Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Локальная регуляция активности бета-адрено- и М-холинорецепторов

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Локальная регуляция активности бета-адрено- и М-холинорецепторов"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н.К.Кольцова

на правах рукописи УДК 612.82.015

С М У Р О В А Елена Александровна

ЛОКАЛЬНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ /З-АДРЕНО- И М-ХОЛИНОРЕЦЕПТОРОВ

(03.00.13 - физиология человека и жиоотмых)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандилата биологических наук

Москнл - 19!)Г>

Работа выполнена в лаборатории межклеточных взаимодействий Института биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН (директор - академик РАН Н.Г.Хрущов)

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Б.Н.Манухни

' Официальные оплоиепты:

доктор биологических наук, профессор И.М.Роднонов доктор биологических наук, Н.Д.Озерпюк

Ведущее учреждение:

НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН

Защита состоится "

/Г- ¿¿■¿■¿¿С^ 1996 года в часов на заседании Специализированного совета Д 002.85.01 но защите диссертаций при Институте биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН (117334 Москва, ул.Вавилова, 26).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБР РАН.

Автореферат разослан " ^ " —1996 года.

Ученый секретарь Специализированного гоиста, кандидат биологических наук

Е.13. Волина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы: Развитие многоклеточного организма и его существование как единой системы обусловлено взаимосвязью между клетками, которая осуществляется с помощью сигнальных молекул различной природы. Воздействие медиаторов и гормонов эффекторная клетка воспринимает через рецепторы, которые трансформируют полученную информацию в адекватную ответную реакцию. Поэтому изучение функциональных свойств рецепторов: их количества и чувствительности к биологическим регуляторам, представляет несомненный интерес для физиологов, биохимиков, фармакологов и клиницистов (Турпаев, 1962; Манухин, 1968; Бузннков, 1987; Авдонин, Ткачук, 1994). Мембранные рецепторы являются типичными интегральными белками, свойства которых зависят от липидиого окружения и состояния структурных компонентов плазматических мембран (Fraser, 1995). Следовательно, мембраноактивные факторы могут быть хорошим инструментом для изучения закономерностей н механизмов локальной регуляции рецепторных систем (Kowatch, Roth, 1994; Williams et al., 1995).

Ранее в физиологических опытах было показано, ' что высокая температура и фосфолипазы оказывают модулирующее влияние на холннергическую и адренергическую реакции (Манухин и др., 1987; Кичикулова и др., 1988). Поскольку величина физиологического ответа зависит не только от функционального состояния рецепторов, но и последующих этапов реализации медиаторной реакции, особое значение приобретает изучение взаимодействия лнганда со специфическим рецептором на мембранном и клеточном уровнях.

Для исследования активности мембранных рецепторов применяют радиолигандный анализ, который позволяет определить истинное количество рецепторов и константу диссоциации лиганд-рецепторного комплекса в норме, а также оценить изменения этих показателей при экспериментальных воздействиях. Основываясь на концепции общего ответа организма на внешнее воздействие, сопровождающегося как нейро-гуморальными, так и клеточными изменениями, в качестве "модельных" систем в последние годы широко используют клетки периферической крови (Красникова и др., 1993). Это позволяет получить прижизненную информацию о состоянии рецепторного. аппарата в норме, при различных заболеваниях, экспериментальных воздействиях на организм, а также исследовать влияние различных факторов, изменяющих состав н физико-химические свойства мембран in vitro.

Несомненно, иЗуче.ше закономерностей лиганд-рецеиторного взаимодействия на клеточном н суб1слеточном уровнях будет способствовать более глубокому пониманию биологических и медицинских проблем, таких как изменение рецепторной активности в процессе эмбриогенеза, при старении, нарушениях обмена веществ, различных заболеваниях, что необходимо для диагностики и эффективного подбора лекарственных препаратов.

Цель и задачи работы: Исследование общих закономерностей связывания специфических блокаторов с 0-адрено- . и М-холино-рецепторами, а также модулирующего действия мембраноактивных факторов на активность рецепторов. Были поставлены следующие задачи:

1) Установить количественные закономерности связывания специфических блокаторов с /3-алрено- и М-холинорецепгорами эритроцитов и синаптосомальных мембран коры мозга крыс.

2) Исследовать влияние фосфолипаз Аз и С на активность /в-адре-норецепторов эритроцитов и М-холинорецепторов синаптосомальных мембран коры мозга крыс.

3) Изучить действие высокой температуры на функциональные свойства /3-адренорецепторов эритроцитов крыс.

4) Исследовать влияние гипертермии на активность М-холино-рецепторои синаптосомальных мембран коры мозга крыс.

Научная новизна и практическая значимость работы: В работе предложен новый метод анализа результатов лиганд-рецепторного взаимодействия, основанный на предположении существования нескольких пулов рецепторов и присоединения одной или нескольких молекул лнгавда к рецептору. С помощью раднолигандного анализа взаимодействия специфических антагонистов с /3-адренорецепторами мембран, "теней" и нативных эритроцитов, а также с /3-адрено- и М-холинорецеиторами синаптосомальных мембран коры мозга крыс впервые показано, что исследованные рецепторы присоединяют но две молекулы лиганда и представлены двумя пулами - высоко- и ннзкоаффинным.

. Установлено, что действие фосфолипаз и высокой температуры приводит к изменению свойств обоих пулов рецепторов. Фосфолипаза С вызывает уменьшение количества /3-адренорецепторов эритроцитов, при этом сродство рецепторов высокоаффннного пула к лнганду не изменяется, а ннзкоаффинного - увеличивается. На синаптосомальных мембранах коры мозга крыс обнаружено дозозависимое снижение количества М-холинорецепторов в результате гидролиза фосфолипидов фосфолнпа.юп А2. После действия высокой температуры на изолированные эритроциты крыс показано уменьшение количества /32

адренорецепторов. Впервые обнаружено различное изменение свойств высоко- и низкоаффинного пулов М-холинорецепторов коры мозга после гипертермии крыс: количество рецепторов высокоаффинного пула снижается без изменения константы диссоциации, а количество рецепторов низкоаффинного пула повышается, при этом уменьшается их чувствительность к лиганду. -

Практическое значение работы состоит в возможности применения полученных результатов в фармакологии и клинической медицине для количественной оценки функционального состояния холинергнческой и адренергнческои систем. Изолированные клетки крови могут быть использованы для скрининга фармакологических препаратов, направленно действующих на рецепторы определенного типа: Использование предложенного метода анализа результатов лиганд-рецепторного "взаимодействия дает новую информацию об активности рецепторов и механизмах их локальной регуляции.

Апробация работы: Основные материалы диссертации докладывались на коллоквиумах лаборатории межклеточных взаимодействий и научных конференциях ИБР им.Н.К.Кольцова РАН (1994-1996г); на международном симпозиуме "Thermoregulation and Temperature Adaptation" Минск, 1995 г. По материалам- диссертации опубликовано 6 статей, одна находится в печати.

Структура н объем работы: Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста, содержит 21 таблицу, иллюстрирована 36 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав изложения собственных результатов, заключения, выводов и списка литературы, включающего 325 источников.

: МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Опыты проводили на крысах-самцах линии "Вистар" (150-300г). Эритроциты выделяли по общепринятому методу (Мэллн, 1979), промывали 3 раза физиологическим раствором, содержащим 150 мМ NaCI, 15 мМ трис-HCI, рН 7.4, н разводили этим буфером. Количество клеток составляло 553±19 тыс. эритроцитов в I мл. Мембраны и закрытые "тени" эритроцитов получали по методу G.Т.Dodge ft al. (1963) с некоторыми модификациями. Мембраны эритроцитов разводили в 15 мМ трис-HCI, рН 7.4. Концентрацию белка в мембранных препаратах определяли но методу О.H.Lowry et al. (1951).

Обработку эритроцитов фосфолиназой С из Uacilus ccrcus (F.C 3.1.4.3; 2000 ед.акт./мг белка; "ВосМпцег Mannheim", Германия) проводили в физиологическом растворе, содержащем 15 мМ трис-HCI, 2.5 мМ СаС12, рН 7.4. Пробы с фосфолиназой С инкубировали 15 мин при температуре 37ПС. Концентрация фермента 10 ед.акт./'мл вызывала-не более 10°i гемолиза. Для остановки действия фосфолмпазм суспензию эритроцитов. 2 раза п|м>мынали 10 кратным объемом

ледяного физиологического раствора с 15 мМ трис-HCl, рН 7.4 и разводили как и контрольных образцах.

Термошок эритроцитов проводили в течение часа при температуре 41°С. После тепловой обработки суспензию эритроцитов промывали 2 раза физиологическим раствором комнатной температуры с 15 мМ трис-HCl, рН 7.4 и разводили как в контрольных образцах. Полученную суспензию эритроцитов использовали для ралиолигандного анализа через 30 и 60 мин после термошока. Температура инкубационной среды составляла 23°С.

Гипертермию крыс вызывали, помещая животных в хорошо проветриваемую сухо-воздушную термокамеру 45°С на 60 мин. В этих условиях ректальная температура животных повышалась с 37.3°С до 40.6°С, а через сутки снижалась до 36.8°С (Мезидова и др., 1984). Через 24 часа после воздействия животных оглушали электрическим током с последующей декапитацней. Определение содержания норадрепалипа н адреналина и коре больших полушарии мозга, воротной вене, надпочечниках выполняли модифицированным способом на основе трноксиипдольного флюориметрического метода (Manukhin et al., 1981). Флюоресценцию аминов измеряли на спектрофлюориметре MPF-4 фирмы "Hitachi" (Япония).

Снпаптосомальпые мембраны из коры мозга крыс выделяли по методу S.W.Henil и F.A.Henil (1982) с некоторыми модификациями. Сипаптосомы разрушали с помощью осмотического шока и использовали для ралиолигандного анализа. Обработку синантосомальных мембран фосфолипазой A¿ из яда кобры Naja naja (ЕС 3.1.1.4; 1880 ед.акт./мг белка; "Sigma", США) проводили в среде, содержащей 50 мМ трис-HCl, 3 мМ СаОг, рН 7.4. Пробы с фосфолииазой А2 (0.5 ед.акт./мл) инкубировали 30 мин при температуре 25°С. Действие фосфолипазы останавливали добавлением ЭДТА (10 мМ). Суспензию мембран разводили до конечной концентрации белка 0.4 мг/мл и использовали для ралиолигандного анализа.

Для получения параметров связывания лнгандов с /3-адренорецепторами использовали специфические блокаторы DL-|4-3H 1-проираполол гидрохлорид (|3HJ-PRP "Amersliam", Великобритания 25 Кюри/ммоль) в концентрациях 0.80-22.22 нМ и Ь-(нропил-2,3,-3Н ¡-дигидроалпреполол ((' Н |Ш IA "Amersham", Великобритания 60. Ки/ммоль и 38 Ки/ммоль) » концентрациях 0.42-6.67 нМ. При конкурентном выгеснении радиолитанда немеченым блокагором использовали (3H]-PRP в концентрациях 8.2 нМ или 2 нМ. В качестве вытеснителя применяли DÍ--nponpa-нолол гпдрохлорид в концентрациях 0.01-10 мкМ. Для связывания с М-холипо-рсценгорами использовали специфический блокатор 1.-хннуклпдн:п1Л-|феш1Л-4-:,11|-бепзилат (|3H|-QNB "Amersliam", Великобритания, 41.5 Ки/ммоль) в концентрациях 0.3-9.0 пМ. Специфическое связывание лнгандов определяли по разнице между общим связыванием и связыванием в присутствии 10 мкМ DL-пропранолола гидрохлорида пли L-алпрснолола гидрохлорида в течение 30 мин при исследовании ¿¿-адрсиорсцснгоров и 10 мкМ атропина в течение часа при исследовании М-холипорецепторов. Несвязавшийся радиоактивный лиганд отмыкали иод вакуумом па стеклонолокнисгых фильтрах GF/B ("Whatman") 10 кратным объемом охлажденного 50 мМ ipuc-HCI, рН 7.4. Фильтры помещали в кюветы с 5 ;ил гцииги.ыяниошюЛ жидкое!н ЖС-106. Радиоактивность измеряли на жидкостном сцингилляциониом счетчике 1214 Rack beta фирмы "LKB Wallac" (Швеция) с эффективностью счета 60/Ó.

Определение основных параметров лш анд-реценторного взаимодействия:

констант диссоциации - Kji и К<]2, кажущихся коистаит диссоциации для вытеснителя - IC50(d и 1С50(2) и общего количества мест связывания лигаида -Вта11=В,+В2 проводили по методу нелинейной регрессии с помощью компьютерной программы "SigmaPlot 5.0". В качестве начального этапа обработки экспериментальных результатов и представления данных строили графики в координатах Скэтчарда. Определение количества центров связывания лигаида на молекуле рецептора проводили с помощью графикой Хнлла к компьютерной программы "SigmaPlot 5.0". При расчете коэффициента Хнлла (пц) использовали компьютерную псрсию метода наименьших квадратов. Теоретические кривые строили но уравнению для двух пулов рецепторов (Манухни и др.,1990):

b = -1- + -i-, где b - зависимость величины связывания лигаида от

V П . дП ir П , аП

~dl + А ivd2 + А его концентрации; К^, K<i2 - константы диссоциации высоко- и ннзкоаффииного пулов рецепторов; В|, В2 - количество мест связывания лигаида с высоко- и низкоаффинным пулами рецепторов; Л - концентрация лигаида; п - количество мест связывания лигаида на молекуле рецептора.

Величину ингибитормой константы вытеснителя вычисляли с помощью 1С'>П по методу Y.-С.Cheng, W.II.Prusoff (1973). Количественную опенку ингибиториой активности фосфолиназ определяли по уравнению для неконкурентного ингибирования (Диксон, Узйб, 1982). Статистическая обработка результатов осуществлялась методами вариационной статистики. Достоверность различий оценивали по критерию Стыодента (р < 0.05). Все значения представлены, как среднее арифметическое ± средняя ошибка пли среднее отклонение.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. ,Oc":on:i' ie эакопокерпоета лтгапд-рсцсптсрпогв огшсгодейстпнп.

В представленной работе проведен анализ общих закономерностей и определены количественные параметры равновесного связывания специфических ' блокаторов [3H]-PRP и [3H]-DHA с /3-адре-норецепторами мембран, "теней"'и натнвных эрцтроцнтоз крыс, а такке [3H]-DHA с /3-адренорецепторами и [3H]-QNB с М-холннорецепторамн синаптосомальных мембран, выделенных из коры мозга крыс.

Специфическое связывание радиолнгандов, использованных в широком диапазоне концентраций, насыщаемо (рнс.1А). Неспецифическое связывание на фоне вытеснителя, взятого в концентрации и 100 раз превышающей его К<|, линейно зависит от количества добавленного радиолиганда и в большинстве случае» составляет менее 40% от общего связывания. Во всех опытах графики специфического связывания лигандов в стандартных координатах Скэтчарда (Ь; Ь/А) не соответствуют простой модели лнганд-реценторного взаимодействия: [L] + [R] = ■ (LR). Величина коэффициента Хилла (пц) зависит от количества связанных с лпгпндом рецепторов. Например, для все:: экспериментальных точек

Рис. 1. Графики специфического связывания 13Н ] РНР с /З-адренорсцснторами эритроцитов крыс.

В - то же в координатах Хилла. В - то же в коордкватах Скатчарда. Прямыми показаны высоко- и нивкоаффинный пул рецеаторов.

Рис. 2. Графика конкурентного вытеснения пропранололок *Н—РНР(2нЫ), связанного о Д-адренорвцепторами вритродитов.

А - теоретическая кривая и экспериментальные точки. В - то же в координатах Скатчарда. Результаты б опытов.

равновесного связывания [3Н]-РИР с /3-адренорецепторами нативных эритроцитов коэффициент Хилла равен 1.14; для точек, составляющих от 10 до 70% связывания лиганда, - 1.45; а для крайних точек - 2.07 и 2.06, соответственно (рис.1 Б). Поэтому результаты экспериментов анализировали, исходя из предположений о взаимодействии одной или двух молекул лиганда с рецептором. На основании . проведенных расчетов в модифицированных координатах Скэтчарда (Ь; Ь/А2) строили графики специфического связывания лигандов. Во всех случаях экспериментальные точки представляли собой вогнутую кривую, что указывает на гетерогенный характер связывания лигандов (рис.1 В). Нелинейный регрессионный анализ различных моделей лиганд-рецепторного взаимодействия с помощью компьютерной программы "818таР1о1: 5.0" также показал, что полученным результатам наиболее соответствует модель, включающая два пула мест связывания лиганда и предполагающая присоединение двух молекул лиганда к рецептору : (табл.1). Еще одним подтверждением правильности методов расчета параметров (К^ и Втах) является совпадение экспериментальных значений с теоретической кривой (рис.1 А), построенной по уравнению -для двух пулов рецепторов (см. материалы и методы).

Таблица 1. Использование разных моделей лиганд-рецепторного взаимодействия для расчета параметров специфического связывания [3Н]-РИР с /3-адренорецепторами нативных эритроцитов крыс.

Модель п К,,, (нМ) Кнг (нМ) В| (ед/кл) Вг (ед/кл) Norm

1 пул 1 82.5 + 15.6 - 1006 + 158 - 11.13

1 пул 2 10.7 + 0.90 - 250 + 15 - 32.93

2 пула 1 Параметры не определяются

2 пула 2 0.74 ±0.07 114.4+ 0.41 | 24 ± 2 | 263±5 | 5.21

Примечания: п - показатель степени для концентрации лиганда в уравнении связывания лиганда с рецептором; К,ц, К^ - константы диссоциации высоко-и низкоаффинного пулов; В|, В2 - количество мест связывания лиганда с высоко- и низкоаффишгым пулами рецепторов на одной клетке; Norm -квадратный корень из суммы квадратов отклонений каждой экспериментальной точки от расчетпой величины. Средние данные семи экспериментов. В каждом опыте 14 экспериментальных точек с трехкратным повтором.

Для подтверждения полученных результатов был' использован другой метод определения кинетических параметров: конкурентное вытеснение [:'H]-PRP одинаковым по структуре нерадноактнвным пропранололом. Компьютерный и графический анализ (рис.2) обнаружил качественное и количественное совпадение данных и опытах

но конкурентному вытеснению н равновесному связыванию [:iHJ-PRP с /З-адренорецепторами эритроцитов крыс, что означает идентичность мест связывания вытеснителя и радиолнганда. В обоих случаях подтверждается предположение, что места специфического связывания лиганда представляют собой два гетерогенных пула и к одному адренорецеитору присоединяются две. молекулы блокатора. При равновесном связывании ['HJ-PRP в концентрации 2 нМ обнаружено 26 /3-адренорецепторов на отдельны!! эритроцит, а при конкурентном вытеснении - 24 места связывания на одной клетке.. Ингибиторная константа пропранолола для высокоаффинного пула рецепторов (Kj(|)=1.2 нМ), найденная методом Ченга и Прасоффа, совпадала с равновесной константой диссоциации высокоаффинного пула рецепторов (К(||=0.74+0.07 нМ), а для низкоаффшшого была в 9 раз выше (К|(2)='26.4 нМ; K(i2= 14.40+0.4i нМ). Наши результаты и данные литературы (Limbird, (986) свидетельствуют, что расчет ингибиторной константы вытеснителя возможен, если концентрация радиолнганда близка к его константе диссоциации, а вытеснитель используется в узком диапазоне концентраций, действующих преимущественно на один пул рецепторов. Вышеназванные условия позволяют рассчитать величину К,| исследуемого вещества близкую к истинной, в остальных случаях она получается более высокой. Следовательно, определяемая методом Чеша и Прасоффа ингибиторная константа в значительной степени зависит от условий эксперимента, поэтому характеризует только относительную специфическую активность вытеснителя. Таким образом, два метода анализа лппшд-рецепторного взаимодействия (равновесное связывание и конкурентное вытеснение) дают совпадающие по Втах результаты и оба могут быть использованы для определения количества рецепторов.

В нашей работе исследования равновесного связывания специфических блокаторов [:iH]-PRP и (:)HJ-DHA с /3*адрено-рецепторами были выполнены как на целых клетках, так и на мембранных препаратах и "тенях" эритроцитов (табл.2). Анализ полученных результатов показал, что при выделении мембран п получении "теней" эритроцитов сохраняются основные закономерности лшанд-рецепторного взаимодействия: присоединение к рецептору двух молекул специфических блокаторов и наличие двух дискретных пулов, достоверно различающихся по сродству к лпганду. Равновесное связывание антагонистов с мембранами, "тенями" и натнвными эртроцтами .крыс, как правило, характеризуется одинаковыми константами диссоциации. Установлено, что 1 мг белка изолированных мембран соогнеитпует 4.109 эритроцитам. Это позволило рассчитать, что количество мест связывания [:,H]-DHA и |:,H]-PRP с /З-адрено-

рецепторами при выделении мембран и "теней" эритроцитов уменьшается на порядок. Значительное снижение количества адренорецепторов на клетку может быть обусловлено методическими процедурами, приводящими к инактивации большей части рецепторов. Поскольку специфические блока-горы [3Н]-Р11Р и [3Н]-ОНЛ проникают внутрь клетки (Краашкова ¡1 др., 1989), то большее число рецепторов на интактных клетках обьясняется связыванием со всеми клеточными рецепторами, поверхностными и интерналнзованными.

Таблица 2. Параметры равновесного связывания блокаторов с /3-адрено-рецепторами мембран, "тенен" и нативных эритроцитов крыс.

Параметры [3Hj-DHA 13Ш- PRP

связывания Нативныс Мембраны Нативныс "Тени"

лигандов эритроциты эритроцитов эритроциты эритроцитов

К(И (ттМ) 0.22 + 0.01 0.46 + 0.02'** 0.74 ± 0.07 0.70 + 0.17.

Kt|2 (нМ) 3.75 + 0.44 3.97 + 0.14 14.40 + 0.41 19.59 + 2.59

В( (сд/кл) 71+2 7***(46+1) 24 + 2 2***(9±1)

В2 (ед/ кл) 61 + 4 7***(47+1) 263 + 5 <3***(39+4)

Вшах (сд/кл) 132 + 4 14"*(93+!) 287 + 5 . 8*4*(48+4)

"и 0.84 0.99 1.14 0.78

число опытов б 2 7 2

Примечания: в скобках указана концентрация мсст связывания лнгандов, выраженная в фмоль/мг белка, *** - различия достоверны, р < 0.001; остальные обозначения тс же, что в таблице 1,

Таким образом, проведенный графический н математический анализ равновесного и конкурентного взаимодействия радиолнгандов с ^-адренорецепторами мембран, "тенен" и нативных эритроцитов крыс, а также с /З-адрено- и М-холинорецепторами синапгосомальлых мембран коры мозга крыс показал, что исследованные рецепторы присоединяют по две молекулы антагониста и представлены двумя пулами - высоко- и низкоаффннным.

2. Влияние фосфолнпаэ на взаимодействие лнгандоз с /3-адрено-рецепторами эритроцитов и М-холпнорецепторами коры мозга крыс.

Мембранные рецепторы очень чувствительны к состоянию структурных компонентов плазматических мембран, а использование различных мембраноактншгмх факторов может способствовать пониманию локальных механизмов регуляции активности рецепторов (Kowatch, Rot h, 1994; Williams et al., 1993). Известно также, чш медиаторы вегетативной нервной системы (ацечнлхо.-пш и

норадреналин) опосредуют свое влияние на обмен фосфоиноэитидов активацией внутриклеточнлх фосфолипаз, которые являются ключевым звеном трансмембранной передачи химических сигналов (изсоуксЬ, 1992; Уе е1 а!., 1994). Исходя из этого, исследовали модулирующее действие липолитических ферментов на свойства каждого пула /3-адрено-и М-холинорецепторов в отдельности.

Действие фосфолипазы С из ВасНиз сегеиэ (10 ед.акт./мл; 37°С, 15 мин) на.нативные эритроциты крыс не изменяет общий характер связывания [3Н]-ОНА с /?-адренорецепторами. Специфическое связывание лиганда насыщаемо (рис.ЗА), неспецифическое ненасыщаемо. Коэффициент Хилла (пц=1.42) свидетельствует об участии в'реакции двух молекул блокатора. Графический анализ данных в координатах Скэтчарда (рис.ЗБ) и математический анализ методом нелинейной регрессии в контроле и опыте выявил два пула рецепторов, различающихся по сродству к лцганду. Под влиянием фермента общее число /3-адренорецепторов уменьшается (табл.3).

Таблица 3. Влияние фосфолипазы С на параметры специфического связывания [3Н]-ОНА с /З-адренорецепторами эритроцитов крыс.

Параметры связывания |3Н]-ПНА Контроль После действия фосфолипазы С

К.Ц (нМ) К^ (нМ) И| (ед/кл) В2 (сд/кл) Вшах (сд/кл) П|| количество опытов 0.22 + 0.01 3.75 ±0.45 71 ±2 61 ±4 132 ± 4 0.84 6 0.21 ± 0.02 1.75 ± 0.06" 28 + 1"* 39 ± 1" 67 ± 1*" 1.42 4

Различия между контролем и опытом достоверны: " - р < 0.01,

•**-р <0.001.

Количество рецепторов высокоаффннного пула снижается на 61% при неизменной константе диссоциации. Количество рецепторов ннзкоаффшшого пула снижается на 36%, а сродство к лиганду увеличивается в два раза. Ингибиторная константа при которой фермент наполовину уменьшает специфическое связывание лиганда с высокоаффинным пулом рецепторов, рассчитанная по уравнению для неконкурентного ингибпрования, составляет 6.5 ед.акт./мл. При расчете пнгнбнторной константы для. низкоаффиниого пула рецепторов (К,(2)=1.6 ед.акт./мл) приходится учитывать изменения как К,^, так и Поэтому использовали уравнение, применяющееся в энзнмологии дли расчета К( при смешанном тине ингибировання (Диксон, Уэбб;

ю

Рис 3. Влияние фосфолипааы С на специфическое связывание 'Н-ОНА с /3-адреяорецепторами эритроцитов.

В/А»(«д/*л нМ")

А - теоретические кривые и экспериментальные точки. Б - то ае в координатах Скэтчарда. 1 - контроль (в опытов). 2 - после действия фосфолипааы С (4 опыта).

Рис 4. Влияние перегревания крыс на специфическое связывание °Н-(}КВ с Ы-холинорецепторами коры иоага.

Б

ООО

400

200 -

В/А1 (фиат /ыг/нЫ»)

А

В(фмоль/иг)

А(нМ)

О 600 1000 Шиоъ/иг)

А - теоретические кривые и экспериментальные точки. В - то асе в координатах Скотчарда. 1 - контроль (6 опытов). 2 - через сутки после гипертермии (в опытов).

1982). Сравнение ингибиторных констант показало, что рецепторы с низким сродством к лиганду более чувствительны к действию фосфолнпазы С.

Известно, что наибольший гидролиз фосфолипидов наблюдается при действии фосфолипаз на изолированные мембраны клеток (Мэдди, 1979). Поэтому было исследовано влияние фосфолнпазы Л2 из яда кобры Naja naja (25°С, 30 мин) на связывание специфического блокатора [:!H]-QNf! с М-холинорецепторами синаптосомальных мембран, выделенных нз коры мозга крыс. В предварительных опытах показано, что ннгнбнрование фосфолипазой A-¿ связывания антагониста -это дозозависнмый процесс. Для дальнейшей работы была выбрана концентрация 0.5 ед.акт./мл. Действие фосфолнпазы Л2 не изменяет общий характер связывания [3íI]-QNB с М-холинореценторами мембран коры мозга крыс. Сохраняются высоко- и низкоаффшшый пулы рецепторов, присоединяющих по две молекулы блокатора, но в восемь раз уменьшается количество мест связывания лиганда (табл.4).

Таблица 4. Влияние фосфолнпазы A-¿ на параметры специфического связывания [■'IIJ-QNB с М-холинорецепторами синаптосомальных мембран, выделенных из коры мозга крыс.

Параметры связывания Контроль После действия

[•'H1-QNB фосфолииазы Аг

К(И (нМ) 0.43 ± 0.02 0.43 + 0.09

К,|2 (нМ) 2.G7 ± 0.13 3.21 + 0.31

В) (фмоль/мг) 712 + 22 43 + 7***

В2 (фмоль/мг) 677 ± 19 122 + 5***

Вша* (фмоЛЬ/мг) 1389 + 29 165 ± 9***

»11 1.34 1.38

количество опытов 8 8

Различия между контролем и опытом достоверны: *** - р < 0.001.

Сродство обоих пулов рецепторов к лигапду не изменяется. Фосфолипаза уменьшает количество рецепторов высокоаффинного пула на 94%, а ннзкоаффинного - на 82%. Уменьшение числа рецепторов при неизменной константе сродства говорит о неконкурентном тине ингнбнторного действия фосфолнпазы A-2 на связывание лиганда. Рассчитанная ингпбнторная константа для высокоаффннного пула раина 0.032 ед.акт./мл, а ннзкоаффинного - 0.11 ед.акт./мл. Сравнение ингибиторных констант показало, что более чувствителен к действию фермента пысокоаффшшын пул рецепторов. На основании многочисленных литературных данных (Кээмбре. и др., 1984; Гх-локоцевц, Зайцев, 1993; Rauch et al., 1994) можно предположить, что

инактивация рецепторов, вызванная фосфолипазамн А2 и С, в основном определяется изменениями физико-химических свойств лшшдоп мембран.

3. Влияние высокой температуры на взаимодействие лигандов с /З-адренорецепторами эритроцитов.

Температура является еще одним фактором от которого зависит состояние структурных компонентов цнтоплазматаческих мембран. Далее исследовали влияние термошока эритроцитов (41°С, 60 мин) на функциональные свойства /З-адренорецепторов.

Действие высокой температуры не изменяет общий характер связывания [3Н1-Р1*Р и [3Н]-В11А с /3-адренорецепторами эритроцитов. Сохраняются высоко- и низкоаффшшый пулы рецепторов, присоединяющих по две молекулы лиганда. Однако, происходит уменьшение общего количества функционально активных рецепторов, выявляемых с помощью [3Н]-Р11Р и |3]1]-1)НА (табл.5).

Таблица 5. Влияние термонюка на параметры специфического связывания блокаторон с /?-адренорецепторами эритроцитов крыс.

Параметры 13Н|-РИР 13Н|- Г>НА

связывания Через 30 Через час Через час

лигандов Контроль нии после после Контроль после

термонюка термошока термошока

К,и (нМ) 0.7.1 ± 0.07 1.29 ± 0.38 1.10 + 0.24 0.22 + 0.01 0.23 + 0.01

К,|2 (нМ) 1-1.10 + 0.41 22.02 ± 5.91 19.28+1.73* 3.75 + 0.45 1.89+0.1 Г*

В, (рд/кл) 24 + 2 19 + 3 11 + I*** 71+2 52 ± I"*

Й2 (ед/кл) 263 + 5 86 + 2*** 87 + 6*** 61 + 4 30 + 1 ***

Вш.1х(сд/кл) 287 + 5 105 + 4*** 98 + 6"* 132 + 4 82 + Г**

"И 1.14 0.88 1.05 0.84 1.21

число опытов 7 5 5 • 6 4

Различии между контролем и опытом достоверны: * - р < 0.05, ** - р < 0.01, »** - р < 0.001.

Вызнанные термошоком нарушения сохраняются не менее часа при комнатной температуре, т.е. они обусловлены стойкими изменениями в структуре /5-адренорецепторов. Как показали исследования, сродство высокоаффнпного пула рецепторов к обоим лигандам не изменяется, т.е. эти рецепторы более устойчивы к действию высокой температуры. Сродство рецепторов ннлкоаффшшою пула к

[3Н]-РИР уменьшается, а к [3Н]-ОНА увеличивается, что может быть обусловлено различной структурой лигандов. Повышение чувствительности низкоаффинного пула /3-адренорецепторов эритроцитов крыс к [3Н]-ОНА обнаружено нами и после гидролиза фосфолипидов фосфолипазой С. Считается, что гидрофобные взаимодействия липидов с лигандами ориентируют его молекулу определенным образом по отношению к центру связывания, а электростатические - концентрируют молекулы лиганда вокруг рецептора (Белоконева, Зайцев, 1993). Поэтому изменения в составе и структуре липидного окружения при различных воздействиях, нарушающих структуру мембраны, могут модулировать способность рецепторов узнавать лиганд. Полученные данные говорят о высокой чувствительности /3-адренорецепторов эритроцитов к влияниям мембраноактивных. факторов. Можно предположить, что изменение свойств структурных компонентов плазматических мембран является одним из локальных механизмов регуляции активности рецепторов.

4. Функциональная активность М-холинорецепторов и содержание катехоламинов в коре мозга крыс после гипертермии.

Повышение температуры окружающей среды требует от организма в целом и его адренергических и холинергических регуляторных систем перестроек, направленных на защиту от избытка тепла. Нервная система, особенно ЦНС наиболее уязвима при действии высоких температур, приводящих к быстрому развитию гипертермии.

Задача данного раздела работы - комплексное исследование функционального состояния адренергической и холинергической систем после перегревания крыс. С этой целью было изучено изменение содержания катехоламинов в ЦНС и периферических органах (воротная вена, надпочечник) и состояние М-холинорецепторов синаптосомальных мембран, выделенных из коры мозга крыс через сутки после прекращения стрессорного воздействия.

Показано, что в надпочечниках уменьшается содержание норадреналина на 33% и адреналина на 29%. Снижается количество норадреналина в воротной вене и не изменяется в коре головного мозга (табл.6). Изменения содержания катехоламинов свидетельствуют о развитии стресс-синдрома, характеризующегося увеличением выброса катехоламинов из надпочечников и окончаний симпатических нервов, что ведет к уменьшению их количества в периферических органах (Месрсон, Пшенникова, 1988).

Таблица 6. Содержание катехоламинов в ЦНС и периферических органах через сутки после перегревания крыс.

Кора мозга Воротная вена Надпочечник

НА (нг/г) НА (нг/г) НА (мкг/г) А (мкг/г)

контроль (п=5) 360 ± 21 1981 ± 386 261.4±14.8 743.5+55.7

опыт(п=5) 373 +.37 1369 ± 269 175.9+13.3** 531.2+48.1*

Различия между контролем и опытом достоверны: *- р < 0.05; **- р < 0.01.

Далее исследовали изменение активности М-холинорецепторов коры мозга после перегревания крыс, что имеет важное значение для понимания адаптивной роли рецепторного аппарата в нейрональной пластичности Шитап е1 а1., 1994). Действие высокой внешней температуры на крыс (45°С, 60 мин) не изменяет общий характер связывания [3Н]-0ЫВ с М-холннорецепторами синаптосомальных мембран, выделенных из коры мозга животных через сутки после воздействия. Специфическое связывание блокатора насыщаемо (рис.4А), неспецифнческое линейно зависит от концентрации лиганда. Об участии в реакции двух молекул блокатора и наличии высоко- и низкоаффшшого пулов мускариновых рецепторов свидетельствует коэффициент Хилла, который равен 1.42. Анализ данных в координатах Скэтчарда (рис.4Б) также выявил два пула рецепторов, различающихся по сродству к лиганду. Нелинейный регрессионный анализ в обоих случаях обнаруживает высоко- и низкоаффинный пулы М-холннорецепторов, связывающих по две молекулы блокатора.

После действия высокой температуры на организм увеличивается общее количество мест связывания [:)Н]-0ЫВ с синаитосомальными мембранами, выделенными из коры мозга крыс. По-разному изменяется величина специфического связывания лнганда с высоко- и низкоаф-фннным пулами рецепторов. При низкой концентрации [3Н]-<2Ш (до 4 нМ) величина его связывания с рецепторами по сравнению с контролем уменьшается, при высокой - возрастает. Соответственно, графики специфического связывания лнганда в контроле и опыте пересекаются (рис.4). Наблюдается компенсаторное увеличение активности одного пула рецепторов при снижении активности другого. Гипертермия вызывает снижение на 16% количества рецепторов высокоаффннного пула при неизменной константе диссоциации [3Н]-(>Ш. Количество рецепторов низкоаффшшого пула увеличивается на 39%, при одновременном уменьшении сродства рецепторов к лиганду на 22% (табл.7).

Таблица 7. Влияние перегревания крыс на параметры специфического связывания [3H]-QNB с М-холинорецепторамн коры мозга.

Параметры связывания [3H]-QNB Контроль После перегревания крыс

Kdl (uM) Kd2 ("M) B| (фмоль/мг) B2 (фмоль/мг) Вшах (фмоль/мг) П|| количество опытов 0.63 ± 0.04 4.19 ± 0.09 232 ± 11 797 + 9 1029 ± 7 1.43 5 0.71 + 0.05 5.13 + 0.08" . 195 ±10* 1106 ±9** 1301 ± 7"* 1.42 6

Различия между контролем и опытом достоверны: *- р < 0,05; **- р < 0.01, "» - р < 0,001.

Разнонаправленные изменения количества рецепторов высоко- и низкоаффинного пула предполагают различные механизмы этих явлении. Возможно, уменьшение числа рецепторов с высоким сродством к лигаиду объясняется изменениями физико-химических свойств липндного окружения рецепторов. Аналогичное снижение специфического связывания [3H]-QNB с М-холинорецепторамн было показано в предыдущих разделах при модуляции состояния синаптосомалыгых мембран фосфолипазой Аг-

По-видимому, увеличение при гипертермии количества мускариновых рецепторов с низким сродством к [3H]-QNB связано с общей реакцией организма, которая имеет место при стрессе. Воздействие высокой температурь: на целый организм приводит к активации процессов стероидогенеза в коре надпочечников; одним из результатов которого является стабилизация клеточных мембран большим количеством мобилизуемых глюкокортнкоидов (Гурии, 1989). Известно, что стероидные, глюкокортикоидные и тирсоидные гормоны вызывают феномен "up-regulation" - повышение количества /3-адренорецепторов (Hoffman, Lefkowitz, 1980; Davies, Lefkowitz, 1984; Collins et al., 1989). Он связан с активацией стероидами генной экспрессии и увеличением количества мРНК, кодирующей /3-адрено-рецепторный белок (Fraser et al., 1994). В условиях стресса происходит активация белкового синтеза, вызывающая встраивание в мембрану синтезированных пли, так называемых "молчащих" рецепторных молекул. Обнаружено, что увеличение количества мускариновых рецепторов ЦНС наблюдалось при гипертиреозе (Москопкин и др., 1985) и иммобилизационном стрессе у крыс (Takayama et al., 1987). Возможно, что указанный механизм вызывает увеличение количества М-холпнороцепторов ЦНС и в условиях температурного стресса.

Анализ экспериментальных »данных показал, что как симнато-адреналовая, так и холинергическая система участвуют в ответе организма на тепловое воздействие. Гипертермия вызывает разнонаправленные изменения свойств высоко- и низкоаффинного пулов М-холинорецепторов мембран коры мозга крыс, что может свидетельствовать об их разной устойчивости к перегреванию организма и различном функциональном значении.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, проведенный графический и математический анализ равновесного и конкурентного взаимодействия радиолигандов с /3-адренорецепторами мембран, "тенен" и нативных эритроцитов крыс, а также с /3-адрено- и М-холинорецепторами сннаптосомальных мембран коры мозга крыс показал, что полученным результатам соответствует модель лнганд-рецепторного взаимодействия, в которой к одному рецептору присоединяются две молекулы антагониста, а рецепторы представлены двумя пулами - высоко- и низкоаффинным.

Анализ модулирующего действия мембраноактивных веществ и высокой температуры па рецепторы позволил определить некоторые общие закономерности. На изолированных клетках и клеточных мембранах действие мембраноактивных факторов (фосфолипаз А2, С и высокой температуры) не изменяет общий характер специфического связывания антагонистов: сохраняются высоко- и ннзкоаффинный пулы /3-адрено- и М-холинорецепторов, присоединяющих по две молекулы блокатора к одному рецептору. Сродство пысокоаффннного пула /3-адрено- и М-холинорецепторов не изменяется, что свидетельствует об относительной устойчивости рецепторов данного пула к воздействиям, нарушающим структуру мембраны. Сродство низкоаффинного пула /3-адренорецепторов исследованные мембраноактнвные факторы изменяют. Инкубация нативных эритроцитов с фосфолипазой С увеличивает сродство /8-адренорецепгоров ннзкоаффшшого пула к [!!! ¡-ОНА. Термошок эритроцитов увеличивает сродство /3-адренорецепторов ннзкоаффшшого пула я [3Н]-1ЭПА, а к [3Н]-Р1*Р уменьшает. После гидролиза фосфолипидов сннаптосомальных мембран фосфолниазой А2 сродство М-холинорецепторов низкоаффинного пула к [ЛН]-(}ЫВ остается неизменным. Во всех случаях существенно уменьшается количество активных рецепторов высоко- и ннзкоаффшшого пулов, что приводит к значительному снижению .эффективности /3-адренергической и М-холинергической реакций. Возможной причиной инактивации рецепторов является изменение состава и физико-химических свойств

лшшдного матрикса мембран, что рассматривается как один из локальных механизмов регуляции активности мембранных рецепторов.

Действие высокой температуры на целый организм приводит к увеличению общего количества М-холинорецепторов коры мозга. Происходят разнонаправленные изменения свойств высоко- и низкоаффинного пулов М-холинорецепторов, что может свидетельствовать об их разной устойчивости к перегреванию организма и различном функциональном значении. Снижается доступность рецепторов высокоаффинного пула без изменения константы диссоциации лиганд-рецепторного комплекса и повышается количество рецепторов низкоаффинного пула при уменьшении их чувствительности к блокатору, что возможно, связано с активацией белкового синтеза, вызывающей встраивание в мембрану вновь синтезированных или, так называемых "молчащих" рецепторных молекул. Поэтому изучение свойств рецепторов с различным сродством к лиганду способствует выявлению молекулярных механизмов регуляции активности рецепторов, что необходимо для понимания адаптивной роли рецепторного аппарата в ответной реакции организма на внешнее воздействие.

ВЫВОДЫ

1) Радиолигандный анализ взаимодействия специфических антагонистов с /3-адренорецепторами мембран, "теней" и нативных эритроцитов, а также с /3-адрено- и М-холинорецепторами синаптосомальных мембран коры мозга крыс показал, что исследованные рецепторы присоединяют по две молекулы лиганда и представлены двумя пулами - высоко- и ннзкоаффинным.

2) После действия фосфолипазы С на эритроциты крыс обнаружено уменьшение количества /3-адренорецепторов обонх пулов, при этом сродство рецепторов высокоаффинного пула к лиганду не изменяется, а низкоаффинного - увеличивается.

3) Установлено значительное дозозависимое снижение количества М-холинорецепторов высоко- и низкоаффинного пулов без изменения констант диссоциации лиганд-рецепторного комплекса, после действия фосфолипазы А2 на синаптосомальные мембраны, выделенные из коры мозга крыс.

4) После действия высокой температуры на нативные эритроциты крыс показано уменьшение количества /8-адренореценторов. Для рецепторов высокоаффинного пула константа диссоциации не изменяется, тогда как для низкоаффинНого пула обнаружено уменьшение сродства к рЩ-РЛР и увеличение сродства к [:'Н]Ш1Л.

5) Гипертермия вызывает различное изменение свойств высоко- и ■ низкоаффинного пулов М-холинорецепторов синаптосомальных мембран коры мозга крыс. Количество рецепторов высокоаффинного пула снижается при неизменном сродстве к блокатору, количество рецепторов низкоаффинного пула повышается при уменьшении их чувствительности

к лиганду.

6) Таким образом, действие липолитических ферментов (фосфолипаэ Аз, С) и высокой температуры не изменяет общий характер специфического связывания антагонистов: сохраняются два пула /9-адрено- и М-холинорецепторов, присоединяющих по две молекулы блокаторов. Количество рецепторов и их чувствительность к лигандам изменяются. Такие изменения являются, по-видимому, составной частью адаптивных перестроек адренергнческой и холинергической систем организма при экстремальных воздействиях.

Список работ, опубликовапных по теме диссертации.

1. Манухин Б.Н., Смурова Е.А., Нестерова Л.А. Закономерности связывания [3Н)-пропранолола /3-адренорецепторами эритроцитов крыс. // Докл. РАН 1993, т. 332, N 3, с.388-390.

2. Смурова Е.А. Функциональная характеристика /3-адренорецепторов изолированных мембран и интактных эритроцитов крыс. // Онтогенез 1994, т. 25, N 6, с.42-46.

3. Смурова Е.А., Нестерова Л.А., Манухин Б.Н. Действие высокой температуры in vitro на специфическую активность /3-адренорецепторов. // Докл. РАН 1995, т. 342, N 3, с.421-423.

4. Нестерова Л.А., Смурова Е.А., Манухин Б.Н. Характеристика связывания специфического блокатора [3Н]-хннуклидиннлбензплата М-холннорецепторами мембран коры мозга крыс. // Докл. РАН 1995, т.343, N 2, с.268-271.

5. Manukhin B.N., Nesterova L.A., Smurova Е.А. Effect of high temperature on the specific activity of beta-adrenoceptors in vitro. In: Thermoregulation and Temperature Adaptation. Ed. by V.N.Gourine, 1995, Minsk, Belarus, p.121-123.

6. Manukhin B.N., Nesterova L.A., Smurova E.A. Characteristics of the kinetics of interaction between /З-adrenoreceptors of rat erythrocytes and a specific blocker propranolol. // Membr. and Cell Biol. 1995, V. 8. N5. P. 509-516.

7. Смурова Е.А.,. Нестерова Л.А., Манухин Б.Н. Действие фосфолниазы Л2 на связывание специфического блокатора [ '111-хинуклидинилбензнлата с М-холинорецепторами мембран коры мозга крыс. // Бнол. мембраны 1996, в печати.