Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение свойств глутаматных рецепторов АМПА-типа мозга крысы на модели эпилепсии, вызванной имплантацией кобальта

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гранстрем, Олег Константинович, Санкт-Петербург

/* У " У У *> ¡/

у ^

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЗГА ЧЕЛОВЕКА

На правах рукописи

ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ГЛУТАМАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ АМРА-ТИПА МОЗГА КРЫСЫ НА МОДЕЛИ ЭПИЛЕПСИИ, ВЫЗВАННОЙ ИМПЛАНТАЦИЕЙ КОБАЛЬТА

Специальность 03.00.04. Биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: заведующая лабораторией молекулярной нейробиологии Института Мозга человека РАН доктор биологических наук профессор С. А. Дамбинова

Санкт-Петербург 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ:

ВВЕДЕНИЕ 7

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1 ГЕТЕРОГЕННОСТЬ ГЛУТАМАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ И 14

ИХ ФУНКЦИИ В ЦНС

1.1. Свойства семейства глутаматных рецепторов и их роль в ЦНС 14

1.2. Классификация глутаматных рецепторов 16

1.3. Молекулярная организация глутаматных рецепторов 17

1.4. Распределение и локализация глутаматных рецепторов в ткани 24 мозга • - ,

1.5. Функциональная роль глутаматных рецепторов в мозге 25 Глава 2 РОЛЬ ГЛУТАМАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ В

ПАТОГЕНЕЗЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЦНС

2.1. Роль глутаматных рецепторов в эпилептогенезе 29

2.2. Участие глутаматных рецепторов в развитии ишемии, алкоголизма, 35 шизофрении, и болезни Альцгеймера

2.3. Экспериментальные модели эпилепсии у животных 36

2.4. Изменение экспрессии генов ОЫЯб при эпилепсии 40

2.5. Особенности ЭКоГ при эпилепсии 44 Глава 3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Характеристика модельных животных 47

3.2. Выделение синаптических мембран из мозга крыс 48

3.3. Выделение ГМБ из синаптических мембран мозга крыс 49

3.3.1. Солюбилизация мембранных белков 49

3.3.2. Аффинная хроматография ГМБ на глутамат-сефарозе 49

3.3.3. Выделение субъёдиниц АМРА рецептора методом 50 препаративного электрофореза

3.4. Аналитический электрофорез 52

3.4.1. Электрофорез в денатурирующих условиях 52

3.4.2. Окраска гелей при помощи Кумасси R-250 54

3.4.3. Окраска гелей серебром 54

3.4.4. Аналитический электрофорез ДНК 55

3.5. Техника выполнения Вестерн блота 56

3.5.1. Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану 56

3.5.2. Выявление фракций белка с использованием специфичных 57 антител после электропереноса на нитроцеллюлозную мембрану

3.6. Техника выполнения ДОТ блота. 58 3.6.1. Перенос белков и пептидов на нитроцеллюлозную мембрану 58

3.7. ELISA. ;.■ . 58

о

3.8. Определение специфического связывания [°Я] АМРА с фракциями 59 GluRs

3.9. Определение концентрации белка в растворе 61

3.10.Выделение тотальной мРНК из мозга крыс 62 3.10.1 .Очистка препарата мРНК от примесей ДНК 63

3.11. Методика проведения прямой ЯТ-РСЯ 65

3.12. Количественный анализ продуктов ЯТ-РСЯ 66

3.13.. Иммуноцитохимическое окрашивание 67

3.13.1. Предварительная подготовка ткани 67

3.13.2. Приготовление и окрашивание срезов 67

3.14. Имплантация кобальта и регистрация ЭКоГ 68

3.15. Методы статистического анализа результатов исследования 69

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Глава 4 ВЫДЕЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИИ СУБЪЕДИНИЦ АМРА РЕЦЕПТОРА

4.1 Выделение глутаматсвязывающих мембранных белков и 71 субъединиц АМРА рецептора из мозга крысы

4.2. Идентификация субъединиц АМРА рецептора 76

4.3. Сравнение иммунологических свойств субъединицы 01иЯ1 из 78

мозга крысы и синтетического №концевого пептида- фрагмента С1иШ Глава 5 РАСПРЕДЕЛЕНИЕ, ИММУНОРЕАКТИВНОСТЬ И

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ СУБЪЕДИНИЦ АМРА РЕЦЕПТОРА В КОРЕ И ГИППОКАМПЕ КРЫС С ЭПИЛЕПСИЕЙ, ВЫЗВАННОЙ ИМПЛАНТАЦИЕЙ КОБАЛЬТА

5.1. Иммунореактивность субъединиц АМРА рецептора в мозге крыс 81

5.2. Распределение субъединиц АМРА рецептора в гиппокампе и коре 84 мозга

5.3. Экспрессия гена 01иШ в мозге крыс 85 Глава 6 СОПОСТАВЛЕНИЕ ДИНАМИКИ ОШЮ АУТОАНТИТЕЛ В

СЫВОРОТКЕ КРОВИ КРЫС С ЭПИЛЕПСИЕЙ, ВЫЗВАННОЙ ИМПЛАНТАЦИЕЙ КОБАЛЬТА, И ДАННЫХ ЭКоГ 6.1 ЭКоГ мониторинг у крыс с эпилепсией, вызванной имплантацией 89 кобальта

6.2. Динамика накопления ОЫШ аутоантител в крови крыс с 90 эпилепсией, вызванной имплантацией кобальта

6.3. Сравнение изменений уровня ОШИ аутоантител у различных 94 моделей эпилепсии: генетической, аудиогенной и индуцированной электрическими стимулами

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 101

ВЫВОДЫ 110

ЛИТЕРАТУРА 112

ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

аАТ - аутоантитела

GluRs - глутаматные рецепторы

ГМБ - глутаматсвязывающий мембранный белок

ЦНС - центральная нервная система

АМРА - а-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксолпропионат

NMDA - N-метил D-аспартат

PCR - полимеразная цепная реакция,

РТ - PCR одновременные обратнотранскриптазная и полимеразная цепная реакции

TS - тотальный солюбилизат

ГЭБ - гематоэнцефалический барьер

ЭЭГ - электроэнцефалография

ЭКоГ - электрокортикография

ЯМР - ядерномагнитный резонанс

PBS - физиологический фосфатный буфер

DOX - дезоксихолат натрия

ДВП - долговременная потенциация

КА - каинатные рецепторы

ТМД - трансмембранный домен

SDS - додецил сульфат натрия

ВВЕДЕНИЕ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ: Глутаматные рецепторы являются одними из самых распространенных рецепторов возбуждающих аминокислот, ответственных за передачу сигналов в более чем в 80% синапсов ЦНС (Hollman, Heineman, 1994). Наиболее изученными среди них являются ионотропные рецепторы глутамата, так называемые NMDA- и не-NMDA рецепторы (Meldrum, 1994). Последние подразделяются на АМРА и каинатный типы глутаматных рецепторов (Monoghan, Wenthold, 1997).

. Установлено, что АМРА тип рецепторов вносит преимущественный вклад в механизмы гипервозбудимости, лежащие в основе патогенеза эпилепсии (Meldrum, 1995, McNamara, 1995). Было показано, что антитела к АМРА рецепторам способны их активировать и приводить к судорожным состояниям у животных и возникновению электрических разрядов in vitro (Twaiman et al., 1995). Однако, детальные механизмы процессов, происходящих в нервной ткани на уровне рецепторов, остаются пока еще малоизученными.

В Институте Мозга человека РАН под руководством проф. Дамбиновой С. А. в течение ряда лет проводятся исследования участия ионотропных рецепторов глутамата, в том числе, АМРА-рецепторов, в развитии пароксизмальных состояний головного у человека и животных. Выдвинута концепция об участии аутоиммунных процессов в развитии эпилепсии, в частности, отмечено появление аутоантител (аАТ) к субъединицам АМРА

рецептора (Громова, Дамбинова и др., 1997). В связи с этим целесообразным методологическим подходом для изучения конкретных молекулярных событий, предшествующих появлению пароксизмальной активности в мозге, могли бы оказаться экспериментальные исследования эпилепсии у животных. Тем более что различные варианты течения клинических форм эпилепсии достаточно полно представлены среди известных в настоящее время экспериментальных моделей этого заболевания. Одной из наиболее интересных и хорошо изученных с электрофизиологической точки зрения является модель эпилепсии, вызванной имплантацией кобальта на dura mata крыс (Dawson et al., 1967; Fisher et al., 1989). Эта модель эпилепсии хорошо имитирует' генерализованные, фокальные судороги, наступление которых разворачивается во времени, а спайковая активность контролируется с помощью ЭКоГ мониторинга (Tourov et al., 1996).

Для того чтобы понять вклад АМРА рецепторов в механизмы развития эпилепсии были определены ключевые вопросы, ответы на которые позволили бы понять молекулярные аспекты развития судорожных состояний. Целесообразным представлялось определить свойства АМРА рецепторов мозга

« " ч*- 1 .

крысы, их иммунореактивность в мозге, изучить динамику накопления аАТ к GluRl рецептору в крови экспериментальных животных, предварительно сравнив антигенные свойства GluRl N-терминального синтетического пептида и выделенной из мозга крысы GluRl субъединицы. Актуальность такого направления исследований определяется, на наш взгляд, не только

теоретической важностью анализируемой проблемы, но и возможностью решения прикладных вопросов и, в частности, диагностики пароксизмальных состояний головного мозга на основе иммуно-биохимического подхода, дополняющего данные уже существующих методов инструментальной диагностики (ЭЭГ, ЭКГ, ЯМР и позитронно-эмиссионная томография).

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ: Целью настоящей работы является изучение свойств глутаматных АМРА рецепторов мозга крыс на модели эпилепсии, вызванной имплантациеи кобальта.

Конкретные задачи исследования сводились к следующему:

1. Выделить и идентифицировать 01иШ субъединицу АМРА рецептора мозга крысы и сравнить ее иммунологические свойства со свойствами С1иЮ синтетического пептида (ТЧГ-терминальная часть, 241-255 а. о.);

2. Оценить изменение экспрессии гена субъединицы 01иЯ1 в коре и гиппокампе крыс с эпилепсией, вызванной имплантацией кобальта;

3. Изучить распределение и иммунореактивность субъединиц АМРА рецепторов в коре и гиппокампе крыс с эпилепсией, вызванной имплантацией кобальта;

■ 4. Сопоставить динамику накопления • аутоантител (аАТ) к 01и]11 в сыворотке крови и данные ЭЭГ мониторинга у крыс с кобальтовой эпилепсией;

5. Провести сопоставление динамики накопления и 01иЮ аАТ в сыворотке крови крыс с различными формами экспериментальной эпилепсии:

генетической (WAG/Rijn), аудиогенной (КМ), вызванной имплантацией кобальта и электрической стимуляцией.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ:

1. На репрезентативной модели в работе впервые подтверждена концепция об участии аутоантител к АМРА рецепторам в патогенезе

• S'-

эпилепсии. ,

2. Впервые сопоставлены локальные события на мембранах нейронов, такие как распределение и иммунореактивность АМРА рецепторов, системные биоэлектрические процессы в головном мозге и аутоиммунные реакции организма животного.

3. Установлено, что, наряду с основным компонентом GluRl субъединицы с молекулярной массой 110 кДа, имеется минорный компонент с молекулярной массой 57 кДа.' Доказано', что синтетический N-концевой (241255 а. о.) GluRl пептид проявляет сходные иммунологические свойства с выделенными фрагментами 57 и 110 кДа и может быть использован в качестве антигена для определения уровня аутоантител в крови.

4. У крыс с эпилепсией, вызванной имплантацией кобальта, установлено увеличение экспрессии гена GluRl в коре и гиппокампе, причем впервые установлено значительное раздичие между уровнями GluRl мРНК в правом и левом полушариях. Выявлено усиление GluRl и GluR2/3 иммунореактивности в гиппокампе данных крыс.

V 11

5. Показано, что при экспериментальной эпилепсии аутоантитела к субъединицам АМРА рецептора могут служить маркерами поражения глутаматергических связей в мозге.

6. Обнаружено, что появление аутоантител к 01иШ в крови крыс с эпилепсией, вызванной имплантацией кобальта, предваряет возникновение спайковой. активности, на ЭКоГ.

7. Впервые обоснована5 на экспериментальной модели возможность биохимической диагностики пароксизмальных состояний с использованием в качестве критерия уровня С1иЫ1 аутоантител.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ

РЕЗУЛЬТАТОВ: Результаты свидетельствуют о первичной дисфункции АМРА рецепторов в мозге и лишь последующем развитии спайковой активности. Наиболее существенным фактом является' выявление корреляции между уровнем аутоантител к вШИ в сыворотке крови крыс и частотой разрядов пик-волна в мозгу крыс, с эпилепсией вызванной имплантацией кобальта. Это позволяет по-новому представить молекулярные механизмы развития эпилепсии, видя в патогенезе болезни не только поражение на уровне нервной ткани, но и системные изменения и реакции организма на них. Исследование выявило наличие тонкого взаимодействия между нервной и иммунной системами в патогенезе эпилепсии, .что открывает новые горизонты в понимании процессов лежащих в основе данного заболевания. Выявленные

закономерности создают рациональную основу для разработки новых адекватных методов диагностики и лечения эпилепсии.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ: Диссертация изложена на 132-х страницах и состоит из введения, обзора литературы (главы 1,2), материалов и методов исследования (главаЗ), собственных исследований (главы 4 - 6), обсуждения результатов и выводов. Работа иллюстрирована 26 рисунками и содержит 7 таблиц. Список литературы представлен 147 названьями работ на русском и английском языках.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ: ■ 1. Выделена и идентифицирована GluRl субъединица АМРА рецептора мозга крысы с молекулярной массой 110 кДа, а также минорный компонент с молекулярной массой 57 кДа. С применением иммуноцитохимического анализа установлены локализация и распределение в коре и гиппокампе АМРА рецепторов.

2. Показано увеличение экспрессии гена GluRl и иммунореактивности GluRl и GluR2/3 субъединиц АМРА рецептора в коре и гиппокампе крыс с эпилепсией, вызванной имплантацией кобальта. Установлено значительное различие между уровнями GluRl мРНК в правом и левом полушариях мозга данных животных.

3. Обнаружено повышение уровня аутоантител к субъединице GluRl АМРА рецептора и синтетическому N-концевому пептиду GluRl в крови крыс

с эпилепсией, вызванной имплантацией кобальта. Динамика накопления аАТ коррелировала с частотой пароксизмальной активности.

4. Динамика накопления 01иШ аутоантител является маркером поражения глутаматэргических путей и отражает состояние мозга крыс с различными формами экспериментальной эпилепсии. При сравнении изученных моделей выявлены индивидуальные особенности накопления аутоантител в крови, зависящие от типа модели и возраста экспериментальных животных.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ: Апробация состоялась 29 июля 1998 г. на расширенном научном заседании лаборатории молекулярной нейробиологии (зав. лаборатории - д. б. н. профессор С.А. Дамбинова)

По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, из них 3 в центральной печати, сделаны доклады на симпозиумах и конференциях:

- 33-ем Конгрессе Международного Физиологического Общества (XXXIII ШРв), Санкт- Петербург, 1997 г;

- 16-ом Собрании Международного Нейрохимического Общества, Бостон, 1997 г;

- 2-ом Съезде Российского Биохимического Общества, Москва, 1997г;

- 12-ом Собрании Европейского Нейрохимического Общества, Санкт-Петербург* 1998 г.

ОБЗОР ЛИТЕРАТЕРЫ

Глава 1

Гетерогенность глутаматных рецепторов и их функции в ЦНС 1.1. Семейство глутаматных рецепторов и их роль в ЦНС

L-глутаминовая кислота является наиболее широко распространенным возбуждающим нейротрансмиттером в нервной системе позвоночных (Meldrum, 1994). К настоящему времени известно, что она взаимодействует с четырьмя классами постсинаптических глутаматных рецепторов: NMDA, АМРА, каинатными и метаболотропными (Michaelis, 1996). Как оказалось, наряду с обеспечением быстрой синаптической передачи, эта аминокислота способна индуцировать такие изменения в возбудимости нейронов, как долговременная потенциация (ДВП) или, в некоторых случаях, торможение (Johnston et al., 1996). Доказано, что вызванное глутаматом возбуждение нейронов является одним из основных механизмов, ответственных за развитие мозга на ранних стадиях (Sheng et al., 1994; Tremblay et al., 1988). In vivo, глутаматные рецепторы (GluRs) оказывают влияние на образование синапсов в зрительных путях мозга (Bear M.F. et al., 1990) и обуславливают элонгацию нейритов (Brewer G.J. et al., 1989). В культурах ткани глутаматные рецепторы положительно влияют на выживание гранулярных клеток мозжечка (Balazs et

v 7-4- "

al., 1988). Активация потока ионов Ca является, по всей видимости, ключевым моментом к опосредованному глутаматными рецепторами нейрональному ответу. Вход Са2+ к клетку, в свою очередь, приводит к

стимуляции кальмодулинзависимой киназы II и тирозинкиназы (Fukunaga et al.,1990; Bading et al., 1991). Стимуляция этих ферментов ведет, вероятно, к изменениям в передающих сигнал каскадах и, таким образом, влияя, в конечном итоге, на регуляцию транскрипции (Kaltschmidt et al., 1995). Глутамат также взаимодействует с семейством G-белков, связываясь с метаболотропными рецепторами, которые или активируют фосфолипазу С или уменьшают активность аденилатциклазы.

В последние годы стало известно, что глутаматные рецепторы представлены не только в нейронах, но и в клетках глии - астроцитах и олигодендроцитах (Steinhauser et al., 1996). Эти клетки обладают AMP А, КА и метаболотропными глутаматными (но не NMDA) рецепторами. Астроциты демонстрируют кальций зависимое высвобождение глутамата, которое может быть запущенным посредством брадикинина или других агентов, увеличивающих внутриклеточную концентрацию кальция в астроцитах. Таким образом, клетки глии отвечают за возрастание концентрации внеклеточного глутамата и способна индуцировать нейрональный ответ на глутамат (через NMDA рецепторы).

Глутаматные рецепторы глиальных клеток, будучи активируемыми параллельно с активацией GluRs в нейронах, модулируют экспрессию генов.

. V

Пролиферация и ' дифференциация, клеток-предшественников также регулируется через активацию глутаматных рецепторов, представленных на их

мембранах, и служит ответом на функциональное состояние окружающих их нейронов.

GluRs оказывают влияние на экспрессию ранних c-fos генов, а изменения в ЦНС, вызванные индукцией этих генов, играют важную роль во время раннего развития мозга так же, как и во взрослом состоянии (Lerea et al., 1995).

В работах многих исследователей показан�