Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Глутаматные рецепторы гиппокампа крыс: Са2+ -зависимая регуляция NMDA-активируемых токов

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Глутаматные рецепторы гиппокампа крыс: Са2+ -зависимая регуляция NMDA-активируемых токов"

АКАДЕМИЯ НАУК РОССИИ ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н.К КОЛЬЦОВА

Р Г Б ОД

на отавах рукописи

1 2 ДЕК г-

ФИЛИППОВА Наталья Германовна

УДК 577.352.5.

ГЛУТАМАТНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ ГИППОКАМПА КРЫС: 12+ - ЗАВИСИМАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ^БА - АКТИВИРУЕМЫХ ТОКОВ

03.00.13. физиология человека и животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Москва 1994

Работа выполнена в лаборатории электрофизиологии Института нейробиологии и патологической физиологии развития (Париж).

Научный руководитель: д.б.н. П.Д. Брежестовский

Офицальнае оппоненты: д.б.н. В.Г. Скребитский К-б.н. Е.А. Вульфиус

Ведущая организация: Институт обшей патологии и патологической физиологии АМН России

Защита состоится " 28 " декабря 1994 г. в 11 час. 00 мин. на заседании специализированного совета в Институте Биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке в Институте Биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.

Автореферат разослан "_"_ 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Е.М. Протопопова

Общая характеристика работы.

■\ктуэльнпсть проблемы. Основы поведения, обучения, памяти заложены и ненрональной организации центральном нервной системы (ЦНС) живых орпншзмоп. Синаптическая передача - форма повторяемой и устойчивой связи между взаимодействующими нейронами - осуществляется посредством ненромеднаторов, которые активируют рецептор- канальные комплексы на постсинаптнческой мембране, обеспечивая таким образом прохождение через неё тока (Катц, 1969; Shepherd, 1979). В синапсах IIHC млекопитающих основным возбуждающим медиатором является глутамат ( Fonnum 1984 ).

По функциональным и структурным характеристикам рецепторы глутамата были -классифицированы на понотропные - белковые молекулы, встроенные в клеточную мембрану п непосредственно образующие ионный канал (Monaghan et al., 1989) и метаботропные - белковые молекулы, регулирующие ионные каналы через системы клеточных посредников (Sladeczek et al., 1985; Tanabe et al., 1992). k Фармакологический и электрохимический анализ глутамат- активируемого сннаптического тока показал, что он сформирован активностью двух видов нонотропных рецепторов: non-NMDA н NMDA (Forsythe & Westbrook 1988). NMDA - активируемые каналы - селективны для катионов, высоко проницаемы для ионов кальция, обеспечивают долговременные сннаптическне изменения (Ascher et "al., 1988; Watkins etal., 1991; Bliss & Collingridge 1993). Ионные каналы рецепторов non-NMDA - селективны для катионов, низко проницаемые для ионов кальция, формируют быстрый сниаптнческий ответ, активируются АМРА и каииатом (Watkins et al:, 19911. В синапсах ЦНС млекопитающих, как правило, NMDA н non-NMDA типы рецепторов глутамата ко-локализованы на поверхности постсинаптнческон мембраны (Watkinsetal., 1991).

Следовательно, можно предположить, что активация одного подкласса рецепторов может модулировать функцию других, расположенных-в близком окружении, подклассов рецепторов глутамата. Действительно, на пирамидных нейронах в срезах гиппокампа было недавно показано, что активация метаботропных рецепторов Qp типа потенцннрует NMDA активируемый ток (Manzoni et al., 1990; Aniksztejn et al., 1991). Более того, известно, что рецепторы NMDA имеют несколько центров, позволяющих регулировать их активность с внутренней н внешней стороны мембраны.

Цель работы и постановка задач. Целью работы было: исследование взаимодействия между NMDA- - и АМРА- подклассами рецепторов

глутамата и механизмов Са2- - опосредованной регуляции NMDA- токов.

Основные задачи:

1. Исследовать феноменологию взаимодействия между AM РА- н NMDA-подклассами рецепторов глутаматп и нейронах гпшюкампакркс.

2. Охарактеризовать процессы Ca2* - зависимой регуляции рецепторов NMDA в культивируемых нейронах гнппокампакрыс.

3. Исследовать свойства Ca2- - зависимой инактивации рекомбииантных рецепторов NMDA, эксп рссспрованных в клетки линии НЕК-293. Научная новизна Работы. Методами локальной фиксации потенциала, конфокальной сканирующей микроскопии и двойной эмиссионной флуорометрнн исследована модуляция NMDA- токов ионами Ca-' на культуре нейронов гнппокампа и на свежевыделенных фермеитативно изолированных пирамидных нейронах из CAI-САЗ областей:

1. обнаружено и исследовано явление взаимодействия между АМРА и NMDA типами рецепторов глутамата;

2. доказано, что пнактивпрующее действие АМРА на NMDA- ток опосредованно ионами Cal-, проникающими чепосрсдстешю через АМРА- каналы.

На уровне механизмов явлений классифицированы разные типы модуляции нонами Ca2* токов NMDA : обратимая и необратимая ннактнвацни рецепторов NMDA.

Впервые, с помощью методов локальной фиксации потенциала н молекулярной клеточной биологии на рекомфннантных NR1+NR2A и NR1+NR2B рецепторах NMDA, экспресснрованных в клетки линии НЕК-293, зарегистрировано явление обратимой Ca-* - зависимой инактивации. Научно-практическое зпачение. Полученные результаты по модуляции нонами' Ca2* NMDA токов имеют значимость в исследованиях вопросов пластичности, памяти и Ca2* - опосредованной токсичности рецепторов NMDA в UHC млекопитающих.

Совокупность используемых в работе методов: локальной фиксации потенциала, конфокальной сканирующей микроскопии, двойной эмиссионной флуорометрпи, молекулярной клеточной биологии — определяет широкие перспективы будущих исследований.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на научных семинарах ИБР АН России (Москва), BKHU АМН России (Москва); Института нейробнологш и патфнзнологнн развития (INSERM-U29, Париж, Франция 1993). Основные результаты исследования были представлены на Международных конференциях 4eme Colloque "Canaux ioniques" Carry-le-Rouet, 5eme Colloque "Canaux ioniques" Carry-Je-Rouet Франция 1993, 1994; Международных конференциях XVin eme Conference en Neurobiologie de Gif-Sur-Yvette "Molecular basis of diversity in neurones", XIX Conference en Neurobiologie de Gif-Sur-Yvette

'uoi de neuf dans la transmission synaptigue?" Франция 1993, 1994; ждуиародной конференции 14th Blankenese Conference "Modulation of signals in uronal systems" Hamburg-Blankenese, Германия 1994; Международной зимней соле, Аликанте, Испания 1994.

I материалам диссертации опубликованы 2. статьи п 5 тезисов. руктура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, шеания использованных и работе материалов н методов исследования, бственных экспериментальных данных, обсуждения результатов, выводов п щека цитируемой литературы (173 источника). Работа изложена на 154 раннцах машинописного текста и содержит 33 рисунка.

Материалы и методы.

Экспериментальная работа представляет результат исследований

рнблнзитсльио на 250 нейронах гиппокампа в условиях культуры ткани, на 30

кгмс

>ея;с&ыделс1шых нейронах гипнокампаЧ! на 350 трансфектпрованных клетках 1шнн НЕК-293.

астворы: наружные: рпегпор В/ (для культуры нейронов пшпокампа) (мМ): 170 lad, 3.5 KCl, 2 CaCh, 10 глюкозы, 5 NaHCOj.lQ HEPES-Na, pH 7.4; раствор B2 аля свежевыделенных нейронов пшпокампа) (мМ): 140 NaCl, 3.5 KCl, 2 СаС1г, 0 глюкозы, 5 NaHCOj, 10 HEPES - Na, pH 7.4; раствор Bj (для трансфек-ировашшх клеткок) (мМ): 140 NaCl, 3.5 KCl, 2 СаС12, 10 глюкозы, 10 HEPES -■Ja, pH 7.4. Тетродотоксин (ТТХ. 1 мкМ), бнкукулин (10 МиМ), глицин (10 мкМ) ■ ipiicj-гствовали во всех типах внешних растворов. В зависимости от задач во ¡нешнлх растворах варнровали также концентрацию ионов Са2+(от 0.2 до 10 ,tM) н Mg2+ (or 0 .to 2 мМ). Внутриклеточные: раствор Ci (для культуры гнппо-

сампалышх нейронов) (мМ): 100 CsCl, 80 К-глюконат, 0.4 СаС12, 1.1 EGTA (Са2 + :вободный 5x10-8), Ю HEPES - К, 4 Mg-АТФ, pH 7.2; раствор С2 (для свежевыделенных пирамидных нейронов и культуры трансфектпрованных клеток) (мМ): 100 CsCl, 40 К-глюконат, 0.4 СаС12,1.1 EGTA (Са?+ свободный 5x10-8), ю HEPES-K, 4 Mg-АТФ, pH 7.2.

Методы. Для измерения интегральных токов и токов через одиночнне ионные каналы был использован метод локальной фиксации потенциала. Измерение внутриклеточной концентрации ионов Ca2- проводилось с помощью конфокального сканирующего микроскопа н Ca-*- чувствительной флуоресцирующей краски Fluo-3 AM н Fiuo-3; двойной эмиссионной флуорометрик с использованием Сэ2-- чувствительной флуоресцирующей краски Indo-1. Для транс-

фекцпн клеток применялся метод 4S часовой инкубации с соответствующей сДНК, содержащей последовательность желаемых стбъедшпш.

Регистрирующие пипетки имели сопротивление 5-8 МО.м. Эксперименты проводились при комнатной температуре (18-22°С ). Потенциал фиксации при регистрации интегральных токов был -50 мВ. Вольтамперные .характеристики снимались при подаче линейного напряжения от -150 до +50 мВ длительностью в 1.5 сек. Токи в whole-cell конфигурации регистрировались при фильтре 3 кГц , в cell-attached при фильтре I или 3 кГц. Анализ кинетических параметров работы каналов проводился с использованием программы pCLAMP (Al,Burlingame, USA).

Системы аппликации агоннста: в нашем исследовании были использованы два метода -аппликации агонистов: а) система , быстрой перфузии, представляющая собой две параллельно паущих трубки для позачи растворов, способных быстро (в результате подачи электрического сигнала) менять своё положение относительно клетки (Johnson & Ascher 1987; Mayer et al., 1989) ; 6) аппликация из пипеток при подаче к ним импульсов положительного давления с помощью ппкошприцера (GVC,USA). В случае использования системы быстрой перфузии постоянная времени нарастания составляла примерно 12 мсек; при импульсной аппликации агоннста - 40 мсек. Протокол работы системы импульсной аппликации и быстрой перфузии задавался через компьютер.

Результаты исследований п их сбсутт'деггас/ ■" " 1. АМРА тип рецепторов глутамата вызывает инактивацию М]УША -активируемыхтохов, опосредованную увеличением |Са2*][.

На Рис. 1 показан эффект каината на ЫМЛА активируемый ток. После аппликации каината (50 мкМ , 5 сек, при значениях тока порядка 200 — 400 пА) амплитуда пика ЫМОА - активируемого тока обратимо уменьшалась на 32 ±4 % (П=49).

Рис. 1. Каннат вызывает инактивацию ИКГОА токов. Интегральные токи, активируемые в результате аппликации на нейрон из системы быстрой перфузии 7 мкМ ИМБА н 2 мкМ глицина, приведены до (левый трек), через 4 сек (средний трек) п.спустя 80 сек (правый трек) после аппликации 50 мхМ каината.

Таким образом, было обнаружено, что каннат вызывает обратимую инактивацию ответа на ЫМОА.

jcopa

7

Для исследования этого эффекта был использован протокол после-звательной диух-импульспон аппликации агоннстов (Katz & Thesleff 1957; Mayer : al., 19S9; Sather et ai., 1992), позволяющий характеризовать кинетику (время азвптня и выхода из пнактивированного состояния) и степень нпактпвацпп очных токов в зависимости от условий аппликащш провоцирующего эффект гоннста. С.уть экспериментального протокола заключалась в следующем: на сследуемый нейрон из двух идентичных пипеток, связанных с системой икошприцера, последовательно подавались аппликации, различающиеся лнтельностью и типом агоннста. 50 мсек аппликации NMDA с интервалом в 10 ек использовалась для активации тест NMDA токов; 3-5 сек аппликация канната ли другого агоннста использовалась для активации кондиипоннрующего тока, ¡ровоцнрующего эффект инактивации тест токов.

Степень инактивации оценивалась по отношению (I-I0)/I0 где I- амплитуда тест оков после кондиционирующего импульса , 10- амплитуда тест ответов в :онтроле (до подачи конднционнр.пощего импульса).

Аппликация кондиционирующего импульса канната (70 мкМ, 5—15 сек) ¡ызывала уменьшение амплитуды NMDA токов (Рис. 2).

NMDA 50 ms _ * КА Is КА 3 s КА 10s у

°Г SY^fiW W liTiVAWW W1 /iWWYiTnY №

200

40QL

20 40 60 HMH(s)

500- ИРА)^.

100 -50 50

/^-500 Vm (mV)

-1030-

Рис. 2. Свойства капнат-индуцируемой инактивации ММОА токов на нейронах культуры гиппокамиа. А.'. кондиционирующие аппликации канната (50 мкМ, длительностью в 1, 3 и 10 сек) инактпвируют тест ЫМЬА токи (50 мкМ , 50 мсек). Пунктирная линия указывает на уровень амплитуды ЯМБА тест токов до подачи

инахтпвацнонного стимула. В: полулогарифмическая зависимость времени выхода из инактивпрованного состояния №«ГОА тест токов после аппликаций канната длительностью в 1, 3 п 10 сек ; временные-константы выхода, соответственно. 9, ¡5 н 90 сек. С: вольтамперная характеристика ответа на каннат: линейна, потенциал реверсии тока около 0 мБ.

Степень пнактпвацнн возрастала с увеличением длительности

кондиционирующей дози каппата. Выход из ннактппированного состояния описывался одноэкспонгшшальной функцией, постоянная времени котором увеличивалась пропорционально длительности кондиционирующего импульса. Аналогичные результаты были получены при кондиционирующем импульсе АМРА на свежевшелениых пирамидных нейронах (п=8 ).

Таким образом. АМРА-. каинат- вызываемая инактивация NMDA токов в неГфонах гиппохампа имеет следующие свойства: 4

1). Активация рецепторов АМРА с помощью каината или АМРА вызывает обратимую инактивацию NMDA токов на 25-35 7..

2). Степень инактивации NMDA тест токов возрастает с увеличением длительности кондиционирующих доз клина га пли ЛМРА. ----

3). Выход нз инактивации описывается, примерно, моноэкспоненцналыюй функцией с постоянной времени порядка 10 - 50 сек.

4). Время выхода из инактивации NMDA ответов возрастает с увеличением длительности кондиционирующих доз канната или АМРА.

Инактнвнрующее действие хаината н АМРА могло бы возникнуть в резз-льтате неслецифнчесхого взаимодействия этих агонистов с рецепторами NMDA и последующей их десенситпзацнн. Чтобы проверить это предположение

было изучено действие канната на NMDA токи в присутствии избирательных антагонистов АМРА- рецепторов (CNQX) и NMDA- рецепторов (APV). Рис. 3 иллюстрирует-специфичность модуляцп- ответов на NMDA через АМРА. рецепторы.

А

100 рА

В

200 рА

NMDA, 50 ms

KA + CNQX КА /

"\Г........

20 s

ka nmda apv xa apv /

ШТ

50 s

• Рис. 3. Каннат - индуцируемая инактивация ИМОА тест токов опосредована непосредственной активацией АМРА типа рецепторов глутамата. А; CNQX - (20мкМ) специфический блокатор non-NMDA рецепторов при аппликации из системы быстрой перфузии вместе с капнатом ( 50 мкМ ) полностью предотвращал эффект инактивации тест ЫМОА токов. В: АРУ - (50 мкМ) специфический блокатор ММОА рецепторов при аппликации из системы быстрой

перфузии уменьшал тест NMDA токи, в условиях апплпкашга вместе с каниатом (59 мкМ) не влиял на степень капнат - индуцируемой инактивации N/víDA токов и время выхода из илактлвацип-

Полученные результаты позволяют предполагать, что явление каннат-индуцируемой инактивацшг обусловлено активацией рецепторов AiVfPA и не связано с десенситизацией рецепторов NMDA.

Другой причиной пнактпвирующего действия каината на NMDA ответы могло быть повышение внутриклеточного Са2- при активации АМРА рецепторов. Для проверки этой гипотезы были проведены эксперименты по регистрации ¡Ca2-]¡ во время аппликации канната (50 мкМ). Действительно, результаты, полученные на конфокальном сканирующем микроскопе при регистрации иптенсивностн флуоресценции Са-' чувствительной флуоресцирующей краски (Ипо-3 АМ, 20 мкМ), загрз-женной в исследуемый нейрон, подтвердили предположение о каинат- 1 опосредованном увеличении [Ca--]¡. Более того, исскуственная деполяризация-

неГфона от поддерживающего потенциала -50 мВ до +20 шВ (3 сек), кондиционирующая аппликация NMDA (5 сек, 100 мкМ) , сопровождающиеся увеличением [Ca2-]¡, вызывали инактивацию тест NMDA токов.

Для определения роли [Ca--]¡ в инактивации NMDA токов бьан проведены эксперименты с добавлением хелатора ионов Са2-. Ю мМ ВАРТА во внутриклеточном растворе полностью блокировали инактивацию, вызванную кондиционирующей аппликацией каината и деполяризацией. Таким образом, обратимая /»¡активация NMDA токов опосредована нонами Са--

А NMDA. 50 шs

Рис.4. Хелатирование ионов [Ca2-]¡

с помощью 10 мМ ВАРТА предотвращает инактивации тест NMDA токов, вызваемую: (А) кондиционирующим импульсом каината (50 мкМ, 20 сек) и (В) деполяризацией (от -50 мВ до +20 мВ, 20 сек).

КА20 s /

ьг

в

20 s

Возможны следующие механизмы увеличения цнтоилазматпческого кальция. опосредованные активностью рецепторов АМРА : 1) в результате активации потенциал чувствительных кальциевых каналов при' деполяризации клетки. 2) прямого входа кальция через АМРА: рецепторы. Для днфференциров-, кн этих эффектов были проведены эксперименты с,блокатором потенциал чувствительных кальциевых каналов (100 мкМ ЧС(3-+ ) во время ■ кондиционирующих импульсов . .

Рпс. 5 демонстрирует результаты по избирательной обратимой блокаде ионами С<12+ инактивации, вызванной деполяризующим импульсом. Кондиционирующие деполяризующие импульсы, от.поддерживающего потенциала -50 мВ до +20 мВ длительностью 1-2 сек вызывали инактивацию тест ЫМСОА ответов на 20-30 В присутствии ионов Сс12+ (Ю0 мкМ), блокатора потенциал чувствительных кальциевых каналов, .кондиционирующие деполяризующие импульсы не вызывали инактивации ЫМОА тест токов. В случае инактивации, спровоцированной кондиционирующей аппликацией канната, присутствие ионов СсЗ-+ во внешнем растворе не влияло на инактивацию тест НМОА ответов.

сотого! ДО цМ Сс!**

Рис. 5 Кадмий предотвращает инактивацию тест ИМОА

токов, провоцируемую конд!/- "

шюннрующпм деполяризующим импульсом, не влияя на инактивацию, вызванную кондиционирующей аппликацией канната.

Прямое дсиазательство того, что Са2- непосредственно входит через АМРА-каналы было получено в эксперименте с одновременной регистрацией токов н [Са3-]; . Рпс. 6 демонстрирует одновременную регистрацию токов (верхняя часть

рисунка) и интенсивность флуоресценции Са2- чувствительной краски Р1ио-3 (10-20 мкМ) (нижний трек), загруженной в исследуемый нейрон через регистрирующую пипетку. Кондиционирующая аппликация канната ( 50 мкМ, 10 сек), деполяризующие импульсы от поддерживающего потенциала -50 мВ ло +20 мВ (1-2 мсек) вызывали увеличение |Са2-][. Добавление в экспериментальную камеру ионов Сё2+ (¡00 мкМ) обратимо предотвращало увеличение флуоресценции во время деполяризующих импульсов, не меняя флуоресцентного ответа, вызванного капнатом.

пгтпт Я:

т-ггг|тг

п20 шУ -I 1--50 шУ

-1 I-11. -50 тУ

lOOuMCd

Рис. 6 Каицат провоипрз'ег увеличение концентрации Са2-^ независимо от активности потенциал - чувствительных кальциевых каналов..

В предыдущих экспериментах было показано , что время выхода тест NMDA токов из инактивации пропорционально дозе кондиционирующего импульса. Для определения корреляции между изменением |Ca2-J¡ ti скоростью выхода NMDA - тест токов из инактнвнрованного состояния были проведены и проанализированы эксперименты по одновременной регистрации данных токов и |Ca2-j¡. Рис. 7 демонстрирует результаты одного из проведенных экспериментов. Вверху приведены треки NMDA - активируемых тест токов до и после кондиционирующих импульсов NMDA (5 сек). Внизу, в совмещённых координатах приведены кинетика изменения |Ca2-¡¡ н выход NMDA токов из инактцв.прованного состояния.

NMDA 5s

NMDA. 50 ms /

-100-

-500 60400-

jl — ra

^--0 (lo-iyio

&

■

* V^s

0.5

0.4 ° Ó

Ю.2 ~ 0.0

Рис. 7. Корреляция между кинетикой изменения ¡Ca2-]¡ и

амплитудой тест NMDA токов после кондицнонорующего импульса NMDA (50 мкМ, 5 сек).

50 s

Из рисунка видно, что изменение |Са-*|| является лимитирующим фактором и обратимой кальциевой инактивации ЫМИА токов, выход нз ниактнвашш коррелирует со скоростью возвращения концентрации ионов Са?- к контрольному уровню после кондиционирующего импульса. Таким образом.

1. обнаружено явление взаимодействия между АМРА и ИМОА типами глутаматпых рецепторов.

2. показано, что активация АМРА рецепторов в нейронах гиппокампа сопровождается повышением |Са2*)), обусловленным входом нонов Са> через АМРА- активируемые каналы.

3. Доказано, что механизм взаимодействия между АМРА и ММРЛ рецепторами основан на явлении Са2- - зависимой обратимой инактивации ЫМВА рецепторов.

2. Исследование механизмов Са2* - зависимой ннахтпвацин №ЮА рецепторов на культуре пирамидных нейронов гиппокампа. Описано два основных явления модуляции рецепторов ИМВА , опосредованных изменением (Са2»|,: необратимое надеине чувствительности нейронов к агоннсту (до 50 - рандаун (МасОопаИ М а!., 1989). обратимая инактивация (на 30-40 7.") (Ье§епс1ге е1 а!., 1993): В этой части работы были исследованы и дифференцированы процессы обратимой и необратимой инактиваций по следующим критериям:

а) зависимость от катионов Са>, Ва2* с наружной стороны мембраны;

б) зависимость от 1Са2-Ч1;

в) зависимость от энергетического состояния клеток:

— концентрации АТФ во внутриклеточном растворе,

— активности РР1 н РР2Л.В типов фосфатаз,

г) состояния шпоскелста.

Из Рис. 8 видно, что в условиях отсутствия АТФ во внутриклеточном растворе амплитуда тест ЫМОА токов последовательно падала до постоянного стабильного уровня 49±5 % к 25 мин регистрации (п=7). Половина уровня падения достигалась к 6 мни. 4 мМ АТФ полностью предотвращали процесс рандауна. Обратимая калышевая инактивация наблюдалась на протяжении всего эксперимента ( после кондиционирующих импульсов на 3. 7, 15. 25 минутах), не зависимо от концентрации АТФ во внутриклеточном растворе. Время выхода нз ниактнвашш в отсутствии АТФ увеличивалось с 16±3 сек на 3 мин до 26±6 сек на 25 мин (П=7, Р<0.05).

Рис. 2. АТФ предотвращает рандаун. не влияя на обратнмзто инактивацию ИШЖ токов. А: треки NN10 А токов яри 0 и 4 мМ [АТФ][(а, в -соответственно). В: зависимость степени обратимой инактивации ИМЛА токов от времени регистрации. С: постоянные времени выхода тест МУГОА токов из обратимой инактивация на 3, 7 н 25 мнн регистрации.

Таблица суммирует результаты по сравнительному анализу свойств рандауна и обратимой кнактнвашщ ЩОА токов в нейронах гнппохампа.

Фактор Условия •АТФ Рандаун Обратимая инактивация

наружные двухвалентные катионы 2 мМ |Са2-| 2 мМ |Ва 2-] 0 мМ ¡Са 2-) 0 0 0 _ + * + + *

1Са>Ь«10-9 30 мМ ВАРТА 0 (2-3 70

АТФ 4мМ 0 — +• +■ + *

состояние цнтохалазнн В 4 ,мМ

цитоскелета фаллонднн О

калнкулпн А 0 (задержка)

регуляция • РК-506

фосфатаз 10 мкМ 0 —

500 нМ 0 (задержка)

100 нМ 0

* - отмечпюГчто поос полного ршиаупа Са-'-завпсимпя инактивация сохранялась.

Таким образам, из полученных результатов следу ет, что в Са>- зависимые процессы рандауна и обратимой инактнваинн вовлечены разные внутриклеточные механизмы.

Мозуляипя обратимой Сл--- зависимой нактивацнн ШОА рецепторов релокс реагентами.

Недавно было показано, что редокс реагенты регулируют работу каналов: ШТ, восстанавливающий Б-Б связи , потенцпирует NN10 А токи; ШЫВ, обладающий окислительным потенциалом, пнактнвпрует. Для того, чтобы выяснить, не связана ли ннактпвацпя NN10 А рецепторов с модуляцией групп канала , были проведены эксперименты в присутствии 5 мМ ОТТ . '

№<ША - активируемые токи в нейронах культуры гнппокампа исследовались по стандартному протоколу последовательной двухимпульсной аппликации агоннста. Кочдиинонирующнп импульс ИЩ)А ( 5 сек, 100 мкМ) провоцировал инактивацию тест ИМОА токов на 20-30 % (п=Ю) (Рис. 9 А ). Добавление в экспериментальную камеру йТТ (2 — 10 мМ), реагента с восстанавливающим редокс потеициалом. обратнмо увеличивало амплитуду тест токов в 1.5 — 3.5 раза, необратимо уменьшая (п=10) пли полностью блокируя (П=2) кальциевую инактивацию (Рис. 9 А, В).

А

сспто!

2 тМОТТ

I?

_1100 рА

30 г

ЩШШ

в

БшМЕТГ

ТТТТт

100 рА

205

Рис.9. ОТТ уменьшает степень обратимой Са2- -зависимой инактивации рецепторов ММОА.

Известно, что редокс реагенты нарушают работу К^Ыа-, Ка*^ Са-' насосов клетки, соответственно, это моя;ет приводить к повышению [Са2-],. Действительно, в экспериментах по измерению |Са2-;| с помощью конфокального

сканирующего микроскопа после добавления во внешний раствор ШТ (5 мМ) в присутствии мягкого Сл-' буфера во внутриклеточном растворе (1.1 мМ ЕвТА) наблюдалось сильное увеличение 1Са-~][, достигающее стационарного уровня на 5-10 мин регистрации. Таким образом, возможно, отсутствие инактивации №.ГОА токов в данных экспериментах, связано с необратимым, ШТ опосредованным изменением [Сэ2"]|-

Для нзбежання артефактов, связанных с увеличением ¡С а забыли проведены эксперименты по протоколу регистрации токов от натнвной клетки при локальном добавлении Г)ТТ (5 мМ ) в регистрирующую пипетку. После кондиционирующего импульса N^ÍDA (5 сек, 100 мкМ) вследствие деполяризации клетки амплитуда тока через одиночные каналы в условиях контрольного раствора падала от 5 пА до 1-2 а^ (П=10) (Рис. 10 А). Непосредственно сразу после' отмывки К1УГОА амплитуда тока возвращалась к контрольному значению 4-5 пА (Рис. 10 А, В ). Вероятность нахождения каналов в открытом состоянии после аппликации ММОА обратимо уменьшалась (Рис. 10 А). Время выхода из ннактнвированного состояния составляло 10-15 сек (Рис. 10 А). В присутствии йТТ вероятность открытого состояния каналов после кондиционирующего импульса ИМОА не менялась (П=8) , в то время как амплитуда тока падала от 5 пА до 2 пА (П=10) (П=8) (Рис. 10 А, В). Таким образом, 'редокс реагент с восстан'авлпвающим потенциалом ОТТ (5 мМ)" предотвращает обратимую кальциевую инактивацию.

А

В

Control

DTT. Я шМ

и

Pnc.10.DTT предотвращает обратимую инактивацию. NMDA токов в cell -attached конфигурации . А: совмещенные графики амплитуды и вероятности отхрытого состояния канала. В: примеры токов в отмеченные моменты времени.

3. Са2*- зависимая инактивация NMDA тохов на культуре трансформированных эмбриональных клеток почкн человека (линия НЕК-293), трансфсктироващшхмРНК, содержащими последовательность NR1 н NR2A3 субъеднкиц рецепторов NMDA.

В нейроны гнппокампа экспрессированы разные субьединицы NMDA рецепторов, в основном NR1 и NR2A, В типов (Мопуег et al„ 1994). Для решения вопросов: а) не определяется ли Сэ2- - зависимая обратимая инактивация NMDA токов структурой рецептора; б) не связан ли процесс инактивации с ненронально-спецнфическпм окружением рецептора — были проведены эксперименты на рекомбннантных NR1-NR2A и NR1 -NR2B рецепторах, экспрессированных в клетки линии НЕК-293. Особенность данного типа экспериментов - отсутствие специфических для нейронов систем вторичных посредников и мембран/го- ассоциированных белков в культуре эмбриональных

Рис. 11. Характеристики глутамат активированных токов через рекомбннантнме №11-КК2А н №1-ШЙВ рецепторы на клетках линии НЕК-293. А: ответы'на" глутамат (5сек, 100 мкМ) 1^1-НРч2А рецепторов. В: характеристики рандауна КК1-ИК2А рецепторов; С: ответы на гулутамаг (5 сек, 100 мкМ) NR1-NR2B рецепторов.

1>

Рнс. И иллюстрирует типичные глутамат - активируемые токи на клетках линии .НЕК-293, трансфектнрованных №Ю-ЫИ2А и N¡11-N11213 рецепторами. Для' обоих типов рецепторов во время длительных аппликаций агониста наблюдалась "десенаггизация" ИМОА тока. Для рецептора №и-КК2А в начале эксперимента спад тока описывался одной (П=5) или двумя экспонентами (П = 6) с постоянным!! времени 39501300 мсек или 558±101 мсек и 3100+770 мсек, соответственно. В течение эксперимента десенситпзация ускорялась и через 15

клеток почек человека (НЕК-293).

NSl-ЫЮЛ 2 mm вйл «sraalaed

0 10 20 0 Ш 20

Tun* (nun] Т зле (пил)

W1-NK25

1 5

мин регистрации на всех клетках спал тока описывался двумя экспонентами. Рандаун составлял 50+6 % через 18 минут регистрации в присутствии 4 мМ [АТФ ];. Для рецептора спад тока характеризовался одной экспонентом

с постоянной времени 3230+700 мсек (П=4), рандаун составлял 10-15 " к'28 ' мин регистрации. В присутствии 1 мМ максимум амплитуды токов для

обоих типов рецепторов наблюдался при — 30 мВ.

Рис. 12 демонстрирует кальцевую ннактивашио ММБА токов на клетках с экспрессированнымн N1^1 и N112 А субъедшшцами. Для исследования свойств инактивации в экспериментах использовался стандартный протокол последовательной двухпмиульснои аппликации агониста. Кондиционирующий иппульс глута.мата или ММБА (5 сек. 100 мкМ ) вызывал обратимое паление амплитуды тест токов на 30±6 % (п=15). Свойства ннактивацин исследовались в зависимости от [Са--] и длительности кондиционирующего импульса.

А

В

щ

С °-4

I

о.пс

Рис. 12. Характеристики кальциевой инактивации рекомбннантньгх №11-1ЧК2А рецепторов, экспрессированных в клетки линии НЕК-293.А: инактивация №ШЭА токов при 5 и 0.5 мМ [Са-*] . В: инактивация ИМИА токов после кондиционирующих импульсов глута.мата длительностью 5 и 2 сек. С: в

полулогарифмических координатах

зависимость инактивации от

протекаемого через мембрану заряда во время кондиционирующего импульса.

20 5

- 0.2-

Из рисунка видно, что степень ннактпванни увеличивается с ростом длительности кондиционирующего импульса и концентрации ионов Са2-

(соответственно, 15±Ч % при 0.5 мМ |Са2"1, п=5 и 50±8 % при 5 мМ |СаН, П=6). Время выхода нз пнактнващш возрастало с увеличением длительности аппликации агонпста (25 сек при 2 сек аппликации и 60 сек при 5 сек аппликации) (Рис. 12 В); увеличивалось с повышением концентрации кальция в

наружном растворе с 10±5 сек при 0.5 мМ |Са2*1, П=5 до 45 ±15 сек. при 5 мМ |Са2*1, П = 6 (Рис. 12 А). Аналогичный результат был получен на рекомбннантных КК1 -КК2В рецепторах. Таким образом, рекомбинантные КК.1-ИК2А и NR1-NR2B каналы обладают свойством обратимой Са'-¡--зависимой инактивации натнвных ЫМОА рецепторов, что указывает на возможность следующих механизмов ннактнвацнн: а) через неизвестный, характерный для разных типов клеток Са2- - чувствительный цптоплазматичеекцй фактор; б) через Са2~ - чувствительный участок, находящийся непосредственно на ММ1)А канале.

Выводы. -

1. Методами локальной фиксации потенциала, конфокальной сканирующей микроскопии и двойной эмиссионной флуорометрин исследовано. взаимодействие между АМРА . л Ь'МОА типами рецепторов глутамата, • а также .модуляция ИМВА- активируемых токов нонами Са2- в нейронах гпппокампа и в трансфектированиых клетках лншш НЕК-293.

2. Обнаружено, что избирательная активация АМРА- рецепторов в нейронах гпппокампа вызывает обратимую инактивацию токов ЫМОА на 20-30 %. Доказано, что эффект инактивации вызван ионами Сэ2- , проникающими непосредственно через рецепторы АМРА .

3. В иеГфОнах культуры гпппокампа обнаружено два типа модуляции ЫМОА-токов нонами Са2- : ¡) обратимая инактивация, П) необратимая инактивация. ' Показано, что ' процессы 'обра^1мон и необратимой инактиваций имеют следующие общие свойства:

а) в отсутствие Са 2- в наружном растворе оба процесса не развиваются;

б) экипмолярная замена и наружном растворе Са2* на Ва2- (2 мМ) приводит к их уменьшению;

в) хелатировпнне внутриклеточных ионов Са2- с помощью ВАРТА (30 мМ) предотвращает оба процесса.

4. Показано, что А ТФ. ингибиторы фосфатаз (типов РР1 н РР2А.В), модуляторы состояния цитоскелета (фаллондни и цнтохалазнн В) регулируют необратимую пнактпваишо, не влияя на обратимую инактивацию. Таким образом, в процессы обратимой и необратимой кальциевой инактивации повлечены. ло-видпмому, разные внутриклеточные механизмы.

5. На уровне одиночных каналов показано, что:

а) обратимая Са2*- зависимая инактивация сопровождается уменьшением частоты работы каналов NMDA ;

б) степень и кинетические параметры инактивации определяются концентрацией ионов Са2- в клетке:

в) восстановление 3-S связен рецептора NMDA с помощью DTT уменьшает степень-обратимой инактивации. • - ■ •

6. Обнаружено, что обратимая. Са2- - зависимая инактивация NMDA-токов существует в культуре клеток линии НЕК-293, трансфектнрованных рекомбинантнымн рецепторами NR1-NR2A и NR1-NR2B. Таким образом, пепрон-спсцнфические цитоплазматическне и мембранные элементы не вовлечены в процесс обратимой инактивации.

7. Полученные результаты позволяют предполагать, что процесс обратимой Са2- - зависимой инактивации управляется либо (а) через неизвестный, характерный для разных типов клеток Са2* -чувствительный цитоплазматнчеекин фактор, либо (б) через Са2--чувствительный участок, находящийся непосредственно на макромолекуле NMDA- канала.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Medina 1.. Filippova N.. Barbin G., Beri-Ari Y., Bregestovski P. (1994) Kainate-induced inactivation of NMDA current1; via an elevation of intracellular Ca2+ in hippocampal neurons. J. Neurophysiol. 72,456-465.

2. Medina 1., Filippova N.,Ben-Ari Y., Bregestovski Р. Л 993) Modulation of the NMDA Channels recovery from lcainate-induced inhibition.4th Conference "Canaux ioniques" Carry-le-Rouet, France, abstract

3. Medina I., Filippova N.,Ben-Ari Y., Bregestovski P. (1993) Calcium mediated interaction between AMPA/kainate and NMDA receptors in cultured hippocampal neurones, xviiith Conference in Neurobiology "Molecular basis of diversity in neurones" Gif-Sur-Yvette, France, abstract.

4. Filippova N„ Medina I., Khrestchatisky M.,Ben-Ari Y.,Bregestovski P. (1994) NMDA receptors in human eel! line, are modulated by intracellular Ca2+. 5th Conference "Canaux ioniques" Carry-le-Rouet, France, abstract

5. Medina 1., Filippova N.,Ben-Ari Y., Bregestovski P. (1994) Calcium-dependent rundown ¿nd calcium-induced inactivation of NMDA currents are functionally disconnected. 5th Conference "Cariaux ioniques" Carry-le-Röuet,'France;'abstract " "

6. Bregestovski P., Medina I., Filippova N. end Ben-Ari Y. (1994) Modulation of NMDA currents calcium in hippocampal neurones. 14 th Blankenese Conference "Modulation of signals in neuronal systems" Hamburg-Blankenese, abstract

Medina I., Filippova N.. Charton G., Rougeole S., Ben-Ari Y., Khrestchatisky M., Bregestovski P. (1994) Calcium-dependent inactivation of recombinant heteromeric NMDA receptor channels. J. Physiol, in press