receptor-mediated neuroprotection. //J. Neurochem. 2001; 78(2):254-264.

139. Lo Y.Y, Cruz T.F. Involvement of reactive oxygen species in cytokine and growth factor induction of c-fos expression in chondrocytes. //J. Biol. Chem. 1995; 270(20): 1172711730.

140. Lombardi G., Dianzani Ch., Miglio G., et al. Characterization of ionotropic glutamate receptor in human lymphocytes. // Br. J. Pharmacol. 2001; 133(6):936-944.

141. Low C.M., Lyuboslavsky P., French A, et. al., Molecular determinants of proton-sensitive N-methyl-D-aspartate receptor gating. //Mol. Pharmacol. 2003; 63(6):1212-1222.

142. Lu Y.M, Roder J.C, Davidow J, and Salter M.W. Src activation in the induction of long-term potentiation in CA1 hippocampal neurons. //Science. 1998; 279(5355): 1363-1367.

143. Luscher C, Xia H, Beattie E.C, et al. Role of AMPA receptor cycling in synaptic transmission and plasticity. //Neuron. 1999; 24(3):649-658.

144. Lynch M.A. Long-term potentiation and memory. //Physiol Rev. 2004; 84(1):87-136.

145. Malenka R.C, Kauer J.A, Perkel D.J, et. al. An essential role for postsynaptic calmodulin and protein kinase activity in long-term potentiation. //Nature. 1989; 340(6234):554-557.

146. Manabe S., Lipton S.A. Divergent NMDA signals leading to proapoptotic and antiapoptotic pathways in the rat retina. //Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2003; 44(l):385-392.

147. Marazziti D., Ori M., Nardini M., et al. mRNA expression of serotonin receptors of type 2C and 5A in human resting lymphocytes. //Neuropsychobiology. 2001; 43(3):123-126.

148. Mardiney M.R.Jr, Bredt A.B. The immunosuppressive effect of amantadine upon the response of lymphocytes to specific antigens in vitro. //Transplantation. 1971; 12(3):183-188.

149. Marini A.M., Rabin S.J., Lipsky R.H. and Mocchetti I. Activity-dependent release of brain-derived neurotrophic factor underlies the neuroprotective effect of N-methyl-D-aspartate. //J. Biol. Chem. 1998; 273(45):29394-29399.

150. Markert M., Andrews P., Babior B. Measurements of O2' production by Human neutrophils//Methods Enzymol. 1984; 105:358-365.

151. Martino G., Hartung H.P. Immunopathogenesis of multiple sclerosis: the role of T cells. //CurrOpin Neurol. 1999; 12(3):309-321.

152. Maslinski W., Lullberg M., Nordsnrom O.and Bartfai T. Muscarinic receptors and receptor-mediated actions on rat thymocytes. //J. Neuroimmunol. 1988; 17(4):265-274.

153. Matsuda K., Fletcher M., Kamiya Y. and Yuzaki M. Specific assembly with the NMDA receptor 3B subunit controls surface expression and calcium permeability of NMDA receptors. //J. Neurosci. 2003; 23(31):10064-10073.

154. Matsuda K., Kamiya Y., Matsuda S. and Yuzaki M. Cloning and characterization of a novel NMDA receptor subunit NR3B: a dominant subunit that reduces calcium permeability. //Brain. Res. Mol. Brain Res. 2002; 100(l-2):43-52.

155. Mattson M.P., Meffert M.K. Roles for NF-kappaB in nerve cell survival, plasticity, and disease. //Cell Death Differ. 2006; 13(5):852-60.

156. Mayer M.L., Vyklicky L., Clements J. Regulation of NMDA receptor desensitization in mouse hippocampal neurons by glycine. //Nature. 1989; 338(6214):425-427.

157. McBain C.J., Mayer M.L. N-methyl-D-aspartic acid receptor structure and function. //Physiol Rev. 1994; 74(3):723-760.

158. McCormack R.J., Hart R.P., Ganea D. Expression of NK-1 receptor mRNA in murine T lymphocytes. //Neuroimmunomodulation. 1996; 3(l):35-46.

159. McKenna F., McLaughlin P.J, Lewis B.J., et al. Dopamine receptor expression on human T- and B-lymphocytes, monocytes, neutrophils, eosinophils and NK cells: a flow cytometric study. //J. Neuroimmunol. 2002; 132(l-2):34-40.

160. Meloni F., Brochieri A., Ballabio P.C., et al. Bombesin, calcium homeostasis and tumour growth. //Monaldi Arch. Chest. Dis. 1998; 53(4): 405^09.

161. Miglio G., Varsaldi F., Dianzani C., et al. Stimulation of group I metabotropic glutamate receptors evokes calcium signals and c-jun and c-fos gene expression in human T cells. //Biochem Pharmacol. 2005a; 70(2): 189-199.

162. Miglio G., Varsaldi F., Lombardi G. Human T lymphocytes express N-methyl-D-aspartate receptors functionally active in controlling T cell activation. //Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005b; 338(4):1875-1883.

163. Molnar E., Varadi A., Mcllhinney R.A., and Ashcroft S.J. Identification of functional ionotropic glutamate receptor proteins in pancreatic beta-cells and in islets of Langerhans. //FEBS Lett. 1995; 371(3):253-257.

164. Monyer H., Sprengel R., Schoepfer R., et al. Heteromeric NMDA receptors: molecular and functional distinction of subtypes. //Science. 1992; 256(5060): 1217-1221.

165. Mukheijee P.K., DeCoster M.A., Campbell F.Z. et al. Glutamate receptor signaling interplay modulates stress-sensitive mitogen-activated protein kinases and neuronal cell death. //J. Biol. Chem. 1999; 274(10):6493-6498.

166. Mustelin Т., Tasken K. Positive and negative regulation of T-cell activation through kinases and phosphatases. //Biochem. J. 2003; 371 (Pt 1): 15-27.

167. Nakamichi N., Yoneda Y. Functional proteins involved in regulation of intracellular Ca(2+) for drug development: desensitization of N-methyl-D-aspartate receptor channels. //J. Pharmacol. Sci. 2005; 97(3):348-350.

168. Nakayama Т., Kawakami H., Tanaka K. and Nakamura S. Expression of three glutamate transporter subtypes mRNA in human brain regions and peripheral tissues. //Brain Res. Mol. Brain Res. 1996; 36(1): 189-192.

169. Nathanson J.A., Chun L.L. Immunological function of the blood-cerebrospinal fluid barrier. //Proc Natl Acad Sci USA. 1989; 86(5):1684-1688.

170. Nicoletti I., Migliorati G., Pagliacci M.C., et al. A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry. //J. Immunol. Methods. 1991; 139(2):271-279.

171. Nitsch R., Pohl E.E, Smorodchenko A., et al. Direct impact of T cells on neurons revealed by two-photon microscopy in living brain tissue. //J. Neurosci. 2004; 24(10):2458-2464.

172. Noel J., Ralph G.S., Pickard L., et al. Surface expression of AMPA receptors in hippocampal neurons is regulated by an NSF-dependent mechanism. //Neuron. 1999; 23(2):365-376.

173. Ogita K., Okuda H., Yamamoto Y., et al. In vivo neuroprotective role of NMDA receptors against kainate-induced excitotoxicity in murine hippocampal pyramidal neurons. //J Neurochem. 2003; 85(5):1336-1346.

174. Ottaway C.A., Greenberg G.R. Interaction of vasoactive intestinal peptide with mouse lymphocytes: specific binding and the modulation of mitogen responses. //J. Immunol. 1984; 132(1):417-423.

175. Ottaway C.A., Lay Т.Е., Greenberg G.R. High affinity specific binding of vasoactive intestinal peptide to human circulating T cells, В cells and large granular lymphocytes. //J. Neuroimmunol. 1990; 29(1-3): 149-155.

176. Ovadia H., Abramsky О. Dopamine receptors on isolated membranes of rat lymphocytes. //J. Neurosci Res. 1987; 18(l):70-74.

177. Pacheco R., Ciruela F., Casado V. et. al. Group I metabotropic glutamate receptors mediate a dual role of glutamate in T cell activation. III. Biol. Chem. 2004; 279(32):33352-33358.

178. Pani G., Colavitti R., Borrello S., and Galeotti T. Endogenous oxygen radicals modulate protein tyrosine phosphorylation and JNK-1 activation in lectin-stimulated thymocytes. //Biochem J. 2000; 347 Pt 1:173-181.

179. Papadia S., Stevenson P., Hardingham N.R. et al. Nuclear Ca2+ and the cAMP response element-binding protein family mediate a late phase of activity-dependent neuroprotection. III. Neurosci. 2005; 25(17):4279-4287.

180. Partiseti M., Le Deist F., Hivroz C., et. al., The calcium current activated by T cell receptor and store depletion in human lymphocytes is absent in a primary immunodeficiency. HI. Biol. Chem. 1994 Dec 23; 269(51):32327-32335.

181. Patton A.J., Genever P.G., Birch M.A. et al. Expression of N-methyl-D-aspartate-type receptor by human and rat osteoblasts and osteoclasts suggests a novel glutamate signaling pathway in bone. //Bone. 1998; 22(6):645-649.

182. Perez-Otano I., Schulteis C.T., Contractor A. et al. Assembly with the NR1 subunit is required for surface expression of NR3A-containing NMDA receptors. III. Neurosci. 2001; 21(4):1228-1237.

183. Pirnik Z., Schwendt M., Jezova D. Single dose of morphine influences plasma corticosterone and gene expression of main NMDA receptor subunit in the adrenal gland but not in the hippocampus. //Endocr. Regul. 2001; 35(4):187-193.

184. Pollock P.M., Cohen-Solal K., Sood R. et. al. Melanoma mouse model implicates metabotropic glutamate signaling in melanocytic neoplasia. //Nat. Genet. 2003; 34(1): 108-112.

185. Poulopoulou C., Davaki P., Koliaraki V. et. al. Reduced expression of metabotropic glutamate receptor 2mRNA in T cells of ALS patients. //Ann. Neurol. 2005; 58(6):946-949.

186. Prybylowski K., Wenthold R.J. N-Methyl-D-aspartate receptors: subunit assembly and trafficking to the synapse. III. Biol. Chem. 2004; 279(11):9673-9676.

187. Qian B.F., Zhou G.Q., Hammarstrom M.L. and Danielsson A. Both substance P and its receptor are expressed in mouse intestinal T lymphocytes. //Neuroendocrinology. 2001; 73(5):358-368.

188. Raine C.S. The Norton Lecture: a review of the oligodendrocyte in the multiple sclerosis lesion. Hi. Neuroimmunol. 1997; 77(2):135-152.

189. Rao A., Luo C., Hogan P.G. Transcription factors of the NFAT family: regulation and function. //Annu. Rev. Immunol. 1997; 15:707-747.

190. Ravati A., Ahlemeyer В., Becker A. et al. Preconditioning-induced neuroprotection is mediated by reactive oxygen species and activation of the transcription factor nuclear factor-kappaB. Hi. Neurochem. 2001; 78(4):909-919.

191. Riccio A., Ahn S., Davenport C.M. et al. Mediation by a CREB family transcription factor of NGF-dependent survival of sympathetic neurons. //Science. 1999; 286(5448):2358-2361.

192. Ritter L.M., Vazquez D.M., Meador-Woodruff J.H. Ontogeny of ionotropic glutamate receptor subunit expression in the rat hippocampus. //Brain Res. Dev. Brain Res. 2002; 139(2):227-36.

193. Rivera-Cervantes M.C., Torres J.S., Feria-Velasco A. et al. NMDA and AMPA receptor expression and cortical neuronal death are associated with p38 in glutamate-induced excitotoxicity in vivo. Hi. Neurosci. Res. 2004; 76(5):678-687.

194. Rocha M., Martins R.A., Linden R. Activation of NMDA receptors protects against glutamate neurotoxicity in the retina: evidence for the involvement of neurotrophins. //Brain Res. 1999; 827(1-2):79-92.

195. Roche K.W, Standley S., McCallum J., et al. Molecular determinants of NMDA receptor internalization. //Nat. Neurosci. 2001; 4(8):794-802.

196. Ron D. Signaling cascades regulating NMDA receptor sensitivity to ethanol. //Neuroscientist. 2004; 10(4):325-336.

197. Rosenmund C., Westbrook G.L. Calcium-induced actin depolymerization reduces NMDA channel activity.//Neuron. 1993; 10(5):805-814.

198. Rzeski W., Turski L., Ikonomidou C. Glutamate antagonists limit tumor growth. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001; 98(11):6372-6377.

199. Said S.I., Dey R.D., Dickman K. Glutamate signaling in the lung. //Trends. Pharmacol. Sci. 2001; 22(7):344-345.

200. Sattler R., and M. Tymianski. Molecular mechanisms of glutamate receptor-mediated excitotoxic neuronal cell death. //Mol. Neurobiol. 2001; 24(1-3): 107-129.

201. Schwendt M., Jezova D. Gene expression of NMDA receptor subunits in rat adrenals under basal and stress conditions. //J. Physiol. Pharmacol. 2001; 52(4 Pt 2):719-727.

202. Sedqi M., Roy S., Ramakrishnan S. et al. Complementary DNA cloning of ц-opioid receptor from rat peritoneal macrophages. //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995; 209(2):563-574.

203. Shamloo M., Rytter A., Wieloch T. Activation of the extracellular signal-regulated protein kinase cascade in the hippocampal CA1 region in a rat model of global cerebral ischemic preconditioning. //Neuroscience. 1999; 93(l):81-88.

204. Sharp B.M. Multiple opioid receptors on immune cells modulate intracellular signaling. //Brain Behav. Immun. 2006; 20(1):9-14.

205. Shi S.H., Hayashi Y., Petralia R.S. et al. Rapid spine delivery and redistribution of AMPA receptors after synaptic NMDA receptor activation. //Science. 1999; 284(5421):1811-1816.

206. Shiose A., Kuroda J., Tsuruya K. et. al. A novel superoxide-producing NAD(P)H oxidase in kidney. //J. Biol. Chem. 2001; 276(2):1417-1423.

207. Schmalhausen E.V., Muronetz V.I. An uncoupling of the processes of oxidation and phosphorylation in glycolysis.//Biosci. Rep. 1997; 17(6):521-527.

208. Schmalhausen E.V., Nagradova N.K., Boschi-Muller S. et al. Mildly oxidized GAPDH: the coupling of the dehydrogenase and acyl phosphatase activities. //FEBS Lett. 1999; 452(3):219-222.

209. Sinclair P.B., Sorour A., Martineau M. et. al., A fluorescence in situ hybridization map of 6q deletions in acute lymphocytic leukemia: identification and analysis of a candidate tumor suppressor gene. //Cancer Res. 2004; 64(12):4089-4098.

210. Skeberdis V.A., Lan J., Opitz T. et. al. mGluRl-mediated potentiation of NMDA receptors involves a rise in intracellular calcium and activation of protein kinase C. //Neuropharmacology. 2001a; 40(7):856-865.

211. Skeberdis V.A, Lan J., Zheng X. et. al. Insulin promotes rapid delivery of N-methyl-D-aspartate receptors to the cell surface by exocytosis. //Proc. Natl. Acad, Sci. USA. 2001b; 98(6):3561-3566.

212. Snyder E.M., Philpot B.D., Huber K.M. et. al. Internalization of ionotropic glutamate receptors in response to mGluR activation. //Nat. Neurosci. 2001; 4(11):1079-1085.

213. Stefulj J., Jernej В., Cicin-Sain L. et al. mRNA expression of serotonin receptors in cells of the immune tissues of the rat. //Brain Behav Immun. 2000;14(3):219-224.

214. Stepulak A., Sifringer M., Rzeski W. et al. NMDA antagonist inhibits the extracellular signal-regulated kinase pathway and suppresses cancer growth. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005; 102(43):15605-15610.

215. Storto M., De Grazia U., Battaglia G. et al. Expression of metabotropic glutamate receptors in murine thymocytes and thymic stromal cells. Hi. Neuroimmunol. 2000; 109(2): 112120.

216. Storto M., Sallese M., Salvatore L. et al. Expression of metabotropic glutamate receptors in the rat and human testis. Hi. Endocrinol. 2001; 170(l):71-78.

217. Storto M., De Grazia U., Knopfler T. et al. Selective blockade of mGluR5 matabotropic glutamate receptors protect rat hepatocytes against hypoxic damage. Hi. Hepatol. 2003; 38(2): 179-187.

218. Storz P. Reactive oxygen species in tumor progression. //Front. Biosci. 2005; 10:18811896.

219. Sucher N.J., Awobuluyi M., Choi Y.B. and Lipton S.A. NMDA receptors: From genes to channels.//Trends. Pharmacol. Sci. 1996; 17(10):348-355.

220. Suzuki Y., Ono Y. Involvement of reactive oxygen species produced via NADPH oxidase in tyrosine phosphorylation in human B- and T-lineage lymphoid cells. //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999; 255(2):262-267.

221. Takai H., Katayama K., Uetsuka K. et al. Distribution of N-methyl-D-aspartate receptors in the developing rat brain. //Exp. Mol. Pathol. 2003; 75(l):89-94.

222. Takano Т., Lin J.H., Arcuino G. et al. Glutamate release promotes growth of malignant gliomas. //Nat Med. 2001; 7(9):1010-1015.

223. Tarpey M.M., Wink D.A., Grisham M.B. Methods for detection of reactive metabolites of oxygen and nitrogen: in vitro and in vivo considerations. //Am. J. Physiol. Regul. Integr. Сотр. Physiol. 2004; 286(3):431-444.

224. Thannickal V.J., Fanburg B.L. Activation of an H202-generating NADH oxidase in human lung fibroblasts by transforming growth factor beta 1. Hi. Biol. Chem. 1995; 270(51):30334-30338.

225. Thannickal V.J, Fanburg B.L. Reactive oxygen species in cell signaling. //Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 2000; 279(6):1005-1028.

226. Thomas J., Carver M., Haisch C. et. al. Differential effects of intravenous anaesthetic agents on cell-mediated immunity in the Rhesus monkey. //Clin. Exp. Immunol. 1982; 47(2):457-466.

227. Timmerman L.A., Clipstone N.A., Ho S.N. Rapid shuttling of NF-AT in discrimination of Ca2+ signals and immunosuppression. //Nature. 1996; 383(6603):837-840.

228. Tong G., Jahr C.E. Regulation of glycine-insensitive desensitization of the NMDA receptor in outside-out patches. //J. Neurophysiol. 1994; 72(2):754-756.

229. Tong G., Shepherd D., Jahr C.E. Synaptic desensitization of NMDA receptors by calcineurin.// Science. 1995; 267(5203): 1510-1512.

230. Van Beek J., Elward K., Gasque P. Activation of complement in the central nervous system: roles in neurodegeneration and neuroprotection. //Ann. N. Y. Acad. Sci. 2003; 992: 5671.

231. Vanhoutte P., Barnier J.V., Guibert B. et al. Glutamate induces phosphorylation of Elk-1 and CREB, along with c-fos activation, via an extracellular signal-regulated kinase-dependent pathway in brain slices. //Mol. Cell Biol. 1999; 19(1):136-146.

232. Wang Y.T., Salter M.W. Regulation of NMDA receptors by tyrosine kinases and phosphatases. //Nature. 1994; 369(6477):233-235.

233. Wang Y.T., Yu X.M., Salter M.W. Ca(2+)-independent reduction of N-methyl-D-aspartate channel activity by protein tyrosine phosphatase. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996; 93(4): 1721-1725.

234. Washbourne P., Liu X.B., Jones E.G., and McAllister A.K. Cycling of NMDA receptors during trafficking in neurons before synapse formation. //J. Neurosci. 2004; 24(38):8253-8264.

235. Watanabe M., Mishina M., Inoue Y. Distinct gene expression of the N-methyl-D-aspartate receptor channel subunit in peripheral neurons of the mouse sensory ganglia and adrenal gland. //Neurosci. Lett. 1994; 165(1-2):183-186.

236. Waxman E.A., Lynch D.R. N-methyl-D-aspartate receptor subtype mediated bidirectional control of p38 mitogen-activated protein kinase. //J. Biol. Chem. 2005; 280(32):29322-29333.

237. Welch D.R., Fabra A., Nakajima M. Transforming growth factor beta stimulates mammary adenocarcinoma cell invasion and metastatic potential. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990; 87(19):7678-7682.

238. Wenthold R.J., Prybylowski K., Standley S. et al. Trafficking of NMDA receptors. //Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2003; 43:335-58.

239. Williams M.S., Henkart P.A. Role of reactive oxygen intermediates in TCR-induced death of T cell blasts and hybridomas. //J. Immunol. 1996; 157(6):2395-2402.

240. Williams M.S., Kwon J. T cell receptor stimulation, reactive oxygen species, and cell signaling. //Free. Radic. Biol. Med. 2004; 37(8):1144-1151.

241. Winter C.R., Baker R.C. L-glutamate-induced changes in intracellular calcium oscillation frequency through non-classical glutamate receptor binding in cultured rat myocardial cells. //Life Sci. 1995; 57(21): 1925-1934.

242. Whitney K.D., McNamara J.O. GluR3 autoantibodies destroy neural cells in a complement-dependent manner modulated by complement regulatory proteins. //J. Neurosci. 2000; 20(19):7307-7316.

243. Wrogemann K., Weidemann M.J., Peskar B.A. Chemiluminescence and immune cell activation. I. Early activation of rat thymocytes can be monitored by chemiluminescence measurements. //Eur. J. Immunol. 1978; 8(10):749-752.

244. Xia Z., Dickens M., Raingeaud J. et al. Opposing effects of ERK and JNK-p38 MAP kinases on apoptosis. //Science. 1995; 270(5240): 1326-1331.

245. Xia Z., Dudek H., Miranti C.K., and Greenberg M.E. Calcium influx via the NMDA receptor induces immediate early gene transcription by a MAP kinase/ERK-dependent mechanism.//J Neurosci. 1996; 16(17):5425-5436.

246. Xiong Z.G., Raouf R., Lu W.Y. et. al. Regulation of N-methyl-D-aspartate receptor function by constitutively active protein kinase C. // Mol Pharmacol. 1998; 54(6).i 055-1063.

247. Yen L.H., Sibley J.T, Constantine-Paton M. Fine-structural alterations and clustering of developing synapses after chronic treatments with low levels of NMDA. //J. Neurosci. 1993; 13(ll):4949-4960.

248. Yoo B.C., Jeon E., Hong S.H. et al. Metabotropic glutamate receptor 4-mediated 5-Fluorouracil resistance in a human colon cancer cell line. //Clin. Cancer Res. 2004; 10(12 Pt 1):4176-4184.

249. Yu X.M., Askalan R., Keil G.J. and Salter M.W. NMDA channel regulation by channel-associated protein tyrosine kinase. // Science. 1997; 275(5300):674-678.

250. Yu X.M., Salter M.W. Gain control of NMDA-receptor currents by intracellular sodium. //Nature. 1998; 396(6710):469-474.

251. Yu X.M., Salter M.W. Src, a molecular switch governing gain control of synaptic transmission mediated by N-methyl-D-aspartate receptors. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999; 96(14):7697-7704.

252. Zheng F., Gingrich M.B., Traynelis S.F. and Conn P.J. Tyrosine kinase potentiates NMDA receptor current by reducing tonic Zn2+ inhibition. //Nat. Neurosci. 1998; 1 (3): 185-191.

253. Zheng X., Zhang L., Wang A.P. et al. Ca2+ influx amplifies protein kinase С potentiation of recombinant NMDA receptors. //J Neurosci. 1997; 17(22):8676-8686.

254. Zheng X., Zhang L., Wang A.P. et al. Protein kinase С potentiation of N-methyl-D-aspartate receptor activity is not mediated by phosphorylation of N-methyl-D-aspartate receptor subunits. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999; 96(26): 15262-15267.

255. Zhu D., Wu X., Strauss K.I. et al. N-methyl-D-aspartate and TrkB receptors protect neurons against glutamate excitotoxicity through an extracellular signal-regulated kinase pathway. //J. Neurosci. Res. 2005; 80(1):104-113.

256. Zweifach A., Lewis R.S. Mitogen-regulated Ca2+ current of T lymphocytes is activated by depletion of intracellular Ca2+ stores. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993; 90(13):6295-6299.