Структурно-функциональные отношения в рядах блокаторов глутаматных рецепторов NMDA и AMPA типов

Николаев, Максим Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурно-функциональные отношения в рядах блокаторов глутаматных рецепторов NMDA и AMPA типов
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональные отношения в рядах блокаторов глутаматных рецепторов NMDA и AMPA типов"

На правах рукописи

Николаев Максим Владимирович

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОТНОШЕНИЯ В РЯДАХ БЛОКАТОРОВ ГЛУТАМАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ N1^0 А И АМРА ТИПОВ

03.00.13 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

-3 ДЕК 2009

Санкт-Петербург 2009

003486876

Работа выполнена в лаборатории биофизики сннантических процессов Учреждения Российской академии наук Института Эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова РАН (Санкт-Петербург)

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, Константин Викторович Большаков

Официальные оппоненты: . доктор биологических наук, Юрий Алексеевич Негуляев

кандидат биологических наук, Михаил Леонидович Фирсов

Ведущее учреждение:

Санкт-Петербургский Государственный Университет

Защита состоится «0$ » в //.СРпя заседании специализированного

Диссертационного совета Д 002.127.01 при Учреждении Российской академии наук Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова РАН по адресу: 194223, Санкт-Петербург, пр. Тореза, д.44.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Учреждения Российской академии наук Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова РАН

Автореферат разослан «

Ученый секретарь диссертационного совета: ■ _

доктор биологических наук, профессор Марина Николаевна Маслова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Основные возбуждающие синапсы в ЦНС позвоночных - глутаматергические. Быстрый компонент возбуждающих постсинаптических токов опосредуется активацией глутаматных ионотропных рецепторов - лигандуправляемых ионных каналов. По чувствительности к агонистам в семействе глутаматных ионотропных рецепторов выделяют АМРА, NMDA и каинатные рецепторы, которые различаются по функциональным и фармакологическим характеристикам.

С момента открытия глутаматергической нейропередачи найдено и синтезировано множество лигандов, взаимодействующих с ионотропными глутаматными рецепторами. Эти соединения обладают разной избирательностью в отношении субъединичного состава, характеризуются различными участками связывания и молекулярными механизмами действия на глутаматные рецепторы. Поэтому они являются незаменимыми фармакологическими инструментами для изучения строения, функционирования и физиологической роли глутаматных рецепторов. С другой стороны, эти вещества могут быть использованы в качестве агентов для коррекции патологических состояний, связанных с нарушением глутаматергической передачи (Bowie 2008). Особое внимание уделяется неконкурентным антагонистам - блокаторам ионных каналов, способным уменьшать последствия гиперактивации глутаматных рецепторов. Некоторые из них успешно прошли клинические испытания и в настоящее время широко применяются для лечения слабоумия, болезни Паркинсона и в качестве анальгетиков (Parsons et al., 1999).

Однако практическое использование большинства известных блокаторов ионных каналов ограничено или неприемлемо, вследствие побочных эффектов, проявляющихся, например, в двигательных и психических расстройствах (Lipton, 1993, Cvrek 2008). Причинами побочных эффектов могут быть механизм блокирующего действия, избирательность блокатора к субъединичному составу рецептора (Parsons et al, 1999). Нельзя исключать также существование нескольких участков связывания блокатора с глутаматным рецептором, что может проявляться в виде дополнительных механизмов действия. Так, множество участков связывания с NMDA рецепторами показано для полиаминов. Взаимодействие с разными участками связывания приводит либо к угнетению, либо к усилению активности NMDA рецепторов (Williams 1997).

Для объяснения причин побочных эффектов и разработки новых безопасных препаратов необходимо детальное понимание строения и функционирования глутаматных рецепторов, а также изучение молекулярных детерминант, обеспечивающих взаимодействие с антагонистами. Для этих целей успешно применяется структурно-функциональный анализ,

в котором устанавливается связь между строением веществ и их действием на глутаматные рецепторы.

Цель исследования состояла в изучении молекулярных механизмов блокирующего и модулирующего действия каналоблокаторов глутаматных рецепторов АМРА и ИЛ-ГОА типов.

Задачи

1. Изучить блокирующую активность производных филантотоксина-433 с ограниченной информационной гибкостью поликатионного «хвоста» и различным строением гидрофобной группировки «головы». Оценить возможность использования этих соединений для исследования структуры и функционирования глутаматных рецепторов.

2. Определить зависимость между блокадой и десенситизацией ЫМРА-рецепторов.

Научная новизна

Проведенные в рамках поставленной задачи исследования действия производных филантотоксина-433 позволили определить причину несоответствий моделей строения АМРА рецепторов, полученных с использованием веществ различной природы. При изучении структуры и функций глутаматных рецепторов с помощью производных филантотоксина-433 необходимо учитывать возможность образования внутримолекулярной водородной связи. Поэтому проведение структурно-функционального анализа должно включать молекулярное моделирование для определения пространственной организации молекулярного комплекса блокатор-ионный канал.

Исследованные в работе производные фенилциклогексила и адамантана усиливали десенситизацию ИМ О А рецепторов. Влияние на десенситизацию не было связано с механизмом действия этих соединений как блокаторов каналов: корреляция между степенью ловушки и усилением десенситизации отсутствовала. Более того, обнаруженный эффект не зависел от мембранного потенциала, т.е., по всей видимости, он не обусловлен блокадой ионного канала. Мы предполагаем существование дополнительного внеканального участка, связывание с которым опосредует наблюдаемый эффект на десенситизацию.

Теоретическое и практическое значение работы

Проведенные в рамках поставленных задач исследования позволили изучить молекулярные механизмы действия антагонистов глутаматных рецепторов. Для проведения структурно-функционального анализа требуется использование максимально простых химических соединений. Для изучения особенностей, определяющих избирательность и

активность производных филактотоксина-433 необходимо молекулярное моделирование конформации молекул блокатора. В этом случае исчезают противоречия, имеющиеся при построении моделей строения каналов глутаматных рецепторов.

Показано, что соединения, основное действие которых связывают с блокадой открытого ионного канала, способны модулировать активность ЫМОА рецепторов путем усиления степени их десенситизации. По всей вероятности, усиление десенситизации опосредуется дополнительным внеканальным участком связывания. Этот факт является существенным дополнением к пониманию фундаментальных вопросов строения и функционирования глутаматных рецепторов. Дальнейшая характеристика обнаруженного эффекта, его проявления в зависимости от субъединичного состава, ионного окружения, позволит более подробно изучить действие антагонистов на глутаматные рецепторы и должно помочь в разработке новых эффективных и безопасных препаратов для лечения расстройств нервной системы. Обнаруженное усиление десенситизации в присутствии классических каналоблокаторов ЫМОЛ рецепторов следует учитывать при интерпретации данных, получаемых при их применении в качестве препаратов для лечения глутамат-опосредованной цитотоксичности.

Положения, выносимые на защиту

1. Ограничение конформационной гибкости «хвостовой» части и варьирование строения группировки «головы» сказывается на блокирующей активности производных филантотоксина-433 и определяет их избирательность к разным типам глутаматных рецепторов. Избирательные каналоблокаторы АМРА рецепторов имеют вытянутый поликатионный «хвост», в то время как для угнетения ЫМОА рецепторов критичным является строение группировки «головы».

2. Ввиду высокой конформационной гибкости производных молекул филантотоксина-433, структурно-функциональный анализ действия этих соединений необходимо комбинировать с молекулярным моделированием для определения возможной пространственной организации комплекса блокатор-ионный канал.

3. Синтетические блокаторы ионных каналов - производные фенилциклогексила и адамантана - обладают дополнительным действием на К\ГОА рецепторы, не связанным с блокадой ионного канала. Они усиливают десенситизацию ИМОА рецепторов.

Апробации работы

Основные материалы диссертации были доложены и обсуждены на научных конференциях:

- 17-European students' conference Promising medical scientist willing to look beyond, 8-12 October 2006, Charite, Berlin, Germany;

- PENS Summer Course Contemprorary Problems of Neurobiology: Molecular Mechanisms of Synaptic Plasticity, 10-24 September 2007, Kazan, Russia;

- 20 съезд физиологического общества им И.П. Павлова, 4-8 июня 2007, Москва, Россия;

- The Physiological Society International Workshop Latest Advances in ion channel techniques applied to physiological problems, 12-16 September 2008, Shanghai, China;

- Международная научная конференция Ионные каналы: структура и функции, 17-18 марта 2009, Санкт-Петербург, Россия.

Публикации

По материалам диссертации опубликованы 7 печатных работ (2 статьи и 5 тезисов докладов).

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, литературного обзора, описания материалов и методов исследования, результатов исследований и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на 103 страницах, включает 18 рисунков и 3 таблицы. Библиографический список содержит 162 источник.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Изолированные нейроны

Работа проведена на крысах линии Wistar. Для выделения мозга животных 14-30-дневного возраста декапитировали под уретановым наркозом. С помощью виброслайсера (Vibroslice 752М, Campden Instruments) приготавливали саггитальные срезы гиппокампа и стриатума толщиной 250 мкм. Готовые срезы переносили в термостатируемую камеру, заполненную физиологическим раствором следующего состава (мМ): NaCl - 124, КС1 - 5, СаС12 - 1.3, MgCl2 - 1.5, NaH2P04 - 1.3, NaHC03 - 26, глюкоза - 10. Предварительно раствор аэрировали карбогеном (95 % 02, 5 % С02) в течение получаса, рН 7.4-7.6. После 2 часов инкубации срезы использовали для электрофизиологических исследований.

Срезы помещали в камеру, перфузируемую раствором для клеток следующего состава (мМ): NaCl - 143, KCl - 5, СаС12 - 2.5, глюкоза - 10, HEPES - 10 (рН-7.2). Эксперименты проводили при комнатной температуре (20-23°С). Клетки изолировали без предварительной энзиматической обработки с помощью методики вибродиссоциации (Vorobjev, 1991). Токи регистрировали методом точечной фиксации потенциала в конфигурации "целая клетка" с помощью усилителя ЕРС8 (Heka Elektronik). Для заполнения микропипеток использовали раствор следующего состава (мМ): CsF - 100, CsCI - 40, NaCl - 5, CaCI2 - 0.5, EGTA - 5, HEPES-CsOH - 10 (рН-7.2). Регистрируемый сигнал фильтровался в полосе частот 0-5 кГц и оцифровывался с частотой 2 кГц для дальнейшего анализа. Контроль мембранного потенциала, запуск системы аппликации веществ, а также регистрацию и анализ данных осуществляли с помощью персонального компьютера. Токи регистрировали при потенциале фиксации -80 мВ, если это специально не оговорено. Для активации АМРА рецепторов использовался Каинат (100 цМ), NMDA рецепторов - NMDA (30 цМ)/Глицин (10 цМ) или Аспартат (100 рМ)/Глицин (10 цМ). Вещества апплицировались с помощью системы быстрой смены растворов RSC-200 (BioLogic).

Ооциты Xenopus

Самок Xenopus laevis анестезировали с помощью 0.2% MS 222. Хирургическим путем извлекали три - пять долей яичника, которые помещали в раствор Барта (в мМ): (NaCl 96, KCl 2, HEPES 5, СаС12 1, MgCl2 2, гентамицин 0.1 мг/мл pH 7.5).

Ооциты очищались от оболочек яичника механически и путем инкубации в модифицированном растворе Барта, в котором отсутствовал антибиотик, кальций и была добавлена коллагеназа тип 1А 200мг/100мл. Для работы отбирали ооциты 5-6 стадии созревания (оценивались по размеру). С помощью инъектора Nanojet 2000 (WPI Inc.) на следующий день после изоляции в ооциты вводили 50 нл тотальной РНК (1мкг/мкл), выделенной из мозга крыс.

Ответы на аппликацию каината регистрировали на 3-5 день после инъекции. Ооциты хранились в растворе Барта при температуре 18 °С. Раствор для инкубации ооцитов менялся ежедневно.

Электрофизиологические исследования производились в растворе следующего состава (в мМ): NaCl 114, KCl 2.5, CaCI2 1.8, NaH2P04 0.3, pH 7.4. Ооциты укладывались в камеру для регистрации объемом около 200 мкл, что позволяло быстро (в течение 10-20 секунд) менять состав апплицируемого раствора.

Токи, вызванные агонистом, регистрировались с помощью метода двухэлектродной фиксации потенциала (усилитель Geneclamp 500).

Аппроксимация кривых доза - эффект производилась по уравнению:

(1о-1)/1о= 1/(1+1С5о/[В]"),

где 10 и I - амплитуда ответов в контроле и в присутствии блокатора, 1С50 -концентрация блокатора, вызывающая ответ с амплитудой 1/210, [В] - концентрация блокатора, п - коэффициент Хилла. Данные приведены как среднее ± стандартная ошибка. В каждой серии экспериментов число проведенных опытов было не менее 5. Для проверки статистических гипотез использован однофакторный дисперсионный анализ.

Реактивы приобретались в 81£та-А1с1псЬ, производные адамантана и фенилциклогексила (ИЭМ) синтезированы В.Е. Гмиро в Институте экспериментальной медицины РАМН, производные филантотоксина-433 синтезированы в Датском фармацевтическом университете в лаборатории проф. КпзПап З^вгг^аагс) (Дания).

Результаты исследования и их обсуждение

Сравнение блокирующей активности производных адамантана и фнлантотоксина-433 па АМРА рецепторах

Исследования с помощью гомологического ряда производных адамантана (где варьировалось расстояние между группировкой «головы» и концевым атомом азота) позволили построить модель строения сайта связывания каналоблокаторов в каналах АМРА рецепторов (ВоЬЬакоу е! а1., 2000). Согласно этой модели, в полости ионного канала существуют гидрофобный и нуклеофильный участки связывания, которые пространственно разнесены на расстояние ~ юА. Аналогичные эксперименты с использованием производных филантотоксина-433 позволили сделать предположение о дополнительном нуклеофильном участке связывания (Ме11ог е1 а1., 2004). Приведенный пример иллюстрирует ситуацию, когда использование лигандов различной природы в структурно-функциональном анализе может давать разное представление об устройстве полного канала (рис. 1).

Для определения причин несоответствия предложенных моделей строения АМРА рецепторов был использован новый гомологический ряд производных филантотоксина-433 РЬТх-5п, где п - количество метиленовых групп, разделяющих атомы азота п= [2, 8] (рис. 3). По сравнению с токсинами, использованными в работе Ме11ог е1 а1., 2004, данные соединения обладают «упрощенным» строением: уменьшено количество атомов азота в «хвостовой» части молекулы.

а) ВокЬакоу е1 а1.„ 2000 б) Ме11ог е1 а1., 2004

Рис. 1. Топографические модели строения ионного канала АМРА рецептора, разработанные с помощью производных адамантана (а) н филантотокс1ша-343 (б).

Красным и зеленым цветом обозначены основной и дополнительный, соответственно, нуклеофильные сайты. Пояснения в тексте.

Максимальной активностью в гомологическом ряду Р11Тх-5п обладало соединение

РЬТх-56 (1С5о=0.05±0,01мкМ (п=7)). Введение или удаление метиленовых групп,

разделяющих атомы азота в поликатионном «хвосте», приводило к снижению активности

соединений в 2-10 раз. Обнаруженная зависимость блокирующей активности от межазотного

расстояния хорошо согласуется с результатами, полученными ранее на дикатионных

производных адамантана (ВоЬЬакоу е! а1., 2005). Оба гомологических ряда имеют

выраженный максимум блокирующей активности при определенном межазотном расстоянии

(п) - 6 метиленовых групп (рис. 2).

2 3 4 5 6 7 8

число метиленовых групп между атомами азота (п)

Рис. 2. Сравнение блокирующей активности производных адамантана (А(1- N112 -(СН2)п- ГЧ+Мез) и филантотоксш1а-433 (РЬТх-5п) на АМРА рецепторах.

График зависимости ГС50 от числа метиленовых групп (п) в составе изученных соединений. Характер зависимости блокирующей активности от межазотного расстояния в гомологических рядах производных адамантана и филантотоксина-433 совпадает. * данные по блокирующему действию производных адамантана взяты из Во^Ьакоу а1., 2005

Соответствие данных, полученных на двух гомологических рядах, позволяет заключить, что для блокады АМРА рецепторов важным является строение поликатионного «хвоста», где терминальный атом азота удален от группировки «головы». В обоих гомологических рядах, таким образом, мы варьируем один и тот же параметр, а именно, количество метиленовых групп между группировкой «головы» и концевым атомом азота. В случае гомологического ряда РЬТх-5п к группировке «головы», таким образом, следует отнести часть молекулы до центрального атома азота полиметиленовой цепи (серая область на рис. 3). Следует отметить, что для филантотоксинов показана возможность образования внутримолекулярной водородной связи между одним из заряженных атомов азота полиметиленовой цепи и карбоксильными атомами тирозина и бутирилыюго заместителя при тирозине ("ПкЬопоу е! а1., 2004) (рис. 3). При стабилизации молекул водородной связью изменяется их пространственная организация: свернутые конформеры филантотоксинов должны иметь больший размер модифицированной группировки «головы» и меньшую длину «хвостовой» части, по сравнению с вытянутыми конформерами.

Рис. 3. Гомологические ряды производных адамантана и филантотокснна-433.

Стрелкой указано возможное образование внутримолекулярной связи. Пояснения см. в тексте.

Изучение потенциалозавиашости действия РИТх- 53 и РИТх- 26

Филантотоксины как блокаторы открытых ионных каналов обладают потенциалозависимостыо действия (МеНог 2003, МеИог&ШЬетоос! 2004). Известно, что гиперполяризация мембраны приводит к проникновению филантотоксинов внутрь клетки через ионные каналы квисквалатных рецепторов беспозвоночных (изЬешоос! 1991). Имеющиеся в литературе данные о прохождении производных филантотоксина-433 через глутаматные рецепторы позвоночных противоречивы (см. МеНог е! а1., 2003).

Для выявления возможности прохождения через каналы АМРА рецепторов производных филантотоксина-433, была изучена потенциалозависимость действия двух соединений: РЬТх-53 и РЬТх-26 на АМРА рецепторах. Они отличаются положением центрального атома азота в поликатионном радикале. В случае РЬТх-53 группировку «головы» и центральный атом азота разделяют пять метиленовых групп, а в молекуле РЬТх-

Гомологический ряд производных Гомологический

I омологическии ряд производных

филантотоксина-433 (РЬТх-5п)

адамантана

26 - две метиленовые группы. Предварительные расчеты конформации РЬТх-53 и РЬТх-26 (Тихонов Д.Б., неопубл. данные) позволяют предположить, что они блокируют АМРА рецепторы в свернутом состоянии.

Для обоих токсинов увеличение потенциала фиксации в диапазоне от -40 до -80 мВ приводило к усилению блокады. Начиная с потенциала -80мВ, -100 мВ дальнейшего нарастания блока не происходило. Для высоких концентраций это могло бы объясняться неоднородностью популяции рецепторов по чувствительности к блокатору, поскольку в работе использована тотальная РНК мозга крысы. Однако данное свойство сохранялось при ненасыщающих концентрациях блокатора (0,11С5о), когда максимальная блокада достигала 60%. Это указывает на возможность прохождения блокатора внутрь клетки при гиперполяризации, что уменьшает эффективность блокады при низких потенциалах.

— РИТх-53

-20-

-1-■-1---1---г-1-1-■-1-■-1-•

-160 -140 -120 -100 -80 -60 -40

Потенциал фиксации, мВ

Рис. 4. Зависимость блокирующей активности PhTx-52 н PhTx-26 от потенциала фиксации. Приведены кривые зависимости блокады от потенциала фиксации для трех концентраций (O.IIC50, IC50, IOIC50) PhTx-53 (черная кривая) и PhTx-26 (красная кривая). Величина IC50 определена при потенциале -80 мВ. При гиперполяризации мембраны для обоих соединений не происходило полного угнетения АМРА рецепторов.

Следует отметить, что в свернутой конформации размер группировки «головы» блокатора превышает величину селективного фильтра АМПА рецепторов - 7.8 Á (Burnashev et al., 1996). Размер гидрофобной группировки филантотоксина-343 в свернутой конформации составляет 11Á (Tikhonov et al., 2000). Таким образом, обнаруженное прохождение крупных молекул производных филантотоксина-433 через каналы АМПА рецепторов требует дальнейшего изучения, так как использование стерической модели не объясняет полученные данные.

Поскольку важной особенностью филантотоксинов является способность к изомеризации, был изучен ее вклад в активность соединений. Для этого были синтезированы производные филантотоксина-433 с различным строением группировки «головы» и полиметиленового радикала. Оба структурных компонента определяют вероятность образования внутримолекулярной водородной связи и должны влиять на эффективность взаимодействия с ионными каналами АМРА и NMDA рецепторов.

Сравнение блокирующей активности филантотоксинов с различным строением группировки «головы».

Введение гетероциклической структуры пиперидина в поликатионный радикал (соединения 5-9) приводило к потере способности блокировать NMDA рецепторы (табл. 1). Такое строение группировки «головы» не оптимально для блокады NMDA рецепторов.

С другой стороны, эти соединения обладали избирательностью по отношению к АМРА рецепторам, что, по всей видимости, объясняется строением дикатионного радикала. В ряду соединений с одинаковым строением шейки между «пиридином» и прилежащим атомом азота максимальной активностью обладало соединение, в котором атомы азота разделены 7 метиленовыми группами (соединение 8). Увеличение или уменьшение этого расстояния приводило к падению активности данных блокаторов. Обнаруженная зависимость совпадает с полученной нами ранее зависимостью блокирующей активности от межазотного расстояния в гомологических рядах адамантапа и фенилциклогексила (см. выше сравнение блокирующей активности производных адамантана и филантотоксина-433 на АМРА рецепторах).

В остальных случаях (соединения 1 -4) зависимости активности и избирательности от строения соединений не наблюдалось. Все исследованные производные филантотоксина с радикалами адамантана, нафталина, пиперидина, дифенила являлись высокоэффективными и неизбирательными. Подобное варьирование структуры «головы» у дикатионных производных адамантана приводило к потере их активности по отношению к АМРА рецепторам (Bolshakov et al., 2005). Наблюдаемые различия между производными адамантана и филантотоксина-433 могут объясняться изомеризацией последних.

Можно заключить, что введение в состав группировки «головы» блокатора приведенных заместителей (соединения 1-4), не приводило к сильному падению их активности как антагонистов NMDA рецепторов. Незначительное увеличение 1С5о наблюдалось только для карбоксиадамантанового соединения. Изменение строения группировки «головы» среди этих молекул не сказывалось на их блокирующей активности на АМРА рецепторах.

Таблица 1.

Строение производных филаитотоксина-433 с массивной группировкой

«головы» и их действие па АМРА и NMDA рецепторы

№ Структура Ю50, мкМ (число опытов)

ИМОА АМРА

1, \Vari 3.10/11-13 0.8±0.1 (п=6) 1,1±0,3 (п=7)

2, \Vaii 3.10/11-15 о^-ГГ5-' п/а 0,5±0,6 (п=8)

3, Ч/т 3.10/11-16 0.7±0.2 (п=8) п/а

4, САО 3.78В ____ ЪААД !И V* • <».« «с: 2.4±0.3 (п=7) п/а

5, АУап 3.27В п/а 1±0.1 (п=6)

6, \Уап 3.27С >300 (п=7) 2±0.4 (п=8)

7,4/ ап 3.270 Г с мл » гоземз 62,1±13,6 (п=7) 0,8±0,2(п=6)

8, \Уап 3.27Е >300 (п=6) 0,21±0,05 (п=8)

9, Wan 3.27Р НС.. О >300(п=5) 1,2±0,1 (п=7)

Примечание: в данном ряду производных филантотоксина-433 к группировке «головы» были добавлены заместители адамантана (№4), нафталина(№3), дифенила (№2). В соединениях 59 атом азота полиамшшого «хвоста» включен в пиперидиновый гетероцикл.

Изучение блокады глутаматных рецепторов производными филаптотоксчна-433 с ограниченной гибкостью полиметипенового радикала

Одним из способов затруднить образование водородной связи является уменьшение конформационной гибкости производных филантотоксина-433 путем введения циклических структур в «хвостовую» группировку блокатора (соединения 10-16) (табл. 2)

Таблица 2.

Строение производных филантотоксина-433 с ограниченной конформационной гибкостью и их действие на АМРА и NMDA рецепторы.

№ Структура IC50, мкМ (число опытов)

NMDA AMPA

10 0 Mol. Wt.: 433.4220 >300 (n=5) >300(n=4)

11 о Mol. Wt.: 658 6302 37,7±2,6 (n=6) 100±16(n=6)

12 x^-^q 0 Mot Wt 883.8384 >300 (n=5) 0,69±0,08(n=7)

13 /чА0 ° Mol. Wl : 883.8334 15,2±7,9 (n=6) 2,5±1,5 (n=8)

14 0 Mol. Wt: 657.8011 19,1 ±6,1 (n=5) 0,12±0,03(n=7)

15 ^XX ° Mol. Wl.: 76a 8270 2,5±0,5 (n=7) 5.8±1.3(n=6)

16 "tx . ----^o0 Mol Wt : 671 6687 88,7±7,7 (n=6) 0,51±0,36 (n=8)

Примечание: Ограничение конформационной гибкости достигается путем введения в состав полиметиленового «хвоста» циклических структур.

В соединении 10 оба атома азота полиметиленового радикала связанны гетероциклом, который ограничивает набор конформаций. Данное соединение было неактивно в отношении АМРА и ЫМЭА рецепторов (1С5о>300 мкМ). Увеличение длины и количества атомов азота приводило к тому, что соединения становились активными как на АМРА, так и на ИМЭА рецепторах (соединения 11-16). По некоторым структурным характеристикам эти соединения можно объединить в группы:

Короткое соединение 11 было слабоактивно при блокаде как АМРА, так и КМБА рецепторов. Увеличение длины молекулы путем вставки дополнительного гетероцикла

(соединение 12) приводило к увеличению активности в 100 раз на АМРА рецепторах, при сохранении низкой активности по отношению к NMDA рецепторам. Таким образом, соединение 11 не является эффективным каналоблокатором глутаматных рецепторов, а соединение 12 приобрело избирательность к АМРА рецепторам.

Среди блокаторов 13-15 на АМРА рецепторах самым активным оказалось соединение 14, которое обладает максимальной гибкостью «хвостовой» части. На NMDA рецепторах все три соединения обладали промежуточной активностью.

Соединение 16 не имеет «вставки» гетероцикла при первом азоте. В «хвостовой» части молекулы находятся два гетероцикла, что обеспечивает вытянутую конформацию. На АМРА рецепторах оно было на два порядка более активным, чем на NMDA рецепторах.

Полученные в настоящей работе данные позволяют заключить, что противоречия, возникающие при построении моделей строения сайтов связывания каналоблокаторов в АМРА рецепторах, снимаются, если учитывать трехмерную конформацию филантотоксинов. Активность каналоблокаторов NMDA рецепторов во многом определяется строением группировки «головы». Для блокады АМРА рецепторов строение группировки «головы» менее важно и на активность влияет преимущественно строение поликатионного «хвоста».

Выявление дополнительных мод действия блокаторов нонных каналов на глутаматпые рецепторы

Оценка действия блокаторов на десенситизацию NMDA рецепторов

Блокаторы открытых ионных каналов NMDA рецепторов характеризуются различными механизмами действия. Так, например, МК-801 и фенциклидин остаются связанными внутри ионной поры после диссоциации агониста и являются блокаторами «ловушечного» типа (MacDonald et al., 1991). Некоторые блокаторы (9-аминоакридин, бикукуллин) препятствуют диссоциации агониста из связанных с блокатором рецепторов и закрытию канала, т.е. действуют по механизму «foot-in-the-door» (Wright & Novak, 1992, Benveniste & Mayer, 1995). Большинство блокаторов обладают промежуточным механизмом действия и характеризуются частичной ловушкой (Mealing et al., 1999).

Следствием разного механизма действия является возможность влияния на «видимую» десенситизацию рецепторов. Нельзя также исключать прямого действия этих веществ на десенситизацию NMDA рецепторов посредством специфических сайтов, расположенных вне полости ионного канала (Usherwood 2004). При оценке действия блокаторов на десенситизацию NMDA рецепторов, необходимо учитывать все вышеперечисленные возможности.

Поскольку «видимая» десеиситизация рецепторов связана с механизмом блокады, были использованы блокаторы с различными механизмами действия: ИЭМ-2044 - высокая степень «ловушки», ИЭМ-2014 - слабая степень «ловушки». Для того чтобы оценить вклад возможного дополнительного эффекта в интерпретацию клинических данных, было изучено действие широко применяемого на практике соединения - мемантина (Parsons et al., 2007).

А100

Мемантин, 1 мкМ А100

А100

ИЭМ-2044, 0.5 мкМ А100

блокада плато 53% блокада пика 12% ловушка 71%

блокада плато 41% блокада пика 25% ловушка 74%

ИЭМ-2014, 5 мкМ А100 А100

Рис. 5. Угнетающее действие производных адамантана и фениклцнклогексила на NMDA рецепторы.

Приведены осциллограммы ответов NMDA рецепторов на аппликацию агониста А100 (аспартат 100 мкМ + глицин ЮмкМ) и агониста в присутствии блокаторов (мемантин, ИЭМ-2044, ИЭМ-2014 в концентрациях 1мкМ, 0.5мкМ, 5мкМ, соответственно). Измерения блокады оценивались после 4-х аппликаций раствора агониста с блокатором, когда достигалось полное развитие блокады. Для каждого из соединений приведены угнетение пикового и стационарного компонентов NMDA ответов, а также степень ловушки*. В условиях равновесной блокады соединения изменяли соотношение пик/плато. Этот эффект не был связан с механизмом их блокирущего действия на NMDA рецепторы (степенью ловушки).

* значения степени ловушки для блокаторов взяты из работ Mealing et al., 1999; Bolshakov et al., 2003

Все соединения угнетали пиковые и стационарные компоненты NMDA ответов (рис. 5). Необходимо отметить, что уменьшение амплитуды пикового компонента происходило в меньшей степени по сравнению со стационарным, что приводило к изменению соотношения пик/плато NMDA ответов.

Схожее изменение соотношения пик/плато было отмечено при действии ИЭМ-2014 и мемантина: сильное угнетение плато и незначительное уменьшение амплитуды пикового компонента. При этом степени ловушки для ИЭМ-2014 и мемантина отличаются и составляют 43% и 71%, соответственно (данные взяты из работ Bolshakov et al., 2003, Mealing et al., 2004). С другой стороны, блокаторы, имеющие схожие степени ловушки (ИЭМ-2044 - 74% и мемантин - 71%), по-разному влияли на соотношение пик/плато: при действии ИЭМ-2044 этот параметр изменялся в меньшей степени, по сравнению с мемантином. Соотношение пик/плато NMDA ответов является одним из параметров, отражающих десенситизацию рецепторов. Таким образом, в проведенных экспериментах зависимость между механизмом блокады и степенью влияния изученных каналоблокаторов на десенситизацию отсутствовала.

В следующей серии экспериментов было изучено влияние каналоблокаторов с разным механизмом действия на параметры десенситизации NMDA рецепторов. Для оценки равновесной десенситизации использован следующий протокол. Сначала регистрировалась величина пикового компонента NMDA ответа (II) на аппликацию агониста (контрольный ответ). После этого клетку перемещали на некоторое время (10 секунд) в раствор с пониженной концентрацией агониста (раствор предобработки). Вследствие десенситизации рецепторов повторная аппликация агониста вызывала меньший по амплитуде ответ 12 (тестовый ответ) (рис. 6).

Для оценки влияния блокаторов на десенситизацию мы повторяли этот протокол в присутствии исследуемых соединений. Для того чтобы исключить вклад блокады (переходных процессов) в наблюдаемое угнетение NMDA ответов, измерения проводились только после полного развития блокады (т.е. по достижении равновесного состояния между блокированными, открытыми и десенситизированными рецепторами) при выбранной концентрации каналоблокатора.

В присутствии всех исследованных блокаторов наблюдалось уменьшение соотношения h/Ii по сравнению с контрольным, что отражало усиление десенситизации NMDA рецепторов (рис. 6). Наиболее выраженным эффектом обладал мемантин, который усиливал десенситизацию в три раза по сравнению с контролем (2,97 ± 1,41 (п=12)).

Мемантин, 1мкМ А100 А10 А100 А100 А10 А100

б)

Рис. 6. Действие блокаторов на десенситизацмю NMDA рецепторов

а) Осциллограмма, иллюстрирующая экспериментальный протокол. Условные обозначения такие же, как на рис. 5. б) Усиление десенситизации ЫМЭА рецепторов в присутствии исследованных веществ. Соотношение 12/1 ь отражающее степень десенситизации, взято за 1. В присутствии блокаторов ЫМОА рецепторов степень десенситизации усиливается (соотношение Ь/1| уменьшается).

Зависимость между степенью ловушки и усилением десенситизации отсутствует, поэтому наблюдаемый эффект, по всей видимости, не связан с блокадой ионного канала.

Степень ловушки, отражающая механизм действия каналоблокатора, и степень

усиления десенситизации не коррелировали. ИЭМ-2044 и ИЭМ-2014 различаются по

степени ловушки, между тем одинаково усиливали десенситизацию рецепторов.

Потенциалозависимость блокады ионного канала и эффекта на десенситизацию Известно, что блокаторы открытых каналов характеризуются потенциалозависимым действием. Для того чтобы исследовать взаимосвязь наблюдаемых феноменов, была изучена

зависимость блокады ионного канала и эффекта на десенситизацию от мембранного потенциала.

Блокада, измеренная по стационарному компоненту ответа, зависела от потенциала фиксации и составляла 33.1±2,5% (п=7) при -40мВ и 68.4±2,81% при -80мВ, что соответствует ранее полученным данным (Blanpied et al., 1997; Mealing et al., 1999; Bolshakov et al., 2003). В то же время, степень десенситизации NMDA рецепторов в контроле и в присутствии блокаторов не зависела от мембранного потенциала (рис. 7).

а)

б)

Десенситизация Десенситизация Блокада плато Блокада плато (-80мВ) (-40мВ) (-40мВ) (-80мВ)

Рис. 7. Потенциалозависимость блокады ионных каналов и десенситизации 1Ч]УША рецепторов

а) Осциллограммы, иллюстрирующие экспериментальный протокол. Эксперименты проведены при потенциале фиксации -40мВ и -80мВ. Условные обозначения такие же, как на рис. 5. б) Столбчатая диаграмма, отражающая влияние мембранного потенциала на блокаду ионных каналов и десенситизацию ЫМОА рецепторов. Десенситизация в присутствии мемантина не зависела от мембранного потенциала, в то же время блокада ионного канала усиливалась при гиперполяризации нейрона.

Зависимость эффекта на десенситизацию от концентрации глицина Известно, что концентрация глицина 10 мкМ не является насыщающей для гетеромеров ЫГМ/ЫРИа. Между тем рецепторы такого субъединичного состава превалируют в гиппокампе (От§1ес1те е1 а1., 1999). При этом глицин, являясь коагонистом ЫМЭА рецепторов, во многом определяет параметры их десенситизации. Для того, чтобы выяснить, будут ли зависеть параметры десенситизации ЫМОА рецепторов и обнаруженный эффект блокаторов от концентрации глицина, мы провели аналогичные эксперименты при повышенном содержании глицина в растворах -100 мкМ (рис. 8).

В контрольных экспериментах без блокатора (рис.8 - а,б) увеличение концентрации глицина вызывало достоверное уменьшение соотношения 12Я1 в 1.2±0.2 раза (п=6). Десенситизация ЫМОА рецепторов, таким образом, усиливалась при повышении концентрации глицина.

А10(Ю10 АКЮЮ А100С10

Мемантин, 1 мкМ

АНЮСЮ АЮвЮ А10(Ю10

5с

в)

Мемантин, ЧмкМ

АЮОБЮО А1(Ю100 А10(Ю100

А1002100 А1(К3100 АЮОСЮО

б)

Рис. 8. Эффект глицина на десенситизацию NMDA рецепторов.

Примеры осциллограмм при разных концентрациях глицина. ¿¡10 - глицин 10 мкМ, в 100 - глицин 100 мкМ, А10 - аспаргаг ЮмкМ, А100- аспартат ЮОмкМ. Пары осциллограмм а, б и в,г записаны на разных нейронах. Повышение концентрации глицина усиливало десенситизацию НМОА рецепторов как в контроле, так и в присутствии блокатора.

Схожее усиление десенситизации при повышении концентрации глицина происходило и в присутствии блокатора (мемантин, 1мкМ). Уменьшение соотношения 12/1| в таких экспериментах (рис. 8 - в,г) составляло 1.5±0.2 раза (п=6). Усиление десенситизации в присутствии блокатора не зависело от концентрации глицина в изученном диапазоне.

Таким образом, можно заключить, что усиление десенситизации ЫКГОА рецепторов -это дополнительный эффект блокаторов на глутаматные рецепторы, проявление которого не связано с основным механизмом действия этих веществ. Объяснить полученные данные можно, предположив существование дополнительного внеканального участка связывания блокаторов с рецептором.

ВЫВОДЫ

1. Соответствие данных, полученных на гомологических рядах филантотоксинов-5п и адамантанов, позволяет заключить, что для блокады АМРА рецепторов важным является строение поликатионного «хвоста», где терминальный атом азота удален от группировки «головы». Модель с разнесенными нуклеофильным и гидрофобными сайтами связывания, предложенная в нашей лаборатории для описания блокады АМРА рецепторов производными адамантана, позволяет объяснить и данные по блокаде производными филантотоксина-433, если учесть образование внутримолекулярной водородной связи в их молекулах. Проведение структурно-функционального анализа производных филантотоксина-433 необходимо сочетать с расчетом конформаций их молекул.

2. Самыми активными блокаторами АМРА и ЫМЭА рецепторов являются производные филантотоксина-433, имеющие наиболее гибкую длинную полиметиленовую цепь. Строение группировки «головы» молекулы важно в случае блокады ЫМБА рецепторов, и оказывает незначительный эффект на блокаду АМРА рецепторов.

3. Для классических блокаторов ионных каналов ИМБА рецепторов показано существование непотенциалозависимого действия - усиление десенситизации. Обнаруженный эффект, связан, по всей видимости, с существованием дополнительного неканального сайта связывания.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Барыгин О.Д., Иванова О.Н., Николаев М.В. Взаимодействие конкурентных и неконкурентных антагонистов с ионотропными глутаматными рецепторами. // Вестник молодых ученых (серия: науки о жизни Г2004). - СПб., 2004. - №2,- С. 11-19.

2. Nikolaev М. Investigation of АМРА type glutamate ionotropic recrptors with philantotoxin-433 derivatives. // European Journal of Medical Research. -Berlin (Germany). -2006.-Vol. 11.-P. 127-128.

3. Nikolaev M. Philantotoxin-343 blocking action on AMPA receptors: effect of "head moiety" and polycationic "tail" structure. // PENS Summer Course "Contemprorary Problems of Neurobiology: Molecular Mechnisms of Synaptic Plasticity". - Kazan.- 2007. - P. 19-20.

4. Николаев M.B., Большаков K.B. Блокада рецепторов АМПА и НМДА типов производными филантотоксина-433. // XX съезд физиологического общества им И.П. Павлова, Тезисы докладов. -М.: Издательский дом «Русский врач», 2007.- С. 154-155.

5. Nikolaev M.V., Bolshakov K.V. Unusual glutamate receptors channel blockers action on desensitization kinetics // The Physiological Society International Workshop: Latest Advances in ion channel techniques applied to physiological problems. - Shanghai (China). - 2008. - P.31

6. Николаев M.B., Большаков K.B. Усиление десенситизации как дополнительный механизм действия блокаторов ионных каналов глутаматных рецепторов // Биологические мембраны; материалы междунар. науч. конф. «Ионные каналы: структура и функции. - СПб, 2009 - Т. 26, № 4. - С. 322-323.

7. Dorofeeva N.A., Karpushev A.V., Nikolaev M.V., Bolshakov K.V., Stockand J.D., Staruschenko A. Muscarinic Ml modulation of acid-sensing ion channels //Neuroreport. Vol. 20, N 15.-2009.-P. 1386-1391.

Лицензия ЛР № 020593 от 07.08.97

Подписано в печать 06.11.2009. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,0. Уч.-изд. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 5131Ь.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.: (812)550-40-14 Тел./факс: (812) 297-57-76

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Николаев, Максим Владимирович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: СТРОЕНИЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ГЛУТАМАТНЫХ

РЕЦЕПТОРОВ.

1.1 Строение глутаматных рецепторов.

1.1.1 Субъединичный состав и свойства.

1.1.2 Стехиометрия и топология.

1.2 Функциональные свойства.^

1.2.1 N- и С- терминальные домены.

1.2.2 Активация глутаматных рецепторов.

1.2.3 Десенситизация и ее регуляция.

1.2.4 Строение и свойства ионных каналов.

1.2.5 Механизмы блокады глутаматных рецепторов.

1.2.6 Дополнительные механизмы действия блокаторов ионных каналов глутаматных рецепторов.3 g

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 3. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОТНОШЕНИЯ В РЯДАХ БЛОКАТОРОВ ИОННЫХ КАНАЛОВ NMDA И АМРА

РЕЦЕПТОРОВ.

3.1. Изучение взаимодействия производных филантотоксина

433 с глутаматными рецепторами.

3.1.1 Сравнение блокирующей активности производных адамантана и филантотоксина-433 на АМРА рецепторах.

3.1.2 Изучение потенциалозависимости действия PhTx

53 и PhTx-26.

3.1.3 Сравнение блокирующей активности филантотоксинов с различным строением группировки головы.

3.1.4 Изучение блокады глутаматных рецепторов производными филантотоксина-433 с ограниченной гибкостью полиметиленового радикала.

3.2 Выявление дополнительных механизмов действия блокаторов ионных каналов на глутаматные рецепторы.

3.2.1.Оценка действия блокаторов на десенситизацию NMDA рецепторов.

3.2.2 Потенциалозависимость блокады ионного канала и эффекта на десенситизацию.

3.2.3 Зависимость эффекта на десенситизацию от концентрации глицина.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-функциональные отношения в рядах блокаторов глутаматных рецепторов NMDA и AMPA типов"

Актуальность проблемы

Основные возбуждающие синапсы в ЦНС позвоночных глутаматергические. Быстрый компонент возбуждающих постсинаптических токов опосредуется активацией глутаматных ионотропных рецепторов — лигандуправляемых ионных каналов. По чувствительности к агонистам в семействе глутаматных ионотропных рецепторов выделяют AMP A, NMDA и каинатные рецепторы, которые различаются по функциональным и фармакологическим характеристикам.

Глутаматные рецепторы построены из четырех субъединиц и являются гетеромерами. При этом большинство субъединиц могут быть представлены разными сплайс-версиями и подвергаться редактированию. Таким образом за счет многообразия вариантов субъединиц и их комбинаций в составе белкового комплекса глутаматного рецептора расширяется количество его функциональных форм. Экспрессия определенных видов субъединиц зависит от типа нейрона и направлена на оптимальное выполнение функциональных задач. Например, для локализации источника звука требуется высокое временное разрешение сигналов, поэтому в соответствующих ядрах звукового анализатора нейроны синтезируют определенные подтипы АМРА рецепторов, обладающие быстрой кинетикой десенситизации (Gardner et al., 1999).

Помимо генетически обусловленного структурного и как следствие функционального разнообразия, глутаматные рецепторы могут подвергаться различным регулирующим воздействиям, с помощью которых обеспечивается тонкая настройка глутаматергической передачи. Важную роль в процессах синаптической пластичности играют вспомогательные белки, которые обеспечивают встраивание субъединиц в мембрану и образование тетрамеров, а также регулируют времена жизни и количество рецепторов. Наиболее изученные формы синаптической пластичности, участвующие в процессах памяти и обучения, - долговременная потенциация (LTP) и долговременная депрессия (LTD), сопровождаются, соответственно, усилением экзо- или эндоцитоза АМРА рецепторов (Man et al., 2000; Mack et al., 2001; Yuetal., 2008)

Значительное влияние на глутаматные рецепторы оказывают различные посттрансляционные модификации белка. Фосфорилирование АМРА рецепторов, например, приводит к увеличению вероятности перехода ионных каналов в открытое состояние (Derkach et al., 1999). Функциональные характеристики глутаматных рецепторов меняются под действием эндогенных модуляторов, к которым относятся полиамины, протоны, ионы магния, кальция, цинка и лития, оксиданты (Dingledine, 1999).

С момента открытия глутаматергической нейропередачи найдено и синтезировано множество лигандов, взаимодействовующих с ионотропными глутаматными рецепторами.

Эти соединения могут обладать разной степенью избирательности в отношении субъединичного состава, характеризуются различными участками связывания и молекулярными механизмами действия на глутаматные рецепторы. Поэтому, они являются незаменимыми фармакологическими инструментами для изучения вопросов строения, функционирования и физиологической роли глутаматных рецепторов.

С другой стороны, эти вещества могут быть использованы в качестве агентов для коррекции патологических состояний, связанных с нарушением глутаматергической передачи (Bowie 2008). Особое внимание уделяется неконкурентным антагонистам - блокаторам ионных каналов, способным уменьшать последствия гиперактивации глутаматных рецепторов. Некоторые из них успешно прошли клинические испытания и в настоящее время широко применяются для лечения слабоумия, болезни Паркинсона и в качестве анальгетиков (Parsons et al., 1999).

Однако практическое использование большинства известных блокаторов ионных каналов ограничено или неприемлемо, вследствие побочных эффектов, проявляющихся, например, в двигательных и психических расстройствах (Lipton, 1993, Brown & Krupp 2006). Причинами побочных эффектов могут быть механизм блокирующего действия, селективность блокатора к субъединичному составу рецептора. Нельзя исключать также существование нескольких участков связывания блокатора с глутаматным рецептором, что может проявляться в виде дополнительных механизмов действия. Так, множество участков связывания с NMDA рецепторами показано для полиаминов. Взаимодействие с разными участками может приводить либо к угнетению, либо к усилению активности NMDA рецепторов (Williams 1997).

Цель исследования состояла в изучении молекулярных механизмов блокирующего и модулирующего действия каналоблокаторов глутаматных рецепторов АМРА и NMDA типов.

Задачи

1. Изучить блокирующую активность производных филантотоксина-433 с ограниченной конформационной гибкостью поликатионного «хвоста» и различным строением гидрофобной группировки «головы». Оценить возможность использования этих соединений для исследования структуры и функционирования глутаматных рецепторов

2. Опеределить зависимость между блокадой и десенситизацией NMDA-рецепторов.

Научная новизна

Проведенные в рамках поставленной задачи исследования действия производных филантотоксина-433 позволили определить причину несоответствий моделей строения АМРА рецепторов, полученных с использованием веществ различной природы. При изучении структуры и функций глутаматных рецепторов с помощью производных филантотоксина-433 необходимо учитывать возможность образования внутримолекулярной водородной связи. Поэтому при проведении структурно-функционального анализа необходимо использовать молекулярное моделирование для определения пространственной организации молекулярного комплекса блокатор-ионный канал.

Исследованные в работе производные фенилциклогексила и адамантана усиливали десенситизацию NMDA рецепторов. Влияние на десенситизацию не было связано с механизмом действия этих соединений как блокаторов каналов: корреляция между степенью ловушки и усилением десенситизации отсутствовала. Более того, обнаруженный эффект не зависел от мембранного потенциала, т.е., по всей видимости, не был связан с блокадой ионного 4 канала. Мы предполагаем существование дополнительного внеканального участка, связывание с которым опосредует наблюдаемый эффект на десенситизацию.

Теоретическое и практическое значение работы

Проведенные в рамках поставленных задач исследования позволили детально изучить молекулярные механизмы действия антагонистов глутаматных рецепторов. Для проведения структурно-функционального анализа требуется использование максимально простых химических соединений. Для изучения особенностей, определяющих избирательность и активность производных филантотоксина-433 необходимо молекулярное моделирование конформации молекул б локатора. В этом случае исчезают противоречия, имеющиеся при построении моделей строения каналов глутаматных рецепторов.

Показано, что соединения, основное действие которых связывают с блокадой открытого ионного канала, способны модулировать активность NMDA рецепторов путем усиления степени их десенситизации. По всей вероятности, усиление десенситизации опосредуется дополнительным внеканальным участком связывания. Этот -факт является существенным дополнением к пониманию фундаментальных вопросов строения и функционирования глутаматных рецепторов. Дальнейшая характеристика обнаруженного эффекта, его проявления в зависимости от субъединичного состава, ионного окружения, позволит более подробно изучить действие антагонистов на глутаматные рецепторы и должно помочь в разработке новых эффективных и безопасных препаратов для лечения расстройств нервной системы. Обнаруженное усиление десенситизации в присутствии классических каналоблокаторов NMDA рецепторов следует учитывать при интерпретации данных, получаемых при их применении в качестве препаратов для лечения глутамат-опосредованной цитотоксичности.

Положения, выносимые на защиту

1. Ограничение конформационной гибкости «хвостовой» части и варьирование строения группировки «головы» сказывается на блокирующей активности производных филантотоксина-433 и определяет их избирательность к разным типам глутаматных рецепторов. Избирательные каналоблокаторы АМРА рецепторов имеют вытянутый поликатионный хвост», в то время как для угнетения NMDA рецепторов критичным является строение группировки «головы».

3. Синтетические блокаторы ионных каналов - производные фенилциклогексила и адамантана - обладают дополнительным действием на NMDA рецепторы, не связанным с блокадой ионного канала. Они усиливают десенситизацию NMDA рецепторов.

Апробации работы

Основные материалы диссертации были доложены и обсуждены на научных конференциях:

- 17-European students' conference Promising medical scientist willing to look beyond, 8-12 October 2006, Charite, Berlin, Germany;

- PENS Summer Course Contemprorary Problems of Neurobiology: Molecular Mechanisms of Synaptic Plasticity, 10-24 September 2007, Kazan, Russia;

- 20 съезд физиологического общества им И.П. Павлова, 4-8 июня 2007, Москва, Россия;

- The Physiological Society International Workshop Latest Advances in ion channel techniques applied to physiological problems, 12-16 September 2008, Shanghai, China;

- Международная научная конференция Ионные каналы: структура и функции, 17-18 марта 2009, Санкт-Петербург, Россия.

Публикации

По материалам диссертации опубликованы 7 печатных работ (2 статьи и 5 тезисов докладов).

Структура и объем диссертации.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Николаев, Максим Владимирович

ВЫВОДЫ

2. Самыми активными блокаторами АМРА и NMDA рецепторов являются производные филантотоксина-433, имеющие наиболее гибкую длинную полиметиленовую цепь. Строение группировки «головы» молекулы важно в случае блокады NMDA рецепторов, и оказывает незначительный эффект на блокаду АМРА рецепторов.

3. Для классических блокаторов ионных каналов NMDA рецепторов показано существование непотенциалозависимого действия — усиление десенситизации. Обнаруженный эффект, связан, по всей видимости, с существованием дополнительного неканального сайта связывания.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение взаимодействия производных филантотоксина-433 с глутаматными рецепторами

Используя новые гомологические ряды производных филантотоксина-433, были изучены особенности их строения, определяющие селективность и механизм действия. Наиболее активными блокаторами АМРА и NMDA рецепторов были производные филантотоксина-433 с наибольшим количеством атомов азота, максимальной длиной и гибкостью полиметиленовой цепи. Ограничение конформационной гибкости хвостовой части молекулы путем введения гетероциклов в большинстве случаев сопровождалось потерей активности блокаторов как на АМРА, так и NMDA рецепторах.

Строение группировки головы (ее стерические размеры в пределах изученных соединений) незначительно влияло на активность веществ на АМРА рецепторах и сильно сказывалось на блокаде NMDA рецепторов. Это позволяет сделать предположение о различиях в строении вестибюля ионных каналов АМРА и NMDA рецепторов. Дальнейшее исследование глутаматных рецепторов с помощью новых гомологических рядов токсинов позволит более четко идентифицировать и фармакологически охарактеризовать сайты связывания производных филантотоксина-433 в ионной поре глутаматных рецепторов.

Полученные в настоящей работе данные позволяют заключить, что противоречия между моделями строения сайтов связывания блокаторов в каналах АМРА рецепторов, снимаются, если учитывать строение производных филантотоксина-433. Поэтому структурно-функциональный анализ обязательно должен включать расчет возможных конформаций этих молекул.

Другой фактор, который необходимо учитывать при использовании производных филантотоксина-433 - это прохождение внутрь клетки через открытые ионные каналы. В наших экспериментах по изучению потенциалозависимости действия PhTx-26 и PhTx-53 установлено, что оба соединения обладают этим свойством. При этом образование водородной связи в молекуле блокатора, приводящее к увеличению стерических размеров, не влияет на его прохождение через ионные каналы.

Ранее было показано, что гиперполяризация может приводить к проникновению филантотоксинов через ионные каналы квисквалатных рецепторов беспозвоночных (Usherwood 1991). Однако, диаметр их селективного фильтра (около 11 А) превышает диаметр селективного фильтра АМРА рецепторов - 7.8А (Burnashev et al., 1996). Это не позволяет переносить данные, полученные на беспозвоночных, на АМРА рецепторы позвоночных.

Большинство изученных в нашей лаборатории производных адамантана и фенилциклогексила проходят через каналы АМРА рецепторов в процессе блокады (Bolshakov et al., 2005). Однако, проходящая через АМРА каналы молекула производных фенилциклогексила имеет, согласно расчетам, размеры гидрофобной группировки 7x5x9 A (Bolshakov et al., 2003), что находится на границе диаметра их селективного фильтра.

Размер группировки головы филантотоксина-343 в свернутой конформации составляет llA (Tikhonov et al., 2000) и превышает диаметр селективного фильтра АМРА рецепторов - 7.8 A (Burnashev et al., 1996b). Поэтому обнаруженное свойство прохождения крупных молекул производных филантотоксина-433 через каналы АМРА рецепторов требует дальнейшего изучения, а использование только стерической модели не в состоянии объяснить полученные данные.

Выявление дополнительных механизмов действия блокаторов ионных каналов на глутаматные рецепторы

Проведенные исследования действия мемантина и производных фенилциклогексила (ИЭМ-2014, ИЭМ-2044) показали, что все три соединения усиливают десенситизацию NMDA рецепторов. Этот эффект не связан с блокадой открытого ионного канала и опосредуется, по всей видимости, связыванием с внеканальным участком в NMDA рецепторах.

Использованные в работе соединения характеризуются различными механизмами блокирующего действия на NMDA рецепторы. Разные механизмы действия блокаторов обусловлены наличием двух сайтов связывания в полости ионного канала - поверхностного и глубокого (Blanpied et al., 1997; Sobolevsky et al., 1998; Bolshakov et al., 2003). Соотношение сродства к тому или иному сайту определяет степень ловушки, т.е. механизм действия. Связывание с обоими сайтами зависит от мембранного потенциала (Mayer et al., 1984; Benveniste & Mayer 1995).

Обнаруженное непотенциалозависимое действие каналоблокаторов на десенситизацию позволяет предположить существование дополнительного участка связывания. Напомним, что естественные блокаторы NMDA рецепторов (полиамины, токсины и их производные) обладают множеством эффектов на глутаматные рецепторы. Эксперименты на нативных и рекомбинантных рецепторах указывают на то, что, помимо основного блокирующего действия на открытые ионные каналы, эти соединения способны модулировать работу глутаматных рецепторов, связываясь с внеканальными участками рецептора (Rock & Macdonald 1992; Paoletti et al. 1995; Kashiwagi et al., 1996; Stoll et al. 2007; Jin et al. 2008). Несколько участков связывания показано, например, для спермина (Kashiwagi et al., 1997). Описано потенциалозависимое и потенциалонезависимое действие спермина (Benveniste & Mayer 1993). Связывание в полости канала NMDA рецептора препятствует току ионов и зависит от степени деполяризации мембраны. Взаимодействие с внеклеточнымими участками может приводить как к потенцированию, так и к ингибированию активности рецепторов. За проявление того или иного эффекта ответственны различные молекулярные механизмы: потенцирование объясняется снятием действия протонов, ингибирование может быть следствием снижения сродства к глутамату (Williams 1994). Однако все эффекты, опосредуемые внеклеточными участками, не зависят от мембранного потенциала.

Таким образом, обнаруженное в настоящей работе не зависящее от потенциала действие блокаторов на десенситизацию, по всей видимости, не связано с блокадой ионного канала. Вполне вероятно, что это влияние опосредуется дополнительным участком связывания (как это было показано для спермина). К сожалению, имеющиеся на настоящий момент данные не позволяют сделать однозначного вывода о местонахождении этого сайта.

Систематического изучения известных синтетических блокаторов NMDA каналов с точки зрения дополнительных эффектов на NMDA рецепторы не проводилось. Между тем, такие исследования представляют большой интерес, поскольку, некоторые из соединений широко используются для лечения нейродегенеративных заболеваний (обзор Johnson and Kotermanski 2006).

Одно из важных функциональных свойств NMDA рецепторов - блокада ионами магния. Сродство ионов магния к рецепторам зависит от субъединичного состава: оно максимально, если комплекс содержит NR2a или NR2b субъединицы (Kd для ионов магния, составляет 10мкМ)и падает примерно в 10 раз, в случае NR2c или NR2d содержащих рецепторов (Мопуег et al., 1992). При мембранном потенциале, близком к состоянию покоя (-60мВ

- -80мВ) и при физиологической концентрации магния (1 мМ), NMDA рецепторы блокированы (Davies & Watkins 1977).

При анализе действия блокаторов необходимо учитывать эту функциональную особенность NMDA рецепторов.

Блокаторы NMDA рецепторов и магний имеют общие сайты связывания в канале NMDA рецептора (Kashiwagi et al., 2002). Обнаружено, что ионы магния значительно снижают эффект мемантина на NRl/NR2a рецепторы (Kotermanski & Johnson 2009). Это основной тип рецепторов, который экспрессируется нейронами поля СА1 гиппокампа. При потенциале фиксации -80 мВ наличие ионов магния во внеклеточной среде (1 мМ) снижает эффект мемантина более чем в 20 раз. Эффект на NRl/NR2d рецепторы менее выражен. Предполагается, что терапевтические дозы мемантина (1 мкМ) в присутствии магния должны иметь незначительный эффект на NRl/NR2a, NRl/NR2b рецепторы и более выраженный эффект на NRl/NR2c, NRl/NR2d рецепторы (Kotermanski & Johnson 2009).

Блокада каналов ионами магния характеризуется сильной зависимостью- • от мембранного потенциала: деполяризация приводит к резкому падению сродства канала NMDA рецептора к ионам магния.

Эффективность блокирующего действия мемантина, как было сказано выше, также зависит от мембранного потенциала, но в меньшей, чем для ионов магния, степени. Таким образом, при деполяризации конкуренция ионов магния и каналоблокаторов за сайты связывания ослабевает. Однако активность блокатора при данных потенциалах значительно снижена. Таким образом, в терапевтических дозах (1 мкМ) каналоблокирующее действие мемантина сильно ослаблено, ввиду его конкуренции с ионами магния.

В отличие от блокирующего действия, обнаруженное нами усиление десенситизации не зависело от потенциала. Исследованные соединения способны угнетать одинаковым образом активность NMDA рецепторов при потенциалах -80мВ и -40 мВ, и, по всей видимости, при более положительных потенциалах. Это дает преимущество изученным соединениям, поскольку они способны угнетать активность NMDA рецепторов в широком диапазоне мембранных потенциалов, в том числе при деполяризации нейронов, когда эффект каналоблокаторов сильно ослаблен.

Общее заключение

Многочисленные варианты молекулярного строения глутаматных рецепторов и, как следстсвие, разнообразие фармакологических и биофизических свойств, обеспечивают возможность тонкой настройки глутаматергической передачи и оптимального выполнения меняющихся функциональных задач. Известно, что некоторые патологические процессы в нервной системе, имеющие различие происхождение, приводят к избыточному выбросу глутамата в тканевую жидкость. Для предотвращения пагубных последствий гиперактивации глутаматергической передачи могут быть использованы антагонисты глутаматных рецепторов (Parsons 2007). Необходимым условием разработки новых- эффективных лекарственных препаратов является детальное понимание строения и функционирования' рецепторов, а также молекулярных механизмов их взаимодействия с антагонистами.

К настоящему времени найдено большое количество соединений, способных взаимодействовать с глутаматными рецепторами. Использование этих соединений в фармакологических исследованиях позволяет детально изучать строение и функционирование глутаматных рецепторов на молекулярном уровне.

В настоящей работе показано, что противоречия между моделями строения АМРА каналов, построенных на основании структурно-функционального анализа филантотоксинов и адаматанов, являются следствием недооценки конформационно гибкости филантотоксинов. Ранее предложенная в нашей лаборатории модель строения АМРА рецепторов позволяет объяснить все данные, получаемые с использованием филантотоксинов при условии расчета трехмерных конформаций молекулярного комплекса блокатор-ионный канал. Установленные структурные закономерности, определяющие избирательность, активность и механизм действия производных филантотоксина-433 важны для понимания строения и функционирования ионных каналов глутаматных рецепторов, а также применения подобных соединений для предотвращения последствий глутаматной цитотоксичности.

Принимая во внимание литературные данные о множестве эффектов токсинов и полиаминов на глутаматные рецепторы, было показано, что синтетические блокаторы ионных каналов - производные фенилциклогексила и адамантана - также обладают дополнительным действием на NMDA рецепторы. Использованные в работе соединения усиливали десенситизацию NMDA рецепторов. Этот эффект не зависел от мембранного потенциала, что исключает интерпретацию данного эффекта в рамках действия блокаторов на ионный канал. Мы предполагаем существование дополнительного участка связывания, локализованного вне полости ионного канала и опосредующего эффект на десенситизацию NMDA рецепторов.

Полученные в настоящей работе результаты расширяют наши представления о взаимодействии блокаторов и ионных каналов глутаматных рецепторов и являются важными для интерпретации клинических данных об использовании антагонистов глутаматных рецепторов в качестве нейропротектороных агентов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Николаев, Максим Владимирович, Санкт-Петербург

1. Кошелев, С.Г., Ходоров, Б.И. 1992. Тетраэтиламмоний и тетрабутиламмоний как инструменты исследования NMDA-каналов нейрональной мембраны. Росс, физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 1064-1068

2. Митюшов М.И., Емельянов Н.А., Мокрушин А.А., Войнер И.А., Багаева Т.Р. 1986 Переживающий срез мозга как объект нейрофизиологического и нейрохимического исследования. Методы физиологических исследований. Л: Наука.

3. Albin RL, Makowiec RL, Hollingsworth ZR, Dure LS 4th, Penney JB, Young . AB. 1992. Excitatory amino acid binding sites in the basal ganglia of the rat: a quantitative autoradiographic study. Neuroscience 46(l):35-48.

4. Antonov SM, Johnson JW. 1996 Voltage-dependent interaction of open-channel blocking molecules with gating of NMDA receptors in rat cortical neurons. J Physiol 493 ( Pt 2):425-45.

5. Anwyl R. 1999 Metabotropic glutamate receptors: electrophysiological properties and role in plasticity. Brains Res Rev 29:83-1201151.

6. Araki K, Meguro H, Kushiya E, Takayama C, Inoue Y, Mishina M. 1993 Selective expression of the glutamate receptor channel delta 2 subunit in cerebellar Purkinje cells. Biochem Biophys Res Commun.l97(3):l267-76.

7. Armstrong N, Gouaux E.2000 Mechanisms for activation and antagonism of an AMPA-sensitive glutamate receptor: crystal structures of the GluR2 ligand binding core. Neuron 28(1):165-81

8. Armstrong, C.M. 1971. Interaction of tetraethylammonium ion derivatives with the potassium channels of giant axons. J.Gen.PhysioL 58(4):413-437

9. Armstrong, N.A., Sun, Y., Chen, G.Q., Gouaux, E. 1998. Structure of glutamate-receptor binding core in complex with kainate. Nature. 395:913-917

10. Ayalon, G., Stern-Bach, Y. 2001. Functional assembly of AMP A and kainate receptors is mediated by several discrete protein-protein interactions. Neuron. 31:103113.

11. Bennett JA, Dingledine R. 1995 Topology profile for a glutamate receptor: Three transmembrane domains and a channel-lining reentrant membrane loop Neuron 14(2):373-84.

12. Benveniste M, Mayer ML. 1993 Multiple effects of spermine on N-methyl-D-aspartic acid receptor responses of rat cultured hippocampal neurones. J Physiol. 464:131-63.

13. Benveniste M, Mayer ML. 1995 Trapping of glutamate and glycine during open channel block of rat hippocampal neuron NMDA receptors by 9-aminoacridine. J Physiol.4S3 ( Pt 2):367-84.

14. Bernard V, Somogyi P, Bolam JP 1997 Cellular, subcellular, and subsynaptic distribution of AMPA-type glutamate receptor subunits in the neostriatum of the rat. J Neurosci. 17(2): 819-33

15. Blanpied ТА, Boeckman FA, Aizenman E, Johnson JW 1997 Trapping channel block of NMDA-activated responses by amantadine and memantine. J Neurophysiol. 77(l):309-23.

16. Blanpied ТА, Clarke RJ, Johnson JW. 2005 Amantadine inhibits NMDA receptors by accelerating channel closure during channel block. J Neurosci. 25(13):3312-22.

17. Bolshakov KV, Gmiro VE, Tikhonov DB, Magazanik LG. 2003 Determinants of trapping block of N-methyl-d-aspartate receptor channels. JNeurochem. 87(1):56-65.

18. Bolshakov KV, Kim KH, Potapjeva NN, Gmiro VE, Tikhonov DB, Usherwood. PN, Mellor IR, Magazanik LG. 2005 Design of antagonists for NMDA and AMPA receptors. Neuropharmacology. 2005 Aug;49(2): 144-55.

19. Bowie D, Mayer ML. 1995 Inward rectification of both AMPA and kainate subtype glutamate receptors generated by polyamine-mediated ion channel block. Neuron. 15(2):453-62.

20. Bowie D. 2008 Ionotropic glutamate receptors & CNS disorders. CNS Neurol Disord Drug Targets. 7(2):129-43.

21. Brackley PT, Bell DR, Choi SK, Nakanishi K, Usherwood PN. 1993 Selective antagonism of native and cloned kainate and NMDA receptors by polyamine-containing toxins. J Pharmacol Exp Ther. 266(3): 1573-80.

22. Bresink I, Benke ТА, Collett VJ, Seal AJ, Parsons CG, Henley JM, Collingridge GL. 1996 Effects of memantine on recombinant rat NMDA receptors expressed in HEK 293 cells. Br J Pharmacol. 119(2): 195-204.

23. Brown D.G., Krupp J.J., 2006 N-methyl-D-aspartate receptor (NMDA) antagonists as potential pain therapeutics. Curr Top Med Chem.6(8):749-70.

24. Burnashev, N. 1996a. Calcium permeability of glutamate-gated channels in the central nervous system. Curr.Opin.Neurobiol 6:311-316.

25. Burnashev, N., Shoepfer, R., Monyer, H., Ruppersberg, J.P., Gunter, W., Seeburg, P.H., Sakmann, B. 1992. Control by asparagine residues of calcium permeability and magnesium blockade in the NMDA receptor. Science. 257:14151419.

26. Burnashev, N., Villaroel, A., Sakmann, B. 1996b. Dimensions and ion selectivity of recombinant AMPA and kainate receptor channels and their dependence on Q/R site residues. J. Physiol. 458: 261-287

27. Burnashev, N., Zhou, Z., Neher, E., Sakmann, B. 1995. Fractional calcium currents through recombinant GluR channels of the NMDA, AMPA and kainate receptor subtypes. J. Physiol, bond. 485:403-418.

28. Chen HS, Pellegrini JW, Aggarwal SK, Lei SZ, Warach S, Jensen FE, Lipton SA. 1992 Open-channel block of N-methyl-D-aspartate (NMDA) responses by memantine: therapeutic advantage against NMDA receptor-mediated neurotoxicity. J Neurosci. 12(ll):4427-36.

29. Chohan MO, Iqbal К. 2006 From tau to toxicity: emerging roles of NMDA receptor in Alzheimer's disease. JAlzheimers Dis. 10(l):81-7.

30. Choi DW 1990 Possible mechanisms limiting N-methyl-D-aspartate receptor overactivation and the therapeutic efficacy of N-methyl-D-aspartate antagonists. Stroke. 1990 Nov;21(11 Suppl):III20-2.

31. Ciabarra AM, Sullivan JM, Gahn LG, Pecht G, Heinemaim S, Sevarino KA. 1995 Cloning and characterization of chi-1: a developmentally regulated member of a novel class of the ionotropic glutamate receptor family. JNeurosci. 5(10):6498-508.

32. Coussen F, Mulle C. 2006 Kainate receptor-interacting proteins and membrane trafficking. Biochem Soc Trans. 34(Pt 5):927-30.

33. Curtis D.R. & Watkins, J.C. 1960. The excitation and depression of spinal neurones by structurally related amino acids. J. Neurochem., 6, 117-141.

34. Curtis D.R. & Watkins, J.C. 1965. The pharmacology of amino acids related to gamma-aminobutyric acid. Pharm. Rev., 17,347-391.

35. Deming D, Cheng Q, Jayaraman V. 2003 Is the isolated ligand binding domain a good model of the domain in the native receptor? J Biol Chem. 278(20): 17589-92.

36. Derkach V, Barria A, Soderling TR. 1999 Ca2+/calmodulin-kinase II enhances channel conductance of alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionate type glutamate receptors. Proc Natl Acad Sci USA. 96(6):3269-74.

37. Dingledine, R., Borges, K., Bowie, D., Traynelis, S.F., 1999. The Glutamate Receptor Ion Channels. Pharmacological Reviews 51 (1), 7-61

38. Donevan SD, Rogawski MA. 1995 Intracellular polyamines mediate inward rectification of Ca(2+)-permeable alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors. Proc Natl Acad Sci U SA. 92(20):9298-302.

39. Doyle, D.A., Cabral, J.M., Pfuetzner, R.A., Kuo, A., Gulbis, J.M., Cohen, S.L., Chait, B.T., MacKinnon, R. 1998. The structure of the potassium channel: molecular basis of K+ conductance and selectivity. Science. 280: 69-77.

40. Egebjerg J, Heinemann SF. 1993 Ca2+ permeability of unedited and edited versions of the kainate selective glutamate receptor GluR6. Proc Natl Acad Sci USA. 90(2):755-9.

41. Fan MM, Raymond LA. 2007 N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor function and excitotoxicity in Huntington's disease. Prog Neurobiol. 81(5-6):272-93.

42. Furukawa H, Singh SK, Mancusso R, Gouaux E 2005 Subunit arrangement and function in NMDA receptors. Nature 438(7065): 185-92.

43. Gardner SM, Trussell LO, Oertel D. 1999 Time course and permeation of synaptic AMPA receptors in cochlear nuclear neurons correlate with input. J Neurosci. 19(20):8721-9.

44. Geiger, J.R., Melcher, Т., Koh, D.S. 1995. Relative abundance of subunit mRNAs determines gating and Ca2+ permeability of AMPA receptors in principal neurons and interneurons in rat CNS. Neuron 15:193-204.

45. Hayashi T. 1954. Effects of sodium glutamate on the nervous system. Keio J. Med., 3, 192-193.

46. Herlitze S, Raditsch M, Ruppersberg JP, Jahn W, Monyer H, Schoepfer R, Witzemann V. 1993 Argiotoxin detects molecular differences in AMPA receptor channels. Neuron 10(6): 1131 -40

47. Hollmann M, Heinemann S. 1994 Cloned glutamate receptors. Annu Rev Neurosci. 17:31-108.

48. Hollmann, M., O'Shea Greenfield, A., Rogers, S.W., Heinemann, S. 1989. Cloning by functional expression of a member of the glutamate receptor family. Nature 342:643-648

49. Horning MS, Mayer ML.2004 Regulation of AMPA receptor gating by ligand binding core dimers. Neuron. 41(3):309-11.

50. Howe JR. 1996 Homomeric and heteromeric ion channels formed from the kainate-type subunits GluR6 and KA2 have very small, but different, unitary conductances. JNeurophysiol. 76(l):510-9.

51. Ihle, E.C., Patneau, D.K. 2000. Modulation of alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptor desensitization by extracellular protons. Mol Pharmacol 5 8:1204-1212

52. Inanobe A, Furukawa H, Gouaux E.2005 Mechanism of partial agonist action at the NR1 subunit of NMDA receptors. Neuron 47(l):71-84.

53. Jatzke C, Hernandez M, Wollmuth LP 2003 Extracellular vestibule determinants of Ca2+ influx in Ca2+-permeable AMP A receptor channels. J Physiol. 549(Pt 2):439-52.

54. Jin R, Clark S, Weeks AM, Dudman JT, Gouaux E, Partin KM. 2005 Mechanism of positive allosteric modulators acting on AMPA receptors. J Neurosci. 25(39):9027-36.

55. Johnson JW, Kotermanski SE. 2006 Mechanism of action of memantine. Curr Opin Pharmacol. 6(l):61-7.

56. Jonas, P., Burnashev, N. 1995. Molecular mechanisms controlling calcium entry through AMPA-type glutamate receptor channels. Neuron 15:987-990

57. Jones, K.S., VanDongen, H.M.A., VanDongen, A.M.J. 2002. The NMDA receptor M3 segment is a conserved transduction element coupling ligand binding to channel opening. J. Neurosci. 22(6):2044-2053.

58. Karkanias N.B., Papke R.L. 1999. Subtype-specific effects of lithium on glutamate receptor function. J. Neurophysiol. 81:1506-1512

59. Kashiwagi K, Fukuchi J, Chao J, Igarashi K, Williams K. 1996 An aspartate residue in the extracellular loop of the N-methyl-D-aspartate receptor controls sensitivity to spermine and protons. Mol Pharmacol. 49(6):1131-41.

60. Kohda, K., Wang, Y., Yuzaki, M. 2000. Mutation of a glutamate receptor motif reveals its role in gating and delta2 receptor channel properties. Nat. Neurosci. 3:315322.

61. Kohler M, Burnashev N, Sakmann B, Seeburg PH. 1993 Determinants of Ca2+ permeability in both TM1 and TM2 of high affinity kainate receptor channels: diversity by RNA editing. Neuron 10(3):491-500.

62. Kotermanski SE, Johnson JW. 2009 Mg2+ imparts NMDA receptor subtype selectivity to the Alzheimer's drug memantine. J Neurosci. 29(9):2774-9.

63. Krampfl К, Schlesinger F, Zorner A, Kappler M, Dengler R, Bufler J. 2002 Control of kinetic properties of GluR2 flop AMPA-type channels: impact of R/G nuclear editing. Eur JNeurosci. 15( 1 ):51 -62.

64. Krupp JJ, Vissel B, Heinemann SF, Westbrook GL. 1996 Calcium-dependent inactivation of recombinant N-methyl-D-aspartate receptors is NR2 subunit specific. Mol Pharmacol 50(6): 1680-8.

65. Krupp JJ, Vissel B, Heinemann SF, Westbrook GL. 1998 N-terminal domains in the NR2 subunit control desensitization of NMDA receptors. Neuron. 20(2):317-27.

66. Kubo M, Ito E 2004 Structural dynamics of an ionotropic glutamate receptor. Proteins. 56(3):411-9.

67. Kuroyanagi T, Yokoyama M, Hirano T. 2009 Postsynaptic glutamate receptor ■ delta family contributes to presynaptic terminal differentiation and establishment of synaptic transmission. Proc NatlAcadSci USA. 106(12):4912-6.

68. Kuroyanagi T, Yokoyama M, Hirano T. 2009 Postsynaptic glutamate receptor delta family contributes to presynaptic terminal differentiation and establishment of synaptic transmission. Proc Natl Acad Sci US AA06(\2):49\2-6.

69. Kuusinen A, Arvola M, Keinanen K. 1995 Molecular dissection of the agonist binding site of an AMPA receptor.EMBO J14(24):6327-32.

70. Lalouette A, Lohof A, Sotelo C, Guenet J, Mariani J. 2001 Neurobiological effects of a mill mutation depend on genetic context: comparison between two hotfoot alleles of the delta-2 ionotropic glutamate receptor. Neuroscience 105(2):443-55.

71. Lei S., Orser B.A., Thatcher G.R., Reynolds J.N., MacDonald J.F. 2001. Positive allosteric modulators of AMPA receptors reduce proton-induced receptor desensitization in rat hippocampal neurons. J. Neurophysiol. 85:2030-2038

72. Leuschner, W.D., Hoch, W. 1999. Subtype specific assembly of a-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid receptor subunits is mediated by their N-terminal domains. J.Biol.Chem. 274(24): 16907-16916.

73. Lipton SA. 1993 Prospects for clinically tolerated NMDA antagonists: open-channel blockers and alternative redox states of nitric oxide. Trends Neurosci. 16(12):527-32.

74. Liu SQ & Cull-Candy SG. 2000 Synaptic activity at calcium-permeable AMPA receptors induces a switch in receptor subtype. Nature.405(6785):454-8.

75. Lomeli H, Sprengel R, Laurie DJ, Kohr G, Herb A, Seeburg PH, Wisden W. 1993The rat delta-1 and delta-2 subunits extend the excitatory amino acid receptor family. FEBSLett. 315(3):318-22.

76. Low CM, Zheng F, Lyuboslavsky P, Traynelis SF 2000 Molecular determinants of coordinated proton and zinc inhibition of N-methyl-D-aspartate NR1/NR2A receptors. Proc Natl Acad Sci USA. 97(20): 11062-7.

77. MacDonald JF, Bartlett MC, Mody I, Pahapill P, Reynolds JN, Salter MW, Schneiderman JH, Pennefather PS. 1991. Actions of ketamine, phencyclidine and MK-801 on NMDA receptor currents in cultured mouse hippocampal neurones. J Physiol. 432:483-508.

78. Mack V, Burnashev N, Kaiser KM, Rozov A, Jensen V, Hvalby O, Seeburg PH, Sakmann B, Sprengel R. 2001 Science. 292(5526):2501-4.

79. Magazanik LG, Buldakova SL, Samoilova MV, Gmiro VE, Mellor IR, Usherwood PN. 1997 Block of open channels of recombinant AMPA receptors and native AMPA/kainate receptors by adamantane derivatives. J Physiol. 505 ( Pt 3):655-63.

80. Man HY, Ju W, Ahmadian G, Wang YT 2000 Intracellular trafficking of AMPA receptors in synaptic plasticity. Cell MolLife Sci 57(11): 1526-34

81. Martin LJ, Blackstone CD, Levey Al, Huganir RL, Price DL. 1993 Cellular localizations of AMPA glutamate receptors within the basal forebrain magnocellular complex of rat and monkey. J Neurosci.l3(5):2249-63.

82. Mayer ML, Westbrook GL, Guthrie PB. 1984 Voltage-dependent block by Mg2+ of NMDA responses in spinal cord neurones. Nature 309(5965):261-3.

83. McFeeters RL, Oswald RE. 2004 Emerging structural explanations of ionotropic glutamate receptor function FASEB J. 18(3):428-38.

84. Mealing GA, Lanthorn TH, Murray CL, Small DL, Morley P. 1999. Differences in degree of trapping of low-affinity uncompetitive N-methyl-D-aspartic acid receptor antagonists with similar kinetics of block. J Pharmacol Exp Ther. 288(1):204-10.

85. Mellor IR, Usherwood PN. 2004 Targeting ionotropic receptors with polyamine-containing toxins. Toxicon. 43(5):493-508.

86. Monyer H, Sprengel R, Schoepfer R, Herb A, Higuchi M, Lomeli H, Burnashev N, Sakmann B, Seeburg PH. 1992 Heteromeric NMDA receptors: molecular and functional distinction of subtypes. Science. 256(5060):1217-21.

87. Moriyoshi, K., Masu, M., Ishii, Т., Shigemoto, R., Mizuno, N., Nakanishi, S. 1991. Molecular cloning and characterization of the rat NMDA receptor. Nature 354:31-37

88. Paas Y, Devillers-Thiery A, Teichberg VI, Changeux JP, Eisenstein M. 2000 How well can molecular modelling predict the crystal structure: the case of the ligand-binding domain of glutamate receptors. Trends Pharmacol Sci. 21(3):87-92

89. Panchenko, V.A., Glasser, C.R., Mayer, M.L. 2001. Structural similarities between glutamate receptor channels and К channels examined by scanning mutagenesis. J.Gen.Physiol. 117: 345-359

90. Panchenko, V.A., Glasser, C.R., Partin, C.M., Mayer, M.L. 1999. Amino acid substitutions in the pore of rat glutamate receptors at sites influencing block by polyamines. J. Physiol. 520(2): 337-357

91. Paoletti P, Neyton J, Ascher P. 1995 Glycine-independent and subunit-specific potentiation of NMDA responses by extracellular Mg2+. Neuron. 15(5): 1109-20.

92. Paoletti P, Perin-Dureau F, Fayyazuddin A, Le Goff A, Callebaut I, Neyton J. 2000. Molecular organization of a zinc binding n-terminal modulatory domain in a NMDA receptor subunit. Neuron. 28(3):911-25.

93. Parsons C.G., Danysz W., Quack G, 1999 Memantine is clinically well tolerated N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor antagonist — a review of preclinical data. Neuropharmacology 38 735-767.

94. Parsons CG, Stoffler A, Danysz W 2007 Memantine: a NMDA receptor antagonist that improves memory by restoration of homeostasis in the glutamatergic system—too little activation is bad, too much is even worse. Neuropharmacology 53(6):699-723.

95. Partin, K.M., Patneau, D.K., Winters, C.A., Mayer, M.L., Buonanno, A. 1993. Selective modulation of desensitization at AMPA versus kainate receptors by cyclothiazide and concanavalin A. Neuron 11(6):1069-1082

96. Pellegrini-Giampietro DE. 2003 An activity-dependent spermine-mediated mechanism that modulates glutamate transmission. Trends Neurosci. 26(1):9-11.

97. Portera-Cailliau C, Price DL, Martin LJ. 1996. N-methyl-D-aspartate receptor proteins NR2A and NR2B are differentially distributed in the developing rat central nervous system as revealed by subunit-specific antibodies. J Neurochem. 66(2):692-700.

98. Raymond, L. A., Blackstone, C. D., and Huganir, R. L. (1993). Phosphorylation and modulation of recombinant GluR6glutarnate receptors by cAMP-dependent protein kinase. Nature 361, 637-641.

99. Robert A, Armstrong N, Gouaux JE, Howe JR. 2005 AMPA receptor binding cleft mutations that alter affinity, efficacy, and recovery from desensitization. J Neurosci. 25(15):3752-62.

100. Rock DM, MacDonald RL 1992 Spermine and related polyamines produce a voltage-dependent reduction of N-methyl-D-aspartate receptor single-channel conductance. Mol Pharmacol. 42(1): 157-64.

101. Rock DM, Macdonald RL. 1992 The poly amine spermine has multiple actions on N-methyl-D-aspartate receptor single-channel currents in cultured cortical neurons. Mol Pharmacol. Mol Pharmacol. 41(l):83-8.

102. Schiffer HH, Swanson GT, Heinemann SF. 1997 Rat GluR7 and a carboxy-terminal splice variant, GluR7b, are functional kainate receptor subunits with a low sensitivity to glutamate. Neuron. 19(5): 1141-6.

103. Schlesinger F, Tammena D, Krampfl K, Bufler J. 2005 Two mechanisms of action of the adamantane derivative IEM-1460 at human AMPA-type glutamate receptors. Br J Pharmacol. 145(5):656-63.

104. Schwappach B. 2008 An overview of trafficking and assembly of neurotransmitter receptors and ion channels,Molecular Membrane Biology,25:4,270 -278

105. Sekiguchi M, Fleck MW, Mayer ML, Takeo J, Chiba Y, Yamashita S, Wada K. 1997 A novel allosteric potentiator of AMPA receptors: 4-2phenylsulfonylamino)ethylthio--2,6-difluoro-phenoxyaceta mide. J Neurosci. 17(15):5760-71.

106. Sekiguchi, M., Fleck, M.W., Mayer, M.L., Chiba, Y., Yamashita, S., Wada, K. 1997. A novel allosteric potentiator of AMPA-receptors: 4-2-(phenylsulphonylamino)-ethylthio.-2,6-Difluoro-Phenoxyacetamide. J. Neurosci. 17(15): 5760-5771

107. Smart TG. 1997 Regulation of excitatory and inhibitory neurotransmitter-gated ion channels by protein phosphorylation. Curr Opin Neurobiol 7(3):358-67.

108. Sobolevsky Al, Koshelev SG, Khodorov BI. Molecular size and hydrophobicity as factors which determine the efficacy of the blocking action of amino-adamantane derivatives on NMDA channels. Membr Cell Biol. 13(l):79-93.

109. Sommer, В., Keinanen, K., Verdoorn, T.A. 1990. Flip and flop: a cell-specific^ functional switch in glutamate-operated channels of the CNS. Science 249:1580-1585.

110. Sommer, В., Kohler, M., Sprengel, R., Seeburg, P.H. 1991. RNA editing in brain controls a determinant of ion flow in glutamate-gated channels. Cell 67:11-20

111. Stern-Bach Y, Bettler B, Hartley M, Sheppard PO, O'Hara PJ, Heinemann SF. 1994 Agonist selectivity of glutamate receptors is specified by two domains structurally related to bacterial amino acid-binding proteins. Neuron. 13(6): 1345-57.

112. Stern-Bach Y, Russo S, Neuman M, Rosenmund С 1998 A point mutation in the glutamate binding site blocks desensitization of AMPA receptors. Neuron. 21(4):907-18.

113. Stoll L, Hall J, Van Buren N, Hall A, Knight L, Morgan A, Zuger S, Van Deusen H, Gentile L. 2007 Differential regulation of ionotropic glutamate receptors. Biophys J. 92(4): 1343-9. Epub 2006 Nov 17.

114. Sun, Y., Olson, R., Horning, M., Armstrong, N., Mayer, M., Gouaux, E. 2002. Mechanism of glutamate receptor desensitization. Nature. 417:245-253.

115. Sutcliffe MJ, Smeeton AH, Wo ZG, Oswald RE. 1998 Three-dimensional models of glutamate receptors. Biochem Soc Trans. 26(3):450-8

116. Sutcliffe MJ, Wo ZG, Oswald RE. 1996.Three-dimensional models of non-NMDA glutamate receptors. Biophys J. 70(4): 1575-89.

117. Taverna FA, Cameron BR, Hampson DL, Wang LY, MacDonald, JF 1994 Sensitivity of AMPA receptors to pentobarbital. Eur J Pharmacol. 267(3):R3-5.

118. Tikhonov DB, Mellor IR, Usherwood PN. 2004 Modeling noncompetitive antagonism of a nicotinic acetylcholine receptor. Biophys J. 87(1): 159-70.

119. Tikhonov DB, Magazanik LG. 1998 Voltage dependence of open channel blockade: onset and offset rates. JMembr Biol 161 (1): 1-8.

120. Tikhonov, D.B., Mellor, J.R., Usherwood, P.R.N., Magazanik, L.G. 2002. Modelling of the pore domain of the GluRl channel: homology with K+ channel and channel blockers. Biophys. J. 82: 1884-1893

121. Tikhonov, D.B., Zhorov, B.S., Magazanik, L.G. 1999. Intersegment hydrogen bonds as possible structural determinants of the N/Q/R site in glutamate receptors. Biphys. J. 77: 1914-1926

122. Tingley, W. G., Roche, K. W., Thompson, A. K., and Huganir, R. L. (1993). Regulation of NMDA receptor phosphorylation by alternative splicing of the C-terminal domain. Nature 364, 70-73.

123. Traynelis SF, Hartley M, Heinemann SF. 1995 Control of proton sensitivity of the NMDA receptor by RNA splicing and polyamines. Science 268(5212):873-6.

124. Usherwood PN. 2000. Natural and synthetic polyamines: modulators of signalling proteins. Farmaco. 55(3):202-5.

125. Usherwood PNR 1991 Polyamine toxins selective glutamate receptor antagonists. In: Inversen L.L., Tipton K.F. (Eds.j, Probes for Neurochemical Target Sites, Royal Irish Academy, Dublin, pp. 99-112

126. Vorobjev VS. 1991 Vibrodissociation of sliced mammalian nervous tissue. J Neurosci Methods. 38(2-3):145-50.

127. Vorobjev, V.S., Sharonova, I.N. 1994. Tetrahydroaminoacridine blocks and prolongs NMDA receptor mediated responses in a voltage dependent manner. Eur. J. Pharmacol. 253: 1-8.

128. Vyklicky L Jr, Patneau DK, Mayer ML 1991 Modulation of excitatoiy synaptic transmission by drugs that reduce desensitization at AMPA/kainate receptors. Neuron. 7(6):971-84.

129. Wada A, Takahashi H, Lipton SA, Chen HS. 2006 NR3A modulates the outer vestibule of the "NMDA" receptor channel. J Neurosci. 26(51): 13156-66.

130. Wang JQ, Liu X, Zhang G, Parelkar NK, Arora A, Haines M, Fibuch EE, Mao L. 2006 Phosphorylation of glutamate receptors: a potential mechanism for the regulation of receptor function and psychostimulant action. J Neurosci Res. 84(8): 1621-9.

131. Watanabe, J., Beck, C., Kuner, Т., Premkumar, L.S., Wollmuth, L.P. 2002. DRPEER: a motif in the extracellular vestibule conferring high Ca2+ flux rates in NMDa receptor channels. J.Neurosci. 22(23): 10209-10216

132. Watkins JC, Jane DE. 2006 The glutamate story. Br J Pharmacol. 147 Suppl l:S100-8.

133. Weston MC, Gertler C, Mayer ML, Rosenmund C. 2006 Interdomain interactions in AMPA and kainate receptors regulate affinity for glutamate. J Neurosci. 26(29): 5650-8.

134. Weston MC, Schuck P, Ghosal A, Rosenmund C, Mayer ML 2006b Conformational restriction blocks glutamate receptor desensitization Nat Struct Mol Biol. 13(12):1120-7. Epub 2006 Nov 19.

135. Williams К 1997 Interactions of polyamines with ion channels. Biochem J 1997 Sep 15;326(Pt3):943

136. Williams К, Kashiwagi К, Fukuchi J, Igarashi K.1995 An acidic amino acid in the N-methyl-D-aspartate receptor that is important for spermine stimulation. Mol Pharmacol 48(6):1087-98.

137. Williams K, Zappia AM, Pritchett DB, Shen YM, Molinoff PB. 1994. Sensitivity of the N-methyl-D-aspartate receptor to polyamines is controlled by NR2 subunits. Mol Pharmacol. 45(5):803-9

138. Williams, K., Pahk, A.J., Kashiwagi, K., Masuko, Т., Nguyen, N.D., Igarashi, K. 1998. The selective filter of the N-methyl-D-aspartate receptor: a tryptophan1. Л Iresidue controls block and permeation of Mg . Mol.Pharmacol. 53: 933-941

139. Wollmuth, L.P., Kuner, Т., Seeburg, P.H., Sakmann, B. 1996. Differential contribution of the NR1- and NR2A-subunits to the selectivity filter of recombinant NMDA receptor channels. J. Physiol. 491(3): 779-797.

140. Wollmuth, L.P., Sakmann, B. 1998. Different mechanisms of Ca2+ transport in NMDA and Ca2+-permeable AMPA glutamate receptor channels. J.Gen.Physiol. 112:623-636

141. Wood, M.W., VanDongen, H.M.A., VanDongen, A.M.J. 1995. Structural conservation of ion conduction pathways in К channels and glutamate receptors. PNAS 92: 4882-4886.

142. Wright, J.M., Nowak L.M. 1992. Effects of low doses of bicuculline on N-methyl-D-aspartatee single-channel kinetics are not evident in whole-cell currents. Mol. Pharmacol. 41: 900-907

143. Yamada KA, Tang CM. 1993 Benzothiadiazides inhibit rapid glutamate receptor desensitization and enhance glutamatergic synaptic currents. JNeurosci. 13(9):3904-15.

144. Yamakura T, Sakimura K, Mishina M, Shimoji K. 1995 The sensitivity of AMPA-selective glutamate receptor channels to pentobarbital is determined by a single amino acid residue of the alpha 2 subunit. FEBS Lett. 374(3):412-4.

145. Yamazaki M, Araki K, Shibata A, Mishina M. 1992 Molecular cloning of a cDNA encoding a novel member of the mouse glutamate receptor channel family. Biochem Biophys Res Commun. 183(2):886-92.

146. Yu SY, Wu DC, Liu L, Ge Y, Wang YT. 2008. Role of AMPA receptor trafficking in NMDA receptor-dependent synaptic plasticity in the rat lateral amygdala. JNeurochem 106(2):889-99.

147. Zhang W, Cho Y, Lolis E, Howe JR. 2008 Structural and single-channel results indicate that the rates of ligand binding domain closing and opening directly impact AMPA receptor gating. JNeurosci. 28(4):932-43.

148. Zheng F, Gingrich MB, Traynelis SF, Conn PJ. 1998 Tyrosine kinase potentiates NMDA receptor currents by reducing tonic zinc inhibition. Nat Neurosci. 1(3):185-91.

149. Zhorov BS, Tikhonov DB. 2004 Potassium, sodium, calcium and glutamate-gated channels: pore architecture and ligand action. JNeurochem. 88(4):782-99.

Информация о работе

Николаев, Максим Владимирович
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2009
ВАК 03.00.13

Диссертация

Структурно-функциональные отношения в рядах блокаторов глутаматных рецепторов NMDA и AMPA типов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы