Исследование строения и механизмов блокады ионных каналов никотиновых холинорецепторов и глутаматных рецепторов

Тихонов, Денис Борисович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование строения и механизмов блокады ионных каналов никотиновых холинорецепторов и глутаматных рецепторов
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование строения и механизмов блокады ионных каналов никотиновых холинорецепторов и глутаматных рецепторов"

На правах рукописи

Тихонов Денис Борисович

ИССЛЕДОВАНИЕ СТРОЕНИЯ И МЕХАНИЗМОВ БЛОКАДЫ ИОННЫХ КАНАЛОВ НИКОТИНОВЫХ ХОЛИНОРЕЦЕПТОРОВ И ГЛУТАМАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ

03.00.13 - физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург -2004

Работа выполнена в лаборатории биофизики синаптических процессов Института Эволюционной Физиологии и Биохимии им. И.М.Сеченова Российской Академии Наук

Научный консультант:

- член-корр. РАН Л.Г.Магазаник

Официальные оппоненты:

- член-корр. РАН Г.Н.Можаева

- доктор биологических наук В.И.Говардовский

- доктор физико-математических наук Т.М.Бирштейн

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской Академии Наук

Защита состоится 08 июня 2004 г. в 11 часов на заседании специализированного диссертационного совета Д 002.127.01 по присуждению ученой степени доктора наук при Институте Эволюционной Физиологии и Биохимии им. И.М.Сеченова РАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Эволюционной Физиологии и Биохимии им. И.М.Сеченова РАН.

194223, Санкт-Петербург, пр. М.Тореза д. 44

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Каналообразующие белки, обеспечивающие пассивный транспорт ионов, являются важными компонентами клеточных мембран. Активность потенциалуправляемых натриевых и калиевых каналов обуславливает генерацию и распространение потенциала действия в нейронах. Синаптические ионные каналы, активируемые нейромедиаторами, необходимы для передачи возбуждающих и тормозных сигналов между нейронами. Многие модуляторы клеточного метаболизма также оказывают свое действие через ионные каналы. Поскольку каналообразующие белки являются трансмембранными, их внеклеточные участки и сама пора канала доступны для действия внеклеточпых химических агентов, как естественных, так и искусственных. Многие яды и токсины, такие как тетродотоксин, аконитиновые алкалоиды, аргиотоксин и филантотоксин, действуют именно на ионные каналы. С другой стороны, ряд лекарственных препаратов, например местные анестетики, антиаритмические агенты, мемантин и др. также модифицируют работу ионных каналов. Поэтому, исследования, направленные на изучения строения и механизмов модуляции ионных каналов, имеют не только фундаментальное, но и практическое значение.

В то же время, представления о трехмерном строении и механизмах действия ионных каналов продолжают оставаться достаточно фрагментарными, несмотря на большое число исследований. Одна из проблем состоит в том, что, как и большинство мембранных белков, молекулы ионных каналов плохо поддаются кристаллизации. До сих пор было кристаллизовано только несколько структур, в основном калиевых каналов прокариот (Doyle et al., 1998; Jiang et al., 2002; 2003). Эти работы, выполненные в лаборатории Р. МакКиннона в 1998 - 2003 годах, были в 2003 удостоены Нобелевской премии. Однако, получение рентгеноструктурных данных для ионных каналов эукариот, имеющих более сложную трансмембранную топологию и гетеромерное субьединичное строение, остается нерешенной проблемой. Таким образом, развитие методов по анализу строения ионных каналов и действия на них лигандов, представляют значительную ценность.

рными пробами

низкомолекулярных лигандов делает и ; ¡З&фЗДЩЦОДКлМ1

БИБЛИОТЕКА

СПепрбург . 05 »0 atr

структуры каналов. Особенно важно то, что структурно-функциональные исследования в рядах блокаторов позволяют получить количественные оценки элементов топографии участков их связывания. Суть разрабатываемого подхода заключается в том, что для изучения-конкретных особенностей строения каналов синтезировались специально разработанные гомологические ряды соединений, и полученные данные использовались для построения молекулярных моделей. Выбор ионотропных рецепторов ацетилхолина и глутамата в качестве объектов исследования был обусловлен тем, что они формируют катион-селективные каналы, которые демонстрируют сходные физиологические и фармакологические характеристики при принципиально разной структурной организации.

В рамках работы решались следующие конкретные задачи:

1. Исследовать механизмы биологического действия неконкурентных ингибиторов никотиновых холинорецепторов - филантотоксинов и дикатионных соединений.

2. Рассчитать пространственные структуры филантотоксинов и разработать молекулярную модель ионного канала холинорецептора, способную воспроизводить наблюдаемые в эксперименте закономерности блокирующего действия,

3. На основании данных по действию блокаторов на открытое и закрытое состояние холинорецептора разработать модель его активации.

4. Выявить структурные детерминанты селективного действия блокаторов на глутаматный рецептор NMDA типа и разработать модель селективного фильтра NMDA канала, обясняющую наблюдаемые различия.

5. С помощью гомологических рядов блокаторов определить основные структурные требования для блокаторов глутаматных каналов АМРА типа.

6. Разработать модель канала АМРА рецептора и выявить аминокислотные остатки, определяющие действие блокаторов.

7. Использовать полученные результаты для анализа строения ионных каналов беспозвоночных, субъединичное строение которых неизвестно.

Созданы и протестированы молекулярные модели каналов, позволяющие теоретически предсказывать характер действия потенциальных блокаторов.

Впервые показано, что пространственная структура филантотоксинов определяется замыканием внутримолекулярных водородных связей. В зависимости от характера замыкания этих связей сильно меняется пространственная геометрия и, как следствие, биологическое действие токсинов (Tikhonov et al., 200a).

Предложена модель активации канала холинорецептора, в которой копформационный переход между открытым и закрытым состояниями происходит за счет локальной перестройки в гибком участке излома каналообразующих сегментов. При этом полного стерического перекрывания просвета канала в закрытом состоянии не наблюдается, а энергетический барьер для токонесущих ионов имеет гидрофобную природу (Tikhonov and Zhorov, 1998 Tikhonov et al., 2004a).

Впервые было дано обьяснение различию диаметров каналов NMDA и АМРА подтипов глутаматных рецепторов, а также слабой чувствительности АМРА' каналов к активным блокаторам NMDA каналов (Tikhonov et al., 1999; 2002).

Разработаны принципы теоретического дизайна блокаторов АМРА каналов. Созданы серии соединений, варьирующих по активности и избирательности действия на NMDA и АМРА каналы. Таким образом, решена проблема отсутствия фармакологических препаратов неконкурентного действия для избирательного подавления АМРА рецепторов (Магазаник и др., 2000; 2001; Tikhonov et al., 2000b; Bolshakov et al., 2000).

Впервые было- показано, что эффект «ловушки»' блокаторов в NMDA каналах определяется не их стерическими размерами, а соотношением сродства к двум различным местам связывания (Bolshakov et al.; 2002).

детерминантах селективного действия блокаторов способствует прогрессу в создании новых лекарственных средств. Наличие эффекта «ловушки», т.е. способности блокатора оставаться в канале после его закрытия, определяет кинетику действия. Блокаторы, для которых этот эффект ярко выражен, демонстрируют медленную кинетику, и их использование приводит в ряде случаев к негативным побочным эффектам. Полученные результаты о молекулярном механизме «ловушки» представляются ценными для разработки препаратов антиглутаматного действия, имеющих минимальное побочное действие. Избирательно действующие блокаторы часто применяются в физиологических экспериментах для выделения отдельных компонентов ответов на раздражение. Можно полагать, что разработанные серии блокаторов будут использоваться в новых научных экспериментах. Разработанные структуры блокаторов, а таже принципы направленного синтеза блокаторов с заданной активностью, селективностью и кинетикой действия, могут оказаться перспективными с точки зрения использования в медицинской практике для терапии патологических состояний ЦНС, связанных с нарушением баланса глутаматергической передачи. Результаты исследований включены в курсы лекций по нейрофизиологии в Санкт-Петербургском Государственном Университете и в Санкт-Петербургском Государственном Техническом Университете.

Положения, выносимые на защиту:

1. В никотиновом холинорецепторе эффекторная часть воротного механизма) расположена в средней части ионного канала. Управление проницаемостью канала осуществляется за счет гидрофобного, а не стерического механизма. Сайты связывания блокаторов открытого и закрытого канала расположены в канале по обе стороны воротного механизма.

2. Пространственная организация ионных каналов NMDA и АМРА подтипов рецепторов глутамата гомологична калиевым каналам. Специфические фармакологические и физиологические характеристики глутаматных рецепторов определяются локальными особенностями строения наиболее узких частей (селективных фильтров) этих каналов.

3. Ионные каналы глутаматных рецепторов нейронов моллюска и мышцы личинки мухи по строению «селективных фильтров» близки к АМРА, но не к NMDA каналам позвоночных.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на ряде научных конференций, в том числе: ХХХШ международном конгрессе по физиологии (Санкт-Петербург, 1997); съездах международного общества нейрохимии (Санкт-Петербург, 1998; Берлин, 1999; Буэнос-Айрес, 2001); съездах международного общества нейронаук (Новый Орлеан, 2000; Сан-Диего, 2001); симпозиумах Британского общества физиологии (Лондон, 2001; 2002; Кембридж, 2003); II съезде биофизиков России (Москва, 1999); XVIII съезде физиологического общества им. И.П.Павлова (Казань, 2001); XII международном совещании по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2001). В 2003 году по приглашению оргкомитета съезда Британского общества токсикологии был сделан пленарный доклад о моделировании связывания лигандов в ионных каналах. Серии работ по экспериментальному и модельному исследованию строения ионных каналов холинорецепторов и глутаматных рецепторов была присуждена медаль РАН для молодых ученых 2000г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 44 научных работы, в том числе 20 статей (из них 16 в рецензируемых международных журналах) и 24 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 176 стр., состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, двух глав результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 220 источников. Работа иллюстрирована 65 рисунками и 6 таблицами.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальный анализ действия блокаторов. В рамках данной работы действие блокаторов исследовалось в электрофизиологических экспериментах. Измерялись мембранные токи, вызванные активацией ионных каналов, и влияние блокаторов на эти токи. Каналоблокаторы вызызают концентрационно-зависимое угнетение токов, что позволяет определить величину (концентрация, вызывающая 50% ингибирование) из кривой концентрация-действие:

1в = 1к/(1 + [К]/ИК!0)

Где 1ки 1В - токи в контроле и в присутствии концентрации К блокатора. Коэффициэнт Хилла для каналоблокаторов, как правило, близок к единице. Детали механизма взаимодействия блокаторов с ионными каналами могут оказывать влияние на экспериментально измеряемые параметры и несут важную информацию о структуре канала и ее (структуры) изменениях при переходах между функциональными состояниями. Например, по потенциалозависимости действия блокаторов можно судить о расположении участка их связывания в канале. Согласно классической модели (ЭДооЛиЛ, 1973), потенциалозависимость действия заряженной молекулы блокатора определяется простой формулой:

ка(У)=ка(0)ехр(25Ртт)

где - заряд частицы блокатора, - доля трансмембранного поля до места связывания, - потенциал мембраны, Б, Я и Т имеют свои обычные значения. Кё(0) представляет собой константу диссоциации блокатора при нулевом потенциале. Несовпадение величин 5 служит признаком разного положения мест связывания блокаторов. У неизбирательных катионных каналов в нормальных условиях потенциал реверсии тока близок к нулю. Поэтому, величину Кё(0), характеризующую сродство блокатора к каналу невозможно измерить прямо. Необходимо исследовать потенциалозависимость блокады и определять Щ0).

Другой важной особенностью механизма действия служит наличие или отсутствие эффекта «ловушки». Если связывание блокатора не влияет на активацию канала, то происходит накопление молекул блокатора в закрытом состоянии канала, то есть «ловушка». Диссоциация блокатора из ловушки возможна только после повторной активации канала. При отсутствии «ловушки» канал не может закрыться, когда внутри него находится блокатор. Наличие ловушки сказывается на блокаде интегральных токов, которая обычно измеряется в электрофизиологическом эксперименте. В случае отсутствия ловушки, реакция блокирования выступает как уборка продукта реакции активации. Это приводит к сдвигу равновесия реакции активации вправо, то есть к активации дополнительного числа каналов и к недоизмерению блокирующего эффекта. Вследствие десенситизаии рецепторов, этот эффект невозможно преодолеть даже использованием насыщающей концентрации агониста. Поэтому, при анализе действия блокаторов определялось наличие или отсутствие «ловушки». Для этого анализировался отмыв блокатора в отсутствии агониста.

Для исследования ионных каналов рецепторов глутамата использовались нейроны, изолируемые из срезов мозга крысы методом вибродиссоциации (Vorobjev, 1991). При изучении NMDA каналов и непроницаемых АМРА каналов брались пирамидные нейроны поля СА1 гиппокампа, а при исследовании Са2+ проницаемых АМРА каналов -гигантские холинергические интернейроны стриатума. При изоляции, оба типа нейронов легко идентифицируются по морфологическим признакам. Регистрация токов осуществлялась методом локальной фиксации потенциала. При анализе действия блокаторов, потенциал, как правило, фиксировался на уровне-80мВ. Для анализа переходных процессов была реализована система быстрой аппликации (Vorobjev et al., 1996). Она позволяла производить смену раствора, омывающего клетку, за время порядка 10 - 20мс. Это временное разрешение достаточно для определения постоянных времени таких реакций, как развитие блокады и отмыв.

Молекулярное моделирование. Во всех расчетах использовалось приближение атом-атомных потенциалов. Конформационная энергия системы (Ек) представлялась в виде суммы компонент:

E« ~ Еж» + Ем + Егор + Евм Ек + Ещдр

Еж,- ван дер Ваальсово взаимодействие пар валентно не связанных атомов. Емл - энергия деформации валентных углов. Ею - энергия водородных связей.

Еш - электростатическое (Кулоновское) взаимодействие пар валентно не связванных атомов.

Е,,,,,- торсионная энергия в четверке валентно связанных атомов. Епщр - энергия гидратации.

Ван дер Ваальсово взаимодействие рассчитывалось по потенциалу Морзе (6/12) с параметрами силового поля AMBER (Weiner et al., 1984). Энергия гидратации рассчитывалась с использованием алгоритмов определения свободной поверхности функциональных групп (Lazaridis and Karplus, 1999). Для ускорения расчета, взаимодействия между атомами, удаленными друг от друга более чем на 8 , не учитывались. Такая отсечка вносит заметные искажения при расчете дальнодействующих электростатических взаимодействий (Brooks et al., 1985). Чтобы минимизировать этот эффект, в молекулах определялись электронейтральные группы атомов, и отсечка производилась не по отдельным атомам, а по электронейтральным группам. Поиск

оптимальной геометрии проводился методом Монте-Карло с минимизацией энергии (МСМ) (Li and Scheraga, 1987). Суть этого подхода состоит в сочетании случайных бросков конформации с последующим градиентным спуском в ближайший энергетический минимум.

При создании моделей использовались системы «ограничителей» (constraints). Ограничители представляют собой дополнительные потенциальные функции, для удержания конформации системы в заданных пределах. Потенциальные функции ограничителей имели вид парабол с плоским дном. Энергия ограничителя равна 0, если конформация системы находится в заданных пределах (плоское дно). Если же конформация отклоняется от предельных значений, энергия ограничителя растет пропорционально квадрату отклонения. Наиболее часто использовались два типа ограничителей: ограничитель отклонения декатровых координат атома от заданных значений и ограничитель расстояния между атомами. Ограничитель отклонения декартовых координат накладывался на С-альфа атомы аминокислот. В качестве центра разрешенной области брались рентгеновские координаты. Радиус плоского дна ограничителя обычно составлял 1 . Ограничитель расстояния между атомами применялся для фиксации специфических взаимодействий, например водородных связей.

Для анализа мест и характера связывания блокаторов и выявления аминокислот, играющих ключевую роль, был разработан метод расчета энергетических профилей. Профиль состоит из серии МСМ оптимизаций комплекса блокатор-канал, выполненных при последовательном продвижении молекулы блокатора вдоль оси канала. Это продвижение выполнялось, как правило, с шагом 1 . Поскольку не каждое положение блокатора соответствует локальному минимуму энергии, положение вдоль оси ограничивалось специальным ограничителем «плоскости». Этот ограничиеть не допускал выхода блокатора из области, ограниченной двумя плоскостями, перпендикулярными оси канала и отстоящими друг от друга на 1 . Подвижность блокатора между этими плоскостями не ограничивалась. В каждой точку профиля проводился МСМ поиск оптимальной конформации комплекса. В процессе поиска рандомизировались только обобщенные координаты блокатора и боковых цепей аминокислот, удаленных от блокатора менее, чем на 6 А. При этом, в минимизациях энергии варьировались все обобщенные координаты модели.

При расчетах использовался пакет программ ZMM (Zhorov, 1981, 1983, Zhorov and Ananthanarayanan, 1996; Zhorov and Lin, 2000). В ZMM реализованы алгоритмы минимизации энергии, Монте-Карло с минимизацией энергии. Пакет поддерживает функции, необходимые для гомологического моделирования, в том числе системы ограничителей. Для визуализации молекулярных систем и для интерактивного управления ZMM автором разработана программа молекулярной графики (MVM) для персональных компьютеров. Программа работает в операционной системе Windows98 и в более поздних версиях. Для создания изображений используется библиотека OpenGl. Программа рассчитана на визуализацию молекулярных систем размером до 256 тысяч атомов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Пространственное строение филантотоксинов: внутримолекулярные водородные связи. Экспериментальное изучение структурно-функциональных отношений лигандов ионных каналов является мощным методом анализа строения мест их связывания. В случае структурно простых лигандов, обладающих однозначным механизмом действия, интерпретация данных не представляет проблем. Однако, если используемые соединения конформационно гибкие, и имеют комплексный механизм действия (например блокируют открытый и закрытый канал),. решение структурно-функциональных парадоксов представляет собой специальную проблему, решать которую можно теоретическими методами.

Филантотоксины (Рис. 1А) представляют собой полиамин-содержащие разветвленные нециклические молекулы. Они являются антагонистами ионных каналов никотиновых холинорецепторов и глутаматных рецепторов (Гришин и др., 1986; Jackson, and Usheiwood, 1988). Несмотря на то, что в 90-х годах было синтезировано и исследовано более 100 производных (Bruce et al., 1990; Karst et al., 1991; Benson et al., 1992), четких закономерностей структурно-функциональных отношений выявить не удалось, поскольку молекулы рассматривались как линейные структуры. Для решения имевшихся парадоксов был проведен расчет трехмерной структуры филантотоксинов методом молекулярной. механики. Монте-Карло траектории, запущенные из полностью вытянутой начальной геометрии за 50 - 100 минимизаций сходились к свернутым структурам, стабилизируемым внутримолекулярными водородными связями. Эти связи формировались между аминогруппами и карбонильными атомами кислорода.

Гипотеза о внутримолекулярных водородных связях кардинально меняла представления о свойствах данных молекул. Обшая длина молекулы при наличии внутримолекулярных связей значительно меньше, чем в развернутом состоянии. Группы, пространственно разнесенные в развернутом состоянии, оказываются сближены. По крайней мере одна из аминогрупп вовлечена во внутримолекулярные связи и не может образовывать внешних водородных связей (ИкЬопоу Ы а1., 2000а).

Действие филантотоксинов на никотиновые холинорецепторы. При замене аминогрупп в а и Р положениях РЬТХ-343 на метиленовые группы (РЬТХ-(12)) блокирующая активность резко увеличивалась ^готаагё е! а1., 1999). Если-предполагать, что полиаминная группа филантотоксина, так же как и аммониевые группы других блокаторов связывается в ионным канале, уменьшение числа заряженных групп в молекуле должно приводить к уменьшению активности. Обнаружение этого парадокса сделало необходимым тщательное исследование и сравнение механизмов действия РЬТХ-343 и РЬТХ-(12) на ионный канал никотинового холинорецептора. Работа была проведена на культуральных клетках линии ТЕ671, экспрессируюшдах холинорецептор мышечного

типа (al^piyS, Интегральные токи, вызываемые быстрой аппликацией ацетилхолина, регистрировались методом локальной фиксации потенциала в конфигурации «whole cell». Для регистрации токов одиночных каналов использовалась конфигурация «outside-out».

Концентрационные зависимости ингибирующего эффекта измерялись в диапазоне мембранного потенциала от +50 до -100 мВ. Действие РКГХ-343 обладало ярко выраженной зависимостью от потенциала на мембране (Рис. 2А). Потенциалозависимость блокады РКГХ-(12) была выражена гораздо слабее (Рис. 2Б). Заряд молекулы РКГХ-(12) меньше, чем у РКГХ-343, что должно приводить к меньшей потенциалозависимости блокады. Однако, многие монокатионные блокаторы открытого канала холипорецептора

(имеющие тот же заряд, что и PhTX-(12)) обладают значительной потенциалозависимостью действия, чего не наблюдается в случае PhTX-(12). Данные о потенциалозависимости действия свидетельствуют, что место связывания PhTX-(12) менее заглублено в канале, чем место связывания PhTX-343.

Данные по влиянию PhTX-343 (IOjiM) и PhTX-(12) (1цМ) на токи одиночных каналов, вызванные 1цМ ацетилхолина, представлены на рис. 2 В и Г. Оба соединения не вызывали изменения проводимости одиночного канала или появления подуровней проводимости. Однако характер действия этих токсинов был существенно разным. PhTX-343 уменьшал среднее время открытого состояния и не влиял достоверно на время закрытого состояния (т«). Такое действие характерно для блокаторов открытого канала, которые могут взаимодействовать с сайтом связывания только когда канал открыт. Напротив, PhTX-(12) не оказывал влияние на то, но существенно повышал время закрытого состояния (тс). Это свидетельствует о том, что PhTX-(12) связывается преимущественно с закрытым каналом. Таким образом, обе серии экспериментов выявили- качественные различия в механизме действия PhTX-343 и PhTX-(12) на никотиновые холинорецепторы (Brier et al., 2003).

Моделирование связывания филантотоксинов: - блокада открытого канала.

Проведенные конформационные расчеты показали, что пространственные структуры PhTX-343 и PhTX-(12) кардинально различаются. Поскольку в молекуле PhTX-(12) аминогруппы в и положениях заменены на метиленовые группы, в систему водородных связей вовлекается единственная аминогруппа в положении. В результате, молекула PhTX-(12) приобретает свернутую конформацию, резко отличающуюся от структуры PhTX-343 (Рис. 1Б). Основываясь на этом различии, было необходимо выявить сайты связывания обеих молекул в канале холинорецептора и объяснить различие их действия исходя из представлений о структуре канала.

Поскольку экспериментальных данных о строении канала холинорецептора в атомарном разрешении не имеется, для анализа была использована молекулярная модель (Tikhonov and Zhorov, 1998). Суть модели заключается в наличие излома выстилающих пору М2 спиралей. В цитоплазматической части эти спирали не имеют радиального наклона и образуют узкую часть поры, в просвет которой обращены полярные боковые цепи

остатков серина и треонина. На внеклеточной стороне, спирали имеют значительный радиальный наклон и формируют воронкообразную структуру. Размеры поры канала были подобраны, исходя из данных о сайтах связывания ряда блокаторов. На данном этапе, кроме М2 сегментов рецептора в модель были включены Ml сегменты, которые частично выстилают пору канала на внеклеточной стороне, между расходящимися М2 сегментами. Модель была оптимизирована, а затем были расчитаны энергетические профили прохождения PhTX-343, PhTX-(12) и ряда других соединений. А

Рисунок 3. Энергетические профили (А) и оптимальные моды связывания (Б и В) РЬТХ-343 и РЬТХ-(12) в модели открытого канала холинорецептора. Вытянутая цепь РЬТХ-343 проникает глубоко в пору (Б) и связывается с полярными боковыми цепями остатков треонина (черный) и серина (серый). Гидрофобная часть молекулы взаимодействует с остатками лейцина и валина (белый). Этому положению соответствует минимум на энергетическом профиле. Свернутая структура РЬТХ-(12) не дает возможности молекуле проникнуть глубоко в канал (В), что приводит к появлению барьера на профиле._

Энергетический профиль PhTX-343 имеет глубокий и хорошо выраженный минимум (Рис. ЗА), соответствущий взаимодействию аминогрупп с полярными боковыми цепями остатков серина и треонина в узкой части канала. При этом гидрофобное ядро блокатора взаимодействует с гидрофобными остатками лейцина и валина в более широкой части (Рис. 3Б). Этот тип связывания характерен для многих блокаторов открытого канала холинорецептора, таких как хлорпромазин и QX-222. Энергетический профиль PhTX-(12) имеет совершенно другой характер. Вместо минимума наблюдается резко очерченный максимум. Различие в профилях для PhTX-(12) и PhTX-343 обусловлено не просто отсутствием в молекуле PhTX-(12) двух аминогрупп. Неспособность PhTX-(12) эффективно связываться в глубине канала объясняется его свернутой конформацией, которая образуется вследствие замыкания внутримолекулярных водородных связей с участием единственной аминогруппы. В результате образуется структура большого диаметра, неспособная проникнуть в узкую часть канала (Рис. ЗВ). Кроме того, единственная аминогруппа вовлечена во внутримолекулярные водородные связи и не может взаимодействовать с каналом. Полученные результаты согласуются с имеющимися экспериментальными данными о действии филантотоксинов, описанными выше: PhTX-343 блокирует открытый канал холинорецептора, a PhTX-(12) - нет. Эти выводы поддерживаются расчетами энергетических профилей для других соединений, как производных PhTX-343, так и ряда других блокаторов каналов холинорецептора.

Модель воротного механизма канала никотинового холинорецептора. Согласно полученным результатам, блокаторы открытого канала связываются в узкой, заглубленной части канала. Следовательно, этот сайт доступен только в открытом состоянии канала, а доступность поверхностного сайта, где могут связываться PhTX-(12) и другие блокаторы закрытого канала, не зависит от состояния рецептора. Таким образом, воротный механизм канала должен быть расположен в средней части канала. Исходя из этого предположения была построена модель закрытого канала. Суть этой модели состоит в том, что участок излома М2 спиралей в средней части канала обладает повышенной гибкостью за счет разрыва спиральных водородных связей (Tikhonov and Zhorov, 1998). При этом, консервативные остатки лейцина, так называемого экваториального кольца, могут быть ориентированы как в область контакта М2 сегментов (модель открытого канала), так и внутрь поры (Рис. 4).

А Б

Рисунок 4. Модели открытого (А) и закрытого (Б) канала. Вид в плоскости мембраны. В открытом канале остатки лейцина экваториального кольца обращены в область межсегментного контакта. В закрытом канале они ориентированы внутрь поры канала, хотя и не перекрывают ее полностью._

В полученной модели закрытого канала боковые цепи этих остатков существенно уменьшают просвет канала, но не перекрывают его полностью. Одновременно, гидрофобные боковые цепи лейцинов экранируют нуклеофильные группы в глубокой части канала. Именно этот эффект, а не стерическое перекрывание канала, по нашей гипотезе является ключевым механизмом воротного механизма. Неорганические ионы легко проходят гидрофильные сужения каналов, заменяя контакты с молекулами воды на взаимодействия с полярными группами, выстилающими канал. Однако дегидратация ионов в гидрофобном сужении, которое образуется в закрытом канале, требует больших энергетических затрат, что проявляется в отсутствии проводимости (Beckstein et al., 2003). Данная гипотеза была подтверждена расчетами, показавшими, что в модели закрытого канала профили для блокаторов открытого канала теряют характерный минимум в заглубленной части канала, а профили для блокаторов закрытого канала практически не меняются.

В 2003 году группой Н. Анвина была опубликована модель закрытого канала холинорецептора, полученная методом электронной микроскопии с разрешением 4 А (Miyazawa et al., 2003). Общий вид этой модели, укладка Ml и М2 сегментов совпадают с предложенными нами (Рис. 5А). Более детальный анализ показывает также практически полное совпадение геометрий колец аминокислот, играющих основную роль в связывании каналоблокаторов (Рис. 5Б, В) и в активации канала (Рис. 5Г).

Рисунок 5. Сопоставление модели ионного канала никотинового холинорецептора с данными электронной микроскопии (М1уа2а\га й а1,2003). Вид в плоскости мембраны. А, общая укладка цепей Слева - данные М1уахалуа е! а1. (2003), справа - предлагаемая нами модель. Б - Г, наложение моделей. Серым цветом представлены данные М^агаига е1 а1 (2003), черным - нашей модели. Геометрии Треонинового (Б) Серинового (В) и Экваториального (Г) колец практически совпадают._

Детерминанты блокады глутаматных рецепторов NMDA-типа: циклическая организация селективного фильтра. Ионные каналы NMDA и АМРА подтипов глутаматных рецепторов существенно различаются по физиологическим и фармакологическим характеристикам. Каналы NMDA рецепторов имеют большую проводимость и большую относительную проницаемость для ионов кальция, чем каналы АМРА рецепторов (Geiger et al, 1995; Wyllie et al., 1996) Они блокируются ионами магния, а каналы АМРА рецепторов - нет (Mayer et al., 1984). Большинство органических блокаторов каналов NMDA рецепторов, такие как МК-801 и фенциклидин также не активны против каналов АМРА рецепторов. Несмотря на это, каналы АМРА рецепторов

проницаемы для органических катионов большего размера, чем каналы NMDA рецепторов (Villarroel et al., 1995; Bumashev et al., 1996), что свидетельствует о большем поперечном сечении первых. Как NMDA, так и АМРА каналы гомологичны калиевым каналам, поэтому различия их свойств должны определяться не разной упаковкой белковой цепи, а локальными свойствами определенных аминокислот. Таким критическим местом в глутаматных рецепторах является аминокислота в вершине внутримембранной М2 петли (N/Q/R. сайт). Это положение соответствует треонину в селективном фильтре калиевых каналов TVGYG. NMDA каналы имеют в этом положении аспарагин, а АМРА каналы - глутамин или аргинин. Наличие аргинина в субъединице GluR2 определяет чрезвычайно низкую проводимость и кальциевую проницаемость этого типа АМРА каналов (Washburn et al., 1996; Swanson et al., 1997).

А Б

Рисунок 6. Циклическое строение селективного фильтра (N/(2/11 сайта) АМРА (А) и 1ч'МОА (Б) каналов. Макроцикл стабилизируется межсегментными водородными связями, показанными стрелками. За счет большей длины боковых цепей остатков, формирующих цикл, АМРА каналы имеют больший диаметр, чем NMDA каналы. В КМОА, но не в АМРА каналах, атомы кислорода боковых цепей (показаны черным) ориентированы внутрь поры (ТЛсЬопоу е! а!., 1999)._

Очевидно, что такие специфические свойства селективных фильтров каналов глутаматных рецепторов могут объясняться только специфическими взаимодействиями в N/0/® сайте. Суть предложенной гипотезы заключается в формировании межсегментных водородных связей, образующих цикл. Расчеты моделей показали, что наиболее вероятно образование водородной связи между аминогруппой боковой цепи остатка N/0/®. сайта и атомом кислорода основной цепи гомологичного остатка, принадлежащего соседней

субъединице (Рис. 6). Модели правильно предсказывают наименьший диаметр канала, имеющего в селективном фильтре аспарагин. Включение боковых цепей аминокислот селективного фильтра в цикл водородных связей существенно ограничивает их конформационную свободу. В результате, изменение длины боковой цепи на один элемент (метиленовую группу) приводит к несовпадению предпочтительных ориентаций кислородов боковых цепей у «аспарагиновой» модели, соответствующей КМБЛ каналу и «глутаминовой» модели, соответствующей АМРА каналу. Для «глутаминовой» модели, имеющей ориентацию кислородов боковой цепи вовне поры канала, цикл селективного фильтра оказывается гидрофобным, так как кислорода основной цепи вовлечены в систему водородных связей и недоступны для взаимодействия с ионами и блокаторами в поре.

Для прохождения неорганических катионов через сужение менее 8 А необходима частичная дегидратация. В гидрофобном сужении это требует затрат энергии и приводит к меньшей проводимости АМРА каналов. Напротив, если кислороды боковой цепи ориентированы внутрь канала, как в «аспарагиновой» модели, они способствуют дегидратации проходящего иона и связыванию катионного блокатора (Рис. 7). Таким образом, основным детерминантом блокады КМБЛ каналов органическими

монокатионами, имеющими в своем составе аминогруппу, протонируемую при физиологических рН, является наличие ориентированных внутрь поры атомов кислорода, являющихся акцепторами водородной связи. Инвертирование ориентации этих атомов кислорода в АМРА каналах объясняет селективное действие блокаторов КМБЛ каналов (Т1кИопоуе1а1., 1999).

Детерминанты блокады глутаматных рецепторов NMDA-типа: эффект ловушки и дополнительный сайт связывания. Активность селективных блокаторов КМВЛ каналов варьирует в широких пределах. Например, производные фенилциклогсксила блокируют КМБЛ канал в 200 раз эффективнее, чем производные адамантана (ВокИакоу е! а1., 2000). Чем определяется такое различие в активности? При анализе блокады КМБЛ каналов было обнаружено существенное различие в механизме действия производных адамантана и фенилциклогексила. Производные фенилциклогексила демонстрируют блок с «ловушкой». Блокирующий- эффект последовательно увеличивается в серии аппликаций, отмыв также достигается несколькими аппликациями агониста. Это говорит о том, что между аппликациями блокатор остается связанным в закрытых каналах, то есть в «ловушке». А при блокаде производными адамантана, блок развивается уже при первой совместной с агонистом аппликации, отмыв также происходит сразу, то есть эффект «ловушки» не наблюдается (Рис. 8).

Обнаруженное различие поставило вопрос о детерминантах эффекта «ловушки». Наиболее очевидной казалась «стерическая» гипотеза: блокатор связывается в полости канала между селективным фильтром и воротами; при этом связывание небольших по размеру молекул не препятствует закрытию канала, а крупные молекулы не дают воротам закрываться и, таким образом, «ловушка» не наблюдается (8оЪо1еу§ку е! а1., 1999). Однако, имеющиеся данные не подтверждает эту гипотезу. Во-первых, анализ пространственных структур известных блокаторов показал отсутствие корелляции между их размерами и эффектом «ловушки». Во-вторых, по данным рентгеноструктурного анализа полость закрытых калиевых каналов, которые гомологичны каналам глутаматных рецепторов, достаточно велика, чтобы вместить даже относительно крупные молекулы блокаторов КМБЛ каналов.

Для решения вопроса о детерминантах эффекта «ловушки» было проведено экспериментальное исследование. Был разработан ряд соединений, представленный на рис. 9. Монокатионные соединения этого ряда различаются по количеству метиленовых групп между гидрофобным фенилциклогексильным ядром и терминальной аминогруппой. Поскольку эти части являются основными детерминантами активности (Кгоешег е! а1., 1998), систематическое изменение расстояния между ними должно было выявить оптимальную структуру. Дикатионные соединения различаются по размеру терминальной группы. Вместо маленькой аминогруппы ИЭМ-1925, ИЭМ-2041 имеет массивную триэтиламмониевую группу. Эта группа не должна проникать сквозь селективный фильтр, и, таким образом, вся молекула должна оставаться в полости канала.

При потенциале фиксации мембраны -80мВ, монокатионные соединения и ИЭМ-1925 имеют величину ИК;о в пределах 1-20 мкМ. Потенциалозависимость действия наиболее сильно различается у дикатионных производных. Она наибольшая у ИЭМ-1925 и наименьшая у ИЭМ-2041. Это означает, что терминальная аминогруппа проникает в узкую часть канала, обеспечивая большую, чем у монокатионных соединений, потенциалозависимость. Напротив, триэтиламмониевая терминальная группа ИЭМ-2041 не может пройти сужение канала. Это обусловливает низкую потенциалозависимость и слабую блокирующую активность данного соединения. У всех соединений кроме ИЭМ-2041 скорость отмыва уменьшается при гиперполяризации мембраны, что коррелирует с потенциалозависимостью блокирующего действия. Анализ потснциалозависимости кинетики отмыва выявил не только количественные, но и качественные различия. В экспериментах наблюдалось два типа отмыва блокаторов, однофазный и двухфазный, при котором ток сначала резко возрастал до величины, превосходящей контрольное значения (овершут), а затем наблюдался более медленный спад к равновесной величине (Рис. 10).

Рисунок 10. Два типа отмыва блокаторов NMDA канала. При двухфазном отмыве (слева) ток возрастает до величины, превышающей контрольное значение, а затем спадает до равновесного уровня. При однофазном отмыве (справа) явление «овершута» не наблюдается._

Наличие «овершута» показывает, что при блокаде равновесие между закрытыми и открытыми каналами смещается в пользу последних. За счет этого, при быстром отмыве блокатора, ток оказывается больше контрольного, а уже затем исходное равновесие восстанавливается. Таким образом, наличие «овершута» свидетельствует о том, что связывание блокатора на дает каналу закрываться, то есть «ловушка» отсутствует. «Овершут» наблюдается для ИЭМ-2041 при любом потенциале фиксации мембраны. Для ИЭМ-1925 и ИЭМ-2014 этот эффект проявляется при деполяризации до -40 мВ, а у ИЭМ-1921 и ИЭМ-2044 только при положительных потенциалах. То есть, для всех соединений,

действие которых потенциал озависимо, проявление «ловушки» тоже зависит от потенциала.

А Б

Рисунок 12. Измерение «ловушки» в опытах с парной стимуляцией. А, протокол опыта. См. текст. Б, потенциалозависимость эффекта «ловушки». Для ИЭМ-2041 ловушка не наблюдается. ИЭМ-1921 демонстрирует силбную «ловушку», несколько снижающуюся при деполяризации. Для ИЭМ-1925 и ИЭМ-2014 «ловушка» сильно потенциалозависима в диапазоне от -100 до -40 мВ._

Измерение степени «ловушки» в экспериментах с парной стимуляцией дало аналогичные результаты (Рис. 12). Вызванные аппликацией агонистатоки блокировались насыщающей концентрацией блокатора. После этого, агонист и блокатор убирались из омывающего нейрон раствора, и через 25 сек. агонист апплицировался вновь. При наличии «ловушки», в начале второй аппликации агониста часть каналов оказывалась уже блокирована, что выявлялось сопоставлением с ответом на контрольную аппликацию агониста (ток 12 меньше тока II, см. Рис. 12А). Для ИЭМ-1921 высокая степень «ловушки» наблюдается при всех отрицательных потенциалах. Для ИЭМ-2041 заметной «ловушки» не наблюдалось. Для остальных соединений эффект был сильно потенциалозависим (Рис. 12Б).

Потенциалозависимость «ловушки» монокатионных соединений нами была обнаружена впервые. Этот эффект не может быть объяснен с точки зрения стерической гипотезы при связывании блокатора с одним единственным сайтом в канале. Предлагаемая нами гипотеза состоит в том, что в канале NMDA рецептора существует два сайта связывания блокаторов (Схема 1, рис. 13). Сайт 1 должен находиться в вестибюле канала, а сайт 2 -глубже, в области селективного фильтра. Поэтому сайт 2 доступен только после оккупации сайта 1. Сайт 1 расположен в области ворот, и его оккупация блокатором

препятствует закрытию канала. В сайте 2 блокатор не препятствует закрытию и «ловушке». Поскольку сайт 2 расположен глубже в канале, гиперполяризация смещает равновесие вправо, то есть в пользу связывания блокатора с сайтом 2. За счет этого и достигается потенциалозависимость «ловушки». Наблюдаемая степень «ловушки» зависит от соотношения сродства блокатора к двум сайтам. При большом сродстве к сайту 2, как у ИЭМ-1921, эффект «ловушки» сильный, и лишь незначительно уменьшается при деполяризации. У более слабых ИЭМ-1925 и ИЭМ-2014 деполяризация приводит к практически полному исчезновению эффекта. Стерические эффекты также проявляются у таких больших молекул как ИЭМ-2041, которые при любых потенциалах препятствуют закрытию канала.

ЛС ЯО + В «-> Я0В1 <-> 110В2 ЯСВ2 Схема 1

ЯС - закрытый канал; ЯО - открытый канал; В - блокатор; ЯОВ1 - канал, блокированный по первому сайту связывания; ЯОВ2 - канал, блокированный по второму сайту; ЯСВ2 -закрытый канал с локатором в «ловушке».

ИЭМ-1921 ИЭМ-1921 ИЭМ-1925 ИЭМ-1925 ИЭМ-2041

Дмплярюация Гиперполяртацря Далоляримцик Гммрполприаащи

Ловушка

Рисунок 13. Схема расположения сайтов связывания блокаторов в канале NMDA рецептора. Связывание с сайтом 1 препятствует закрытию ворот (О) и «ловушке». При связывании с сайтом 2 «ловушка» возможна (Bolshakov et al., 2003)._

Сайт 2 очевидно расположен в области селективного фильтра канала. Именно связывание с этим сайтом, не препятствующее закрытию канала было визуализировано на рис. 7А (ВокЬакоу й а1., 2003). Установить точное расположение сайта 1 пока не представляется возможным. Для этого будет необходимо провести ряд мутаций в МЗ сегментах ММЭЛ канала, которые образуют вестибюль и активационные ворота канала.

Детерминанты блокады глутаматных рецепторов АМРА-типа: структурно-функциональные исследования. Исследования глутаматных рецепторов АМРА-типа в значительной степени тормозилось из-за отсутствия набора блокаторов, которые могли бы быть использованы как молекулярные пробы строения каналов. Для каналов КМБЛ-типа существует большое количество активных блокаторов, но большинство из них не способны блокировать каналы АМРА рецепторов. Все известные блокаторы АМРА каналов являются полиаминами или полиамин-амидами, поэтому обнаружение анти-АМРА активности дикатионных производных адамантана, имеющих простую и предсказуемую трехмерную структуру, явилось ценной находкой, которая была использована для выявления структурных детерминант блокады АМРА каналов (Magazaмk е! аИ, 1997). Активность соединений (ИК50) определялась из концентрацонных зависимостей блокады стационарных интегральных токов, вызванных аппликацией агониста.

На первом этапе исследования был синтезирован ряд монокатионных соединений, включающих разные гидрофобные группы, чтобы проверить, действительно ли монокатионы, являющиеся блокаторами ММЭЛ каналов, не действуют на АМРА каналы. Набор использованных гидрофобных групп приведен на рис. 14. Активность монокатионных соединений на ММЭЛ каналах варьирует в широких пределах, но все они не блокируют АМРА каналы в концентрациях вплоть для 0.5мМ. Избирательное действие монокатионных соединений на ММЭЛ каналы согласуется с моделями селективного фильтра, описанными выше.

Адамантан Фенилциклогексил Ди фенил Трифенил Пирилен

А<1 РЬСЬ РИС РЬЗС Руг

Рисунок 14. Гидрофобные группы соединений, использованных при анализе детерминант блокады АМРА каналов. И - варьируемая цепь._

Дикатионные аналоги тех же самых соединений, напротив, являются активными блокаторами АМРА каналов (ВокЬакоу е! а1., 2000). Все эти соединения демонстрируют потенциалозависимый блок с выраженным эффектом «ловушки». При этом они

оказываются слабоселективными или даже избирательными блокаторами АМРА каналов. Напротив, блокада NMDA каналов при добавлении в структуру блокатора второй заряженной группы меняется незначительно (Рис. 15). Наиболее высокая АМРА селективность наблюдаются у соединений, для которых характерна слабая степень «ловушки» в NMDA каналах. Это свидетельствует, что различия в наблюдаемой активности определяются не различием химического сродства к сайтам связывания, а отражают различия в механизме действия. При слабой «ловушке» анализ активности по блокаде интегральных токов приводит к недоизмерению активности за счет смещения равновесия между открытыми и закрытыми каналами, вызываемого такими блокаторами.

В исследованных дикатионных соединениях терминальная триметиламмониевая группа соединяется с вторичной аминогруппой пентаметиленовой цепью. Если наличие этой группы критично для блокады АМРА каналов, то естественно было проверить, каково оптимальное межазотное расстояние. Это исследование было проведено для гомологического ряда производных адамантана, в котором число метиленовых групп в межазотной цепи (п) варьировалось от 2 до 7. Результаты, представленные на рис. 16А, показывают, что активность блокаторов этого ряда имеет ярко выраженный максимум при п=5. Удлинение или укорочение цепи на одну

щ монокатионныв соединения I | дикатионные соединения

АМРА рецептор NMDA рецептор

Рисунок 15. Соотношение активностей моно- и дикатионных соединений при блокаде ионных каналов АМРА и NMDA рецепторов. АМРА каналы блокируются только дикатионными соединениями, тогда как для блокады NMDA каналов наличие второй заряженной группы не играет значительной роли._

метиленовую группу приводит к уменьшению активности в 6 - 9 раз. А различие между наиболее и наименее активным соединениями составляет три порядка. Для NMDA каналов вариации активности при варьировании межазотной цепи лежат в пределах одного порядка. То есть, для АМРА, но не для NMDA каналов, наличие и положение терминальной аммониевой группы является критическим детерминантом связывания ^^^ et al, 2000).

А Б

Ас) - СН, - М*Н, - (СНД,- N'N18, АМРА рецептор

—•—АМРА рецептор —о— Аа-сн^'н^сн^-^ме.

1000 —о— ММОА рецептор 1000 —«— да - Ы'Н^СН^-ИГМе,

X. —1

I 'И1] 1«к>

У 10. 2 ¡^10-з;

1 1

1 1 4 1 а I п 2 3 4 1 в 7 п

Рисунок 15. Зависимость активности дикатионных блокаторов от числа метиленовых

групп (п) в межазотной цепи (Магазаник и др. 2001).

При увеличении межазотного расстояния в рассмотренном ряду одновременно увеличивается общая длина молекулы. Поэтому не представляется возможным сделать вывод о том, какая из двух меняющихся величин, межазотное расстояние или расстояние между терминальной аммониевой группой и гидрофобным ядром блокатора, является определяющей. Для решения этого вопроса был синтезирован и исследован второй ряд соединений, в котором была удалена метиленовая группа между адамантановым ядром и вторичной аминогруппой. Сопоставление анти-АМРА активностей в этих двух рядах дано на рис. 16Б. Для второго ряда соединений также имеется хорошо выраженный минимум , который однако смещен к То есть удаление одной метиленовой группы между адамантановым ядром и вторичной аминогруппой требует добавления одной метиленовой группы в межазотную цепь для восстановления общей длины молекулы и максимальной активности. Из этого можно сделать вывод о том, что именно расстояние между гидрофобным ядром молекулы блокатора и терминальной аммониевой группой определяет блокирующую активность, в то время как положение вторичной

аминогруппы не имеет большого значения для блокады АМРА каналов (Магазаник и др. 2001).

Если положение вторичной аминогруппы не важно, то можно ли ее вообще удалить? К сожалению, монокатионные соединения, в которых гидрофобное ядро соединено с терминальной аминогруппой длинной цепочкой, являются плохо растворимыми. Попытка преодолеть эту проблему введением в гидрофобное ядро полярных групп также не привела к успеху. Соединения, представленные на рис. 16А не действуют ни на АМРА, ни на ММЭЛ каналы. Причина потери активности в конформационных свойствах этих соединений. При наличии доноров и акцепторов водородной связи, и в отсутствии второй заряженной группы, обеспечивающей вытянутую конформацию цепи за счет электростатического отталкивания, молекула складывается с образованием внутренних водородных связей (рис 16Б). Этот конформационный эффект аналогичен наблюдаемому у филантотоксинов (см. рис. 1). Таким образом, хотя вторичная аминогруппа очевидно не имеет специфического связывания в канале АМРА рецептора, ее роль состоит в стабилизации конформации, оптимальной для связывания гидрофобного ядра и терминальной группы.

А Б

0ЛгЛо (СН2)5 ¿+н3 д (СН2)5 н-ьопа

Рисунок 16. Химические структуры (А) и трехмерная геометрия ■ (Б) соединений с депротонированным азотом. Образование внутримолекулярной водородной связи приводит к сворачиванию молекулы и потере способности блокировать как NMDA, так и АМРА каналы.

Если терминальная аммониевая группа необходима для блокады АМРА каналов, то какова ее оптимальная структура и размеры? Сопоставление активностей соединений, имеющих заместители разного размера в терминальной группе, выявило еще одно

различие между каналами АМРА и NMDA рецепторов. Для блокады NMDA каналов оптимальной является аминогруппа, имеющая минимальный размер. Увеличение размеров при замене аминогруппы триметиламмониевой группой приводит к уменьшению активности в 2-4 раза, причем этот эффект характерен как для моно- так и для дикатионных соединений. Для блокады АМРА каналов зависимость активности от размеров терминальной группы немонотонна, соединения, имеющие триметиламмониевую терминальную группу, в 2-3 раза более активны, чем соединения с терминальной аминогруппой. Соединения, имеющие триэтиламмониевую терминальную группу, слабо действуют как на NMDA, так и на АМРА каналы.

Из полученных данных можно сделать вывод о строении участков связывания блокаторов в NMDA и АМРА каналах (Рис 17). Очевидно, что этот сайт включает гидрофобный карман, в котором связывается гидрофобное ядро блокатора, и нуклеофильное кольцо, с которым связывается терминальная аммониевая группа. Основное различие состоит в расположении нуклеофильной области. В АМРА канале она удалена от гидрофобной области, в результате чего только дикатионные соединения определенной длины

Рисунок 17. Топографические модели участков связывания блокаторов в каналах АМРА(А) и КМЭА (Б) рецепторов (ВоЬЬакоу « а!., 2000; Магазаник и др. 2001).

способны эффективно блокировать эти каналы. В NMDA канале нуклеофильная область расположена близко к гидрофобной, что обеспечивает эффективную блокаду различными монокатионными соединениями. Различие в оптимальном размере терминальной группы свидетельствует о различии в размерах узкой части каналов. Полученные нами данные (Bolshakov et э1., 2000; Магазаник и др. 2001;. 2002) согласуются с независимыми

измерениями, свидетельствующими о большем диаметре АМРА канатов, по сравнению с NMDA каналами (Villarroel et al., 1995; Burnashev et al., 1996).

Из топографических моделей следует простой методический рецепт получения активного блокатора АМРА канала: следует взять блокатор NMDA канала и добавить к нему «хвост» определенной длины, несущий аммониевую группу. Кроме этого практического вывода, важного для направленного синтеза блокирующих агентов, полученные топографические модели участков связывания блокаторов в каналах NMDA и АМРА рецепторов могут служить для разработки молекулярных моделей каналов и анализа деталей их трехмерного строения. Для NMDA канала, разработанная молекулярная модель селективного фильтра (см. Рис. 7) согласуется с топографической моделью. Для того, чтобы определить, чем формируется удаленное нуклеофильное кольцо в АМРА канале, потребовался дальнейший анализ.

Детерминанты блокады глутаматных рецепторов АМРА-типа: модель внутримембранной петли.. В предыдущих разделах было показано, что остаток глутамина в селективном фильтре АМРА канала не может обеспечивать связывание катионных групп блокаторов, так как, карбонильные атомы кислорода не обращены внутрь поры канала. В то же время, путем анализа структурно-функциональных отношений блокаторов, мы продемонстрировали, что аммониевая группа молекулы блокатора, удаленная от гидрофобного ядра, необходима для связывания в канале АМРА рецептора. Эта аминогруппа очевидно взаимодействует с некой нуклеофильной группой в канале. Однако, с помощью химико-фармакологического подхода невозможно было установить, что это за нуклеофильная группа и как она расположена в канале. Приблизиться к пониманию ее природы и местоположения можно с помощью модели канала.

При построении модели были использованы рентгеноструктурные данные калиевых каналов (Doyle et al., 1998), результаты точечного (Mori et al., 1992; Ferrer-Montiel et al., 1998) и сканирующего (Beck et al., 1999; Kuner et al., 1996; 2001; Panchcnko et al., 2001) мутагенеза В качестве шаблона трехмерной структуры был использован кристаллизованный калиевый канал KcsA. Узкую часть калиевых каналов образует Р-петля, гомологичная М2 сегменту глутаматных каналов. Ее N-конец представляет собой спираль, что для глутаматных рецепторов подтверждается многочисленными данными

сканирующего мутагенеза. С-конец непосредственно выстилает селективный фильтр. Поскольку калиевые каналы и каналы АМРА рецепторов обладают разной селективностью, аминокислотные последовательности в области селективного фильтра существенно различны. В частности, АМРА рецепторы имеют делецию в этой области. Поэтому, использовать структуру селективного фильтра калиевого канала для моделирования канала АМРА рецептора не представлялось возможным. Мы могли быть уверены только в том, что М2 сегменты АМРА канала как и Р-сегменты калиевого канала образуют петлю, причем С-часть этой петли спиральна.

Для построения модели необходимо было выявить молекулярные механизмы, стабилизирующие пространственную структуру петли. В калиевых каналах важную роль играют остатки триптофана W41 и W42 (табл. 1). Они образуют водородные связи с остатками D54 и Y52. Мутации в этих парах коррелируют. Например, в HERG каналах теряются обе пары. В каналах глутаматных рецепторов отсутствует пара W42 - Y52, но сохраняется консервативной пара W41 - D54. Логично было допустить, что сохраняется и взаимодействие между этими остатками, стабилизирующее структуру петли. Другим источником стабилизации могут служить межсегментные водородные связи в селективном фильтре, описанные выше.

Таблица 1. Аминокислотные последовательности внутримембранных петель калиевых каналов и глутаматных рецепторов.

Тип Канал 33 41 51

К+ КсвА ЫТУРИДЬ ИНБУЕТАТТУ СУСЭ

М&К СЕЗИТУЗЬ УИТП/Т1АТУ СУСЭ

НЕ1Ш коктетАЬ УГТГЭЗЬТЗУ сгск

аик ИиТи ЕГС1ГИЗЬ »»ЕЗГЛАГМОО с.со

аиЯб ОПШ^Г ЯГСУСАЬМОО й-БЕ

аим ЕГСТгагЬ НГЗЬСАЕТЖО й-СО

Таким образом, при построении модели мы использовали геометрию спиральных участков петель в соответствии с рентгеностуктурными данными калиевых каналов, и оптимизировали структуру С-концов (положения 48 - 54 в Табл. 1), учитывая вероятные стабилизирующие факторы. Оптимизация структуры показала, что за счет делеции в положении 52 С-конец внутримембранной петли АМРА канала оказывается более напряженным, чем в калиевом канале. В результате, в АМРА канале, в отличие от

калиевого канала, не образуется туннеля, выстланного пятью кислородными кольцами. В полученных моделях в пору канала оказывалось обращено не более одного кольца атомов кислорода. Однако, даже при наличии ограничений, конформационный расчет оказался неоднозначен. Было получено 5 моделей, обладающих приблизительно равными энергиями. В этих моделях кислородные кольца, обращенные внутрь поры канала, образовывались остатками G51 или С53.

Рисунок 18. Модель внутримембранной петли ионного канала АМРА рецептора в присутствии каналоблокаторов ИЭМ-1460 (А) и РЬТХ-343 (Б). В обоих случаях гидрофобная часть молекулы связывается в узкой части капала с остатками (}49, а терминальная заряженная группа проникает глубже в какал и достигает кислородного кольца, образуемого остатками 051 ("ПкЬопоу ег а!., 2002)._

Для того, чтобы выбрать наиболее адекватную модель был проведен расчет связывания дикатионных производных' адамантана где число

метиленовых групп (п) варьировало от 3 до 7. В предыдущем разделе было показано, что наибольшей активностью обладает соединеие с п=5, причем уменьшение и увеличение параметра п приводит к прогрессивному уменьшению активности. Расчет оптимальных комплексов 5 блокаторов с 5 вариантами модели показал, что только одна модель способна воспроизвести экспериментально наблюдаемую зависимость активности от длины межазотной цепи блокатора. В этой модели атомы кислорода главной цепи остатков глицина в положении 51 ориентированы внутрь поры канала и способны связывать терминальную аммониевую группу блокатора. Это кислородное кольцо-расположено таким образом, что при связывании адамантанового ядра блокатора с остатками глутамина 49, образующими наиболее узкую часть канала, терминальная

ИЭМ-1460

РЬТХ-343

049 • 049

031 051

аммониевая группа наиболее активного соединения рассматриваемого ряда оказывается точно напротив кислородного кольца остатков глицина 51 (Рис. 18А).

Гипотеза о роли кислородного кольца остатков глицина подтверждается не только визуальным анализом оптимального комплекса блокаторов с моделью. На рис. 19 приведены энергетические характеристики связывания. Общая энергия комплекса блокаторов с каналов согласуется с экспериментальными данными, то есть предсказывает оптимальное связывание соединения с п=5. Видно, что этот минимум обеспечивается электростатическими взаимодействиями между блокатором и каналом, а также оптимальной внутренней энергией модели, то есть суммарной энергией, за исключением энергии взаимодействия между молекулой блокатора и моделью. Последнее означает, что модель «более охотно» принимает конформацию, выгодную для связывания блокатора с n=5. На рис. 19Б показано, как энергия взаимодействия блокаторов с моделью распределена между отдельными аминокислотными остатками. Очевидно, что именно остатки G51 обеспечивают минимум суммарной энергии взаимодействия при n=5.

А Б

3 4 J в 7

Рисунок 19. Энергетические характеристики взаимодействия дикатионных производных адамантана А^СНг->ГН2-(СН2)„->ГМез, с моделью канала АМРА рецептора. А, компоненты энергии и экспериментально определенные активности. Минимум при п=5 достигается за счет электростатических взаимодействий при оптимальной внутренней энергии блокатора и канала. Б, Распределение энергии взаимодействия по аминокислотным остаткам модели. Остатки 051, экспонирующие в пору кислородное кольцо, ответственны за минимум при п=5._

Для того, чтобы проверить предлагаемую модель следовало использовать блокаторы, которые не использовались при ее разработке. В качестве такого соединения был выбран филантотоксин (PhTX-343), который эффективно блокирует каналы АМРА рецепторов. Его оптимальный комплекс с моделью был рассчитан также, как и для дикатионных производных адамантана. Как видно из рис. 18Б, оптимальная мода связывания PhTX-343 аналогична ИЭМ-1460. Терминальная аминогруппа взаимодействует с остатками G51, а гидрофобная «голова» связывается в области Q49. Взаимодействия в гидрофобной области изменяют конформацию «головы» по сравнению с оптимальной структурой, полученной для отдельной молекулы PhTX-343. Однако общая трехмерная структура, стабилизируемая внутримолекулярными водородными связями, сохраняется. То есть модель канала АМРА рецептора не противоречит описанным выше результатам по моделированию филантотоксинов.

Таким образом, нам удалось построить модель, адекватно описывающую блокаду канала АМРА рецептора дикатионными производными адамантана и полиаминными токсинами (Tikhonov et al., 2002). Модель предсказывает, что кислородное кольцо, ответственное за связывание терминальных аммониевых групп блокаторов формируется остатками G51. Согласно нашей модели, основное отличие канала АМРА рецептора от калиевого канала заключается в числе обращенных в пору кислородных колец. В калиевом канале пять таких колец обеспечивают высокую избирательность для проходящих ионов. В канале АМРА рецептора делеция в положении 52 меняет конформацию С-конца внутримембранной петли. В результате, этот канал имеет только одно кислородное кольцо (G51), которое и определяет многие свойства канала, в том числе закономерности его блокады и более низкую селективность по отношению к неорганическим катионам.

Применение блокаторов для сравнительного анализа каналов глутаматных рецепторов позвоночных и беспозвоночных. Разработанные представления о структуре и детерминантах блокады ионных каналов глутаматных рецепторов можно использовать для исследования менее изученных рецепторов беспозвоночных. Известно, что по аминокислотным последовательностям глутаматные рецепторы беспозвоночных бывают похожи как на АМРА, так и на NMDA типы (Hutton et al., 1991; Peterson et al., 1997; Schuster et al., 1991; Stuhmer et al., 1996; Ultsch et al., 1992; 1993), однако, их специфическая локализация и роль остаются слабо изученными. Выше было описано, что структурно-фукциональные отношения в ряду дикатионных производных адамантана при

варьировании межазотного расстояния существенно различаются для АМРА и NMDA каналов позвоночных. Более того, мы показали, что эти различия определяются разным положением нуклеофильного компонента участка связывания блокаторов в этих каналах.

В качестве объектов для сравнения с каналами позвоночных были выбраны глутаматные рецепторы нервно-мышечного соединиения личинки мухи (СаШркога угста) и рецепторы нейронов брюхоногого моллюска (РШапогЬапт согпеыя). При анализе действия блокаторов на рецепторы личинки мухи тестируемые соединения добавлялись в перфузирующий раствор, и анализировалось подавление синаптических ответов, вызванных раздражением нерва. Для анализа действия блокаторов на глутаматные рецепторы моллюска выделялись нейроны висцерального и большого париетального ганглиев

А£1-СН1-М*Н1ЧСН1)>-М*Ме1

• —•—АМРА рецептор —о— ШРА рецептор

—А— рецептор моллюска —▼— рецептор насекомого

1000-

2 1002.

2 3 4 8 1 7

Рисунок 20. Зависимости блокирующей активности от длины межазотной цепи (число метиленовых групп, п) дикатионных производных адамантана. Для обоих препаратов беспозвоночных зависимость имеет минимум при п=5, что характерно для рецепторов позвоночных АМРА типа._

Полученные результаты представлены на рис. 20. Очевидно, что для обоих объектов ход зависимости активности от длины межазотной цепи в дикатионных производных адамантана совпадает с зависимостью, полученной на АМРА каналах позвоночных. В случае нейронов моллюска наблюдается хорошее количественное совпадение. Для нервно-мышечного соединения мухи полученные активности оказались ниже, чем для рецепторов позвоночных. Это можно объяснить как различиями в строении рецепторов,

так и особенностями препарата, вносящими систематическую ошибку в измеряемые величины. Однако, выраженный максимум активности при п=5 свидетельствует, что и рецепторы нейронов моллюска и рецепторы в нервно-мышечном соединении личинки мухи являются АМРА-подобными, то есть имеют пространственно разнесенные гидрофобный и нуклеофильный компоненты сайта связывания блокаторов (Магазаник и др. 2000). Кроме того, оба исследованных типа каналов беспозвоночных оказались нечувствительными к монокатионным блокаторам, что характерно для каналов АМРА-типа.

Следует отметить, что такой вывод был получен путем исследования действия всего шести соединений. Этого удалось достичь за счет детального предварительного анализа действия блокаторов на каналы позвоночных. Мы отобрали для сравнительного анализа те блокаторы, действие которых наиболее характерно и позволяет судить о пространственной геометрии каналов. В случае же бессистемного анализа, даже изучение действия больших рядов соединений не позволяет сделать однозначные выводы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Несмотря на отсутствие прямых структурных данных, наличие ряда блокаторов, обладающих простой структурой и однозначным механизмом действия, позволило в начале 90х годов установить принципиальное строение канала холинорецептора. Однако для более сложных соединений (таких как филантотоксины), обладающих к тому же комплексным действием на открытый и закрытый канал, установить места их связывания и закономерности блокирующего действия непосредственно из эксперимента оказалось невозможно. Для решения этой задачи потребовались модельные подходы. Молекулярные модели канала никотинового холинорецептора, разработанные для анализа связывания блокаторов, позволили выдвинуть и обосновать гипотезу о гидрофобной природе воротного механизма канала.

Строение и механизмы блокады каналов глутаматных рецепторов были к началу работы гораздо менее изучены, чем каналы никотиновых холинорецепторов. Серьезный набор активных блокаторов существовал только для каналов ММЭА типа. Детерминанты блокады каналов АМРА типа и механизмы селективного действия блокаторов известны не были. Таким образом, пришлось параллельно решать задачи по разработке самих

молекулярных проб и анализу с их помощью структуры каналов глутаматных рецепторов. Обе эти проблемы были успешно решены. На основании экспериментальных данных и модельных представлений разработаны принципы направленного дизайна блокаторов подтипов глутаматных каналов. Наряду с углублением фундаментальных научных знаний о строении, механизмах функционирования и путях регуляции работы ионных каналов, полученные выводы могут быть использованы при синтезе новых препаратов антиглутаматного действия для медицинской практики.

В данной работе модельные расчеты велись параллельно с классическими электрофизиологическими исследованиями, что нашло свое отражение в построении диссертационной работы. Новые экспериментальные данные немедленно учитывались при моделировании, так же как модельные результаты служили для разработки новых соединений и дизайна экспериментов. Результаты расчетов нигде не использовались как окончательное доказательство. Предсказания моделей всегда сопоставлялись с независимыми данными, и только совпадение служило основанием для представления модели в качестве научной гипотезы. Все модели строились с конкретными целями, для объяснения парадоксов, обнаруженных в экспериментах. За счет такого сочетания, в исследовании обоих объектов, никотинового холинорецептора и глутаматного рецептора, был достигнут существенный прогресс.

ВЫВОДЫ

2. Сайты связывания блокаторов открытого и закрытого канала находятся внутри поры канала, по разные стороны активационных ворот. Пространственная структура (размеры и форма) лигандов определяют глубину проникновения блокатора в канал никотинового холинорецептора, имеющий воронкообразную форму. Соединения, имеющие небольшые размеры или вытянутую форму, проникают глубоко и достигают сайта, соответствующего блокаде открытого канала. Более массивные соединения могут связываться только с сайтом блокады закрытого канала, расположенного в более широкой вестибюльной части канала.

3. В ионных каналах глутаматных рецепторов остатки, входящие в селективный фильтр, образуют цикл за счет формирования межсегментных водородных связей. При этом у остатков аспарагина (канал NMDA типа) атомы кислорода боковых цепей ориентированы в пору канала. Это обеспечивает связывание катионных групп блокаторов. У остатков глутамина (канал АМРА типа) ориентация атомов • кислорода боковых цепей инвертирована. За счет этого монокатионные блокаторы NMDA канала не блокируют АМРА канал.

4. Помимо основного сайта связывания в области селективного фильтра (N/0^ сайт) в NMDA канале существует дополнительный сайт связывания блокаторов, расположенный в вестибюле. Связывание блокаторов в этом сайте препятствует закрытию канала. Напротив, связывание блокаторов в основном сайте, расположенном более глубоко, не мешает закрытию канала и, следовательно, делает возможным накопление молекул блокатора в закрытых каналах (ловушка). Следовательно, выраженность эффекта ловушки зависит от соотношения сродства блокатора к двум сайтам связывания.

5. Для блокады АМРА канала необходимо наличие у молекулы блокатора гидрофобного ядра и удаленной аминогруппы. Гидрофобное ядро связывается с остатками глутамина в селективном фильтре, а аминогруппа проникает глубже в канал и связывается с дополнительным нуклеофильным кольцом. Это кольцо, связывающее терминальную группу блокаторов, образовано остатками глицина в положении +2 относительно селективного фильтра.

6. При блокаде глутаматных рецепторов в нервно-мышечном соединении личинки мухи и в изолированном нейроне брюхоного моллюска наблюдаются те же закономерности, что и при блокаде АМРА рецепторов позвоночных. Эти каналы блокируются только дикатионными соединениями, причем зависимость активности дикатионных производных от длины межазотной цепи имеет острый максимум при числе метиленовых групп в межазотной цепи равном пяти. Это свидетельствует о том, что исследованные рецепторы беспозвоночных, субъединичное строение которых неизвестно, имеют строение канала, близкое к строению канала АМРА рецептора позвоночных.

ПУБЛИКАЦИИ

1. Тихонов Д.Б., Потапьева Н.Н., Гмиро В.Е., Жоров Б.С., Магазаник Л.Г. (1996). Возможный механизм связывания блокаторов пентаметиленбисаммониевого ряда в ионном канале мышечного никотинового холинорецептора. Биологические мембраны 13:185-195.

2. Магазаник, Л.Г., Большаков, К.В., Булдакова, С.Л., Гмиро, В.Е., Дорофеева, Н.А., Лукомская, Н.Я., Потапьева, Н.Н., Самойлова, М.В., Тихонов, Д.Б., Федорова, И.М., Фролова, Е.В. (2000). Структурные особенности ионотропных глутаматных рецепторов, выявляемые блокадой каналов. Росс, физиол. журн. им. И.М. Сеченова 86:1138-1151.

3. Магазаник Л.Г., Тихонов Д.Б., Большаков, К.В., Гмиро, В.Е., Булдакова, С.Л., Самойлова, М.В. (2001). Исследование строения ионных каналов рецепторов глутамата и механизмов их блокады органическими катионами. Росс. Физиоч. Журнал. 87:1026-1039.

4. Магазаник Л.Г, Дорофеева НА Лаврентьева В.В, Потапьева Н.Н, Гмиро B.E, Самойлова M.B, Тихонов Д.Б, Фролова Е.В. (2001). Активация и блокада никотиновых холинорецепторов дикатионными производными адамантана. Биологические мембраны 19:14-23.

5. Brovtsyna NB," Tikhonov DB, Gorbunova OB, Gmiro VE, Serduk SE, Lukomskaya NY, Magazanik LG, Zhorov BS. (1996). Architecture of the neuronal nicotinic acetylcholine receptor ion channel at the binding site of bis-ammonium blockers. J Membr Biol 152:77-87.

6. Tikhonov DB, Zhorov BS. (1998). Kinked-helices model of the nicotinic acetylcholine receptor ion channel and its complexes with blockers: simulation by the Monte Carlo minimization method. Biophys J 74:242-255.

7. Tikhonov DB, Magazanik LG. (1998). Voltage dependence of open channel blockade: onset and offset rates. J Membr Biol 161:1-8.

8. Tikhonov DB, Zhorov BS, Magazanik LG. (1999). Intersegment hydrogen bonds as possible structural determinants of the N/Q/R site in glutamate receptors. Biophys J 77:1914-1926.

9. Tikhonov DB, Samoilova MV, Buldakova SL, Gmiro VE, Magazanik LG. (2000)ю Voltage-dependent block of native AMPA receptor channels by dicationic compounds. BrJ Pharmacol 129:265-274.

10.Bolshakov KV, Tikhonov DB, Gmiro VE, Magazanik L.G. (2000). Different arrangement of hydrophobic and nucleophilic components of channel binding sites in N-methyl-D-aspartate and AMPA receptors of rat brain is revealed by channel blockade. Neurosci Lett 291:101-104.

11. Buldakova SL, Bolshakov KV, Tikhonov DB, Magazanik LG. (2000). Ca2+-dependent desensitization ofAMPA receptors. Neuoreport 11:2937-2941.

12. Stromgaard K, Brier TJ, Andersen K, Mellor IR, Saghyan A, Tikhonov D, Usherwood PN, Krogsgaard-Larsen P, Jaroszewski JW. (2000). Solid-phase synthesis and biological evaluation of a combinatorial library ofphilanthotoxin analogues. J Med Chem 43:45264533.

13. Tikhonov DB, Magazanik LG, Mellor IR, Usherwood PN. (2000). Possible influence of intramolecular hydrogen bonds on the three-dimensional structure of polyamine amides and their interaction with ionotropic glutamate receptors. Receptors Channels 7:227-36.

14. Bolshakov KV, Essin KV, Buldakova SL, Dorofeeva NA, Skatchkov SN, Eaton MJ, Tikhonov DB, Magazanik LG. (2002). Characterisation of acid-sensitive ion channels in freshly isolated rat brain neurons. Neuroscience 110:723-730.

15. Weiss M, Tikhonov D, Buldakova S. (2002). Effect of flumazenil on gaba receptors in isolatedrathippocampal neurons.Neurochemicalresearch27:1597-1604.

16. Tikhonov DB, Magazanik LG, Mellor IR, Usherwood PN. (2002). Modeling ofthe pore domain of the GluRl channel: homology with K+ channel and binding of channel blockers.Biophys ./82:1884-1893.

17. Brier TJ, Mellor IR, Tikhonov DB, Neagoe I, Shao Z, Brierley MJ, Stromgaard K, Jaroszewski JW, Krogsgaard-Larsen P, Usherwood PN. (2003). Contrasting actions of philanthotoxin-343 and philanthotoxm-(12) on human muscle nicotinic acetylcholine receptors. MolPharmacol64:954-964.

18. Bolshakov KV, Gmiro VE, Tikhonov DB, Magazanik LG. (2003). Determinants of trapping block ofN-methyl-d-aspartate receptor channels. JNeurochem 87:56-65.

19. Zhorov BS and Tikhonov DB. (2004). Potassium, Sodium, Calcium, and Glutamate-Gated Channels: Pore Architecture and Ligand Action. JNeurochem 88:782-799.

20. Tikhonov DB, Mellor IR, Usherwood PN. (2004). Modelling non-competitive antagonism of a nicotinic acetylcholine receptor. Biop

Подписано в печать 28.04.2004. Формат 60x84/16. Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии ЗАО «КопиСервио. Печать ризографическая. Заказ № 1/2804. П. л. 2.5. Уч.-изд. 2.5. Тираж 100 экз.

ЗАО «КопиСервио, 194017, Санкт-Петербург, Скобелевский пр., д. 16

тел.: (812) 234 4333

P106 76

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Тихонов, Денис Борисович

Список сокращений ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Ионный канал никотинового холинорецептора

1.1.1 Общая структура рецептора

1.1.2 Неконкурентные ингибиторы холинорецепторов и строение ионного канала

1.1.3 Моделирование связывания блокаторов: излом каналообразующих спиралей

1.1.4 Проблема активации канала

1.2 Ионотропные рецепторы глутамата

1.2.1 К какому семейству принадлежат ионные каналы рецепторов глутамата?

1.2.2 Происхождение и молекулярная эволюция рецепторов глутамата

1.2.3 Подтипы и субъединицы глутаматных рецепторов

1.2.4 Рецепторы глутамата в норме и патологии

1.2.5 Строение узнающего участка глутаматных рецепторов и его лиганды

1.2.6 Рентгеновские структуры калиевых каналов

1.2.7 Ионные каналы глутаматных рецепторов и их блокаторы ЗАКЛЮЧЕНИЕ

2 МЕТОДИКА

2.1 Расчет энергетически оптимальных конформеров методами молекулярной механики

2.2 Гомологическое моделирование и системы ограничителей

2.3 Анализ лиганд-рецепторного взаимодействия

2.4 Программное обеспечение

2.5 Химико-фармакологический подход

2.6 Экспериментальный анализ действия блокаторов

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Ионный канал никотинового холинорецептора

3.1.1 Активация и блокада никотиновых холинорецепторов дикатионными производными адамантана

3.1.2 Блокада открытого и закрытого канала холинорецептора филантотоксинами

3.1.3 Пространственное строение филантотоксинов: внутримолекулярные водородные связи

3.1.4 Построение модели ионного канала никотинового холинорецептора

3.1.5 Моделирование связывания филантотоксинов: блокада открытого канала

3.1.6 Моделирование связывания филантотоксинов: блокада закрытого канала

3.1.7 Модель активации канала никотинового холинорецептора

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование строения и механизмов блокады ионных каналов никотиновых холинорецепторов и глутаматных рецепторов"

Актуальность проблемы. Каналообразующие белки, обеспечивающие пассивный транспорт ионов, являются важными компонентами клеточных мембран. Активность потенциалуправляемых натриевых и калиевых каналов обуславливает генерацию и распространение потенциала действия в нейронах. Синаптические ионные каналы, активируемые нейромедиаторами, необходимы для передачи возбуждающих и тормозных сигналов между нейронами. Многие модуляторы клеточного метаболизма также оказывают свое действие через ионные каналы. Поскольку каналообразующие белки являются трансмембранными, их внеклеточные участки и сама пора канала доступны для действия внеклеточных химических агентов, как естественных, так и искусственных. В то же время, представления о трехмерном строении, механизмах действия и путях модуляции ионных каналов продолжают оставаться достаточно фрагментарными, несмотря на большое число исследований. Одна из проблем состоит в том, что как и большинство мембранных белков, молекулы ионных каналов плохо поддаются кристаллизации. Это делает получение рентгеноструктурных данных проблематичным. До сих пор было кристаллизовано только несколько структур, в основном калиевых каналов прокариот. Эти работы, выполненные в лаборатории Р. МакКиннона в 1998 - 2003 годах, произвели своего рода структурную революцию в области изучения ионных каналов. За прошедшие шесть лет получили объяснение или были переосмыслены многие более ранние работы. В 2003 году Родерику МакКиннону была присуждена Нобелевская премия по химии.

Однако говорить о том, что проблема строения ионных каналов близка к разрешению, пока не приходится. Вследствие большого разнообразия семейства калиевых каналов, имеющийся ограниченный набор рентгеноструктурных данных не включает ряд подтипов с интересными структурными особенностями. Для натриевых и кальциевых каналов, а также для каналов, активируемых циклическими нуклеотидами и глутаматом, имеющиеся рентгеноструктурные данные могут служить лишь приблизительным шаблоном общей архитектуры канала, не объясняя ионной селективности и фармакологической чувствительности. Об атомарном строении каналов, активируемых ацетилхолином и ГАМК, мы по-прежнему можем судить только по косвенным данным.

Среди косвенных подходов одно из важнейших мест занимают методы молекулярной биологии. Исследования влияния точечных мутаций на свойства каналов позволяют выявлять функционально значимые аминокислоты. В настоящее время широко используется сканирующий мутагенез, предусматривающий последовательное мутирование аминокислот, входящих в исследуемый сегмент канала. Таким способом можно, например, выявить аминокислоты, доступные для водорастворимого реагента, и, следовательно, обращенные в просвет канала.

Важным источником информации о строении ионных каналов является анализ структурно-функциональных отношений в рядах низкомолекулярных органических лигандов. Поскольку пространственные структуры лигандов сравнительно легко предсказуемы, анализ их действия позволяет выявить важные элементы топографии канала, такие как стерические размеры отдельных участков и взаимное расположение функциональных групп.

Экспериментальные данные, полученные из разных источников и разными методами, могут быть объединены в рамках модели. Это позволяет более корректно интерпретировать экспериментальные данные и дает возможность более тонкого планирования новых исследований, например, выбора участков для направленного мутагенеза. При этом отклонение получаемых экспериментальных результатов от предсказанных свидетельствует о расхождении между использованным «шаблоном» или моделью и реальным объектом исследования. Анализ этих отклонений позволяет корректировать модель и, осуществляя новые экспериментальные подходы, получать более точные сведения об изучаемом ионном канале.

Таким образом, в настоящее время только комплексное исследование способно значительно углубить и развить существующие представления о строении и функционировании ионных каналов. Сочетание экспериментальных и теоретических подходов представляется особенно продуктивным. Простое накопление опытных данных без теоретического анализа в рамках молекулярных или кинетических моделей не сулит существенного прогресса. В то же время моделирование, не являющееся обобщением всего набора доступных данных, остается ограниченным и не способствует дальнейшему прогрессу в экспериментальных исследованиях. Если же экспериментальные и теоретические подходы используются параллельно, в рамках единого проекта, их взаимодействие происходит непрерывно, и модельно-теоретическая работа (эксперимент т бШсо) становится непосредственным продолжением классических экспериментов, а подчас и исходным пунктом для планирования новых экспериментов и подходов. Именно такое сочетание различных методик было использовано в данной работе для изучения двух важнейших типов ионных каналов, образуемых синаптическими рецепторами глутамата и ацетилхолина.

Цели и задачи исследования. Фундаментальной научной проблемой, решавшейся в рамках данной работы, было создание и применение комплексного подхода к исследованию строения ионных каналов и их взаимодействия с каналоблокаторами. Относительная простота и предсказуемость пространственной структуры низкомолекулярных лигандов делает их эффективными молекулярными пробами структуры каналов. Особенно важно то, что структурно-функциональные исследования в рядах блокаторов позволяют получить количественные оценки элементов топографии участков их связывания. Суть разрабатываемого подхода заключается в том, что для изучения конкретных особенностей строения каналов синтезировались специально разработанные гомологические ряды соединений, и полученные данные использовались для построения молекулярных моделей. Выбор ионотропных рецепторов ацетилхолина и глутамата в качестве обьектов исследования был обусловлен тем, что они формируют катион-селективные каналы, которые демонстрируют сходные физиологические и фармакологические характеристики при принципиально разной структурной организации.

В рамках работы решались следующие конкретные задачи:

1. Исследовать механизмы биологического действия неконкурентных ингибиторов никотиновых холинорецепторов — филантотоксинов и дикатионных соединений.

Научная новизна. В результате проведенных физиологических, фармакологических и модельных исследований определены места и характер связывания блокаторов ионных каналов никотинового холинорецептора и ионотропных глутаматных рецепторов. Созданы и протестированы молекулярные модели каналов, позволяющие теоретически предсказывать характер действия потенциальных блокаторов.

Предложена модель активации канала холинорецептора, в которой конформационный переход между открытым и закрытым состояниями происходит за счет локальной перестройки в гибком участке излома каналообразующих сегментов. При этом полного стерического перекрывания просвета канала в закрытом состоянии не наблюдается, а энергетический барьер для токонесущих ионов имеет гидрофобную природу (Tikhonov and Zhorov, 1998 Tikhonov et al., 2004a).

Впервые было дано объяснение различию диаметров каналов NMDA и АМРА подтипов глутаматных рецепторов, а также слабой чувствительности АМРА каналов к активным блокаторам NMDA каналов (Tikhonov et al., 1999; 2002).

Разработаны принципы теоретического дизайна блокаторов АМРА каналов. Созданы серии соединений, варьирующих по активности и избирательности действия на

NN10 А и АМРА каналы. Таким образом, решена проблема отсутствия фармакологических препаратов неконкурентного действия для избирательного подавления АМРА рецепторов (Магазаник и др., 2000; 2001; ТМюпоу е1 а1., 2000Ь; ВоЫшкоу а а1., 2000).

Впервые было показано, что эффект «ловушки» блокаторов в ИМЭА каналах определяется не их стерическими размерами, а соотношением сродства к двум различным местам связывания (ВокЬакоу е! а!., 2002).

Научно-практическая значимость работы. Ряд патологических состояний ЦНС сопровождается нарушением синаптической передачи. Поскольку большинство возбуждающих синапсов ЦНС позвоночных являются глутаматергическими, избирательные модуляторы разных подтипов глутаматных рецепторов являются потенциально ценными терапевтическими агентами. Развитие представлений о детерминантах селективного действия блокаторов способствует прогрессу в создании новых лекарственных средств. Наличие эффекта «ловушки», т.е. способности блокатора оставаться в канале после его закрытия, определяет кинетику действия. Блокаторы, для которых этот эффект ярко выражен, демонстрируют медленную кинетику, и их использование приводит в ряде случаев к негативным побочным эффектам. Полученные результаты о молекулярном механизме «ловушки» представляются ценными для разработки препаратов антиглутаматного действия, имеющих минимальное побочное действие. Избирательно действующие блокаторы часто применяются в физиологических экспериментах для выделения отдельных компонентов ответов на раздражение. Можно полагать, что разработанные серии блокаторов будут использоваться в новых научных экспериментах. Разработанные структуры блокаторов, а таже принципы направленного синтеза блокаторов с заданной активностью, селективностью и кинетикой действия, могут оказаться перспективными с точки зрения использования в медицинской практике для терапии патологических состояний ЦНС, связанных с нарушением баланса глутаматергической передачи. Результаты исследований включены в курсы лекций по нейрофизиологии в Санкт-Петербургском Государственном Университете и в Санкт-Петербургском Государственном Техническом Университете.

Положения, выносимые на защиту:

1. В никотиновом холинорецепторе эффекторная часть воротного механизма расположена в средней части ионного канала. Управление проницаемостью канала осуществляется за счет гидрофобного, а не стерического механизма. Сайты связывания блокаторов открытого и закрытого канала расположены в канале по обе стороны воротного механизма.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на ряде научных конференций, в том числе: XXXIII международном конгрессе по физиологии (Санкт-Петербург, 1997); съездах международного общества нейрохимии (Санкт-Петербург, 1998; Берлин, 1999; Буэнос-Айрес, 2001); съездах международного общества нейронаук (Новый Орлеан, 2000; Сан-Диего, 2001); симпозиумах Британского общества физиологии (Лондон, 2001; 2002; Кембридж, 2003); II съезде биофизиков России (Москва, 1999); XVIII съезде физиологического общества им. И.П.Павлова (Казань, 2001); XII международном совещании по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2001). В 2003 году по приглашению оргкомитета съезда Британского общества токсикологии был сделан пленарный доклад о моделировании связывания лигандов в ионных каналах. Серии работ по экспериментальному и модельному исследованию строения ионных каналов холинорецепторов и глутаматных рецепторов была присуждена медаль РАН для молодых ученых 2000г.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 166 стр., состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, двух глав результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 224 источников. Работа иллюстрирована 66 рисунками и 6 таблицами.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Тихонов, Денис Борисович

1. Активация канала холинорецептора происходит за счет конформационной перестройки в гибком участке излома М2 спиралей. В открытом канале на участке излома расположено кислородное кольцо, способствующее дегидратации ионов и связыванию блокаторов. В закрытом канале в просвет экспонируются гидрофобные остатки лейцина, экранирующие кислородное кольцо. При этом полного перекрывания просвета канала не происходит Таким образом, активационные ворота ионного канала холинорецептора имеют гидрофобную, а не стерическую природу.2. Сайты связывания блокаторов открытого и закрытого канала находятся внутри поры канала, по разные стороны активационных ворот. Их близкое расположение обеспечивает конкуренцию между блокаторами открытого и закрытого состояния. Пространственная структура (размеры и форма) лигандов определяют глубину их проникновения блокатора в канал никотинового холинорецептора, имеющий воронкообразную форму.Соединения, имеющие небольшые размеры или вытянутую форму, проникают глубоко и достигают сайта, соответствующего блокаде открытого канала.Более массивные соединения могут связываться только с сайтом блокады закрытого канала, расположенного в более широкой вестибюльной части канала.3. В ионных каналах глутаматных рецепторов остатки, входящие в селективный фильтр, образуют цикл за счет формирования межсегментных водородных связей. При этом у остатков аспарагина (канал NMDA типа) атомы кислорода боковых цепей ориентированы в пору канала. Это обеспечивает связывание катионных групп блокаторов. У остатков глутамина (канал АМРА типа) ориентация атомов кислорода боковых цепей инвертирована. За счет этого монокатионные блокаторы NMDA канала не блокируют АМРА канал.4. Для блокады АМРА канала необходимо наличие у молекулы блокатора гидрофобного ядра и удаленной аминогруппы. Гидрофобное ядро связывается с остатками глутамина в селективном фильтре, а аминогруппа проникает глубже в канал и связывается с дополнительным нуклеофильным кольцом. Это кольцо, связывающее терминальную группу блокаторов, образовано остатками глицина в положении +2 относительно селективного фильтра.5. Помимо основного сайта связывания в области селективного фильтра (N/Q/R

сайт) в NMDA канале существует дополнительный сайт связывания блокаторов, расположенный в вестибюле. Связывание блокаторов в этом сайте препятствует закрытию канала. Напротив, связывание блокаторов в основном сайте, расположенном более глубоко, не мешает закрытию канала и, следовательно, делает возможным накопление молекул блокатора в закрытых каналах (ловушка). Следовательно, выраженность эффекта ловушки зависит от соотношения сродства блокатора к двум сайтам связывания.6. При блокаде глутаматных рецепторов в нервно-мышечном соединении личинки мухи и в изолированном нейроне брюхоного моллюска наблюдаются те же закономерности, что и при блокаде АМРА рецепторов позвоночных. Эти каналы блокируются только дикатионными соединениями, причем зависимость активности дикатионных производных от длины межазотной цепи имеет острый максимум при числе метиленовых групп в межазотной цепи равном пяти. Это свидетельствует о том, что исследованные рецепторы беспозвоночных, субъединичное строение которых неизвестно, имеют строение канапа, близкое к строению канала АМРА рецептора позвоночных.ПУБЛИКАЦИИ

1. Тихонов Д.Б., Потапьева Н.Н., Гмиро В.Е., Жоров B.C., Магазаник Л.Г. 1996.Возможный механизм связывания блокаторов пентаметиленбисаммониевого ряда в ионном канале мышечного никотинового холинорецептора.Биологические мембраны, 13:185-195.2. Магазаник, Л.Г., Большаков, К.В., Булдакова, Л., Гмиро, В.Е., Дорофеева, Н.А., Лукомская, Н.Я., Потапьева, Н.Н., Самойлова, М.В., Тихонов, Д.Б., Федорова, И.М., Фролова, Е.В. 2000. Структурные особенности ионотропных глутаматных рецепторов, выявляемые блокадой каналов. Росс, физиол. журн.им. КМ. Сеченова^: 1138-1151.3. Магазаник Л.Г., Тихонов Д.Б., Большаков, К.В., Гмиро, В.Е., Булдакова, Л., Самойлова, М.В. 2001. Исследование строения ионных каналов рецепторов глутамата и механизмов их блокады органическими катионами. Росс. Физиол.Журнал. 87:1026-1039.4. Магазаник Л.Г., Дорофеева Н.А., Лаврентьева В.В., Потапьева Н.Н., Гмиро В.Е., Самойлова М.В., Тихонов Д.Б., Фролова Е.В. 2001. Активация и блокада никотиновых холинорецепторов дикатионными производными адамантана.Биологические мембраны 19:14-23.5. Brovtsyna N.B., Tikhonov D.B., Gorbmiova О.В., Gmiro V.E., Serduk S.E., Lukomskaya N.Y., Magazanik L.G., Zhorov B.S. 1996. Architecture of the пеш^опа! nicotinic acetylcholine receptor ion channel at the binding site of bis-ammonimn blockers. JMembr Biol 152:77-87.6. Tikhonov D.B., Zhorov B.S. 1998. Kinked-helices model of the nicotinic acetylcholine receptor ion channel and its complexes with blockers: simulation by the Monte Carlo minimization method. Biophys J. 74:242-255.7. Tikhonov D.B., Magazanik L.G. 1998. Vohage dependence of open channel blockade: onset and offset rates. JMembr Biol. 161:1-8.8. Tikhonov D.B., Zhorov B.S., Magazanik L.G. 1999. Intersegment hydrogen bonds as possible structural determinants of the N/Q/R site in glutamate receptors. Biophys J.77:1914-1926.9. Tikhonov D.B., Samoilova M.V., Buldakova S.L., Gmiro V.E., Magazanik L.G.2000. Voltage-dependent block of native AMPA receptor channels by dicationic compounds. Br J Pharmacol. 129:265-274.10. Bolshakov K.V., Tikhonov D.B., Gmiro V.E., Magazanik L.G. 2000. Different arrangement of hydrophobic and nucleophilic components of channel binding sites in N-methyl-D-aspartate and AMPA receptors of rat brain is revealed by channel blockade. Neurosci Lett. 291:101-104.11. Buldakova S.L., Bokhakov K.V., Tikhonov D.B., Magazanik L.G. 2000. Ca2+-

dependent desensitization of AMPA receptors. Neuroreport. 11:2937-2941.12. Stromgaard K., Brier T.J., Andersen K., Mellor I.R., Saghyan A., Tikhonov D., Usherwood P.N., ICrogsgaard-Larsen P., Jaroszewski J.W. 2000. Solid-phase synthesis and biological evaluation of a combinatorial library of philanthotoxin analogues. J Med Chem. 43:4526-4533.13. Tikhonov D.B., Magazanik L.G., Mellor I.R., Usherwood P.N. 2000. Possible influence of intramolecular hydrogen bonds on the three-dimensional structure of polyamine amides and their interaction with ionotropic glutamate receptors.Receptors Channels. 7:227-36.14. Bolshakov K.V., Essin K.V., Buldakova S.L., Dorofeeva N.A., Skatchkov S.N., Eaton M.J., Tikhonov D.B., Magazanik L.G. 2002. Characterisation of acid-sensitive ion channels in freshly isolated rat brain neurons. Neuroscience. 110:723-730.15. Weiss M., Tikhonov D., Buldakova S. 2002. Effect of flumazenil on gaba receptors in isolated rat hippocampal neurons. Neurochemical research 27:1597-1604.16. Tikhonov D.B., Magazanik L.G., Mellor I.R., Usherwood P.N. 2002. Modeling of the pore domain of the GluRl channel: homology with K+ channel and binding of channel blockers. BiophysJ. 82:1884-1893.17. Brier T.J., Mellor I.R., Tikhonov D.B., Neagoe I., Shao Z., Brierley M.J., Stromgaard K., Jaroszewski J.W., bCrogsgaard-Larsen P., Usherwood P.N. 2003.Contrasting actions of philanthotoxin-343 and philanthotoxin-(12) on human muscle nicotinic acetylcholine receptors. Mol Pharmacol. 64:954-964.18. Bolshakov K.V., Gmiro V.E., Tikhonov D.B., Magazanik L.G. 2003. Determinants of trapping block of N-methyl-d-aspartate receptor channels. J Neurochem. 87:56-

19. Zhorov B.S., Tikhonov D.B. 2004. Potassium, Sodium, Calcium, and Glutamate-

Gated Channels: Pore Architecture and Ligand Action. J Neurochem. 88:782-799

20. Tikhonov D.B., Mellor I.R., Usherwood P.N. 2004. Modelling non-competitive antagonism of a nicotinic acetylcholine receptor. Biophys J. (In press)

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Тихонов, Денис Борисович, Санкт-Петербург

1. Большаков, К.В., Булдакова, Л. 1999. Фармакологический анализ субъединичного состава в АМПА-рецепторов в нейронах гиппокампа. Росс, физиол. о/сурн. им. И.М. Сеченова. 85(12),1480-1488.

2. Кошелев, Г., Ходоров, Б.И. 1992. Тетраэтиламмоний и тетрабутиламмоний как инструменты исследования NMDA-каналов нейрональной мембраны. Росс, физиол. окурн. им. И.М. Сеченова. 29(8), 1064-1068.

3. Лукомская, Н.Я., Гмиро, В.Е. 1982. Гангиоблокирующее действие несимметричных бис-катионных соединений. Докл. АН СССР. 265(3), 743-747.

4. Магазаник Л.Г., Антонов СМ., Гмиро В.Е. 1984. Механизмы активации и блокирования постсинаптической мембраны, чувствительной к глутамату. Биол. мембраны. 1(2), 130-140.

5. Магазаник, Л.Г., Антонов, СМ., Федорова, И.М., Волкова Т.М., Гришин Е.В. 1986. Действие яда паука Argiope Lobata и его низкомолекулярного компонента - аргиопина на постсинаптические мембраны. Биологические мембраны. 3(12), 1204-1219.

6. Магазаник, Л.Г., Антонов, СМ., Большаков, В.Ю., Федорова, И.М. 1991. Применение нейротоксинов их яда пауков для исследования механизмов глутаматергической передачи. Росс, физиол. окурн. им. И.М. Сеченова 27(5), 632-639.

7. Магазаник, Л.Г., Антонов, СМ., Лукомская, Н.Я., Потапьева, Н.Н., Гмиро, В.Е., Джонсон, Я. 1994. Блокада глутамат- и холинергических ионных каналов производными адамантана. Росс, физиол. окурн. им. И.М. Сеченова 80(1), 99-112.

8. Магазаник, Л.Г. 1998. Блокада ионного канала как подход к исследованию подтипов АМПА-рецепторов. Росс, физиол. оюурн. им. И.М. Сеченова 84(10), 994-1005.

9. Самойлова М.В., Фролова Е.В., Магазаник Л.Г. 1997. Глутаматные рецепторы, управляющие катионными каналами в мембране нейронов брюхоного моллюска Planorbarius corneus. Журн. эволюц. биохимии и физиологии. 33(3), 331-345.

10. Скок В.И., Селянко А.А, Деркач В.А. 1987. Нейрональные холинорецепторы. Москва, Наука, 343стр.

11. Уткин Ю.Н., Цетлин В.И., Хухо Ф. 1999. Структурная организация никотиновых холинергических рецепторов. Биололгические мембраны. 16(2), 118-135.

12. Adams, P.R. (1976) Drug blockade of open end-plate channels. J Physiol, 260, 531- 52.

13. Adams, P.R. and Feltz, A. (1980) Quinacrine (mepacnne) action at fi-og end-plate. J РЛуло/, 306,261-81.

14. Akabas, M.H., Kaufinann, C , Archdeacon, P. and Karlin, A. (1994) Identification of acetylcholine receptor channel-lining residues in the entire M2 segment of the alpha subunit. Neuron, 13,919-27.

15. Akabas, M.H. and Karlin, A. (1995) Identification of acetylcholine receptor channel- lining residues in the Ml segment of the alpha-subunit. Biochemistry, 34,12496-500.

16. Albuquerque, E.X., Tsai, M.C, Aronstam, R.S., Witkop, В., Eldefirawi, A.T, and Eldefrawi, M.E. (1980) Phencyclidine interactions with the ionic channel of the acetylcholine receptor and electrogenic membrane. Proc Natl Acad Sci USA, 77, 1224-8.

17. Amador, M. and Dani, J.A. (1991) MK-801 inhibition of nicotinic acetylcholine receptor channels. Synapse, 7,207-15.

18. Anand, R., Conroy, W.G., Schoepfer, R., Whiting, P. and Lindstrom, J. (1991) Neuronal nicotinic acetylcholine receptors expressed tn Xenopus oocytes have a pentameric quaternary structure. J Biol Chem., 266,11192-8.

19. Anis, N.A., Berry, S.C, Burton, N.R. and Lodge, D. (1983) The dissociative anaesthetics, ketamine and phencyclidine, selectively reduce excitation of central mammalian neurones by N-methyl-aspartate. Brit J Pharmacol, 79, 565-75.

20. Antonov, S.M., Johnson, J.W., Lukomskaya, N.Y., Potapyeva, N.N., Gmiro, V.E. and Magazanik, L.G. (1995) Novel adamantane derivatives act as blockers of open Hgand-gated channels and as anticonvulsants. Mol Pharmacol, 47, 558-67.

21. Antonov, S.M. and Johnson, J.W. (1996) Voltage-dependent interaction of open- channel blocking molecules with gating of NMDA receptors in rat cortical neurons. J Physiol, 493,425-45.

22. Antonov, S.M., Gmiro, V.E. and Johnson, J.W. (1998) Binding sites for permeant ions in the channel of NMDA receptors and their effects on channel block. Nature Neuroscience, 1,451-61.

23. Armstrong, CM. (1972) The inner quaternary ammonium ion receptor in potassium channels of the node of Ranvier. У Gew Physiol, 60, 588-608.

24. Armstrong, N., Sun, Y., Chen, G.Q. and Gouaux, E. (1998) Structure of a glutamate- receptor ligand-binding core in complex with kainate. Nature, 395, 913-7.

25. Armstrong, N. and Gouaux, E. (2000) Mechanisms for activation and antagonism of an AMPA-sensitive glutamate receptor: crystal structures of the GluR2 ligand binding core. Neuron, 28,165-81.

26. Ascher, P., Marty, A. and Neild, Т.О. (1978) The mode of action of antagonists of the excitatory response to acetylcholine in Aplysia neurones. J Physiol, 278,207-35.

27. Augspurger, J.D. and Scheraga, H.A. (1996) An efScient, differentiable hydration potential for peptides and proteins. J Со/ирм/ Chem, 17,1549-58.

28. Bahring, R., Bowie, D., Benveniste, M. and Mayer, M.L. (1997) Permeation and block of rat GluR6 glutamate receptor channels by internal and external polyamines. J Physiol, 502, 575-89.

29. Beck, C, Wollmuth, L.P., Seeburg, P.H., Sakmann, B. and Kuner, T. (1999) NMDAR channel segments forming the extracellular vestibule inferred from the accessibility of substituted cysteines. Neuron, 22, 559-70.

30. Beckstein, O., Biggin, P.C, Bond, P., Bright, J.N., Domene, C , Grottesi, A., Holyoake, J. and Sansom, M.S. (2003) Ion channel gating: insights via molecular simulations. FEBS Letters, 555, 85-90.

31. Bennett, J.A. and Dingledine, R. (1995) Topology profile for a glutamate receptor: three transmembrane domains and a channel-lining reentrant membrane loop. Neuron, 14,373-84.

32. Benoit, P. and Changeux, J.P. (1993) Voltage dependencies of the effects of chlorpromazine on the nicotinic receptor channel from mouse muscle cell line So 18. Neuroscience Letters, 160, 81-4.

33. Benveniste, M. and Mayer, M.L. (1995) Trapping of glutamate and glycine during open channel block of rat hippocampal neuron NMDA receptors by 9-aminoacridine. J Physiol, 483,367-84.

34. Bixel, M.G,, Krauss, M., Weise, C , Bolognesi, M.L., Rosini, M., Usherwood, P.N,, Melchiorre, С and Hucho, F. (2001) Location of the polyamine binding site in the vestibule of the nicotinic acetylcholine receptor ion channel. Farmaco, 56,133-5.

35. Blanpied, T.A., Boeckman, F.A., Aizenman, E. and Johnson, J.W. (1997) Trapping channel block of NMDA-activated responses by amantadine and memantine. J Neurophysiol, 77,309-23.

36. Bormann, J, (1989) Memantine is a potent blocker of N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor channels. Eur J Pharmacol, 166, 591-2.

37. Bowie, D. and Mayer, M.L. (1995) Inward rectification of both AMP A and kainate subtype glutamate receptors generated by polyamine-mediated ion channel block. Neuron, 15,453-62.

38. Brackley, P.T., Bell, D.R., Choi, S.IC, Nakanishi, K. and Usherwood, P.N. (1993) Selective antagonism of native and cloned kainate and NMDA receptors by polyamine-containing toxins JPharm Exp Ther, 266,1573-80.

39. Brooks, C.L., Pettitt, B.M. and Karplus, M. (1985) Structural and energetic effects of truncating long ranged interactions in ionic polar fluids. J CAew Phys, 83, 5897-908.

40. Brose, N., Gasic, G.P., Vetter, D.E., Sullivan, J.M. and Heinemann, S.F. (1993) Protein chemical characterization and immunocytochemical localization of the NMDA receptor subunit NMDA KX.JBiol Chem, 268, 22663-71.

41. Buisson, B. and Bertrand, D. (1998) Open-channel blockers at the human alpha4beta2 neuronal nicotinic acetylcholine receptor. Mol Pharmacol, 53, 555-63.

42. Bumashev, N., Sakmann, B. and Seeburg, P.H. (1992) Divalent ion permeability of AMPA receptor channels is dominated by the edited form of a single subunit. Neuron, 8,775-85.

43. Bumashev, N., Zhou, 2., Neher, E. and Sakmann, B. (1995) Fractional calcium currents through recombinant GluR channels of the NMDA, AMPA and kainate receptor subtypes. J Physiol, 485, 403-18.

44. Bumashev, N., ViUarroel, A. and Sakmann, B. (1996) Dimensions and ion selectivity of recombinant AMPA and kainate receptor channels and their dependence on Q/R site residues. J Physiol, 496,165-73.

45. Chamet, P., Labarca, C , Leonard, R.J., Vogelaar, N.J., Czyzyk, L., Gouin, A., Davidson, N. and Lester, H.A. (1990) An open-channel blocker interacts with adjacent turns of alpha-helices in the nicotinic acetylcholine receptor. Neuron, 4, 87-95.

46. Chen, H.S. and Lipton, S.A. (1997) Mechanism of memantine block of NMDA- activated channels in rat retinal ganglion cells: uncompetitive antagonism. J Physiol, 499,27-46.

47. Chen, G.Q., Cui, C , Mayer, M.L. and Gouaux, E. (1999) Functional characterization of a potassium-selective prokaryotic glutamate receptor. Nature, 402, 817-21.

48. Costa, A.C. and Albuquerque, E.X. (1994) Dynamics of the actions of tetrahydro-9- aminoacridine and 9-aminoacridine on glutamatergic currents: concentration-jump studies in cultured rat hippocampal neurons. J Pharm Exp Ther, 268,503-14.

49. Dingledine, R., Borges, K., Bowie, D. and Traynelis, S.F. (1999) The glutamate receptor ion channels. Pharmacological Reviews, 51, 7-61.

50. DiPaola, М., Као, P.N. and ICarlin, A. (1990) Mapping the alpha-subimit site photolabeled by the noncompetitive inhibitor 3H.quinacrine azide in the active state of the nicotinic acetylcholine receptor. J Biol Chem, 265,11017-29.

51. Donevan, S.D. and Rogawski, M.A. (1995) Intracellular polyamines mediate inward rectification of Ca(2+)-permeable alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors. Proc Natl Acad Sci USA, 92, 9298-302.

52. Doyle, D.A., Morals Cabral, J., Pfixetzner, R.A., Kuo, A., Gulbis, J.M., Cohen, S.L., Chait, B.T. and MacKinnon, R. (1998) The structure of the potassium channel: molecular basis of K+ conduction and selectivity. Science, 280, 69-77.

53. Dudel, J., Franke, С and Hatt, H. (1990) Rapid activation, desensitization, and resensitization of synaptic channels of crayfish muscle after glutamate pulses. Biophys J, 57, 533-45.

54. Dwyer, T.M., Adams, D.J. and Hille, B. (1980) The permeability of the endplate channel to organic cations in frog muscle. J Gen Physiol, 75,469-92.

55. Eldefi"awi, A.T., Eldefi-awi, M.E., Konno, K., Mansour, N.A., Nakanishi, K., Oltz, E. and Usherwood, P.N. (1988) Structure and synthesis of a potent glutamate receptor antagonist in wasp venom. Proc Natl Acad Sci USA, 85,4910-3.

56. Ferrer-Montiel, A.V. and Montal, M. (1993) A negative charge in the M2 transmembrane segment of the neuronal alpha 7 acetylcholine receptor increases permeability to divalent cations. FEBS Letters, 324,185-90.

57. Ferrer-Montiel, A.V. and Montal, M. (1996) Pentameric subunit stoichiometry of a neuronal glutamate receptor. Proc Natl Acad Sci USA, 93, 2741-4.

58. Ferrer-MontieL, A.V., Merino, J.M., Planells-Cases, R., Sun, W. and Montal, M. (1998) Structural determinants of the blocker binding site in glutamate and NMD A receptor channels. Neuropharmacology, 37,139-47.

59. Filatov, G.N. and White, M.M. (1995) The role of conserved leucines in the M2 domain of the acetylcholine receptor in channel gating. Mol Pharmacol, 48, 379-84.

60. Furois-Corbin, S. and Pullman, A. (1989) A possible model for the inner wall of the acetylcholine receptor channel. BBA, 984, 339-50.

61. Gallagher, M.J. and Cohen, J.B. (1999) Identification of amino acids of the torpedo nicotinic acetylcholine receptor contributing to the binding site for the noncompetitive antagonist (3)H.tetracaine. Mol Pharmacol, 56, 300-7.

62. Galzi, J.L., Devillers-Thiery, A., Hussy, N., Bertrand, S., Changeux, J.P. and Bertrand, D. (1992) Mutations in the channel domain of a neuronal nicotinic receptor convert ion selectivity fi-om cationic to anionic. Nature, 359, 500-5.

63. Geiger, J,R., Jonas, P. and Sakmann, B. (1995) Relative abundance of subunit mRNAs determines gating and Ca2+ permeability of AMPA receptors in principal neurons and intemeurons in rat CNS. J Physiol, 485, 383-402.

64. Go, N. and Scheraga, H.A. (1970) Ring closure and local conformational deformations of chain molecules. Macromolecules, 3,178-87.

65. Guenot, J. and Kollman, P.A. (1992) Molecular dynamics studies of a DNA-binding protein: 2. An evaluation of implicit and explicit solvent models for the molecular dynamics simulation of the Escherichia coli trp repressor. Protein Sci, 1,1185-205.

66. Guenot, J. and Kollman, P.A. (1993) Conformational and Energetic Effects of Truncating Nonbonded Interactions in an Aqueous Protein Dynamics Simulation. J Comp Chem, 14,296-311.

67. Hollmann, M., Maron, С and Heinemann, S. (1994) N-glycosylation site tagging suggests a three transmembrane domain topology for the glutamate receptor GluRl. Neuron, 13,1331-43.

68. Hopfinger, A.J. and Battershell, R.D. (1976) Application of SCAP to drug design. Prediction of octanol-water partition coefficients using solvent-dependent conformational analyses. J Med Chem, 19, 569-73.

69. Hsiao, CD., Sun, Y.J., Rose, J., Cottam, P.P. and Wang, B.C. (1994) Crystals of glutamine-binding protein in various conformational states. JMol Biol, 240, 87-91.

70. Hucho, P., Oberthur, W. and Lottspeich, P. (1986) The ion channel of the nicotinic acetylcholine receptor is formed by the homologous helices M II of the receptor subunits. FEBS Letters, 205,137-42.

71. Hucho, P. and Hilgenfeld, R. (1989) The selectivity filter of a ligand-gated ion channel. The helix-M2 model of the ion channel of the nicotinic acetylcholine receptor. FEBS Letters, 257,17-23.

72. Huettner, J.E. and Bean, B.P. (1988) Block of N-methyl-D-aspartate-activated current by the anticonvulsant MK-801: selective binding to open channels. Proc Natl Acad Sci US A, 85, 1307-U.

73. Hutton, M.L., Harvey, R.J., Barnard, E.A. and Darlison, M.G. (1991) Cloning of a cDNA that encodes an invertebrate glutamate receptor subunit. FEBS Letters, 292, 111-4.

74. Isa, Т., lino, M., Itazawa, S. and Ozawa, S. (1995) Spermine mediates inward rectification of Ca(2+)-permeable AMPA receptor channels. Neuroreport, 6,2045-8.

75. Jackson, H. and Usherwood, P.N. (1988) Spider toxins as tools for dissecting elements of excitatory amino acid transmission. Trends Newosci, 11,27-83.

76. Jatzke, С , Hernandez, М. and Wollmuth, L.P. (2003) Extracellular vestibule determinants of Ca2+ influx in Ca2+-permeable AMPA receptor channels. J Physiol, 549,439-52.

77. Jiang, Y., Lee, A, Chen, J., Cadene, M., Chait, B.T. and MacKinnon, R, (2002) The open pore conformation of potassium channels. Nature, 417, 523-6.

78. Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., Cadene, M., Chait, B.T. and MacKinnon, R. (2002) Crystal structure and mechanism of a calcium-gated potassium channel. Nature, 417, 515-22.

79. Jiang, Y., Ruta, V., Chen, J., Lee. A and MacKinnon, R. (2003) The principle of gating charge movement in a voltage-dependent K+ channel. Nature, 423, 42-8.

80. Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., Ruta, V., Cadene, M., Chait, B.T. and MacKinnon, R. (2003) X-ray structure of a voltage-dependent K+ channel. Nature, 423.

81. Johansen, T.N., Frydenvang, K., Ebert, В., Krogsgaard-Larsen, P. and Madsen, U. (1994) Synthesis and structure-activity studies on acidic amino acids and related diacids as NMDA receptor ligands. J Med Chem., Ъ1,3252-62.

82. Johnson, J.W. and Ascher, P. (1987) Glycine potentiates the NMDA response in cuhured mouse brain neurons. Nature, 325, 529-31.

83. Jones, K.S., VanDongen, H.M. and VanDongen, A.M. (2002) The NMDA receptor M3 segment is a conserved transduction element coupling ligand binding to channel opening. JNeurosci, 22,2044-53.

84. Kamboj, S.K., Swanson, G.T. and Cull-Candy, S.G. (1995) Intracellular spermine confers rectification on rat calcium-permeable AMPA and kainate receptors. J Physiol, 486,297-303.

85. Koh, D.S., Bumashev, N. and Jonas, P. (1995) Block of native Ca(2+)-permeable AMPA receptors in rat brain by intracellular polyamines generates double rectification. J Physiol, 486, 305-12.

86. Koh, D.S., Geiger, G.S.P., Jonas, P. and Sakmann, B. (1995) Ca(2+)-permeable AMPA and NMDA receptor channels in basket cells of rat hippocampal dentate gyrus. J Physiol, 485, 383-402.

87. Kohda, K., Wang, Y. and Yuzaki, M. (2000) Mutation of a glutamate receptor motif reveals its role in gating and delta2 receptor channel properties. Nature Neuroscience, 3,315-22.

88. Konno, Т., Nakai, J., Wang, F., Mishina, M. and Numa, S. (1991) Rings of anionic amino acids as structural determinants of ion selectivity in the acetylcholine receptor channel. FEBS Letters, 289, 193-200.

89. Kreienkamp, H.J., Maeda, R.K., Sine, S.M. and Taylor, P. (1995) Intersubunit contacts governing assembly of the mammalian nicotinic acetylcholine receptor. Neuron, 14, 635-44.

90. Kuner, Т., Wollmuth, L.P., Karlin, A., Seeburg, P.H. and Sakmann, B. (1996) Structure of the NMDA receptor channel M2 segment inferred fi-om the accessibility of substituted cysteines. Neuron, 17, 343-52.

91. Kuner, Т., Beck, C, Sakmann, B. and Seeburg, P.H. (2001) Channel-lining residues of the AMPA receptor M2 segment: structural environment of the Q/R site and identification of the selectivity filter. JNeurosci, 21,4162-72.

92. Kuner, Т., Seeburg, P.H. and Guy, H.R. (2003) A common architecture for K+ channels and ionotropic glutamate receptors? Trends Neurosci, 26,27-32.

93. Kuo, A., Gulbis, J.M., Antcliflf, J.F., Raham, Т., Lowe, E.D., Zimmer, J., Cuthbertson, J., Ashcroft, P.M., Ezaki, T. and Doyle, D.A. (2003) Crystal structure of the potassium channel KirBacl.l in the closed state. Science, 300, 1922-6.

94. Labarca, C , Nowak, M.W., Zhang, H., Tang, L., Deshpande, P. and Lester, H.A. (1995) Channel gating governed symmetrically by conserved leucine residues in the M2 domain of nicotinic receptors. Nature, 376, 514-6.

95. Laube, В., Hirai, H., Sturgess, M., Betz, H. and Kuhse, J. (1997) Molecular determinants of agonist discrimination by NMDA receptor subunits: analysis of the glutamate binding site on the NR2B subunit. Neuron, 18,493-503.

96. Lauffer, L. and Hucho, F. (1982) Triphenylmethylphosphonium is an ion channel ligand of the nicotinic acetylcholine receptor. Proc Natl Acad Sci US A, 79, 2406-9.

97. Lazaridis, T. and Karplus, M. (1999) Effective energy function for proteins in solution. Proteins, 35,133-52.

98. Lee, С J., Jackson, A.C., MacDermott, A.B. and Nishiyama, T. (1999) Analgesic interaction between intrathecal midazolam and glutamate receptor antagonists on thermal-induced pain in rats. Eur J Neurosci, 11,2758-66.

99. Leonard, R.J., Labarca, C.G., Chamet, P., Davidson, N. and Lester, H.A. (1988) Evidence that the M2 membrane-spanning region lines the ion channel pore of the nicotinic receptor. Science, 242,1578-81.

100. Li, Z. and Scheraga, H.A. (1987) Monte Carlo-minimization approach to the multiple- minima problem in protein folding. Proc Natl Acad Sci I7S Л , 84, 6611-5.

101. Liu, Y., Holmgren, M., Jurman, M.E. and Yellen, G. (1997) Gated access to the pore of a voltage-dependent K+ channel. Neuron, 19, 175-84.

102. Liu, S.Q. and Cull-Candy, S.G. (2000) Synaptic activity at calcium-permeable AMPA receptors induces a switch in receptor subtype. Nature, 405,454-8.

103. Liu, S.J. and Cull-Candy, S.G. (2002) Activity-dependent change in AMPA receptor properties in cerebellar stellate cells. J Neurosci, 22,4428-36.

104. MacDonald, J.F., Miljkovic, Z. and Pennefather, P. (1987) Use-dependent block of excitatory amino acid currents in cultured neurons by ketamine. J Neurophysiol, 58, 251-66.

105. Machold, J., Weise, C , Utkin, Y., Tsetlin, V. and Hucho, F. (1995) The handedness of the subunit arrangement of the nicotinic acetylcholine receptor from Torpedo califomica. EurJBiochem, 234, 427-30.

106. Madsen, U., Ebert, B. and Krogsgaard-Larsen, P. (1994) Modulation of AMPA receptor function in relation to glutamatergic abnormalities in Alzheimer's disease. Biomed Pharmacother, 48, 305-11.

107. Magazanik, L.G. and Usherwood, P.N. (1996) Competitive antagonism of recombinant AMPA/kainate receptors by N-methyl-D-aspartate and analogues. Neuroreport, 8,257-9.

108. Magazanik, L.G., Buldakova, S.L., Samoilova, M.V., Gmiro, V.E., Mellor, I.R. and Usherwood, P.N. (1997) Block of open channels of recombinant AMPA receptors and native AMPA/kainate receptors by adamantane derivatives. J Physiol, 505, 655-63.

109. Malinow, R. and Malenka, R.C. (2002) AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Annual Review ofNeuroscience, 25,103-26.

110. Mano, L, Lamed, Y. and Teichberg, V.I. (1996) A venus flytrap mechanism for activation and desensitization of alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid receptors. J Biol Chem, 271,15299-302.

111. Mano, I. and Teichberg, V.I. (1998) A tetrameric subunit stoichiometry for a glutamate receptor-channel complex. Neuroreport, 9,327-31.

112. Mayer, M.L., Westbrook, G.L. and Guthrie, P.B. (1984) Voltage-dependent block by Mg2+ of NMD A responses in spinal cord neurones. Nature, 309,261-3.

113. Mayer, M.L., Olson, R. and Gouaux, E. (2001) Mechanisms for ligand binding to GluRO ion channels: crystal structures of the glutamate and serine complexes and a closed apo state. JMol Biol, 311, 815-36.

114. MitcheU, K.M., AlbahadUy, F.N., MichaeUs, E.K., WUson, G.S. and Maren, S. (1994) Emergence neophobia correlates with hippocampal and cortical glutamate receptor binding in rats. Brain Research, 659,117-25.

115. Miyazawa, A., Fujiyoshi, Y. and Unwin, N. (2003) Structure and gating mechanism of the acetylcholine receptor pore. Nature, 424,949-55.

116. Mori, H., Masaki, H., Yamakura, T. and Mishina, M. (1992) Identification by mutagenesis of a Mg(2+)-block site of the NMDA receptor channel. Nature, 358, 673-5.

117. Mosbacher, J., Melcher, Т., Hoger, Т., Geiger, J.R., Kuner, Т., Monyer, H., Higuchi, M., Bach, A. and Seeburg, P.H. (1994) A molecular determinant for submillisecond desensitization in glutamate receptors. Science, 266,1709-13.

118. Nakanishi, N., Shneider, N.A. and Axel, R. (1990) A family of glutamate receptor genes: evidence for the formation of heteromultimeric receptors with distinct channel properties. Neuron, 5, 569-81.

119. Neely, A. and Lingle, C.J. (1986) Trapping of an open-channel blocker at the frog neuromuscular acetylcholine channel. BiophysJ, 50, 981-6.

120. Nemethy, G., Pottle, M.S. and Scheraga, H.A. (1983) Energy parameters m polypeptides. 9. Updating of geometrical parameters, nonbonded interactions, and hydrogen bond interactions for the naturally occurring amino acids. J Phys Chem, 87, 1883-7.

121. Neyton, J. and Miller, С (1988) Discrete Ba2+ block as a probe of ion occupancy and pore structure in the high-conductance Ca2+ -activated K+ channel. J Gen Physiol, 92,569-86.

122. Neyton, J. and Miller, C. (1988) Potassium blocks barium permeation through a calcium-activated potassium channel. J Gen Physiol, 92,549-67.

123. Nicoll, R.A. and Malenka, R.C. (1999) Expression mechanisms underlying NMD A receptor-dependent long-term potentiation. Annals of the New York Academy of Sciences, 868, 515-25.

124. Nutter, T.J. and Adams, D.J. (1995) Monovalent and divalent cation permeability and block of neuronal nicotinic receptor channels in rat parasympathetic ganglia. J Gen Physiol, 105, 701-23.

125. Panchenko, V.A., Glasser, C.R. and Mayer, M.L. (2001) Structural similarities between glutamate receptor channels and K(+) channels examined by scanning mutagenesis. J Gew Physiol, 117, 345-60.

126. Parsons, C.G. (1999) Memantine is a clinically well tolerated N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor antagonist—a review of preclinical data. Neuropharmacology, 38, 1253-9.

127. Pellegrini-Giampietro, D.E., Goiter, J.A., Bennett, M.V. and Zukin, R.S. (1997) The GluR2 (GluR-B) hypothesis: Ca(2+)-permeable AMPA receptors in neurological disorders. Trends Neurosci, 20,464-70.

128. Petersen, S.A., Fetter, R.D., Noordermeer, J.N,, Goodman, C.S. and DiAntonio, A. (1997) Genetic analysis of glutamate receptors in Drosophila reveals a retrograde signal regulating presynaptic transmitter release. Neuron, 19,1237-48.

129. Qian, A., Antonov, S.M. and Johnson, J.W. (2002) Modulation by permeant ions of Mg(2+) inhibition of NMDA-activated whole-cell currents in rat cortical neurons. J Physiol, 538,65-77.

130. Roche, K.W., Raymond, L.A., Blackstone, С and Huganir, R±. (1994) Transmembrane topology of the glutamate receptor subunit GluR6, J Biol Chem, 269, 11679-82.

131. Rosenmund, C, Stern-Bach, Y. and Ctevens, C.F. (1998) The tetrameric structure of a glutamate receptor channel. Science, 280, 1596-1599.

132. Sankararamakrishnan, R., Smart, O.S. and Sansom, M.S. (1994) Molecular dynamics studies of M2 helices of nicotinic acetylcholine receptors. BiophysJ, 67,1501-15.

133. Sankararamakrishnan, R., Adcock, C. and Sansom, M.S. (1996) The pore domain of the nicotinic acetylcholine receptor: molecular modeling, pore dimensions, and electrostatics. BiophysJ, 71, 1659-71.

134. Schuster, СМ., Ultsch, A., Schloss, P., Cox, J.A., Schmitt, B. and Betz, H. (1991) Molecular cloning of an invertebrate glutamate receptor subunit expressed in Drosophila muscle. Science, 254,112-4.

135. Sobolevsky, A.I., Koshelev, S.G. and Khodorov, B.I. (1999) Molecular size and hydrophobicity as factors wluch determine the efficacy of the blocking action of amino-adamantane derivatives on NMDA channels. Membr Cell Biol, 13,79-93.

136. Sobolevsky, A.I. (1999) Two-component blocking kinetics of open NMDA channels by organic cations. BBA, 1416,69-91,

137. Sobolevsky, A.I., Koshelev, S.G. and Khodorov, B.I. (1999) Probing of NMDA channels with fast blockers. JNeurosci, 19,10611-26.

138. Sobolevsky, A.I. and Yelshansky, M.V. (2000) The trapping block of NMDA receptor channels in acutely isolated rat hippocampal neurones. J Physiol, 526 Pt 3,493-506.

139. Sobolevsky, A.I., Beck, С and Wollmuth, L.P. (2002) Molecular rearrangements of the extracellular vestibule inNMDAR channels during gating. Neuron, 33,75-85.

140. Steigerwald, F., Schulz, T.W., Schenker, L.T., Kermedy, M.B., Seeburg, P.H. and Kohr, G. (2000) C-Terminal truncation of NR2A subunits impairs synaptic but not extrasynaptic localization of NMDA receptors. JNeurosci, 20,4573-81.

141. Sterz, R., Hermes, M., Peper, K. and Bradley, R.J. (1982) Effects of ethidium bromide on the nicotinic acetylcholine receptor. Eur J Pharmacol, 80, 393-9.

142. Stuhmer, Т., Amar, M., Harvey, R.J., Bermudez, I., van Minnen, J. and Darlison, M.G. (1996) Structure and pharmacological properties of a molluscan glutamate-gated cation chaimel and its likely role in feeding behavior. JNeurosci, 16,2869-80.

143. Swanson, G.T., Kamboj, S.K. and Cull-Candy, S.G. (1997) Smgle-channel properties of recombinant AMPA receptors depend on RNA editing, splice variation, and subunit composition. JNeurosci, 17, 58-69.

144. Swanson, G.T., Gereau, R,W.t., Green, T. and Heinemann, S.F. (1997) Identification of amino acid residues that control fimctional behavior in GluR5 and GluR6 kainate receptors. Neuron, 19,913-26.

145. Tavema, F.A., Cameron, B.R., Hampson, D.L., Wang, L.Y. and MacDonald, J.F. (1994) Sensitivity of AMPA receptors to pentobarbital. Eur J Pharmacol, 267, R3-5.

146. Tingley, W.G., Roche, K.W., Thompson, A.K. and Huganir, R.L. (1993) Regulation of NMD A receptor phosphorylation by alternative splicing of the C-terminal domain. Nature, 364,70-3.

147. Toth, K. and McBain, C.J. (1998) Afferent-specific innervation of two distinct AMPA receptor subtypes on single hippocampal intemeurons. Nature Neuroscience, 1, 572-8.

148. Tsai, M.C., Oliveira, A.C., Albuquerque, E.X., Eldefirawi, M.E. and Eldefi-awi, A.T. (1979) Mode of action of quinacrine on the acetylcholine receptor ionic channel complex. Mol Pharmacol, 16, 382-92.

149. Ultsch, A., Schuster, СМ., Laube, В., Schloss, P., Schmitt, B. and Betz, H. (1992) Glutamate receptors of Drosophila melanogaster: cloning of a kainate-selective subunit expressed in the central nervous system. Proc Natl Acad Sci USA, 89, 10484-8.

150. Ultsch, A., Schuster, СМ., Laube, В., Betz, H. and Schmitt, B. (1993) Primary structure of a putative NMDA receptor protein expressed in the head of the adult fly. FEBSLetters, 224, m-7.

151. Unwin, N. (1993) Nicotinic acetylcholine receptor at 9 A resolution. J Mo/ Biol, 229, 1101-24.

152. Unwin, N. (1995) Acetylcholine receptor channel imaged in the open state. Nature, 373,37-43.

153. Unwin, N. (1996) Projection structure of the nicotinic acetylcholine receptor: distinct conformations of the alpha subunits. JMol Biol, 257, 586-96.

154. Varanda, W.A., Aracava, Y., Sherby, S.M., VanMeter, W.G., Eldefrawi, M.E. and Albuquerque, E.X. (1985) The acetylcholine receptor of the neuromuscular junction recognizes mecamylamine as a noncompetitive antagonist. Mol Pharmacol, 28, 128-37.

155. Villarroel, A., Herlitze, S., Koenen, M. and Sakmann, B. (1991) Location of a threonine residue in the alpha-subunit M2 transmembrane segment that determines the ion flow through the acetylcholine receptor channel. Proc Natl Acad Sci USA, 243, 69-74.

156. Villarroel, A. and Sakmann, B. (1992) Threonine in the selectivity filter of the acetylcholine receptor channel. BiophysJ, 62, 196-205.

157. Villarroel, A., Bumashev, N. and Sakmann, B. (1995) Dimensions of the narrow portion of a recombinant NMD A receptor channel. Biophys J, 68, 866-75.

158. Vorobjev, V.S. (1991) Vibrodissociation of sliced mammalian nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods, 38, 145-50.

159. Vorobjev, V.S. and Sharonova, I.N. (1994) Tetrahydroaminoacndine blocks and prolongs NMDA receptor-mediated responses in a voltage-dependent manner. Eur J Pharmacol, 253, 1-8.

160. Vorobjev, V.S., Sharonova, I.N. and Haas, H.L. (1996) A simple perfixsion system for patch-clamp studies. Journal of Neuroscience Methods, 68, 303-7. m

161. Wahl, P., Madsen, U., Banke, Т., bCrogsgaard-Larsen, P. and Schousboe, A. (1996) Different characteristics of AMP A receptor agonists acting at AMP A receptors expressed in Xenopus oocytes. Eur J Pharmacol., 308,211-8.

162. Wang, F. and Imoto, K. (1992) Pore size and negative charge as structural determinants of permeability in the Torpedo nicotinic acetylcholine receptor channel. Proceedings of the Royal Society of London - Series B: Biological Sciences, 250, 11-7.

163. Washburn, M.S. and Dingledine, R. (1996) Block of alpha-anuno-3-hydroxy-5- methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) receptors by polyamines and polyamine toxins. JPharm Exp Ther, 278, 669-78.

164. Washburn, M.S., Numberger, M., Zhang, S. and Dingledine, R. (1997) Differential dependence on GluR2 expression of three characteristic features of AMPA receptors. JNeurosci, 17,9393-406.

165. Weiner, S.J., Kollman, P.A., Case, D.A., Singh, U.C, Chio, C , Alagona, G., Profeta, S. and Weiner, P.K. (1984) A new force field for molecular mechanical simulation of nucleic acids and proteins. J Am Chem Soc, 106, 765-84.

166. White, B.H., Howard, S., Cohen, S.G. and Cohen, J.B. (1991) The hydrophobic photoreagent 3-(trifluoromethyl)-3-m-(125I. iodophenyl) diazirine is a novel noncompetitive antagonist of the nicotinic acetylcholine receptor. J Biol Chem, 266, 21595-607.

167. White, B.H. and Cohen, J.B. (1992) Agonist-induced changes in the structure of the acetylcholine receptor M2 regions revealed by photoincorporation of an uncharged nicotinic noncompetitive antagonist. J S/o/ Chem, 267,15770-83.

168. Wilson, G.G. and Karlin, A. (1998) The location of the gate in the acetylcholine receptor channel. Neuron, 20,1269-81.

169. Wollmuth, L.P., Kuner, T. and Sakmann, B. (1998) Adjacent asparagines in the NR2- subunit of the NMDA receptor channel control the voltage-dependent block by extracellular Mg2+. J Physiol, 506,13-32.

170. Wong, E.H., Kemp, J.A., Priestley, Т., Knight, A.R., Woodruff, G.N. and Iversen, 1..L. (1986) The anticonvulsant MK-801 is a potent N-methyl-D-aspartate antagonist. Proc Natl Acad Sci USA, 83, 7104-8.

171. Wood, M.W., VanDongen, H.M. and VanDongen, A.M. (1995) Structural conservation of ion conduction pathways in К channels and glutamate receptors. Proc Natl Acad Sci USA, 92, 4882-6.

172. Woodhull, A.M. (1973) Ionic blockage of sodium channels in nerve. J Gen Physiol, 61, 687-708.

173. Wright, W.L., Robinson, T.N., 3rd, D'Angelo, C.P. and Wright, J.M. (1991) Multiple effects of tetraethylammonium on N-methyl-D-aspartate receptor-channels in mouse brain neurons in cell culture. Pharmacology, Biochemistry & Behavior, 39, 479-85.

174. Yamakura, Т., Sakimura, K., Mishina, M. and Shimoji, K. (1995) The sensitivity of AMPA-selective glutamate receptor channels to pentobarbital is determined by a single amino acid residue of the alpha 2 subimit. FEBS Letters, 374,412-4.

175. Yu, Y., Shi, L. and Karlin, A. (2003) Structural effects of quinacrine binding in the open channel of the acetylcholine receptor. Proc Natl Acad Sci USA, 100,3907-12.

176. Zhang, H. and Karlin, A. (1997) Identification of acetylcholine receptor channel- lining residues in the Ml segment of the beta-subunit. Biochemistry, 36,15856-64.

177. Zhorov, B.S. (1981) Vector method for calculating derivatives of energy of atom- atom interactions of complex molecules according to generalized coordinates. J Struct Chem, 22,4-8.

178. Zhorov, B.S. (1983) Vector method for calculating derivatives of the energy deformation of valence angles and torsion energy of complex molecules according to generalized coordinates. J Struct Chem, 23, 649-55.

179. Zhorov, B.S. (1993) Comparison of Lowest-Energy Conformations of Dimethylcurine and Methoxyverapamil: an Evidence of Ternary Association of Calcium Chaimel, Ca2+, and Calcium Entry Blockers. J Membr Biol, 135,119-37.

180. Zhorov, B.S. and Ananthanarayanan, V.S. (1994) Similarity of Ca2+ bound conformations of morphine and Met-enkephalin: a computational study. FEBS 1.etters, 354, 131-4.

181. Zhorov, B.S. and Ananthanarayanan, V.S. (1995) Conformational analysis Ca2+- bound opioid peptides: implications for ligand-receptor recognition. J Biomol Struct Dyn, 13, 1-13.

182. Zhorov, B.S. and Ananthanarayanan, V.S. (1996) Conformational and electrostatic similarity between polyprotonated and Ca2+-boimd mu-opioid peptides. J Biomol Struct Dyn, U, 173-84.

183. Zhorov, B.S. and Ananthanarayanan, V.S. (1998) Signal transduction within G- protein coupled receptors via an ion tunnel: A hypothesis. J Biomol Struct Dyn, 15, 631-7.

184. Zhorov, B.S. and Ananthanarayanan, V.S. (2000) Homology models of mu-opioid receptor with organic and inorganic cations at conserved aspartates in the second and third transmembrane domains. Arch Biophys Biochem, ZIS, 31-49.

185. Zhou, Y., Morais-CabraL, J.H., Kaufinan, A. and MacKinnon, R. (2001) Potassium channel receptor site for the inactivation gate and quaternary amine inhibitors. Nature, 414,43-8.

186. Zimmerman, S.S., Pottle, M.S., Nemethy, G. and Scheraga, H.A. (1977) Conformational analysis of the 20 naturally occurring amino acid residues using ECEPP. Macromolecules, 10, 1-9.

Информация о работе

Тихонов, Денис Борисович
доктора биологических наук
Санкт-Петербург, 2004
ВАК 03.00.13

Диссертация

Исследование строения и механизмов блокады ионных каналов никотиновых холинорецепторов и глутаматных рецепторов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы