Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярное моделирование ионных каналов рецептеров ацетилхолина и глутамата

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярное моделирование ионных каналов рецептеров ацетилхолина и глутамата"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Институт эволюционной физиологии н биохимии о_ им. И.М. Сеченова РАН

^ч- На правах рукописи

Ъ

УДК 577.113

Тихонов Денис Борисович

МОЛЕКУЛЯРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ИОННЫХ КАНАЛОВ РЕЦЕПТОРОВ АЦЕТИЛХОЛИНА И ГЛУТАМАТА

03.00.13 - физиология человека и животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических паук

Санкт-Петербург -1998

Работа выполнена в лаборатории биофизики сннаптических процессов Института Эволюционной Физиологии и Биохимии им. И.М.Сеченова РАН.

Научные руководители:

доктор биол. наук Б.С.Жоров

член-корр. РАН, профессор Л.Г.Магазаник

Официальные оппоненты:

член-корр. РАЕН, доктор биол. наук Л.Б.Пиотровский

доктор биол. наук, профессор Е.В.Розенгарт

Ведущее учреждение - Институт цитологии РАН

Защита диссертации состоится на заседании

специализированного совета Д002.89.01 при Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова РАН по адресу: 194233, Санкт-Петербург, пр. М. Тореза 44.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Эволюционной Физиологии и Биохимии им. И.М.Сеченова

Автореферат разослан марта 1998г.

Ученый секретарь специализированного совета

доктор биол. наук, профессор М.Н.Маслова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Лиганд-ахгнвнруемые ионные каналы участвуют в передаче сигналов в быстрых химических синапсах. Их изучение представляет значительный интерес для нейрофизиологии. В последние два десггалетня в этой области достигнут огромный прогресс. Помимо аминокислотных последовательностей, известна трансмембранная топологах рецепторов, определены сегмента, формирующие поры ионных каналов, нх вторичная структура н конкретные остатки, ответственные за такие особенности, как связывание каналоблохатсров, иоялаз селективность и проницаемость. Однако, многие детали строения ионных каналов продолжают оставаться неясными. В частности неизвестно, какие факторы определяют физиологические и фармакологические различия между подтипами рецепторов. Сущность механизмов активации и десснситнзацнн такие нензвестна. Мезду разными экспериментальными данными существуют определенные противоречия.

В этой ситуации теоретический подход - молекулярное моделирование может сыграть вазеную роль. Современные экспериментальные методы предоставляют необходимую для успешного моделирования информацию. Экспериментальные и модельные подходы могут эффективно дополнять друг друга. Молекулярная модель дает визуализацию системы в атомном разрешении, что экспериментально возможно только при рентгенострупурнсм анализе. Б тех случаях, когда технические проблемы делают реитгенострупурный анализ затруднительным (как в случае мембранных рецепторов), моделирование становится единственно возможным путем к анализу структуры в атомном разрешении.

Цель исследования. Целью работы было создание непротиворечивых моделей ионных каналов никотинового холинорецептора и глутаматного рецептора, используя максимально широкий набор экспериментальных данных.

¡Сопкрэттклз задспа исследошигая:

I. На основании ьмекяцгосся литературных данных о строении ионного сан ала никотинового холинорецептора построить молекулярную модель терьггого канала. Особое внимание уделялось анализу связывания яналоблокаторов, в том числе анализу экспериментальных данных, юлученных лабораториями биофизики и фармакологии ИЭФиБ.

. На основе разработанной модели открытого канала попытаться устранить ротяворечне между данными электронной микроскопии (ипиоп, 1993, 995) и цистеинового картирования (АкаЬаз еЛ а!., 1994; АкаЬаэ & Каг1ш, 995), а также разработать возможный механизм активации канала.

3. Используя опыт, накопленный при моделировании ионного канала никотинового холннорецептора, найти основные молекулярные детерминанты, определяющие строение так называемого N/<3/11 сайта глугаматных рецепторов, в значительной мере определяющего физиологические и фармакологические свойства их каналов.

Научная новизна. В данной работе впервые предложена модель ионного канала никотинового холннорецептора, адекватно описывающая связывание блокирующих агентов разной структуры. Показано, что одним из условий связывания блокаторов является излом каналообразующнх М2 спиралей, что согласуется с данными электронной микроскошш. Анализ модели открытого канала позволил предложил, принципиально новый механизм активации канала, согласующийся с современными экспериментальными данными. На основании анализа стерических и химических свойств аминокислот, входящих в N/(^/11 сайт глугаматных рецепторов, впервые выдвинута гипотеза о циклическом характере водородных связей, определяющих пространственное строение селективного фильтра данных ионных каналов.

Теоретическое и практическое значение работы. В данной работе на основании результатов модельных экспериментов предложен ряд новых гипотез о функциональной организации липшд-активируемых ионных каналов, что способствует более глубокому пониманию функционирования

и путей регуляции этих физиологически колотых объектов. Такие положения работы, как участие М1 сегментов никотиновых холинорецепторов в передаче возбуждения от узнающего участка к эффекторному звену воротного механизма и циклический характер специфических взаимодействий, обеспечивающих стабильность поры ионных каналов, подлежат опытной проверке и, следовательно, предоставляют материал для разработки новых экспериментов." Поскольку разработанные модели способны описывать связывание каналоблокаторов различной структуры, на основании моделей может вестись направленный синтез новых активных и избирательных препаратов, которые, в сбою очередь, могут использоваться в экспериментальных целях а также явится перспективными для клинической практики.

Апробация работы. Основные материалы диссертации представлены в 6 печатных работах. Предварительные результаты моделирования ионного канала ММБА рецептора докладывались на первой конференции молодых физиологов и биохимиков России (Санкт-Петербург, 1995), и были отмечены специальной премией. Модель ионного канала никотинового холннорецептора была представлена на XXXIII международном конгрессе

физиологических наук (Санкт-Петербург, 1997) и П Российско-Германской пколе для молодых ученых "Передача клеточного сигнала" (Пущино, 1997).

Структура и объем работы.

(иссертапня изложена на 130 стр., содержит 27 рисунков, 6 таблиц и остоит из введения, обзора литературы, описания методики, изложения и Осуждения собственных результатов, общего заключения и выводов. !писок цитируемой литературы включает 207 наименований.

Тетодика исследования. Молекулярные модели ионных каналов ецепторов ацетилхолина и глутшата и их комплексов с блокаторами были азработаны с помощью методов теоретического хонформацнопного зализа. Для расчетов использовались силовые поля Дашевского ^ашевскнй, 1974) и ЕСЕРР/2 (Momany et al., 1975; Nemethy et al., 1983). лекгростатическне заряды на атомах блокагоров рассчитывались на методу NDO/2. Поиск энергетически оптимальных конформаций осуществлялся зи помощи метода Монте-Карло с минимизацией энергии (МСМ) (Li and iheraga, 1988). Минимизация энергии проводилась в пространстве гутреппих координат: торсионных углов каналообразующих М2 сегментов блохоторов, валентных углов блокагоров и координат, задающих взаимное ^положение элементов комплексов (Декартовы координаты и Эйлеровы лы). МСМ траектории рассчитывались при температуре Т=600К. чередная точка траектории определялась из предшествующей изменением учайно выбранной внутренней координаты на случайную величину, после го проводилась минимизация энергии. Минимизация прекращалась, когда едпяя квадратнческая величина составляющих храдиента энергии ановшгась меньше 1 ккал*ыоль"'*рад'1. Полученная равновесная нформация включалась в МСМ траекторию, если ее энергия Е была ныне энергии предшествующей конформацин Ер, или, если случайная йичипа п с (0, 1) оказывалась меньше, чем ехр(-{Е X Ep)/RT). Процесс иска прекращался, после того, как очередные к минимизаций не уводили к уменьшению энергии системы. В различных модельных :периме$гп$х параметр к варьировался от 100 до 3000.

ЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

жалгаацяя участка еззэывытз дтзкатиопых блокаторов в поппом нале никотнноейго холкпергцептора. Ранее было обнаружено, что зсобность полиметалендааммониевых соединений, имеющих >уктурнук> формулу R^R3^ - (CH2)„ - N^Tl^R6, блокировать ионные галы мышечных и нейроналытых холинорецепторов зависит как от >уктуры обеих катиошшх головок, так и от расстояния между шиш лсомская и Гмиро, 1982; Zhorov et al., 1991). Наибольшей блокирующэй "ивностью обладают несимметричные производные пентаметония, у

которых размеры катионных головок существенно различаются. На основании этого был сделан вывод, что блокатор в канале связывается обеими катноннымн группами с дауш различными пуклеофильными сужениями, имеющими размеры 6.1x8.3А и соответственно (Эюгоу

е1 а!., Вго\1зупа е! а!., 1996). Сопоставление результатов анализа

структурно-функциональных отношений с данными о строении ионного канала позволило в настоящей работе предположить, что блокаторы пентаметилёцдиаммошевого ряда связываются в ионном канале никотинового холннорецептора с серяновъм и треоштовым кольцами гомологичных аминокислот. Тогда размеры сечений поры ионного канала на уровне этих колец составляют 6.1 х8.зА и 5.5х6.4А (Вхш1зупа е! а1., 1996).

Было проведено моделирование связывания диаммониевых блокаторов в ионном канале с использованием молекулярной модели, предложенной РигоЬ-СогЬт & Ри11тапп (1989). Методом расчета энергетических профилей удалось приближенно описать вариации кинетики связывания, наблюдающиеся в гомологических рядах днкатионных блокаторов мышечного никотинового холннорецептора, в частности более высокую активность несимметричных соединений, имеющих катко иные головки неодинакового размера. Результаты расчетов подтверждают гипотезу о том, что местом связывания дикатиояных блокаторов в ионном канале шшупшобого хояшюрецеитора являются сериновое и треониновое кольца (Тихонов и др. 1996). Следующим логическим шагом представлялось создание более полной молекулярной модели, согласующейся с появившимися в 90х годах новыми экспериментальными данными (Штоп, 1993,1995; АкяЬаз е1 а1., 1995, и т.д.). При этом предполагалось, взяв за основу полученные ранее результаты, существенно расширить круг изучаемых блокаторов.

Излом М2 спиралей никотинового холннорецептора На первом этапе моделирования исследовались конформационные свойства отдельной М2 спирали с последовательностью ЕКМТЪ518УЬ101АЫЛТЫ.У120У. Для поддержания спиральной геометрии длины водородных связей ЫН;...Ои были ограничены диапазоном 1.7-2.0А. Основной особенностью, характеризующей полученную оптимальную структуру, является то, что атомы водорода гидроксильных групп боковых цепей остатков серина и треонина образуют водородную связь с атомами кислорода основной цепи, принадлежащим аминокислотам, расположенным на предыдущем витке спирали. При этом у остатков серина наиболее удаленным от оси спирали оказывается атом кислорода гидроксильной группы, несущий частичный отрицательный заряд. Будучи обращенным в пору канала этот атом кислорода может облегчать прохождение катионов через канал и способствовать связыванию катионных блокаторов.

б

азлнчия в эффективных размерах боковых цепей остатков серила и >еонина приблизительно соответствуют различию в размерах сечений фшювого и треошшового колец, рассчитанных ранее (ВгоуЬупа е1 а1. >96). Этот результат свидетельствует, что М2 спирали не должны иметь тцественного радиального наклона к оси канала. С другой стороны, элекула хлорпромазина должна свободно проходить через экваториальное >льцо (КеуаЬ е1 а1., 1990), что накладывает ограничение на его знямалькые размеры (12.5x5.5А). Принимая ео внимание размеры ринового кольца (6.1х8.зА), можно сделать вывод о значительном ¡диальном наклоне М2 спиралей. Данное противоречие может быть траиено, если предполошггь, что М2 спираль имеет излом между риновым и экваториальным кольцами, причем во внутриклеточной часта тральные участки не имеют наклона к оси, а спнаптические частя М2 ■огнуты наружу и образуют воронкообразную структуру. Вывод об изломе 2 спиралей в области экваториального лейцинового кольца, полученный I основе анализа их пространственного строения и мест связывания налоблокаторов, согласуется с результатами Унвина, полученными ггодом криоэлектронной микроскопии (Х1падп, 1993,1995).

эстроеипе п тестнроваппа модели. Модель собиралась как симметричная стема из пяти идентичных линейных М2 спиралей, геометрия которых ша определена в ходе предшествовавших расчетов. Ориентация спиралей ноентельно собственной оси была выбрана так, чтобы остатки в ложениях 4,8,11,12,15,19 были обращены внутрь поры капала, ометрнчесхий профиль канала задавался при помощи ограничения ССТ05ПШЙ мезду Са атомами этих аминокислот и ближайшими евдоатомами оси канала. Было рассчитано 10 вариантов модели, этветствующнх различным системам ограничений. Для определения тимальной геометрии при данных условиях требовалось 2-4 тыс. лнмнзацнй энергии.

блпца 1. Сайты связывания блокатороз иопного канала никотинового гсннорецептора.____

Соединение Сайт связывания

Е13К+ - (СН2)5 - N^13 ЗегЗ

Е13К+-(СН2)5-М+Ме{3 БегН, ТЬг4

Ме1з*Г-(СН2)5-К+Ме13 5ег8, ТЬг4

Ме1зК+-(СН2)5-Н+Нз ТЬг4

ОХ-222 А1а12, Бег8

Хлорпромазин Ьеи11, 5ег8

ггарование каждой модели проводилось при помощи построения ;ргетических профилей для ряда блокаторов, представленных в табл. 1. лысо для одной модели было получено соответствие между положениями

7

энергетических барьеров в профилях блокаторов и экспериментальв определенными местами связывания. Геометрические параметры это оптимальной модели представлены в табл. 2., а общий вид - на рис. 1. Как следовало ожидать из предварительных расчетов, в получение оптимальной модели открытого ионного канала никотиновш холинорецехгтора М2 спирали имеют выраженный излом в област экваториального кольца. При этом во внутренней части оси спиралей I имеют радиального наклона к оси канала, а после излома, то есть наружной части, имеют радиальный наклон к оси канала порядка 30% образуют воронкообразную структуру. Общнй вид модели сходен изображением, полученным методом криоэлехтронной микроскопии (\Jnwi 1993,1995). Основное отличие данной модели состоит в меньших размер; поры канала.

Таблица 2. Основные геометрические параметры оптимальной моде: открытого канала никотинового холнпорсцептора. Г) - расстояние от ( атома до осп канала, Я - минимальный радиус поры на данном уровне, 2 высота сечения относительно плоскости, проведенной через Са атом

Параметр ОСТАТОК

ТНЯ4 БЕИ8 1ЛШ11 УАЫ5 ЬЕШ8 УА1Л9

в (А) 6.2 6.2 9.3 12.0 15.0 15.0

к (А) 2.2 2.9 4.9 7.1 10.9 11.0

г (А) 0 5.8 10.2 17.6 20.1 21.2

Энергетические профшш н саазызанве блоки горов в ионном канале, наших расчетах энергетические профили содержали две основа компоненты: невалентные взаимодействия и элекгростатическ взаимодействия. Вклад торсионной энергии н энергии водородных связ оказался незначительным. Примеры энергетических профилей даны рис.2. Поскольку основной вклад в энергию элекгростатическ взаимодействий вносит взаимодействие аммониевых групп молех блокаторов с гидроксиламн боковых цепей серипового и феонгаок колец, электростатические компоненты всех полученных профилей име сходный между собой вид (Рис. 2А).

Б

упои 1. Вид с в-лсг-леточной стороны в плоскости мембраны модели кого канала вико лшового холннорецептора. А - в открытом канале 1ткн лейцина экваториального кольца обращены в область ссегментного контакта; Б - закрытый канал, в котором остатки лейцина ггориального кольца выступают в пору, уменьшая ее диаметр._

Б-

•а -К -11 4 -А

Пи* ИИПШ X

-К -М 4

Пслепоия блмтоу*. А

рпок 2. Энергетические профили для соединений I (жирная линия), II хая линяя) п ГУ(пушгшрная линна). А - Электростатические содействия; Б - неваленткс взаимодействия. Ход кривой •тростатическнх взаимодействий совпадает для всех трех соединений, оженке барьера невалентных взаимодействий зависит от стеричесхнх [еров блокатора.___

А Б

Рисунок 3. Оптимальные варианты связывания блокатороз в модели открытого канала, полученные путем построения энергетических профилей. А - хлорпромазин. Фенотиазяновая головка связывается с экваториальным (Э.к.) и сернновым (С.к.) кольцами. Катионнаа группа проходит сквозь ссриновое кольцо, взаимодействует с гидроксалами боковых цепей остатков сернна и приближается к треоннновому кольцу (Т.к.). Б - QX-222. Гидрофобный цикл связывается с экваториальным кольцом, а катионяая группа - с сериновым кольцом._

ЫаПрОТНВ, Б СНЛу раЗЛИЧНЯ ГСОМСТрНЧССКНХ XSpaKTCpKCTKX, К 17рС/лДС ПССГ стерических размеров молекул блохаторов, профили невалентны взаимодействий существенно различаются в рассматриваемом ряду. Дл четырех соединений из шести наиболее глубокий минимум невалентаы взаимодействий по положению практически совпадает с минимумов электростатической энергии. Дня соединений (I н IV), которые явяяюге слабыми каналоблокаторами, положения минимумов невалентной i электростатической компонент существенно различны. Получении энергетические профили могут служить не только для выбора оптимальног варианта модели, но несут информацию об энергетических i геометрических характеристиках комплекса блокатор-канал. Харахте связывания в канале молекул хлорпромазина и QX-222 показан на рис. ЗА, ] и согласуется с экспериментальными данными (Chamet et al., 1990; Revah £ al., 1990).

Возможный механизм активации канала. Известно, что остатки лейциш входящие в экваториальное кольцо и расположенные в области излом спиралей, играют ключевую роль в переходах между открытым и закрыты; состояниями (Lauarca ct al., 1995; Filatov and White, 1995). Согласно схсмс предложенной Унвином (1995), активация канала происходит за сче поворота изломанных спиралей, в результате которого остатки Leull обращенные внутрь поры в закрытом канале, перестают перекрыват просвет канала. Участок излома должен играть роль "молскулярног

ю

шарнира". Эта гипотеза не согласуется с результатами цистеяяового картирования, согласно которым существенных изменений в ориентации остатков, входящих в М2, не происходит (Akabaa et al., 1994, Akabas and Karlin, 1995). Представляется вероятным, что активация канала происходит за счет более локальных механизмов, не приводящих к существенному изменению доступности отдельных аминокислот.

Участок излома, в котором нарушены водородные связи, стабилизирующие альфа-спираль, обладает значительной гибкостью. Возможно, среда конформацнй этого региона имеются разные структуры, соответствующие открытому и закрытому состояниям. Для проверки этой гипотезы был выполнен дополнительный расчет копформациоиных возможностей участка излома. Было проведено 5500 минимизаций энергии и получено 45 различных нпзкоэиергетических хонформеров. Для большинства из них характерна неполная дестабилизация водородных связей на исследуемом участке (Val9-Alal2). Были обнаружены две различные пары водородных связей:

Ser6...Leu!0 и I!e7...Leul 1, соответствующие альфа-спирали;

Ser6...Val9 и De7...Leul0, соответствующие другому типу спирали (Зю

спирали), также встречающемуся в белках (Bariow and Thornton, 1938).

В обоих случаях на участке излома й пору канала оказываются обращены остапш, расположенные на следующем после сернновсго кольца (Ser8) витке спирали. Для альфа-спирали это А1а12, а для Зш спирали это Leull. Естественно предположить, что хонформация, включающая виток Зш спирали, ссстпетствуэт закрытому каналу, а конформация, имеющая дополнительный виток альфа-спирали иа участке излома - открытому. В закрытой копформаппи в пору обращены остатки Leul 1, что уменьшает диаметр поры на данном уровне до 1.75А, по сравненню с 4.9А в конформацнй, соответствующей открытому каналу (Рис. 1.). Торсионные углы главной цепа М2 сегментов доя открытого и закрытого состояния представлены на рис. 4. В обоих случаях значительные отклонения торсионных углов от идеальных величин, соответствующих альфа-спирали наблюдаются только в области излома (остатки 9-12). В спиральных областях различия торсионных углов для открытого и закрытого состояний несущественны.

Таким образом, исходя из наших расчетов, можно выдвинуть гипотезу о том, что активация ионного канала никотинового холкнорецептора происходит за счет конформационных изменений в гибком участке цепи, соединяющем более стабильные н менее подвижные спиральные части М2 сегментов. Эта модель удовлетворительно согласуется с широким спектром современных экспериментальных данных о механизмах активации ионного канала холннорецептора.

Б

з 4 в I и 11 м я II » г

в « ю

Рисунок 4. Торсионные углы главной цепи М2 сегментов в моделях открытого (А) и закрытого (Б) канала. По оси абсцисс - порядковый номер аминокислотного остатка.

Мезкспнралъыыс солевые мостшш как возможный механизм стабилизации структуры канала. При построении модели для поддержания пентагональной геометрии фиксировались расстояния между отдельными атомами М2 сегментов и псевдоатомами оси канала. Реальные механизмы, стабилизирующие третичную структуру ионного канала никотинового холинорецептора, до настоящего времени остаются неизвестными. На N концах М2 сегментов расположены высоко консервативные остатки глупшата (Е) в положении 1 и лизина (К) в положении 2 - так называемые ЕК пары. Эта соседние остатки с длинной и гибкой боковой цепью, несущие заряды разного знака, должны образовывать внутренний солевой мостик, что отмечалось многими авторами (Рилш-СогЬш апс1 Ри11тапп, 1989; ЗапкагагашакгЬЬшп & Банаою, 1994). Наша гипотеза состояла в том, что возможаы не только внутрисегментные, но и межсегментные солевые мостшш, то есть каждый остаток глутамата может образовывать ионную кару с остатком лизина, принадлежащим соседнему М2 сегменту. МСМ поиск проводился из стартовой конформации, соответствующей модели открытого канала. Положение п ориентация М2 фиксировались так же как и геометрия остатков с 4 по 21. Расчеты показали, что возможно одновременное замыкание как внутрисегментных, так и межсегментных солевых мостиков.

Карбоксильная группа боковой цепи глутамнна имеет два атома кислорода, способных к образованию ношшх пар. Один из этах атомов может входить во внутрисегментный солевой мостик, а другой - в межсегментный. Чередование аммониевых и карбоксильных групп, принадлежащих разным М2 сегментам и образующих ионные пары, способно стабилизировать пентагональную структуру канала в цитоплазматкческой части. Фактически структура, представленная на рас. 5 представляет собой ЗОти-членный цикл.

12

Диаметр этого цикла - 8.4Ä, что ие противоречит данным о размерах поры открытого ионного канала, полученным при помощи анализа проницаемости канала для органических катионов разного размера (Dwyer et al., 1980; Cohen et al., 1992; Nutter and Adams, 1995).

Рисунок 5. Модель канала никотинового холинорецептора. Вид в шоскости мембраны с внутриклеточной стороны. 10 селевых мостиков, ЯЗразованных заряженными боковыми цепями остатков глутамата и газина, формируют циклическую структуру, способную поддерживать 1ептагоиальную симметрию канала.__

)кспергшеиталыгая н теоретическая основы моделя пенного капала лутгшатпого рецептора. Важнейшие характеристики ионных копалов •лутаматпых рецепторов (ионная селехтнвность и связывание ;апалоблокаторов) в значительной степени определяются аминокислотами, (асположеннымн в тах называемом N/0/11 сайте. Этот сайт находится в ершине петли, образуемой М2 сегментами рецептора в толще мембраны, и юрмярует наиболее узкую часть ношюго канала. Рецепторы КМОА-типа смеют в этом положении остаток аспарапша, а рецепторы АМРА-тапа -луташш или аргшшн. Строение N/0/11 сайта остается неизвестным, а [екоторыг экспериментальные данные представляются парадоксальными. Диаметр капала NN10А рецептора составляет 5.5А, а АМРА и кшгаатиого -'ЛК. И это при том, что АМРА и каинатпые каналы имеют в N/(¡>/11 сайте лугамнн, имеющий более длинную боковую цепь, чем аснараган в КМВА аналах. Остатки в N/0/11 сайте обращены » пору канала, и остаткам с более [лннной 6охоеой цепью должны были бы соответствовать более узкие апалы. Эксперимент же свидетельствует об обратной зависимости. )сновной задачей нашего моделирования было найти специфические заимодействия, определяющие пространственное строение N/0/11 сайта лутаматных рецепторов.

Парадокс несоответствия диаметров пор глутаматных каналов размерам боковых цепей аминокислот, определяющих этот диаметр, может быть разрешен, если предположить, что боковые цепи остатков, входящих в N/<3/1*. сайт, образуют циклическую структуру. В этом случае более длинные цепи могут образовывать цикл большего диаметра. Кроме того, циклические, то есть межсегментные, связи могут участвовать в стабилизации пентагональной геометрии канала, подобно солевым мостикам ЕК пар никотинового холинорецептора, описанным выше. В том случае, если в искомой системе связей участвуют полярные группы главной цепи, замыканием этих связей можно объяснить нарушение спиральной геометрии М2 сегментов в области N/<3/11 сайта.

Модель пространственного строения N/<2/11 сайта глутаматного рецептора Простейшая система, удовлетворяющая перечисленным выше требованиям, состоит в том, что амвно1рушш боковых цепей аминокислот, входящих в N/(3/11 сайт устанавливают водородные связи с карбонильными группами главной цепи гомологичных аминокислот соседнего М2 сегмента. Для проверки этого предположения было построено две молекулярные модели: одна с использованием последовательности М2 сегмента N111 субьединицы №ЛОА- рецептора (аспарапш в N/(3/11 сайге), а вторая - с использованием последовательности М2 сегмента ОЫ11 субъедшшцы АМРА рецептора, имеющая б N/(3/14. сайте остаток глутамина. Модели собирались как симметричные системы пяти идентичных М2 сегментов. Первоначально дня М2 сегментов была выбрана альфа-спиральная конформация. Ориентация спиралей в модели была выбрана в соответствии с данными цистеннового картирования (Кипег е! а!., 1996). Оси М2 спиралей были расположены параллельно оси канала Расстояние от оси канала до Са атомов остатков, выстилающих пору, было выбрано равным 11.5 А. Циклическая система водородных связей может быть замкнута двумя способами - по часовой стрелке и против, причем укладки главной цепи для этих двух способов существенно различаются. Таким образом, МСМ траектории рассчитывались для четырех вариантов модели.

В результате расчетов было получено 89 устойчивых низкознергетических конформеров. Эти конформеры были сгруппированы по следующим признакам:

1) минимальный диаметр канала, как удвоенное расстояние от фиксированного атома в центре поры до ближайшей Ван-дер-Ваальсовой сферы;

2) грушш, шветственные за формирование минимального диаметра;

3) дополнительные водородные связи.

Таблица 3. Основные характеристики устойчивых конформеров, полученных при расчете вариантов модели ионного канала глутаматного рецептора Нумерация остатков дана относительно N/(^/11 сайта.

Группа МОДЕЛЬ Диаметр поры (А) Образован Дополнительные

группой водородные связи

1 Ж1 по ч.с. 4.8 01 нет

2 N111 по ч.с. 5.6 01 О(ост-П-НН2(ост0) 01(8егН)-Н(ост+2)

3 N111 по ч.с. 7.2 01 01(8егН>Н(ост+2)

4 №11 по ч.с. 6.6 СН2 нет

5 N111 по ч.с. 6.0 01 0(ост-1)-Н (ост 0)

6 N111 против ч.с. 5.9 01 0(ост-5)-Н1(8егИ)

7 N111 против ч.с. 8.2 N11-. С(ост0)-Ш(8ег+1)

8 N111 против ч.с. 7.8 01 0(ост-1)-Н (ост+1)

9 N111 против ч.с. 6.0 01 0(ост-1>Н1(5ег+1)

10 ИиЮ по ч.с. 5.5 01 нет

11 вМИ по ч.с. 6.7 01 нет

12 вЫИ по ч.с. 7.2 Ш2 пет

13 СшШ против ч.с. 8.6 ын2 нет

14 СМИ против ч.с. 8.7 ' ш2 0{ост-1 )-Н(ост+1) 01(01п6)-Ш2(01п+1)

0 - атом кислорода главной цепи;

01 - атом кислорода бохоюй цепи;

Н - атом водорода аминогруппы главной цепи; Н1 - атом водорода гндроксильной группы боковой цепи; №2 - аминогруппа боковой цепи.

Всего было найдено 14 принципиальных групп конформеров, характеристики которых представлены в табл.3. Из девяти устойчивых конформаций, полученных для N111 моделей, в ее? га наиболее узкую часть поры канала образуют карбонильные группы боковой цепи аспарагинов, тогда как из пяти конформаций, полученных для ИиКЛ моделей, только в двух максимальное сужение формируется атомами кислорода боковой цепн глутаминов, входящих в N/(3/11 сайт. Это согласуется с экспериментальными данными о лучшей блокируемосга МК-801 н фенциклидиновыми производными и большей проницаемости для ионов кальция №*ЮА каналов, по сравнению с АМРА и каннатными. Изображения характерных конформаций N111 и С1иШ даны на рис. 5. Средний диаметр поры N111 моделей составляет 5.92А, а 01иЮ моделей - 7.48А, что близко к экспериментально полученным значениям.

15

Как и при моделировании ионного канала холинорецептора, в процессе МСМ поиска в гибком участке цепи могут замыкаться дополнительные водородные связи, стабилизирующие те или иные конформации. Особое значение могут иметь водородные связи с участием боковой цепи остатка серии а, следующего за остатком аспарагина в N111 субъединице ЫМОА рецептора. Гидроксильная группа способна выступать как донором так и акцептором водородной связи. При нарушении альфа-спирали освобождается несколько полярных групп главной цепи. Боковая цепь серина может устанавливать водородные связи с такими группами.

К сожалению, на данном этапе затруднительно сделать вывод о функциональной значимости этих водородных связей. Возможно, в реальных каналах реализуется только одна из конформацнй. С другой стороны, возможно динамическое равновесие между разными конформерами. Также не представляется возможным сделать выбор между замыканием водородных связей по и против часовой стрелки. Безусловно, появление новых экспериментальных данных может помочь в разрешении этих вопросов. Другим подходом может явиться моделирование связывания блокаторов с различными вариантами модели КМОА канала.

Рисунок 6. Укладка цепи и конформации остатков, входящих в М/р/К сайт для модели 1чШ рецептора (А) н ЙиШ АМРА рецептора (Б). Вид в плоскости мембраны с внеклеточной стороны. В канале №*ЮА-рецсптора сужение формируется атомами кислорода, а в канале АМРА рецептора -аминогруппами, что объясняет различия свойств каналов._

В целом, несмотря на то, что в ходе моделирования ионных каналов глутаматных рецепторов не удалось получить однозначные ответы на ряд вопросов, полученные результаты представляются достаточно важными. На

16

А

Б

/О

я*

основании предположения о циклическом характере связей в N/(2/11 сайте, была найдена система связей, которая может определять основные черты строения этого важного участка ионного канала. Дальнейшие теоретические и экспериментальные исследования могут вестись уже на базе этой гипотезы. Наши расчеты показывают, что предложенная схема водородных связей не противоречит имеющимся опытным данным, хотя, разумеется, гипотеза нуждается в дополнительней экспериментальной проверке.

выводы

1. Проведенный анализ экспериментальных данных о местах и характере связывания блокаторов ионного канала никотинового холинорецептора свидетельствует, что каналообразующие М2 спирали должны иметь излом в области экваториального кольца. При этом внешние части М2 сегментов имеют значительный радиальный наклон к оси канала и образуют воронкообразную структуру, что обеспечивает каналоблоюгрующкм агентам доступ к месту связывания во внутренней части канала.

2. Расчет конформационных возможностей полипептидной цепи в области излома показал, что этот участок может играть роль эффекторного звена при активации ионного канала. Излом спиралей значительно увеличивает гибкость цепи за счет разрыва части водородных связей, стабилизирующих спиральную конформацшо. Локальные конформационные изменения в этой области могут объяснить различия между проводящим и непроводящим состояниями канала. В закрытом канале остатки лейцина, входящие в экваториальное кольцо, обращены внутрь поры и препятствуют прохождению гадратаровзнных ионов. В открытом состоянии эти остатки ориентированы в область межсегментных контактов.

3. Предложенный механизм активации канала является локальным н предусматривает, что спиральные участки М2 сегментов остаются неподвижными. В этом случае должны существовать специфические механизмы, стабилизирующие геометрию канала. На N концах М2 сегментов расположены высоко консервативные пары остатков глутамата и лизина (ЕК пары), боковые цепи которых несут заряд противоположного знака. Компенсация электростатических взаимодействий достигается замыканием внутреннего солевого мостика. Проведенные расчеты показали, что солевые мостикн могут замыкаться не только внутри каждого М2 сегмента, но и между соседними сегментами. При этом образуется устойчивая циклическая структура, способная эффективно стабилизировать пентагональную геометрию ионного канала.

4. Важнейшие свойства ионных каналов глутаматных рецепторов (проводимость, ионную селективность, взаимодействие с канал облокаторамн) определяют аминокислоты, расположенные в так называемом Ы/()/Я сайте М2 сегментов. Анализ имеющихся экспериментальных данных позволил предположить, что основным структурным мотивом, определяющим геометрию N/(2/11 сайта, являются циклические водородные связи между соседними М2 сегментами. Аминогруппы боковых цепей аминокислот, входящих в сайт (аспарагин, глутамин или аргинин), устанавливают водородные связи с карбонильными группами главной цепи гомологичных аминокислот

соседнего М2 сегмента. Результаты расчетов, проведенных на основании данной гипотезы, согласуются с данными о структурных и функциональных особенностях М/СУЯ сайта глутаматпых рецепторов. Сходство предложенной циклической структуры N/(¡»/11 сайта с циклом солевых мостиков ЕК пар никотинового холинорецептора (см. пункт 3) позволяет предположить, что образование специфических цикличных связей может являться общим механизмом стабилизации каналоподобиых структур, форм1фуемых олигомерными белхамн.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Тихонов Д.Б., Потапьева Н.Н., Гмиро В.Е., Жоров Б.С., МагазаншШ.Г.

(1996). Возможный механизм связывания блокаторов пентаметнленбис -аммониевого ряда в ионном канале мышечного никотинового холинорецептера. Еиол. Мембраны, том 13, N 2, с. 185-195.

2. Тихонов Д.Б. 1995. Моделирование ионных каналов Глутаматных

рецепторов NMDA-типг. Тезисы I конференции молодых физиологов и биохимиков России, с. 168. Санкт-Петербург.

3. Brovtsyna, N. B., Tikhonov, D. B., Gorbunova, O. B., Gmiro, V. E., Serduk, S.

E., Lukoniskaya, N. Y., Magazanik, L. G. and Zhorov, B. S. (1996). Architecture of the nicotinic acetylcholine receptor ion channel at the binding site of bis-ammonium blockers. J. Membr.Biol. v.152, p. 77-87.

4. Tikhonov, V., Zhoroy.B., Magazanik^. Modelling nicotinic acetylcholine receptor ion channel in the open and closed states. XXXIII international congress of physiological scinces. A 002.29. Sankt-Petersburg, 1997.

5. Tikhonov,D.B., MagazanikJLG. (1998) Voltage-dependenea of the open-channel blockade: onset and offset rates. JMembr.Biol. v. 161, pp. 1-8.

6. Tikhonov, D.B., Zhorev,B.S. (1998) Kinked-helices model of the «icoiinic acetylcholine receptor ion channel and its complexes with blockers. Simulation by Monte - Carlo - with-energy-minimization method. Biophys.J. v. 74, pp. 242-255.