Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структура и функция ионотропных глутаматных рецепторов
ВАК РФ 03.00.13, Физиология
Автореферат диссертации по теме "Структура и функция ионотропных глутаматных рецепторов"
АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ ИМ.А.А.БОГОМОЛЫДА ИНСТИТУТ МЕДИЦИНСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ МАКСА-ПЛАНКА
На правах рукописи
БУРНАШЕВ Наиль Абдурахманович
УДК 612.17
СТРУКТУРА И ФУНКЦИЯ ИОНОТРОПНЫХ ГЛУТАМАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ
03.00.13 - Физиология человека и животных
Диссертация
в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук
Киев 1993
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы.
Синаптическая передача в центральной нервной системе (ЦНС) осуществляется при посредстве основного нейротрансмитгера глутамата, который активирует глутаматные рецепторы. Эти рецепторы представляют собой белковые молекулы встроенные в клеточную мембрану и образующие ионные каналы. При связывании трансмиттера с рецептором, последний активирует прохождение ионного тока через постсинаптическую мембрану.
Традиционно ионотропные глутаматные рецепторы классифицируются согласно их предпочтению к связыванию с соответствующими агонистамн на АМРА-каинатные (не-NMDA) и NM DA рецепторы (Moneghan et al., 1989, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 29, 365; Watkins et al., 1990, Trends Pharmacol. Sei., 11, 25).
Синаптический ток состоит из двух компонент: быстрой и медленной. Фармакологический анализ тока показал, что каждая из компонент обусловлена активностью соответствующего типа рецептора. АМРА-каинатцые рецепторы ответственны за быструю составляющую синаптического тока и проводят в основном натрйевые Токи. NMDA рецепторы отвечают за медленную компоненту и характеризуются ярко выраженной потенциало зависимой кальциевой проницаемостью (Headley and Grillner, ■ 1990, Trends Pharmacol. Sei, 11, 205; Collingridge and Singer, 1990, Trends Pharmacol. Sei., 11, 290). Вход ионов кальция в нервную клетку, как полагают, играет ключевую роль в регулировании долговременных изменений в синаптической активности, являющихся молекулярной основой таких процессов как память и обучение. В то же время чрезмерный,. вход ионов кальция имеет токсический эффект и приводит к гибели клетки (Nicol et al., 1988, Neuron, 1, 97; Chol, 1988, Neuron, 1, 623). Молекулярное клонирование выявило наличие большого числа субъединиц глутаматньи рецепторов и позволило приступить к детальному изучению свойств различных типов рецепторов и в частности к выявлению структурных элементов, ответственных за особенности ионной проницаемости субъединиц.
Предлагаемый цикл работ посвящен, в основном, анализу свойств различных типов рекомбинантных глугаматных рецепторов на основе знания Их первичной структуры. Иными словами, выяснению того, какие общие структурные элементы определяют характер ионной проницаемости глугаматных рецепторов и, в особенности их кальциевой проницаемости. Эти вопросы авизировались с использованием двух методических подходов: электрофизиологического описания свойств рецепторов, экспрессированных в фибробласты и техники точечной мутации, позволяющей целенаправленно изменять элементы рвичной структуры. Сделана попытка провести молекулярную идентификацию нативных глугаматных рецепторов на основе анализа свойств составляющих их субъединиц.
Цель и основные задачи исследования.
Цель настоящей работы - исследование свойств рекомбинантных глугаматных рецепторов в контексте структура-функция. Основные задачи заключались в следующем:
1. Описать^ электрофизиологические свойства различных субъединиц клонированных Глугаматных рецепторов, экспрессированных в клетки фибробластов.
2. Провести классификацию глугаматных рецепторов на основе анализа их функциональных особенностей и первичной структуры.
3. Выявить элементы в первичной структуре белковой молекулы, определяющие ионную проницаемость глугаматных рецепторов различных классов.
4. Исследовать влияние посттранскрипциональных генетических механизмов: "сплайсинга" и "редактирования" мРНК на характеристики ионного тока глугаматных рецепторов.
5. Провести молекулярную идентификацию глугаматных рецепторов в клетках ЦНС на основе сравнения свойств нативных и рекомбинантных рецепторов.
Конкретные задачи исследования указаны в. соответствующих разделах изложения.
Научная новизна работы.
Проведен детальный анализ функциональных характеристик всех типов рекомбинантных ионотропных глутаматных рецепторов. Проведена классификация глутаматных рецепторов на основе анализа структуры и функциональных характеристик.
Впервые идентифицирован участок в аминокислотной последовательности трансмембранного сегмента ТМ2 (О/Я участок), ответственный за контроль ионной проводимости АМРА рецепторов.
Исследованы структурные детерминанты проницаемости глутаматных рецепторов для двухвалентных ионов. Для рецепторов АМРА типа показано, что низкая проницаемость для ионов кальция определяется наличием положительно заряженного аминокислотного остатка аргинина в О/Я участке, внесенного в этот участок вследствие редактирования мРНК на более поздней стадии развития. Показано, что различная степень экспрессии редактированной формы субъединицы С1иЯ-0 определяет Са2+ проницаемость гетеромерных каналов.
Исследовано влияние альтернативного "сплайсинга" на функциональные характеристики АМРА рецепторов.
Впервые идентифицирована структурная композиция нативных глутаматных рецепторов АМРА типа в клетках Бергмановскон глии, на основе сравнения их свойств со свойствами рекомбинантных глутаматных рецепторов. 1
Показано существование восьми вариантов субъединицы С1иЯ-6 семейства ка1)патных рецепторов обусловленных редактированием мРНК в трансмембранных участках ТМ2 и ТМ1. Выявлено влияние редактирования как в ТМ2, так и в ТМ1 на Са2+ проницаемость этой субъеднницы.
Для ИМОА рецепторов идентифицирован участок в ТМ2, ответственный за контроль кальциевой и магниевой проницаемости и потенциалозависимого блока ионами магния этого типа рецепторов.
В результате исследования для разных типов глугаматных репепторов удалось выявить общие структурные элементы определяющие характер их ионной проницаемости. Сформулированные представления открыли новые направления в исследовании генетических механизмов контроля функций глугаматных рецептопов и их молекулярной идентификации.
2-6*26
Апробация работы.
Результаты работы были представлены на следующих научных собраниях: На конференциях физиологического общества ФРГ (Фрайбург, 1991; Мюнхен, 1993), на конференции физиологического общества Великобритании (Лондон, 1991), на ежегодных конференциях Американской Ассоциации по Нейронаукам (Ныо Орлеане, 1991; Анахайм, 1992), на Весенней конференции по гилпокампу (Каймановы острова, 1992), на конгрессе Европейской Ассоциации по Нейронаукам (Мюнхен, 1992), на конференции биофизического общества США (Вашингтон, 1993). Результаты работы были также представлены и обсуждались при чтении лекций и докладов в институтах и университетах ФРГ, Англии, США.
Публикации.
Результаты работы полно представлены в 22 статьях и коротких сообщениях в ведущих международных журналах.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Здесь представлены только основные детали методики, необходимые для последующего изложения. Подробно методы исследования, включая технику клонирования субъединиц, точечную мутацию и способы выявления постгранскрипциональных изменений амино-кислотных последовательностей изложены в соответствующих статьях.
Клеточная культура и трансфекция.
Трансформированные эмбриональные клетки почек человека (АТСС CRL 1573, 293) были культивированы на подложке в среде MEM-Gibco (Eggenstein, ФРГ), содержащей 10% телячей плазмы (fetal calf serum). После инкубации в 5% С02 в течение 48 часов клетки трансфектировали соответствующей плазмидой сДНК (PCDM-8), содержащей аминокислотные последовательности желаемых субъеднииц, используя модифицированный метод Саз(РС>4)2 преципитации (Chen and Okayama, 1987, Mol. Cell Biol. 7, 2745;
Pritchett et al,1988, Science, 242, 1306). В тех случаях когда трансфектировали комбинации, для каждой из субъединиц брали штзмиды одинакового веса (1000 иг, 500 нг или 100 нг на одну ячейку культуральной посуды). В ряде случаев сД Н К для различных субъединиц трансфектировали в пропорции 1:10 или 1:5. Приблизительно через 48 часов после трансфекции клетки использовались дал электрофизиологического эксперимента.
Глиальные клетки и клетки нейронов.
Первичную культуру нейронов и глиальных клеток из мозжечка 8-дневных крыс получали по модифицированному нами методу описанному в (Novellí et al., 1988, Brain Res., 451, 205; McCarthy and de Villis, 1980, J. Cell. Biol. 85, 890). Для электрофизиологических экспериментов использовали гранулярные нейроны и астроциты веретенообразной формы начиная с 8 до 13 дня in vitro. Культуральные астродиты веретенообразной формы, как полагают (Ortega et al., 1991, Meuroscience, 41, 335), представляют собой клетки Бергмановской глии.
Растворы.
V
Составы. основных растворов, использованных в наших экспериментах, приведены в Таблице 1.
Таблица 1. Композиции использованных в работе вне- и внутриклеточных растворов (в мМ).
Растворы NaCI KCI MgCl-, CaCb CsCl EGTA HEPES
Наружные:
"нормальный" 135 5,4 1 1,8 5
"натриевый" 140 1 5
"кальциевый^ 110 5
"магниевый" 110 5
Внутриклеточный 1 140 10 •10
В ряде случаев было необходимо варьировать концентрацией двухвалентных катионов в "нормальном" и "натриевом" растворах.
Всякого рода изменения в составе основных растворов оговорены в соответствующем месте. рН всех растворов 7,2. Все агоннсты и блокаторы растворялись в соответствующих концентрациях в наружных растворах. Опыты проводили при комнатной температуре 20-23 °С.
transacted ПЕК 293 cell!
G!uR-A(flip)/D(flip)
300 tiM L-gtutamate
attached cell
200 pA
GtuR-A(flop)
300 |iM L-glutamate
attached cell
60 pA
Рпс.1 А. Схематическое предстаа1енис экспериментальной процедуры быстрой подачи агонпста. Для оптимальной смены раствора клетка должна быть оторвана от дна камеры.
В. Примеры отьетов на подачу глутамата клеток лежащих на дне камеры и после их поднятия. В первом случае быстрый компонент тока не регистрируется.
Электрофизиология.
Трансфектнрованные клетки на подложке переносили в рабочую камеру, помещенную на предметном столике инвертированного микроскопа. Камера постоянно перфузировалась "нормальным" раствором. Регистрацию ионных токов проводили от одиночных клеток мет дом локальной фиксации мембранного потенциала в конфигурации "v.holc-cell" (Hamill et al.,1981, Pjluegers Archiv, 391, 85), используя усилитель EPC-7 (List Electronics, Darmstadt, ФРГ).
Агоннсты, растворенные в одном из наружных растворов подавались с помощью системы быстрой смены раствора, основанной на двойной пипетке приводимой в движение пьезо-элементом (Рис. 1). Перед подачей агонисга, клетки выдерживались по крайней мере 30 с в контрольном растворе (соответствующий наружный раствор без агониста). Время полной смены раствора, измеренное при переключении растворов с 140 мМ NaClfia 140 мМ КС1 составляло 2 мс для открытой пипетки и 10 мс для конфигурации "whole-cell".
Сбор и обработка данных.
Вольт-амперные характеристики (ВАХ) получали измерением амплитуды тока либо при дискретных значениях мембранного потенциала, либо при пилообразном изменении потенциала в диапазоне ±100 мВ в течение 2 с. В последнем случае результирующая ВАХ получалась вычитанием ВАХ, полученной в отсутствие агониста из ВАХ полученной во время постоянной составляющей тока, активированного агонистом. Оцифрованные кривые усреднялись через 4 мВ и эти усредненные значения использовались для аппроксимации кривых полиномиальными функциями. Эти полиномиальные функции использовались для определения потенциалов реверсии и хордовых проводимостей при заданных потенциалах. Активированные агонистами токи оцифровывались и хранились в компьютерной системе VME-bus и анализировались после эксперимента. Перед оцифровкой (с частотой 10 кГц) токи фильтровали с частотой 1-2 кГц (-ЗдБ). Временной ход десенситизации тока аппроксимировали экспоненциальной функцией используя Симплекс метод. Для определения потенциалозависимости проводимости каналов применяли ступенчатое изменение потенциала. Ступенька потенциала длительностью 50 мс подаваясь от поддерживаемого потенциала 0 мВ до заданного значения. Токи, измеренные в ответ на ступеньку потенциала в отсутствие агониста вычитались из ответов на ступеньку потенциала, зарегестрированных во время стационарной составляющей активированного агонистом тока. Токи в течение импульса потенциала аппроксимировались выражением
l=J0e-t/T+B,
где t-время, Т-постоянная времени, 10-экстраполированная амплитуда тока к началу импульса потенциала (мгновенное значение тока), BJ
амплитуда тока в конце импульса. 10 использовали для построения мгновенной DAX, В - для построения стационарной ВАХ. В данной серии экспериментов токи фильтровали с частотой 4 кГц. Наличие тока утечки и емкостной составляющей не позволило провести точных измерений тока в пределах 1 мс от начала ступеньки потенциала.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
КЛАССИФИКАЦИЯ СУБЪЕДПНИЦ ГЛУТАМАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ.
К. настоящему времени клонировано более 14 субъединиц ионотропных глутаматных рецепторов (Hollmaii et al., 1989, Nature, 342, 643; Keinanen et al., 1990, Science, 249, 556; Bettler et al., 1990, Neuron, 5, 583; E^ebjerg et al., 1991, Nature, 351, 745; Bettler et al., Neuron, 8, 257; Werner et al., 1991, Nature,-35\, 742; Herb et al., 1992, Neuron, 8, 775; Moryoshi et al., 1991, Nature, 354, 31; Monyer et al., 1992, Science, 256, 1217; Meguro et a!., 1992, Nature, 357, 70). Согласно гомологичности их структуры и функциональным свойствам их можно разделить на три семейства: АМРА рецепторы, Каинатные рецепторы и NMDA рецелторы (Рис.2). Семейство АМРА рецепторов включает в себя 4 субъединицы обозначенные здесь как GluR-A, -В, -С, -D (по другой номенклатуре GluRl, 2, 3, 4). Рецепторы этого семейства имеют высокую афинность к АМРА, активируются также глутаматом и каинатом. Характерной особенностью каналов, образованных из этих субъединиц является быстро
десенситизуруюшийся ответ при аппликации глутамата или АМРА и недесенситпзирующийся каинатный ответ. Анализ молекулярных и функциональных свойств субъединиц этого типа выявил, что каждая из субъединиц имеет участок из 38 аминокислот между предполагаемыми трансмембранными сегментами ТМЗ и ТМ4, который может иметь два варианта аминокислотной последовательности, контролируемых альтернативным "сплайсингом".
NMDA family
NR1
NR2 -А; -В; -С, -D
QluR
AMPA family
GluR -А; -В; -C; -D (or-1; -2;-3; -4)
KA family
GluR -5; -6; -7
KA1; KA2
Рис.2. Классификация глутаматнмх рецепторов. Справа указан процент гомологичности структуры субъеднниц внутри каждого семейства. Гомологичность структуры между семействами составляет 20-45%.
Эти два варианта были названы "flip" и "Пор" (Г). Основное функциональное различие между этими двумя вариантами заключается в Том, что активируемый глутаматом ток в первом случае десенситтоирует до некоего постоянного уровня, в то время как "flop" субъединицы десенситизируют до уровня нулевого тока. В семейство Каинатных рецепторов входят субъединицы GluR-5, -6, -7 и КА1 и КА2. Все они характеризуются высокой аффинностью к каинату. При этом только субъединицы GluR-5 и GIuR-6 способны образовывать функциональные каналы. Каналы образованные из этих субъединиц (Рис.3) характеризуются десенситизирующимся каинатным ,, ответом (4,5,10). Важно отметить также, что GluR-6 каналы не отвечают на апшшкацию АМРА. Что касается остальных
* Номера в скобках соответсвуют собствен ным публикациям приведенным в конце работы .
членов семейства кашттных рецепторов, то хотя они и не образуют
АМРА.КА receptors
Kainate
L-glutamate or AMPA
GluR-A,-B, -C,-D
Hip
Hop
Glu'R5
r
GluR6
L-glutamate
AMPA
AMPA
GJuRS/KA-2
Рис.З. Записи токов в ответ на быструю подачу агонистов различных глутамантных рецепторов АМРА и каинатного типов. Линии над каждой записью указывают на продолжительность аппликации агонистов. Мембранный потенциал -60 мВ.
каналов сами по себе, однако при коэкспрессии с субъединицами С1и11-5 и 01иК-6 они модифицируют свойства последних (5). Следует отметить, что КА1 и КА2 субъединицы образуют гетеромерные каналы только с в1иЯ-5 и вШИ-б. Поэтому мы объединили эти два типа субъединиц в одно семейство каинатных рецепторов.
Семейство ЫМйА рецепторов включает в себя субъединицы N1^1 и N112А, В, С, О. При коэкспрессии субъединицы N111 и какой либо из субъединиц N¡12 А, -В, -С или -О образуются каналы различающиеся по кинетике активированного глутаматом тока (Рис.4) и чувствительности их к блокированию ионами
NMDA receptors NMOA/glycina L-glutamate/glycine
NR1-NR2 wJ WfflP \ —
NR1- I NR2A J NR1- /----"" NH2D .....'
Рис. 4. Записи токов через различные комбинации субъединиц рецерторов.
Однако основные характерные свойства N М РЛ рецепторов, а именно, медленная кинетика активированного глутаматом тока, высокая проницаемость для ионов Са2+, чувствительность к глицину и потенциале- зависимость магниевого блока сохраняются для всех комбинаций субъеднннц (7). Следует отметить, что из всех субъединиц N М ПЛ типа, только N111 формировала гомомерные каналы при только экспрессии в ооцнгдх (МопуояЫ а а1, 199!, Ипшге, 354, 31). Субгединицы N112 экспрессировались только в
сочетании с ЫК1 как в ооцитах так и в фибробластах. Это указывает на то, что натлвные ЫМОА рецепторы, по-видимому, являются каналами гетеромерной структуры, причем субъединица N111 является обязательным компонентом.
При всем многообразии субъединиц глутаматных рецепторов и различии их свойств, структурно все глутаматные рецепторы можно объединить в одно супер семейство. По современным представлениям все глутаматные рецепторы имеют 4 трансмембранных участка с N и С терминалами обращенными наружу. Каналы глутаматных рецепторов, по-видимому, образуются из 5 субъединиц (Рис.5), при этом трансмембранный сегмент ТМ2 является участком, формирующим ионную пору. Свидетельства в пользу этого утверждения будут приведены в дальнейшем изложении при анализе структуры и функции глутаматных рецепторов.
в^исШге о1 АМРА/КА-еМата1е гесерЮгэ
01иИ-сЬапгк||
Рис.5. Схематическое представление структуры каналов глутаматных рецепторов и расположение в мембране транс.чеыбранных участков отдельной субьединшЦл (на примере, субъединиц АМРА-Каинатного типа). Количество трансмембранных участков и их взаимное расположение предполагается на основе анализа индекса пщропатии.
ОСНОВНЫЕ СВОЙСТВА ПРОХОЖДЕНИЯ ИОННОГО ТОКА ЧЕРЕЗ РЕКОМБИНАНТНЫЕ ГЛУТАМАТНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ АМРАТИПА.
Вольт-амперные характеристики субъединиц AM РА типа.
Быстрая подача 300 мкМ тлугамата на клетки, трансфектировнные сДНК, кодирующей гомомерные GluR-A, -В, -С и -D рецепторы (в версии "flip"), вызывала ток, состоящий из пиковой компоненты быстро спадающей до некоторого постоянного уровня. Отношение пикового тока к постоянной составляющей варьировало от 2,5 до 8 в зависимости от субъединицы. Вольт-амперная характеристика (ВАХ) для GluR-A каналов имела сложный характер, демонстрируя при отрицательных мембранных потенциалах аномальное выпрямление, а при потенциалах более чем +60 мВ нормальное выпрямление. Мы назвали такой тип ВАХ двойным выпрямлением (Рис.бА), Аналогичные ВАХ были зарегистрированы для двух других субъединиц GluR.-C и -D (Таблица 2). Однако для GluR-B каналов ВАХ .имела характер нормального выпрямления в диапазоне потенциалов ±80 мВ (Рис.бВ). Для каждой из субъединиц характер ВАХ для пиковй и постоянной составляющих тока был одинаков. Это обстоятельство позволило в дальнейшем для определения ВАХ использовать пилообразную стимуляцию.
-И
А
В
Рис.6. Зависимость характера ВАХ от типа субъсдишщ глугаматных рецепторов. Данные из экспериментов «а клетках трансфектированных одиночными субъедняицами 01иЯ-А (А) и 01иЯ.-В (В). ВАХ были получены при быстрой подаче 300 мкМ глугаМата при различных значениях поддерживаемого мембранного потенциала. В каждой секции записи токов показаны слева, а соответствующие ВАХ для пиковых (•) и постоянных (О) компонент тока - справа. Сплошными линиями показаны полиномиальные функции, экстраполирующие соответствующие экспериментальные точки. В каждом случае аналопгшые данные получены на 3-4 других клетках.
Рис.7. Записи токов и соответствующие ВАХ для пиковых (•) и постоянных (О) компонент тока для комбинаций субьеднниц ОиИ-АД) (А) И СНиЯ-А/В (В). Экспериментальные условия такие же как и нз Рис.}.
Коэкспрессия вЫЯ-А и -О субъединиц приводила к формированию гетероМерных каналов 01иЯ-А/0, демонстрирующих ВАХ с двойным выпрямлением, аналогичную ВАХ гомомерных составляющих (Рис.7А). Однако гетеромерные каналы, сформированные из субъединиц вЬЯ-А и 01иЯ-В (вЫЯ-А/В) имели ВАХ подобную той что и ОиЯ-В (Рис.7В). Эксперименты, проведенные с помощью пилообразной подачи мембранного потенциала показали, что при совместной экспрессии двух субъединиц результирующие гетеромерные каналы имеют простую ВАХ с нормальным выпрямлением только если СТиЯ-В является частью рецептора (Таблица 2). В противном случае имеют место ВАХ
5-£426
с двоимым выпрямлением. Эти данные предполагают, что GluR-B субъединица определяет характер ВЛХ гетеромерного ансамбля. Схожесть форм ВЛХ GluR-B и GInR-A/B указывает также на то, что при коэкспрессии GluR-A и GluR-B субъединиц гомомерные GluR-A каналы практически не формируются или их образуется слишком мало.
Таблица 2. Характер выпрямления ВАХ различных субъдиниц ыутаматиых рецепторов АМРА типа. Данные получены аз стационарных БАХ, измеренных при пилообразном изменении мембранного потенциала. Отношение хордовых проводнмостей G+80/G-80 отражает форму ВЛХ. Отношения меньше чем 1 указывают на аномальное выпрямление во входящем направлении тока в диапазоне потенциалов -80 мВ и +S0 мВ. Отношения больше чем 1 указывают па нормальное выпрялыение ВЛХ в выходящем направлении тока. ВАХ с двойным выпрямлением имели величину отношения существенно меньше ¡.Числовые значения отношений представляют собой среднее ± SEM из числа клеток указанных в скобках. ND - отношение не вычиогялось.
Субъедшшца G+sn/G.sn G i ¡¡(l/G_so
Глутамат (300 мкМ) Каинаг (ЗООмкМ)
GluR-A / 0,07 + 0,045 (5) 0,206 ± 0,125 (7)
GluR-B 2,65 ± 0,51 (5) 2,87 ± 1.04 (4)
GluR-C 0,219 + 0,138 (4) ND
GluR-D 0,125 ± 0,034 (5) 0,122 ± 0,048 (5)
GluR-A/B 2,02 ± 0,27 (5) 1,9 ± 0,14 (9)
GluR-A/C 0,45 (1) ND
GluR-A/D ■ 0,108 ± 0,037 (4) 0,09; 0,1 (2)
GluR-B/C 1,5 ± 0,46 (4) ND
GluR-B/D 2,2 ± 0,16 (9) 2,28 ± 0,46 (4)
В отличие от гомомерных каналов ВАХ пиковой и постоянной компонент для комбинации ОиИ-А/В отличались друг от друга. Для количественного описания этого различил мы вычислили отношение хордовых проводнмостей, измеренных при потенциалах +80 мВ и -80. мВ (С-|-8о/С_8о)> 4X0 является мерой потенциалозависимости активируемого агонистом тока. В 5 клетках, экспрессирующих А/В каналы это огношенне составляло 1,77 + 0,26 (среднее ± Б.Е.М.) для пиковых значений тока и 2,72 ± 0,4 для постоянной составляющей (Р <0,05, парный Ьтест). Такое различие предполагает,
что б гетеромерных (ЛиК-А/В каналах быстро десенситизирующийся пиковый ток обусловлен конформационным состоянием канала, отличающимся от состояния, проводящего постоянную составляющую тока. Степень десенситизации вызванной 300 мкМ глутамата при -60 мВ также была существенно различной для гомомерных С1иЯ-Л и СНиИ-В и гетеромерных ОЬК-А/З каналов. В каждом случае временной ход десенситизации пикового тока описывался одной экспонентой с постоянными времени: 6,5 ± 0,56 мс (и=9) для вШ-А; 35,9 ± 9,8 мс (п=3) для вЬЯ-В и 16,9 ± 2,3 мс (п=6) для 01иН.-А/В каналов. Тот факт, что для С1иЯ-А/В каналов десенситизация была моноэкспонснциальной с промежуточной постоянной времени указывает на то, что ток в этом случае не является просто суммой токов через гомомерные каналы С1иЯ-А и 01иК-В, и, следовательно, эти субъединицы при коэкспрессии действительно формируют канал гетеромерной структуры.
Структурные детерминанты характера ионного тока через
рекомбинантные АМРА рецепторы.
Мы показали, что характеристики ионного тока через 01и11-В каналы отличаются от характеристик тока через 'каналы, сформированные из субъединнц С1иЯ-А, -С или -О, и что наличие 01(1 IV В определяет В АХ гетеромерных каналов. Анализируя первичную структуру рецепторов, мы обнаружили, что трансмембранный участок ТМ2, который предположительно (по аналогии с ацетилхолиновыми рецепторам») может участвовать в формировании ионной поры, идентичен для каждой из четырех субъединиц по всей длине за исключением одного места. В позиции 586 аминокислотной последовательности 01иК-В(Я5Я6) содержит положительно заряженную аминокислоту аргинин (К), в то время как в субъединицах 01иК-Л, -С или -О, в гомологичных позициях находится нейтральная аминокислота глутамин (0) О1иК-А(0582), -0(0590) и -0(0587) (Рис.ЯА). Используя технику точечной мутации, для субъедшнщ С1иК-И и С1иЯ-0 нам удалось получить субъединицы мутанты, в которых соответственно аргинин был заменен на глутамин О1иК-В(К5860) и наоборот аиК-0(0587К). Форма ВАХ для субъединиц мутантов при такой замене обратимо изменилась (Рнс.8В и С). Теперь мутированные каналы ОШК-В(1Ч58б(3) имели ВАХ с
двойным выпрямлением, в то время как мутированные каналы Ок1И-Г(р58711) имели ВАХ с нормальным вынрямлением.
GIliR
Рис.8. Отличие в одной аминокислоте в трансмембранном ееаменте ТМ2 изменяет ВАХ. (At Наверху показана схематическая диаграмма первичной структуры су&ъединицглутамалшх рецепторов АМРАти па, показывающая взаимное расположение трансмембранных участков. Вишу раскрыта последовательность аминокислот в сенменте ТМ2. Различие между субъединицами GluR-B и остальными, только в одной аминокислоте (полная последовательность аминокислот для всех субъсдиниц приведена в работе Keinanen et al.; 1990, Science, 49, 556)
(А) Влияние на форму вольт-амперной характеристики мутации субъединицы GluR-B (верхняя ВАХ) в сбъеднницу мутант GluR-B(R586Q) (нижняя ВАХ). Каждая ВАХ получена при пилообразном изменении мембранного потенциала на одиночной клетке. (С) Данные эксперимента аналогичного показанному в (А) с нсмутированной субъединицей GluR-P (верхняя ВАХ) и мутантом GluR-D(Q587R) (нижняя ВАХ). В каждом из экпериментов п качестве дгониета применялся тлутамат (300 мкМ). Эти и аналогичные кривые были использованы для вычисления отношений хордовыо проводимостей, приведенных в Таблицах 2 11 3.
Рис.9. Аршмин в трансмембранном участке ТМ2 доминирует в поведении гетеромерных каналов.
(А) Наложенные ВАХ, полученные с помощью пилообразного изменения мембранного потенциала на двух разных (слетках, экспрессирующих либо 01иК-В/П либо 01ий-В(Н5860)/О (С1иЯ-В*/0) каналы.
(А) ВАХ, полученная на клетке, экспресирующей гетсромериую комбинацию мутантов аиЯ-В(К58б<})и 0ШЯ-0(Р587К) (СЬЯС'/О*). Эта комбинация также содержит аргинин, привнесенный мутантом
Поскольку ВАХ постоянной составляющей тока через гетеромерные глутаиатные рецепторы аналогичны ВАХ для GluR-B каналов, мы решили выяснить обусловлено ли это "доминирование" самой субъединицей (т.е. избытком субъединицы GluR-B в teiepoMepiioM ансамбле) или наличие аргинина в ТМ2 доминантно определяет свойства гетеромерного канала. Для этого мы исследовали ВАХ гетеромерных комбинаций, в которых одна или обе составляющие субъединнцы были мутантами (Рис.9, Таблица 3). Результаты этих экспериментов показывают, что гетеромерные каналы имеют ВАХ с нормальным выпрямлением если в ансамбле присутствует субьединица, содержащая аргинин, независимо от того будет ли это GluR-B или мутант GluR-D. Наиболее наглядно это показано в случае, когда гетеромерные каналы образованы обоими мутантами. Так каналы GluR-B(R586Q)/D(Q587R) имели ВАХ с ярко выраженным нормальным выпрямлением (Рис.9В). Эта ВАХ практически не отличается от ВАХ для соответствующей комбинации пемутрованных субъедшшц (Рис.9А). Однако комбинации субьединиц, несодержащих аргинин в ТМ2 сегменте (например, GhiR-B(R586Q)/D (Рнс.9А) всегда имели ВАХ с двойным выпрямлением.
Таблица З.Характер выпрямления стационарные ВАХ для мутированных субъедшшц глутаматных рецепторов АМРА типа и комбинаций, содержащих по крайней мере одну мутированную субъедишщу. Подробнее смотри описание к Таблице 2.
G+80/G-80 G+80/G-80
Субъединицы Глутамат (300 мкМ) Каннат (ЗООмкМ)
GluR-B(R586Q) 0,106 ± 0,042 (6) 0,055 ± 0,031 (4)
GluR-D(Q587R) 1,52 ± 0,1 (3) 1,63 ± 0,13 (5)
GluR-B/D(Q587R) 1,65 ± 0,28 (3) 1,56 ± 0,18 (3)
GluR-B(R586Q)/D 0,058; 0,83 (2) 0,023; 0,31 (2)
GluR- B(R586)/D(Q587R) 1,44 ± 0,15 (5) 1,61 ± 0,2 (5)
GluR-A/B(R586Q) 0,27 + 0,1 (3) 0,12 ±0,06(4)
GluR-A/D(Q587R) 1,08 ±0,08(3) 1,59 ±0,15(3)
GluR-B/'B(R586Q) 2,32 ± 0,28 (3) 2,35 ± 0,14 (3)
GluR-D/D(Q587R) 1,14 ±0,08 (4) 1,86 ±0,05(4)
Различия в характере 11ЛX между субъедииидами С1ий-В и С1иК-0 определяетются потенцналозависимостью проводимости каналов.
Форма ВАХ, измеренной на целой клетке определяется потенпиалозависимостью проводимости одиночных каналов и потенцилозависимостыо кинетики открывания и закрывания канала. Для выяснения причины различия ВАХ для разных субъединиц мы провели эксперименты со скачкообразным изменением мембранного потенциала. В этом случае потеншшозависимость проводимости канала должна определяться мгновенной ВАХ, для которой амплитуда тока измеряется сразу же после скачка потенциала, потенциалозависимость же кинетики открывания и закрывания канала определяется релаксацией тока до нового стационарного состояния и стационарной ВАХ. Гомомерные С1иК-В канаты демонстрировали незначительную релаксацию тока и имел» мгновенную ВАХ с несущественно меньшей кривизной чем у . шционарной ВАХ (Рис.ЮА). Таким образом, каналы, образованные субъединицей С1иИ-В нмеюг ВАХ линейную или с небольшим выпрямлением в выходящем направлении тока. Это указывает на то, что их проводимость практически не зависит от потенциала. Токи через гомомерные каналы СТий-О также имели лишь незначительную релаксацию (Рис. 10В) и их мгновенная ВАХ имела 'двойное выпрямление. Это указывает на то, что проводимость этих каналов является потенциалозависимой и, по-видимому, определяет вид стационарной ВАХ. Аналогичную мгновенную ВАХ имели С!и(1-А каналы. С1и[1-В/0 каналы демонстрировали большую релаксацию тока и их мгновенная ВАХ была практически линейной (Рис. ЮС). Эти данные предполагают, что различие формы стационарных ВАХ гомомерных С1иЯ-В каналов и гомомерных 01иК-А и -Б, а также и ОиЯ-С каналов главным образом обусловлено различием потенциалозависимости их проводнмостей. Доминирование субъедкницм С!иК-П в гетеромерных каналах может быть связано с ее доминированием в определении потенциалозависимости проводимости капала. Однако, в виду того, что ВАХ для одиночных каналов не была построена, иа-аа малой проводимости одиночных каналов (~ 1 пС), существует возможность наличия быстрой релаксации (<1 мс), которая не могла быть измерена в ' наших экспериментальных условиях.
В
С
Рис.10. Потенииалозашсимая проводимость каналов определяет различие в форме стационарных ВАХ между GluR-B и GluR-D каналами. Вольт-амперные кривые были построены с использованием скачкообразною изменения мембранного потенциала (А) для GluR-B, (В) для GluR-D и (С) для GluR-B/D каналов. Слева показаны записи токов в ответ на скачки потенциала (схематически показанные выше записей тока) от 0 мВ до ±80, ±60, ±40 и ±20 мВ. Результирующие мгновенные (•) и стационарные (О) ВАХ показаны справа. Сплошными линиями показаны кривые полиномиальных функций, экстраполирующих экспериментальные- точки. Для GluR-Б и GluR-B/D каналов стационарные ВАХ имеют более ярко выраженное выпрямление в выходящем направлении тока чем мгновенные ВАХ. Степень выпрямления (G+-80/G-80) для GluR-B в данном случае, составляла 1,85 для стационарного, тока и 1,55 для мгновенного тока. Для GluR-B/D эти величины были соответственно 1,72 и 1,2. Для GJuR-D это отношение было практически одинаковым в обоих случаях и составляло 0,.08. Аналогичные результаты б' ми получены на 2-3 других клетках для каждой из комбинаций субъсдиниц.
Приведенные данные показывают, что ионный транспорт через рекомбинантные глугаматные рецепторы AMPÁ типа критически зависит от аминокислотной последовательности трансмембранного сегмента ТМ2. Аргинин, размещенный внутри этого сегмента ближе к внеклеточному концу определяет форму ВАХ с нормальным выпрямлением как для гомо^ерных, так и гетеромерных каналов. Выпрямление проводимости в никотиновых ацетилхолиновых рецепторах зависит. от раатичных аминокислотных остатков в М2 транемембранком сегменте их субъединиц (Imoto el al., 198S, Nature, 335, 6191; Vjllaroei et al., 1991, Croc. Я So с Londoñ, Ser. В, 243, 69). При этом если свободный заряд кольца из аминокислот на внешней стороне М2 сделать более положительным, отрицательный участок ВАХ для одиночных каналов становится менее крутым. Полученные нами результаты могут быть интерпретированы аналогичным образом. Изменение заряда сегмента ТМ2 нд более положительный путем замены определенных аминокислот (глутамина на аргинин), приводит к менее крутой ВАХ при отрицательных потенциалах. Таким образом, наши данные подтверждают точку зрения о том, что сегмент ТМ2 глугаматных рецепторов АМРА типа пронизывает мембрану и формирует часть поры ионного канала. Большинство нативных АМРА рецепторов имеют линейную ВАХ или ВАХ с нормальным выпрямлением (Mayer and Weátbrook, 1987, Progr. Neurobiol., 28, 197). Наши данные предполагают, что эти рецепторы должны содержать субъединицу GluR-B. Однако не исключено, что может быть найдена другая субъединица, имеющая аналогичные свойства. С другой стороны в субпопуляции культивированных нейронов гиппокампа активируемый кап патом ток имел ярко выраженное аномальное выпрямление (lino et al., 1990, J.Physiol. (London), 424, 151). Эти глутаматные рецепторы, по-видимому, не содержат GluR-B. Свойства рекомбинантных гетеромерных глугаматных рецепторов (содержащих GluR-B) сравнимы со свойствами нативных глугаматных рецепторов не-NMDA типа, например в нейронах гиппокампа. В пирамидальных нейронах гиппокампа крысы в участке САЗ ВАХ для пиковых значений тока имеет меньшую кривизну чем ВАХ постоянной составляющей, временной ход десенситизации быстрого тока аналогичен таковому для гетеромерных GluR-A/B каналов (12). Возбужденный постсннаптическии ток (ВПСТ) в пирамидальных нейронах участков CAI и САЗ также демонстрируют линейную ВАХ
.7-6^26
(Sah et al., 1990, J.Physiol. (London), 430, 605). Представляется весьма вероятным, что потенциалозависимые свойства ВПСТ, пропускаемого не-NMDA рецепторами, определяются субъединицей GluR-B.
ПРОНИЦАЕМОСТЬ АМРА РЕЦЕПТОРОВ ДЛЯ ДВУХВАЛЕНТНЫХ ИОНОВ ОПРЕДЕЛЯЕТСЯ РЕДАКТИРОВАННОЙ ФОРМОЙ СУБЪЕДИНИЦЫ.
Редактированные и нередактированные варианты субъединицы GluR-B.
В гегеромерных ансамблях Из субъединиц АМРА рецепторов, GluR-B субъедгшица определяет свойства прохождения моновалентных ионов наличием аргинина в определенном месте трансмембранного' сегмента ТМ2. Как оказалось, аргинин в этой позиции не кодируется GluR-B геном, а вводится путем редактирования мРНК для GluR-B и заменяет кодируемый геном глугамин (Sommer et al., 1991, Cell 67, 11). Анализ сДНК, сконструированной с помощью полииеразной цепной реакции (ПЦР) по РНК из эмбрионального мозга показал, что это редактирование регулируется возрастными изменениями. На ранних стадиях развития (Э 14 и П 0) небольшой процент GluR-B мРНК не претерпевает редактирования (Рис. НА) и, следовательно, в эмбриональном мозге экспрессированы GluR-B субъединицы с ТМ2 сегментом идентичным таковому субъединиц GluR-A,-C и -D и они сосуществуют вместе с редактированной формой.
Проницаемость гомомерных АМРА рецепторов для двухвалентных ионов.
Проницаемость гомомерных каналов, образованных . Из редактированной и. нередактированной субъединиц. GluR-B
иллюстрирована на Рис. 1]В-НЕ. На Рис.11 В и 11D показаны записи токов, активированных Глутаматом при мембранном потенциале -60 мВ в "натриевом" и "кальциевом" наружних растворах. На клетках, экспрессирующих редактированную GluR-B(R) субьединицу входящий ток регистрируется в "натриевом" растворе и не регистрируется в "кальциевом" (Рис. И В). В то же время на клетках, экспрессирующих нередактированную GIuR-B(Q) субъединицу входящий ток может бить зарегистрирован как в "натриевом" так и в "кальциевом" растворах (Рис.1Ш). Соответственно клетки, экспрессирующие эти два типа GluR-B каналов имеют существенно различную проницаемость для двухвалентных ионов по отношению к моновалентныц ионам. Это.видно из различия в сдвиге потенциалов реверсии тока при изменении наружного раствора с "натриевого" на "кальциевый" или "магниевый". Например, в клетках экспрессирующих GluR-B(R) субъединицу потенциал реверсии сдвигался с -1,24 ±1,8 мВ к -50,8 ± 1,9 мВ (п=3) в "кальциевом" растворе и даже к более отрицательным значениям в "магниевом" растворе (Рис.11С; Таблица 4), указывая на то, что этот гомомерный канал имеет низкую проницаемость для двухвалентных катионов по отношению к моновалентным (PCa/f'Cs- ",05; P(víg/PCs: 0.018; 0,025). •В отличие от этого, в клетках, экспрессирующих гомомерный GIuR-B(Q) канал, имеющих ВАХ с двойным выпрямлением в "натриевом" растворе, потенциал реверсии сдвигался с -9,3 ± 5 мВ (п=7) к +10,3 ± 2,5 мВ (п=6) при изменении наружного раствора с "натриевого" в "кальциевый" (Ряс.НЕ). Это указывает на то, что гомомерные каналы, образованные нередактированнон субъединицей GluR-B(Q) характеризуются высокой проницаемостью двухвалентных ионов по отношению к моновалентным (PCa/^Cs-' '>2; P¡Vfg/PCs: 0,8) (Таблица 4). Подобное соотношение проницаемостей наблюдалось в клетках, экспрессирующих гомомерные GluR-A и GtuR-D каналы (Таблица 4). При этом введение аргинина вместо глутамина в позиции Q/R сегмента ТМ2 в GluR-D(Q587R) канале полностью изменяло такое поведение, приводя к низкой проницаемости для двухвалентных ионов в мутированной субъединице (Таблица 4). Сравнимая форма ВАХ, измеренных в "кальциевом" и "магниевом" растворах для субъединиц GluR-B(Q), GluR-A, GluR-D с одной стороны и GluR-B(R) и GluR-D(Q587R) с другой стороны, подтверждает тот факт, что гомомерные каналы образованные из субьединиц АМРА рецепторов,
не имеющих аргинин в ТМ2 сегменте имеют высокую проницаемость для двухвалентных ионов. Таким образом, в глутаматных рецепторах АМРА типа аминокислотный остаток (аргинин или глутамин) в позиции Q/R трансмембранного участка ТМ2 является основным детерминантом проницаемости для двухвалентных ионов. Наши данные расширяют результаты предыдущих работ, демонстрирующих, что в ооиитах Са2+ ток пропускается через гомомерные GluR-A каналы и не проходит через гетеромерные каналы, содержащие субъединицу GiuR-B(R) (HoHmann et ni.,1991; Science 252, 851 Hume et al., 1991, Science, 253, 1028). Однако, гомомерные GluR-B каналы не были охарактеризованы, кроме того в ооцитах точное определение Са2+ проницаемости затруднено влиянием нативного хлорного тока, активируемого ионами Са^+проходящими через глугаматные рецепторы.
Таблица 4. Потенциалы реверсии активируемого глутаматом (300 мкМ) тока о "кальциевом" (110 мМ Саи "магниевом" (110 мМ Alg^J наружных растворах. В пипетке внутриклеточный раствор (140 мМ CsВеличины представляют среднее ± SEM для числа клеток, указанного в скобках. ND - величина не измерялась. /
Потенциал реверсии (мВ) Потенциал реверсии (мВ)
Субъединица Ca2+/Cs+ Mg2+/Cs+
GluR-B(Rl -50,8 + 1,9 (3) -74; -67 (2)
GIuR-B(Q) 10,3 ±2,9 (6) 1,9; 5,8 (2)
GluR-A 13,0 ± 5,0 (9) 2,1; 6,4 (2)
GluR-D 12,7 ± 2,3 (8) 4,9 ± 0,7 (3)
GluR-D(Q5S7R) -48,4 (1) -44 (1)
GluR-B(R586N) 21,6 ± 1,5 (3) -8,6 ± 3,6 (3)
GluR-D(Q587N) 17,0 ± 2,5 (7) -17,3 ± 5,6 (5)
GluR-B(R)/D -50,7 ± 2,6 (8) -51,5 ± 9,8 (4)
GluR-B(Q)/D(Q5S7R) -58,6; -48,9 (2) -55; -48,9 (2)
GIuR-B(R)/B(Q) -53,4 ± 3,4 (7) ND
A N
I II III
H H_H_]~
IV
-O c
edited ...FGIFNSLWFSLGAFMRQG...
unedited ...FGIFNSLWFSLGAFMQQG...
GluR-B
early late +
(-99%) (>99.99%)
+ +
(~ 1%) (< 0.01%)
300|iML-Glu
Ca
c l(pA) T 600
GluR-B(R)
It
' Tc»ICa 0
300 fiM L-Glu
l(P») t 1000
ci -1
1O0 pA
GluHB(Q)
—f-- 1 100
s jMglCs/
g r/\V'
1 CilCs
—i
9-6*26
Рнс.И. Расположение позиции (2/Л в ТМ2 сегменте м различие в проводимости и проницаемости для двухвалентных ионов гомомерных каналов, образованных из редактированной С1ч[1-В(К) и [«редактированной 01ц11-В((Э) субеъдшпщ.
(A) ТМ2 сегмент редактированной и нередакгированной форм субъединицы С1иН-В. Справа показан средний процент редактированной и нередактированной форм субъелиницы С1иК В, определенный с помощью ПЦР анализа мРНК из мозга крысы и мыши для ранней (Э14 и ПО) и поздней (П8) стадии развития.
(B) Записи токов в отпет на быструю подачу 300 мкМ глутамата в "натриевом" и "кальциевом" растворах на клет клх, экспрсссируюпч'"' гомомерные 01 и К-В( К) каналы. Мембранный потенциал -60 мВ.
(C) Проницаемость 01иК-В(Я) каналов для двухвалентны.! ионов по отношению к моновалсшным. ВАХ для постоянной составляющей активированных глутаматом (300 мкМ) токов в "натриевом", "катьцисвом" и "магниевом" порухи их растворах получены с помощью вилообразного изменения мембранного потенциала.
На вставке показан участок ВАХ в увеличенном масштабе. Гладкими линиями показаны полиномиальные функции экстраполирующие экспериментальные кривые. Стрелки укалывают на интерполированные потенциалы реверсии для соответствующих ионов (-67,1 мВ для и -52,6 мВ для Са^+).
(I)) Записи токов в ответ на быструю подачу 300 мкМ глутамага в "натриевом" и "кальциевом" растворах на клетках, экспрессирующих гомомерные б1иК-В((}) клналы. Мембранный потенциал -60 мВ.
(Е) ВЛХ для постоянной составляющей активированных глутаматом (300 мкМ) токов н "натриевом", "кальциепом" и "магниевом" наружних растворах для Слипов) каналов, ткгь (еные с помощью пилообразного изменения мембранного потенциала. На вставке показан участок ВАХ в увеличенном масштабе. Стрелки указывакгг ля интерполированные потенциалы реверсии для соответствующих ионов (5,8 мВ для КЬ21~ и 8,8 и В для Са2+).
I
Заряд и размер аминокислотного остатка в позиции (2/11 сегмента ТМ2 определяет проницаемость АМРА рецепторов для двувалентных ионов.
Для дальнейшего выяснения природы катонной проницаемости гомомерных глугаматньк рецепторов, мы исследовали свойства мутированных субъединиц С1иК-В или -О, которые содержали в О/К позиции ТМ2 аминокислоты лизин (К.), аспарагин (И) или глутаминовую кислоту (Е). Положительно заряженный лизин приводил к низкой проницаемости канала для двухвалентных ионов, аналогичной проницаемости 01иК-В(К) каналов. Присутствие нейтрального аспарагина, имеющего на одну СН2 группу меньше, чем глугамин, в О/К позиции приводило к тому, что оба мутанта 01иК-В(Я586Ы) и С1и11-0(Р587М) обладали высокой кальциевой проницаемостью (РсаАЧ^ 2,49 и 1,84 соответственно) (Рис.9А и 9В). Эти величины немного больше отношений для немутированных 01иК-Л и 01нК-0 и нередактированных С1иК-П(У) каналов (Таблица 4). В то же время проницаемость для ионов была существенно
меньше (Рис.12, Таблица 4). Таким образом, аспарапш в Q/R позиции производит канал, который предпочтительнее пропускает ионы кальция, а не магния. Отношение Pca/Pcs к '^Mg/l'Cs составляло 6,4 для GluR-B(R586N) и 7,7 для GluR-D(Q587N).
Рнс.12. (А) ВАХ для годгомерных 01иЯ-В(Я586М) каналов в "натриевом", "кальциевом" и "магниевом" иар'ужннх растворах. При замене аргинина на аспарапш в субъединице СкК-В Канал имеет ВАХ с иорьшьным выпрямлением в "натриевом" растворе, обладает высокой кальциевой проницаемостью и меньшей проницаемостью для ионов магния. Стрелки указывают на потенциалы реверсии для двухвалентных ионов (-5,1 мВ дли и 22,6 мВ для Са^+). (В) ВАК для гомомериых С1и!ЫЭ((}5в7М) каналов в "натриевом", "кальциевом" и "магниевом" наружних растворах Стрелки указывают на потенциалы реверсии для двухвалентных нонов (-13,3 мВ'для и 21,2 ыП для Са2+). Обратите внимание на практически одинаковую форму ВАХ для обоих мутированных каналов.
Введение глутамшювон кислоты в (}/Я позицию в С1иК-В и ОЬЛ-О ингибироъало экспрессию функциональных каналов. Таким образом, эти эксперименты показывают, что проницаемость для
двухвалентных ионов по отношению к моновалентным в томомерных AM РА рецепторах определяется как зарядом, так й размером аминокислотного остатка в Q/R позиции трансмембранного сегмента ТМ2. Положительный заряд аргинина делает канал практически непроницаемым для двухвалентных ионов. Тот факт, что при замене глутамина на аспарагин ВАХ имеет вид с нормальным выпрямлением, а проницаемость при этом для Са^+ остается высокой, указывает на то, что свойства выпрямления ВАХ и проницаемость для двухвалентных ионов обусловлены разными механизмами взаимодействия проникающих ионов и каналов. При этом оба этих механизма зависят от структуры ТМ2.
Проницаемость для двухвалентных ионов гетеромерных глутаматных
рецепт оров AM РА типа.
Во многих участках мозга транскрипции мРНК для разных субьсдиниц, включая GluR-B, обнаружены в разных относительных количествах (Keinanen et al.,1990, Science, 249, 556; Monyer et al.,1991, Nettron, 6, 799). Возникает вопрос являются ли каналы' в нативных нейронах гомогенной популяцией тетероиериых каналов, например, каналами типа GluR-B(R)/D, или они образованы суперпозицией нескольких типов глутаматных рецепторов При коэкспрессии сДНК, кодирующих GluR-B(R) и GluR-D- субъединицы, с высокой концентрацией рекомбинантных векторов (1мкГ на ячейку культуратыюй посуды), образуются гетеромерные каналы с новыми свойствами. Одним из таких свойств является временной ход десенситизации активированного глутамагом тока. Для гетеромерного канала временной ход спада пикового тока описывался одной экспонеитой с постоянной времени 14,9 ± 0,7 мс (п=17). Эта величина существенно отличалась от значений постоянных времени как для GluR-B(R) (32 ± 5,6 мс (п=5), так и для GluR-D (8 ± 0,7 мс (п=7). В отличие от десенситизации тока через гетеромерные GluR-B(R)/D каналы, которая отражает наличие новых свойств, присущих этому типу каналов, проводимость и проницаемость для' двухвалентных ионов этих каналов ¡были практически. идентичными таковым дгя GluR-B(R) каналов. В клетках экспрессирующих гетеромерные GluR-B(R)/D каналы; в "натриевом" растворе глутамат активировал как входящий так и выходящий токи, в то время как в
"кальциевом" растворе активировался только выходящий ток (Рис.1 ЗА).
Рис.13. (А) Записи интегральных токов в ответ на быструю аппликацию 300 мкМ глутамата на клетках котранефсктированных векторами с убт,единиц OluR-B(R) и GluR-D при потенциалах -50 и +50 мВ. Входящий и выходящий токи зарегистрированы в "натриевом" растворе. D "кальциевом" растворе входящий ток практически не регистрируется. Постоянные времени десенснтнзации тока в "натриевом" растворе 13,8 мс (-50 мВ) и 14,3 мс (+50 мВ) в "кальциевом" растворе 12,3 мс (+50 мВ).
(B) ВАХ для комбинации субьединиц GluR-(B) R/D в "натриевом", "кальциевом" и "магниевом" растворах. Соответствующие потенциалы реверсии 1.5 мВ, -53.7 мВ (отмечен стрелкой) и -49.8 мВ (отмечен стрелкой).
(C) ВАХ для комбинации субьединиц GIuR-(Q)D(Q587R) в "натриевом", "кальциевом" и "магниевом" растворах. Соответствующие потенциалы реверсии -0.4 мВ, -58.6 мВ (отмечен стрелкой) и -55 мВ (отмечен стрелкой).
При смене раствора с "натриевого" на "кальциевый", потенциал реверсии тока в клетках экспрессирующих эти каналы сдвигался с -1,9 ±1,9 мВ (п=8) к -50,7 ±'2,6 мВ (п=8) и к-51,5 ± 9,8 мВ (п=4) в
"магниевом" растворе (Рис.|ЗВ; Таблица 4). Таким образом, низкая проводимость и проницаемость для двухвалентных ионов гетеромерных GliiR-B(R)/D каналов определяется GluR-B(R) субъединицей. Проницаемость для двухвалентных ионов гетеромерных GluR-B(R)/D каналов может быть низкой или из-за того, что более эффективно транскрибируется мРНК для GluR-B(R) субъединицы, или из-за • того, что в гетеромерныи канал преимущественно инкорпорируется именно эта субъединица. Чтобы выяснить какая из этих причин является определяющей, мы исследовали проницаемость для двухвалентных ионов в клетках экспрессирующих нередактированнуш GluR-B(Q) субъединицу и мутированную субъединицу GluR-D(Q587R). На рис.ЮС показано, что Проницаемость для двухвалентных нонов в этом случае такая же низкая как и для гомомерных GluR-ß(R) каналов (Таблица 4). Этот результат предполагает, что низкая проницаемость гетеромерных каналов GluR-B(R)/D для двухвалентных ионов связана не с большим числом субъедиииц GluR-B в гетеромерном ансамбле, а скорее всего отражает функциональное доминирование субъединицы содержащей аргинин в сегменте ТМ2.
Таким образом при высокой концентрации векторов для двух субъединиц образуются гетеромерные каналы со свойствами, отличающимися от таковых для гомомерных каналов, образованных из составляющих их субъедиииц.
Совместная экспрессия гомомерных GluR-D и гетеромерных GIuR-
B(R)/D каналов в одной клетке.
В клетках трансфектированных с использованием меньшей концентрации вектора для субъедиииц GluR-B(R) и GluR-D (500 нГ или 100 нГ/на ячейку) наблюдалась промежуточная проницаемость для двухвалентных ионов. Из 35 тестированных клеток приблизительно половина демонстрировала низкую проницаемость для ионов кальция (потенциал реверсии в "кальциевом" растворе -49,9 ± 1,4 мВ (п=19). Однако в 16 клетках потенциал реверсии варьировал в пределах от-37 мв до +8 мВ, со средним значением -20,4 ± 2,9 мВ (п=16), указывая на промежуточную между гомомерными субъединицамн GlnR-B(R) и GluR-D проницаемость для двухвалентных ионов. Наличие клеток с промежуточной
проницаемостью может объясняться экспрессией гетеромерного капала нового типа. С другой стороны эго может быть связано с различной степенью экспрессии проницаемых юмомерных СЛиК-П каналов и непроницаемых С1н11-В(К) и 01иК-В(Я)/0 каналов. Для выявления вклада С1иЯ-0 каналов в проницаемость для двухвалентных ионов мы измерили временной ход десенситизации активированного глутаматом тока в "кальциевом" растворе при потенциале -50 мВ. Рисунки 14А и 14В иллюстрируют эксперимент на клетке, имеющей промежуточную кальциевую проницаемость (Рис.МА). Активируемый глутаматом ток, переносимый ионами Са2+ десенснтнзировался с постоянной времени 8 ±0,6 мс (п=3) (Рис.14В), Эта величина практически не отличается от таковой для клеток экспрессируюших гомомернне 01и11-0 канаты (7,4 ±1,4 мс п=3). С другой стороны, лыходяшпе токи при мембранном потенциале +50 мВ десенситнзировалисъ с постоянной времени 12 ± 1 мс (п=3), что не отличается от постоянной времени для гетеромерных С1иГ1-В(К)/0 каналов в аналогичных экспериментальных условиях (12,5 ± 1,2 мс (п=6). Таким образом. наиболее вероятным объяснением промежуточной проницаемости клеток, трансфектнрованных двумя векторами может быть то, что в этом случае экспрессируются как гомомерные С1иК-О так и гетеромерные 01иК-В(К)/П каналы, причем гомомерные С1иК-Г) каналы ответственны за заметную проницаемость для двухвалентных ионов.
Коэкспрессия редактированной и кередактированнон форм
субъединицы С1иК-В в одной клетке.
Для выяснения основы функционального доминирования редактированной С|иК.-И субъединицы при условии приблизительно одинакового количества двух субъедишш, одной содержащей аргинин, а другой не содержащей аргиНпна в ТМ2 сегменте, мы определили проницаемость для двухвалентных ионов клеток трансфектированннх векторами для ГЛиЯ-В(К) и О1иЯ-В(0) субъсдшшц при одинаковой концентрации векторов (1мкГ или 100 нГ на ячейку). Во всех тестированных клетках (п=7), кальциевая проницаемость была низкой (Рса/^Ся1 0,04) и несущественно отличалась от таковой для гомомерных 01"11-В(Г<) каналов (Рса/^Св1 0,05) (Рис.14С; Таблица 4). Это предполагает, что количество
гоиомерных рецепторов, проницаемых для двухвалентных ионов очень мало.
\ 1(РА)
6luR-B(R)/D
Ca/Cs |
-100
1200
В
ко
-1200
V (mV)
50 mV
100 рА
50 шз
GluR-B(R)/B(Q) 1:1 I (рА) 600
-100
^Ca/Cs
D
100 ^
V (mV)
J.-600
GluR-B(R)/B(Q) 1:10 I (рА) 180
V(roV)
-180
"Рис.14. Промежуточная кальциевая проницаемость клеток трансфекгированньй векторами для двух субьединиц, одна'из которых содержит аргинин в ТМ2 сегменте.
(A) ВАХ для клеток трансфектированных векторами, несущими сДНК для GluR-B(R) и GluR-D субьединиц'в "натриевом" и "кальциевом" наружних растворах. Потенциалы реверсии соответственно -2,2 мВ и -13,9 мВ (указан стрелкой).
(B) Записи активированных глутаматом токов с той же клетки, что и на (А), в "кальциевом" растворе при потенциалах -50 и +50 мВ. Постоянные времени десенсигизации тока 7,2 при -50 мВ и 11,1 при +50 мВ.
(C) ВАХ для клеток трансфектированных одинаковой концентрацией векторов, для GluR-B(R) и GluR-B(Q) субьединиц (100 нГ на ячейку) в "натриевом" и "кальциевом" наружних растворах. Потенциалы реверсии соответственно -1,7 мВ и -49,6 мВ (указан стрелкой).
(D) ВАХ для клеток трансфектированных высокой концентрацией вектора для GluR-B(Q) (1мкГ на ячейку) и низкой для GluR-B(R) субъединицы (100 нГ на ячейку) в "натриевом" и "кальциевом" наружних растворах. Потенциалы реверсии соответственно -2,3 мВ и -1,1 мВ.
Клетки демонстрировали заметную кальциевую проницаемость только когда коцентрация G)uR-B(R) вектора была уменьшена в 10 раз по сравнению с GluR-B(Q) (100 нГ и 1мкГ на ячейку соответственно). Однако даже при таком, существенно сниженном уровне GluR-B(R) только половина клеток (4 из 8 тестированных) имели промежуточную кальциевую проницаемость. Потенциал реверсии в "кальциевом" растворе варьировал от -31 до +б, 1 мВ (усредненное значение потенциала реверсии составляло -5,2 + 10,1 мВ (n=4), Pca/PCs: О.4?)- На pnc.HD показаны ВАХ для клеток с промежуточной кальциевой проницаемостью. ВАХ в "натриевом" растворе по форме напоминает таковую для клеток, экспрессирующих гомомернме GluR-B(R) каналы, в то время как кальциевая проницаемость является промежуточной.
Таким образом, различная степень экспрессии редактированной субъединицы GluR-B может приводить к разнообразию формы ВАХ активируемых г л у гам атом токов и разной проницаемости клеток для двухвалентных ионов. В большинстве нейронах экспрессированы каналы АМРА типа имеющие ВАХ с нормальным выпрямлением и низкую проницаемость для двухвалентных ионов. Наши данные предполагают, что это обусловлено экспрессией редактированной формы субъединицы GluR-B. Это подтверждается данными in situ гибридизации. Однако субпопуляшш культивированных нейронов из гиппокампа крысы характеризуется высокой проницаемостью для двухвалентных ионов вызванной каинатом (lino et al., 1990 J.Physiol. (London), 242, 151; Ozawa et al., 1991, J.Neurophysiol., 66, 2). И хотя эти клетки в целом имеют ВАХ с аномальным выпрямлением, в диапазоне потенциалов от +10 до +50 мВ имеется участок демонстрирующий выпрямление в выходящем направлении тока. Биполярные клетки ретины саламандры также содержат АМРА рецепторы с высокой проницаемостью'для двухвалентных ионов и их ВАХ имеет вид с нормальным выпрямлением (Gilberstou et al., 1990; Science, 251, 1613). Эти данные сравнимы с поведением клеток трансфектнрованных с низкой концентрацией векторов для GluR-B(R) и GluR-D или GluR-B(Q) и могут означать, что интегральный ток в этих клетках обеспечивается мозаикой «¿пропускающих и пропускающих ионы Са2+ каналов АМРА типа.
АМРА РЕЦЕГЦОРЫ С ВЫСОКОЙ СА^+ ПРОНИЦАЕМСТЬЮ В КЛЕТКАХ БЕРГМАНОВКОЙ ГЛИИ
Наиболее наглядно роль экспрессии редактированной формы субъединицы GluR-B(R) выявилась на клетках Бергмановской глии из мозжечка крысы. Эксперимента in situ гибридизации показали, что в клетках Бергмановской глии зкспрессированы только субъединицы GluR-A и GluR-D и не экспрессированл субъединица GluR-B. Для выяснения вопроса будет ли такая специфическая экспрессия субъединиц в этих клетках функционально коррелировать со свойствами рекомбинантных каналов мы приготовили культуру глиальных клеток из мозжечка и исследовали характер ВАХ и проницаемость для Са2+ при активации их специфическими агонистами глутаматных рецепторов.
30 (¿н АМРА
_| 25 рА.
ЗООцЫКЛ
SMMCNOX
ЗООцМКА
300 liMKA
f* * №
Са
Na _I25?*
4О0 ms
Рис.15. Свойства глутаматных рецепторов АМРА типа в клетках Бергмановской
ГЛ11Н.
(Л) Записи токов на глиальных клетках в ответ на быструю подачу 300 мкМ каината (КА, левый пробег) и 30 мкМ AM РА (правый пробег), Длительность подами агонистов указана линией над каждым пробегом. Клетка была оторвана от дна камеры для более быстрой смены растворов.
(B) Блокирование каинатного тока специфическим блокзтором рецепторов АМРА-каинатиопо типа CNQX. Слепа на прано показаны записи токов о ответ на подачу 300 мкМ каината соответственно, в контрольном растворе, в присутствии 5 мкМ CNQX и через 20 с после отмывки.
(C) Записи токов на глиальных клетках в ответ на быструю подачу 300 мкМ каината в "натриевом" растворе (140 мМ Na+, левый пробег) и в "кальциевом" растворе (110 мМ Са2+, праиый пробег). В пипетке 140 мМ Cs . Для всех записей мембранный потенциал -60 мВ.
В первой серии экспериментов на глиальных клетках веретенообразной формы мы выяснили, являются ли их глутаматные рецепторы рецепторами AM РА типа. Токи в ответ на быструю подачу каината не десенситизировачи на протяжении всего времени аппликации, в то же время подача AM РА вызывала ток быстро десенситнзируюший до некого постоянного уровня ток (Рис. 15А). Вызванные каинатом токи обратимо блокировались CNQX, Избирательным блокатором рецепторов АМРА-каинатного типа (Рис.15В). Кроме того, при смене наружнего раствора с "натриевого" на "кальциевый" при отрицательных мембранных потенциалах регистрировался активированный каинатом ток (Рис.15С), указывающий на высокую Са2+ проводимость глутаматных рецепторов в этих клетках. Все эти данные указывают на то, что нативные глутаматные рецепторы в глиальных клетках веретенообразной формы сформированы из субъединиц АМРА типа и не содержат субъеднницу GIuR-B.
Сравнение стационарных ВАХ, измеренных в "натриевом" и "кальциевом" наружних растворах также подтверждает это утверждение. В "натриевом" растворе ВАХ активированного каинатом тока, измеренная при пилообразном изменении мембранного потенциала имела вид с двойным выпрямлением (Рис.16А). Потенциал реверсии тока при этом составлял 3.5 ± 2,6 мВ (п=4). В "кальциевом" растворе потенциал реверсии сдвигался в положительном направлении и составлял 13,3 ± 1,9 мВ (п=4) (Таблица 5). Эти данные предполагают величину отношения проницаеМостей Pea/PCs порядка 1,44 и указывают на то, что нативные глутаматные рецепторы в клетках Бергмановской глии более проницаемы для ионов Са2+ чем для ионов Cs+. Следует отметить, что наши данные согласуются с результатами, полученными
на кулиуральных глиальных клетках веретенообразной формы, демонстрирующих вход в эти клетки меченого кальция (Ortega et al., 1991, Neuroscience, 41, 335), Таким образом, характер выпрянления НАХ и проницаемость для двухвалентных ионов глутаматных рецепторов в клетках Бергиановской глии очень похожи на аналогичные свойства каналов рекомбинантных глутаматных рецепторов, образованных «з субъединиц GluR-A и GluR-D АМРА-тИпа, транзиторно экспрессированных в фибробласты (Таблица.5).
А
В
Рис.16. Высокая проницаемость Для ионов Са^+ глутаматных рецепторов АМРА типа в глиальных клетках веретенообразной формы и низкая Са^+ проницаемость в гранулярных нейронах. ВАХ для глиальных клеток (А) и нейронов (В) в "натриевом" и "кальциевом" наружных растворах получены при пилообразном изменении мембранного потенциала. В качестве агониста использовался каинат (ЗОО.мкм). Стрелками указаны потенциалы реверсии в "кальциевом" растворе (13.5 мВ н -61 и В соответственно в А и В).
Следовательно, форма ВАХ с двойным выпрямленнем и высокая Са2+ проницаемость глутаматных рецепторов в веретенообразных глиальных клетках могут служить ключем для идентификации субъединиц составляющих нативные каналы глутаматных рецепторов в клетках Бертмановскон глин.
Таблица 5. Сравнение потенциалов реверсии и степени выпрямления ВАХ нашивных канате АМРА типа в метках мозжечка и рекомбинатпиых глутаматных рецепторов экскрессированных в клетки линии ПЕК 293. Экспериментальные условия во всех случаях одинаковы.
Ccll/subunit Vrev (mV) Ca/Cs G+BO^ G-80 Kalnata (300 цМ)
glia 13.3±1.9 (4) 0.310.06 (4)
neuron -52.414.7 (3) 1.010.1 (4)
GluR-A 13.015.0 (9) 0.2110.12(7)
GluR-D 12.7±2.3 (8) 0.1210.05 (5)
GluR-A/D 3.511.5(6) 0.1210.04 (6)
Наши данные предполагают, что, по-видимому, нативные каналы глутаматных рецепторов в клетках БергмаНовской глии состоят из гомомериых субъединиц GluR-A и GluR-D или гетеромерных субъеднниц G)uR-A/D. Чтобы убедиться в том, что в культивированных клетках сохраняется клеточная специфичность свойств глутаматных рецепторов, мы провели аналогичные эксперименты на культуралыгых гранулярных нейронах. ВАХ глутаматных репепторов активированных каинатом в "натриевом" растворе была практически линейной с потенциалом реверсии -1,1 ± 3 мВ (п=4) (Рис. 16В). В "кальциевом" растворе потенциал реверсии сдвигался в отрицательном направлении и составлял -52,4 ± 4,7 мВ (п=3) (Таблица 5). Этот сдвиг предполагает величину отношения прошшаемостей PcVCs порядка 0,05 и указывает на низкую проницаемость глутаматных рецепторов в гранулярных нейронах из мозжечка. Эти данные согласуются с опубликованными ранее результатами (Wyllie et al.,1991, J. Physiol. (London) 432, 235; Wyllie &
Cull-Candy, 1992, J.Physiol. (London), 446, 598P). Хотя мы не можем полностью исключить, что композиция субъединиц в каналах глугаматных рецепторов глиальных клеток не меняется в культуральных условиях, одно из свойств каналов глугаматных рецепторов, не имеющих субъединицы GluR-B, а именно ВАХ с двойным выпрямлением, было показано в клетках Бергмановской глии на интактных срезах мозга (Müller et al.,1992, Science, 256, 1563).
Таким образом наши данные демонстрируют строгую корреляцию между свойствами натнвных каналов глугаматных рецепторов и рекомбинантных каналов, сконструированных из субъединиц, идентифицированных методом in situ гибридизации.
ДЕТЕРМИНАНТЫ СХ2+ ПРОНИЦАЕМОСТИ В ТМ1 И ТМ2 СЕГМЕНТАХ ГЛУТАМАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ КАИНАТИОГО ТИПА: ВЛИЯНИЕ РЕДАКТИРОВАНИЯ мРНК.
Различные варианты аминокислотной последовательности сегмента ТМ1 в GliiR-б субъединице.
Анализ усиленного с помощью ПЦР фрагмента сДНК субъединицы GluR-6 содержащего трансмембранные участки ТМ1, ТМ2 и ТМЗ выявил различие в трех нуклеотидных позициях. Во всех трех позициях в кодирующей последовательности размещается либо зденозин (А) либо гуанозин (G). Одна позиция в которой происходит замена А на G, соответствует подверженному редактированию Q/R участку в ТМ2 сегменте субъединицы GluR-6, а также субъедшшц GluR-B и GluR-5 (Sommer et al.,1991, Cell, 67, 11). Две другие позиции расположены в ТМ1 сегменте и предполагают замену изолейцина I (кодон АТГ) на валин V (кодон GTT) и тирозина Y (TAC) на цистеин С (TGC) (Рис. 17). При этом имели место все возможные комбинации аминокислотной последовательности сегмента ТМ1, в которых претерпевали изменение либо один, либо оба, либо ни один из кодонов, что указывает на наличие в мозге четырех различных конфигураций ТМ1 субъединицы GluR-6. Анализ геномного ДНК показал, что в аминокислотной последовательности ТМ1 сегмента в изменяемых позициях находятся АТТ (изолейцин) и
TAC (тирозин) кодоны (Рис.17). Таким образом, в этих позициях, как и в Q/R участке ТМ2, наличие колонов, не обнаруженных в геноме GluR-б, требует перехода от А к G. Это ука ывает на то, что как и для аргинина в Q/R участке, замена аминокислот в TMI субъедшшцм GluR-б осуществляется редактированием РНК.
Ш1 TVtl тмз ти«
вым НН 2 ■ сш-сзхгз-СЭ"
,_________________I I----------------
ТСС ССТ ЮТ АТС Т«в ЛГв П« ЛТТ СП СТ« ост т*с ттв сет «тс мт тпт «го «с тгт ОТС АТЯ шх м «гмсхгвгг
ccna* тсс ест сат р>тс гвв итв гаг мт ств m ест га. ггв,с*тт ittmfwwotmewnnwmemí«
1 р 9 * СО* > 4 '©f*** я'..'.*.. У: Г в
тсс сст «м атс ros лтв таг *тт ств ств ест тос ттв вет втс мт твтетвггетттотситивсвАевттгл«
» » о :'!; « и Vi х - ь: ' в *; .*ГС , 'У. t;;r:::v .-„х ¿A-. в г «
тсс ест см атс тсч ач тдт сгт ста «с ест тк ттвевтатАвттсгсгвстстттетсмлвее tm ттт *et
* 9 9 1 m: * -"* v • Ju' *•'" * -P>'. ? • *." , v ' * •: * r *
TCC CCÍ CAT TOC АЯ T*r ГГТ CT3 ríe ест T« JTO ОСТ rrc furr тег er* rrc m at* $Ct АРв T7T MIT
I V o • « К , ч ijgj) г • а ^ v • . \T-.'V. * 4 '
Рис. 17. Сравнение кодонов геномного и клонированного ДНК для аминокислотной последовательности сегмента ТМ1 су*тьединицы СНиЯ-б. Сверху схематически показана субъеднннш 011)11-6 с четырьмя трансмембранными сегментами (ТМ1-ТМ4). Как ТМ1 так и "ГШ имеют изменяемые кодоны в позициях отмеченных поперечными линиями. Участок, кодирующиий сегмент ТМ1 показан в развернутом виде внизу и демонстрирует геномную последовательность сегмента ТМI. Два адснознна (А) в этой последовательности отмеченные стрелками заменяются на гуанозия (О) в процессе редактирования РНК, что приводит к измененной последовательности сДНК. показанной ниже геномной последовательности. Аминокислоты, получающиеся в результате редактирования ГНК. отмечены в черных овалах.
Восемь вариантов сДГ(К субъедншщы С/иЯ-б.
При наличии трех мест в последовательности аминокислот ТМ1 и ТМ2, подверженных редактированию, возможно существование восьми различных вариантов субъединицы С1иЯ-6. Анализ генерированных ПЦР сДНК с использованием специфических олигонуклеотшов показал, что в мозге крысы и мыши встречаются
все восемь вариантов: один, кодируемый геном и семь, полученных в результате редактирования РНК. Относительная частота появления этих вариантов (в 96) показана на Рис. 18.
NH2-
тмi таз tui
71 \
GXuR-6 (ir XiQ) * unedited I "t Q
GluR-6 (I, C:Q) I. SS Q
GluR-6(V, 1-. 0) .V If Q
GluR-6 (V, C:Q) * Q
GluR-6 (I, Г;К) * I Y Ж
GluR-6 (I. C;R) v , I Щ ' fRi
GluR-6 {Vt Y;R) « Ш X К
GluR-6 (V, C;R) * My «Jit* K*
-COOH
10 %
5 %
10 %
5 %
5 %
65 %
Рнс.18. Восемь вариантов субьсдиницы 01иЯ-6, генерируемых редактированием ТМ1 и ТМ2 кодонов.
Субьединица С31иЯ-6 схематически представлена в верхней части рисунка. Изменяемые позиции в ТМ1 и ТМ2 отмечены поперечными линиями. Восемь вариантов субьедцницы ОиЯ-б, генерируемых редактированием РНК показаны ниже. Амина кислотные остатки в изменяемых позициях указаны в скобках. Для каждого из вариантов показана локализация этих остатков в трансмембранных сегментах. Звездочками отмечены субьсдиницы, которые анализировались в этой работе. Справа показана относительная частота появления каждой из форм сДНК (в процентах).
Задачей данной части исследования было выяснить влияет ли редактирование в О/К участке сегмента ТМ2 субъединицы СТиЯ-б на характер ионной проницаемости каналов в той же степени, как это имеет место в каналах из субъединиц АМРА типа. И имеет ли функциональное значение редактирование в сегменте ТМ1.
На Рис.19 показаны записи токов через каналы, образованные наиболее часто ' встречающимся ' вариантом субъединицы С1иЛ-б(У,С;К), редактированном во всех трех позициях, при быстрой аппликации различных агонистов. Глугамат и каинат вызывали ток, быстро десенситизирующийся до нулевого уровня. В ответ на подачу домоата пиковый ток спадал до некоего стационарного уровня. При отмывании домоата ток достигал нулевого уровня относительно медленно. Подача ,1 мМ АМРА не вызывала детектируемого тока. Аналогичные свойства наблюдались при активации каналов, образованных из субъединиц О1иК-б(У,С;0), 01иЯ-6([,У;С)), СТиК,-6(1,У;Я) и их гетеромерных комбинаций. В дальнейших экспериментах в качестве агонистов использовали глутамат или
домоат в насыщающих концентрациях для измерения ВАХ, соответственно, для пиковьгх или стационарных значений тока.
ОЮИ- 6(0) ТМ1 еМес! 1.-д1и1ата1е 1 тМ
200 рА
150 те
Ка(па1е 300 цМ
1000 рА
150 те
Оотоа1е 50
200 рА
150 плэ
АМРА1тМ
1000 рА
150 те
Рис.19, Записи интегральных токов через каналы образованные из полностью редактированной субъединицы ОЫК-бСУ.С^Я), экспрсссированной в клетки лин"и 293 при быстрой подаче 1 мМглутамата (А), 300 мкМкаината (А), 50 шсМ домоата (С) и 1мМ АМРА (О). Величина мембранного потенциала -60 мА.
Кальциевая проницаемость редактированных и нередактированных каналов субъединицы ОиИ-б.
Изменение проницаемости для ионов Са2+ измеряли при пилообразном изменении мембранного потенциала во время аппликации домоата. На Рис.20А и В показаны ВАХ в "натриевом" и "кальциевом" растворах для редактированных в ТМ1 форм ОЫЯ-6(У,С;<3) и ОиИ-б^СД). Характер выпрямления ВАХ варьировал между 0 и К формами в "натриевом" растворе также как и в случае С и К форм АМРА рецепторов. Однако для гомомерных С1иК-6(У,С;С|) каналов потенциал реверсии в "кальциевом" растворе сдвигался в сторону отрицательных потенциалов. Это указывает на более низкое отношение проницаемостеи по сравнению с таковым для
АМРА рецепторов, содержащих глутамин в (^/Я участке. С другой стороны для гомомерных СПиЛ-б^С;!?.) каналов потенциал реверсии в "кальциевом" растворе сдвигался незначительно (Рис.20В, Таблица 6). Таким образом для редактированной в ТМ1 субъеднницы 01иЯ-6 отношение проницаемостеи
выше для Я формы сегмента ТМ2, чем для формы, что является обратным тому, что наблюдалось в каналах АМРА рецепторов. Следует отметить, что для Л формы входяший ток, переносимый ионами Са^"1" был больше чем натриевый ток. Это справедливо как для пиковой так и стационарной компонент (Рис.20В, вставка). Ранее мы показали, что в гетеромерных АМРА рецепторах характер ВАХ и проницаемость для двухвалентных ионов определяется таковыми для субъсдиницы С1иЯ-В. В связи с этим было интересно посмотреть как эти параметры модифицируются в ; гетеромерных каналах, образованных из различных форм субъединицы С1иК-6. На Рис.20С показаны стационарные ВАХ при аппликации домоата в "натриевом" и "кальциевом" внеклеточных растворах полученные на клетках, экспрессирующих О1иК-6(У,С;0) и С11и11-6(\',С;Я) субъединицы. ВАХ в "натриевом" растворе имеет вид с нормальным выпрямлением, как если бы она доминируется Я формой сегмента ТМ2. Потенциал реверсии в "кальциевом" растворе , однако, бьи более отрицательный чем потенциаль! реверсии для гомомерных каналов. Следует отметить, что он был приблизительно равен потенциалу реверсии каналов АМРА рецепторов, содержащих аргинин в СУЯ участке. Таким образом, в отношении проницаемости О/К участок в
субъединице ОиИ-б не является эквивалентным своему гомологу в С1иЯ-А - 01аЯ-И субъединицах.
ТМ1 есМеа
01иП-6( У,С;0)
1(рА)
Са/Св
4000
У(тУ)
В
6( У.С;П )
■4000 I (рА) 7000
160,
/ -20 Са / /№ ■160
- <тУ)
•1--6000
Рис,20. Катьциевая проницаемость и характер выпрямления.ВАХ вариантов субъединицы 01иИ-6 с полностью редактированным ТМ1 сегментом.
(A): С1иЯ-6(У,С;(3) томомсрные каналы. Стационарные ВАХ при аппликации домоата (50 мкМ) в "натриевом" и "кальциевом" внеклеточных растворах. Потенциалы реверсии соответственно-4,1 мАи -27 мА (отмечен стрелкой). На вставке показан участок ВАХ вблизи потенциалов реверсии в увеличенном масштабе.
(B): I ЛиКУ.С.К) гомомерные каналы. Стационарные ВАХ при аппликации домоата в "натриевом" и "кальциевом" внеклеточных растворах. Потенциала реверсии соответственно -1,5 мА и -4,4 мА (отмечен стрелкой). На вставке показаны записи токов активированных домплтом при потенциале -60 мА в "натриевом' и "кальциевом" внеклеточных растворах.
(C): 01иК-6(У,С;(2)/01и11-6(У,С;1*) тстеромерные каналы. Стационарные ВАХ при аппликации домоата в "натриевом" » "кальциевом" внеклеточных растворзх, Потенциалы реверсии соответственно -1,8 чА и -43,6 мА (отмечен стпелкой).
ТМ1 unedited
QluR-8( ixai
l{pA)
CaCi,
6000
GluR-0( I.Y.R)
UPA)
.-100
См
V(mV)
-20 / ■гоа
-100
100
V(mV)
V (mV)
Рис.21. Кальциевая проницаемость и характер выпрямления ВАХ варнанто субъединицы 0!иЯ-6 с нередакгированным ТМ1 ссгментои
(A): 01иК.-6(1,У;С?) гомомерные каналы. Стационарные ВАХ при аппликаци домоата (50 мкЫ) в "натриевом" и "кальциевом" внеклеточных раствора: Потенциалы реверсии соответственно -1,2 мВ и -11,3 ыВ (отмечен стрелкой Белый треугольник указывает на потенциал реверсии для соответствующе редактированной в ТМ1 сегменте субъединицы представленной на Рис.17А. Н вставке показан участок ВАХ вблизи потенциалов реверсии в увеличение масштабе.
(B):. 01иЯ-б(1,У;К) гомомерные каналы. Стационарные ВАХ при аппликаци домоата в "натриевом" и "кальциевом" внеклеточных растворах. Потенциал реверсии соответственно 2,5 мВ и -5,8 мВ (отмечен стрелкой). Белый треугольш указывает на потенциал реверсии для соответствующей редактированной в Т,\ сегменте суСъсдинпце представленной на Рис.20В.
(С): 01иК-6(1,У;())/'01иК-6(1,У;Я) гетеромерные каналы. Стационарные ВАХ при аппликации яомоата в "натриевом" н "кальциевом" внеклеточных растворах. Потенциалы реверсии соответственно 1,6 мВ и -21,3 мВ (отмечен стрелкой). Белый треугольник указывает на потенциал реверсии для комбинации соответствующих редактированных в ТМ1 сегменте су&ьединиц, представленной на Рис.ЗОС.
Чтобы выяснить аншнне редактирования сегмента ТМ1 на Са^+ проницаемость мы измерили потенциалы реверсии для ионов Са^+ в каналах, образованных из нередактированных в сегменте ТМ1 форм аи11-6(1,У;С>) ОиЯ-б^/У;!*). Как видно из Рнс.21 и Таблицы 6 редактирование в ТМ1 влияет на Са2+ проницаемость ТМ2 формы. Относительно низкая Са2+ проницаемость С1иК-6(У1С;0) каналов увеличилась в нередактировэшюй в ТМ1 форме, С1иК-б(1,У;0) (Р/1с.21А). Са2+ проницаемость гомомерных С1иК-6(У,С,1{) каналов существенно не менялась при редактировании в ТМ1 (Рис.21 В). Таким образом в нередактированной в ТМ1 форме, эффект редактирования ТМ2 существенно ослабляется. В гетеромерной комбинации субъединиц, содержащей редактированный и нередактированныи ТМ2 сегменты, редактирование в ТМ1 также снижает Са^+ проницаемость (Рис.21С)
Рамичие в Са^+ проницаемостч для разных форм субъединицы (ЛиЯ-б было обнаружено также при анализе ВАХ пиковых значений токов, активированных быстрой аппликацией глутамата, в экспериментальной ситуации моделирующей ВПСТ (Рис.22). Потенциалы реверсии в "кальциевом" растворе были аналогичны таковым, измеренным по стационарным ВАХ с использованием домоата.
Таблица 6. Потенциалы реверсии токов активированных домоатом а клетках линии 293, экспрессирующих различные варианты . субъединицы СЫК-б.
Каналы Потенциал реверсии (мВ) Са2+/С8+
С1иК-6(У,С;0) -24,6 ± 1,4 (8)
анЯ-б^.СД) -4,2 ± 0,6 (8)
С1иК-6(1,У;0) -12,5 ± 0,8 (9)
01иК-6(1,У;К) -5,6 ± 2,3 (6)
С1иЯ-6(У,С;0)/С1и11-6(У,С;К) -42,3 ±2,3(3)
С1иЯ-6(1,У;0)/С1иК-6( 1,У; Я) -24,2 ± 1,9 (5)
А аиН-6(У,С;Я)
1 тМ 1-о(:]1етв1э |тМ 1-оМагпа<в
«бОтУЛ . ♦ютУ
•м»>У голи
_[""р* -мтуУ _(
£0рА
1 тМ 1-д<и!ата1а 1 тЦ Ы№ата1е
+«0тУ
»60 »V
N1
1000 рА
2Э1М 20л
200 рА
40 тУ
п ||рА1 гооо
У(тУ|
Рис.22.' ВАХ пиковых значений токов, акгивированных быстрой аппликацией глутамата для каналов образованных из наиболее часто встречающихся форм субъединицы ОиИ-б в "натриевом" и "кальциевом" растворах.
(A): 01иК.-6(У,С;К) гомомерные каналы. Семейство интегральных токов регистрируемых в ответ на 100 мс аппликацию глугамата при рачных мембранных Потенциалах в "натриевом" (слева) и в "кальциевом" (справа) внеклеточных растворах.
(B): ВАХ пиковых значений токов, показанных в А в "натриевом", (черные кружочки) и в "кальциевом" (белые кружочки) внеклеточных растворах. Потенциалы реверсии соответственно 0,4 мВ и -5,4 мВ (отмечен стрелкой).
(C): С1иЯ-6(\,С-,())/0]иЯ-6С^,С,К) гетеромерные каналы. Семейство интегральных токов регистрируемых в ответ на 100 мс аппликацию глугамата при разных мембранных потенциалах в "натриевом" (слева) и в "кальциевом" (справа) внеклеточных растворах.
(Б): ВАХ пиковых значений токов, показанных в С в "натриевом" (черные кружочки) и в "кальциевом" (белые кружочки) внеклеточных растворах. Потенциалы реверсии соответственно -0,4 мВ и -45 мВ (отмечен стрелкой).
Таким образом, в субъединнце СНиК-б три позиции в последовательности ТМ1 и ТМ2 заняты аминокислотными остатками, не кодируемыми соответствующими генами. Эти аминокислотные остатки участвуют в контроле проницаемости каналов
Следовательно, редактирование мРНК в совокупности (
возможностью образования гетеромерных ансамблей из различных комбинаций субъединиц могут быть использованы в качестве механизма, регулирующего вход ионов калышч в клетку.
Данные по физиологическим свойствам 01иК-6 каналов предполагают, что (2/11 позиция в сегменте ТМ2 определяет характер выпрямления ВАХ таким же образом как и в АМРА рецепторах. Однако проницаемость для двухвалентных ионов в гомомерных С1иК-6 каналах изменяется редактированием в ТМ2 сегменте в противоположном направлении по сравнению с субъединнцей.ОЫК-В. При этом в гетеромерном ансамбле, образованном из 0 и Я вариантов ОиИ-б проницаемость для двухвалентных ионов очень низкая, меньше чем таковая для гомомерных каналов, образованных каждой суйт,единицей в отдельности. В этом контексте интересно отметать, что мутирование ТМ1 сегмента в субъединице 01иГ(-0(1,из семейства АМРА рецепторов в его "редактированную" форму 01и11-0(У,С;(3) не влияет на Са2+ проницаемость. Этот результат и различное влияние О/Я участка на проницаемость
указывает на различие в структуре каналов АМРА и каинатных рецепторов несмотря на то, что субъединицы этих двух типов глутаматных рецепторов имеют вьк окую степень идентичности в аминокислотной последовательности, особенно в предполагаемых трансмембранцых сегментах ТМ1, ТМ2 и ТМЗ. В частности, эти два типа каналов могут иметь разную топологию. Можно предположить, что аминокислотные остатки сегмента ТМ1 субъединицы 01иЯ-6 участвуют в формировании поры ионного канала. В этой связи следует отметить, что два аминокислотных остатка в ТМ1, подверженных редактированию лежат на одной стороне ТМ1 сегмента (в предположении его вторичной структуры в виде а-геликса) ровно на один виток друг от друга.
КОНТРОЛЬ Са2+ И МВ2+ ПРОНИЦАЕМОСТИ КМОА РЕЦЕПТОРОВ.
Одной из важнейших характеристик КМОА рецепторов является их высокая проницаемость для ионов Для рецепторов АМРА и
каинатного типа мы показали, что стр хтурным детерминантом Са^+
проницаемости является О/К участок в предполагаемом трансмембранном сегменте ТМ2. При этом для АМРА рецепторов введение аспарагина в этот критический участок приводило к образованию канала с более высокой проницаемостью для ионов по сравнению с ионами (см. Рис. 12). Анализ структуры
клонированных ЫМОА рецепторов показал, что для всех субъединиц характерно наличие аспарагина- в предполагаемом сегменте ТМ2 в участке гомологичном таковому для рецепторов АМРА и каинатного типа (Рцс.23А). Таким образом представляло интерес выяснить Приведет ли замена аспарагина в этой позиции к изменению Са^"1" и Мб2+ проницаемости ЫМОА рецепторов. Для выяснения этого вопроса мы провели серию экспериментов в "натриевом", "кальциевом" и "магниевом" наружних растворах, аналогичных описанным ранее для АМРА и каинатных рецепторов. Для каналов образованных комбинацией субъединиц N111 и N1(2А потенциал реверсиии тока в "кальциевом" растворе составлял около 20 мВ (Рис.23В, отмечен стрелкой). В клетках, экспрессирующих комбинацию мутированной N111 (N598(3) и N112 А субъединиц потенциал реверсии сдвигался в среднем к величине -6 мВ (Рис.23С). Отличие в величине потенциала реверсии для двух- этих случаев указывает на то, что мутированные каналы имеют существенно меньшую Са2+ проницаемость и, следовательно, Са2+ Проницаемость ЫМОА рецепторов критически зависит от аспарагина N1^1 (N598) в ТМ2 сегменте. Уменьшение Са2+ проницаемости при замене аспарагина на глутамин в субъединице N111 наблюдалось также при коэкспрессии мутированной и немутированной форм этой субъединицы с субъединицей N1120 (Таблица 7). Далее мы исследовали вопрос имеет ли аспарагин в гомологичной позиции в субъединицах N112 такое же функциональное значение в контроле проницаемости гетеромерного ансамбля. Однако, для N111-NR2A(N595Q) и Ка1^Я2С(№930) каналов потенциалы реверсии в "кальциевом" растворе не отличались существенно от таковых для немутированных каналов (Таблица 7).
В отличие от мутации в субъединице которая не изменила низкую проницаемость для ионов мутация в субъеднннцаэ
NR2 приводила ' к образованию каналов с большей проницаемостью. Потенциал реверсии в "магниевом" наружное растворе при этом составлял -12 мВ (Рис.230, Таблица 7). Дл>
немутированных каналов эта величина была более отрицательной чем -50 мВ (Рис.23В, Таблица 7).
TMI ТМ 2 ТИЗ
оаю-
-о
nri daltlssamwfswsvl;«í;£;igegap соб
kr2a PSFTIGKAIWLLWGLVFlfíiSVPVQNP 603
íjk2c PSFTIGKSVTVLLWALVTWISVPIEÍJF 601
s
6lub-b mefsifhslwfslgafhpogcdispr 594
С |(рА)
NH1(N5980VNR2A
Рис.23. Различие в Са^+ и проницаемости между немутированными и
мутированными каналами NMDA реиегггоров. (А) Сверху представлена схематическая диаграмма первичной структуры субъединиц 1 глугаматных рецепторов NMDA типа, покзывающая взаимное расположение трансмембранных участков. Внизу раскрыта последовательность аминокислот в сегменте ТМ2 для субъединиц NMDA рецепторов и редактированной и нередактированной форм субьсдиницы GluK-B АМРА nina. (В) ВАХ активированного глугаматом тока в "натриевом", "кальциевом" и "магниевом" наружних растворах для комбинации немугированных субъединиц NR1-NR2A. Стрелкой указан потенциал реверсии для ионов Са^"1" (22,3 мВ). В "магниевом" растворе входящий ток не детектировался. вплоть до -100 мВ. (С) ВАХ активированного глугаматом тока в "натриевом"и "кальциевом" наружних растворах для комбинации мутированной NR1(N598Q) и нсмугированнон NR2A субъединиц. Стрелкой указан потенциал реверсии для ионов (-3 мВ). (D) ВАХ аетивироваиного глугаматом тока в "натриевом" и "магниевом" наружних растворах для комбинации немутированной NR1 и мутированной NR2A(N595Q) субъеднниц. В "магниевом" растворе потенциал реверсии составлял -И мВ (указан стрелкой). Во всех экспериментах с NMDA рецепторами "натриевый" раствор не содержал ионов магния. Глугамат (100 мкМ) подавался совместно с глицином (10 мкМ).
Аспарагин в ТМ2 сегменте контролирует блокирование NMDA рецепторов ионами
В нативных каналах NN1 РА рецепторов ионы являются
сильными блокаторами входящего тока. Различие в проницаемости немутированных и мутированных каналов может предполагать также разную степень блокирования входящего тока ионами Чтобы выяснить влияние мутаций в ТМ2 сегменте на
характер блокирования ионами
мы сравнили ВАХ, полученные в растворе не содержащем двухвалентных ионов и в растворе, содержащем 0,1 мМ Мв2+.
Результаты этих экспериментов приведены на Рлс.24. Для немутированных каналов ^1-НЯ2А амплитуда тока измеренного при потенциале -100 мВ в присутствии 0,1 мМ
состашхяла 9+3% (п=4) от контрольной величины измеренной в растворе, не содержащем двухвалентных ионов. Для мутированных каналов ЫК.1(№98С2)-ЫК2А эта величина составляла 30 ±6% (п=4) (Рис.24А,В). Замена гомологичного аспарагина в ТМ2 сегменте субъе^иницы NR2A еще более существенно уменьшила чувствительность каналов к блокированию ионами и
практически устраняла потенциапозависимость магниевого блока. Амплитуда тока измеренного при потенциале -100 мВ в присутствии 0,1 мМ Мё2+ для каналов ^1-К112А(К5950) составляла 71 ±4% (п=4) от контрольной величины Рис.24С. Качественно похожие изменения в характере блокирования ионами
наблюдались в
клетках, экспрессирующих мутированные КЮ (Н598(Э)-ЫИ2С и N111-NR2C(N593Q) комбинации субъедйниц.
Рис.24. Различие в. степени блокирования внеклеточным магнием каналов образованных из мутированных и немутированных субъединиц. (А) Каналы, состоящие из субъединиц NR1 и NR2A. ВАХ активированного глугаматом тока в растворе, не содержащем двухвалентных ионов (а) н в растворе с 0,1 мМ Mg2+ (b). (В) Аналогичные DAX для каналов NR1(N598Q)-NR2A. (С) ВАХ для каналов NR1-NR2A(N595Q).
Замена аспарапша на аргинин в КК1^598К)-Н112А комбинат!!! приводила к образованию каналов, имеющих низкую Са^+ проницаемость (потенциал реверсии в "кальциевом" растворе составлял в среднем около -80 мВ (Рпс.^А.В; Таблица 7.). Кроме того в клетках, экспрессиругащих КЩ(М59811)-Н112А рецепторы, форма ВАХ активируемого глугаматом тока была нечувствительна к внеклеточной концентрации ионов
Рис.25. Уменьшение Са^"' проницаемости и степени блокирования ионами мутированных каналов с аргинином вместо аспарагина в ТМ2 сегменте субъединицы ЫЯ1. (А) Записи токов, вызванных аппликацией 100 мкМ глутамата при потенциале -60 мВ в "натриевом" растворе (входящий ток направлен вниз) и в "кальциевом" растворе (выходящий ток направлен вверх). (В) ВАХ активированного глугамагом тока в "натриевом" и "кальциевом" растворах. Потенциалы реверсии соответственно 0 и -87 мВ (отмечен стрелкой). (С) ВАХ активированного глугаматом Тока в растворе, не содержащем двухвалентных ионов (а) н в растворе с 0,5 мМ Ме,^ (Ь). Обе кривые практически совпадают.
Входящий ток, измеренный в растворе не содержащем двухвалентных ионов не был блокирован при добавлении 0,5 мМ (Рис.25С). Таким образом, в том случае когда положительно заряженный аргинин расположен в критической позиции в ТМ2 субъединицы N111, двухвалентные катионы, по-видимому не могут войти в устье канала.
Таблица 7. Потенциалы реверсии активированного глутаматом тока для разных комбинаций немутироваппых и мутированных субъ единиц ИМОА рецепторов в "кальциевом" (НО мМ) и "магниевом" (110 мМ) иаружшис раствирах. В пипетке 140 мМ
Комбинация субъединиц Vrev (MB) Ca2+/Cs+ " Vrev (MB) Mg2+/Cs+
NR1-NR2A 23,4 ± 1,6 (5) -50 (4)
NR1-NR2C 19,5 ± 0,7 (6) -100 (3)
NR1(N598Q)-NR2A -5,9 ± 1,6 (10) -100 (3)
NRI(N598Q)-NR2C 6,6 ± 1,0 (3) -100 (1)
NR1-NR2A(N595Q) 18,1 ± 1,3 (6) -12,7 ± 0,8 (4)
NRI-NR2C(N593Q) 17,6 ± 1,0 (3) -11,0 ±3,9 (3)
NR1(N598Q)-NR2A(N595Q) 3,4 ± 1,3 (3) -6,4 (1)
NR1(N598R)-NR2A -82,5 ± 2,2 (4) ND
Влияние на Са2+ проницаемость и проводимость замены аспарагнна на аргиннн или тлутамин в трансмембранном сегменте ТМ2 субъединицы NR1 предполагает, что этот сегмент является частью поры ионного канала рецепторов NMDA типа. Аспарагины в субъединицах NR2, разметенные в гомологичной позиции, по-видимому, также участвует в формировании поры, так как их замена на тлутамин влияет на магниевую проницаемость и блокирование канатов ионами Влияние мутации на проницаемость и
блокирование канала может предполагать, что аспарагины двух субъединиц формируют, по крайней мере, часть селективного фильтра NMDA рецепторов для ионов Mg2+ и Са2+. Гомологичное расположение аспарагинов в двух субъединнцах, выявленное при сопоставлении аминокислотных последовательностей, однако, не обязательно должно означать их эквивалентное расположение в сформированном канале. Разл1гчные субьедцницы NMDA рецепторов могут по разному влиять на свойства гетеромерного канала вследствие их асимметричного расположения, как это имеет место для других типов каналов (Unwiri et а!., 1988, J.Cell Biol. 107, 1123).
Высокая кальциевая проницаемость и гсотенциалозлвисимое блокирование ионами Mg2+, как полагают, играют важную роль в такой функции NMDA рецепторов как поддержание долговременных
изменений в синагпической активности клеток, а также в цитотоксическом эффекте глутамата в условиях гипоксии (Collingridge and Bliss, 1987, Trends Neurosci. 10, 288; Nicoll et al.,1988, Neuron. 1, 97; Chol, 1988, Neuron 1, 623). Мы показали, что как проницаемость так и блокирование ионами
Mg2+
критически зависят
от одного аминокислотного остатка аспарагина в трансмембранном сегменте. ТМ2 субъединиц NIM и NR2. Следовательно, мутации воздействующие на этот остаток в любой из субьединиц могут вызвать дисфункции в синаптической передаче вследствие нарушения потенциалозависимого входа ионов Са2+ в постсинаптическую клетку.
ВЫВОДЫ
1. Используя комбинацию методов регистрации ионных токов и точечной мутации, проведен детальный анализ функциональных характеристик всех типов рекомбинантных нонотропных глутаматных рецепторов. Произведена классификация субъединиц глутаматных рецепторов на основе анализа структуры и функциональных характеристик (1,2,4,5,7,18).
2. Установлено, что субъединицы глутаматных рецепторов, принадлежащие одному классу могут образовывать гетеромерные канаты с новыми свойствами, отличающимися от свойств составляющих субъединиц (1,2,3,5,7).
3. Установлено, что предполагаемый трансмембранный сегмент ТМ2 участвует в формировании ионной поры каналов глутаматных рецепторов (2,3,9,10).
4. Идентифицирован участок в аминокислотной последовательности трансмембранного сегмента ТМ2 (Q/R участок), ответственный за контроль ионной проводимости AM РА рецепторов. Установлено, что изменение одного аминокислотного остатка в этой позиции приводит к изменению потег шпал озиииси мости ионной проводимости (2).
5. Исследованы структурные детерминанты проницаемости глутаматных рецепторов для двухвалешвш ионов. Для рецепторов АМРА типа показано, что низкая проницаемость для ионов катьция определяется наличием положительно заряженного ямино кислотного
остатка аргинина в О/Я участке, внесенного в этот участок вследствие редактирования мРНК на более поздней стадии развития. Показано, что различная степень экспрессии редактированной формы субъединицы С1пК-В определяет Са2+ проницаемость гетеромерных каналов (3).
6. Идентифицирована структурная композиция нативпых глутаматных рецепторов АМРА типа в клетках Еергмановской глии, на основе сравнения их свойств со свойствами рекомбинантных глутаматных рецепторов. Установлено, что функциональные каналы глутаматных рецепторов в этих клетках образованы из субъединиц АМРА типа 01иК-А и йиИ-О, имеющих высокую кальциевую проницаемость (8,14).
7. Для субъединииы С1иЯ-6 показано существование восьми вариантов субъединицы, обусловленных редактированием мРНК в трансмембранных участках ТМ2 и ГМ1. Установлено, что редактирование как в ТМ2 так и в ТМ1 является одним из генетических механизмов, контролирующих Са2+ проницаемость глутаматных рецепторов ЛМРА- и каннатного типа (10,15,19).
8,. Для NМО Л рецепторов идентифицирован участок в ТМ2, ответственный за контроль хатьциевоп и магниевой проницаемости и потенциалозависимого блока ионами магния этого типа рецепторов. Показано, что как кальциевая (магниевая) проницаемость, так и блокирование NMDA рецепторов ионами магния критически зависит от одного аминокислотного остатка аспарагина в трансмембранном сегменте ТМ2 субъединиц ИШ и N112 (9,16,17,20).
9. В результате исследования удалось выявить общий для разньк типов глутаматных рецепторов элемент первичной структуры, участок в трансмембранном сегменте ТМ2, определяющий характеристики их ионной проницаемости.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ГЮ ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Sommer B, Keimnen K, Verdooni T, Wisden W, Burnashev N, Herb A,
Kohler M, Takagi T, Sakmann B & Seeburg P (1990). Flip and Flop: A cell-specific functional switch in glutamate-operated channels of the CNS. Science 249.1580-1585.
2. Verdooni T, Burnashev N, Monyer H, Seeburg P & Sakmann B (1991).
Structural determinants of ion flow through recombinant glutamate receptor channels. Science 252:1715-1718.
3. Burnashev N, Monyer H, Seeburg P & Sakmann B (1992). Divalent ion
permeability of AMPA receptor channels is dominated by the edited form of single subunit. Neuron 8:189-198.
4. Sommer B, Burnashev N, Verdoom T, Keinanen K, Sakmann B &
Seeburg P (1992). A glutamate receptor channel with high affinity for domoate and kinnate. EMÈO Journal 11:1651-1656.
5. Herb A, Burnashev N, Werner P, Sakmann B, Wisden W & Seeburg P
(1992). The KA-2 subunit of excitatory amino acid receptors shows widespread expression in brain and forms ion channels with distantly-related subunits. Neuron 8:775-785.
6. Sommer B, Monyer H, Wisden W, Verdoorn T, Burnashev N, Sprengel
R, Sakmann B & Seeburg P (1992). Glutamate-gated ion channels in the brain-genetic mechanisms for generating molecular and functional diversity. Awieimittel-ForschungJDrug research 42-l(N2A):209-210.
7. Monyer H, Sprengel R, Schocpfer R, Herb A, Higuchi M, Lomeli H,
Burnashev N, Sakmann B & Seeburg P (1992). Heteromeric NMDA receptors: Molecular atid functional distinction of subtypes. Science 256:1217-1221.
8. Burnashev N, Khodorova A, Jonas P, Helm PJ, Wisden W, Monyer H,
Seeburg P & Sakmann В (1992). Calcium-permeable AMPA-Kainate receptors in fusiform cerebellar glial cells. Science 256:1566-1570.
9. Burnashev N, Schoepfer R, Monyer H, Ruppersberg JP, Gunther W,
Seeburg P & Sakmann В (1992). Control by asparagine residues of calcium permeability and magnesium blockade in the NMDA receptor. Science 257:1415-1419.
10. Koliler M, Burnashev N, Sakmann В & Seeburg P (1993).
Determinants of Ca2+ permeability in both TM1 and TM2 of high-affinity kainate receptor channels.' Diversity by RNA editing. Neuron 10: 491 - 500.
11. Schoepfer R, Monyer H, Sommer В, Wisden W, Sprengel R, Kuner T,
Lomeli H, Herb A, Kohler M, Burnashev N, Gunther W, Ruppersberg JP, & Seeburg P (1993). Molecular biology of glutamate receptors. Progress in Neurobiology (in press).
12. Jonas P, Burnashev N, Verdoom T, Wisden W, Seeburg P & Sakmann
В (1991). Molecular identification of glutamate receptors in CA3 hippocampal neurones. Pflugens Archiv 418 (Supplement I), RI5.
13. Verdoorn T, f urnashev N, Jonas P, Seeburg P & Sakmann В (1991).
Comparison 1 ?tween the functional properties of glutamate receptors native to САЗ I i/ppocampal neurones and recombinant glutamate receptors. Society for Neuroscience Abstracts 17:335.
14. Khodorova A & Burnashev N (1992). Glutamate receptor channels with
high Ca2+ permeability in fusiform glial cells in rat cerebellar cultures. Proceedings of the Physiological Society. Journal nf Physiology 446:516P.
15. Burnashev N, Köhler M, Seeburg P & Sakmann В (1992). Conductance rectification and permeability of edited and unedited forms of recombinant glutamate receptor GluR-6 subunit channels. European Journal of Neuroscience, Supplement 5, 171.
16. Burnashev N, Monyer .H, Schoepfer R & Seeburg P (1992). Ca2+
permeability of recombinant NM DA receptor channels. Society for Neuroscience Abstracts 18, 395
17. Schoepfer R, Seeburg P, Kuner T, Bumashev N, Gunther W & Ruppersberg JP (1992). Single channel analysis of a mutant NMDA receptor with altered ion-channel properties for magnesium block. Society for Neuroscience Abstracts 18, 395
18. Burnashev N & Sakmann B (1993). Differential desensitization behaviour of recombinant AM PA and kainate receptors. Pflugers Archiv, v. 422, Supplement 1, p. R42.
19. Köhler M, Bumashev N, Sommer B, Sprengel R, Sakmann B & Seeburg P (1993). Functional determinants in TM1 and TM2 of kainate receptor channels: Diversity by RNA editing. Journal of cellular biochemistry, Supplement 17D.
20. Ruppersberg P., Burnashev N. Gunther W., Kuner T., Monyer H., Sakmann B., Seeburg P., Schoepfer R. (1993) Mechanisms of magnesium block identified by single-channel recording from mutated NMDA-rcceptor channels. Proceeding of Biophysical Society, 37, A115.
21. Bumashev N. (1993) Recombinant ionotropic glutamate receptors: Functional distinctions imported by different subunits. Cellular Physiology and Biochemistry (in press).
22. Bumashev N. (1993) Molecular biology of NMDA receptors. In: The NMDA receptor, eds J.C.Watcins & G.LCollingridge, IRL Press; Oxford, University Press.
Подп. к печ. И. II-д 3 Формат 60 X 84'/, Бумага тип. ¡Ы . Способ печати офсетный. Условн. печ. л. Условн. кр.-отт. },£ . Уч.-нзд. л. Х.О . Тираж ¿ОО . За». Лг 6ЧЯ6 ■ Бесплатно._
Фирма «ВИПОЛ» 252151, г. Киев, ул. Волынская, 60.
- Бурнашев, Наиль Абдурахманович
- доктора биологических наук
- Киев, 1993
- ВАК 03.00.13
- Изучение свойств глутаматных рецепторов АМПА-типа мозга крысы на модели эпилепсии, вызванной имплантацией кобальта
- Протекторное действие активированного протеина C при нейротоксичности и ишемии мозга
- Роль мембранных рецепторов в сигнальных механизмах в клетках нейрональной природы
- Влияние гомоцистеина на продукцию активных форм кислорода нейтрофилами крыс
- Структурно-функциональные отношения в рядах блокаторов глутаматных рецепторов NMDA и AMPA типов