Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Обнаружение NMDA-рецепторов в лимфоцитах и их характеристика

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Обнаружение NMDA-рецепторов в лимфоцитах и их характеристика"

На правах рукописи

МАШКИНА АННА ПЕТРОВНА

ОБНАРУЖЕНИЕ МУГОА-РЕЦЕПТОРОВ В ЛИМФОЦИТАХ И ИХ ХАРАКТЕРИСТИКА

03.01.04 «биохимия»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва ,

2010 г. ¡- и

004602303

Диссертационная работа выполнена на кафедре биохимии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В, Ломоносова.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

БОЛДЫРЕВ Александр Александрович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Чернов Николай Николаевич

доктор биологических наук, профессор Гуляева Наталья Валерьевна

Ведущее учреждение: Гематологический Научный Центр РАМН

Защита состоится «21» мая 2010 г. в 14 ч. 00 мин. на заседании диссертационного учёного совета Д.213.203.13. при Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.8, Аграрный факультет РУДН, аудитория 453 .

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6.

Автореферат разослан «19» апреля 2010 г.

Учёный секретарь диссертационного совета Д.213.203.13., доктор биологических наук, профессор Лукашова Е. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Интактный мозг является иммунопривилегированным органом, где не обнаруживается лимфоузлов и не встречаются лимфоциты. Эта особенность мозга поддерживается за счет существования гематоэнцефалического барьера, который не дает клеткам иммунной системы мигрировать в мозг из кровотока. Более того, кроме астроцитов в ЦНС не встречаются другие клетки, способные презентировать молекулы МНС (Major Histocompatibility Complex) (Engelhardt, 1996; Sehgal and Berger, 2000). Однако, при развитии нейродегенеративных заболеваний это свойство, обеспечивающее стабильную работу ЦНС в нормальных условиях, грозит развитием аутоиммунных реакций (Gendelman, 2002).

Недавно в литературе появились данные о непосредственной регуляции функций иммунокомпетентных клеток со стороны нервной системы (Wrona, 2005). Эта регуляция может осуществляться как через эндокринную систему, включающую гормоны гипоталамуса (Munck and Guyre, 1991), так и через «симпатические пути» за счет иннервации лимфоидных органов (Shimizu et al., 1994). В осуществлении нормального «диалога» между нервной и иммунной системами большое значение имеют такие нейромедиаторы, как дофамин и ацетилхолин (Basu and Dasgupta, 2000; Pavlov et al., 2003; Saeed et al., 2005). В последнее время к ним относят и глутамат.

Глутамат является возбуждающим нейротрансмиттером мозга. Долгое время глутаматные рецепторы, в том числе и рецепторы NMDA-класса, обеспечивающие когнитивные процессы и память, считались специфическими маркерами нейрональной ткани. Однако в последнее время в литературе появились косвенные данные о том, что функционально активные NMDA-рецепторы могут присутствовать и в иммунокомпетентных клетках (Lombardi et al., 2001; Ganor et al., 2003). Вышеперечисленные факты поднимают вопрос о том, каким образом данный класс рецепторов может участвовать в функциональном ответе лимфоцитов и в их взаимодействии с нервной тканью.

В первую очередь это относится к патологическим состояниям, характеризующимся воспалительными процессами в ЦНС, к ишемии головного мозга, рассеянному склерозу, болезни Альцгеймера и гипергомоцистеинемии, -процессам, протекающим на фоне выраженного окислительного стресса. Общей чертой в развитии таких заболеваний является значительное повышение уровня свободного глутамата как в мозге и спинномозговой жидкости, так и в плазме крови, что приводит к нейрональной смерти вследствие развития

экзайтоксических механизмов (Carpenter, 2002), и привлечения лимфоцитов в очаг воспаления. В связи с вышесказанным, установление экспрессии NMDA-рецепторов в клетках иммунной системы и исследование их возможного участия в этих процессах является актуальной проблемой, имеющей значение для современной биохимии.

Целью данной работы явилось доказательство присутствия NMDA-рецепторов в лимфоцитах грызунов и человека и характеристика их функциональной активности.

Задачи исследования:

1. Используя ОТ-ПЦР, выявить экспрессию канальной NR1-субъединицы NMDA-рецептора в лимфоцитах.

2. Исследовать влияние N-метил-О-аспартата (NMDA) на уровень ионов кальция и продукцию активных форм кислорода (АФК) в лимфоцитах методом проточной цитометрии.

3. Выявить субпопуляции лимфоцитов, активируемых NMDA, с помощью флуоресцентно-меченых моноклональных антител к поверхностным маркерам (метод иммунофенотипирования) в сочетании с нагрузкой клеток флуоресцентным зондом на активные формы кислорода (АФК) - DCFH2-DA (2,7-дихлордигидрофлуоресцеин-диацетатом).

4. Оценить долю клеток в общей популяции лимфоцитов, презентирующих NMDA-рецепторы в норме и после их активации «in vitro» интерлейкином-2 (ИЛ-2) или фитогемагглютинином (ФГА).

5. Установить наличие NMDA-рецепторов на поверхности лимфоцитов, активированных «in vivo» в процессе спинномозговой травмы.

6. Исследовать влияние NMDA на продукцию интерферона-у различными субпопуляциями лимфоцитов, активированных «in vitro».

Научная новизна и практическая ценность работы

В настоящей работе охарактеризовано влияние агониста глутаматных рецепторов NMDA-класса, Ы-метил-О-аспартата, на лимфоциты периферической крови человека и крыс. В работе впервые установлено наличие в лимфоцитах периферической крови крыс мРНК, кодирующей основную белковую субъединицу NMDA-рецепторного комплекса (NR1). Методом проточной цитометрии было продемонстрировано, что под действием NMDA в Т-лимфоцитах и NK-клетках (natural killer cells) увеличивается уровень ионов Са2+, сопровождающийся возрастанием уровня АФК. Т-лимфоциты оказались

субпопуляцией, более чувствительной к NMDA по сравнению с NK-клетками, в то время как на продукцию АФК В-лимфоцитами NMDA действия не оказывал.

При помощи иммунофлуоресцентного окрашивания показано связывание антител с внеклеточным доменом NMDA-рецепторного комплекса на мембране лимфоцитов, а также усиление экспрессии этих рецепторов в результате инкубации клеток, активированных интерлейкином-2 или фитогемагглютинином в присутствии NMDA. В условиях индуцированного воспаления спинного мозга «in vivo» нами было показано, что Т-лимфоциты, мигрировавшие в очаг воспаления, презентируют NMDA-рецепторы на своей мембране. NMDA отрицательно влияет на реактивную способность лимфоцитов, препятствуя синтезу интерферона у (IFN-y) в субпопуляциях NK-клеток и Т-лимфоцитов.

Полученные результаты расширяют представления об экспрессии и функции NMDA-рецепторов в клетках иммунной системы, и позволяет предполагать участие этих рецепторов в регуляции иммунного ответа.

Апробация работы

Результаты исследований были доложены на XXI международном конгрессе "Молекулярные основы неврологических и психиатрических заболеваний" (Словакия, Мартин, 2006 г.), на XXIX ежегодном собрании Японского нейрохимического общества (Япония, Киото, 2006 г.), на Всероссийской нейрохимической конференции в Санкт-Петербурге (сентябрь 2008 г.). Апробация работы прошла в лаборатории клинической и экспериментальной нейрохимии Научного центра неврологии РАМН (февраль 2010 г.) и на кафедре биохимии МГУ имени М.В. Ломоносова (сентябрь 2009 г.).

Публикации

Материалы диссертации отражены в 8 публикациях.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Экспериментальной части, включающей описание материалов и методов (2 главы), результатов исследования и их обсуждения (7 глав), Заключения и Выводов. Диссертация изложена на 114 стр. печатного текста, содержит 32 рисунка и 3 таблицы. Список литературы включает 424 наименования.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования явились лимфоциты периферической крови крыс и человека.

Отбор крови. В работе использовалась кровь доноров без выраженных патологий, которая отбиралась у каждого донора многократно. Забор крови осуществляли из локтевой вены с утра, натощак. Кровь собирали в полистироловую пробирку с гепарином (конечная концентрация 100 ед/мл). При выделении клеток для последующего роста в культуре отбор крови осуществляли в стерильных условиях с использованием вакуумных пробирок.

Отбор крови у крыс линии Wistar проводили под анестезией. Взрослых животных перед опытом усыпляли хлоралгидратом, взятым из расчета 400-600 мг вещества на 1 кг веса животного и отбирали кровь из яремной вены с помощью шприца, содержащего раствор гепарина (50 ед/мл крови).

Выделение лимфоцитов. Процедуру выделения лимфоцитов проводили не позднее 2 часов с момента отбора крови. Выделение периферических мононуклеарных клеток проводили в градиенте фикола (плотность 1,077±0,001), используя стандартную среду выделения «LymphoSep» (ICN Biomedicals) и следуя указанному производителем протоколу. Разведение крови осуществляли изотоническим раствором Хенкса (рН 7,2).

Собранные после выделения клетки дважды отмывали, и полученный осадок ресуспендировали в небольшом объеме раствора Хенкса (0,5 - 1 мл). В случае необходимости от моноцитов избавлялись путем адгезии пробы на пластике при 37°С в течение 40 мин. Подсчет клеток проводили в камере Горяева.

Для выделения очищенной субпопуляции NK-клеток использовали набор «NK Cell Isolation Kit II (human)» фирмы «Milteny Biotec» (Германия), проводя работу в стерильных условиях в соответствии с инструкцией производителя.

Первичная культура периферических лимфоцитов. Клетки выделяли описанным выше способом, избавляясь от моноцитарной фракции. Все работы проводили в стерильном ламинарном боксе. После отмывания клетки суспендировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% инактивированную эмбриональную сыворотку телят, глутамин (2 мМ), пенициллин (100 ед/мл), стрептомицин (100 мг/мл), и инкубировали в 5% СОг-инкубаторе.

Плотность клеточной суспензии составляла 2x106 кл/мл. О появлении мертвых клеток в ходе эксперимента судили по окраске проб с трипановым синим. Активированные лимфоциты получали в результате инкубации с фитогемагглютинином (ФГА-П, ПанЭко, Россия) (10 цг/мл) или рекомбинантным ИЛ-2 (600 ед/мл) (Suresnes, Франция) в течение 72 ч.

Модель индуцированного компрессионного повреждения спинного мозга >> крыс. Воспаление создавали путем внедрения катетера в спинной мозг животного (Tarlov et al., 1953). В опытах были использованы взрослые самцы крыс линии Lewis весом 300-330 г. Первичную анестезию проводили ингаляцией 2-4% галотана (Zentiva, Польша). В ходе операции под хирургическим микроскопом в арке позвонка Т10 просверливали отверстие диаметром 1,5 мм. Через полученное отверстие вводили катетер "Intramedic" (Becton Dickenson, США), наполняемый водой через герметично присоединенный шприц Hamilton (тип 1705) с помощью специального удерживающего устройства. Катетер вводили в пространство между аркой позвонка и твердой мозговой оболочкой и продвигали вверх вдоль позвоночного столба на 1 см. Таким образом, очаг воспаления приходился на место уширения катетера при наполнении его водой и располагался на уровне 8-9 позвонков грудного отдела. Катетер наполняли 12,5 |!л жидкости и фиксировали на 5 мин. Затем жидкость откачивали и извлекали катетер. Слои мягких тканей и кожи в месте разреза сшивали и прекращали анестезию.

После операции животных содержали в больших клетках в течение 4-14 дней. По окончании этого срока крыс подвергали глубокой анестезии и перфузировали через большой круг кровообращения физиологический раствор и 0,1 М фосфатный буфер с 4% параформальдегидом. Спинной мозг извлекали и переводили в фиксирующий раствор на 1 сутки. По прошествии этого времени спинной мозг разрезали на сегменты длиной в 5 мм и переносили в 30% раствор сахарозы. Для каждой временной точки было использовано не менее трех животных.

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ПОДХОДЫ И РЕГИСТРИРУЕМЫЕ ПАРАМЕТРЫ

Выделение РНК и обратная транскрипция. Выделение тотальной РНК из лимфоцитов периферической крови крыс линии Wistar проводили с использованием стандартного набора для выделения РНК «RNeasy Mini Kit» («Qiagen», Германия). Количество лимфоцитов, использовавшихся для выделения, составляло 5 х 106 клеток.

Обратную транскрипцию проводили в смеси объемом 20 |хл, содержащей 10 |_1г тотальной РНК, 40 ед ингибитора РНКаз IRNase («Синтол», Россия), 1 рл Random-нуклеотидов (исходная концентрация 0,5 мг/|1л), инкубировали в течение 1 мин при 94°С для отжига праймеров и мгновенно охлаждали до 4°С. После этого в инкубационную смесь вносили 5 ед. IRNase, 6 цл 5хкратного MLV-буфера («Синтол», Россия), 1 цл дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTP, концентрация 10 мМ) («Fermentas», Литва), 1 цл фермента MLV-ревертазы («Синтол», Россия) и проводили реакцию обратной транскрипции при 42°С в

течение 40 мин, после чего смесь инкубировали 3 мин при 93°С для остановки реакции.

Полимеразная цепная реакция. Для проведения ПЦР использовали набор «PCR-Core» фирмы «ИзоГен» (Россия), рассчитанный на проведение реакции в объеме 20 |1л. Конечные концентрации реагентов в одной пробе составляли 1 ед Taq-полимеразы, 20 мМ KCl, 15 мМ сульфата аммония, 65 мМ Трис-НС1-буфера (pH 8,8), 2,5 мМ MgCl2, 200 цМ дезоксинуклеотидтрифосфатов.

В качестве затравочных нуклеотидов использовали уникальные пары праймеров к консервативным последовательностям генов всех классов глутаматных рецепторов и гена GAPDH, составленные В.И. Казеем (лаборатория клинической нейрохимии ГУ НЦ неврологии РАМН). В пробирку вносили 2 |лл ДНК-матрицы и праймеры (в концентрации 1 цМ), на реакционную смесь наслаивали 30 цл минерального масла и проводили амплификацию в амплификаторе «Терцик» (Россия). Отрицательным контролем служили пробы, в которые в качестве матрицы вносили продукт выделения тотальной РНК без последующей реверсии; остальные компоненты присутствовали в тех же количествах.

ПЦР проводили в следующем режиме: исходная денатурация матрицы - 5 мин при 95°С; денатурация - 94°С, 30 сек; отжиг праймеров - 60°С или 67°С, 60 сек; элонгация - 72°С, 60 сек. Заключительная достройка продуктов реакции - 72°С, 10 мин. Реакцию проводили в течение 36 циклов.

Электрофорез ДНК. Визуализацию продукта ПЦР проводили методом электрофореза в 1,5% агарозном геле в ТАЕ буфере. Агарозу растворяли в однократном ТАЕ буфере при 100°С, охлаждали до 60°С и добавляли бромистый этидий из расчета 0,5 цг/мл. Гель заливали в плашки слоем толщиной 4 мм. Электрофорез проводили при напряжённости поля 10 В/см. Результат визуализировали при помощи UVP трансиллюминатора.

Проточная цитометрия. Измерения проводили на приборе «Beckman Coulter, EPICS» (USA), оснащенном аргоновым лазером с длиной волны возбуждения 485 нм. В каждой пробе анализировали 10 000 событий. В качестве параметра, характеризующего интенсивность флуоресценции внутриклеточного маркера АФК (DCFH2-DA), использовали среднее значение флуоресценции, которое характеризует стационарный уровень АФК в клеточной популяции. При анализе некроза или взаимодействия клеток со специфическими антителами определяли процент клеток, характеризующихся флуоресценцией, вызванной взаимодействием соответствующих красителей со специфическими лигандами.

Определение внутриклеточного уровня АФК. Для определения внутриклеточного уровня АФК клетки в течение 30 мин нагружали

флуоресцентным красителем DCFH2-DA (2,7-дихлордигидрофлуоресцеин-диацетатом, Хех 485 им, Хет 535 нм) в конечной концентрации 100 (J.M. Краситель растворяли в DMSO так, чтобы концентрация растворителя в образце была не выше 0,1% (Boldyrev et al., 1999).

Определение доли мертвых клеток. Для идентификации некроза в клеточной популяции лимфоциты или нейроны окрашивали иодидом пропидия (PI, 485 нм, 610 нм) в конечной концентрации 10 (дМ. Краситель добавляли к клеточной суспензии за 5 мин до измерения, окраска оставалась стабильной в течение 30 мин.

Иммунофенотипирование. Клеточную суспензию окрашивали моноклональными антителами к CD-маркерам поверхности лимфоцитов (CD45, CD3, CD16, CD56, CD19), конъюгированным с флуоресцентными красителем фикоэритрином (РЕ). В случае окрашивания лимфоцитов человека преципитацию антител проводили следующим образом: к 50 |1л суспензии, содержащей 500 тысяч клеток, добавляли 5 |дл антител («Сорбент» Россия), инкубировали 45 мин при +4°С, дважды отмывали, а осадок ресуспендировали в 50 цл среды Хенкса. Анализ проводили методом проточной цитометрии.

Лимфоциты крысы окрашивали по аналогичной методике моноклональными анти-CD антителами (10 цг/мл) производства Becton Dickenson (США). Для определения изменения уровня АФК в различных субпопуляциях лимфоцитов использовали метод иммунофенотипирования с одновременной нагрузкой флуоресцентным красителем DCFFb-DA (Patrick et al., 1987).

Определение экспрессии NRl-субъединицы в первичной культуре лимфоцитов. Определение экспрессии NMDA-рецепторного белкового комплекса на поверхности лимфоцитов проводили методом непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания с моноклональными (mouse anti-rat) антителами к NR1-субъединице NMDA-рецептора (3 (.ir/мл) (GTX30182, GenTex, USA) с последующей окраской ФИТЦ (флуоресцеинизотиоцианат)-коньюгированными поликлональными «козьими» Fab-фрагментами к IgG мыши (10 |!г/мл) (ab 6669, Abeam, USA). В качестве положительного контроля использовали связывание анти-NRl антител с гранулярными клетками мозжечка крысы.

Для нейронов и лимфоцитов процедуру окрашивания проводили сходным образом. Клетки после отмывания от среды выделения разводили в растворе Хенкса до концентрации (1-5) х 106 кл/мл и инкубировали 40 мин при комнатной температуре в присутствии первичных антител. После этого клетки отмывали в растворе Хенкса при 400 г в течение 10 мин и прокрашивали вторичными антителами, меченными флуоресцентным красителем (ФИТЦ). Инкубацию проводили в течение 30 мин в темноте, после чего клетки повторно

отмывали в тех же условиях. Для того, чтобы исключить неспецифическую флуоресценцию вторичных антител, контрольные пробы прокрашивали с ними без предварительной инкубации с первичными антителами.

Определение количества интерферон-у (IFN-y) продуцирующих клеток. Стимуляцию продукции интерферона-у лимфоцитами проводили растворами рекомбинантного ИЛ-2 (600 ед/мл) и ФГА (10 jir/мл) в присутствии и в отсутствие 500 |iM NMDA в течение 12 ч. Далее к суспензии добавляли брефелдин А до концентрации 10 (ir/мл и инкубировали 6 ч. Затем пробы разделяли на аликвоты и окрашивали моноклональными антителами к CD маркерам, как описано выше. После этого клетки фиксировали в 300 цл 4% раствора параформальдегида в течение 20 мин, отмывали и добавляли пермеабилизующий буфер, содержащий 1% азид натрия и 3% сапонина; инкубацию проводили в течение 15 мин. Далее клетки в течение 30 мин окрашивали ФИТЦ-конъюгированными моноклональными анти-IFN-y антителами (5 цл на 100 мкл клеточной суспензии) в 100 цл пермеабилизирующего буфера. Чтобы избавиться от несвязавшихся антител, клетки дважды отмывали пермеабилизующим буфером. Полученную суспензию ресуспендировали в 0,1 М фосфатно-солевом буфере и определяли количество окрашенных лимфоцитов на проточном цитометре.

Количественное определение IFN-y проводили с помощью коммерческого набора для иммуноферментного анализа (ИФА) «Human IFN-y ELISA Kit» производства «Pierce Endogen» (CUIA). В качестве проб использовали супернатант после центрифугирования суспензии активированных лимфоцитов, инкубированных с NMDA в течение 18 ч. Для приготовления стандартов использовали прилагающийся к набору стандарт IFN-y. Постановку ИФА производили согласно протоколу производителя.

Приготовление срезов спинного мозга. Из участка спинного мозга длиной 3 см, содержащего очаг воспаления, с помощью криостата готовили срезы толщиной 40 |!м. Срезы помещали в 0,1 М раствор фосфатного буфера (РВ) и применяли стандартный протокол окрашивания для визуализации лимфоцитов. Чтобы открыть эпитопы для взаимодействия с антителами и блокировать неспецифическое связывание, срезы инкубировали в 0,1 М фосфатно-солевого буфере, содержащем 0,2% Triton Х-100 (Sigma, США) и 5% сухое молоко ("Cell signaling, Тес.", Германия) в течение 2 ч при 4°С, затем отмывали 3 раза.

Для обнаружения лимфоцитов, находящихся в очаге воспаления, применяли несколько независимых способов окрашивания. Срезы инкубировали с моноклональными анти-СОЗ антителами (40 мкг/мл), коньюгированными с фикоэритрином (РЕ) (Becton Dickenson, США), в течение 24 ч при 4°С. За 30 мин до окончания инкубации добавляли DAPI (4'-6-

Diamino-2-phenylindoIe) (Molecular Probes, Нидерланды) для окрашивания клеточных ядер. Полученные срезы анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа.

В случае световой микроскопии срезы инкубировали с моноклональными aHTH-CD3 антителами (50 рх/мл) (Becton Dickenson, США) в течение 24 ч и применяли трехступенчатую систему окрашивания с использованием биотинилированного goat-anti-mouse IgG в качестве вторичных антител и комплекс Streptavidin-HRP (Vectastain elite ABC KIT, США) совместно с диаминобензидином (DAB) (Fluka, Финляндия).

Чтобы показать экспрессию NMDA-рецепторов в лимфоцитах, мигрировавших в очаг воспаления в спинном мозге, применяли двойное окрашивание срезов моноклональными анти-СОЗ антителами в сочетании с вторичными goat-anti-mouse антителами (40 цг/мл), конъюгированными с флуоресцентным красителем Alexa Fluor 594 ("Invitrogen Molecular Probes", США). После этого срезы инкубировали с anti-NRl моноклональными антителами (2,5 мкг/мл) и вторичными антителами (50... мкг/мл), конъюгированными с флуоресцентным красителем Alexa Fluor 488. ("Leigeh", Нидерланды). В обоих случаях инкубацию с первичными моноклональными антителами проводили в течение 24 ч при 4°С, после чего срезы отмывали 3 раза по 10 мин в 0,1 M PBS. С вторичными антителами срезы инкубировали 2 ч и отмывали трижды.

В качестве позитивного контроля использовали срезы, окрашенные только anti-NRl моноклональными антителами и вторичными антителами, конъюгированными с флуоресцентным красителем Alexa Fluor 488. На срезах были отчетливо видны тела моторных нейронов, экспрессирующие NMDA-рецепторы. В качестве негативного контроля использовали срезы спинного мозга и суспензии клеток, подвергнутых стандартной процедуре окрашивания с исключением первичных антител из растворов. После этого срезы переносили на предметные стекла, покрытые 0,1% желатином, высушивали и покрывали смолой для флуоресцентной микроскопии. Для анализа использовали флуоресцентный микроскоп Olympus ВХ 40, оборудованный цифровой фотокамерой.

Статистическая обработка результатов. В экспериментах для каждого опыта использовали не менее 3 животных, измерения проводили не менее, чем в 3 параллельных пробах. Обработку результатов проводили, используя для сравнения полученных выборок критерий Стьюдента. Достоверными считали различия при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Определение экспрессии мРНК глутаматных рецепторов ММРА-класса в периферической крови крысы

Доказательство экспрессии мРНК, кодирующей субъединицы глутаматных рецепторов, проводили методом обратной транскрипции (ОТ) и последующей ПЦР (ЯТ-РСЛ) с нуклеотидными праймерами, специфическими к определенному участку искомой последовательности гена ИМОА-рецептора. На Рис. 1 представлена электрофореграмма продуктов амплификации.

JOOO_

750 -

500 — ■ < , -ятте

250 ---

12 3 4

Рис. 1. Электрофореграмма образцов, полученных после проведения RT-PCR в лимфоцитах крысы (агарозный гель 1,5 %). 1 - набор молекулярных маркеров GeneRuler длиной от 250 до 10000 пар оснований; 2 - отрицательный контроль, не содержащий матрицы ДНК; 3 - положительный контроль с праймерами к гену ГАФД; 4 - NR1 субъединица NMDA-рецепторов.

Проведенный анализ показал наличие в пробах кДНК к NR1 -субъединице NMDA-рецептора, что является доказательством экспрессии мРНК, полученной из лимфоцитов периферической крови крысы. Аналогичные результаты были опубликованы (Miglio et al., 2005), где была показана экспрессия мРНК к NR1 и NR2-cy6beflHHH4aM в лимфоцитах человека.

2. Идентификация NR1 субъединицы NMDA-рецепторного комплекса на поверхности лимфоцитов

Экспрессия NR! субъединицы является необходимым условием для формирования NMDA-рецепторного комплекса в мембране вне зависимости от того, в сочетании с какими субъединицами (NR2 и/или NR3), ко-экспрессирующимися в конкретных условиях, формируется ионный канал (Cull-Candy et al., 2001). Поэтому в наших экспериментах мы определяли присутствие именно NR1 субъединицы на клеточной поверхности лимфоцитов с помощью окраски антителами, специфичными к внеклеточному участку аминокислотной последовательности этого белка.

2.1 Окраска клеток моноклональными антителами (GTX30182) к NR1 -субъединице. Использовавшиеся в эксперименте антитела к NR1 субъединице были специфичны к белку крысы. Сравнение аминокислотной последовательности участка, к которому специфичны моноклональные

антитела GTX30182, у человека и крысы показывает 100% гомологию. Кроме того, высокий консерватизм (гомология 99%) белковой последовательности NR1 в области N-конца позволяет предположить близкую или даже идентичную конформацию белка для этих видов, что дает основание для использования этих антител на лимфоцитах как крыс, так и человека.

Анализ показал наличие окраски 5,5±1% интактных лимфоцитов, выделенных из периферической крови здоровых доноров, что позже было подтверждено в другой лаборатории (Miglio et al., 2005). Таким образом, результат исследований, проведенных с использованием специфических антител к NR1-субъединице NMDA-рецептора, доказывает поверхностную экспрессию белковой субъединицы NR1 NMDA-рецепторного комплекса на внешней мембране субпопуляции лимфоцитарных клеток.

Несмотря на то, что мы не анализировали экспрессию остальных белковых субъединиц NMDA-рецепторного комплекса, комплексный анализ полученных данных свидетельствует об экспрессии данного рецептора в лимфоидных клетках, хотя не исключено, что его структура и функциональные свойства у лимфоцитов могут отличаться от таковых для NMDA-рецепторов, экспрессируемых в нейрональных тканях.

2.2. Усиление экспрессии NR1 субъединицы в результате инкубации активированных клеток с NMDA. Для клеток иммунной системы известны два состояния, в которых они различаются как морфологически, так и функционально. В кровотоке лимфоциты циркулируют в состоянии покоя, однако под действием пролиферирующих агентов и цитокинов воспаления они способны активироваться и мигрировать в очаг воспаления, где происходит распознавание антигенов и управление работой макрофагов. Доля активированных лимфоцитов в периферической крови зависит от состояния метаболизма. В связи с этим мы изучили изменение экспрессии NR1 субъединицы в лимфоцитах как до, так и после их активации пролиферативным агентом ИЛ-2 и цитокином ФГА в условиях «in vitro».

В экспериментах с окрашиванием лимфоцитов моноклональными антителами мы показали, что достоверно значимых изменений уровня экспрессии после активации не происходит. Одновременно мы обнаружили, что инкубация суспензии лимфоцитов, обогащенной Т-лимфоцитами и NK-клетками, полученной из периферической крови человека и активируемой цитокином совместно с 500 цМ NMDA приводит к существенному возрастанию количества NR1-позитивных клеток (Рис. 2).

В то же время, внесение в среду одного NMDA не вызывало изменения количества клеток, несущих на своей поверхности NR1 субъединицу NMDA рецептора. Динамика появления NR1-позитивных лимфоцитов во времени показана на Рис. 2. Через 48 ч активации клетки, несущие NMDA-рецепторы,

составляли около половины, а через 72 ч - почти 100% всей популяции. Таким образом, с увеличением времени инкубации активированных лимфоцитов в присутствии ЫМБА усиливается экспрессия клетками субъединицы N111, при этом число N111 -позитивных клеток, инкубировавшихся без NMDA, не изменяется. В этих экспериментах мы обнаружили еще один интересный феномен: антагонист NMDA-peцeптopoв МК-801 (25 р.М) препятствовал появлению N111 субъединицы на поверхности лимфоцитов, активированных ИЛ-2 в присутствии NMDA.

Время, часы

Рис. 2. Количество NMDA-пoзитивныx клеток в переживающих культурах периферических лимфоцитов в контроле (1) и, стимулированных ФГА (10 дг/мл) и инкубированных в присутствии 500 [1М КМБА (2) в зависимости от времени инкубации.

При этом инкубация клеток с одним агонистом и/или антагонистом ЫМОА-рецепторов в отсутствие ФГА или ИЛ-2 не вызывала достоверных изменений экспрессии. Результаты этих экспериментов приведены на Рис. 3.

га а

Контроль ШОА

ММОА+М<- МК-801 801

60 40 ■

.....В....

Контроль ШОА ММОА+МК- М<-801 801

Рис. 3. Количество NMDA-пoзитивныx клеток в переживающей культуре периферических лимфоцитов в контроле (А) и после стимуляции ИЛ-2 (600 ед/мл) в присутствии 500 Ц.М NMDA и 25 |Ш МК-801 (Б). Время инкубации 72 ч.

Известно, что в нейронах, экспрессирующих NMDA-рецепторы, идет конститутивный синтез NR1-субъединиц, которые долгое время могут удерживаться в эндоплазматическом ретикулуме. В результате в нейронах обнаруживается значительный фонд свободных NR1-субъединиц, не ассоциированных с NR2-cy6beflHHHuaMH, что позволяет клетке быстро регулировать количество и функциональную активность рецепторов в синапсе (Prybylowski and Wenthold, 2004). Можно предположить, что в проведенных нами экспериментах инкубация активированных периферических лимфоцитов с агонистом глутаматных рецепторов NMDA-класса ведет к запуску процессов, приводящих либо к усилению синтеза рецепторных субъединиц, либо к активации процессов их экстернализации и сборки функционально активных рецепторов.

Механизмы, лежащие в основе наблюдаемого феномена, требуют дальнейшего изучения, однако сами факты свидетельствуют, что существует положительная связь между воздействием NMDA на периферические лимфоциты и экспрессией этими клетками рецепторов к соответствующему лиганду, что может служить свидетельством вовлечения глутаматных рецепторов NMDA-класса в регуляцию процессов клеточной активации или модификации функциональных свойств лимфоцитов.

3. Влияние NMDA на уровень АФК и внутриклеточного Са2+ в различных субпопуляциях лимфоцитов

В нашей лаборатории косвенным методом (измерение люминол-зависимой хемилюминесценции) ранее было показано, что инкубация NMDA с лимфоцитами человека приводит к увеличению продукции АФК (Тунева и соавт., 2003). Известно, что в нейронах рост уровня АФК под действием агонистов NMDA-рецепторов непосредственно связан с увеличением концентрации цитоплазматического Са2+, поступающего в клетку через Са-каналы, управляемые этими рецепторами (или находящиеся в их составе).

Мы предположили, что если глутаматные NMDA-рецепторы лимфоцитов имеют сходство с таковыми в нейронах, то связывание агонистов с этими рецепторами также должно приводить к увеличению концентрации внутриклеточного Са2+. Ионы Са2+ в клетках выполняют роль вторичных мессенджеров, и одним из результатов увеличения концентрации кальция в клетке является активация фосфолипазы Аг- В результате происходит накопление лизофосфолипидов и арахидоновой кислоты, наблюдается активация различных протеинкиназ и накопление свободных радикалов.

Нашей задачей было установить, участвует ли Са2+ в процессе накопления АФК в лимфоцитах человека под действием NMDA. Кроме этого мы изучали действие NMDA как на уровень АФК в общей фракции лимфоцитов человека и

грызунов, используя флуоресцентный зонд DCFH2-DA, так и на уровень внутриклеточного Са2+, применяя зонд Fluo-3 AM. После 30 мин инкубации суспензии лимфоцитов человека с 500 (J.M NMDA мы наблюдали рост флуоресценции DCF до 185±54% и Fluo-3 AM до 146±11% от контрольного уровня. Эффект NMDA устранялся в присутствии специфического антагониста NMDA-рецепторов D-AP5 (D-2-amino-5-phosphonopentanoic acid, 1 цМ).

Известно, что общая суспензия лимфоцитов неоднородна и содержит клетки нескольких субпопуляций, которые различаются по морфологии и функциональным свойствам. Для того, чтобы определить, на какие именно субпопуляции лимфоцитов оказывает влияние NMDA, мы выявляли ответ каждой субпопуляции, идентифицируемой с помощью избирательной маркировки их с помощью моноклональных антител к специфическим CD-маркерам (Clusters of Differentiations) на их поверхности, одновременно нагружая их DCFH2-DA и анализируя ответ на NMDA в проточном цитомере.

Таблица 1. Влияние 500 Ц.М NMDA на продукцию АФК лимфоцитами

человека

CD маркер Популяция исследуемых клеток % от общего количества лимфоцитов Флуоресценция DCF после инкубации с NMDA. % от контроля

CD 45 Лимфоциты 100 185±54

CD 3 Т-лимфоциты 66+10 260±81

CD 16 NK-клетки ¡4 ±6 221 ±22

CD 19 В-лимфоциты 11±5 88+12

CD 14 Моноциты <2 -

Оказалось, что увеличение внутриклеточного уровня АФК наблюдается в Т-лимфоцитах и NK-клeткax. В таблице 1 представлены данные об изменениях во всех изученных популяциях лимфоцитов. На Рис. 4 представлены результаты окрашивания Т-лимфоцитов с помощью ОСРН2-ОА, отражающего рост уровня АФК под действием 500 цМ NMDA. Субпопуляцию Т-клеток идентифицировали с помощью РЕ-конъюгированных анти-СОЗ антител.

Мы исследовали действие NMDA на NK-клeтки и Т-лимфоциты в диапазоне концентраций 100-1000 цМ (Рис. 5). Нами было выявлено дозо-зависимое увеличение уровня АФК в этих клетках, причем характер чувствительности соответствовал тому, что характерно для нейронов (ВоИугеу е1 а1., 2000). Интересно, что в области низких концентраций NMDA Т-лимфоциты являются более чувствительными к активирующему лиганду, чем в то время как в области высоких концентраций ответ обеих групп

клеток уравнивается. Таким образом, можно сказать, что среди циркулирующих в кровотоке лимфоцитов именно эти клетки являются Т^ЛУЮА-чувствительными в отличие от В-лимфоцитов, в которых уровень продукции АФК не изменяется.

А Б

■ Т-лимфоцить ■(Шд-^)

3 = /У

м

Ы . . .

в

■ -лШ

Рис. 4. Эффект 500 мкМ на продукцию АФК Т-лимфоцитами

человека. Клетки, связавшиеся с анти-СЭЗ антителами, имеют высокую флуоресценцию в красной области спектра (РЬ2). Интактные клетки представлены на рисунке А. Лимфоциты на рисунке Б и В дополнительно нагружены ОСРН-ЭА для измерения флуоресценции в зелёной области спектра (РЫ). На рисунке В представлены клетки после 30 мин инкубации с 500 рМ Ы1УГОА; это приводит к отчетливому усилению флуоресценции ОСР, приводящему к сдвигу вправо (по шкале нарастания АФК) субпопуляции клеток, реагирующих с ЫМЕ>А.

0 200 400 600 800 1000

Концентрация ММРА, мкМ

Рис. 5. Концентрационная зависимость флуоресценции ОСР от NMDA для Т-лимфоцитов (1) и 1\К-клеток (2).

4. Влияние NMDA иа продукцию IFN- у лимфоцитами человека

В организме лимфоциты могут находиться в двух функционально значимых состояниях: покоя и активации. Связывание их с такими факторами, как ИЛ-2 или ФГА запускает клеточные программы пролиферации, дифференциации и транскрипции генов, значимых для иммунного ответа. Так, сигнал, опосредованный ИЛ-2, приводит к быстрой гетеродимеризации ИЛ-2-рецептора и активации тирозиновых киназ, которые фосфорилируют большое количество внутриклеточных белков, приводя в действие транскрипционные факторы (Cippitelli et al., 1995; Schroder et al., 2004). Одной из важных особенностей Т-лимфоцитов и NK-клеток является способность синтезировать интерферон-у (IFN-y), который может лизировать опухолевые и зараженные вирусом клетки, а также регулировать работу макрофагов (Gesbert et al., 1998).

Z 18

а 12 г ю

ч

& 8 С * 6

1 <

2 о □ С=1

Контроль ЫМРА

Рис. 6. Эффект NMDA на продукцию №N-7 лимфоцитами человека (А -определение количества №N-7 продуцирующих клеток, Б - определение накапливающегося 1ПЧ-у).

Мы изучили влияние ЫМЭА на продукцию №N-7 клетками, активированными ФГА и ИЛ-2 по стандартной методике. Чтобы наиболее полно охарактеризовать этот процесс, мы применяли два разных подхода, определяя количество клеток, способных синтезировать 1ПЧ-у, а также проводя количественное измерение ШЫ-у в среде культивирования клеток.

Количество 1РМ-у-синтезирующих лимфоцитов определяли после окрашивания суспензии анти-С016 и анти-СОЗ антителами, конъюгированными с фикоэритрином, и моноклональными антителами к ¡ПМ-у, конъюгированными с ФИТЦ, и их последующего анализа в проточном цитометре. Клетки инкубировали с ИЛ-2 и ФГА в течение 18 ч в присутствии 500 цМ ЫМОА.

Как видно из Рис. 6А, на покоящиеся лимфоциты ЫМЭА влияния не оказывает, однако после стимуляции клеток ИЛ-2 их инкубация с 500 цМ NMDA приводит к снижению количества П-Ы-у-продуцирующих клеток

ил-

2+NMDA

1400 1200

Контроль NMDA ИЛ-2

ИЛ-2+NMDA

практически до уровня контроля. На Рис. 6Б приведены результаты исследования накопления во внеклеточной среде IFN-y, высвобождаемого активированными NK-клетками. Полученные данные подтверждают, что NMDA подавляет синтез этого цитокина. Аналогичные результаты были получены при активации Т-лимфоцитов и NK-клеток с ФГА (10 мг/мл).

5. Характеристика Т-лимфоцитов в очаге воспаления, созданном

механическим повреждением сшитого мозга Исходя из данных, полученных в экспериментах «in vitro», и сведений, известных из литературы, мы предположили, что влияние NMDA на лимфоциты может иметь наибольшее значение при активации их в условиях воспаления в мозге. Ведь экспрессия NMDA-рецепторов иммунокомпетентными клетками начинается при условии их активации в присутствии NMDA. Естественным аналогом и агонистом NMDA-рецепторов в организме является глутамат. Как известно, концентрация этого нейромедиатора увеличивается в межсинаптической области нейрональных контактов, спинно-мозговой жидкости и плазме в условиях воспаления, вызванного различными патологиями. Это может провоцировать усиленную экспрессию NMDA-рецепторов возбужденными лимфоцитами.

Для индукции воспаления использовали технику искусственного компрессионного повреждения спинного мозга (Spinal Cord Injury, SCI), впервые описанную Тарловым (Tarlov et al., 1953). В этих условиях инфильтрация лимфоцитов в ткань происходит в течение 1 недели после создания SCI. Мы исследовали срезы спинного мозга животных на разных сроках после воспаления и убедились, что в поврежденной ткани уже на 5 день после операции наблюдается аккумуляция лимфоцитов, причем скопление их происходит, в основном, в белом веществе непосредственно в очаге воспаления (Рис. 7).

На Рис. 7А представлен вид среза, окрашенного DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole), иллюстрирующий повреждение в дорсальной области спинного мозга. DAPI связывается с ДНК и, таким образом, визуализирует ядра клеток. На фотографии отчетливо видны неокрашенные регионы, соответствующие разрывам ткани спинного мозга, характерным для гистологической картины данной модели воспаления. На Рис. 7Б изображен срез, окрашенный anti-CD3 антителами для флуоресцентной микроскопии, показывающий накопление Т-лимфоцитов в очаге воспаления.

Несмотря на то, что модель SCI достаточно хорошо изучена, до сих пор в литературе не существовало данных о времени начала миграции лимфоцитов в поврежденную ткань спинного мозга. В наших исследованиях было продемонстрировано, что до 4 дня включительно в срезах практически не

обнаруживается лимфоцитов, однако начиная с 5 дня в местах повреждения ткани наблюдается активная инфильтрация Т-лимфоцитов, которые мы идентифицировали при помощи моноклональных антител к CD3 рецептору.

Пик аккумуляции лимфоцитов приходится на 6-7 сутки после операции, и в дальнейшем лимфоциты обнаруживались в срезах в течение всех 14 дней наблюдения. На Рис. 7 представлен вид срезов, взятых из зоны очага воспаления, окрашенных моноклональными анти-СйЗ антителами для световой микроскопии на 4 (В), 6 (Г) и 14 (Д) дни после операции. На фотографиях стрелками обозначены лимфоциты, связавшиеся с антителами. Они имеют характерную округлую форму и хорошо различимы в массиве поврежденной ткани.

6. Т-лимфоциты, активированные "in vivo" с помощью SCI, экспрессируют NR1 субъединицу NMDA-рецептора

Методом двойного окрашивания NR1 субъединицы и CD3 рецептора Т-лимфоцитов по методике, описанной выше, мы показали, что все Т-лимфоциты, инфильтрирующиеся в очаг воспаления, несут на своей мембране NR1-субъединицу NMDA-рецептора. Для лучшей визуализации на Рис. 8 синий цвет флуоресцентной метки Alexa fluor 594 заменен на красный с помощью компьютерной программы.

На Рис. 8А стрелками отмечены лимфоциты, концентрирующиеся в очаге воспаления, окрашенные обоими видами антител. На Рис. 8Б в качестве позитивного контроля представлен срез спинного мозга, окрашенный антителами к NRl-субъединице NMDA-рецептора. На срезах видны тела моторных нейронов в латеральной области серого вещества с неокрашенными ядрами и дендритными отростками, презентирующие NMDA-рецептор.

Известно, что далеко не все лимфоциты, мигрировавшие в воспаленный мозг в течение первой недели, задерживаются там. Большая их часть возвращается обратно в кровоток спустя короткий промежуток времени. Остается лишь небольшой пул клеток, по-видимому, способный распознавать тканевые маркеры, а возможно, и причину, вызвавшую инфильтрацию (Hickey, 1991), Накапливающиеся лимфоциты способны регулировать активность макрофагов, действуя на них цитокинами, такими как интерлейкины и интерферон-у, и влияя на протекание воспалительных реакций (Lodge, 1996).

Интересно отметить, что все Т-лимфоциты, обнаруженные нами в поврежденной ткани, презентируют NMDA-рецепторы, что может быть свидетельством тканеспецифичности данного пула клеток. Естественным агонистом этих рецепторов в клетках, которые их экспрессируют, может быть глутамат. В таком случае его функция может заключаться в модуляции свойств иммунокомпетентных клеток.

А

'1 .

■а ; " /

у

в

Рис. 7. Вид срезов спинного мозга крысы, взятых из очага воспаления, индуцированного введением катетера с 12,5 мкл жидкости. Срезы окрашены флуоресцентным красителем ОАР1 (А) для визуализации сайта повреждения и ^ РЕ-конъюгированными

V моноклональными анти-СБЗ антителами

(Б) для идентификации лимфоцитов методом флуоресцентной микроскопии. В, Г и Д соответствуют картине срезов, взятых на 4, 6 и 14 день после операции и окрашенных антителам к СБЗ-Д рецепторам Т-лимфоцитов (световая

микроскопия).

Рис. 8. Срезы спинного мозга с находящимися в очаге воспаления Т-лимфоцитами (А) и мотонейронами в сером веществе (Б), презентирующими NR1 субъединицу NMDA-рецептора (6 день после операции). Жёлтый цвет лимфоцитов получается в результате двойного окрашивания антителами к NR-1 субъединице (зелёный) и СОЗ-маркеру (красный).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе мы впервые продемонстрировали экспрессию NMDA-рецепторов в иммунокомпетентных клетках, а также показали, что уровень этой экспрессии зависит от функционального состояния лимфоцитов и присутствия NMDA. Результаты исследований указывают на то, что активация лимфоцитов NMDA происходит по механизмам, аналогичным описанному для нейронов, и влечет за собой снижение иммунореактивности клеток. Активация NMDA-рецепторов приводит к подавлению синтеза интерферона-у.

В условиях воспаления спинного мозга «in vivo» все лимфоциты, накапливающиеся в очаге воспаления, несут на своей поверхности NMDA-рецепторы. Длительная активация глутаматных рецепторов должна приводить к истощению иммунной системы. В случае, когда развитие патологических процессов сопровождается накоплением токсических метаболитов, как, например, гомоцистеина, который является конгенером глутамата, способным активировать NMDA-рецепторы, экзайтотоксический эффект гомоцистеина может быть направлен не только на нейроны, но и на клетки иммунной системы, экспрессирующие эти рецепторы. Таким образом, NMDA-рецепторы в иммунокомпетентных клетках могут выполнять функции модуляции иммунного ответа.

Более того, NMDA-рецепторы играют важную роль в развитии и регуляции воспаления в ЦНС или в других тканях в условиях повышенных концентраций агонистов NMDA-рецепторов.

выводы

1.С помощью ОТ-ПЦР впервые продемонстрировано наличие мРНК для канальной субъединицы NMDA-рецептора в лимфоцитах крысы.

2. N-метил-О-аспартат, специфический агонист глутаматных рецепторов NMDA-класса, вызывает рост свободных радикалов в лимфоцитах, ассоциированный с увеличением концентрации внутриклеточного Са2+.

3. Анализ субпопуляций лимфоцитов, чувствительных к NMDA, показал, что в реализации клеточного ответа на NMDA участвуют Т-лимфоциты и NK-клетки.

4. Доля лимфоцитов, несущих NMDA-рецепторы, существенно возрастает при стимуляции лимфоцитов «in vitro» интерлейкином-2 или ФГА.

5. В опытах «irt vivo» на модели спинномозговой травмы у крыс показано, что лимфоциты, мигрирующие в очаг воспаления, несут на своих мембранах NMDA-рецепторы.

6. NMDA подавляет синтез INF-y в субпопуляциях Т-лимфоцитов и NK-клеток, стимулированных ИЛ-2 или ФГА.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Boldyrev A., Kazey V., Leinsoo T., Mashkina A., Tyulina 0., Johnson P., Tuneva J., Chittur S. and Carpenter D. (2004) Rodent lymphocytes express functionally active glutamate receptors Biochem. Biophys. Res. Commun.-,324,133-139.

2. Boldyrev A., Mashkina A., Tyulina O., Johnson P., Tuneva J and Carpenter D. (2004) Glutamate effects on ROS levels in rodent lymphocytes. J. Neurochem. ,90 (Suppl. 1),AP7-01.

3. Boldyrev A., Bulygina E., Davydova O., Mashkina A., Vladychenskaya E., Tyulina O. (2006) Functional role of glutamate receptors of NMDA-class in immune system. 29lh Annual Meeting Neurochem. Soc. Jap., Abstract #20001.

4. Mashkina A., Tyulina O., Kovalenko E., Kanevski L., Johnson P., Boldyrev A. (2006) Glutamate Receptor-mediated increases in reactive oxygen species affect human lymphocyte interferon-y production. ll'h Int. Congress "Molecular basis of neurological and psychiatric disorders ", p. 66.

5. Mashkina A., Tyulina O., Solovyova T., Kovalenko E., Kanevski M., Johnson P., Boldyrev A. (2007) The excitotoxic effect of NMDA on human lymphocyte immune function. Neurochem. Int., 51, 356-360.

6. Maxpo A.B., Машкина А.П., Соленая O.A., Трунова О. А., Козина JI.C., Арутюнян A.B., Булыгина Е.Р. (2008) Пренатальная гипергомоцистеинемия как модель окислительного стресса мозга. Бюлл. Эксп. Биол. Мед., 146, №7, 37-39.

7. Махро A.B., Машкина А.П., Соленая O.A., Трунова O.A., Тюлина О.В., Булыгина Е.Р., Болдырев А.А (2008) Карнозин защищает от окислительного стресса, вызванного гипергомоцистеинемией. Нейрохимия, 25, №3, 1-8.

8. Mashkina A., Vanicky I., Boldyrev А. (2010) NMDA-receptors are expressed in lymphocytes activated both "in vitro" and "in vivo". Cell Molec. Neurobiol.

Краткая аннотация диссертационной работы А. П. Машкиной «Обнаружение NMDA-рецепторов в лимфоцитах и их характеристика».

Работа посвящена изучению влияния специфического агониста глутаматных рецепторов NMDA-класса, N-метил-О-аспартата, на лимфоциты периферической крови человека и крыс. В работе методом ОТ-ПЦР впервые установлено наличие в лимфоцитах периферической крови крыс мРНК, кодирующей основную белковую субъединицу NMDA-рецепторного комплекса (NR1). При помощи иммуноцитохимического окрашивания показано присутствие соответствующего белка на мембране клеток, активированных в условиях «in vitro» и «in vivo». В ходе работы было установлено, что NMDA вызывает окислительный стресс лимфоцитов и отрицательно влияет на реактивную способность этих клеток.

Summary of Ph.D. Thesis by Mashkina A. entitled "Detection of NMDA-receptors in lymphocytes and its description"

The study is devoted to investigation of N-methyl-D-aspartathe, a specific agonist of NMDA-class glutamate receptors, on human and rat peripheral blood lymphocytes (PBL). In this work for the time by means of RT-PCR has been shown the presence of mRNA coding canal protein subunit of NMDA-receptor complex in rat PBL. With help of immunocytochemical staining the presence of corresponding protein on membrane of cells, activated "in vitro" and "in vivo" conditions, has been shown. As a result of this work it has been established that NMDA causes oxidative stress in lymphocytes and influences negatively on their immunoreactivity.

ЗаказЛ;! 65-а/04/10 Подписано в печать 16.04.2010 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Машкина, Анна Петровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1.1. Клетки иммунной системы и их рецепторы.

1.1.1. Общие представления об иммунной системе.

1.1.2. Клетки иммунной системы.

1.1.3. Поверхностные маркеры субпопуляций лейкоцитов.

1.1.4. Активация лимфоцитов.

1.1.4.1. Роль кальция в активации лимфоцитов.

1.1.4.2. Участие А ФК в активации лимфоцитов.

Глава 1.2. Воспаления центральной нервной системы.

1.2.1. Иммунопривилегированность.

1.2.2. Стадии воспаления.

1.2.3. Взаимосвязь нервной и иммунной систем.

1.2.4. Влияние цитокинов на метаболизм глутамата в мозге.

Глава 1.3. Распространение и функции глутаматных рецепторов.

1.3.1. Классификация глутаматных рецепторов.

1.3.2. NMDA-рецептор: структура и функци.

1.3.2.1. Структура NMDA-рецептора: субъединичный состав и лигандная специфичность.

1.3.2.2. Десенсибилизация.

1.3.2.3. Фосфорилирование.

1.3.2.4. Встраивание в мембрану и формирование функционально активного рецепторного комплекса.

1.3.2.5. Экзайтотоксичность.

Глава I. 4. Глутаматные рецепторы лимфоцитов.

Цель и задачи исследования.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Положения, выносимые на защиту.

II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ПЛ. Материалы и методы исследования.

II.1. Объекты исследования.

II. 1.1. Отбор крови.

II.1.2. Выделение лимфоцитов.

II. 1.3 Первичная культура периферических лимфоцитов.

11.1.4. Модель индуцированного компрессионного повреждения спинного мозга у крыс.

11.2. Используемые подходы и регистрируемые параметры.

П.2.1.0пределепие экспрессии гена GRI.

II.2.1.1. Выделение РНК и обратная транскрипция.

7.2.2.2. Полимеразная цепная реакция.

7.2.5.5. Электрофорез ДНК.

11.2.2. Проточная цитометрия.

11.2.3. Определение внутриклеточного уровня АФК.

П.2.4.0пределение доли мертвых клеток.

11.2.5. Иммунофенотипирование.

11.2.6. Определение экспрессии NRl-субъединицы NMDA-рецептора.

11.2.7. Количественное определение интерферона-у.

11.2.8. Определение количества клеток продуцирующих интерферон-у.

11.2.9. Приготовление и окрашивание срезов спинного мозга для микроскопии.

11.3. Статистическая обработка результатов.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ.

111.1. Определение экспрессии мРНК к глутаматным рецепторам крысы.

111.2. Определение экспрессии NRl-субъединицы NMDA-рецепторного комплекса на поверхности лимфоцитов.

111.2.1. Идентификация NRl-субъединицы с помощью моноклональных антител.

111.2.2. Влияние NMDA на экспрессию NR1 в лимфоцитах человека.

111.3. Исследование действия NMDA на функциональное состояние лимфоцитов.

111.4. Распределение клеток в субпопуляциях лимфоцитов.

111.5. Влияние NMDA на продукцию IFN-y лимфоцитами человека.

111.6. Характеристика Т-лимфоцитов в очаге воспаления, созданном механическим повреждением ткани спинного мозга.

111.7. Т-лимфоциты, активированные "in vivo" в условиях спинномозговой травмы, экспрессируют NRl-субъединицу NMDA-рецептора.

Список сокращений

АФК - активные формы кислорода

ИЛ - интерлейкин

КФГ - (8)-4-карбоксифенилглицин

ГЦ - гомоцистеин

ГЦК - гомоцистеиновая кислота

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ТкР - Т-клеточный рецептор

ФХЭ-А - анафилактический фактор хемотаксиса эозинофилов

ЦНС - центральная нервная система

3-HPG - 3-гидроксифенилглицин

ACPD - 1-аминоциклопентан-1,3-дикарбоксилат

АМРА - а-амино-3 гидрокси-метил-4-изоксазолпропионовая кислота

Caspase - Cysteine-requiring Aspsrtate Protease

CD - кластер дифференциации

CSI - Spinal Cord Injury

D-AP5 - D-2 амино-5-фосфорновалериат

DCF - дихлорфлуоресцеин

DCFH2-DA - 2',7'-дихлорфлуоресцеин диацетат

EAAT - Excitatory amino acid transporter

ELISA - Enzyme linked immuno-sorbent assay

FITC - флуоресцеинизотиоцианат

FL1 - логарифмическая ось зелёной флуоресценции

FL2 - логарифмическая ось красной флуоресценции

FL3 - логарифмическая ось оранжевой флуоресценции

IFN-y - interferon (интерферон) у

L-AP4 - L-амино 4-фосфонобутират

МК-801 - трапс-Б-метил-10,11 -дигидро-5н-бензо[а,ё]циклопентен-5,10иминмалеат NADPH - никотинадениндинуклеотидфостат NK - натуральные киллеры

NMDA - N-Mexim-D-acnapTaT PBS - фосфатно-солевой буфер РЕ - фикоэритрин PI - пропидий иодид РКС - протеинкиназа С РМА - форболмиристатацетат

Введение Диссертация по биологии, на тему "Обнаружение NMDA-рецепторов в лимфоцитах и их характеристика"

Общепринято, что мозг является иммунопривилегированным органом, где не обнаруживаются лимфоузлы и не встречаются лимфоциты. Эта особенность мозга поддерживается за счет существования гематоэнцефалического барьера, который не дает клеткам иммунной системы мигрировать в мозг из кровотока. Более того, кроме астроцитов в центральной нервной системе (ЦНС) не встречается клеток, способных презентировать молекулы МНС (Major Histocompatibility Complex) [Engelhardt, 1996; Sehgal and Berger, 2000]. Однако при развитии нейродегенеративных заболеваний это свойство, обеспечивающее стабильную работу ЦНС в нормальных условиях, грозит развитием аутоиммунных реакций [Gendelman, 2002]. Таким образом, взаимодействие нервной и иммунной систем представляется важным и актуальным направлением современной биологии.

Недавно в литературе появились данные о возможности непосредственной регуляции функций иммуннокомпетентных клеток со стороны нервной системы [Wrona, 2005]. Эта регуляция может осуществляться как через центральную эндокринную систему, включающую гормоны гипоталамуса [Munck and Guyre, 1991], так и при реализации симпатических путей за счет иннервации лимфоидных органов [Shimizu et al., 1994]. В осуществлении нормального «диалога» между нервной и иммунной системами важное значение имеют такие нейромедиаторы, как дофамин и ацетилхолин [Basu and Dasgupta, 2000; Pavlov et al., 2003; Saeed et al., 2005]. В последнее время обращает на себя внимание глутамат, как еще один возможный участник этого диалога.

Глутамат является важным нейротрансметтером. До последнего времени глутаматные рецепторы, в том числе и рецепторы NMDA-класса, обеспечивающие когнитивные процессы и память, считались специфическими маркерами нейрональной ткани. Однако недавно стали появляться данные о том, что лимфоциты обладают спсообностыо специфически связывать глутамат [Костянян и соавт. 1997], а функционально активные NMDA-рецепторы могут экспрессироваться в некоторых иммунокомпетентных клетках [Lombardi et al., 2001; Boldyrev et al., 2004]. Вышеперечисленные факты поднимают вопрос о том, каким образом данный класс рецепторов может участвовать в функциональном ответе лимфоцитов и в их взаимодействии с нервной тканью.

Эта проблема приобретает дополнительный интерес применительно к патологическим состояниям, характеризующимся воспалительными процессами в ЦНС, к ишемии головного мозга, рассеянному склерозу, болезни Альцгеймера и гипергомоцистеинемии, — процессам, протекающим на фоне выраженного окислительного стресса. Общей чертой в развитии таких заболеваний является значительное повышение уровня свободного глутамата как в мозге и спинномозговой жидкости (с 1,8 (J.M до 8 цМ), так и в плазме крови (с 50 цМ до 200 jxM и более) [Spreux-Varoquaux et al, 2002]. Это приводит к нейрональной смерти вследствие развития экзайтоксических механизмов [Carpenter, 2002] и привлечению лимфоцитов в очаг воспаления. В связи с вышесказанным установление экспрессии NMDA-рецепторов в клетках иммунной системы и исследование их возможного участия в этих процессах является актуальной проблемой, имеющей большое значение, как для нейрохимии, так и для клинической биохимии и медицины.

I. Обзор литературы

Данный обзор сфокусирован на имеющихся в литературе данных об экспресси глутаматных рецепторов в иммунокомпетентных клетках. Поскольку иммунная система представлена разнообразными компонентами, сложно взаимодействующими между собой, мы сочли необходимым описать некоторые из них. Особое внимание в обзоре уделено объекту исследования - клеткам врожденного иммунитета: их функциям, основным активирующим факторам и внутриклеточным изменениям после активации. В Главе 1.2 следующего текста рассказывается о воспалительных процессах в ЦНС и взаимодействии нервной и иммунной систем, в частности, об изменениях, происходящих при компрессионном повреждении мозга, так как эта модель была использована в исследованиях. Вторая половина обзора содержит литературные данные о NMDA-рецепторах, их структуре и функциях, а также немногочисленные литературные данные, о присутствии этих белков в лимфоцитах.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Машкина, Анна Петровна

выводы

1. С помощью ОТ-ПЦР впервые продемонстрировано наличие мРНК для канальной субъединицы NMDA-рецептора в лимфоцитах крысы.

2. N-Meran-D-acnapTaT, специфический агонист глутаматных рецепторов NMDA-класса, вызывает рост свободных радикалов в лимфоцитах, гл 2+ ассоциированный с увеличением концентрации внутриклеточного Са .

3. Анализ субпопуляций лимфоцитов, чувствительных к NMDA, показал, что в реализации клеточного ответа на NMDA участвуют Т-лимфоциты и NK-клетки.

4. Доля лимфоцитов, несущих NMDA-рецепторы, существенно возрастает при стимуляции лимфоцитов «in vitro» интерлейкином-2 или ФГА.

5. В опытах «in vivo» на модели спинномозговой травмы у крыс показано, что лимфоциты, мигрирующие в очаг воспаления, несут на своих мембранах NMDA-рецепторы.

6. NMDA подавляет синтез INF-y в субпопуляциях Т-лимфоцитов и NK-клеток, стимулированных ИЛ-2 или ФГА.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю искреннюю благодарность всем сотрудникам кафедры биохимии биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, а также сотрудникам лаборатории нейрохимии Научного Центра Неврологии РАМН, за их доброжелательное отношение и участие в обсуждении данной работы: Н.Б. Гусеву, А.Г. Катрухе, С.Л. Стволинскому, О.В. Тюлиной, Е.Р. Булыгиной, Л.В. Карповой. Особую благодарность я приношу сотруднику группы А.Г. Катрухи Татьяне Соловьевой, сотруднику лаборатории межклеточных взаимодействий ИБХ имени М.А. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Е.И. Коваленко и директору Института Нейробиологии (Кошице) профессору Иво Ваницкому, принимавшим участие в экспериментах по исследованию экспрессии NMDA-рецепторов.

Я благодарю своего научного руководителя Александра Александровича Болдырева за постоянное внимание, терпение, понимание и искреннюю поддержку, проявленные за все время проведения данной работы. Я благодарна ему за уникальный опыт поисковой исследовательской работы, за приобретенные навыки и самостоятельность.

Я также хочу поблагодарить сотрудников нашей группы за теплую рабочую атмосферу, и всех, без чьей дружеской заботы и поддержки данная работа не могла бы состояться — моих родителей, сестру, близких и друзей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе мы впервые показали присутствие мРНК для белка канальной субъединицы NMDA-рецептора в лимфоцитах. Продемонстрировали, что активность её экспрессии зависит от функционального состояния лимфоцитов и присутствия NMDA. Так покоящиеся лимфоциты практически не несут на своей мембране NMDA-рецепторы, однако после стимуляции их цитокинами, начинается более активное презентирование этого белка. NMDA критическим образом усиливает этот процесс, оказывая индуцирующее действие на экспрессию своих рецепторов. Результаты исследования указывают, что действие NMDA на лимфоциты происходит по механизмам, аналогичным описанным для нейронов. Так при взаимодействии лимфоцитов с NMDA возрастает концентрация внутриклеточного кальция и происходит увеличение уровня свободных радикалов в цитоплазме лимфоцитов. Длительная инкубация активированных клеток с NMDA влечет за собой снижение иммунореактивности клеток. Активация NMDA-рецепторов в них приводит к подавлению синтеза интерферона-у. В условиях воспаления спинного мозга «in vivo» все лимфоциты, накапливающиеся в очаге воспаления, несут на своей поверхности NMDA-рецепторы.

Функциональная роль NMDA-рецепторов и их сигнальные каскады в лимфоцитах требуют дальнейшего изучения. Однако, опираясь на нашу работу можно сделать несколько предположений.

Известно, что далеко не все лимфоциты, мигрировавшие в воспаленный мозг в течение первой недели, задерживаются там. Большая их часть возвращается обратно в кровоток, спустя короткий промежуток времени. Остается лишь небольшая субпопуляция, по-видимому, способная распознавать тканевые маркеры, а возможно, и причину, вызвавшую инфильтрацию [Hickey, 1991]. Так как все Т-лимфоциты обнаруженные нами в поврежденной ткани, являются NMDA-позитивными, можно предположить, что это свойство связано с тканеспецифичностыо данного пула клеток.

В медицинской практике известны случаи рецидивов воспаления после компрессионных повреждений мозга. Чаще всего воспаление начинается на третьей неделе после заживления места компрессии. Этот феномен очень похож на развитие хронической реакции иммунной системы на нарушение в этом участке мозга. На стр. 14 мы подробно говорили о двух различных субпопуляциях лимфоцитов Т-хелперов (Тх), различающихся по способности синтезировать различные профили цитокинов. Напомним, что у человека Тх1-клетки, продуцируют IFN-y, TNF (Tumor Necrosis Factor) и ИЛ-2 стимулируют фагоцитоз у макрофагов, а также вызывают усиление воспалительных процессов. Тх2 синтезируют ИЛ-4-6, ИЛ-9,10 и ИЛ-13. Их активация приводит к гиперпродукции антител класса Е и аллергическим реакциям.

Цитокины, выделяемые одним типом Тх-клеток, подавляют продукцию других. Таким образом, любой иммунный ответ развивается в направлении Тх-1 или Тх-2 [Carter et. al., 1996, Romagani, 1995]. Механизм переключения следующий, под действием интерферона-у макрофаги человека экспрессируют 1-а-гидроксилазу, которая может превращать неактивный циркулирующий 25-гидроксихолекальциферол в активный 1,25-дигидроксихолекальциферол (витамин D3 или кальцитриол). Он дополнительно стимулирует макрофаги через специфический рецептор на их поверхности. Кроме того, по механизму обратной отрицательной регуляции кальцитриол оказывает мощный подавляющий эффект на Тх1-лимфоциты. Этот эффект является способом переключения иммунного ответа с Txl-типа на Тх2-тип ответа в тех случаях, когда возбудитель не может быть устранен из ткани, и воспаление, как реакция клеточного иммунитета, становится хронической [Ройт и др., 2000].

Как известно, в очаге повреждения нервной ткани из-за гибели астроцитов высвобождается большое количество глутамата - естественного агониста NMDA-рецепторов (стр. 32). В наших экспериментах мы показали, что NMDA подавляет продукцию интерферона-у. Возможно, избыток глутамата служит дополнительным стимулом для переключения ответа на Тх2-тип для скорейшего устранения острой фазы воспаления в мозге, но таким образом приводит к хроническим воспалениям.

В Главе 1.2.4. «Влияние цитокинов на метаболизм глутамата в мозге» мы обсуждали роль интерферона-у, как стимулирующего фактора для поглощения глутамата глией. Можно предположить, что тяжесть воспалительных процессов в мозге, при которых даже здоровые нейроны страдают от ишемии [Blight et al., 2002], связана с неспособностью лимфоцитов синтезировать интерферон-у при активации NMDA-рецепторов глутаматом. Что приводит к еще большему накоплению глутамата в мозге. Все эти данные указывают на то, что NMDAрецепторы могут играть значительную роль во взаимодействии нервной и иммунной системы и требуют дальнейшего изучения.

В настоящей работе мы подтвердили косвенные литературные данные об экспрессии NMDA-рецепторов в лимфоцитах грызунов. И показали, что уровень их экспрессии значительно зависит от функционального состояния лимфоцитов и присутствия NMDA. Результаты исследований указывают на то, что действие NMDA на лимфоциты происходит по схожим с нейронами экзайтотоксическим механизмам и влечет за собой снижение иммунореактивности клеток. В условиях воспаления спинного мозга "in vivo", все лимфоциты, накапливающиеся в очаге воспаления, несут на своей поверхности NMDA-рецепторы. Таким образом, следует подчеркнуть, что NMDA-рецепторы могут играть значительную роль в развитии и регуляции воспалений, как в ЦНС, так и в других тканях в условии повышенных концентраций природных агонистов NMDA-рецепторов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Машкина, Анна Петровна, Москва

1. Ашмарин И. П., Стукалов П. В. (1996) Нейрохимия. М. Изд. Ин-та Биомед. Хим. РАМЩ230-259.

2. Болдырев А.А. (2000) Функциональные взаимодействия между глутаматными рецепторами разных классов. Бюлл. эксп. биол. мед.; 130(7):823-829.

3. Галактионов В.Г. (2000) Иммунохимия. М., Изд. Нива России; 347-360.

4. Костанян И. А., Наволоцкая Е. В., Нуриева Р. И., Завьялов В. П., Липкин В. М. (1997) Взаимодействие L-глутаминовой кислоты с Т-лимфоцитами человека. Биоорг. хим.; 23:805-808.

5. Крыжановский Г.Н., Магаева С.В., Макаров С.В., Сепиашвили Р.И. (2003) Нейроиммунопатология. Руководство. М., Изд-во НИИ общей патологии и патофизиологии;А\2-АЪЪ.

6. Полетаев А.Б., Морозов С.Г., Ковалев И.Е. (2002) Регуляторная метасистема: Иммунонейроэндокринная регуляция гомеостаза. М: Медицина; 120-168.

7. Рассанов С.П., Маянский А.Н., Чеботарь И.В. (1987) Хемилюминесценция лимфоцитов человека в процессе стимуляции фитогемагглютинином. Жури, микробиол. иммунобиол.;5:64-67.

8. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. (2000) Иммунология. М., Мир.

9. Тунева Е.О., Давыдова О.Н., Болдырев А.А. (2003) Эффект NMDA на генерацию активных форм кислорода в лейкоцитах человека. Бюлл. эксп. биол. л*ед.;136(4):151-154.

10. Alberati-Giani D., Ricciardi-Castagnoli P., Kohler С., Cesura A. (1996) Regulation of the kynurenine metabolic pathway by interferongamma in murine cloned macrophages and microglial cells. JNeurochem.; 66(3):996-1004.

11. Andersson O., Stenqvist A., Attersand A., von Euler G. (2001) Nucleotide sequence, genomic organization, and chromosomal localization of genes encoding the human NMDA receptor subunits NR3A and NR3B. Genomics.; 78(3): 178-184.

12. Ascher P. (1989) Glutamate receptors and glutamatergic synapses. In: Receptors, Membrane Transport, and Signal Transduction. (Eds. Evangelopoulos A. E., Changeux J. P., et al). NATO 10S Series: Cell Biology,29:121-146.

13. Bakalash S., Kessler A., Mizrahi Т., Nussenblatt R., Schwartz M. (2003) Antigenic specificity of immunoprotective therapeutic vaccination for glaucoma. Invest Ophthalmol Vis. Sc/.;44(8):3374-3381.

14. Baldridge C., Gerard R. (1993) The extra respiration of phagocytosis. Am. J. Physiol.-,103:235-236.

15. Bartholdi D., Schwab M. (1995) Methylprednisolone inhibits early inflammatory processes but not ischemic cell death after experimental spinal cord lesion in the rat. Brain i?ey.;672(l-2): 177-186.

16. Bartholdi D., Schwab M. (1997) Expression of pro-inflammatory cytokine and chemokine mRNA upon experimental spinal cord injury in mouse: an in situ hybridization study. Eur. J. Neurosci.;9(7): 1422-1438.

17. Bauer J., Ruuls S., Huitinga I., Dijkstra C. (1996) The role of macrophage subpopulations in autoimmune disease of the central nervous system. Hislochem J.;28(2): 83-97.

18. Beal M. (1995) Aging, energy, and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Ann. Neurol.\38(3):357-366.

19. Behrmann D., Bresnahan J., Beattie M., Shah B. (1992) Spinal cord injury produced by consistent mechanical displacement of the cord in rats: behavioral and histologic analysis. J Neurotrauma;9{3): 197-217.

20. Bertrand G., Gross R., Puech M., Loubatieres-Mariani M., Bockaert J. (1992) Evidence for a glutamate receptor of the AMPA subtype which mediates insulin release from rat perfused pancreas. Br. J. Pharmacol.-,106(2):354-359.

21. Bethea J., Dietrich W. (2002) Targeting the host inflammatory response in traumatic spinal cord injury. Curr. Opin. Neurol.;l5(3):355-360.

22. Bishopric N., Cohen H., Lefkowitz R. (1980) Beta adrenergic receptors in lymphocyte subpopulations. J. Allergy Clin. Immunol.;65(l):29-33.

23. Blight A. (1991) Morphometric analysis of blood vessels in chronic experimental spinal cord injury: hypervascularity and recovery of function. J. Neurol. Sc/.;106(2): 158-174.

24. Blight A. (2002) Miracles and molecules—progress in spinal cord repair. Nat. Neurosci.;5 (Suppl):1051-1054

25. Blight A., Cohen Т., Saito K., Heyes M. (1995) Quinolinic acid accumulation and functional deficits following experimental spinal cord injury. Brain-, 118(Pt 3): 735-752.

26. Bliss Т., Collingridge G. (1993) A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature.;361(6401):31-39.

27. Boldyrev A., Carpenter D., Johnson P. (2005) Emerging evidence for a similar role of glutamate receptors in the nervous and immune systems. J. Neurochem. ;95(4):913-918.

28. Boldyrev A., Kazey V., Leinsoo Т., Mashkina A., Tyulina O., Johnson P., Tuneva J., Chittur S. and Carpenter D. (2004) Rodent lymphocytes express functionally active glutamate receptors Biochem. Biophys. Res. Comm.;324,\33-\39.

29. Boutin H., LeFeuvre R., Horai R., Asano M., Iwakura Y., Rothwell N. (2001) Role of IL-lalpha and IL-lbeta in ischemic brain damage. J. Neurosci.;21(15):5528-5534.

30. Bregestovski P., Redkozubov A., Alexeev A. (1986) Elevation of intracellular calcium reduces voltage-dependent potassium conductance in human T cells. iVatare.;319(6056):776-778.

31. Cahalan M., Wulff H., Chandy K. (2001) Molecular properties and physiological roles of ion channels in the immune system. J. Clin. Immunol. ;21(4):235-252.

32. Carlson S., Parrish M., Springer J., Doty K., Dossett L. (1998) Acute inflammatory response in spinal cord following impact injury. Exp. Мшго/.;151(l):77-88.

33. Carroll R., Zukin R. (2002) NMDA-receptor trafficking and targeting: implications for synaptic transmission and plasticity. Trends Neurosci.;25(ll):57\~577.

34. Carter L., Dutton R. (1996). Type 1 and type 2 a fundamental dichotomy for all T cell subsets. Curr. Opin. Immunol.;8:336-342.

35. Casella G., Marcillo A., Bunge M., Wood P. (2002) New vascular tissue rapidly replaces neural parenchyma and vessels destroyed by a contusion injury to the rat spinal cord. Exp. Neurol. ;173(l):63-76.

36. Chen L., Huang L. (1992) Protein kinase С reduces Mg2+ block of NMDA-receptor channels as a mechanism of modulation. Nature.;356(6369):521-523.

37. Choi D., Rothman S. (1990) The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death. Annu. Rev. Neiirosci. ;13:171 -182.

38. Crabtree G. (2001) Calcium, calcineurin, and the control of transcription. J. Biol. C/zem.;276(4):2313-2316.

39. Craig A., Banker G. (1994) Neuronal polarity. Annu. Rev. Neurosci.;17:267-310.

40. Crowe M., Bresnahan J., Shuman S., Masters J., Beattie M. (1997) Apoptosis and delayed degeneration after spinal cord injury in rats and monkeys. Nat. Med.;3(l):73-76.

41. Cull-Candy S., Brickley S., Farrant M. (2001) NMDA receptor subunits: diversity, development and disease. Curr. Opin. Neurobiol;ll(3):327-35.

42. Dambinova S., Izykenova G., Burov S., Grigorenko E., Gromov S. (1997) The presence of autoantibodies to N-terminus domain of GluRl subunit of AMPA receptor in the blood serum of patients with epilepsy. J. Neurol 5,c/'.;152(l):93-97.

43. Danysz W., Parsons C. (1998) Glycine and N-methyl-D-aspartate receptors: physiological significance and possible therapeutic applications. Pharmacol. i?ev.;50(4):597-664.

44. Demopoulos H., Flamm E., Pietronigro D., Seligman M. (1980) The free radical pathology and the microcirculation in the major central nervous system disorders. Acta. Physiol. Scand. Suppl.;492:91-119.

45. Ding A., Nathan C., Stuehr D. (1988) Release of reactive nitrogen intermediates and reactive oxygen intermediates from mouse peritoneal macrophages. Comparison of activating cytokines and evidence for independent production. J Immunol.;141(T):2407-12.

46. Dingledine R., Borges K., Bowie D., Traynelis S. (1999) The glutamate receptor ion channels. Pharmacol. i?ev.;51(l):7-61.

47. Dufour J., Dziejman ML, Liu M., Leung J., Lane Т., Luster A. (2002) IFN-gamma-inducible protein 10 (IP-10; CXCL10)-deficient mice reveal a role for IP-10 in effector T cell generation and trafficking. J. /тотш?о/.;168(7):3195-3204.

48. Dusart I., Schwab M. (1994) Secondary cell death and the inflammatory reaction after dorsal hemisection of the rat spinal cord. Eur. J. Neurosci.;6(5):7l2-724.

49. Eck H., Frey H., Droge W. (1989) Elevated plasma glutamate concentrations in HIV-1-infected patients may contribute to loss of macrophage and lymphocyte functions. Int. Immunol.-,1(4):367-372.

50. Ekejindu G., Shifrine M., Misra H. (1986) Chemiluminescence of canine peripheral blood lymphocytes stimulated by mitogens. Vet. Immunol. Immunopathol. ;11 (2): 175-192.

51. Elward K., Gasque P. (2003) "Eat me" and "don't eat me" signals govern the innate immune response and tissue repair in the CNS: emphasis on the critical role of the complement system. Mol Immunol.;40(2-4):85-94.

52. Eriksson M., Nilsson A., Froelich-Fabre S., Akesson E., Dunker J., Seiger A., Folkesson R., Benedikz E., Sundstrom E. (2002) Cloning and expression of the human N-methyl-D-aspartate receptor subunitNR3A. Neurosci. Zetf. ;321 (3): 177-181.

53. Fiorica-Howells E., Gambale F., Horn R., Osses L., Spector S. (1990) Phencyclidine blocks voltage-dependent potassium currents in murine thymocytes. J. Pharmacol. Exp. Ther. ;252(2):610-615.

54. Frei K., Siepl C., Groscurth P., Bodmer S., Schwerdel C., Fontana A. (1987) Antigen presentation and tumor cytotoxicity by interferon-gammatreated microglial cells. Eur. J. Immunol.;17(9) :1271-1278.

55. Fukunaga K., Stoppini L., Miyamoto E. and Muller D. (1993) Long-term potentiation is associated with an increased activity of Ca2+/ calmodulin-dependent protein kinase II. J. Biol. Chem.,268:7863-7867.

56. Furukawa H., Gouaux E. (2003) Mechanisms of activation, inhibition and specificity: crystal structures of the NMDA receptor NR1 ligand-binding core. EMBO J.;22(12):2873-2885.

57. Galant S., Remo R. (1975) Beta-adrenergic inhibition of human T lymphocyte rosettes. J. Immunol.; 114(1 Pt 2):512-513.

58. Gegelashvili G., Robinson M., Trotti D., Rauen T. (2001) Regulation of glutamate transporters in health and disease. Prog Brain i?es.;132:267-86.

59. Gerber G., Kangrga I., Ryu P., Larew J., Randic M. (1989) Multiple effects of phorbol esters in the rat spinal dorsal horn. J. Neurosci. ;9(10):3606-3617.

60. Giulian D., Lachman L. (1985) Interleukin-1 stimulation of astroglial proliferation after brain injury. 5с/еисе;228(4698):497-499

61. Gonzalez R., Glaser J., Liu M., Lane Т., Keirstead H. (2003) Reducing inflammation decreases secondary degeneration and functional deficit after spinal cord injury. Exp. 7VewTO/.;184(l):456-463.

62. Gordon M., Cohen J., Wilson I. (1978) Muscarinic cholinergic receptors in murine lymphocytes: demonstration by direct binding. />Л/Ж;75(6):2902-2904.

63. Grant S. (2003) Synapse signalling complexes and networks: machines underlying cognition. Bioessays.;25(12): 1229-1235.

64. Grimwood S., Lebourdelles В., Whiting P. (1995) Recombinant human NMDA homomeric NR1 receptors expressed in mammalian cells form a high-affinity glycine antagonist binding site. J. Neurochem.;64(2):525-530.

65. Gurd J. (1997) Protein tyrosine phosphorylation: Implications for synaptic function. Neurochem. M.;31(5):635-649.

66. Gushchin G., Jakovleva E., Kataeva G., Korneva E., Gajewski M., Grabczewska E. (1994) Muscarinic cholinergic receptors of rat lymphocytes: effect of antigen stimulation and local brain lesion. Neuroimmunomodulation;l(4):259-264.

67. Guth L., Zhang Z., Steward O. (1999) The unique histopathological responses of the injured spinal cord. Implications for neuroprotective therapy. Ann. N.Y. Acad. Sci.;890:366-384.

68. Hartley Z., Dubinsky J. (1993) Changes in intracellular pH associated with glutamate excitotoxicity. J. Neurosci. ;13(ll):4690-4699.

69. Heinecke J. (2002) Tyrosyl radical production by myeloperoxidase: a phagocyte pathway for lipid peroxidation and dityrosine crosslinking of proteins. Toxicology;lll(l):\\-22.

70. Heuss C., Scanziani M., Gahwiler В. II. and Gerber U. (1999) G-protein-independent signaling mediated by metabotropic glutamate receptors. Nat. Neurosci. ;2:1070-1077.

71. Heyworth G., Shrimpton C., Segal A. (1989) Localisation of the 47 kDa phosphoprotein involved in the respiratory burst NADPH oxidase of phagocyte cell. Biochem. J.;260:243-248.

72. Hickey W. (1991) Migration of hematogenous cells through the blood-brain barrier and the initiation of CNS inflammation. Brain Pathol.\\ (2):97-105.

73. Hildeman D., Mitchell Т., Teague Т., Henson P., Day В., Kappler J., Marrack P. (1999) Reactive oxygen species regulate activation-induced T cell apoptosis. Immunity', 10:735744.

74. Hildeman D., Mitchell Т., Teague Т., Henson P., Day В., Kappler J., Marrack P. (1999) Reactive oxygen species regulate activation-induced T cell apoptosis. Immunity.-,\(S(6)-.135-144.

75. Hill C., Beattie M., Bresnahan J. (2001) Degeneration and sprouting of identified descending supraspinal axons after contusive spinal cord injury in the rat. Exp. Neurol;171(l): 153-169.

76. Hollmann M., Heinemann S. (1994) Cloned glutamate receptors. Annu. Rev. Neurosci.-,\1\Ъ1-Ш.

77. Hsu C., Dimitrijevic M. (1990) Methylprednisolone in spinal cord injury: the possible mechanism of action. J. Neurotrauma;l(3): 115-119.

78. Huitinga I, van RooijenN., De Groot C., Uitdehaag В., Dijkstra C. (1990) Suppression of experimental allergic encephalomyelitis in Lewis rats after elimination of macrophages. J. Exp. Med.;172(4): 1025-1033.

79. Hume D., Wrogemann K., Ferber E., Kolbuch-Braddon M., Taylor R., Fischer H., Weidemann M. (1981) Concanavalin A-induced chemiluminescence in rat thymus lymphocytes. Its origin and role in mitogenesis. Biochem. ./.;198(3):661-667.

80. Ihle J. (1995) Cytokine receptor signaling. Nature;377:591-594.

81. Jackson M., Song W., Liu M., Jin L., Dykes-Hoberg M., Lin C., Bowers W., Federoff H., Sternweis P. and Rothstein J. (2001) Modulation of the neuronal glutamate transporter EAAT4 by two interacting proteins. Nature;410:89-93.

82. Jackson S., Devadas S., Kwon J., Pinto L., Williams M. (2004) T cells express a phagocyte-type NADPH oxidase that is activated after T cell receptor stimulation. Nat. Immunol.;5(8):&l8-827.

83. Jones M. (1993) Agonist and antagonist actions of phenylglycine derivatives at depolarization-mediating (IS, 3R)-ACPD receptors in neonatal rat motoneurones. Br. J. Pharmacol.;108:86.

84. Katoh S., Ikata Т., Tsubo M., Hamada Y., el Masry W. (1997) Possible implication of leukocytes in secondary pathological changes after spinal cord injury. Injury ;28(3):215-217.

85. Khansari N., Whitten H., Fudenberg H. (1984) Phencyclidine-induced immunodepression. Science. ;225(4657):76-78.

86. Kishimoto Т., Taga Т., Akira S. (1994) Cytokine signal transduction. Cell;76:253-262.

87. Krieger P., Hellgren-Kotaleski J., Kettunen P., El Manira A. (2000) Interaction between metabotropic and ionotropic glutamate receptors regulates neuronal network activity. J. Neurosci.;20(14):5382-5391.

88. Kobayashi S., Imajoh-Ohmi S., Nakamura M., Kanegasaki S. (1990) Occurrence of cytochrome b558 in B-cell lineage of human lymphocytes. Blood.;l75(2):458-6l.

89. Kuryatov A., Laube В., Betz H. and Kuhse J. (1994) Mutational analysis of the glycine-binding site of the NMDA receptor: Structural similarity with bacterial amino acid-binding proteins. Neuron;12(6):1291-1300.

90. Lai J., Douglas S., Ho W. (1998) Human lymphocytes express substance P and its receptor. J. Neuroitn?nunol.;86(l):&0-86.

91. Lan J., Skeberdis V., Jover Т., Grooms S., Lin Y., Araneda R., Zheng X., Bennett M., Zukin R. (2001) Protein kinase С modulates NMDA receptor trafficking and gating. Nat. Neurosci. ;4(4):382-390.

92. Lau L., Huganir R. (1995) Differential tyrosine phosphorylation of N-methyl-D-aspartate receptor subunits. J. Biol. C7?em.;270(34):20036-20041.

93. Laube В., Kuhse J., Betz H. (1998) Evidence for a tetrameric structure of recombinant NMDA receptors. J. Afewrasr/.;18(8):2954-2961.

94. Laube В., Kuryatov A., Kuhse J. and Betz H. (1993) Glycine-glutamate interactions at the NMDA receptor: role of cysteine residues. FEBS. Lett.;335(3):331-334.

95. Le Fur G., Phan Т., Canton Т., Tur C., Uzan A. (1981) Evidence for a coupling between dopaminergic receptors and phospholipid methylation in mouse В lymphocytes. Life Sci.;29(26):2737-2749.

96. Lee J. (2003) Reactive oxygen species play roles on В cell surface receptor CD40-mediated proximal and distal signaling events: effects of an antioxidant, N-acetyl-L-cysteine treatment. Mol. Cell Biochem.;252(1-2): 1-7.

97. Lemons M., Howland D., Anderson D. (1999) Chondroitin sulfate proteoglycan immunoreactivity increases following spinal cord injury and transplantation. Exp. Neurol.; 160(l):51-65.

98. Leonard A., Hell J. (1997) Cyclic AMP-dependent protein kinase and protein kinase С phosphorylate N-methyl-D-aspartate receptors at different sites. J. Biol. CTze/rz.;272(18):12107-12115.

99. Levite M., Chowers Y., Ganor Y., Besser M., Hershkovits R., Cahalon L. (2001) Dopamine interacts directly with its D3 and D2 rcceptors on normal human T cells, and activates betal integrin function. Eur. J. Immunol.;31:3504-3512.

100. Lewis R. (2001) Calcium signaling mechanisms in T lymphocytes. Annu. Rev. Immunol. ;19:497-521.

101. Li G., Farooque M., Holtz A., Olsson Y. (1999) Apoptosis of oligodendrocytes occurs for long distances away from the primary injury after compression trauma to rat spinal cord. Acta. Neuropathol. (Berl.);98(5):473-480.

102. Lieberman D., Mody I. (1994) Regulation of NMDA channel function by endogenous Ca2+-dependent phosphatase. Nature;369(6477):235-239.

103. Lin C., Orlov I., Ruggiero A., Dykes-Hoberg M., Lee A., Jackson M. and Rothstein J. D. (2001) Modulation of the neuronal glutamate transporter EAAC1 by the interacting protein GTRAP3-18. Nature-,410:84-88.

104. Lin C„ Yeh S., Lin C., Lu K., Leu Т., Chang W., Gean P. (2001) A role for the PI-3 kinase signaling pathway in fear conditioning and synaptic plasticity in the amygdale. iVewro/j;31(5):841-851.

105. Liu X., Xu X., Hu R., Du C., Zhang S., McDonald J., Dong H., Wu Y., Fan G., Jacquin M., Hsu C., Choi D. (1997) Neuronal and glial apoptosis after traumatic spinal cord injury. J. Neurosci.',\l(\4):5Ъ95-5406.

106. Lombardi G., Dianzani Ch., Miglio G., et al. (2001) Characterization of ionotropic glutamate receptor in human lymphocytes. Br. J. Pharmacol. ;133(6):936-944.

107. Loy D., Crawford C., Darnall J., Burke D., Onifer S., Whittemore S. (2002) Temporal progression of angiogenesis and basal lamina deposition after contusive spinal cord injury in the adult rat. J. Сотр. Arewro/.;445(4):308-324.

108. Lu Y., Roder J., Davidow J. and Salter M. (1998) Src activation in the induction of long-term potentiation in CA1 hippocampal neurons. Science;279(5355):l363-1367.

109. Luscher C., Xia H., Beattie E., Carroll R., von Zastrow M., Malenka R., Nicoll R. (1999) Role of AMPA receptor cycling in synaptic transmission and plasticity. Neuron;24(3):649-65S.

110. Lynch M. (2004) Long-term potentiation and memory. Physiol. i?ev.;84(l):87-136.

111. Maly F., Jones O., Gauchat F., Urwyler A., Walker C., Dahinden C., de Week A., Nakamura M. (1989) Superoxide dependent NBT reduction and expression of cytochrome b245 components by human tonsillar B-lymphocytes and В cells. J. Immunol. ;142:1260-1267.

112. Maragos W., Penney J., Young A. (1988) Anatomic correlation of NMDA and 3H-TCP-labeled receptors in rat brain. J. Neurosci.;8(2):493-501

113. Marazziti D., Ori M., Nardini M., Nardi I., Cassano G. (2001) mRNA expression of serotonin receptors of type 2C and 5A in human resting lymphocytes. Neuropsychobiology;43(3): 123-126.

114. Mardiney M., Bredt A. (1971) The immunosuppressive effect of amantadine upon the response of lymphocytes to specific antigens in vitro. Transplantation-,12(3): 183-188.

115. Maslinski W., Lullberg M., Nordsnrom O.and Bartfai T. (1988) Muscarinic receptors and receptor-mediated actions on rat thymocytes. J. Neurounmunol.;17(4):265-274.

116. Matsuda K., Fletcher M., Kamiya Y. and Yuzaki M. (2003) Specific assembly with the NMDA receptor 3B subunit controls surface expression and calcium permeability of NMDA receptors. J. Neurosci. ;23(31): 10064-10073.

117. Matsuda K., Kamiya Y., Matsuda S. and Yuzaki M. (2002) Cloning and characterization of a novel NMDA receptor subunit NR3B: a dominant subunit that reduces calcium permeability. Brain. Res. Mol. Brain i?e,s.;100(l-2):43-52.

118. Mayer M., Vyklicky L., Clements J. (1989) Regulation of NMDA receptor desensitization in mouse hippocampal neurons by glycine. 7Уа/мге;338(6214):425-427.

119. Mayer M., Westbrook G. (1987) Prog. Neurobiol.;40:143-210.

120. McBain C., Mayer M. (1994) N-methyl-D-aspartic acid receptor structure and function. Physiol. Rev.;74(3):723-760.

121. McCormack R., Hart R., Ganea D. (1996) Expression of NK-1 receptor mRNA in murine T lymphocytes. Neuroimmunomodulation;3(l):35A6.

122. Means E., Anderson D. (1983) Neuronophagia by leukocytes in experimental spinal cord injury. J. Neuropathol. Exp. Neurol.-,42(6):707-719.

123. Meloni F., Ballabio P., Tua A., Grignani G., Grassi G. (1998) Bombesin, calcium homeostasis and tumour growth. Monaldi Arch. Chest. Dis.; 53(4):405—409.

124. Miglio G., Varsaldi F., Dianzani C., Fantozzi R., Lombard! G. (2005a) Stimulation of group I metabotropic glutamate receptors evokes calcium signals and c-jun and c-fos gene expression in human T cells. Biochem. Pharmacol.-, 70(2):189-199.

125. Miglio G., Varsaldi F., Lombard! G. (2005b) Human T lymphocytes express N-methyl-D-aspartate receptors functionally active in controlling T cell activation. Biochem. Biophys. Res. Commw«.;338(4):1875-1883.

126. Minami Y., Kono Т., Miyazaki Т., (1993) The IL-2 receptor complex: its strucrure, function, and target genes. Annu. Rev. Immunol.;11:145-173.

127. Molniar E., Varandi A., Mcllhinney R., Ashcroft S. (1995) Identification of functional ionotropic glutamate receptor proteins in pancreatic beta-cells and in islets of Langerhans. FEBS Lett.;371:253-267.

128. Monaghan D., Cotman C. (1985) Distribution of N-methyl-D-aspartate-sensitive L-3H.glutamate-binding sites in rat brain. J. Neurosci.;5(11):2909-2919.

129. Monyer H., Sprengel R., Schoepfer R., Herb A., Higuchi M., Lomeli H., Burnashev N., Sakmann В., Seeburg P. (1992) Heteromeric NMDA receptors: molecular and functional distinction of subtypes. SWewce.;256(5060):1217-1221.

130. Muller A., Maurin L. and Bonne C. (1998) Free radicals and glutamate uptake in the retina. Gen. Pharmacol;30:315-318.

131. Mustelin Т., Tasken K. (2003) Positive and negative regulation of T-cell activation through kinases and phosphatases. Biochem. J. ;371(Pt 1): 15-27.

132. Nagy G., Koncz A., Perl A. (2003) T cell activation- induced mitochondrial hyperpolarization is mediated by Ca2+- and redoxdependent production of nitric oxide. J. Immunol. 171:5188 -5197.

133. Nakajima Y., Iwakabe H., Nakanishi S. (1993) Molecular characterization of a novel retinal metabotropic glutamate receptors mGluR6 with a high agonist selectivity for L-2-Amino-4-phosphnobutirate. J. Biol. Chem., 268:11868-11876.

134. Nakamichi N., Yoneda Y. (2005) Functional proteins involved in regulation of intracellular Ca(2+) for drug development: desensitization of N-methyl-D-aspartate receptor channels. J. Pharmacol. Sto.;97(3):348-350.

135. Nathan C., Murray H., Wiebe M. (1983) Identification of IFN- у as the cytokine that activates human macrophage oxidative metabolism and antimicrobial activity. J.Exp. M?^.;158:670-689.

136. Noel J., Ralph G.S, Pickard L., Williams J., Molnar E., Uney J., Collingridge G., Henley J. (1999) Surface expression of AMPA receptors in hippocampal neurons is regulated by an NSF-dependent mechanism. Neuron.;23(2):365-376.

137. Ogita K., Okuda H., Yamamoto Y., Nishiyama N., Yoneda Y. (2003) In vivo neuroprotective role of NMDA receptors against kainate-induced excitotoxicity in murine hippocampal pyramidal neurons. J. Neurochem.;85(5):1336-1346.

138. Ottaway C., Greenberg G. (1984) Interaction of vasoactive intestinal peptide with mouse lymphocytes: specific binding and the modulation of mitogen responses. J. 1ттипо1.;132(1):4П-423.

139. Oudega M., Vargas С., Weber A., Kleitman N., Bunge M. (1999) Longterm effects of methylprednisolone following transection of adult rat spinal cord. Ear. J. Neurosci.;11(7): 2453-2464.

140. Ovadia H., Abramsky O. (1987) Dopamine receptors on isolated membranes of rat lymphocytes. J. Neurosci Лел.;18(1):70-74.

141. Owen Т., Jones, Hancock J. (2000) Free Radicals and Inflammation (P. R. Blake and C. H. Evans, Eds.). Switzerland.

142. Pacheco R., Ciruela F., Casado V., Mallol J., Gallart Т., Lluis C. And Franco R. (2004) Group of metabotropic glutamate receptors mediate a dual role of glutamate in T cell activation. J. Biol. Chem.,279:33352-33358.

143. Pan J., Ni L., Sodhi A., Aguanno A., Young W., Hart R. (2002) Cytokine activity contributes to induction of inflammatory cytokine mRNAs in spinal cord following contusion. J. Neurosci. Res.;68(3):315-322.

144. Pani G., Colavitti R., Borrello S., Galeotti T. (2000) Endogenous oxygen radicals modulate protein tyrosine phosphorylation and JNK-1 activation in lectin-stimulated thymocytes. Biochem. J.;347:173-181.

145. Partiseti M., Le Deist F., Hivroz C., Fischer A., Korn H., Choquet D. (1994) The calcium current activated by T cell receptor and store depletion in human lymphocytes is absent in a primary immunodeficiency. J. Biol. Chem.; 269(51):32327-32335.

146. Patrick C., Ash R., Libnoch J., Keller R. (1987) Clinical cytometry and immunophenotyping. I. Flow cytometric analysis of normal peripheral blood and bone marrow. Pathol. Immunopathol.;6(l):64-76.

147. Pearse D., Chatzipanteli K., Marcillo A., Bunge M., Dietrich W. (2003) Comparison of iNOS inhibition by antisense and pharmacological inhibitors after spinal cord injury. J. Neuropathol. Exp. Neurol.;62(11): 1096-1107.

148. Perez-Otano I., Schulteis C.T., Contractor A., Lipton S., Trimmer J., Sucher N., Heinemann S. (2001) Assembly with the NR1 subunit is required for surface expression of NR3 A-containing NMDA receptors. J. Neurosci. ;21(4): 1228-1237.

149. Popovich P., Reinhard J., Flanagan E., Stokes B. (1994) Elevation of the neurotoxin quinolinic acid occurs following spinal cord trauma. Brain. Res.;633(l-2):348-352.

150. Popovich P., Horner P., Mullin В., Stokes B. (1996) A quantitative spatial analysis of the blood-spinal cord barrier. I. Permeability changes after experimental spinal contusion injury. Exp. Neurol.\ 142(2):258-75.

151. Popovich P., Wei P., Stokes B. (1997) Cellular inflammatory response after spinal cord injury in prague- Dawley and Lewis rats. J. Сотр. Neurol.;377(3):443-464.

152. Popovich P. (2000) Immunological regulation of neuronal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Prog. Brain. 7?e5.;128:43-58.

153. Popovich P., Hickey W. (2001) Bone marrow chimeric rats reveal the unique distribution of resident and recruited macrophages in the contused rat spinal cord. J. Neuropathol. Exp. vVewro/.;60(7):676-685.

154. Poulopoulou C., Davaki P., Koliaraki V. Kolovou D., Markakis I., Vassilopoulos D. (2005) Reduced expression of metabotropic glutamate receptor 2mRNA in T cells of ALS patients. Ann. Neurol.;58(6):946-949.

155. Prybylowski K., Wenthold R. (2004) N-Methyl-D-aspartate receptors: subunit assembly and trafficking to the synapse. J. Biol. Chem.;219{\ l):9673-9676.

156. Qian В., Zhou G., Hammarstrom M., Danielsson A. (2001) Both substance P and its receptor are expressed in mouse intestinal T lymphocytes. Neuroendocrinology.;73 (5): 3 5 8 -3 6 8.

157. Rao A., Luo C., Hogan P. (1997) Transcription factors of the NFAT family: regulation and function. Annu. Rev. Immunol. ;15:707-747.

158. Relton J., Rothwell N. (1992) Interleukin-1 receptor antagonist inhibits ischaemic and excitotoxic neuronal damage in the rat. Brain. Res. Bull.;29(2):243-246.

159. Roche K., Standley S., McCallum J., Dune Ly C., Ehlers M., Wenthold R. (2001) Molecular determinants of NMDA receptor internalization. Nat. Neurosci.; 4(8):794-802.

160. Romagani S. (1995). Biology of human Thl and Th2 cells. J. Clin. Immunol.; 15:121129.

161. Ron D. Signaling cascades regulating NMDA receptor sensitivity to ethanol. (2004) Neuroscientist. ;10(4):325-336.

162. Roof R., Hall E. (2000) Gender differences in acute CNS trauma and stroke: neuroprotective effects of estrogen and progesterone. J. Neurotrauma;17(5):367-8S.

163. Rosenberg L., Wrathall J. (1997) Quantitative analysis of acute axonal pathology in experimental spinal cord contusion. J. Neurotrauma;14(ll):S23-S38.

164. Rosenmund C., Westbrook G. (1993) Calcium-induced actin depolymerization reduces NMDA channel activity. vVez/ro/t.;10(5):805-814.

165. Rossi C., Delcroix M., Huitinga I., McAllister A., van Rooijen N., Claassen E., Brahic M. (1997) Role of macrophages during Theiler's virus infection. J. F/ro/.;71(4):3336-3340.

166. Rotrosen D., Leto T. (1990) Phosphorilation of neutrophil 47 kDa cytosolic oxidase factor. Translation to membrane is associated with distinct phosphorilation events. J. Biol. C/ze/w.;272:461-476.

167. Scanziani M. (2002) Competing on the edge. Trends Neurosci.;25:282-283.

168. Schwartz M., Kipnis J. (2001) Protective autoimmunity: regulation and prospects for vaccination after brain and spinal cord injuries. Trends. Mol. Med.;7(6):252-258.

169. Selmaj K., Raine C. (1988) Tumor necrosis factor mediates myelin and oligodendrocyte damage in vitro. Ann. Neurol.;23(4):339-346.

170. Shaked I., Tchoresh D., Gersner R., Meiri G., Mordechai S., Xiao X., Hart R., Schwartz M. (2005) Protective autoimmunity: interferon-gamma enables microglia to remove glutamate without evoking inflammatory mediators. J. Neurochem.;92(5):997-1009.

171. Shi S., Hayashi Y., Petralia R., Zaman S., Wenthold R., Svoboda K., Malinow R. (1999) Rapid spine delivery and redistribution of AMPA receptors after synaptic NMDA receptor activation. £с/еисе.;284(5421):1811-1816.

172. Shuman S., Bresnahan J., Beattie M. (1997) Apoptosis of microglia and oligodendrocytes after spinal cord contusion in rats. J. Neurosci. Res.;50(5):798-808.

173. Skeberdis V., Lan J., Opitz Т., Bennett M., Zukin R. (2001a) mGluRl-mediated potentiation of NMDA receptors involves a rise in intracellular calcium and activation of protein kinase C. Neuropharmacology.;40(7):856-865.

174. Skeberdis V., Lan J., Zheng X., Zukin R., Bennett M. (2001b) Insulin promotes rapid delivery of N-methyl-D- aspartate receptors to the cell surface by exocytosis. Proc. Natl. Acad, Sci. USA.;9S{6)'.3561-3566.

175. Sorg O., Horn Т., Yu N., Gruol D., Bloom F. (1997) Inhibition of astrocyte glutamate uptake by reactive oxygen species: role of antioxidant enzymes. Mol. Med.;3'A31-440.

176. Springer J., Azbill R., Knapp P. (2000) Activation of the caspase-3 apoptotic cascade in traumatic spinal cord injury. Nature. Mec/.;5(8):943-946.

177. Sroga J., Jones Т., Kigerl K., McGaughy V., Popovich P. (2003) Rats and mice exhibit distinct inflammatory reactions after spinal cord injury. J. Сотр. Neurol.-,462(2):22Ъ-240.

178. Stefulj J., Jernej В., Cicin-Sain L., Rinner I., Schauenstein K. (2000) mRNA expression of serotonin receptors in cells of the immune tissues of the rat. Brain Behav. Immun.;14(3):219-224.

179. Streit W., Semple-Rowland S., Hurley S., Miller R., Popovich P., Stokes B. (1998) Cytokine mRNA profiles in contused spinal cord and axotomized facial nucleus suggest a beneficial role for inflammation and gliosis. Exp. Neurol.-, 152(l):74-87.

180. Streit W., Hurley S., McGraw Т., Semple-Rowland S. (2000) Comparative evaluation of cytokine profiles and reactive gliosis supports a critical role for interleukin-6 in neuron-glia signaling during regeneration. J. Neurosci. ite.s.;61(l): 10-20.

181. Sucher N., Awobuluyi M., Choi Y., Lipton S. (1996) NMDA receptors: From genes to channels. Trends. Pharmacol. <Sc/.;17(10):348-355.

182. Suh Y., Arnold R., Lassegue В., Shi J., Xu X., Sorescu D., Chung A., Griendling K., Lambeth J. (1999) Cell transformation by the superoxide-generating oxidase Moxl. Nature;*01:79- 82.

183. Taoka Y., Naruo M., Koyanagi E., Urakado M., Inoue M. (1995) Superoxide radicals play important roles in the pathogenesis of spinal cord injury. Paraplegia:33(H):45Q-453.

184. Thomas J., Carver M., Haisch C., Welch J., Carchman R. (1982) Differential effects of intravenous anaesthetic agents on cell-mediated immunity in the Rhesus monkey. Clin. Exp. Immunol ;47(2):457-466.

185. Timmerman L., Clipstone N. Ho S. (1996) Rapid shuttling of NF-AT in discrimination of Ca2+ signals and immunosuppression. Aro/wre.;383(6603):837-840.

186. Tong G., Jahr C. (1994) Regulation of glycine-insensitive desensitization of the NMDA receptor in outside-out patches. J. Neurophysiol. ;72(2):754-756.

187. Tong G., Shepherd D., Jahr C. (1995) Synaptic desensitization of NMDA receptors by calcineurin. SWewce. ;267(5203): 1510-1512.

188. Totoiu M., McTigue D., Glaser J., Nistor G., Keirstead H. (2001) Demyelination as a secondary degenerative event of spinal cord contusion. Soc. Neurosci. Abst. San Diego, CA.

189. Trotti D., Rossi D., Gjesdal O., Levy L. M., Racagni G., Danbolt N. C. and Volterra A. (1996) Peroxynitrite inhibits glutamate transporter subtypes. J. Biol. Chem. ;271:5976-5979.

190. Vanicky I., Urdzikova L., Saganova K., Cizkova D., Galik J. (2001) A simple and reproducible model of spinal cord injury induced by epidural balloon inflation in the rat. J. Neurotrauma; 18(12):1399-1407.

191. Volterra A., Trotti D. and Racagni G. (1994a) Glutamate uptake is inhibited by arachidonic acid and oxygen radicals via two distinct and additive mechanisms. Mol. Pharmacol. ;46:986-992.

192. Volterra A., Trotti D., Floridi S. and Racagni G. (1994b) Reactive oxygen species inhibit high-affinity glutamate uptake: molecular mechanism and neuropathological implications. Ann. NY Acad. Sci.;738:153-162.

193. Wang Y., Salter M. (1994) Regulation of NMDA receptors by tyrosine kinases and phosphatases. Nature.-,369(6477):233-235.

194. Wang Y., Yu X., Salter M. (1996) Ca(2+)-independent reduction of N-methyl-D-aspartate channel activity by protein tyrosine phosphatase. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A;93(4):1721-1725.

195. Washbourne P., Liu X., Jones E., McAllister A. (2004) Cycling of NMDA receptors during trafficking in neurons before synapse formation. J. Мштус/.;24(38):8253-8264.

196. Wenthold R, Prybylowski K., Standley S. et al. (2003) Trafficking of NMDA receptors. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol.;43:335-58.

197. Williams M., Kwon J. (2004) T cell receptor stimulation, reactive oxygen species, and cell signaling. Free Radical Biology & Medicine:,31 \\ 144 1151.

198. Williams M., Henkart P. (1996) The role of reactive oxygen intermediates in TcR-induced death of T cell blasts and hybridomas. J. Immunol.; 157:2395-2402.

199. Wrogemann K., Weidemann M., Peskar B. (1978) Chemiluminescence and immune cell activation. I. Early activation of rat thymocytes can be monitored by chemiluminescence measurements. Eur. J. Immunol. ;8(10):749-752.

200. Xiong Z., Raouf R., Lu W., Wang L., Orser В., Dudek E., Browning M., MacDonald J. (1998) Regulation of N-methyl-D-aspartate receptor function by constitutively active protein kinase C. Mol. Pharmacol. ;54(6): 1055-1063.

201. Young W. (1993) Secondary injury mechanisms in acute spinal cord injury. J. Emerg. Med.\ 11(1): 13-22.

202. Yu X., Askalan R., Keil G., Salter M. (1997) NMDA channel regulation by channel-associated protein tyrosine kinase. £с/еисе.;275(5300):674—678.

203. Yu X., Salter M. (1998) Gain control of NMDA-receptor currents by intracellular sodium. A/a/wre.;396(6710):469-474.

204. Yu X., Salter M. (1999) Src, a molecular switch governing gain control of synaptic transmission mediated by N-methyl-D-aspartate receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. ;96(14):7697-7704.

205. Zatti M., Rossi F. (1965) Early changes of hexose monophosphate pathway activity and of NADFH oxidation in phagocytosing leucocytes. Biochem. Biophys. Acta;99,551-56\.

206. Zhang L., Jin M., Ни X., Zhu J. (2006) Homocysteine stimulates nuclear factor kappaB activity and interleukin-6 expression in rat vascular smooth muscle cells. Cell Biol /иЛ;30:592-597.

207. Zhang Z., Guth L. (1997a) Experimental spinal cord injury: Wallerian degeneration in the dorsal column is followed by revascularization, glial proliferation, and nerve regeneration. Exp. iVewro/.;147(l):159-171.

208. Zhang Z., Krebs C., Guth L. (1997b) Experimental analysis of progressive necrosis after spinal cord trauma in the rat: etiological role of the inflammatory response. Exp. .Vewro/.;143(l): 141-152.

209. Zheng X., Zhang L., Wang A., Bennett MV, Zukin RS. (1997) Ca2+ influx amplifies protein kinase С potentiation of recombinant NMDA receptors. J. Neurosci.;17(22):S616-8686.

210. Zheng F., Gingrich M., Traynelis S., Conn P. (1998) Tyrosine kinase potentiates NMDA receptor current by reducing tonic Zn2+ inhibition. Nat. Neurosci.; 1(3): 185-191.

211. Zweifach A., Lewis R. (1993) Mitogen-regulated Ca2+ current of T lymphocytes is activated by depletion of intracellular Ca stores. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A.;90(13):6295-6299.