Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль мембранных рецепторов в сигнальных механизмах в клетках нейрональной природы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль мембранных рецепторов в сигнальных механизмах в клетках нейрональной природы"

На правах рукописи

КУЛИКОВ Андрей Валентинович

РОЛЬ МЕМБРАННЫХ РЕЦЕПТОРОВ В СИГНАЛЬНЫХ МЕХАНИЗМАХ В КЛЕТКАХ НЕЙРОНАЛЬНОЙ ПРИРОДЫ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2007

003057729

Работа выполнена в ГУ НИИ неврологии РАМН (г. Москва).

Научный руководитель: Заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук профессор

доктор биологических наук профессор

Ведущая организация:

Институт биохимии РАН им А.Н. Баха

Болдырев Александр Александрович

Панкин Вадим Зиновьевич

Гомазков Олег Александрович

Защита диссертации состоится ¿0 <*УУЬа/Д 2007 г заседании диссертационного совета Д 212.203.13 при РоссиН) дружбы народов по адресу: 117198, ГСП, г. Москва, ул. Миклу»

;ском университете о-Маклая, д. 8

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библ« университета дружбы народов по адресу: 117198, ГСП, г. Мо Маклая, д. 6

Автореферат разослан » 1-чС-^кк 2007 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 212.203.13 доктор биологических наук, профессор

1А—

часов на

ютеке Российского сква, ул. Мюслухо-

ЛукашбваЕ.В

Общая характеристика работы Астуальность проблемы

Na/K-Hacoc и глутаматные рецепторы представляют собой две стороны обеспечения функций глутаматергической нейрональной клетки. Первый поддерживает асимметричное распределение ионов натрия и калия по обе стороны нейрональной мембраны, создавая основу для генерации потенциала возбуждения, а вторые являются инициаторами процесса возбуждения, реализующего ионные градиенты. Накоплен ряд данных, свидетельствующих о том, что Na/K-АТФаза выступает как рецептор кардиотонических стероидов (КТС) типа уабаина, включаясь в сигнальные каскады клетки (McConkey et al, 2000; Saunders & Scheiner-Bobis G., 2004; Kometiani et al, 2005). В свою очередь, глутаматные рецепторы влияют на активность Na/K-АТФазы (Boldyrev et al, 2002).

КТС синтезируются в организме в небольших количествах, которые способны действовать на изоформы Na/K-АТФазы чувствительного типа (а2 и аЗ), запускают сигнальные механизмы без изменения ионного гомеостаза клетки (Scheiner-Bobis & Schoner, 2002). Эти сигнальные механизмы реализуются в активации транскрипционных факторов NF-кВ и АР-1, экспрессии генов и синтезе белка (Peng et al, 1996; Huang et al, 1997). В настоящей работе мы исследовали взаимодействие Na/K-АТФазы и глутаматных рецепторов в клеточной культуре нейробластомы человека SH-SY5Y и в нейронах мышей SAMP1, характеризующихся повышенным уровнем активных фррм кислорода (АФК), что соответствует состоянию тканевого окислительного стресса (Takeda (ed), 1998, Болдырев с соавт, 2003).

Цель работы; Изучение участия Na/K-АТФазы, глутаматных рецепторов NMDA-класса и метаботропных рецепторов в проведении внутриклеточных сигналов; выяснение их роли в регуляции клеточного метаболизма и значения для жизнеспособности нейрональной клетки, а также нахождение новых особенностей механизмов взаимодействия этих систем.

Для выполнения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1) Определение изоформного состава Ыа/К-АТФазы и субъединиц NMDA-рецепторов в клетках нейробластомы SH-SY5Y.

2) Оценка влияния Ыа/К-АТФазы и NMDA-рецепторов на внутриклеточный уровень ионов кальция и АФК в клетках нейробластомы SH-SY5Y.

3) Выявление внутриклеточных белков-посредников, участвующих в механизмах клеточной сигнализации, реализующихся при участии Ыа/К-АТФазы и NMDA-рецепторов в клетках нейробластомы SH-SY5Y.

4) Оценка жизнеспособности клеток нейробластомы SH-SY5Y при блокаде Na/K-АТФазы уабаином и действии токсических концентраций NMDA.

5) Определение типа клеточной смерти (некроз или апоптоз) при ингибировании Na/K-АТФазы уабаином на клеточной линии РС-3.

6) Сопоставление уровня АФК и темпов гибели нейронов мозжечка быстростареющих мышей линии SAMP (Senescence Accelerated Mice) при активации глутаматных ионотропных и метаботропных рецепторов.

Научная и практическая новизна работы. Представленные данные показывают, что Иа/К-АТФаза вовлекается в систему внутриклеточной сигнализации нейробластомы БН-БУЗУ в качестве регулятора клеточнот метаболизма и жизнеспособности этих клеток. В клеточной культуре нейробластомы 5Н-8У5У

присутствуют все 3 типа изоформ Na/K-АТФазы. При инги уабаином наблюдается увеличение уровня АФК и внутриклеточ которые, вероятно, участвуют в передаче сигналов в мессенджеров. На клетках нервного происхождения впервые п активации Na/K-АТФазой сигнальных путей с участием протеиню РКВ. Впервые обнаружено, что действие уабаина приводит к белка Bad, что приводит к Подавлению его проапоптозного дейс

вьивлена активация ряда внутриклеточных посредников, участвующих в развитии

апоптоза в этих клетках - снижается доля активных (фосфорилирс 2 и Bcl-xL, подавляющих выход цитохрома С из митохоця появляется цитохром С, активируется каспаза 3 и белок р53. Дв пути регуляции характеризуются различной чувствительностью выявляется при низких, а второй - при высоких (1 мкМ и выше) лиганда.

Показано, что в клетках нейробластомы SH-SY5Y присутству NMDA-рецепторов, но инкубация клеток с NMDA не приводит к АФК и ионов Са2+. Тем не менее, в этих условиях активируются ] >42/44 МАРК и РКВ киназы. Возможно, что именно NR1 субъединица NMDA-рецептбров ответственна за их сигнальную функцию.

Данные, полученные на мышах линии SAMP, демонстрируют регулирующее действие метаботропных глутаматных рецепторов на выражающееся в том, что метаботропные рецепторы I группы осл усиливают токсическое действие NMDA.

Обнаруженные закономерности помогают уточнить молекулярные механизмы сигнальной функции Na/K-АТФэзы и рецепторов глутаматергической системы в нервных клетках.

>ировании АТФазы «ых"ионов кальция, иестве вторичных злучены данные об шаз р42/44 МАРК и фосфорилированию гвия. Одновременно

ванных) белков Bcl-рий; в цитоплазме а противоположных к уабаину: первый :онцентрациях этого

icy

Апробация работы. Результаты исследований были Международном симпозиуме по фармакологии церебральной Германия, июль 2004), на экологической конференции в РУДН (М< 20 съезде Международного нейрохимического сообщества (Инсбр; 2005), на физиологической конференции в Университете им. Ю( Германия, март 2006), на 5-м симпозиуме европейских нейрохй (Вена, Австрия, июль 2006), на лабораторном семинаре в институте (Москва, сентябрь 2006), на заседании кафедры биохимии Биолог: МГУ им М.В. Ломоносова (Москва, октябрь 2006).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 4 сообщения.

Объем работы: Диссертация состоит из введения, посвященного свойствам Ыа/К-АТФазы и рецепторов глутамат описания материалов и используемых методов, результатов, обе: списка литературы (264 ссылки). Общий объем работы - 143 стр; рисунка и 6 таблиц.

?г NR1 субьёдиница увеличению уровня

NMDA-рецепторы, абляют, а Ш группы

Доложены на 10-м ишемии (Марбург, [осква, май 2004), на |ук, Австрия, август са Либиха (Гиссен, мических сообществ неврологии РАМН ического факультета

статьи и 4 тезисных

обзора литературы, ергической системы, ;уждения, выводов и аницы, в том числе 43

Общее содержание работы Материалы и методы исследования

В качестве объекта исследования в работе использовались культуры клеток нейробластомы SH-SY5Y (АТСС, USA) и карциномы простаты РС-3, поддерживающиеся согласно протоколу производителя, и первичная культура нейронов, выделенных из мозжечка быстро стареющих мышей линии SAMP, получаемая обработкой диспазой (Oyama et kl, 1996; Болдырев, 2000). Выделение мРНК и полимеразную цепную реакцию для определения изо форы Na/K-АТФазы и субъединиц NMDA-рецепторов проводили с помощью набора Q1AGEN RNcasy Mini Kit (Qiageri, Germany) согласно протоколу производителя. Определение количества белка для Вестсрн-блота производили с помощью специального набора ВСА Protein Assay Reagent Kit (Pierce, Rockford, USA). Электрофорез в полиакриламидноги геле и вестерн блотгинг проводили по стандартной процедуре. Для специфического окрашивания белков использовали антитела фирмы "Cell Signaling" (Germany). Определение уровня внутриклеточного кальция, АФК и типа клеточной смерти проводили методом проточной цитометрии на приборе FACSCalibur (BD Biosciences, USA), результаты анализировали с помощью программы WinMDl 2.7 (Scripps Institute, UaJolla, USA). В качестве маркеров использовали специфические флуоресцентные зонды - Fluo-3-AM (Calbioclicm, Schwalbach, Germany) для определения внутриклеточного кальция, DCF-DA (Invitrogcn, Germany) для определения уровня АФК; для определения типа клеточной смерти применяли комбинированное окрашивание клеток PI (некрозные клетки) и аннексином V F1TC (апоптозные клетки) (Invitrogen, Germany). Статистическую обработку данных проводили с помощью программ Statistica, GraphPadPrism 4.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. УЧАСТИЕ Na/K-АТФазы В СИГНАЛЬНЫХ МЕХАНИЗМАХ КЛЕТОК НЕЙРОБЛАСТОМЫ ЧЕЛОВЕКА SH-SY5Y Определение изоформного состава Na/K—АТФазгы в клетках нейробластомы SH-SY5Y

В возбудимых тканях Na/K-АТФаза экс премируется в виде нескольких изоформ, различающихся по чувствительности к переносимым ионам, АФК, а также к гормонам и гормоноподобным соединениям, например, к уабаину (Huang et al, 1992; lj га у a ma et at, 1989).

600 bp 500 bp —*

400 bp . . ft

al a2 a3 a1 a2 a3 gapdh

^-V--'

40 PGR 36 PCR

циклов циклов

Рис. 1. Изоформный состав Na/K-АТФззы в клетках нейробластодч SH-SY5Y

Исходя из этого, мы решили выяснить, какие изоформы ферме в клетках нейробластомы БН-БУбУ. Из клеток была выделена реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реа] показано, что в данной клеточной культуре присутствуют все 3 (Рис. 1).

Изоформы Ка/К-АТФазы различаются по содержани сульфгидрильных групп в первичной структуре. Изоформа резистентна к уабаину и более устойчива к свободнорадикальи взаимодействует с этим гликозидом при его концентрации ев; изоформы, чувствительные к уабаину (взаимодействуют с эти; концентрации 10~9-10~* М), содержат более доступные для модиф окисляются АФК в первую очередь (АйепуШ е1 а1, 1984; Болды] 1999). Специфичная для нейрональных клеток изоформа аЗ явля <х2-изоформа слабо представлена в клетках нейробластомы 8Н-! составляет около 10 % от уровня а1).

нта экспрессируются ДНК, и с помощью кции (Л РСЯ) было изоформы фермента

:ю и локализации а1 относительно ому окислению, она ьппе 10"6 М; (а2+аЗ) м лигавдом при его икации БН-группы и рев, 1996; Же е! а1, ется доминирующей, £ У5У (ее содержание

Уабаин увеличивает уровень внутриклеточного кальция и АФК в клетках нейробластомы БН-вУбУ Уровень внутриклеточного кальция и АФК в клетках нейроб. наших опытах определялся после 30 мин ингибирования Ыа/К-концентрациями уабаина. Максимальная его концентрация состав ингибйровались и чувствительные и резистентные изоформы N

Ж-

концентрациях 10"5 - 10"6 М вызывал достоверное внутриклеточного кальция (на 25-30% от исходного уровня) уабаина 10'7-10'8 М отличия от контроля были недостоверны (Рис.

Для оценки роли внеклеточного кальция в регистрируемом Э! среду инкубации 1 мМ кальциевого хелатора ЭГТА. Совместное и ЭГТА не приводило к повышению ионов кальция внутри кто кальциевый сигнал в присутствии уабаина был обусловлен постуг. внеклеточного пространства. Вероятно, подавление Ма/К-приводило к накоплению ионов натрия в клетках и акгивир обменника. Исходя из того, что выявление этого эффекта (достф контроля) обнаруживалось при высоких концентрациях уабаина, что за эффект ответственны резистентные изоформы Ка/К-АТФазы

ластомы БН-БУбУ в \ТФазы различными ляла 10'5 М, при этом -АТФазы. Уабаин в увеличение уровня при концентрации 2).

ффекте мы вводили в присутствие уабаина еток, следовательно, лением этого иона из АТФазы уабаином звало работу Ыа/Са-верность отличий от можно предположить,

—«----*

"ВЗТЙ"

НИ---»-

Контроль 10нМ 100нМ 1 МкМ ЮмкМ ЕСЛИ мкМ Е<5ТА1 шМ Е$ТА1 иМ

*

т\0

• Змадочсой помчены данные, достоверно оттмчанш^вея отммлроля

уьбаян 1 укМ

Рис, 2, Влияние уабаина на уровень внутриклеточного {измерено по флуоресценции Пио-З-АМ)

.*. -гЭН

альция

Идгибирование Иа/К-АТФазы уабаином вызывает и рост внутриклеточного уровня активньрс форм кислорода (АФК). Видно, что зд 30 мин инкубации уабаин вызывает рост уровня АФК концентрационно-зависимым способом, статистически достоверные отличия от контроля отмечены начиная с концентрации 100 нМ, то есть при концентрации, не вызывающей роста уровня ионов кальция внутри клетки. Максимальное увеличение уровня АФК наблюдалось при действии 10 мкМ уабаина и составляло 50% от контроля. В присутствии кальциевого хелатора ЭГТА изменения уровня АфК были пропорциональны исходным, таким образом, генерация свободных радикалов исследуемыми клетками в присутствии уабаина имеет Са-независимую природу. _

Контроль 10 НМ 100 НМ 1мкМ 10 мкМ EGTA1 EGTA1 EGTA1

МКМ мкМ + мкМ +

уабаин 1 уабаин

* - Зодедснкой помечены дянныо. достоверно отичающиаея at котроля мкМ 10 мкМ

Рис. 3: Влияние уабаина на уровень АФК в клетках SH-SY5Y (измерено по флуоресценции DCF-DA)

Согласно многочисленным данным литературы (Xie Z. & Askari А., 2002) АФК способны активировать в нейронах различные тирозинкиназы и стимулировать «нисходящие» сигнальные системы, включающие р42/44 МАРК и фосфолипазу С (PLCy). Активация PLCy приводит к увеличению уровня кальция, как из внутриклеточного пула, так и из внешнего пространства клетки (Kamata & Hirata, 1998; Mikoshiba, 1997). Можно заключить, что сигнальные механизмы Na/K-АТФазы на клетках нейробластомы SH-SY5Y реализуются с помощью как ионов кальция, так и АФК, причем их продукция может регулировать активность внутриклеточных белков, участвующих в сигнальных каскадах.

Активация уабаином внутриклеточных белков-посредников в клетках SH-SY5Y Активацию (фосфорилирование) белков, являющихся внутриклеточными передатчиками сигнала, мы измеряли методом вестерн-блотгинга, детектируя искомые белки по связыванию со специфическими антителами. Таким способом определялось общее количество нужных белков, а также отдельно их фосфорилированная фракция. Мы изучали вовлеченность белков-посредников в реализацию сигнальных механизмов с участием Ыа/К-АТФазы, инкубируя клетки с разными концентрациями уабаина в течение 30 мин, а также 6 ч и 24 ч. Через 30 мин инкубации активации внутриклеточных посредников не происходило, тогда как через 6 ч инкубации выявлялось уабаин-зависимое фосфорилирование ряда сигнальных белков!, свидетельствующее о сигнальных свойствах Na/K-АТФазы. Каждый эксперимент имел не менее 3 повторов, данные на графиках представлены в виде means ± SEM;* = р < 0,05.

Активация уабаином р42/44 МАРК (Erkl/2) протеинкиназы.

Активация р42/44 МАРК киназы ассоциируется с ранними стадиями передачи сигнала и является ключевым событием в пролиферации и дифференцировке клеток (Davis, 1993). Мы установили, что под действием уабаина за 6 ч и 24 ч инкубацни происходит активация р42/44 МАРК киназы, наиболее изученного внутриклеточного регулятора. Рис. 4-А демонстрирует детекцию на нитроцеллюлозной мембране суммарного белка (общая р42/44 МАРК), на Рис. 4-Б представлен сигнал фосфоршшро ванной фракции р42/44 МАРК.

А

Уабаин Контроль

Б Фосфо р42/44 МАРК

«-44 kDa

Г* " 42 KDa

Уабаин Контволь 10 нМ 100 нМ 1 ыкМ 10 мкМ %

350 эоо

2EQ ЭОО 150 1ПО 50 О

к*>гтт*1гь 10 j+Л 1 Mdví 10

Общая р42/44 МАРК

10 нМ 100 нМ 1 мкМ ЮмкМ

44 kDa 42 kDa

Рис.ш4. р42/44 MAP киназа в клетка* исйробласгомы SH-SY5V. А - Общая р42/44 МАРК, Б~ фосфо р42/44 МАРК, В - зависимость интенсивности сигналя фосфо p42/4<t МАРК на мембране от концентраций уабанна в процентах к контролю (для всех значений means ± S£M;*=p-=0,Q5, п = 3; время инкубации 6час).

На Рис. 4-В представлен сигнал фосфо- р42/44 МАРК в численном выражении, полученном при анализе фотографий мембраны с помощью компьютерной профаммы Total Lab. График отображает отношение числового значения интенсивности фосфо-р42/44 МАРК к значению общей р42/44 МАРК. При неизменности сигнала р42/44 МАРК для всех проб, сигнал ее фосфоршшроваякой фракции растет в соответствии с ростом концентрации уабаина в пробе. Достоверный рост этого сигнала наблюдается при концентрациях уабаина 100 нМ и выше, при этом максимально сигнал увеличился почти в 3,5 раза.

б

Ацщивация протеинкиназы В (РКВ, Akt киназы) под действием уабаина.

Через .6 часов инкубации с уабаином в клетках нейробластомы SH-SY5Yi обнаруживается активация протеинкиназы В, происходящая дозо-зависимым образом.' Известно, что РКВ играет важную роль в процессах внутриклеточной сигнализации,' активируя пути «выживаемости» и препятствуя апоптозной гибели клетки.' Обнаруженное нами увеличение сигнала фосфорилированной фракции РКВ было не1 столь значительно, как для р42/44 МАРК - максимальный рост активной РКВ составил1 20-30% от контрольного уровня, и выявлялся при более высоких концентрациях1 уабаина, чем в случае р42/44 МАРК {Рис. 5).

Рис.5: РКВ в клетках нейробластомы SII-SY5Y. А - общая РКВ, В - фосфо РКВ (Ser473), С -график зависимости интенсивности сигнала фосфо РКВ на мембране от концентрации уабаина.

На графике для всех значений п =3; means ± SEM; *=р<0,05. Время инкубации б час.

Активация уабаином про- и антиапоптозных белков.

На ряде биологических моделей показано, что ингибирование Na/K-АТФэзы вызывает апоптоз (Викторов и соавт., 1996). Мы решили оценить участие сигнальных механизмов Na/K-АТФазы в принятии клеткой решения о жизни или смерти на модели нейробластомы SH-SY5Y в присутствии разных концентраций уабаина. Принятие клеткой решения об апоптозной гибели основывается на смещении баланса про- и антиапоптозных сигнальных белков. В то время как участие р42/44 МАРК (Saunders et al, 2004; Kometiani et al, 2005) и РКВ (Zhou et al, 2001) в сигнальных механизмах Na/K-АТФазы описано на различных клеточных культурах, участие белков, связанных с развитием апоптоза ранее не исследовалось.

Белок Bad в нормальном состоянии клетки находится в неактивной фосфорилированной форме. При стимуляции апоптоза Bad дефосфорилируется и связывается на внешней митохондриальной мембране с белком Bcl-xL, тем самым ингибируя его антиапоптозное действие (снимая его блокирующее действие на выход цитохрома С из митохондрий) (Zha et al, 1996, 1997). После связывания Bad с митохонриальной мембраной цитохром С выходит в цитоплазму, связывается в апоптосомный комплекс с адаптерным белком Apaf-1, который и индуцирует активацию каспазного каскада. Таким образом, белки Вс1-2 и Bcl-xL относятся к антиапоптозным, а белки Bad, цитохром С и каспазы к проапоптозным.

Мы показали, что в клетках нейробластомы SH-SY5Y под действием уабаина происходит фосфорилирование белка Bad (Рис. 6), и этот эффект достоверно проявляется при концентрациях уабаина 100 нМ и выше. Максимально при 10 мкМ фосфорилирование Bad увеличивается в 2,5 раза.

7

Рис. 6: Зависимость интенсивности сигнала фосфо-Bad на мембране от к На графике для всех значений п = 3; means ± SEM; *=р<0,05. Время

знцентрации уабаина. инкубации б час.

общ

Параллельно с появлением фосфорклированного Bad мы уабаином снижение фосфорилированной фракции антиапоптоз] BcI-xL (Рис. 7), что обычно наблюдается при активировании arji гибели. Характерно, что эффект уабаина на эти белки прож концентрации, чем на белок Bad.

аружили вызванное ных белков Вс1-2 и юптозной клеточной ется при большей

Конгрогь ЮМ 100НМ 1 мкМ ЮмкМ

BcJ-xl_

°/с120

Кснгрхъ 10 100нМ 1мкМ ЮккМ

Рис. 7: Детектирование белков Bcl-2 и Bcl-xL методом вестерн-блоттинга при воздействии уабаина в клетках SH-SY5Y (для всех приведенных данных п = 3; means ± SEM; * - р<0,05; время инкубации 6 час).

Механизм защиты от клеточной смерти с участием белков Вс не понятен. Тем не менее было показано, что Bcl-xL предотвраща взаимодействуя с белком Вак и препятствуя формированию пор дриальной мембране и освобождению проапоптогенных факторЬ; (Willis et al, 2005; Ramirez-Ortega et al, 2006). По этой причине разным измерить уровень цитохрома С в цитозольной фракции исо.

Мы обнаружили, что снижение фосфорилированной фра] сопровождается появлением цитохрома С в цитозоле {Рис. 8), образования пор во внешней митохондриальной мембране свобо, Вах. Данные литературы показывают, что различные КТС дигоксин) могут вызывать высвобождение цитохрома сив (Ramirez-Ortega et al, 2006).

юс

-2 и Вс1-хЬ до конца гг развитие апоптоза, ро внешней митохон-в типа цитохрома С мы сочли целесооб-ледуемых клеток. к!ции Вс1-2 и Вс1-хЬ вероятно, вследствие |дными белками Вак и (уабаин, строфантин, гльтуре клеток НеЬа

о — - I 1 ■ -■-с==а-----■-

Контроль to ММ 100 нМ 1 ыкМ 10 мкМ

FubJSi Детектирование цитохрома С методом вестерн-блоттищ а и клетках SH-SY5Y, График зависимости интенснвпости сигнала от кони уабаина после 6 час инкубации (п = 3; means * SEM; * = р<0,05).

Было показано, что при действии уабаина происходит активация каспазы 3, главного исполнителя программы апоптоза {Рис 9). Известно, что каспазы активируются каскадным способом и поэтому оценка активности какой-либо из них, например, каспазььЗ или каспазы-9, может служить доказательством того, что клетка вступила в апоптоз (Earnshaw et al, 1999).

J4s,ifXüi> 10 nM IGOHM 1 РЛФЛ IQMKM

уаба»

Рис 9: Зависимость интенсивности сигнала каспазы-3 от концентрации yaGftiniu и клетках SH-SY5Y.

Кроме этого мы показали увеличение ф о сформирован ной фракции белка р53 в положении Ser! 5 в ответ на 6-часовую аппликацию уабаина (Рис. 10).

I

от концентрации уабаина в клетках SH-SY5Y, 9

1П"о:

Белок р53 в активном состоянии индицирует каскад программ смерти (Gottlieb & Oren, 1998; el-Deify, 1998) и фосфорилирован Serl5 играет ключевую роль в вызываемой этим белком апоптозн 2005). Одним из следствий активации р53 является изм регулируемых им генов, таких как Вах, Вс1-2 и др., контроле г p21w , GADD45 (Growth Arrest and DNA Damage-induced), J: приводит к остановке клеточного цикла. В результате клеп произошли или только могут произойти генетические изменен: результате индукции апоптоза, либо останавливается в G1- или G клеточного цикла.

Мы видим, что после 6 часов инкубации с уабаином в клетках SY5Y одновременно активируется и проапоптозный, и антиапо] часто выбор клеткой пути выживания или смерти есть итог с\ альтернативных процессов, а во внутриклеточных механизмах смещении баланса сигнальных путей, ведущих к жизни или к смер-сторону. Поэтому оказывается, что один и тот же стимул противоположные механизмы смерти и жизнеустойчивости, и клет сигналы которого будут преобладать.

Анализируя динамику появления активных белков при раз уабаина, мы видим, что антиапоптозные белки, такие как р42/44 активными уже при 100 нМ уабаина, тогда как проапоптозные каспаза 3, Р53 становятся активными лишь при 1 мкМ, т.е. при к по-видимому, включаются резистентные изоформы Na/K-AT< Поэтому можно предполагать, что чувствительные изофор способствуют активации антиапоптозных белков, тогда как концентрациях, включаются резистентные изоформы, и равнов' сторону апоптозного каскада, включаются каспазы, р53, цитохром i Г

ируемой клеточной toe р53 в положении эй гибели (Lai et al, гнение экспрессии >ующих апоптоз, и кспрессия которых ;а, в которой уже -Ыя, либо гибнет в , а иногда в S-фазе

нейробластомы БН-зный пути. Очень ещения равновесия это проявляется в 1ТИ в ту или другую ожет активировать ш выберет тот путь,

Таблица 1: Роль чувствительных и резистентных изоформ Na/K-A внутриклеточных сигнальных белков._

Название бежа

МАРК РКВ Bad Bcl-2 Bcl-xL цитохром С каспаза 3 Р53

а2 и аЗ изоформы (чувствительные)

100 нМ уабаина +

ИЗ 01

al (рези! 1 mkPV

Какой путь доминирует? Погибают ли клетки SH-SY5Y уабаином? Для выяснения этого вопроса мы измеряли уровень (LDH) в остаточной культуральной среде через 6 часов инкубацик различными концентрациями уабаина. Результаты измерения не вм фермента в среду, что позволяет сделать заключение, что через уабаином клетки SH-SY5Y не погибают. Однако, как мы видим, к активируется ряд проапоптозных белков, в том числе каспазы.

ю

nix концентрациях 'К, Bad становятся белки Bcl-2, Bcl-xL, энцентрации, когда, Фазы (Таблица 1). мы Иа/К-АТФазы более высоких есие смещается в и клетка погибает.

ми»:

при

ГФазы в активации

формы :сгентныс)

уабаина +

+ + + + + + +

тосле инкубации с Лактатдегидрогеназы клеток 8Н-8У5У с .ювили выхода этого > часов инкубации с этому моменту уже

При более длительной инкубации клеток 8Н-БУ5У с уабаином в культуре наблюдается снижение количества клеток. Это показано в эксперименте, где чашки Петри с клетками нейробластомы БН-8У5У мы инкубировали с низкой (10 нМ) и высокой (1 мкМ) концентрациями уабаина в течение 3 суток - за это время количество клеток снизилось на 75% (Рис. 11).

Рис 11: Временная зависимость изменения числа клеток в популяции при действии уабаина

На Рис. II видно, что в среде с высоким содержанием уабаина количество клеток снижалось гораздо значительнее, чем в среде с низкой концентрацией уабаина. Через 3 суток инкубации при 10 нМ уабаина количество клеток снизилось на 20%, тогда как при высокой - на 75%. В этих опытах мы не исследовали вопрос о том, каким образом погибают клетки под влиянием уабаина - лизируются, агрегируют или умирают другим способам (например, вследствие апоптоза). Тем не менее, учитывая литературные данные, свидетельствующие, что уабаин может вызывать апоптозную гибель клеток (Викторов с соавт., 1996), мы предполагаем, что при длительной инкубации с уабаином в клетках нейробластомы 8Н-8У5У проапоптозные белки начинают доминировать и они погибают по пути апоптоза.

На другой клеточной модели — линии карциномы простаты РС-3, с помощью флуоресцентных красителей пропидия иодида и аннексина V, мы выясняли, какой тип клеточной смерти преобладает при действии уабаина. Клетки РС-3 одновременно прокрашивались аннексином V (он реагирует на фосфатидилсерин, молекулы которого появляются на внешней стороне мембраны при апоптозе) и иодидом пропидия, который, как отмечено выше, является маркером некротических клеток. На проточном цитометре клетки отображались в координатах БЬ Аппехт V уб БЬ Р1 (где РЬ -флуоресценция) (Рис. 12).

Клетки РС-3 инкубировали с различными концентрациями уабаина в течение 2 суток, после чего проводили их прокрашивание флуоресцентными зондами. На Рис 12 видно, что при низких концентрациях уабаина - до 1 мкМ, клеточной смерти не наблюдается, а при 1 мкМ и выше выявляется как апоптоз, так и некроз клеток. Тот факт, что низкие концентрации уабаина не вызывают клеточной гибели, а при этих концентрациях ингибитора уже подавляются чувствительные изоформы Ыа/К-АТФазы (и не задействованы резистентные изоформы) позволяет предполагать, что в клетках РС-3 причиной клеточной гибели является ингибирование уабаин-резистентной изоформы, которое наблюдается при действии высоких концентраций уабаина (свыше 1 мкМ).

И

Уабаин

Контроль 1 нМ 10 нМ 100 нМ 1 мкМ

Рис. 12: Определение типа клеточной смерти при действии различных концентраций уабаина в

течение 4S часов в клетка* РС-3 методом проточной цнтометрнй. fî верхних квадратах изображены популяции клеток н координатах FS-SS, в нижних квадратах- в координатах PI-

Aiinexin Yr.

Уабаин препятствует дифференцировке клеток иейробластомы SH-SYSY под воздействием ретиноевой кислоты (PK),

Ретиноевая кислота используется как фактор дифференцировки клеток иейробластомы SH-SY5Y (Singh & Kaur, 1995; Pizzi et al, 2002) наравне с такими агентами как нейротрофические факторы (Kaplan et al, 1993), форболовые эфиры (Pahimati et al, 1995). При этом клетки SH-SY5Y дифференцируются в клетки, которые биохимически, ультраструктурно и электрофизиологически близки к нормальным нейронам (Abcmayor & Sidell, 1989).

Мы решили выяснить, влияет ли ингибирование Na/K-АТФазы уабаином на формирование нейрональных отростков в клетках иейробластомы SH-SY5Y, формирующихся в присутствии ретиноевой кислоты (Рис. 13).

Рис. 13; Влияние уабаина на вейрнтогенез, вызванный действием ретиноевой кислоты. Диаграмма А отражает коэффициент, равный величине нервных отростков, превышаю mux SO м км, полелей пых на число измеряемых клеток (о = 50-65; ±SF.M; *=р<(1,01); Б-Г- фотографии Контроля (Г>), инкубированных с PK (В) и инкубированных с 1'К и 1 мкМуабаина (Г) клеток иейробластомыSH-SY5Y. Длина белого прямоугольника соответствует 50 мки.

12

Действительно, по нашим данным, подтверждающим данные литературы, инкубация с 10 мкМ ретиноевой кислоты приводит к формированию отростков, похожих на аксоны нервных клеток. Присутствие 1 мкМ уабаина блокирует этот эффект, и формирование нейритов не происходит. Исходя из этого можно предполагать, что сигнальные механизмы Ыа/К-АТФазы связаны с процессами дифференцировки клеток нейробластомы 8Н-3\'5У.

2. СИГНАЛЬНЫЕ МЕХАНИЗМЫ С УЧАСТИЕМ NMDA-РЕЦЕПТОРОВ В КЛЕТКАХ НЕЙРОБЛАСТОМЫ ЧЕЛОВЕКА SH-SY5Y

Структурно NMDA-рецепторы представляют собой лиганд-связывающий кальциевый канал, состоящий из четырех или пяти субъединиц, которые формируют гетеромерные комплексы (McBain & Mayer, 1994; Cull-Candy et al, 2001), Субъединица NMDA-рецептора NR1 представлена наиболее широко и кооперируется с одной или несколькими субъединицами второго семейства, содержащего NR2A, NR2B, NR2C и NR2D. Функционально активные NMDA-рецепторы требуют наличия и NR1, и NR2 субъединиц, так как NRI субъединица содержит глииин-связывагощий домен, a NR2 субъединица содержит глутамат-связывающий сайт (Laube et al, 1997; Dingledine et a!, 1999). В некоторых случаях функционированию рецептора помогают еще дополнительные субъединицы, NR3A и NR3B (Das et al, 1998; Nishi et al, 2001).

Экспрессия NMDA-рецепторов в клетках нейробластомы SH-SY5Y, Данные об экспрессии субъединиц NMDA-рецепторов представлены на Рис 14. По нашим данным, в клетках присутствует только NR1 субъединица NMDA-рецепторов. И даже в присутствии ретиноевой кислоты, которую считают фактором дифференцировки (под ее воздействием у клеток нейробластомы появляются отростки, и они приобретают нейрональный фенотип) клеточных культур, обнаруживается только NR1 субъединица.

Контроль Ретинмвая кислота

Jjki™«»Щвдн! Йойай 5 дней)

(N -1 - I

i ll S

1000 ■ 500 -

100 ■

GAPDH bp NR2B 222 bp NR1 333 bp NR2C 204bf) NR2A 224 tp NR2D 224 lip

is N N ct oi QL a:

^ г г ^

u

I г

lUll fciii

И» »»

Рис. 14: Обнаружение субъсднпнц NN10А рецепторов в клетках ненройласгомы 5Н-8¥5У в контроле и при инкубации с ретиноевой кислотой (10 М0Л, 5.1 иен).

Вероятно, что ЫМОА-рсцспторы в этих клетках структурно не достроены и могут быть нефункциональны (Р\хх\ й а1, 2002). Эта гипотеза подтверждается нашими данными, полученными с помошью проточной цитометрии, согласно которым воздействие ИМОА не приводит к росту уровня ионов кальция и активных форм кислорода (Рис. 15), как это многократно показано на нормальных нейронах.

13

Уров***. АФК гри действии NMDA

NM>4 M^ecrf WE» зоои«м юэомкМ юмА4 .

Уроовнь СПри действии NVCA

- -й

. мял

ТООмьМ

1СООЫКМ

1'ис. 15: Уровень внутриклеточвого кальция и активных форм кислорода иод действием №ША

о клетках нейробластомы ЭН-ЗУЗУ,

Мы отмечаем даже дозо-зависимое снижение уровня АФК от концентрации ММОА, что нельзя объяснить, исходя из данных о функционировании интактных N М О А-р еце пто р о в. Нельзя исключить, что в этих клетках существуют иные, кроме N№ГО А -рецепторов, мишени для №ГОА, однако факты, свидетельствующие об этой возможности, отсутствуют.

Активация р42/44 МАРК (ЕНК1/2) и РКВ под действием МША.

Не смотря на отсутствие типичного ответа клеток на МУЮА (в наших опытах не наблюдается ни кальциевого сигнала, ни накопления АФК), мы обнаружили, что действие №ГОА на клетках нейробластомы 5Н-5У5У приводит к активации р42/44 МАРК и РКВ киназ (Рис 16 и 17).

Активации р 42/44 МАРК,, РКВ и других киназ л од воздействием №ЮА описана в литературе для различных объектов - многочисленные данные получены на изолированных нейронах (¿Ьи еС а!, 2002; 51ери1ак е! а1, 2005). Это позволяет нам предполагать, что активация р42/44 МАРК и РКВ в клетках нейробластомы $Н-8У5У, вызванная ЫМОА реализуется все же через ЫМОА-рецепторы - через №11 субъединицу. Мы предполагаем, что именно ЫК.1 субъединица обеспечивает сигнальные свойства ЫМОА-рецепгоров и активацию внутриклеточных киназ. Таким образом, даже в нефункциональном состоянии, ЫМОА-рецепторы могут воздействовать па внутриклеточные сигнальные системы,

тааь-МАРК <ЕгК1/2)

ЫМОА 250 мкМ

Коитро™. 15 мин Зи МИН 1ЦИ 2 часа

РПОЭрПО-МАРК (ЕгШ/2) Контроль 15 мин 30 wriM 1 час 2 часа 3 часа

L.SBIr. HR' i'jin

NM OA 2S0 «кМ

x ЭйЖКЕ

— 44 KDft

— 42 kOa

Hi«

Puc. 16: Активация p42/44 MAP кнназы под воздействием NMDA u клетках SI1-SY5Y.

14

Total-Akt

Контроль 15 шин ЗОмин 1 чае 2часа 3 часа 6 чассе MM DA 2-50 МКМ

60 kDa

Рис, 17: Активация протеи нкнназы В (РКВ) пол воздействием NMDA в клетках S1I-SY5V.

3. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ИОНОТРОПНЫХ И МЕТАБОТРОПНЫХ ГЛУТАМАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ В НЕЙРОНАХ МЫШЕЙ ЛИНИИ SAMP

Ионотропные глутаматные рецепторы связаны с ионными каналами и определяют электрическую активность нейронов, а метаботропные глутаматные рецепторы связаны с различными G-белками, и их активация приводит к модификации клеточного метаболизма посредством включения внутриклеточных сигнальных каскадов [Pin el al, 2002). Поскольку метаботропные рецепторы способны менять активность G-белков, а через них регулировать реакции с участием внутриклеточных протеинкиназ, в последнее время получила широкое распространение гипотеза о способности реакционных каскадов, запускаемых метаботропными рецепторами, регулировать активность ионотропных рецепторов (Ашмарин с соавт, 1996), Особенный интерес представляют взаимодействия между различными метаботропными рецепторами и иокотропными рецепторами NMDA-класса, поскольку последние вовлекаются в развитие окислительного стресса и связанных с ним патологий головного мозга.

Мы решили оценить развитие окислительного стресса, вызванного NMDA и влияние на него метаботропных рецепторов различных групп в глутаматергических нейронах мышей линии SAMP, Линия мышей SAMP характеризуется ускоренным накоплением старческих признаков и укороченным временем жизни вследствие постоянно поддерживаемого в их тканях состояния окислительного стресса (Takeda ct al, 1994), таким образом, по нашим предположениям, эти животные должны иметь повышенную чувствительность к окислительному стрессу, вызываемому NMDA и па них более четко можно будет оценить действие метаботропных рецепторов.

Phospho-Akt

NMDA 250 мкМ 60 Ша

Контроль

NMDA 100 NMDA 250 NMDA 500 MK-B01 10 мкМ mkM mkM mkM

Рис. IS: Уровень АФК при действии NMDA и его антаго 1иста МК-801 на изолированные нейроны мышей SAMP

Мы показали, что для нейронов мозжечка мышей зависимое возрастание уровня АФК, вызванное инкубацией с как мы и предполагали, у этих животных хорошо выражены из-за их повышенной чувствительности к активным формам ки

На Рис. 19-А представлено сравнение действия исследует концентрациях, считающихся оптимальными для глутаматер: (ВоМугеу е! а1,2003).

220 200 180 2 160 • §■ 140 ■

I 120-

к

^ 100 — 80 — 60 ■ 40 • 20 0

----Ш

Контроль L-AP4 10 мкМ 3-HFG250mkM

MPI характерно дозо NMDA. Действительно эффекты NMDA, видим огорода.

ых лигандов, взятых 1]ических нейронов кры

Рис. 19: А - уровень АФК при активации агонистов I и III групп мет 1ботропных глутаматных рецепторов З-НГС и Ь-АР4, Б - действие З-НРС и Ь-АР4 на фойе о кислительиого стресса,

вызванного №МОА (250 мкМ).

Видно, что не только №уГОА, но и Ь-АР4 вызьшает повьш]и радикалов в клетках, измеряемого по флуоресценции ОС выражен слабее, чем таковой ММОА. В то же время, 3-НРЙ уровень АФК. Следовательно, в нейронах мозжечка 8АМР1 метаботропные рецепторы включены в регуляцию уровня могут как увеличивать, так и уменьшать уровень АФК в зав: путей, которые активируются при этом в нейроне.

ение уровня свободнь хотя эффект Ь-АР снижал стационарны" как ионотропные, так свободных радикалов 1симости от сигнальнь

С целью проверки взаимодействия между рецепторами в нейрональных клетках мозжечка SAMP1, мы провели измерение АФК при одновременной активации рецепторов разных классов (Рис. 19-Б). Оказалось, что активация mGluR III L-AP4 не влияет на уровень АФК, продуцируемый в присутствии NMDA, но активация mGluR I 3-HPG снижает эффект NMDA, направленный на рост свободных радикалов. Возможно, что отсутствие синергизма между mGluR Ш и ионотропными рецепторами, обнаруженного для нейронов крыс линии Wistar (Boldyrev А., 2003) отражает нарушения глутаматергической регуляции и связано с исходно более высокой продукцией АФК в нейронах SAMP1. В то же время, ограничение продукции АФК при активации mGluR I воспроизводится в исследуемых нейронах. Таким образом, этот принцип ограничения продукции АФК, по-видимому, является общим при регуляции окислительного стресса в глутаматергической системе, который присутствует и у мышей SAMP.

Аналогичные механизмы могут реализоваться и при развитии нейродегенераций, в основе которых лежит стойкое повышение внутриклеточного уровня АФК. В этом случае эффективным способом восстановления нормального уровня свободных радикалов может быть применение фармакологических препаратов, вызывающих избирательную активацию mGluR I.

Выводы

1) В клетках нейробластомы SH-SY5Y присутствуют как уабаин-резистентная (al), так и уабаин чувствительные (a2+a3) изоформы Na/K-АТФазы; как те, так и другие включаются в реализацию внутриклеточных сигналов.

2) Действие уабаина на Na/K-АТФэзу нейробластомы приводит к увеличению уровня внутриклеточного кальция и активных форм кислорода, причем эти процессы происходят независимо друг от друга.

3) При ингибировании Иа/К-АТФазы уабаином наблюдается воздействие как на проапоптозные, так и на антиапоптозные белки. Происходит фосфорилирование белка Bad (антиапоптозное действие). В то же время обнаружено снижение фосфорилированных Вс1-2 и Bcl-xL, увеличение фосфорилирования цитохрома С, каспазы 3 и белка Р53 (проапоптозное действие). Проапоптозные белки активируются при высоких концентрациях уабаина, когда в работу включаются уабаин-резистентные изоформы Na/K-АТФазы.

4) Уабаин-чувствительные изоформы Na/K-АТФэзы участвуют в активации р42/44 МАРК и РКВ в клетках нейробластомы SH-SY5Y.

5) Действие уабаина приводит к апоптозной и некротической гибели клеток линии РС-3.

6) В клетках нейробластомы SH-SY5Y экспрессируется NR1 субъединица NMDA-рецепторов, связывание NMDA с которой приводит к активации белков р42/44 МАРК и РКВ, что говорит об общности сигнальных путей, активируемых NMDA-рецепторами и Ыа/К-АТФазой.

7) Изолированные нейроны быстростареющих мышей SAMP демонстрируют концентрационно-зависимое увеличение уровня АФК в ответ на действие NMDA, причем этот эффект снимается в присутствии МК-801 и регулируется агонистами глутаматных метаботропных рецепторов.

Публикации по теме диссертации

1) Kulikov A.V., Stvolinsky S.L., Boldyrev А.А. 3-Nitropropionic acid neurotoxici enhances oxidative stress in SAMP1 animals (Senescence Accelerated Mice Prone, strain 1 // Ann. Rep. SAM Studies - 2004 - 7 (17-18) p.103-104.

2) Kulikov A. V. Study of the 3-nitropropionic acid (3-NPA) neurotoxicity on SAMP1 animals (Senescence Accelerated Mice Prone, strain 1). // in Materials of 10th Int. Symp

:rmany), p.32. примнения карнозина ей Гентингтона н

Pharmacol. Cerebral Ischemia, 25,h-28th of July 2004 in Marburg (G 3) Куликов A.B., Беляев M.C. Возможности терапевтического мексидола в условиях З-НПК индуцированной хор быстростареющих мышах линии SAMP1 // сборник «Актуальные проблемы экологии и

природопользования» Москва, Изд. РУДН, Вып. 6. ч. 1, с. 22-25

2004.

регулируют уровень шей SAMP // Доклады

4) Kulikov А. V. Analysis of the 3-nitropropionic acid (3-NPA) induced neurotoxicity in the brain of rats and Senescence Accelerated Mice Prone (SAMP), h J. Neurochem. Vol. 94, suppl. 2, p.226 (P408). 2005.

5) Куликов A.B., Болдырев А.А. Глутаматные рецепторь: активных форм кислорода в нейронах быстростареющих мыс Академии Наук, том 407, №6, с. 832-834.2006.

6) Федорова Т.Н., Маклеуова М.Г., Куликов А.В., Степанова М.С., Болдырев А.А. Карнозин защищает от окислительного стресса, вызванного пр< :натальной гипоксией II Доклады Академии Наук, том 408, №16, с. 1-4.2006.

7) Kulikov A., Eva A., Kirch U., Boldyrev A., Scheiner-Bobis С. Ouabain acting on the Na+/K+-ATPase induces signal cascades and apoptosis in neurobl istoma SH-SY5Y cells // in Materials of 5th Forum of European Neuroscience, 8th-12th of July 2006 in Vienna (Austria).

8) Болдырев А.А, Булыгина E P., Казей В.И., Куликов A.B., Макро А.В., Соколова Н.А., Степанова М.С. Молекулярные механизмы экзайтотоксичности глутамагга // в материалах конференции «Нейроспецифические метаболиты и энзимологические основы деятельности центральной нервной системы» Пета 25-27 сентября 2006 г. С. 38-40.

Куликов Андрей Валентинович (Российская Федерация) «Роль мембранных рецепторов в сигнальных механизмах в клетках нейрональной природы» В работе исследованы сигнальные механизмы с участием Na/K-АТФазы и глутаматных рецепторов NMDA-класса на клеточной культуре нейробластомы SH-SY5Y и взаимодействие NMDA-рецепторов с метаботропными глутаматными рецепторами различных групп на изолированных нейронах быстростареющих мышей SAMP.

Показано, что кратковременное ингибирование Na/K-АТФазы уабаином ведет к росту ионизированного кальция и уровня активных форм кислорода. При более длительной инкубации выявлялось фосфорилирование сигнальных белков р42/44 МАРК и РКВ, а также белка Bad, что свидетельствует о включении антаапоптозпых путей. Одновременно обнаруживалась активация и ряда проапоптозных белков - Bcl-2, Bcl-xL, каспазы 3, цитохрома С, р53. Таким образом, при стимуляции SH-SY5Y клеток уабаином активировались как проапоптозные, так и антиапоптозные факторы. На этом этапе смертности клеток ие было обнаружено. Однако апоптозная гибель клеток выявлялась позднее—через 2-4 суток инкубации, что показано также на культуре РС-3.

В клетках нейробластомы SH-SY5Y обнаружена только NR1 субъединица NMDA-реценгоров, и не выявлено роста уровня ионов кальция и АФК в ответ на аппликацию NMDA из чего делается вывод, что в этих клетках NMDA-рецепторы не функционируют как ионные каналы Однако под воздействием NMDA наблюдается активация р42/44 МАРК и РКВ кип аз, следовательно, NR1 субьединица NMDA-рецепторов вовлекается в проведение сигнальных стимулов

На нейронах быстростареющих мышей SAMP, характеризующихся повышенной чувствительностью к окислительному стрессу, показан дозо-зависимый рост АФК при воздействии NMDA, который блокируется антагонистом NMDA-рецепторов МК-801. Агонист III группы мстаботропных глутаматных рецепторов L-AP4 способствует развитию окислительного стресса и усиливает токсическое действие NMDA, в то время как агонист I группы метаботропных рецепторов 3-HPG защищает нейроны от окислительного стресса, вызванного NMDA.

Kulikov Andrey (Russian Federation) The role of membrane-bound receptors in signal transduction mechanisms in the cells of neuronal origin We have shown that Na/K-ATPase, a membrane-bound enzyme, which provides the asymmetnc distribution of Na+ and K+ ions across cellular membrane, involves in specific signaling mechanisms on SH-SY5Y neuroblastoma cells being secondary to its ion pumping function. Incubation of SH-SY5Y neuroblastoma cells with ouabain results into increase in cytosolic [Ca2+] and ROS levels, which are independent of each other.

It was shown that short-term inhibition of Na/K-ATPase leads to increase of [CaJ+] and ROS levels Incubation of the cells with ouabain, in a concentration-dependent manner induces a number of anti-apoptotic signalling cascades including p42/44 МАРК, РКВ activation (phosphorylation) and phosphorylation of pro-apoptotic protein Bad, that means induction of anti-apoptotic pathways. Phosphorylation of Bad has not previously been noted in the literature. In parallel with induction of the anti-apoptotic pathways, we've detected an ouabain-induced activation of proapoptotic proteins - down regulation of the proteins Bcl-2 and Bcl-xL, appearancc of cytochrome С in the cytosol, activation caspase-3 and P53. Thus, inhibition of Na/K-ATPase by ouabain results in induction both anti- and proapoptotic pathways. We have also found out a decline in cell number (cell death) 4 days after a 3-h pulse of ouabain treatment and both apoptotic and necrotic cell death of PC-3 cells after 48 hours incubation with ouabain.

Using PCR method we've found NR1 submit as the only representative of NMDA-receptor complex in neuroblastoma SH-SY5Y cells. We have also shown no increase in cytosolic [Ca2+] and ROS levels, and come to conclusion that NMDA-receptors in these cells are not functioning as ionic channels As a result of NMDA treatment, we've disclosed p42/44 МАРК and РКВ activation in neuroblastoma SH-SY5Y cells and supposed that even non functional NMDA-receptois can provide signalling mechanisms via NR1 subunit.

We've observed a concentration-dependent ROS activation after NMDA treatment of isolated neurons from ccerebellum of Senescence Accelerated Mice (SAMP), which are more sensitive to oxidative stress than ordinary mice. L-AP4, a group III metabotropic glutamate receptor's agonist, has elevated NMDA-induced excitotoxicity, whereas 3-HPG, a group I metabotropic glutamate receptor's agonist, has decreased this parameter and protected neurons from oxidative stress

Принято к исполнению 07/02/2007 Исполнено 08/02/2007

Заказ X» 105 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495)975-78-56 \vww.autoreferat ш

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Куликов, Андрей Валентинович

Список сокращений и сайтов производителей оборудования и реактивов.

Введение.

Цель и задачи работы, научная и практическая новизна.1.

Часть I Обзор литературы.

Глава 1 Типы клеточной смерти. Внутриклеточные посредники регуляции жизнеспособности клеток.

1.1) Некроз и апоптоз.

1.2) Регуляция апоптоза. Семейство белков Вс1-2.

1.3) Роль белка Р53 при апоптозе.

1.4) Сигнальная функция внутриклеточных ионов Саг*.

1.5) Сигнальная функция активных форм кислорода, окислительный стресс в мозге.

1.6) Серин-треониновые протеинкиназы (MAPKs, РКА, РКВ, РКС).).

Глава 2 Ыа/К-АТФаза и глутаматные рецепторы

2.1) Ыа/К-АТФаза как ионный насос и участник сигнальных каскадов.

2.2) Рецепторы глутаматергической системы.

2.3) Функциональная взаимосвязь между глутаматными рецепторами и Ыа/К-АТФазой.

Глава 3 Биологические модели, использованные в работе

3.1) Клеточная культура нейробластомы человека SH-SY5y.

3.2) Линия мышей с ускоренным старением SAMP.

Часть II Материалы и методы.

1) Культура клеток нейробластомы человека 5Н-бУ5У.1.

2) Получение суспензии выделенных нейронов быстростареющих мышей SAMP.

3) Определение нуклеотидных последовательностей методом полимеразной цепной реакции (ПЦР, PCR).

4) Приготовление клеточных лизатов.

5) Определение белка в клеточных лизатах.

6) Разделение белков электрофорезом и Вестерн блоттинг.

7) Определение уровня внутриклеточного кальция, активных форм кислорода и типа клеточной смерти методом проточной цитометрии.

8) Статистическая обработка данных.

Часть III Результаты.

Глава 1 Участие Ыа/К-АТФазы в сигнальных механизмах клеток нейробластомы человека SH-SY5Y.

1) Определение изосрормного состава No/K-АТФазы в клетках SH-SY5Y.

2) Уровень внутриклеточного кальция и АФК в клетках нейробластомы SH-SY5Y при действии уабаина.

3) Активация уабаином внутриклеточных белков-посредников в клетках нейробластомы SH-SY5Y.

3.1) Активация уабаином р42/44 МАРК (Erkl/2) протеинкиназы.

3.2) Активация протеинкиназы В (РКВ, Akt киназа) под действием уабаина.

3.3) Активация уабаином про- и антиапоптозных белков.s.

3.4) Определение типа клеточной смерти при действии уабаина на клеточной культуре РС-3.

3.5) Уабаин препятствует дисрсреренцировке клеток нейробластомы SH-SY5Y под воздействием ретиноевой кислоты (РК).

Глава 2 Сигнальные механизмы с участием NMDA-рецепторов в клетках нейробластомы человека SH-5Y5Y.

1) Определение субъединиц NMDA-рецепторов в клетках SH-SY5Y.

2) Действие NMDA на уровень внутриклеточного кальция и АФК.

3) Активация протеинкиназ р42/44 МАРК и РКВ при действии NMDA.

Глава 3 Взаимодействие ионотропных и метаботропных глутаматных рецепторов в нейронах мышей линии SAMP.

Часть IV Обсуждение.

1) Участие No/K-АТФазы в сигнальных механизмах клеток 6Н-5У5У.

2) Сигнальные механизмы с участием NMDA-рецепторов в клетках 5Н-5У5У.

3) Взаимодействие ионотропных и метаботропных глутаматных рецепторов в нейронах мышей линии SAMP.

Часть V Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль мембранных рецепторов в сигнальных механизмах в клетках нейрональной природы"

В клеточной биологии в настоящее время отмечается активный интерес к изучению молекулярных механизмов передачи информации из внешней среды во внутриклеточное пространство, регулирующих клеточный метаболизм и жизнеспособность. Весь комплекс молекулярных событий, происходящих в клетке после связывания сигнальной молекулы со своим рецептором, составляет предмет изучения биохимической науки, посвященной клеточной сигнализации (cell signaling). Особенно активно эта область стала развиваться с 50-х годов XX века, когда произошло открытие Сазерлендом циклического моносроссрата (сАМР), отмеченное Нобелевской премией. Эта работа привела впоследствии к созданию теории вторичных мессенджеров (посредников) и представлению о сигнальных каскадах реакций. Изучение клеточной сигнализации лежит в основе современной эндокринологии, иммунологии, нейрохимии и других наук, и имеет целью не только разобраться в глубинных процессах функциональных клеточных изменений, но и научиться управлять этими процессами.

Сигнальные молекулы могут иметь разное строение и происхождение, однако все они работают по единому принципу, связываясь со своим специфическим рецептором по аналогии «ключа» и «замка». Поэтому они могут действовать только на те клетки, и только в том месте, где есть их специфический рецептор. Рецепторы в большинстве случаев представляют собой интегральные мембранные белки, поли пептидная цепь которых пронизывает толщу мембраны, поэтому сигнальные молекулы, включая большинство гормонов (за исключением стероидных и тиреоидных, действующих через ядерные рецепторы), как правило, не проникают внутрь клетки, а специфически взаимодействуют с рецепторами, локализованными во внешней клеточной мембране.

В неврологии с пониманием механизмов внутриклеточной сигнализации связывают надежды на лечение таких заболеваний как болезнь Альцгеймера, Паркинсона, хорея Гентингтона и многих других. Изучение сигнальных механизмов в мозге должно основываться на знании специфических функций и 5 особенностей метаболизма нейрональной клетки. Как известно, основной функциональной особенностью нейрональных клеток является способность к электрическому возбуждению, а биохимически нервные клетки и мозг в целом отличаются, например, высокой интенсивностью окислительных процессов и большим потреблением энергии.

В основе электрического возбуждения нервной клетки лежит существование электрохимического градиента, вызванного неравномерным распределением ионов Na\ К+ и Саг* по обе стороны клеточной мембраны. Деполяризация мембраны приводит к открыванию ионных каналов, и ионы Na+ устремляются внутрь клетки, а ионы К+ - устремляются наружу (Шмидт Т., 1996). Очевидно, что способность нервной клетки к возбуждению ограничивалась бы моментом, когда ионные концентрации внутри и снаружи клетки выровняются, если бы не существовало механизма, восстанавливающего ионныи градиент и позволяющий нервной клетке функционировать длительное время. Такой механизм оказался представлен мембранным ферментом Ыа/К-АТФазой, открытый в 1957 году J. Skou (Skou 1957). Работа Na/K-АТФазы заключается в одновременном переносе ионов Na+ изнутри клетки наружу и ионов К+ снаружи во внутриклеточное пространство с затратой энергии АТФ - поэтому No/K-АТФазу называют также ионным насосом. Однако впоследствии выяснилось, что Ыа/К-АТФаза способна не только перекачивать ионы, но и передавать информационные сигналы внутрь клетки, являясь рецептором для группы кардиотонических стероидов (КТС) типа уабаина (Scheiner-Bobis 6. & Schoner W., 2001; Xie Z. & Askari A., 2002). Существует 2 изоформы фермента, различающиеся по чувствительности к КТС -чувствительные и резистентные к ним.

КТС синтезируются в организме в небольших количествах, действуя на высокочувствительные к ним изоформы Ыа/К-АТФазы (а2 и а3), они запускают сигнальные механизмы без изменения ионного гомеостаза клетки (Scheiner-Bobis, Schoner, 2002). Эти сигнальные механизмы реализуются в активации транскрипционных факторов NF-кВ и АР-1, экспрессии генов и синтезе белка

Peng, 1996; Huang, 1997). Сигнальные свойства Ыа/К-АТФазы открыты недавно и к настоящему моменту изучены далеко не полностью. '

Электрохимический градиент, создаваемый Ыа/К-АТФазой, используется системами нейромедиаторов, в частности, глутаматергической системой, для инициации процессов возбуждения или торможения. Глутамат и связанная с ним система глутаматных рецепторов инициируют возбуждающие стимулы, ответственные за распознавание объектов, анализ и запоминание информации, обучение и выработку стратегии поведения. В глутаматергических синапсах обнаруживается более десяти различных рецепторов с разными свойствами и различным сродством к глутамату. Предполагается, что дифференцированная I активация рецепторов при высвобождении глутамата лежит в основе синоптической пластичности, играющих важную роль как в процессах обучения, так и в развитии двигательных нарушений при некоторых патологиях, сопровождающихся развитием окислительного стресса (например, болезнь Паркинсона или хорея Гентингтона).

Глутаматные рецепторы по современной классификации делятся на 2 подтипа: ионотропные (iGluR) и метаботропные (mGluR). Первые из них связаны с ионными каналами, активация которых обеспечивает электрическую активность нейронов, а вторые передают информацию на внутриклеточные сигйальные системы, что приводит к модификации клеточного метаболизма.

Особенно важную роль в жизнедеятельности нейронов играют глутаматные рецепторы NMDA-класса. NMDA-рецепторы в норме участвуют в процессах долговременной потенциации и запоминания. При чрезмерной активации NMDA-рецепторов наблюдается избыточная продукция активных форм кислорода (АФК) и развитие окислительного стресса, в связи с чем глутамат относят к экзайтотоксическим соединениям.

По ряду биохимических особенностей мозг особенно чувствителен к окислительному стрессу (Halliwell, Gutteridge, 1999). Так, известно, что при ишемии в тканях мозга нарастает концентрация свободного глутамата, что приводит к длительной активации ионных каналов, высвобождению ионов кальция из внутриклеточных депо, а затем и к гибели клетки. Такой механизм гибели клеток характерен как для ишемии мозга, так и для многих видов травмы и эпилепсии.

Метаботропные глутаматные рецепторы делятся на 3 группы (mGluR I, m6luR II и mGluR III), отличающиеся тем, с какими б-белками в мембране они связаны и, соответственно, какие сигнальные системы в клетке включаются лри их активации. В настоящее время накоплен ряд данных, свидетельствующих о модулирующей роли mGluRs в функционировании экзайтотоксических медиаторов, в частности для разных групп mGluRs показана усиливающая и защитная роль при состояниях окислительного стресса, вызванного внешними факторами.

В последнее время получен ряд данных, свидетельствующих о функциональных взаимодействиях различных глутаматных рецепторов друг с другом и с Ыа/К-АТФазой через внутриклеточные белки-посредники и активные формы кислорода. Было установлено, что активация нейронов повышающимися концентрациями NMDA приводит к прогрессивному ингибированию Na/K-АТФазы, которое может предотвращаться антагонистом NMDA-рецепторов МК-801, а в присутствии цистеина утраченная активность Ыа/К-АТФазы может быть восстановлена.

Известно, что активация NMDA-рецепторов приводит к входу в нейрон ионов кальция и к активации протеинкиназы С (РКС) (Boldyrev, 2002). Ыа/К-АТФаза является одной из мишеней этой киназы, причем более чувствительной к действию РКС является уабаин-резистентная а1-изоформа, и в результате ее I фосфорилирования чувствительность Ыа/К-АТФазы к уабаину повышается (Fedorova, 2003). Эндогенный уабаин-подобный гликозид препятствует связыванию МК-801 с NMDA-рецепторами (Reines 2001). Показано, что известный токсический эффект уабаина не связан с вызываемой им деполяризацией мембраны или снижением ионных градиентов, а отражает непосредственное участие Ыа/К-АТФазы в антиоксидантной защите клеток (Veldhuis2003; Boldyrev et al, 2003). Эти и другие факты подтверждают наличие взаимодействия Ыа/К-АТФазы и глутаматных рецепторов NMDA-класса и вовлечение Ыа/К-АТФазы в систему передачи информации через клеточную мембрану внутрь клетки. Возможно, управляя сигнальными функциями Ыа/К-АТФазы, можно научиться снижать окислительный стресс, вызванный гиперактивацией NMDA-рецепторов.

Существующие представления о роли глутаматергической системы и Ыа/К-АТФазы при передаче информационных сигналов и активаторов внутриклеточных сигнальных каскадов с участием протеинкиназ, ионов кальция и активных форм кислорода послужили теоретической основой для настоящей работы. Она посвящена исследованию сигнальных функций Ыа/К-АТФазы и глутаматных рецепторов и их функциональной взаимосвязи.

В работе использованы 2 биологические модели: культура клеток нейробластомы человека БН-бУбУ и первичная культура изолированных нейронов мозжечка 2-недельных мышей линии SAMP (Senescence Accelerated Mice, prone). В некоторых опытах на клетках РС-3 проводилась оценка типа клеточной смерти при ингибировании Ыа/К-АТФазы уабаином. Выбор в качестве объекта клеточной культуры нейробластомы SH-SY5y связан с тем, что она является распространенной моделью нервных клеток и часто используется в нейрохимической литературе. Опухолевые клетки являются удобным объектом для изучения как имеющие нервное происхождение - именно такой культурой и является клеточная линия нейробластомы бН-бУбУ. Второй объект исследования I

- животные SAMP - характеризуются повышенным стационарным уровнем АФК (окислительный стресс), поэтому экзайтотоксические механизмы в их мозге представлены в наиболее выраженном виде. Мы предполагали, что сопоставление данных, полученных на культуре клеток и на свежевыделенных нейронах позволит получить более объективную информацию о реальных процессах клеточной сигнализации в нервной ткани.

В соответствии с этим, первая часть работы посвящена изучению сигнальных каскадов с участием No/K-АТФазы и глутаматных рецепторов NMDA-класса на клеточной культуре нейробластомы 5Н-5У5У. Вторая часть работы выполнена на нейронах быстростареющих мышей и посвящена взаимодействию ионотропных NMDA-рецепторов с различными классами метаботропных глутаматных рецепторов.

Целью исследования явилось изучение участия No/K-АТФазы, глутаматных рецепторов NMDA-класса и метаботропных глутаматных рецепторов в проведении внутриклеточных сигналов; выяснение их роли в регуляции клеточного метаболизма и значения для жизнеспособности нейрональной клетки, а также выявление механизмов взаимодействия этих i систем.

Задачи исследования:

1) Определение изосрормного состава No/K-АТФазы и субъединиц NMDA-рецепторов в клетках нейробластомы 5Н-5У5У.

2) Оценка влияния No/K-АТФазы и NMDA-рецепторов на внутриклеточный уровень ионов кальция и активных форм кислорода (АФК) в клетках нейробластомы SH-Sy5Y.

3) Выявление внутриклеточных белков-посредников, участвующих в механизмах клеточной сигнализации, реализующихся при участии Na/K-АТФазы и NMDA-рецепторов в клетках нейробластомы БН-бУбУ.

4) Оценка жизнеспособности клеток нейробластомы 5Н-5У5У при блокаде No/K-АТФазы уабаином и действии токсических концентраций NMDA.

5) Выявление типа клеточной смерти (некроз или апоптоз) при ингибировании Na/K-АТФозы уабаином на клеточной линии РС-3.

6) Сопоставление уровня АФК и темпов гибели нейронов мозжечка быстростареющих мышей линии 5AMP (Senescence Accelerated Mite) при активации глутаматных ионотропных и метаботропных рецепторов.

Научная и практическая новизна исследования:

Исследования сигнальных процессов, в которые вовлекаются Ыа/К-АТФаза и глутаматные рецепторы, на изучаемых объектах до сих пор не проводились. Представленные данные показывают, что Ыа/К-АТФаза принимает непосредственное участие в реализации внутриклеточной сигнализации в клетках нейробластомы SH-SY5y в качестве регулятора клеточного метаболизма и i жизнеспособности этих клеток. В клеточной культуре нейробластомы 5Н-бУ5У присутствуют все 3 изосрормы каталитической субъединицы Na/K-АТФазы. При ингибировании АТФазы уабаином наблюдается увеличение уровня АФК и внутриклеточных ионов кальция, которые, вероятно, участвуют в передаче сигналов в качестве вторичных мессенджеров. На клетках нервного происхождения впервые получены данные об активации Na/K-АТФозой сигнальных путей с участием протеинкиназ МАРК и РКВ. Впервые обнаружено, что действие уабаина приводит к сроссрорилированию белка Bad и подавлению его проапоптозного действия. Одновременно выявлена активация! ряда внутриклеточных посредников, участвующих в развитии апоптоза в этих клетках -снижается доля активных (сроссрорилированных) белков Вcl-2 и Bcl-xL, подавляющих выход цитохрома С из митохондрий; в цитоплазме клеток появляется цитохром С, активируется каспаза 3 и белок р53. Два противоположных пути регуляции характеризуются различной чувствительностью к уабаину: первый выявляется при низких, а второй - при высоких (1 мкМ и выше) концентрациях этого лиганда.

Показано, что в клетках нейробластомы 6Н-5У5У присутствует NR1 субъединица NMDA-рецепторов, но инкубация клеток с NMDA не приводит к увеличению уровня АФК и ионов Са2+. Тем не менее, в этих условиях активируются МАРК и РКВ киназы. Возможно, что именно NR1 субъединица NMDA-рецепторов ответственна за их сигнальную функцию.

Данные, полученные на мышах линии SAMP, демонстрируют регулирующее действие метаботропных глутаматных рецепторов на NMDA-рецепторы, выражающееся в том, что метаботропные рецепторы I группы ослабляют, а III группы усиливают токсическое действие NMDA.

Обнаруженные закономерности помогают уточнить молекулярные механизмы сигнальной функции No/K-АТФазы и рецепторов глутаматергической системы в нервных клетках.

Часть I Обзор литературы

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Куликов, Андрей Валентинович, Москва

1. Circulation 108, 3048-53., 2003. 26) Abetnayor, E, and Sidell, N. Human neuroblastoma cell lines as models for the in vitro study of neoplastic and neuronal cell differentiation. Environ. Health Perspect. 80, 3-15., 1989. 21) Agarwal S. and Sohal R.

2. Cloned glutamate receptors Annu. Rev. Neurosci., 17, 31-108., 1994. 115) Houamed KM, Kuijper J.L., Gilbert T.L, Haldeman B.A., OHara P.J., MuMhill ЕЛ, Aimers W., Hagen F.

3. Epub 2005 Sep 21, 2006. 136) Kitamura У, Zhao Z.H., Ohnuki Т., Takei M., and Nomura У. Age-related changes in transmitter glutamate and NMDA receptor/channels in the brain of senescence-accelerated mouse. Neurosci. Lett. 1992. Vol. 137. P. 169-172. 137) Knight J.A. The biochemistry of Aging. Adv. din. chem. v. 35. pp. 1-62; 2000. 132