Механизмы функционирования рецепторов глутамата в мышцах членистоногих и нейронах мозга позвоночника

Антонов, Сергей Михайлович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизмы функционирования рецепторов глутамата в мышцах членистоногих и нейронах мозга позвоночника
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы функционирования рецепторов глутамата в мышцах членистоногих и нейронах мозга позвоночника"

Г': ■

со РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ ЭВОЛЮЦИОННОЙ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ • им. И. М. СЕЧЕНОВА

еч;

На правах рукописи УДК 612.815:595.2/.7:596/599

АНТОНОВ Сергей Михайлович

МЕХАНИЗМЫ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ РЕЦЕПТОРОВ ГЛУТАМАТА В МЫШЦАХ ЧЛЕНИСТОНОГИХ И НЕЙРОНАХ МОЗГА ПОЗВОНОЧНЫХ

СПЕЦИАЛЬНОСТЬ 03.00.13 ФИЗИОЛОГИЯ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1997

Работа выполнена в лаборатории биофизики синаптических процессов Института эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН (директор — академик В. Л. Свидерский).

Научный консультант — доктор биол. наук, профессор Л. Г. МАГАЗАНИК

Официальные оппоненты:

доктор биол. наук, профессор А. А. АЛЕКСАНДРОВ доктор биол. наук, профессор Г. А. НАСЛЕДОВ-доктор биол. наук Л. Б. ПИОТРОВСКИЙ

Ведущее учреждение — Институт общей патологии и патологической физиологии РАМН.

Защита состоится мая 1997 года в/*" часов на заседании специализированного совета Д002.89.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН.

Адрес Института: 194223, Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, 44.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЭФиБ им. И. М. Сеченова РАН.

Автореферат разослан ^апреля 4997 года.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биол. наук, профессор

) ■ . ... ^/МАСЛОВА

• -бс-" - ..............у

Введение

Актуальность проблемы. Глугамат является возбуждающим медиатором в нервно-мышечных соединениях членистоногих (Takeuchi & Takeuchi, ¡964; Usherwood et al., 1968; Kawagoe et al., 1981) и ЦНС позвоночных животных (Curtis & Johnson, 1974; Evans et al., 1979; Shapovalov et al., 1980; Watkins & Evans, 1981). Как у членистоногих, так и у позвоночных синаптические эффекты глугамата реализуются через ионотропные постсинаптическиерецепторы, которые по их чувствительности к агонистам: квисквалагу (KB), Л-метил-Б-аспартату (НМДА), <г-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионату (АМПА) и каинату (КА), - подразделяются на рецепторы KB- (в мышцах членистоногих), НМДА-, АМПА- и КА-типов (в нейронах ЦНС позвоночных, см. McBain & Mayer, 1994). Роль рецепторов глутамата в функционировании двигательной системы членистоногих и нервной системы позвоночных трудно переоценить. Они передают возбуждающий пусковой сигнал от пресинаптической терминали к эффекторной клетке. Хотя в одном случае эффекторной клеткой является мышечное волокно членистоногих, а во втором -нейрон позвоночных, принципиальные механизмы генерации сигналов в обеих системах сходны. Отчасти это определяется единством механизмов синтеза, освобождения и утилизации глутамата. Вдобавок, все рецепторы глутамата имеют, вероятно, общее происхождение, на что указывает большая степень гомологии их первичных структур (McBain & Mayer, 1994). Однако, как недавно выяснилось, даже внутри одного типа нейрональные рецепторы могут различаться по селективности ионных каналов, например, к ионам Ca", и по их способности модулироваться другими веществами (Kutsuwada et al., 1992; Monyer et al., 1992; Ishii et al., 1993; Yamakura et al., 1993). Такая гетерогенность -"гетерогенность второго порядка" - связана с олигомерной структурой рецепторов глутамата, когда канал формируется несколькими субъединицами, а различия субъединичного состава могут влиять на свойства ионных каналов. Этот факт открывает возможность нового применения фармакологически активных веществ. Так приобретает особую актуальность поиск и создание новых избирательных блокаторов, которые бы "распознавали" ионные каналы определённого субъединичного состава. Такие вещества существенно облегчили бы анализ иорфо-функционального распределения различных рецепторов глутамата в ЦНС позвоночных животных.

.Другой важный аспект, определяющий актуальность нашего исследования, связан с уникальной ролью НМДА рецепторов для работы ЦНС в целом (Collingridge & Bliss, 1987;

Gustafsson & Wigstrom, 1988; Malenka, 1995). Эти рецепторы играют важную роль в реализации многих нейрональных функций, а также участвуют во многих патологических процессах, приводящих к отмиранию нейронов (Chen et al., 1992; Seif el Nasr et al., 1990; Weller et al., 1993). Например, такие важные явления как долговременная и кратковременная потеициации и депрессии синаптических сигналов в гиппокампе и других отделах головного мозга, ассоциируемые многими с формированием кратковременной и долговременной памяти, запускаются активацией НМДА рецепторов (Collingridge et al., 1983) Гиперактивация НМДА рецепторов глугаматом приводит к некрозу -нейродегенерации нервных клеток. Именно последним во многом определяется нейротоксичносгь глутамата (Lipton et al., 1993; Lipton & Rosenberg, 1994; Bonfoco et al., 1995).

Многообразие эффектов глутамата основано на многообразии свойств глутаматных рецепторов. Одной из особенностей физиологической регуляции НМДА и АМПА рецепторов является блок их открытых ионных каналов ионами Mg++ наружного раствора (Nowak et al., 1984; Mayer et al., 1984) и полиамином спермином цитоплазмы нейронов (Kamboj et al., 1995; Koh et al., 1995) соответственно. Большое число различающихся по химической структуре органических веществ также могут связываться в ионной поре после открывания канала, блокируя прохождение тока через канал. Такие вещества могут быть использованы как инструменты исследования структуры ионных путей в рецепторах и механизмов их открывания. Предполагается, что органические блокаторы НМДА каналов могут быть использованы как терапевтические средства для уменьшения паталогических последствий гиперактивации НМДА рецепторов (Chen etal., 1992; Rogawski, 1993). Этим определяется важность поиска новых эффективных блокаторов и изучение механизмов их действия. Такие исследования сулят перспективу создания новых лекарственных препаратов.

Представляемый цикл работ посвящен анализу механизмов работы ионотропных рецепторов глутамата мышц членистоногих, мотонейронов спинного мозга лягушки и нейронов мозга позвоночных животных. Однако исследование затрагивает значительно более широкий круг проблем, касающихся функционирования каналов в биологических мембранах и глутаматергических синапсах.

Цель и задачи исследования. Цель данной работы состояла в изучении механизмов активации и блокирования ионотропных ионных каналов рецепторов глутамата в условиях

целостного нервно-мышечного синапса и в изолированных фрагментах мембран. Основные задачи заключались в следующем:

1. найти новые избирательные блокаторы и изучить механизмы их действия на ионные каналы, активируемые глутаматом, в мышцах членистоногих и нейронах позвоночных;

2. исследовать роль механизмов "утилизации" глутамата в глутаматергических синапсах;

3. изучить природу рецепторов глутамата в возбуждающих синаптических входах на мотонейроны спинного мозга лягушки;

4. с целью более глубокого понимания структурно-функциональной организации ионных каналов рецепторов НМДА-типа, проанализировать зависимость механизма блокады открытого состояния каналов от строения новых производных адамантана.

Конкретные задачи исследования указаны в соответствующих разделах изложения. Научная новизна работы. Проведён детальный анализ функциональных характеристик ионных каналов рецепторов глутамата КВ-типа в мышцах личинки мухи и речного рака, глутаматных рецепторов мотонейронов спинного мозга лягушки, а также рецепторов НМДА-типа в нейронах коры головного мозга крыс.

Впервые из яда паука Агроре 1оЬа1а выделен низкомолекулярный нейротоксин полиаминной природы - аргиопин. Изучен механизм его действия на рецепторы глутамата. Выявлены два механизма блокады этим непроторенном рецепторов глутамата мышц членистоногих: потенциалозависимый блок закрытого канала и блокада открытого канала.

Впервые обнаружено явление неквантовой секреции глутамата из пресинаптической терминали. Выявлена важная роль механизма активного обратного захвата глутамата в функционировании глутаматергического синапса.

Обнаружена гетерогенность глутаматных рецепторов не НМДА-типов в различных возбуждающих входах в мотонейроны спинного мозга лягушки.

Проведён анализ строения и действия синтетических производных адамантана, оказавшихся эффективными блокаторами ионных каналов рецепторов КВ-типа и рецепторов НМДА-типа. Выявлены два места связывания этих веществ в канале НМДА рецептора. Возможность движения молекулы блокатора с одного места связывания на другое в канале НМДА рецептора продемонстрирована впервые.

Для производных адамантана исследован механизм взаимодействия проникающих

ионов и молекул бло кагора в ионном канале НМДА рецептора. Полученные данные позволяют предполагать существование мест связывания проникающих ионов в наружном "вестибюле" ионного канала вне его участка, на котором происходит полное падение мембранного потенциала (МП).

Сформулированные представления открыли новые направления в электрофизиологическом анализе механизмов действия биологически активных веществ на ионные каналы биологических мембран.

Практическое значение работы. Практическая значимость нашего исследования определяется важной ролью, которую играют глутаматные рецепторы в работе ЦНС. Как упоминалось выше, рецепторы НМДА-типа участвуют в патогенезе многих психических заболеваний, включая паркинсонизм, ишемический удар, и многих двигательных расстройств. Уже сейчас амантадин и мемантин - блокаторы ионных каналов глутаматных рецепторов НМДА-типа применяются для лечения паркинсонизма и других психических заболеваний (Schwab et al., 1969; Fischer et al., 1977; Brenner et al., 1989). Возникает проблема создания новых препаратов того же механизма действия, но более эффективных и имеющих меньше побочных эффектов. В нашей лаборатории обнаружено, что предложенные и исследованные производные адамантана обладают эффективной антисудорожной активностью (Antonov et al., 1995). Это означает, что предложенные вещества или их близкие аналоги, наряду с использованием в качестве инструментов научного исследования, впоследствии могли бы применяться как лекарственные препараты или, по крайней мере, могли бы служить основой для создания более эффективных и безопасных лекарств.

IПоложения. выносимые на защиту. 1. Глутаматные рецепторы членистоногих и позвоночных обладают общими фармакологическими характеристиками: нейротоксины из яда паука Argiope lobata и синтетические блокаторы, исходно изученные на глутаматных рецепторах мышц членистоногих, оказались эффективными неконкурентными антагонистами глутаматных рецепторов в спинном мозгу и ЦНС позвоночных животных. Механизмы эффектов нейротоксинов и синтетических блокаторов на все глутаматные рецепторы оказались сходными.

2. В условиях блокады систем обратного захвата глутамата обнаружено явление неквантовой секреции - утечки медиатора из пресинаптических окончаний в нервно-мышечных синапсах членистоногих. Таким образом, системы "утилизации" глутамата из

синаптической щели играют важную роль в поддержании нормального функционального состояния глугаматегических синапсов членистоногих н позвоночных.

3. Глутаматные рецепторы не НМДА-типа возбуждающих входов в мотонейроны спинного мозга лягушки являются гетерогенными. Моносинаптические входы от ретикулярной формации эффективно блокируются аргиопином, в то время как моносинаптические связи первичных афферентов с мотонейронами остаются резистентными к действию этого нейротоксина.

4. Производные адамантана (ИЕМ-вещества) имеют два места связывания в канале НМДА-рецептора. При МП до -90 мВ блокаторы связываются с местом, находящимся в начальной части канала. Гиперполяризация сопровождается движением молекулы блокатора к месту, расположенному более глубоко в канале. Находясь связанной с местом, расположенным в начальной части канала, молекула блокатора взаимодействует с воротным механизмом, предотвращая закрывание канала.

5. В канале НМДА-рецептора в процессе блокады происходит взаимодействие между молекулой блокатора и проникающими ионами. Механизм этого взаимодействия определяется существованием мест связывания ионов в наружном вестибюле канала. Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих собраниях: на IV Всесоюзной конференции "Физиология и биохимия медиаторных процессов" (Москва, 1985); IV Всесоюзной межуниверситетской конференции "Биология клетки" (Тбилиси, 1985); Всесоюзной конференции по нейронаукам памяти Д.С.Воронцова (Киев, 1986); симпозиуме "Рецепторы и ионные каналы" (Ташкент, 1986); Всесоюзной конференции "Исследование глутаматергических синапсов. Теоретические и прикладные аспекты" (Ленинград, 1987); Всесоюзной конференции "Физико-химические свойства биологических мембран" (Рига, 1988); Всесоюзном симпозиуме "Регуляция сенсомоторной функции" (Винница, 1989); Всесоюзной конференции "Механизмы действия медиаторов и гормонов на эффекторные клетки" (Суздаль, 1989); Всесоюзном симпозиуме "Одиночные ионные каналы в биологических мембранах" (Коктебель, 1989); Всесоюзной конференции "Фауна и экология пауков, скорпионов и ложноскорпионрв" (Ленинград, 1990); X Всесоюзном совещании по эволюционной физиологии памяти Л.А.Орбели (Ленинград, 1990); International symposium "Excitatory amino acids 1990" (Montegrotto Terme, Italy, 1990); V Всесоюзной конференции памяти Х.С.Коштоянца "Физиология и биохимия медиаторных процессов" (Москва, 1990); Всесоюзном симпозиуме "Ионные каналы в биологических

мембранах" (Коктебель, 1990); Международном симпозиуме по клеточным сетям (Паланга, 1992); Society for Neuroscience Meeting (Washington, 1993, 1996; Miami, 1994; San Diego, 1995).

Публикации. Основные положения работы отражены в 51 работах, опубликованных в отечественных и зарубежных изданиях.

Материалы и методы исследования Материалы. Экспериментальным материалом служили: нервно-мышечный препарат кожно-мускульного мешка личинки мясной мухи Calliphora vicina, мышечные волокна желудка рака Austropotamobius torrentium, изолированный спинной мозг лягушки Rana ridibunda и нейроны коры мозга крыс, растущие в первичной культуре ткани. Подробности препаровки нервно-мышечного препарата личинки мухи и мышц желудка рака были описаны ранее (Jan & Jan, 1976; Магазаник и др., 1984; Антонов и Магазаник, 1984; Antonov et al., 1989). Детальное описание препаровки, свойств и электрофизиологических подходов к изучению спинного мозга лягушки было сделано Шаповаловым и Ширяевым (1987). Процедура приготовления первичных культур нейронов коры головного мозга крыс описана ранее (Dichter, 1978; Antonov et al., 1995). Вкратце, на 16 дне беременности самки крыс Sprague-Dawley умервщлялись путем помещения их в закрытую камеру с С02. 10-12 зародышей вынимались и охлаждались до 5 "С. Мозг каждого из зародышей выделялся. Кора мозга механически отделялась и энзиматически диссоциировалась, а затем использовалась для приготовления первичных культур нейронов. В экспериментах использовались клетки, содержавшиеся в культуре 15-30 дней.

Растворы. Составы наружных растворов, использованных в наших экспериментах, приведены в таблице 1. Использование того или иного раствора определялось конкретными задачами экспериментов и типом препарата.

Для регистрации возбуждающих постсинаптических потенциалов и токов (ВПСП и ВПСТ) нервно-мышечных препаратов личинки мухи и спинного мозга лягушки микроэлектроды заполнялись 2,5 и 3 М КС1. Для регистрации токов одиночных каналов в мышцах рака в конфигурации cell-attached микропипетки заполнялись наружным раствором (таблица 1). Токи одиночных ионных каналов от фрагментов мембран нейронов коры мозга регистрировались в конфигурации outside-out микропипетками, заполненными растворами, состав которых приведён в таблице 2. Все растворы доводились до рН 7,2 -

7,6. Перед заполнением пипеток растворы фильтровали через бактериальный фильтр (М)Шроге 08) и хранили замороженными. Опыты проводились при комнатной температуре 19 - 24 "С, при этом перепад температур в одной серии экспериментов не превышал 3 "С. Таблица 1.

Ионные составы наружных растворов (вмМ), использованных в экспериментах.

Na* К* Са" ис С1" нгр о/ НСО,- нго4- Т.,Н. е., г.

муха 172 2,5 0,7 6,0 188 0,3 0,6 - - 42(c)

рак 220 5,4 13,5 2,5 257,4 - - - 10 (Т) -

Rana 112 2 2 0,5 119 1,2 9 2 - 5,5(г)

крыса ЭДТА ТТХ

а 140 2,8 1 - 144,8 - 0,0002 Ю(Н) -

б 70 2,8 0,5 - "73,8 - 1 0,0002 10(H) 140

' - наружные растворы, использованные в опытах на первичных культурах нейронов коры мозга крыс (а, б). Т - Tris; Н - HEPES; с - сахароза; г - глюкоза; ЭДТА -этилендиаминотетрауксусная кислота; ТТХ - тетродотоксин; Rana - озерная лягушка.

Таблица 2.

Ионные составы растворов (в мМ) для заполнения микропипеток при регистрации одиночных ионных каналов нейронов коры мозга (внутреннихрастворов).

Cs+ F' Cl- ЭГТА HEPES НМДГ

1 130 120 io 10 10 -

2 20 20 5 10 10 НО

НМДГ - jV-метил-П-глюкамии; ЭГТА - этиленгликольтетрауксусная кислота.

Регистрации потениитов. сипаптических токов и токов одиночных каналов. В нашем исследовании использовались практически все существующие электрофизиологические методы регистрации и анализа ионных токов. Синаптические потенциалы регистрировались вне- и внутриклеточно. Традиционный метод двухэлектродной фиксации МП применялся для регистрации спонтанных или, миниатюрных (мВПСТ), и вызванных ВПСТ в нервно-мышечных препаратах личинки мухи. На мышцах личинки для анализа кинетики активации ионных каналов, управляемых глутаматом, был использован флуктационный анализ вызванных глутаматом "шумов" постсинаптической мембраны (Магазаник и др., 1986; Ашопоу & Magazanik, 1988). Все эти методы были детально описаны в соответствующих публикациях.

Регистрировались токи всей клетки в конфигурации whole-cell и токи одиночных ионных каналов в конфигурациях cell-attached и outside-out методом локальной фиксации мембранного потенциала (Hamill et al., 1981). Использовались усилители: изготовленный самостоятельно в лаборатории на базе отечественных и импортных элементов (Самойлова и др., 1988; Антонов и Самойлова, 1991), фирмы List-Electronic ЕРС7 (Германия; Antonov et al., 1989), Axopatch 200 и ID (США; Antonov et al., 1995; Antonov & Johnson, 1996). Токи фильтровались с необходимой частотой и после перевода в цифровую форму с частотой 44 кГц записывались на видеокассету. Для анализа записи регистрации проигрывали, фильтровали в большинстве случаев с частотой 4 кГц, а затем оцифровывали сигналы с частотой 40 кГц. Для измерения времён открытых и закрытых состояний использовался 50% критерий (Colquhoun & Sigworth, 1995). Детали анализа токов одиночных каналов можно найти в соответствующих публикациях.

Результаты и обсуждение 1. Поиск лнгандов глутаматных рецепторов мышц членистоногих.

Для поиска новых лигандов рецепторов, активируемых глутаматом, были использованы два подхода. Один подход определялся большим прогрессом, достигнутым благодаря применению нейротоксинов, выделенных из ядов разных животных (змей, рыб, насекомых), при исследовании структуры и функции различных типов ионных каналов (см. Каменская, 1982; Adams & Olivera, 1994). Это побудило к поиску нейротоксинов, действие которых было бы направлено на глугаматные рецепторы, тем более, что фармакология глутаматных рецепторов к тому временил была ещё очень скудна. Естественно, исследователи обратились к ядам животных - энтамофагов. В частности, была обнаружена способность ядов, продуцируемых пауками из семейства аранеид (Hephila clavata, Kawai eta)., 1982, 1984; Araneus ventricosus, Kawai etal., 1983; Araneus gemma, Araneus trifasciata, Uscherwood et al., 1984; и Argiope lobata, Усманов и др., 1983), и яда роющих ос (Philanthus triangulvm F, May & Piek, 1979; Piek et al., 1980) нарушать нервно-мышечную передачу у членистоногих, т.е. блокировать глутаматергические синапсы (см. Jackson & Usherwood, 1988).

Другой подход заключался в направленном синтезе веществ и анализе их строения и действия на синаптическую передачу в нервно-мышечных соединениях личинки мухи. Эта работа проводилась совместно с В.Е.Гмиро (Институт экспериментальной медицины

РАМН). За основу для работы были взяты вещества производные адамантана (Магазаник и др., 1984).

1.1. Нейротоксины из ядов пауков.

Изучались механизмы действия ядов пауков на нервно-мышечную передачу личинки мясной мухи. Анализировался эффект ядов на параметры ВПСП и мВПСП. Были исследованы яды пауков 30 видов. Поскольку яды представляют собой многокомпонентные смеси, они могут вызывать нарушение синаптической передачи посредством нескольких механизмов. Например, из ядов пауков семейства Therididae (Latrodectus tredecimguttatus) наряду с а-латротоксином, обладающим пресинаптическим действием на синапсы позвоночных, был

выделен инсектолатротоксин, действующий мВПСП (g) и впст (в) зарегистрированные в

избирательно на синапсы насекомых (Магазаник мышечных волокнах личинки мясной мухи. 1 -

контроль (до подведения яда), 2 - после и др., 1990). Наибольший интерес с точки зрения инку6аци11 в растворе яда в течение 80 мин, 3 -

нашего исследования представляли яды пауков после 60 мин отмывки, семейства Araneidae (Argiope lobata, Araneus ocellatus, A. comutus, A. diadematus, A. marmoreus, A. quadratus, Metadentipalpis) и семейства Tetragnathidae (Tetragnaíha sp.). Все они обладали сходным типом действия (Антонов и др., 1990). Наиболее подробно изучено действие фракций и цельного яда паука Argiope lobata.

Через 20 мин после добавления в перфузирующий раствор лиофшшзированный яд A. lobata в концентрации 5 мкг/мл вызывал резкое снижение амплитуды ВПСП и заметно слабее снижал амплитуду мВПСП (рис 1). Частота мВПСП не изменялась. На уровне максимального эффекта амплитуда ВПСП составляла 3 ± 1 % (п = 5), а амплитуда мВПСП составляла 30 ± 3 % (п = 5) по отношению к контролю. Разница в степени подавления спонтанных и вызванных ответов показывает, что имеет место сочетание постсинаптических эффектов (снижение чувствительности к действию квантов медиатора) и пресинаптических эффектов (подавление вызванного раздражением освобождения медиатора). Действительно, на уровне максимального эффекта квантовый состав ВПСП,

JffffMC

-70 «а

JV/v^-'

V-

ím5

¡00 мкВ

20 м

та д.

Рис.1. Влияние яда. (5 мкг/мл) на ВПСП (а),

2В0

г -

ю ю

220 мл

подсчитанный как отношение амплитуд ВПСП и мВПСП, составил 12 ± 4 % (п = 5) от исходного. Отмывка приводила к восстановлению квантового состава ВПСП, но никогда не приводила к полному восстановлению амплитуды вызванных и спонтанных ответов (рис. 1).

Цельный яд подвергали фракционированию (Гришин и др., 1986). Все фракции тестировали на способность подавлять ВПСП и мВПСП. Наибольшей активностью обладали фракции 2 и 4 (рис. 2). Они существенно различались по характеру эффектов. Фракция 2 Рис 2 Разделение ада (100 мг) на биогепе Р-10 в 0,1

вызывала сильное падение М аммонийбикарбонатном буфере, рН 7,9, объём фракции 4

мл. Столбиками показана способность фракций, обладающих амплитуды вызванных ответов, максимальной аШ1ВНостью, снижать амплитуду ВПСП

при этом влияние на амплитуду (заштрихованные столбики) и мВПСП (незаилрихованные

столбики) в опытах на нервно-мышечных препаратах личинки спонтанных ответов было му)<и.за юо% принято полное подавление ответов.

незначительным. Очевидно, этой фракции присуще преимущественно пресинаптическое

действие: способность уменьшать квантовый состав ВПСП. Фракция 4 в одинаковой мере

уменьшала амплитуду ВПСП и мВПСП, что свидетельствует о её посгсинаптическом

эффеете. Далее производилась дальнейшая очистка фракции 4 и была определена структура

нейротоксина, обладающего посгсинаптическим действием (Гришин и др., 1986;

Магазаник и др., 1986). Этот нейротоксин получил название - аргиопин. Было установлено,

что аргиопин является низкомолекулярным соединением с молекулярной массой 636 Да.

В структуру аргиопина

ГШ О

А/х/хА

Н^ N | N N К

Рис. 3. Химическая структура аргиопина. входят аргинин и аспарагин, разделённые по'лиамином, и остаток 2,4-диоксифенилуксусной кислоты (рис. 3). Позднее из яда этого паука было выделено целое семейство низкомолекулярных нейротоксинов полиаминной природы (аргиопинины I - V и

псевдоаргиопинины I - III; Гришин и др., 1988). Нейротоксины сходной химической природы были выделены также из яда паука Nephila clavata ("Joro spider toxin", JSTX; Aramaki et al., 1986) и ядов других пауков семейства Araneidae (Adams et al., 1986; для обзоров Jackson & Usherwood, 1988; Magazanik, 1996) и из ядов роющих ос Philanthus triangulum F. (филантотоксин, PhTX; Eldefrawi et al., 1988; Anis et al., 1990). 1.1.1. Механизм ингибирования аргиопином рецепторов глутамата мышц насекомых.

При добавлении аргиопина в концентрациях 4,4 - 23,4 • 10'7 М к перфузирующему раствору наблюдалось параллельное уменьшение амплитуды ВПСП и мВПСП, что свидетельствует о его посгсинаптическом действии. Исследовалось влияние аргиопина на ВПСТ, регистрируемые методом двухэлектродной фиксации мембранного потенциала в мышцах личинки мясной мухи. Спад ВПСТ от 60 до 10 % амплитуды в контроле был экспоненциальным (рис. 4) и характеризовался величиной постоянной времени - г„. При -50 мВ тк= 8,9 ± 0,4 мс (п = 6). т„ была потенциалозависимой и увеличивалась с гиперполяризацией (Магазаник и др., 1984). В присутствии аргиопина наблюдалось концентрационнозависимое угнетение амплитуды и изменение кинетики спада ВПСТ. В присутствии аргиопина спад ВПСТ становился двухэкспоненциальным (рис. 4). Аппроксимация спадов двумя экспонентами позволяла определить постоянные времени быстрого (rs) и медленного (г„) компонентов и их амплитуды в точке максимума ВПСТ (А6 и AJ.

г6была всегда быстрее, а тм была медленнее, чем г„ (рис. 4). При -50 мВ и 4,4 • 10"7 Маргиопина 4,9±0,7 мс(п = 6), а тм = 18,6±6,1 мс(п = 6). Увеличение концентрации аргиопина сопровождалось уменьшением величины тб и увеличением величины г„. Такой эффект является характерным для блокаторов открытых ионных каналов, и поэтому модель последовательного блокирования ионных каналов (Adams, 1977; Neher& Steinbach, 1978; . Ruff, 1982; обзор феноменологии блока открытых каналов см. в Скок и др., 1987)

£3

~В0

Рис. 4. Влияние аргиопина (4,4 • 10 7 М) на ВПСТ мышц личинки мухи. У кривых указаны значения МП. Справа от кривых показано логарифмическое представление спадов ВПСТ от 100 до 5 %. Верхние кривые - до воздействия аргиопином, средние - после 30 мин инкубации с аргиопином, нижние -после 60 мин отмывки. Каждая кривая -результат усреднения 16 ответов.

приложима для описания эффектов аргиопина на глутаматные рецепторы:

2А + Р А + АР * А2Р* + Б >* А2Р'Б (1),

где А - молекула агониста (в рассматриваемом случае - глутамата); Р - рецептор глутамата в состоянии с закрытым каналом; Р*- тот же рецептор, но с открытым каналом; Б -молекула блокатора; ку - константа скорости ассоциации молекулы блокатора с открытым каналом; к. - константа скорости диссоциации блокатора с открытым каналом. В присутствии блокагоров, которые работают в соответствии с этой моделью, тб должна быть всегда быстрее, чем тК, т.к. длительность открытого состояния канала становится короче из-за связывания молекулы блокатора с открытым каналом. При этом должно наблюдаться концентрационнозависимое увеличение длительности вспышек - "bursts" одиночных каналов (время, проведённое в переходах между состояниями А2Р* и А2Р*Б в схеме 1). Считается, что медленный компонент в двухэкспоненциальном спаде ВПСТ отражает увеличение длительности вспышек одиночных ионных каналов в присутствии блокатора (Neher& Steinbach, 1978).

Используя схему 1, могут быть рассчитаны константы скоростей блокады открытого канала аргиопином ( Ruff, 1982). k_ рассчитывалась из уравнения: k. = [VTM + AJ(Ae-r6)]/(l +AJA6) (2).

рассчитывалась из уравнения: К = (1 !тм + 1/г6- 1/г, - *.)/[В] (3).

Константа диссоциации (/Q определялась из соотношения kjkt. Параметры блокады аргиопином ионных каналов, активируемых глутаматом, нервно-мышечньк соединений насекомых, определённые разными методами, показаны в таблице 3.

Таблица 3.

Параметры блокады аргиопином открытых ионных каналов глутаматных рецепторов мышц личинки мухи.

Метод регистр. t, °С МП, мВ К ■ ю-6, М-'с1 К с"1 кд- Ю-7, м п- число опытов

ВПСТ 21 -50 1,0 ±0,3 55 ± 12 6,7 ± 1,5 6

ВПСТ 21 -120 2,0 ± 0,3 72 ± 10 3,6 ± 0,4 4

"Шум" 8 -60 4,3 ± 0,2 36 ±2 0,84± 0,33 14

Приведены средние ± стандартные ошибки.

10г

Эффект аргиопина был слабо

потенциалозависимым: по мере гиперполяризации

происходило небольшое увеличение к, и к. (рис. 4;

таблица 3). Действие аргиопина было обратимым,

поскольку характеристики спада ВПСТ

возвращались к исходным после отмывки

аргиопина из раствора (рис. 4).

Влияние ариопина на кинетику активации

каналов, активируемых глугаматом, было

показано наиболее убедительным образом при

анализе флуктуации проводимости

постсинаптической мембраны в ответ на

аппликацию 1.-глутамага. Если в контроле

энергетический спектр этих флуктуаций

удовлетворительно аппроксимировался одной

функцией Лоренца (рис. 5, а), то в присутствии 4,4

• Ю-7 М аргиопина - двумя (рис. 5, б). Расчет

констант скоростей и равновесной константы

Рис. 5. Влияние аргиопина на взаимодействия аргиопина с открытым каналом среднее время открытого состояния ионных

. ._I_ш

10г /,Гц

каналов, а - спектр энергетической на основа,ши данных флуиуационного анализа плотности "глутаматного шума", дал значение Кя в 8 раз меньше, чем то, которое зарегистрированного при температуре 8 °С

и МП.= -60 мВ до воздействия аргиопином. бьш0 получено при анализе спада ВПСТ (таблица

Сплошная линия - аппроксимация функцией з) Это согласуется с данными работ (Ка\\-а1 й а1„ Лоренца. Частота среза (/„ указана

стрелкой) составляет 14 Гц, среднее время 1982> шз. 19И и5сЬепуоос) е( а1., 1984; Ва1ешап

открытого состояния (г= составила е1 ^ 1985^ в которых была показана большая 11,4 мс. 6 - спектр "глутаматного шума"

через 30 мин воздействия аргиопином (4,4 эффективность ядов пауков по отношению к

• 10-' М). Сплошные линии - аппроксимация ответам на эк30генный глугамат, чем к ответам на двумя функциями Лоренца. Частота среза

X, = 7 Гц, г, = 22,7 мс;/, = 48 Гц, т, = 3,3 мс. кванты медиатора. Однако в рассматриваемом случае, причины расхождения результатов могут быть чисто методическими. Флуктуации регистрировали при пониженной температуре (8 °С), поэтому скорость распада комплекса канал - блокатЬр могла быть.меньше, чем при нормальной температуре. Кроме того, при анализе ВПСТ удавалось провести измерения при нескольких концентрациях аргиопина,

мВ -ш -за

111111'

обеспечивая их большую надёжность. К сожалению, в опытах по анализу флуктуаций проводимости использовалась только одна концентрация аргиопина. Это могло привести к некоторому завышению значения определённому из этих опытов. Главное значение экспериментов по анализу "глутаматных шумов" заключалось в том, что они выявили изменения кинетики ионных каналов в присутствии аргиопина и тем самым

Рис. 6. Влияние аргиопина на амплитуду ВПСТ мышц личинки мухи при различных значениях МП. 1 - до воздействия аргиопином, 2 -через 30 мин после введения аргиопина, 3 - после 60 мин отмывки. Концентрация аргиопина 4,4 ■ 10"7 М.

10 нА

-40 мВ

'мор

1,1, ,1

-130 мВ

Рис. 7. Потенциалозависимое действие аргиопина на амплитуду ВПСТ. Примеры ВПСТ мышц личинки мухи, зарегистрированных через разные промежутки времени (показаны стрелками) после скачкообразного смещения МП от -130 до -40 мВ в присутствии аргиопина (4,4 ■ 1 Сг7 М).

доказали каналоблокирующий механизм его действия.

Другой особенностью действия аргиопина была потенциалозависимость его эффекта на амплитуду ВПСТ. Оказалось, что в присутствии аргиопина амплитуда ВПСТ в мышце личинки мухи нелинейно зависит от МП (рис. 6). Способность аргиопина снижать амплитуду ВПСТ в глутаматергических синапсах была сильнее выражена в области потенциала покоя (11X1) и уменьшалась по мере гиперполяризации. Так, если в контроле смещение МП от -40 до -50 мВ приводило к приращению амплитуды ВПСТ на 38,5 ±7,7 нА, то в присутствии аргиопина - всего на 4,8 ± 1,2 нА. Смещение МП на 10 мВ, но от -120 до -130 мВ, дало соответственно приращение амплитуды ВПСТ на 35,8 ± 6,7 и 34,8 ± 7,9 нА (п = 6). Поскольку сродство аргиопина к открытому каналу явно не снижалось по мере гиперполяризации (таблица 3), то очевидно аргиопин взаимодействует с закрытым глутаматергическим каналом. Чёткая потенциалозависимость этого процесса позволила оценить кинетику взаимодействия. Для этого в присутствии 4,4 • 10"' М аргиопина регистрировали ВПСТ, вызванные через разные интервалы времени после скачкообразного смещения МП от -130 до -40 мВ (рис. 7). Оказалось, что по мере увеличения времени после

смещения МП амплитуда ВПСТ снижается по экспоненте (рис. 7) с постоянной времени 4,5 ± 0,7 мс (п = 4). Константа скорости связывания аргиопина с закрытым каналом, рассчитанная из постоянной времени и концентрации аргиопина, составила (2,7 ± 0,5) • 108 М 'с'1. Ранее было определено, что концентрация аргиопина, приводящая в равновесных условиях (при МП = -40 мВ) к двукратному снижению амплитуды ВПСТ, составляет (4,4 ± 1,4) • 10"7 М. Эта величина принималась за минимальное значение Кд аргиопина с закрытым каналом. Рассчитанная из этих значений константа скорости диссоциации аргиопина с закрытым каналом составила 116 ± 68 с"1.

Таким образом, аргиопин блокирует рецепторы глутамата мышц насекомых посредством двух механизмов. Один механизм заключается в блокаде открытых ионных каналов. Этот процесс является слабо потенциалозависимым и описывается моделью последовательной блокады ионных каналов (схема 1). Второй - заключается в потенциалозависимой блокаде закрытых каналов. Его можно представисть как связывание аргиопина с рецепторами в закрытых состояниях (состояния Р и АР схемы I). Если блок открытых каналов рецепторов КВ-типа насекомых и членистоногих был показан для других нейротоксинов полиаминной природы близкой к аргиопину структуры (Abe et al., 1983; Bateman et al., 1985; Miwa et al., 1987; Kerry et al., 1988), то потенциалозависимый блок закрытых каналов был продемонстрирован только в наших исследованиях (Магазаник и др., 1986; Magazanik et al., 1987).

1.1.2. Эффект аргиопина на рецепторы глутамата мышц речного рака.

Механизм действия аргиопина на рецепторы КВ-типа мышц рака изучался методом регистрации токов одиночных каналов в конфигурации cell-attached. Микропипетки заполнялись наружным раствором (таблица 1), к которому добавлялся глутамат в концентрациях от 10"3 до 10"2 М и аргиопин в концентрациях от 10"9 до 10"6 М в зависимости от целей экспериментов. Рис. 8 показывает частоту вспышек одиночных каналов в течение 12 мин. после формирования контакта пипетки с мембраной в присутствии 10"9М аргиопина. В самом начале регистрации (во время 0) частота вспышек флуктуировала около 10 с"1, но имела тенденцию уменьшаться во времени, и через 1,2 мин активность каналов полностью исчезала (Блок А). С течением времени активность каналов не восстанавливалась. По аналогии с опытами на личинке мухи, мы попытались вызвать деблокирование рецепторов гиперполяризацией мембраны. В опыте, показанном на рис. 8, после 2,2 мин отсутствия активности каналов, вызванного блокадой аргиопином,

пипетка поляризовалась скачком на 100 мВ. При этом МП возрастал от величины ПП = -80 до ~ -180 мВ. Гиперполяризация мгновенно приводила к деблокированию и восстановлению первоначального уровня активности каналов. Реполяризация к ПП (после 5,1 мин гиперполяризации) не сопровождалась мгновенным блоком: блок наступал только через 11 мин нормальной активности каналов (Блок Б). Следует особенно подчеркнуть, что кинетика активации каналов в присутствии 10'9 М аргиопина практически не изменяется; средняя длительность вспышек оставалась неизменной (2,1 - 2,3 мс; рис. 8).

10* М-глутамата; Ю'* М-аргиопина

О 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10 Длительность вспышек (мс) Длительность вспышек (мс) Длительность вспышек (мс)

Рис. 8. Действие аргиопина (10"9 М) на активность каналов, активируемых глугаматом. Верхний график показывает изменения частота вспышек во времени после формирования высокоомного контакта пипетки с мембраной клетки. Исходно МП поддерживали на уровне ПП. После исчезновения активности каналов (Блок А) мембрану гиперполяризовали на -100 мВ. Гиперполяризация сопровождалась восстановлением активности. Затем мембрану реполяризовали до уровня ПП, что снова вызывало исчезновение активности (Блок Б). Внизу рисунка показаны распределения длительностей вспышек, полученные: в начальный период регистрации при ПП; в период гиперполяризации на -100 мВ; и после реполяризации до ПП.

Добавление в пипетку 10"6 М аргиопина приводило к тому, что блок наступал практически мгновенно после формирования высокоомного . контакта пипетки с мембраной. При ПП активность каналов была полностью блокирована (токи одиночных каналов не генерировались). Гиперполяризация вызывала потенциалозависимое увеличение частоты появления токов (рис. 9 а). При одном отдельно взятом МП частота токов была тем меньше, чем больше была концентрация аргиопина (рис. 9 б). Независимо от концентрации аргиопина гиперполяризация на -160 мВ приводила к полному деблокированию каналов.

Рис. 9. а - активность одиночных ионных каналов, зарегистрированная в конфигурации cell-attached, в присутствии 10'2 M глугамата и 10*" M аргиопина при различных уровнях МП. При ПП активность каналов была полностью блокирована (регистрация не показана). Частота активации каналов заметно увеличивалась при гиперполяризации от ПП = -80 мВ на -80 - -160 мВ. 6 - график зависимости частоты вспышек токов одиночных каналов (нормализованные величины) от величины гиперполяризации от уровня ПП; представлены данные 6 различных опытов. О мВ на оси абсцисс соответствует ПП, который составлял от -75 до -80 мВ. Приведены данные по пяти различным концентрациям аргиопина (Apr). Частоты вспышек нормализовали относительно частоты вспышек, полученной при гиперполяризации на -160 мВ. Абсолютная величина частоты вспышек при гиперполяризации на -160 мВ варьировалась от 8 до 30 Гц. При ПП (0 на шкапе абсцисс) для всех концентрациях аргиопина активность каналов отсутствовала.

Описанные выше эксперименты однозначно показывают, что аргиопин

о -40 -60 -80 -100 -120 -140 -1G0

Поляризация мембраны (мВ) обладает способностью блокировать

закрытое состояние рецепторов глутамата мышц рака и этот тип блокады является

потенциалозависимым. Потенциалозависимый блок приводит только к уменьшению

частоты активации рецепторов и, очевидно, не изменяет параметров открытого состояния

каналов.

Как и в случае мышц личинки мухи, сильная потенциалозависимость эффекта аргиопина на закрытые состояния каналов в мышцах рака позволяет определить скорости связывания и диссоциации аргиопина с закрытым каналом путём анализа скоростей релаксаций частоты активации каналов в ответ на включение (рис. 10) и выключение (рис. 11) гиперполяризационного скачка.

В присутствии 10° M аргиопина при ПП, когда рецепторы не активируются и наблюдается состояние полного блока, гиперполяризационные скачки на -120 и -160 мВ от ПП длительностью 7 сек вызывали деблокирование (рис. 10 а). Временной ход нарастания активности на уровне гиперполяризации усреднялся по 50 поляризационным скачкам. Графики на рис. 10 6 показывают распределения среднего числа открытых

Ю'! М-глутамата; 1С" М-аргиопина

-100 мЗ

ттт-Il Ц III! /Ill III fi

-SO мВ

^-rç-[П-!-гт

ю-21А-гпу7ама1а; 10"' м-арггопина

п_-320_г—2-- --. _£

I -160 |

тш¥- -

Т|# щ!

> 1 с <

Время (с) Время (с)

Рис. 10. а, примеры регистрации токов одиночных каналов в присутствии 10'2 М глутамата и 10е Маргиопина, в каждой из регистрации применялся гиперполяризационный скачок длительностью в 7 сек от ПП (0 мВ) на -120 мВ (три примера показаны слева) и на -160 мВ (три примера показаны справа). При ППтоки одиночных каналов были полностью блокированы. Гиперполяризация вызывала деблокирование, которое развивалось во времени: частота токов увеличивалась после начала скачка. ПП = -75 мВ. б, усреднённая динамика нарастания вероятности нахождения каналов в открытом состоянии, вызванного гиперпопяризацией на -120 и -160 мВ в присутствии 1 Сгг М глутамата и 10'6 аргиопина. Графики из опыта, иллюстрированного на - а. Графики получены в результате усреднения 50 гиперполяризационных скачков. Временной ход нарастания вероятности аппроксимировался экспонентой. Постоянные времени составили 5 и 3 сек для скачков на -120 и -160 мВ соответственно.

каналов (или вероятности пребывания каналов в открытом состоянии в определённый момент времени) для периодов гиперполяризации. Реполяризация в присутствии 1Сг6 М аргиопина приводила практически к мгновенной блокаде активности. Восстановление активности каналов при гиперполяризации аппроксимировалось экспонентой. Постоянные времени для гиперполяризаций на -120 и -160 мВ были 5 и 3 сек соответственно. На уровне равновесия, измеренного на 7 сек гиперполяризации, вероятности открытых состояний были 0,004 и 0,01 для скачков на -120 и -160 мВ соответственно.

Из-за того, что в присутствии Ю-6 М аргиопина блок наступал практически мгновенно (рис. 10 а), для измерения скорости блокирования каналов применяли меньшую концентрацию токсина (Ю-7 М). МП поддерживали на уровне, когда блок аргиопином не проявляется (гиперполяризация на -190 мВ, рис. 9 б). На этом уровне МП -260 мВ) вероятность открытого состояния каналов составляла 0,08, что соответствует частоте

10"' М-глутамага; 10"' М-аргаолина -60 ыВ поляризация о

-190 мВ

-190

ПГЩ1—1П-гг~т

20 ГТА'

4 С

тштггтш

ттаттгготп

Л'щмц'ш'циггц'да >'

10 20 О

Время (с)

С 1

И №1

'I ">|11 "III 1ИЦЩ ■ г гщч ■

-190 мВ - Ом0 г- Зс

10 20 Время (с)

Рис. 11. а, примеры активности токов одиночных каналов при реполяризации от -190 мВ до уровней поляризации в -60 (слева) и 0 мВ - уровня ПП (справа) в присутствии 10"2 М глутамата и 10"7 М аргиопина. Длительности реполяризационных скачков составляли 20 сек ПП = -78 мВ. 6, усреднённый временной ход спада вероятности нахождения каналов в открытом состоянии после реполяризации от -190 мВ до уровней поляризации в -60 (слева) и 0 мВ (справа) в присутствии 102 М глутамата и 10"7 М аргиопина. Показаны данные из опыта, иллюстрированного на - а. Каждый график является резупьтатом усреднения 42 регистрации. Графики аппроксимировались экспонентой с постоянными времени 7 и 3 сек для репопяризаций до -60 и 0 мВ соответственно.

появления вспышек около 40 с"'. От этого уровня гиперполяризации, скачком длительностью 20 сек мембрану реполяризовали до уровней поляризации -60 и 0 мВ (рис. 11 а). В последнем случае, очевидно, МП становился равным ПП. При этом, с течением времени, развивалась блокада активности каналов, скорость которой зависела от уровня реполяризации (рис. 11 а). Анализ, аналогичный описанному выше для деблокирования, показал, что при реполяризации до -60 мВ постоянная времени блока составила 7 сек, а для реполяризации до 0 мВ - 3 сек (рис. 11 б).

В нескольких экспериментах эффект аргиопина изучался в конфигурации оШ81с1е-ои1, позволяющей быструю смену наружного раствора. В присутствии аргиопина развивался типичный потенциалозависимый блок закрытых каналов. Было замечено, что если в

условиях гиперполяризации, когда каналы деблокированы, быстро убрать аргиопин из наружного раствора, то потенциалозависимый блок сохраняется в отсутствии аргиопина в течение довольно длительного времени, т.е. деполяризация приводит к блокаде активности каналов. Эти опыты свидетельствуют о двухстадийности блокады закрытого канала: вероятно, имеется место накопления аргиопина, связывание с которым само по себе не вызывает блокады, но облегчает доступ к рецептору.

Для концентраций аргиопина до 10'7 М потенциалозависимый блок закрытого состояния каналов является единственным наблюдаемым эффектом. Однако, повышение концентрации до Ю^М сопровождалось появлением ещё одного блокирующего действия. Если в присутствии Ю-7 М аргиопина токи одиночных каналов на уровне гиперполяризации на -120 мВ имели кинетику, которая не отличалась от кинетики в отсутствии токсина (рис. 12 a; Franke et al., 1986; Dudel & Franke, 1987), то в Ю-6 М при гиперполяризации на -160 мВ аргиопин вызывает очевидные изменения кинетики токов одиночных каналов (рис. 12 б). Наблюдается большое число коротких непроводящих состояний, отсутствовавших в контроле, которые прерывают проводящее состояние. Такое проявление блокады получило название "flickering block" и является типичным для блокады открытого канала (Neher & Steinbach, 1978; Neher, 1983).

Количественный анализ времён открытого состояния показан на рис. 12 в - е. Без аргиопина (рис. 12 в) и в присутствии 10"7 М аргиопина (рис. 12 г) распределения времен открытых состояний описывались одной экспонентой, а средние времена открытого состояния в этих условиях практически не отличались (0,37 и 0,32 мс). В присутствии 10"6 М аргиопина при гиперполяризации на -160 (рис. 12 д) и -100 мВ (рис. 12 е) распределения времён становились двухзкспоненциальными. При этом однозначно выявлялось появление дополнительного быстрого компонента (г;) средней длительностью 0,11 (рис. 12 д) и 0,13 мс (рис. 12 е). Очевидно, этот компонент был вызван укорочением длительности открытого состояния в результате блока открытых каналов молекулами аргиопина. Вдобавок, аргиопин вызывал появление дополнительного компонента в распределениях времён закрытых состояний, который, как известно, отражает распределение длительностей блокированных состояний (данные не показаны). Средняя длительность блокированных состояний (состояние АР*Б в схеме 1) составила 1,5 мс. К более детальному анализу кинетики блокады открытого канала и её потенциалозависимости мы вернёмся ниже при описании эффектов ИЭМ-веществ на рецепторы НМДА-типа.

10'2 М-глу; 10"1 М-Арг; -160 мВ поляризация

тлм—г^ и г~ ""падпг

г—^-ьг^пигт-^

Время («С) Бремя (мс)

Рис. 12. а, б, токи одиночных каналов, зарегистрированные в присутствии 10"! М глутамата (Гпу). В а, добавлен аргиопин в концентрации 10"' М. Для предотвращения блокады закрытых каналов МП поддерживался гиперполяризованныи на -120мВ. В б, добавлен аргиопин в концентрации 10'6 М. Для предотвращения блокады закрытых каналов МП поддерживался гиперлоляризованным на -160 мВ (ПП = -77 мВ); токи фильтровались в полосе 0-10 кГц. в, г, д, е, распределения времён открытых состояний из опытов, показанных на а, б. в, распределение, полученное в отсутствии аргиопина. г, распределение, полученное в присутствии 10~7 М аргиопина при гиперполяризации на -120 мВ. д, е, распределения в присутствии 10*М аргиопина в условиях гиперполяризации на -160 мВ (в) и -100 мВ (е). Распределения, показанные на в, г, аппроксимировались одной экспонентой с постоянной времени г. Распределения, показанные на д, и е, аппроксимировались двумя экспонентами с постоянными времени т, и т2.

Таким образом, как и в случае нервно-мышечного препарата личинки мухи, на мышцах рака аргиопин вызывает блок рецепторов глутамата посредством двух механизмов: потенциалозависимой блокады закрытого канала и блокады открытого состояния канала. Это означает, что для объяснения эффектов аргиопина на открытый канал может быть применена схема 1. Также как у насекомых, блокада закрытого

10'2 М-глу; 10'' М-Арг; -120 мВ поляризация

состояния рецепторов глутамата мышц рака, по-видимому, определяется связыванием с рецептором в состоянии Р или АР схемы 1.

Кинетика обоих типов блокады аргиопином может быть сопоставлена на нескольких объектах исследования. Как и в наших экспериментах на мышцах рака, в мышцах саранчи очень низкие концентрации аргиопина (< 10'9 М) полностью блокировали активность рецепторов глутамата; при этом блок был плохо обратимым (Kerry et al., 1988). В отличие от мышц рака, на этом объекте блокада активности наблюдалась даже в более низких концентрациях (Ю10 - 10'12 М). Среднее время открытого состояния ионных каналов, измеренное до исчезновения активности, уменьшалось до 0,4 мс, а время пребывания в закрытом состоянии увеличивалось. Авторы работы на саранче (Kerry et al., 1988) испытывали некоторые трудности, интерпретируя свои данные только в рамках модели блокады открытого канала. На наш взгляд, привлечение представлений о блокаде закрытого канала, применённых нами для объяснения данных, существенно облегчило бы трактовку.

На мышцах личинки мухи блокада открытого состояния каналов, активируемых глутаматом, проявляется в виде двух экспонент на спаде ВПСТ. Кд, определённая для блокады открытых каналов, находилась в пределах от 10'7 до 10"6 М, что хорошо совпадает с величиной Кь вытекающей из "flickering block" - блокады открытых каналов рецепторов мышц рака. Кроме того, аргиопин вызывал потенциапозависимый блок закрытых каналов на обоих объектах. Связывание аргиопина с закрытым каналом мышц личинки имело Кд = 4,4 • 10"7 М. Тем самым блокада закрытых каналов и блокада открытых каналов на этом объекте исследования были равноэффективяыми. Расчёты из приведённых выше данных дают величину константы скорости связывания аргиопина с закрытым каналом в мышцах рака, равную 3,3 • 106 М'сЭта величина практически на два порядка меньше, чем константа скорости связывания аргиопина с закрытыми каналами в мышцах личинки мухи. По-видимому, существенно меньшие скорости связывания и диссоциации аргиопина с закрытыми каналами определяют более медленную обратимость эффекта аргиопина на мышцах рака.

1.2. Синтетические блокаторы - производные адамантана.

В нашем исследовании в качестве блокаторов был использован специально синтезированный гомологический ряд производных адамантана (ИЕМ-1754, -1460, -1592 и -1857), общая структурная формула которых показана на рис. 13. Ранее была выявлена

способность ИЭМ-1460 блокировать открытое состояние активируемых глутаматом

ионных каналов в нервно-мышечных соединениях личинки мухи (Магазаник и др., 1984).

Здесь мы сопоставляем эффект этого вещества с его другими аналогами,

синтезированными позднее в Институте экспериментальной медицины РАМН В.Е.Гмиро.

Аппликация каждого из веществ в ванночку в

концентрации 1 • 10"5-1 • 10"4М вызывала умеренное

падение амплитуды и уменьшение постоянной

времени спада ВПСТ, вызванных раздражением нерва и Вещество

иэм-1754 в мышцах личинки мухи. В отличие от действия

(СН,)3ГГ. ИЭМ-1460

(сн,),сн(сн,)гГг. иэм-1592 аргиопина, в присутствии ИЭМ-1460, -1592 и -1854

/.(СН3)3С(СН3)гм*. ИЭМ-1857 г ' г '

Рис. 13. Структуры ИЭМ-веществ. спаД ВПСТ сохранял свой экспоненциальный характер; наблюдалось концентрационнозависимое уменьшение постоянной времени спада ВПСТ. В присутствии ИЭМ-1754 спад ВПСТ становился двухэкспоненциальным только при МП = -60 мВ. Все эти проявления характерны для блокады открытого состояния канала (схема 1; см. Скок и др., 1987). Для случая двухэкспоненциальных ВПСТ константы скоростей блокады могли быть определены из уравнений 2 и 3 (раздел 1.1.1). Поскольку для моноэкспоненциальных ВПСТ к. определить невозможно из-за ее маленькой величины, уравнение 3 для к¥ в этом случае существенно упрощается (величины 1/и к. малы по сравнению с другими параметрами уравнения): к+ = (1/тб - 1/г„)/[Б], - где тб - постоянная времени спада ВПСТ в присутствии блокатора; [Б] - концентрация блокатора. Полученные параметры блокады сведены в таблицу 4.

Таблица 4.

Константы скоростей блокады открытых каналов, активируемых глутаматом, нервно-мышечных соединений личинки насекомого.

Вещество п МП, мВ к„- 10' М'с-' К с"1 Кд, • 10 ' м

ИЭМ-1754 2 -60 0,008±0,001 136,7±33,8 1,74±0,66

ИЭМ-1460 3 -60 0,47±0,14 _ _

3 -100 0,48±0,2б - -

ИЭМ-1592 4 -60 1,78±0,79 _ -

4 -100 1,85±0,93 - -

ИЭМ-1857 5 -60 2,62±1,87 _ -

5 -100 2.78±2,47 - -

Приведены средние ± стандартные отклонения.

Данные свидетельствуют о существовании зависимости между строением катионной головки изучавшихся веществ и к„ которая увеличивалась по мере появления у атома азота более тяжёлых радикалов (от аммониевого у ИЭМ-1754 до т-бутилдиметиламмониевого у ИЭМ-1857). В то же время комплексы этих веществ с открытым глутаматергическим каналом диссоциируют медленно: к., очевидно, меньше, чем 20 с"!, что делает невозможным измерение этого кинетического параметра по изменениям спадов ВПСТ. Потенциалозависимосгь блокирующего эффекта ИЭМ-веществ практически отсутствовала. Данные по строению и действию этих веществ на рецепторы глутамата НМДА-типа нейронов коры мозга будут рассмотрены ниже.

Заключение по разделу 1.

Таким образом, место действия нейротоксинов из ядов пауков (Гришин и др., 1986; Магазаник и др., 1986; \4agazanik еХ а1., ¡987; АМопоу е1 а!., 1989) и ИЭМ-веществ (Магазаник и др., 1994) в рецепторе глутамата КВ-типа мышц членистоногих может быть указано достаточно точно. Это внутренние структуры ионного капаю, которые становятся доступными для взаимодействия с молекулой блокатора сразу же после перехода канала в открытое состояние. Нейротоксины из ядов пауков имеют второе место связывания в рецепторе глутамата мышц членистоногих, взаимодействие аргиопина с которым проявляется в потенциалозависимой блокаде закрытого канала (Магазаник и др., 1986;Magazanгketal., ¡987; АпШсп) е! а1., ¡989). Относительно природы этого места связывания можно лишь спекулировать. По-видимому, эти места доступны для аргиопина лишь после взаимодействия агониста с рецептором, но до перехода канала в открытое состояние. Предполагается также, что имеется "компартмент", в котором накапливаются молекулы аргиопина, и из которого имеется облегчённый доступ молекул к местам связывания в рецепторе глутамата (АгНогюу е/ а1., 1989).

2. Использование аргиопина для анализа механизмов функционирования глутаматергических синапсов.

2.1. Неквантовое освобождение глутамата в нервно-мышечном синапсе личинки насекомого.

В 1977 году Катц и Миледи открыли явление неквантового освобождения ацетилхолина. Они показали, что в условиях блокирования ацетилхолинэстеразы воздействие и-тубокурарином приводит к небольшой (порядка 100 мкВ) гиперполяризации мышечного волокна. Этот феномен получил название й-эффекта (УузкосИ е1 а1., 1983; ТЬеэкй", 1986). Такое действие В-тубокурарина - блокатора рецепторов ацетилхолина -может наблюдаться только в том случае, если мышечная клетка деполяризована медиатором, постоянно секретируемым из пресинаптической терминали.

По аналогии с холинергическим синапсом, можно было предполагать, что и в

глугаматергических синапсах наряду с освобождением медиатора дискретными порциями -квантами, имеет место неквантовая утечка. Для проверки подобного предположения необходимо было подавить высокоаффинный, натрий- и энергозависимый захват глутамата нервными окончаниями (основной путь его удаления из зоны синапса; Erecinska, 1987), чтобы выявить постсинаптический эффект накапливающегося глутамата.

20 мин

Эта серия экспериментов ставилась на нервно-мышечных препаратах личинки мухи. Регистрировали токи в условиях фиксации напряжения с помощью двух внутриклеточных микроэлектродов. Для блокады активного захвата глутамата применяли два способа: 1) полную или частичную замену ионов Na* в перфузирующем растворе на ионы Li+ (Clark et al., 1980); 2)

Рис. 14. а, б, г, примеры входящих токов, вызванных в мышах (МП = -50 мВ) личинки заменой ионов Na* в понижение температуры на 10 - 12 наружном растворе на ионы Li*, а, до, б, после обработки

препарата конканавалином А(3 • 10"6М, 30 мин, рН = 6,8). в, "С, что, замедляя метаболизм, зависимость амплитуды зарегистрированных внеклеточно

мВПСТ от амплитуды входящего тока (абсцисса), должно приводить к снижению вызванного заменой ионов. Ордината, отношение средних

амплитуд мВПСТ в контроле (AJ и в Li* растворе (AL). скорости захвата глутамата. Чёрные кружки без обработки конканавалино'м А; полые с же после замены

кружки, после обработки, г, эффект аргиопина (1 • 10 М,

период аппликации показан линией) на входящий ток, нормального раствора (таблица 1) вызываемый заменой ионов.

на литиевый (вместо Na+ добавлено 172 мМ Li*) возникал медленно нарастающий входящий ток, который, достигнув максимума, начинал медленно снижаться до уровня плато (рис. 14 а). Амплитуда тока на уровне плато достигала 37 ± 7 нА (п = 6) при МП = -50 мВ. Появление входящего тока сопровождалось значительным увеличением частоты мВПСТ (в 22,9 ± 7,7 раза, п = б) и уменьшением их амплитуды (в 1,3 ± 0,1 раза, п = 6). Возникло предположение, что как немонотонный характер входящего тока, так и последующее уменьшение амплитуды мВПСТ вызвано накоплением свободного глутамата в синаптической щели и десенситизацией рецепторов глутамата. Для проверки этого предположения были

поставлены опыты на препаратах, обработанных конканавалином А (3 • Ю-6 М), который, как известно, предотвращает десенсигизацию рецепторов глугамата (Mathers & Usherwood, 1976). При этом увеличивалась амплитуда входящего тока до 65 ± 12 нА (п = 7), этот уровень оставался устойчивым (рис. 14 б), и устранялось падение амплитуды мВПСТ (рис. 14 в). Такие факты свидетельствовали в пользу глутаматной природы наблюдавшегося явления. Применение блокатора глутаматных каналов - аргиопина позволило убедительно показать, что входящий ток вызван накоплением глугамата. Аргиопин, добавленный в раствор в концентрации 1 • Ю-6 М на уровне плато тока, приводил к его резкому снижению. Удаление аргиопина из раствора было способно восстановить интенсивность входящего тока (рис. 14 г).

мин

25нА

23° С

10° с

Рис. 15. Эффект понижения температуры на нервно-мышечный синапс личинки мухи. МП в мышечной клетке фиксировался на уровне -50 мВ. а, входящий ток, вызванный в мышечной клетке понижением температуры с 23 до 10 °С, подавляется аргиопином (1 ■ 10"6 М; период аппликации отмечен линией), б, мВПСТ, регистрируемые внеклеточно при 23 и 10 "С. Та же клетка, что и на - а.

Для того чтобы выявить источник накапливающегося глутамата в ЬГ-растворе (неквантовое освобождение или участившееся спонтанное квантовое), были поставлены опыты, в которых температура раствора снижалась с 21 до 10 °С. Оказалось, что само такое снижение без замены на 1л* вызывает появление входящего тока амплитудой 17,8 ± 2,1 нА (п = 4) (рис. 15 а), но частота мВПСТ при этом снижается в 2,8 ± 0,4 раза (рис. 15 б). Этот "холодовой" входящий ток вызван накапливающимся глутаматом, поскольку он также мог быть блокирован аргиопином (рис. 15 а).

Независимым свидетельством в пользу глутаматной природы тока являются результаты анализа его флуктуаций. Оказалось, что спектр мощности "мембранного шума" на уровне плато тока, вызванного охлаждением, аппроксимируется одним лоренцианом с частотой среза 13,6 ± 0,6 Гц (п = 11) при 10 "С (рис. 16 а). Для сравнения: частота среза

шума, который вызывается аппликацией глугамата на том же объекте при 8 °С, составляет 13,2 ± 0,2 Гц (п = 14; Магазаник и др., 1986).

Рис. 1Б. Спектры энергетической плотности "синаптического шума". Абсцисса, частота (Гц); ордината, нормализованная плотность спектра шума, регистрируемого внеклеточно. а, спектр, полученный при 10 "С. б, спектр, полученный при 22 °С. Вставки показывают примеры шума, регистрируемого в экстрасинаптической (Э) и синаптической (С) зонах. Линии, аппроксимации функциями Лоренца с частотами срезов (указаны стрелками) 14 Гц (а) и 28 Гц (б).

Неквантовые потери глугамата из нервных окончаний требуют для их компенсации достаточно мощного транспорта глугамата внутрь нервных окончаний. Однако, в исследованном синапсе эта компенсация, по-видимому, не отличается полнотой. Об этом свидетельствует спектральный анализ шума, который может быть зарегистрирован при комнатной температуре (22 °С) фокальным внеклеточным электродом в синаптической области (обнаруживаемой по появлению мВПСТ). В 8 из 14 опытов этот "синаптический шум", в отличие от шума в экстрасинаптической зоне, был интенсивнее и по характеру полностью соответствовал шуму, вызываемому аппликацией глутамата. Спектр мощности "синаптического шума" аппроксимировался функцией Лоренца (рис. 16 б) с частотой среза 26,3 ± 1,0 Гц (п = 8), что вполне соответствует данным (Магазаник и др., 1984, 1986). В пользу глутаматной природы "синаптического шума" говорит также хорошее совпадение температурных зависимостей этого шума и спада мВПСТ в том же препарате. При снижении температуры от 22 до 10 "С частота среза шума изменялась в 1,95 раза, а постоянная времени спада мВПСТ - в 2,2 раза (средние по п = 4). Очевидно, несмотря на нормально функционирующую систему захвата, в "синаптической щели" может создаваться концентрация глугамата, достаточная для того, чтобы вызывать синаптический шум. Это может означать, что активный захват не полностью компенсирует неквантовое поступление глугамата. Хотя кажется более вероятным, что система захвата глугамата начинает интенсивно работать только после того, как содержание глугамата превысит

определённый пороговый уровень.

Рис. 17. Схема процессов, происходящих в пресинаптическом окончании и синаптической щели в нервно-мышечных синапсах личинки мухи. ПСО - пресинаптическое окончание; ПСК - постсинаптическая клетка; 1 - рецепторы постсинаптической мембраны, управляемые глутаматом, с закрытым каналов; 2 - рецепторы постсинаптической мембраны,

управляемые глутаматом, с открытым каналом (стрелка - ток ионов); 3 - пресинаптические везикулы, соответствующие квантам медиатора; 4 - молекулы свободного глутамата; 5 - система захвата глутамата; 6 - ионы натрия; 7 - ионы лития. Стрелки на левой схеме показывают циркуляцию глутамата между пресинаптическим окончанием и синаптической щелью. Блокирование системы захвата ионами и* приводит к накоплению глутамата в синаптической щели за счёт его неквантового освобождения.

ПСК

Физиол. растВор

ПСК

На рис. 17 представлена схема, которая, по-видимому, отражает сущность обнаруженных явлений. В нормальных условиях (левая часть схемы) из пресинаптического окончания непрерывно секретируется глутамат. Однако, "мощностей" захвата медиатора достаточно не только для того, чтобы переносить большую его часть обратно, но и для эффективного и быстрого удаления глутамата, освобождающегося квантами. Поэтому квантовый медиатор, действуя на постсинаптическую мембрану, приводит к генерации "нормальных" мВПСТ. После блокады системы захвата (правая часть схемы) ионами ЬГ происходит накопление глутамата в синаптической щели из-за постоянного пополнения его неквантовым освобождением. При этом в мышечном волокне развивается входящий трансмембранный ток. При аппликации экзогенного глутамата такой входящий ток может быть вызван концентрацией 3 • 10"4 М (Антонов, 1984; Магазаник и др., 1984). Это дает основания полагать, что за счет неквантового освобождения в синаптической щели создается концентрация медиатора от 3 • 10'4 до 10° М. Безусловно, при этом развивается десенситизация постсинаптической мембраны и происходит уменьшение амплитуды мВПСТ.

2.2. Гетерогенность возбуждающих синаптических входов в спинальных мотонейронах лягушки.

2.2.2. Аргиопин как антагонист действия глутамата в спинном мозгу лягушки.

Для детального анализа медиаторной роли глутамата и других возбуждающих аминокислот необходимо использование достаточно сильных и избирательных

Глу

J U

Асп

Аргиопин 2.3Х10"7М

•Л

антагонистов - веществ, способных эффективно нарушать передачу через глутаматергические синапсу. Поскольку аргиопин оказался эффективным неконкурентным антагонистом рецепторов глутамата КВ-типа мышц

членистоногих,

а лос Рис. 13. Ответы мотонейронов изолированного спинного мозга

р д т вля ь ЛЯГуШКИна аппликацию глутамата (Глу) и аспартата (Асп; концентрации

10 мВ

1 мин

1*10'<М

5*10^

МО^М 5Х10_<М

принципиально важным

показаны под ответами), а, контроль, амплитуда деполяризаций,

вызванных глутаматом, больше, чем амплитуды деполяризаций, исследовать характер вызванных аспартатом. 6, 2,3 ■ 10'7 М аргиопина (30 мин перфузии) уменьшает амплитуду ответов на глугамат, но не изменяет ответы на действия аргиопина на аспартат. »

глутаматные рецепторы в ЦНС позвоночных, тем более, что к тому времени имелись отрывочные данные об угнетающем эффекте некоторых цельных ядов на возбуждающую синаптическую передачу в ЦНС (Kawai et al., 1984; Vyklicky et al., 1986).

Опыты ставились на поясничном отделе изолированного спинного мозга лягушки

Rana ridibunda. Исследовались ответы 'мотонейронов, исходный МП которых был не ниже -65 мВ. Было исследовано влияние аргиопина на амплитуду деполяризационных ответов мотонейронов, вызванных кратковременной аппликацией глутамата . или аспартата. С помощью внутриклеточного микроэлектрода регистрировали изменения МП

К-10'^)

Рис. 19. Кривые "доза-эффект" мотонейронов, возникающие при пропускании

деполяризаций, вызванных глутаматом и ванночку с препаратом в течение 30 сек

аспартатом, в мотонеиронах до и после г згу

аппликации аргиопина. Кружки (1 и 2) раствора (таблица 1), содержащего различные эффект глутамата; треугольники (3 и 4) ,

эффект аспартата. Контрольные кривые концентрации глутамата (3 ■ 10"5 - 1,5 • 10"3 М; рис. (закрашенные символы); в присутствии аргиопина 2,3 • Ю-7 М (пустые символы).

18 а) или аспартата (1 ■ 10ч - 1 • 10"3 М; рис. 18 б). Интервал между последовательными аппликациями был не менее 2 мин, что оказалось достаточным для хорошей воспроизводимости результатов. Амплитуда деполяризационных ответов (0,5 - 40 мВ) корректировалась с учетом нелинейности изменений потенциала (Ка1г & ТЬез1еАГ, 1957). Ответы на аппликацию глутамата и аспартата в широком диапазоне концентраций использовались для построения в каждом опыте кривой "доза - эффект" (КДЭ) сначала в исходном растворе (контроль), а затем после добавления к нему аргиопина (2,3 • 10~8 - 5 • 10'7 М). В контроле КДЭ аспартата имела типичный Б-образный характер с линейным участком, соответствующим 1,5 • 10"4 - 5 • 10"4 М (рис. 19), при максимуме ответов 31 ± 3 мВ (п = 9). КДЭ глутамата была более сложной. Она состояла из двух ветвей: начальная низкоамплитудная ветвь лежала в области концентраций от 1 • 10 5 до 1 - 1,5 • 10"4 М, амплитуда ответов в этой области не превышала 15-20 мВ; последующая ветвь КДЭ глутамата по своему начальному ходу совпадала с КДЭ аспартата, но превосходила ее по максимуму ответов 43 ± 4 мВ (п = 11) (рис. 19). Такое соотношение ответов на глутамат и аспартат было получено во всех 9 опытах. В присутствии аргиопина в концентрации 2,3 • 10"7 М КДЭ аспартата оставалась неизменной, а КДЭ глутамата меняла свой ход: полностью исчезала начальная ветвь кривой, а последующая снижала свой максимум и ее ход практически совпадал с КДЭ аспартата (рис. 19). Меньшие концентрации аргиопина соответственно уменьшали амплитуду начальной ветви КДЭ глутамата. ЭД50 этого эффекта аргиопина составила (7,5 ± 3,7) ■ 10"! М в 4 опытах. Повышение концентрации аргиопина до 5 • 10"7 М не приводило к изменению КДЭ аспартата и дальнейшему углублению влияния на КДЭ глутамата. В большинстве опытов (6 из 10) эффект аргиопина не устранялся его отмыванием в течение 2 часов, в остальных четырех ослабление эффекта было лишь частичным. Состояние мотонейронов, судя по уровню мембранного потенциала и антидромным потенциалам действия (ПД), оставалось хорошим.

Наблюдавшиеся эффекты аргиопина, очевидно, являются следствием его постсинаптического действия на мотонейроны, поскольку они не изменялись после блокады освобождения медиатора, вызванного ионами марганца. Сложный ход КДЭ глутамата очевидно отражает существование по крайней мере двух популяций рецепторов глутамата. Одна из них, активируемая как глутамагом, так и аспартатом, обуславливает высокоамплитудную ветвь КДЭ глутамата и нечувствительна к блокирующему действию аргиопина. Другая популяция активируется только глутаматом, причём существенно

меньшими его концентрациями. Именно она практически необратимо блокируется аргиопином. Характер изменений начальной, "чисто глутаматной", ветви КЭД в ответ на разные концентрации аргиопина свидетельствует о преимущественно неконкурентном его действии на эту популяцию рецепторов глутамата в мотонейронах лягушки.

Наши данные позволяют говорить о природе рецепторов глутамата в мотонейронах лягушки. Поскольку аспартат является специфическим агонистом рецепторов глутамата НМДА-типа, можно заключить, что именно эти рецепторы являются резистентными к действию аргиопина, или что эффект аргиопина на этот тип рецепторов не выявляется с помощью методов, применённых в наших экспериментах. Популяция рецепторов, активируемых только глутаматом, относится, по-видимому, к рецепторам не НМДА-типа (Antonov et al., 1987; Антонов и др., 1988). Именно они эффективно блокируются аргиопином. Наши данные хорошо согласуются с другими исследованиями действия цельных ядов пауков на рецепторы глутамата в ЦНС позвоночных (Saito el al., 1985; Jackson et al., 1985; Jackson et al., 1987).

2.2.3. Морфо-функционалыюе разделение рецепторов не НМДА-типов в спинальных мотонейронах лягушки.

Глугаматергическая природа возбуждающих синаптических входов в мотонейроны лягушки является доказанной (см. Шаповалов и Ширяев, 1987). В связи с появлением нового фармакологически активного нейротоксина - аргиопина, эффект которого проявляется в блокаде рецепторов глутамата не НМДА-типов, представлялось интересным исследовать природу постсинаптических рецепторов в глутаматергических синапсах спинного мозга. Для полноты фармакологического анализа мы также использовали; 2-амино-5-фосфоновалериановую кислоту (АФВ) - специфический, конкурентный блокатор узнающих центров НМДА-рецепторов (Watkins & Evans, 1981; Corradetti et al., 1985; Watkins & Olverman, 1987; Lodge et al., 1988); кинуренат (Кин) - неспецифический антагонист рецепторов глутамата (Jahr & Yoshioka, 1986; Watkins et al., 1987); и 6-циано-7-нитроквинаксолин-2,3-дион (ЦНКК) - конкурентный антагонист узнающих центров рецепторов не НМДА-типов (Fletcher et al., 1988).

Эксперименты проводились на препарате изолированного спинног- мозга лягушки Rana ridibunda. Синаптические потенциалы вызывались раздражением 9-го и 10-го дорзальных корешков (ДК), небольших групп или отдельных дорзальнокорешковых волокон, а так же ретикулярной формации (РФ) на уровне дна IV желудочка. Детали

стимуляции и регистрации описаны ранее (Шаповалов и Ширяев, 1987; Калинина и Курчавый, 1988).

В контроле ВПСП, вызванные супрамаксимальным раздражением ДК, состояли из нескольких компонентов (рис. 20 а). Во всех случаях через 5-10 мин после начала перфузии раствором, содержащим 3 ■ №7 -1 • 10 5 М аргиопина, отчётливо наблюдалось увеличение амплитуды раннего компонента ВПСП, что могло приводить к генерации ПД. К 30 мин перфузии аргиопином ранний моносинаптический компонент ВПСП возвращался к контрольному уровню. Амплитуда ди- и полисинаптических компонентов существенно снижалась (рис. 20 а). К 45 мин ответ практически не содержал поздних компонентов. Увеличение концентрации аргиопина или удлинение периода наблюдений не приводило к качественным изменениям. На всём протяжении эксперимента клетки сохраняли способность генерировать антидромный ПД неизменной.

Резистентность моносинаптического ответа к блокирующему действию аргиопина подтверждается экспериментами, в которых стимулировались не задние корешки целиком,

Рис. 20. Эффект аргиопина (Apr) на ВПСП, регистрируемые внутрикпеточно в мотонейронах лягушки, а, ВПСП, вызванные стимуляцией дорзапьного корешка (усреднение по 16 ответам). Время после аппликации аргиопина показано рядом с каждым из ответов. Нижний ответ представпяет электротонический компонент, зарегистрированный в условиях блокады освобождения медиатора, б, ВПСП, вызванные стимуляцией одиночного афферентного аксона дорзальных корешков внутриклеточным микроэлектродом (усреднее 32 ответов). 61, потенциал действия, зарегистрированный внугриклеточно в афферентном аксоне; 2, контроль; 3,5 мин и 4,10 мин после аппликации аргиопина. Стрелки показывают моносинаптический компонент ВПСП. а, и б, два разных мотонейрона.

а проводилась внутриаксональная стимуляция отдельных афферентов (п = 3). Пример усреднённого элементарного ВПСП, состоящего из моносинаптического и полисинаптического компонентов, каждый из которых флуктуировал по амплитуде, представлен на рис. 20 б. Латентный период моносинаптического ответа составлял 1,9 мс при измерении от пикаПД в афферентном аксоне. Аргиопин в концентрации 3 • 10'7 М уже через 5 мин. резко уменьшал амплитуду полисинаптической составляющей, в то время как моносинаптический ВПСП даже возрастал (рис. 20 б). Через 10 мин ответ состоял только из моносинаптического ВПСП.

Таким образом, выяснилась существенная разница во влиянии аргиопина на моно-и полисинаптическую передачу по сенсомоторному пути: после кратковременного усиления моносинаптические ВПСП возвращались к исходному уровню, тогда как полисинаптические эффективно подавлялись.

Кроме сенсомоторных входов, мотонейроны обладают моносинаптическими связями с нейронами других отделов мозга, в том числе ретикулярной формации и проприоспинапьных структур. Было необходимо исследовать характер влияния аргиопина на моносинаптические ВПСП иного происхождения. С этой целью сопоставлялись ВПСП, вызываемые в одном и том же мотонейроне стимуляцией ДК и РФ ствола мозга. Рассматривали ответы, которые, судя по длительности латентного периода, можно отнести

а б

Контроль Apr 3*ю"м ю'м 3>1о"м

Рис.21. Эффекты аргиопина (Apr) на ВПСП, вызванные стимуляцией ретикулярной формации (РФ) и дорзапьных корешков (ДК, усреднение 10 ответов), а, эффект 3 • 10"7 М аргиопина на ранние и поздние компоненты РФ ответов. Показано время после аппликации аргиопина. 6, эффект разных концентрации аргиопина (концентрации указаны справа) на моносинаптические РФ и ДК ВПСП, зарегистрированные водном мотонейроне. Время после начала аппликаций аргиопина: 3 • 101 М -30 мин; 1 • 10 s М - 8 мин; 3 • 10"6 М - 4 мин. а, и б, два разных мотонейрона.

к моносинаптическим: не более 2,6 мс для РФ-ВПСП (Ширяев, 1972), 3,5 мс для химического компонента ДК-ВПСП.(8Ьароуа1оу& БЫпаеу, 1980). В этих экспериментах

(n = 18) было возможно, изменяя интенсивность стимуляции, регистрировать сложные ВПСП, состоящие из ранних и поздних компонентов (рис. 21 а), и простые моносинаптические ВПСП (рис. 21 б). Обнаруживалось принципиальное различие во влиянии аргиопина на РФ- и ДК-ВПСП. После 10 мин. перфузии аргиопином (3 • 10"7 М) сложные РФ-ВПСП увеличивались по амлитуде, в то время как после 30 мин. амплитуды обоих ВПСП- сложных (рис. 21 а) и простых (рис. 21 б) - падали. В нескольких экспериментах к 60 мин. РФ ответы полностью исчезали. Аргиопин блокировал моносинаптические РФ-ВПСП в 13 из 18 экспериментах, средняя амплитуда ВПСП в этих 13 опытах после 30 - 40 мин. экспозиции в аргиопине (3 • 10"7 М) составила 46,8 ± 4,7 % от исходного. С увеличением концентрации аргиопина эффект развивался быстрее. В оставшихся 5 опытах какого-либо действия аргиопина (3 • 10"6 М) на моносинаптические РФ-ВПСП в течение 40 мин. обнаружено не было. Моносинаптические ДР-ВПСП, регистрируемые в тех же самых нейронах, были резистентны к действию аргиопина (рис. 21 б).

Наши эксперименты показали, что моносинаптические ДР и РФ входы различаются. Очевидно, что оба моносинаптических входа являются глутаматергическими, т.к. Кин в 2 10"3 М эффективно блокировал все ответы. Оба синаптических входа являются устойчивыми к действию АФВ. Это вещество в концентрации 1 • 10"4 М устраняло деполяризацию мотонейронов, вызванную аппликацией аспартата, но лишь слегка уменьшало амплитуду поздних ДР-ВПСП. ЦНКК в одинаковой степени подавлял поздние ДР- и РФ-ВПСП, но эффективнее блокировал моносинаптические РФ-ВПСП, чем моносинаптические ДР-ВПСП.

Проведённые эксперименты позволяют заключить, что рецепторы глугамата не НМДА-типов вовлечены в передачу сигналов в моносинаптических входах в мотонейроны лягушки. Используя аргиопин и ЦНКК, удалось выявить гетерогенность этих рецепторов. Так, не НМДА рецепторы, резистентные к действию аргиопина и более устойчивые к действию ЦНКК, очевидно, участвуют в передаче в сенсомоторных моносинаптических входах, в то время как в большинстве супраспинальных моносинаптических входов не НМДА рецепторы эффективно блокируются аргиопином и ЦНКК. Позднее группа не НМДА рецепторов была разделена на рецепторы АМПА- и КА-типов (см. McBain & Mayer, 1994). Было показано, что аргиопин (argiotoxin6J6) является неконкурентным блокатором АМПА и КА рецепторов, что хорошо согласуется с нашими данными. При этом аргиопин

способен избирательно связываться с открытым состоянием АМПА (Herlitze et al., 1993; Washburn & Dingledine, 1996) и KA рецепторов (Brackley et al.., 1993) определённого субъединичного состава. Предполагается, что гетеромерные не НМДА-рецепторы, обладающие высокой проводимостью к ионам Са++, являются наиболее чувствительными к действию токсинов полиаминной природы (Tsubokawa et al., 1995). Используя вышеизложенное для интерпретации наших данных, полученных на спинном мозге лягушки, можно предположить, что моносинаптические ДК связи содержат рецепторы АМПА- или КА-типа, канал которых обладает низкой проводимостью для ионов Са" В большинстве моносинаптических РФ связей задействованы рецепторы с высокой проводимостью к ионам Са++. Поскольку данные относительно эффекта аргиопина на НМДА рецепторы не являются принципиальными для интерпретации наших результатов, мы не проводим их обсуждение (см. Raditsch et al., 1993; Ruppersberg et al., 1994; McBain & Mayer, 1984).

Заключения no разделу 2.

Таким образом, входе проведённого исследования выявлена важная роль системы высокоаффинного, натрийзависимого захвата глутамата для функционирования синапса в целом (Antonov & Magazanik, 1988; Антонов, 1989; Антонов и Магазаник, 1989). Обнаружено явление неквантового освобождения глутамата. Можно полагать, что оно играет важную роль в обеспечении работоспособности двигательной системы членистоногих в условиях пониженных температур. Позднее, с использованием тех же подходов, что и в нашем исследовании, была выявлена важная роль захвата глутамата, как фактора, определяющего амплитуду и временной ход синоптических ответов в глутаматергических синапсах ЦНС позвоночных (Hestrin et al., 1990; Isaacson & Nicoll, 1993; Sarantis et al., ¡993; long & Jahr, 1994). Важная роль захвата глутамата в синапсах ЦНС позвоночных позволяет говорить об общности основных тлений синоптического эпектрогенеза для всех глутаматергических систем.

Таким образом, аргиопин оказался эффективным неконкурентным антагонистом рецепторов глутамата нейронов позвоночных (Antonov et al., 1987; Шупляков и др., 1987; Антонов и др., 1988). Механизм его действия - блокада открытых ионных каналов, активируемых глутаматом, - совпадает в мышцах членистоногих и нейронах позвоночных. Во всех типах нейрональных рецепторов аргиопин способен эффективно блокировать лишь рецепторы определённого субъединичного состава, что делает его уникальным для исследования глутаматной рецепции. С помощью аргиопина выявлена гетерогенность рецепторов глутамата не НМДА-типа в мотонейронах лягушки (Antonov et al., 1989; Калинина и др., 1989; Antonov et al., 1991). Существует морфо-фунщионапъное разделение этих рецепторов в мотонейронах. Вероятно, не НМДА-рецепторы, обладающие большой проводимостью к ионам Ся++, вовлечены в передачу в моносинаптических супраспинальных входах в мотонейроны. Рецепторы, имеющие меньшую проводимость к ионам ('а'*, участвуют в передаче в моносинаптических сенсомоторных связях.

3. Анализ строения и действия ИЭМ-веществ на рецепторы глутамата НМДА-типа. 3.1. Феноменология блокады.

Все ИЭМ-вещества ингибировали токи, регистрируемые в конфигурации whole-cell,

НМДА

ИЭМ-1754

160 пА

Юс

10 мкМ НМДА 10 мкМ Гли

+7,5 мкМ ИЭМ-1754

5 пА

+30 мкМ ИЭМ-1857

40 мс

Рис. 22. Бдокада НМДА-акгивируемых токов всей клетки и токов одиночных каналов ИЭМ-веществами. а, ингибирование токов всей клетки, вызванных при МП = -80 мВ аппликацией 1 • 10 5 М НМДА + 1 • 10"5 М глицина, ИЭМ-веществами. б, примеры токов одиночных каналов, зарегистрированных при МП = -80 мВ в присутствии 1 • 10® М НМДА + 1 ■ 10"5 М глицина в контроле (верхняя регистрация) и в присутствии ИЭМ-веществ. Вещества и концентрации показаны над соответствующими регистрациями.

в нейронах коры мозга крыс при аппликации НМДА (рис. 22 а). В опытах по регистрации токов одиночных ионных каналов (в конфигурации outside-out), активируемых НМДА, было показано, что каждое из ИЭМ-веществ вызывает "flickering block" (рис. 22 б): в присутствии ИЭМ-веществ токи одиночных каналов многократно прерывались непроводящими состояниями, отражающими периоды, когда молекулы блокатора, связываясь с открытым каналом, предотвращают прохождение ионов через канал. Частота появления и длительности блокированных состояний увеличивались с гиперполяризацией, однозначно свидетельствуя о потенциалозависимости блокады. В принципе, такая же феноменология блокады была описана для эффекта аргиопина на рецепторы глутамата КВ-типа мышц рака (см. раздел 1.1.2 ). Это означает, что все ИЭМ-вещества являются

блокаторами открытого состояния ионных каналов, активируемых НМДА, и схема 1

применима для анализа кинетики блокады.

3.2. Определение констант скоростей блокады.

Основываясь на схеме 1, можно определить и к. блокаторов с ионными каналами, анализируя времена пребывания каналов в открытом и закрытом состояниях в присутствии блокатора. может быть определена из уравнения:

где г„ - среднее время открытого состояния в контроле; т6 - среднее время открытого состояния в присутствии блокатора; [Б] - концентрация блокатора. Это уравнение совпадает с таковым для определения к¥ в случае экспоненциальных ВПСТ (см. раздел 1.2.). к. может быть определена из уравнения:

где тд - средняя длительность дополнительного компонента в распределении закрытых времён, наблюдаемого в присутствии блокатора. Следствиями схемы 1 являются: 1) зависимость 1/г6 от концентрации блокатора должна быть линейной (к¥ в эксперименте определяется как тангенс угла наклона этой зависимости); 2) тд не должна зависеть от концентрации блокатора.

Распределение времён открытого состояния в контроле могло быть аппроксимировано одной экспонентой (рис. 23). Более сложные, двухэкспоненциальные распределения были описаны ранее (СНЬЬ & Со^иЬоип, 1992; Юескпег & Ра11оИа, 1995). Аппликация любого из веществ и увеличение его концентрации сопровождалась прогрессирующим укорочением среднего времени открытого состояния (рис. 23 а). Для всех веществ зависимости 1/г6 от концентрации имели линейный характер и являлись основой для оценки величин к+.

В контроле распределения времён закрытых состояний могли быть аппроксимированы тремя экспонентами (рис. 23 б), что хорошо совпадает с другими данными по анализу кинетики НМДА рецепторов в контроле (СлЬЬ & СоЦиЬоип, 1992; Юескпег & РаПоЦа, 1995). Добавление в перфузирующий раствор любого из веществ вызывало появление дополнительного компонента в распределении "закрытых" времён, причём даже при меньшей использованной концентрации амплитуда этого компонента существенно превышала амплитуды компонентов, обнаруженных в контроле. С увеличением концентрации вещества амплитуда дополнительного компонета возрастала.

*+ = (1/г6-1/г,)/[Б]

(4),

к. = 11тд

(5),

Следует особенно подчеркнуть, что тд не зависела от концентрации вещества (рис. 23 б). Описанный выше анализ проводился в широком диапазоне МП, что позволило изучать потенциалозависимость констант скоростей блокады.

290-1

600-

270

130

с,

л I

»S 660"

с 330 '

g 150

■у

Контроль

120-1

60 30

1 мкМ ИЭМ-1754

440 220

3 мкМ ИЭМ-1754

410 190

10 мкМ ИЭМ-1754

log "открытых" времен (мс)

270 120

log "закрытых" времен (мс)

Рис. 23. а, распределения длительностей открытых состояний в контроле (т= 4,07 мс, число событий п = 2253), в присутствии 1 • Ю^М (г= 2,01 мс), 3 • 10 е M (г= 1,08 мс), 1 ■ 10"5 M (г= 0,46 мс) ИЭМ-1754. б, гистограммы длительностей закрытых состояний в контроле, в присутствии 1 • 10"6М (средняя длительность блокированных состояний - тд = 1,19 мс, 57 %), 3-10"6 M (та = 1,46 мс, 71%), 1 • 10 s M (гв = 1,59 мс, 85%) ИЭГИ-1754.

Рис. 24 а показывает потенциалозависимости к, для ИЭМ-1754 и ИЭМ-1857 -веществ, наиболее сильно различающихся по структуре аммониевой головки (рис. 13). При всех исследованных МП абсолютные величины к+ для ИЭМ-1754 около четырёх раз

превышали величины к„ полученные для других веществ (ИЭМ-1460, -1592 и -1857). Поскольку при всех МП величины для ИЭМ-1460, -1592 и -1854 не различались достоверно, рис. 24 а показывает потенциалозависимость ку только для ИЭМ-1857. Для всех веществ потенциалозависимости kt, отложенные в полулогарифмических координатах, могли быть аппроксимированы прямой, а значит, были экспоненциальными: к+ ~ к+(0) ■ exp(-Vm/Vc+) (6),

где Аг+(0) - константа скорости ассоциации блокатора с каналом при МП = 0 мВ; Vm - МП; и Vc + - величина изменения МП, вызывающего изменение в е - раз. Для всех веществ величина потенциалозависимости (V,была примерно одинакова и варьировалась от 48 до 56 мВ. Величины Аг+(0) для ИЭМ-1460, -1592 и -1857 также не различались и находились в пределах от 0,82 - 0, 97 ■ 10' М 'с"1. Максимальной скоростью связывания с открытым каналом НМДА-типа обладало ИЭМ-1754; его к,(0) = 3,93 • 107 М"'с"1.

Рис.24, а, зависимость fc. от МП и б, зависимость к. от МП в присутствии ИЭМ-1857 (кружки) и ИЭМ-1754 (треугольники). Линии являются регрессиями по данным. Для ИЭМ-1754 линейной регрессии подвергались данные раздельно в двух областях МП от-30 до -90 мВ и от -90 до -150 мВ (б). Даны средние ± стандартные отклонения по более чем 5 опытам. В а, значения для двух веществ достоверно отличаются (Р <0,01). В б, значения достоверно отличаются только при отмеченных МП (' Р < 0,01;f Р < 0,05).

Рис. 24 б показывает потенциалозависимости к. для ИЭМ-1754 и ИЭМ-1857. Потенциалозависимость к. для ИЭМ-1857 не отличалась от потенциалозависимости к_ для ИЭМ-1592, а потенциалозависимость к. для ИЭМ-1754 от таковой для ИЭМ-1460. Потенциалозависимость к. для ИЭМ-1857 и ИЭМ-1592 имела одноэкспоненциальный характер:

k_ = m-exp(YJVCr) (7),

где k_(0) - константа скорости диссоциации при МП = 0 мВ; Vm - МП; a Ve. - величина МП, вызывающего изменения к. в г - раз. Для ИЭМ-1857 и ИЭМ-1592 величины к_(0) были в пределах 1670 - 2300 с"1, а величины потенциалозависимостей (V,.) находились в пределах 55 - 82 мВ. ДляИЭМ-1754 иИЭМ-1460 потенциалозависимость к_ имела более сложный характер. В области МП от -30 до -90 мВ она практически совпадала с потенциалозависимостью этого параметра для ИЭМ-1857 и ИЭМ-1592 (рис. 24 б), но в области МП от -90 до -150 мВ была существенно круче. Это приводило к тому, что при МП = -150 мВ средние времена блокированных состояний для ИЭМ-1754 и ИЭМ-1592 были почти в 3 раза длиннее, чем для ИЭМ-1857 и ИЭМ-1592. Параметры потенциалозависимости для ИЭМ-1754 и ИЭМ-1460 в области МП от -90 до -150 мВ были: к.(0) варьировалась в небольших пределах 21300 - 23400 с'1; Ve. варьировалась в пределах 24-25 мВ.

Поскольку потенциалозависимости обеих констант скоростей для ИЭМ-1857 и ИЭМ-1592 экстраполировались одной экспонентой, Кд для этих веществ имела экспоненциальный характер:

Кд = Кд{ 0)-exp(WmiWJ (8),

где Кд (0) - константа диссоциации при МП = 0 мВ; Vm - МП; Ve д - сдвиг МП, приводящий к изменению Кд в е - раз. Для ИЭМ-1754 и ИЭМ-1460 потенциалозависимость к. имела более сложный характер. Поэтому потенциалозависимость Кд экстраполировалась разными экспонентами в ограниченных областях МП. Значения параметров уравнения 8, определённые из наших опытов, приведены в таблице 5.

Таблица 5.

Потенциалозависимость ИЭМ-вгществ с каналами рецепторов НМДА-типа.

Вещество Кд(0), ■ ю^м V„, мВ Область МП, мВ

ИЭМ-1754 52 . 27 -30 до -90

295 18 -90 до-150

ИЭМ-1460 165 28 -30 до -9.0

1253 17 -90 до-170

ИЭМ-1592 • 242 26 -30 до-130

ИЭМ-1857 208 29 -50 до-150

Как видно из таблицы 5, крутизна потенциалозависимости Кд для ИЭМ-1754 и

ИЭМ-1460. в области МП = -90 мВ изменяется. Никаких подобных изменений не было обнаружено для ИЭМ-1857 иИЭМ-1592. Традиционная трактовка потенциалозависимости Кд заключается в том, что эта величина отражает фракцию мембранного электрического поля, которую пересекает молекула блокатора при связывании и диссоциации с его местом связывания в открытом канале (Woodhull, 1973). Разная потеициалозависимость Кд для ИЭМ-1754 и ИЭМ-1460 означает, что имеется два места связывания для молекул этих блокаторов внутри канала НМДА рецептора, находящихся на различной глубине в мембранном электрическом поле. Увеличение крутизны потенциалозависимости показывает, что вероятность связывания молекулы блокатора с более глубоко расположенным местом связывания увеличивается по мере гиперполяризации. Так как для ИЭМ-1857 и ИЭМ-1592 во всём диапазоне изучавшихся МП потеициалозависимость/^ была однородной и совпадала с таковой для ИЭМ-1754 и ИЭМ-1460 при МП от -30 до -90 мВ, можно заключить, что место связывания, расположенное ближе к наружному вестибюлю канала, является единственным для ИЭМ-1857 и ИЭМ-1592. Поскольку ИЭМ-вещества различаются только по структуре триапкиламмониевого радикала, можно предполагать, что именно его размерами определяется способность молекул блокаторов проникать глубже в канал НМДА рецептора. В этом случае больший размер этих радикалов у ИЭМ-1857 и ИЭМ-1592 лишает их возможности проникать глубже в канал и взаимодействовать со вторым местом связывания. По-видимому, во время связывания блокирующей молекулы с расположенным более глубоко в канале местом связывания триалкиламмониевый радикал должен быть расположен глубже, чем адамантанная часть молекулы.

Потеициалозависимость Кд позволяет определить глубину положения места связывания для блокаторов в электрическом поле (<5) из уравнения: Ve д = RTIzôF (9),

где z - заряд молекулы блокатора; R - универсальная газовая постоянная; Т- абсолютная температура; F- постоянная Фарадея. Величины Ve jl для ИЭМ-1857 иИЭМ-1592, атакже ИЭМ-1754 и ИЭМ-1460 в диапазоне МП от -30 до -90 мВ совпадали; среднее значение Vt;l = 27,5 ± 1,3 мВ. Эта величина V,д соответствует zô = 0,92. Величина Уед для ИЭМ-1754 и ИЭМ-1460 при МП от-90 до -150 мВ (таблица 5) соответствует zô = 1,44. Далее, поскольку при нейтральных рН оба атома азота в молекулах ИЭМ-веществ протонированы (z = 2), глубины положений мест связывания в электрическом поле будут 0,46 и 0,72. В принципе,

обнаруженная локализация места связывания, находящегося глубоко в мембранном электрическом поле, совпадает с положением места связывания для амантадина. (Blanpied et al., 1997) и мемантина (Chen et at., 1992; Blanpied et al., 1997). Оба этих вещества являются тоже производными адамантана и имеют один положительный заряд. Места связывания для большинства органических блокаторов каналов НМДА рецепторов лежат в пределах 6 от 0,5 до 0,75.

Хотя модель Вудхалл (1973) широко применяется в настоящее время для определения мест связывания блокаторов и ионов в различных типах ионных каналов, она является идеальной и не учитывает взаимодействия проходящих ионов и молекул блокатора. Существование такого взаимодействия может существенно осложнять трактовку данных. Несмотря на то, что считается, будто канал НМДА рецептора может содержать только один проходящий ион (Jahr & Stevens, 1994; Zarei & Dani, 1994), имеются свидетельства в пользу существования взаимодействия между проходящими ионами и блокирующими молекулами в его канале (Johnson & Ascher, 1990; Antonov & Johnson, 1994; Zarei & Dani, 1995). В наших опытах по уменьшению концентраций проходящих ионов в наружном и внутреннем растворах механизм блока открытых каналов НМДА рецепторов ИЭМ-1857 иИЭМ-1754 значительно отличался от традиционной модели Вудхалл (1973). Уменьшение концентрации Cs+ во внутреннем растворе (раствор 2; таблица 2) приводило у значительному увеличению величин kt обоих веществ в диапазоне МП от -30 до -70 мВ, но не сопровождалось изменениями kt при МП от -90 до -150 мВ. Это приводило к значительному уменьшению потенциалозависимости к+. На этом фоне уменьшение концентрации Na+ в наружном растворе (раствор б; таблица 1) для обоих веществ приводило к одинаковому трёхкратному возрастанию величин к, при всех МП. Эти данные однозначно показывают, что измеряемые в экспериментах величины к, не отражают истинную скорость связывания блокатора с каналом, а во многом определяются взаимодействием молекулы блокатора и проходящими ионами. Они могут быть объяснены исходя из предположения о существовании мест связывания для проходящих ионов в наружном вестибюле ионного канала НМДА рецептора. Связывание ионов с этими местами будет препятствовать проникновению блокатора в канал. Благодаря этому, уменьшение концентраций проникающих ионов должно облегчать доступ молекул бокатора в ионную пору. Были обнаружены и другие признаки существования взаимодействия между блокаторами и проходящими ионами в канале НМДА рецептора

(Ruppersberg etal,, 1994).

Относительно природы мест связывания ИЭМ-веществ в канале НМДА-рецептора можно лишь спекулировать. Скорее всего, по аналогии с другими блокаторами, аспарагин, находящийся в одном и том же положении (в положении Q/R для АМПА и КА рецепторов) М2 сегмента всех субъединиц НМДА рецепторов, участвует в связывании ИЭМ-веществ. Мутации этого аспарагина в NR1 и NR2 субъединицах модифицировали чувствительность НМДА рецепторов ко многим блокаторам, включая Mg+* (Burnashev et al., 1992; Mori et al., 1992), MK-801 (Mori etal., 1992; Sakurada et al., 1993), фенциклидин, кетамин (Yamakura et al., 1993) и аргиотоксина636 (Raditsch et al., 1993). Можно предполагать, что в обоих местах связывания ИЭМ-вещества взаимодействуют с аспарагином, находящимся в консервативном положении, а различие мест связывания определяется лишь тем, с каким из положительных зарядов ИЭМ-веществ взаимодействует эта аминокислота.

3.3. Взаимодействие ИЭМ-веществ с воротным механизмом НМДА рецептора.

Для выяснения нюансов механизма блокады, в частности, определения путей, посредством которых блокатор может покинуть открытый, но блокированный канал (состояние АзРЧБ схемы 1), необходимо исследовать эффект ИЭМ-веществ на длительность вспышек токов одиночных каналов НМДА рецепторов (Neher & Steinbach, 1978; Neher, 1983). Если модель последовательной блокады адекватно описывает (схема 1) действие ИЭМ-веществ, то наблюдаемое в присутствии ИЭМ-веществ увеличение длительности вспышек должно определяться уравнением:

RcinjTncjc, Б "-вспышек, К

(1 + [Б ]/Кд) (10),

где t,.1IbJlllcKi к - средняя длительность вспышек в контроле; t>cnbIIIltKi Б - средняя длительность вспышек в присутствии блокатора. Как видно из уравнения 10, зависимость длительности вспышек в присутствии блокатора от его концентрации должна быть пропорциональна Кд блокатора. Если канал может закрыться в блокированном состоянии (механизм "ловушки"), то наблюдаемая tKnum.K должна быть короче, чем предсказанная уравнением 10.

Рис. 25 а показывает, что увеличение концентрации ИЭМ-1857 сопровождается увеличением длительности вспышек при МП = -90 мВ. Распределения длительностей вспышек носили двухэкспоненциальный характер (рис. 25 б), что хорошо совпадало с ранее опубликованными данными (Howe et al., 1988; Traynelis & Cull-Candy, 1991; Gibb &

10 мкМ ИЭМ-1857

5 пА

200 мс ЗОмкМ ИЭМ-1857

100 мкМ ИЭМ-1857

140" 70'

ЮмкМ ИЭМ-

1857

13,3 мс

1.....Г-1-1

ЗОмкМ nil V, 31,3 мс

го '

ft,

" I I-1

Т 50-

100 ИКМ

49,8 мс

'г " "Г I-1

о г

log длительность вспышек (log мс)

Рис. 25. а, примеры токов одиночных каналов в присутствии 1 • 10"® М НМДА + 1 • 10"5 М глицина и трёх различных концентраций ИЭМ-1857. 6, гистограммы длительностей вспышек в присутствии 1 • 10"5,3 • 105 и 1 • 10"' М ИЭМ-1857. Цифры над гистограммами - средние длительности вспышек, определённые как средние арифметические распределений. Непрерывные линии показывают аппроксимацию распределений двум экспонентами. Гистограммы были построены с использованием критических времён: 4,9; 7,6 и 8,3 мс для 1 ■ 10"®, 3 • 10"5, и 1 • 10"4 М ИЭМ-1857 соответственно, в, зависимость 10СПЬ,Ш<И от концентрации блокатора: ИЭМ-1857 (кружки) и ИЭМ-1754 (треугольники). Непрерывные линии представляют собой регрессии через экспериментальные точки. Прерывистые линии показывают теоретические значения, рассчитанные из модели последовательного блока (схема 1; уравнение 10).

СоЦиЬоип, 1992). Все ИЭМ-вещества при МП = -90 мВ продлевали медленный компонент распределений длительностей вспышек и увеличивали 1кпшжк. При этом каких-либо изменений быстрого компонента не было замечено (рис. 25 б). В контроле при -90 мВ ^вспышек = 8,6 ± 2,4 мс (п = 11). При том же МП для 3 • 1_0"5 М ИЭМ-1857, -1592 и -1460

соответственно. ИЭМ-1754 (7,5 • 10"6 М) продлевает 1„СПЬ1Ш„ до 22,7 ± 9,5 мс (п = 6). Все вещества вызывали хорошо достоверное увеличение 1кпышс1( (Р < 0,001; АЫОУА).

Большие концентрации ИЭМ-1857, чем ИЭМ-1754, были необходимы для получения одинаковых значений 1кпышж, что может объясняться более низким значением Кд для ИЭМ-1754. 11СПЫШ(;к в присутствии ИЭМ-1857 хорошо совпадали с величинами 11СПЫШЖ, рассчитанными из уравнения 10, а величины 1В[1ШГ11СК, полученные в экспериментах с ИЭМ-1754, были меньше, чем значения, рассчитанные из уравнения 10 (рис. 25 в).

Рис. 26 показывает зависимость t„.

от МП для ИЭМ-1857 и ИЭМ-1754. В

отсутствии блокатора не зависела от МП. В присутствии 1 • Ю-5 М ИЭМ-1857 было обнаружено потенциалозависимое увеличение 1кпытек. При каждом МП определённые в экспериментах 11Спышек не отличались от величин, рассчитанных из уравнения 10 (рис. 26 а).

• Ю^М ИЭМ-1754, были достоверно меньше, чем величины, рассчитанные из уравнения 10, при МП -130 и -150 мВ (рис. 26 б). Эти данные показывают, что связывание ИЭМ-1857 с открытым каналом предотвращает закрывание ворот канала при всех исследованных МП, а связывание ИЭМ-1754 не препятствует закрыванию ворот канала при гиперполяризации.

б 00

о—о—о—о^^12^

-150 -100 -50

МП (мВ)

Рис. 26. а, эффект 1 • 10 5 М ИЭМ-1857 на 1ВСПЫШ(1> в области МП от-50 до-100 мВ. б, эффект 3 • Ю-6 М ИЭМ-1754 на 1ВСЛЫ1и„ в области МП от -50 до -150 мВ. Открытые символы, ^„„щ,,, полученные в контроле. Заполненные символы, ^„„щ,,, полученные в присутствии веществ. Пунктирные линии, величины, рассчитанные из схемы последовательной блокады, используя уравнение 10. ' и помечены величины достоверно отличающиеся от "предсказаний" модели последовательной блокады. Символы показывают средние ± стандартные отклонения.

В отличие от ИЭМ-1857, величины tKnblulel(, полученные в экспериментах в присутствии 3

Выводы, проведённого анализа вспышек токов одиночных каналов в присутствии ИЭМ-вещесгв, были подтверждены двумя независимыми способами: измерением зависимости частоты блокирования от концентрации блокаторов (С^(1еп & СоЦиЬоип, 1985; МагеЬаД ег а!., 1990) и анализом среднего тока во фрагменте мембраны, вызванного аппликацией НМДА, в присутствии ИЭМ-веществ. Последний метод особенно интересен. Он основан на положении, вытекающем из схемы 1 о том, что в контроле и в присутствии блокатора общее количество заряда, проходящего через каналы, должно оставаться прежним. Именно это происходило в присутствии ИЭМ-1857: не было обнаружено достоверных отличий в количестве проходящего заряда через НМДА-рецепторы в контроле и в присутствии ИЭМ-1857 в области гиперполяризационных МП. Напротив, ИЭМ-1754 достоверно снижал средний ток через мембрану в диапазоне МП от-110до-150

На основании наших данных можно сделать следующий вывод: связывание ИЭМ-1857 с открытым каналом НМДА рецептора предотвращает закрывание ворот канала, в то время как связывание ИЭМ-1754 с открытым каналом перестаёт препятствовать закрыванию ворот по мере гиперполяризации. Этот вывод может быть интегрирован с выводом, сделанным на основе измерения потенциалозависимости к. . и К^ о существовании двух мест связывания ИЭМ-веществ в канале. Тогда, связывание блокатора с местом, расположенным в канале ближе к наружному вестибюлю, предотвращает закрывание ворот канала, а переход молекулы блокатора глубже в канал сопровождается, утерей способности взаимодействовать с воротным механизмом. Эта гипотеза предполагает, что воротные группировки НМДА рецептора долны быть расположены около наружного вестибюля канала. По-видимому, вытянутая структура ИЭМ-веществ

МП (мВ)

Рис. 27. Эффект ИЭМ-1857 и ИЭМ-1754 на средний ток через НМДА-аетивмруемые каналы во фрагменте мембраны. Даны средние ± стандартные отклонения среднего тока в присутствии веществ, нормализованного к среднему току в контроле - без веществ. Открытые столбцы, 3 • 10"6 М ИЭМ-1857; зашгрихованне столбцы 1 • 10'6 М ИЭМ-1754. Величины для ИЭМ-1857 достоверно не отличаются от 1,0. Отмеченные значения для ИЭМ-1754 достоверно отличаются от 1,0:' Р < 0,01;' Р < 0,05.

придает им уникальную способность взаимодействия с воротным механизмом во время блокады канала, активируемого НМДА (Johnson et al., 1995; Antonov et al., 1995). Значение размеров блокирующих молекул для их взаимодействия с воротами НМДА-рецептора предполагалось также для тетраалкиламмониевых соединений (Кошелев и Ходоров, 1992; Koshelev & Khodorov, 1995).

Таким образом, модель последовательной блокады (схема 1) хорошо объясняет блок НМДА рецепторов, вызываемый ИЭМ-1857 и ИЭМ-1592. Для объяснения блокады, вызываемой ИЭМ-1754 и ИЭМ-1460, необходима модель, включающая по крайней мере два блокированных состояния. В одном из блокированных состояний закрывание канала запрещено, а в другом - разрешено. Может быть рассмотрено две схемы, в которых два блокированных состояния расположены параллельно или последовательно. Большинство наших данных свидетельствует в пользу последовательного расположения этих состояний: А2Р' + Б AjP'E1 ^ А2Р'Б2 А2РБ2 * ..... » (11).

Эта модель (схема 11) может реализовываться только в случае, если при связывании с обоими местами аммониевая группа ИЭМ-веществ является частью молекулы, наиболее глубоко расположенной в канале. Блокирование всегда начинается с места, находящегося ближе ко входу в канал (состояние А2Р*Б'). Гиперполяризация провоцирует движение к более глубоко расположенному месту (состояние А2 Р'Б2), находясь связанной с которым, молекула блокатора не мешает каналу закрыться (состояние А2РБ2).

Многие блокаторы каналов, активируемых НМДА, могут использоваться как антиконвульсанты (Rogawski, 1993). Блокаторы, взаимодействующие с воротным механизмом во время блокады, могут иметь преимущества как терапевтические препараты перед теми, которые блокируют канал по механизму "ловушки" (Chen et al., 1992), так как ингибирование ими токов должно становиться более эффективным по мере увеличения концентрации глутамата. Такое увеличение наблюдается во время ишемических и судорожных состояний. Быстрая кинетика блокады тоже может расширять терапевтическое применение блокаторов каналов, активируемых НМДА (Rogawski, 1993). В соответствии с этим, ИЭМ-вещесгва являются очень эффективными антиконвульсантами (Antonov et al., 1995). Хотя в настоящее время механизм действия блокаторов, который позволяет добиться их терапевтического использования не совсем ясен, создание эффективных лекарств зависит от степени понимания механизмов блокады и от того, как они сопряжены с химической структурой веществ!

Заключение по разделу 3.

Таким образом, ИЭМ-вещества являются блокаторами открытого состояния ионных каналов, активируемых НМДА. Этим объясняется их большая эффективность как антиконвульсантов (Магазаник и др., 1994; Antonov et al, 1995). ИЭМ-вещества имеют два места связывания в канале НМДА рецептора (Antonov & Johnson, 1996). Поскольку ИЭМ-вещества различаются только структурой их триалкиламмониевых радикалов, можно полагать, что размер этих радикалов ИЭМ-1754 и ИЭМ-1460 - веществ способных 'глубже проникать в канал - может отражать размер сужения в канале. Для триметиламмониевого радикала площадь сечения составляет 5,4 х 6,5 А (Жоров и др., 1989; Zhorov etal., 1991), что предполагает такое же минимальное сечение узкой части канала НМДА рецептора. Это сужение расположено, по-видимому, в области остатка аспарагина в положении N/Q/R структуры М2 сегмента субъединиц рецепторов глутамата. Близкие величины минимального сечения канала дают другие работы (Zarei &Dani, 1995; Villarroel et al., 1995; Wollmuth et al., 1996). Данные по анализу эффектов ИЭМ-веществ на длительность вспышек токов одиночных каналов позволяют говорить , о локализации воротных структур НМДА рецептора. Скорее всего, части канала, претерпевающие конформационные изменения в результате его активации (ворота), находятся в районе входа в узкую часть канала.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружено, что яды пауков семейства Агапегсйге и ТеКа^аШсЬе обладают способностью нарушать глутаматергическую нервно-мышечную передачу насекомых. Из яда паука Агфоре 1оЬа1а выделен низкомолекулярный нейротоксин, названный аргиопином, который обладает избирательным постсинагтгическим действием.

, 2. В мышцах личинки мухи аргиопин вызывает уменьшение амплитуды и появление двухэкспоненциальности спада ВПСТ. Спектральный анализ "глутаматных шумов" постсинаптической мембраны показал, что в присутствии аргиопина изменяется кинетика активации ионных каналов: энергетическая плотность спектров аппроксимировалась двумя функциями Лоренца. Это свидетельствует о том, что аргиопин является блокатором открытого состояния ионных каналов, активируемых глутаматом.

3. Блркирующее действие аргиопина на амплитуду ВПСТ в мышцах личинки мухи зависело от мембранного потенциала и было сильнее выражено в области низких мембранных потенциалов (-40 - -60 мВ), а гиперполяризация вела к ослаблению эффекта. Это указывает на способность аргиопина потенциалозависимым образом взаимодействовать с закрытым состоянием ионных каналов, активируемых глутаматом.

4. Существование двух механизмов действия аргиопина было подтверждено в опытах на мышцах рака методом регистрации токов одиночных каналов, управляемых

глугаматом, в мышцах рака выявили два механизма действия аргиопина. В концентрациях Ю"9 - 10"' М аргиопин вызывал потенциалозависимый блок закрытых ионных каналов: при потенциале покоя (от -75 до -85 мВ) активность каналов была полность блокирована, а гиперполяризация приводила к деблокированию. В концентрациях больших, чем 10"7 М аргиопин вызывал блокаду открытых ионных каналов, проявляющуюся как "flickering block".

5. В мотонейронах спинного мозга лягушки аргиопин не влияет на амплитуду деполяризаций, вызванных аппликацией аспартата, и уменьшает амплитуду ответов, вызванных аппликацией глутамата. Это означает, что в мотонейронах лягушки аргиопин блокирует глутаматные рецепторы, которые не активируются' аспартатом. Поскольку аспартат является агонистом НМДА рецепторов, можно полагать, что аргиопин является антагонистом рецепторов не НМДА-типа.

6. Блокада высокоафинного, натрий- и энергозависимого захвата глутамата ионами лития или понижением температуры в нервно-мышечных синапсах личинки мухи вызывает возникновение тока в мышечных клетках, который блокируется аргиопином. Анализ мВПСТ и флукгуаций тока показал, что он является результатом активации постсинаптических рецепторов глутамата. Это означает, что из пресинаптического окончания глугамат освобождается не только квантами, но и происходит его непрерывная неквантовая секреция.

7. С помощью фармакологического анализа с использованием аргиопина, кинурината, АФВ и ЦНКК была выявлена гетерогенная природа синаптических входов в мотонейроны лягушки. Аргиопин блокирует полисинаптические и большинство из моносинаптических входов от ретикулярной формации и полисинаптические входы от первичных афферентов. Моносинаптические входы от первичных афферентов оказались резистентными к действию аргиопина. Тем самым, продемонстрировано морфо-функциональное разделение не НМДА рецепторов в мотонейронах. Только рецепторы резистентные к аргиопину участвуют в моносинаптических связях первичных афферентов с мотонейронами.

8. Показано, что производные адамантана (ИЭМ-1754, -1460, -1592 и -1857) являются блокаторами открытого состояния ионных каналов, активируемых глугаматом, мышц личинки мухи. Эффективность блокаторов увеличивалась по мере увеличения размеров катионной головки у ИЭМ-веществ. Наиболее эффективными оказались ИЭМ-

1857 и ИЭМ-1592, имеющие т-бутидциметиламмониевый и изопропилдимегиламмониевый радикалы соответственно.

9. В опытах на культивируемых нейронах коры головного мозга крыс показано, что ИЭМ-вещества эффективно бокируют открытые ионные каналы рецепторов НМДА-типа. В этих опытах ИЭМ-1754, имеющий катионную головку минимальных размеров (аммониевый радикал), оказался самым эффективным в отличие от рецепторов глутамата в мышцах насекомых.

10. Сопоставление структуры и действия ИЭМ-веществ выявило два места их связывания в канале НМДА рецептора. Связывание блокаторов с местом, находящемся ближе ко входу в канал, предотвращает его закрывание. Только ИЭМ-1754 и ИЭМ-1460 способны проникать глубже в канал и связываться со вторым местом связывания. При этом молекула блокатора теряет способность предотвращать закрывание канала. Связывание со вторым местом усиливается гиперполяризацией.

11. Обнаружено взаимодействие проникающих ионов и молекул блокаторов в ионном канале НМДА рецептора. Предполагается существование мест связывания для проникающих ионов в наружном вестибюле канала. Связывание ионов с этим местом препятствует проникновению молекулы блокаторов в канал.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Магазаник Л.Г., Антонов С.М., ГмироВ.Е. Механизмы активации и блокирования посгсинаптической мембраны, чувствительной к глутамату //Биол. мембраны 1984. Т. 1. С. 130-140.

2. Антонов С М., Потапьева H.H., Гмиро В.Е., Магазаник Л.Г. Фармакологическая блокада ионных каналов, активируемых ацетилхолином и глутаматом. - В кн.: IV Всесоюзн. конф. "Физиология и биохимия медиаторных процессов": Тез. докл. М., 1985. С. 17.

3. Антонов С М., Потапьева H.H. (1985) Фармакологические свойства ионных каналов холинергических и глутаматергических постсинаптичесих мембран. - В кн.: IV Всесоюзн. межуниверситетская конф. "Биология клетки" (Тбилиси, 15-20 декабря 1985 г.): Тез. докл. Тбилиси, 1985. С. 32-33.

4. Антонов С.М. Исследование механизмов, ограничивающих длительность

постсинаптического действия глутамата. - В кн.: Всесоюзн. конф. по нейронаукам' Тез докл. Киев, 1986. С. 16.

5. Магазаник Л.Г., Антонов С.М., Волкова Т.М., Гришин Е.В., Федорова И М. (1986) Аргиопин - природный блокатор ионных каналов, активируемых глутаматом. - В кн.: Симпозиум "Рецепторы и ионные каналы": Тез. докл. Ташкент, 1986. С. 25-26.

6. Гришин Е.В., Волкова Т.М., Арсеньев A.C., Решетова О С., Оноприенко В В., Магазаник Л.Г., Антонов С.М., Федорова И.М. Структурно - функциональная характеристика аргиопина - блокатора ионных каналов из яда паука Argiope lobata // Биоорганич. химия 1986. Т. 12. С. 1121-1124.

7. Магазаник Л.Г., Антонов С.М., Федорова ИМ., Волкова Т.М., Гришин Е.В. Действие яда паука Argiope lobata и его низкомолекулярного компонента - аргиопина на постсинаптические мембраны //Биол. мембраны 1986. Т. 3. С. 1204-1219.

8. Шупляков О.В., Антонов С.М., Веселкин Л.Г., Магазаник Л.Г. Способность аргиопина блокировать глугаматергические синапсы в спинном мозгу лягушки // Ж. эвол. биохим. и физиол. 1987. Т. 23. С. 275-276.

9. MagazanikL.G., Antonov S M., Fedoroval.M., Volkova T.M., Grishin E.V. Argiopin -a naturally occurring blocker of glutamate - sensitive synaptic channels // Receptors and ion channels (eds. Ovchinnikov Y.A., Hucho F). Berlin: de Gruyter, 1987. P. 305-312.

10. Antonov S.M., Grishin E.V., Magazanik LG., Shupliakov O.V., Vesselkin N.P., Volkova T.M. Argiopin blocks the glutamate responses and sensorimotor transmission in motoneurones of isolated frog spinal cord //Neurosci. Lett. 1987. V. 83. P. 179-184.

11. Потапьева H.H.., Гмиро E.B., Антонов С.M. Фармакологические свойства ионных каналов, активируемых глутаматом. - В кн.: Всесоюзн. конф. "Исследование глутаматегрических синапсов. Теоретические и прикладные аспекты" (Ленинград, 27-29 октября 1987 г.): Тез. докл. Л., 1987. С. 28.

12. Антонов С.М. Механизмы удаления глутамата как факторы, ограничивающие его постсинаптическое действие. - В кн.: Всесоюзн. конф. "Исследование глутаматегрических синапсов. Теоретические и прикладные аспекты" (Ленинград, 27-29 октября 1987 г.): Тез. докл. Л., 1987. С. 28-29.

13. Шупляков О.В., Антонов С М.. Веселкин Н.П., Магазаник Л.Г. Антиглутаматное действие аргиопина в спинном мозгу амфибий. - В кн.: Всесоюзн. конф. "Исследование глутаматегрических синапсов. Теоретические и прикладные аспекты" (Ленинград, 27-29

октября 1987 г.): Тез. докл. Л., 1987. С. 51.

14. Славнова Т.И., Антонов С.М., Магазаник Л.Г., Тонких А.К., Косовский А.Б., Садыков А.А., Абдувехабов А.Л. Действие нейротоксина из яда наездника НеЪгоЪгасоп hebetor (Say) на нервно - мышечную передачу насекомых // Докл. АН СССР 1987. Т. 297. С. 492-494.

15. Magazanik L.G., Antonov S.M. Activation and blockade of glutamate - sensitive ion channels // Symp. Biolog. Hungarica 1988. V. 36. P. 105-116.

16. Antonov S.M., Magazanik L.G. Intense non - quantal release of glutamate in an insect neuromuscular junctions //Neurosci. Lett. 1988. V. 93. P. 204-208.

17. Антонов C.M., Шупляков O.B., Магазаник Л.Г., Веселкин Н.П., Волкова Т.М., Гришин Е В. Аргиопин как антагонист действия глутамата на спинальные мотонейроны лягушки // Докл. АН СССР 1988. Т. 298. С. 505-508.

18. Антонов С.М., Волкова Т.М., Гришин Е.В., Кискин НИ., Магазаник Л.Г., Федорова И.М., Циндренко А.Я., Крышталь О.Е. Структура и функция антагонистов глутаматного рецептора из яда паука. - В кн.: Всесоюзн. симп. "Физико - химические свойства биологических мембран": Тез. докл. Рига, 1988. С. 25-28.

19. Franke Ch., Hatt Н., Dudel J., Antonov S. Potential - dependent block of glutamate activated channels by argiopine // Pflugers Arch. (Suppl.) 1989. V. 413. P. R2.

20. Antonov S.M., Dudel J., Franke Ch., Hatt H. Argiopine blocks glutamate - activated single - channel currents on crayfish muscle-by two mechanisms // J. Physiol. 1989. V. 419. P. 569587.

21. Антонов C.M., Магазаник Л.Г. Неквантовое освобождение и активный захват глутамата в нервных окончаниях насекомого Calliphora vicina И Докл. АН СССР 1989. Т. 304. С. 483-486.

22. Антонов С.М. Механизмы удаления глутамата как факторы, ограничивающие его постсинапгическое действие // Физиология и биохимия глутаматергических синапсов. Л.: Наука, 1989. С. 110-121.

23. Веселкин Н.П., Магазаник Л.Г., Калинина Н.И., Курчавый Г.Г., Антонов С М.. Шупляков О.В. О химической природе синаптических входов мотонейрона лягушки. - В кн.: Всесоюзн. симп. "Регуляция сенсомоторной функции": Тез. докл. Винница, 1989. С. 34.

24. Антонов С М., Волкова Т.М., Гришин Е.В., Магазаник Л.Г., Федорова И.М.

Сопоставление строения и действия нейротоксинов из яда паука Argiope lobata -структурных аналогов аргиопина на ионные каналы, активируемые глутаматом. - В кн.: Всесоюзн. конф. "Механизмы действия медиаторов и гормонов на эффекторные клетки" (Суздаль, 26-28 сентябрь 1989 г.): Тез. докл. Суздаль, 1989. С. 11.

25. Магазаник Л.Г., Антонов С.М., Веселкин Н.П., Калинина Н И.. Курчавый Г Г., Шупляков О.В. Блокаторы глутаматных каналов как инструменты исследования синаптической организации нервной системы. - В кн.: Всесоюзн. симп. "Одиночные ионные каналы в биологических мембранах" (Кара-Даг, 26-28 апреля 1989 г.): Тез. докл. Пущино, 1989. С. 60.

26. Антонов СМ. (1989) Механизмы блокирующего действия аргиопина на одиночные ионные каналы, активируемые глутаматом. - В кн.: Всесоюзн. симп. "Одиночные ионные каналы в биологических мембранах" (Кара-Даг, 26-28 апреля 1989 г.): Тез. докл. Пущино, 1989. С. 4.

27. Антонов С.М., Самойлова М.В. (1989) Калиевые каналы в мембране мышечных клеток насекомого. - В кн.: Всесоюзн. симп. "Одиночные ионные каналы в биологических мембранах" (Кара-Даг, 26-28 апреля 1989 г.): Тез. докл. Пущино, 1989. С. 5.

28. Калинина Н И., Курчавый ГГ., Шупляков О.В., Веселкин Н.П., Антонов С М., Магазаник Л.Г. Гетерогенность возбуждающих синаптических входов в спинапьных мотонейронах лягушки //Ж. эвол. биохим. физиол. 1989. Т. 25. С. 755-761.

29. Антонов С М., Магазаник Л.Г., Овчаренко В.И., Тарабаев Ч.К., Федорова И М. Механизмы действия ядов пауков и их применение в таксономии // Труды зоол. Института 1990. Т. 226. С. 111-112.

30. Самойлова М.В., Антонов С.М. Молекулярные особенности неинактивирующихся калиевых каналов в мышцах личинки насекомого и их функциональное значение. - В кн: X Всесоюзн. совещание по эволюционной физиологии "Вопросы эволюционной физиологии": Тез. докл. Л., 1990. С. 221.

31. Antonov S.M., Kalinina N.I., Kurchavyj G.G., Magazanik L.G., Shupliakov O.V., Vesselkin N.P. Identification of two types of excitatory synaptic inputs in frog spinal motoneurones //Neurosci. Lett. 1990. V. 109. P. 82-87.

32. Магазаник Л.Г., Федорова И.М., Антонов C.M., Ковалевская Г.И., Булгаков О.В., Пашков В.Н., Гришин ЕВ. В яде каракурта содержатся компоненты, избирательно действующие на пресинагтгические мембраны позвоночных и насекомых // Биол. мембраны

1990. Т. 7. С. 660-661.

33. Antonov S.M., Magazanik L.G., Kalinina N.I., Kurchavyj G.G., Vesselkin N.P. Glutamate receptors in excitatory synaptic inputs to frog spinal motoneurones // Neurochem. International (Suppl.) 1990. V. 16. P. 148.

34. Антонов C.M., Магазаник Л.Г., Калинина Н.И., Курчавый Г Г., Веселкин Н.П. Исследование рецепторов глутамата возбуждающих синаптических входов мотонейронов лягушки. - В кн.: V Всесоюзн. конф. "Физиология и биохимия медиаторных процессов": Тез. докл. М., 1990. С. 18.

35. Антонов С.М., Магазаник Л.Г., Калинина Н.И., Курчавый Г Г., Веселкин Н.П. Идентификация рецепторов глутамата в возбуждающих синаптических входах в мотонейроны лягушки. - В кн.: Всесоюзн. симп. "Ионные каналы в биологических мембранах" (Кара-Даг, 24-27 апреля 1990 г.): Тез. докл. М., 1990. С. 4.

36. Antonov S.M., Magazanik L.G., Kalinina N.I., Kurchavyj G.G., Vesselkin N.P. Glutamate receptors in excitatory synaptic inputs to frog spinal motoneurones // Excitatory amino acids (eds. Meldrum B.S., Moroni F, Simon R.P.S, Wood J.H.). N.Y.: Raven Press, 1991. P. 303306.

37. Антонов С М., Самойлова M B. Калиевые каналы в мышечных клетках личинки насекомого //Биол. мембраны 1991. Г. 8. С. 69-77.

38. Магазаник Л.Г., Антонов С М., Большаков В.Ю., Федорова И.М. Применение нейротоксинов из ядов пауков для исследования механизмов глутаматергической передачи // Ж. эвол. физиол. биохим. 1991. Т. 27. С. 77-85.

39. Magazanik L.G., Antonov S.M., Bolshakov V.Y., Fedorova I.M. Neurotoxins as tools for the investigation of glutamatergic synaptic transmission. - In: 7th International Symp. "Neuroreceptors, ion channels and brain": Abstr. Tokyo, 1991. P01.

40. Magazanik L.G., Antonov S.M., Bolshakov V. Y., Fedorova I.M., Gapon S.A. Spider neurotixins as tools for the inverstigation of glutamatergic synaptic transmission // Neurotox-91( ed. Duce I.R.). London: Elsevier, 1992. P. 19-31.

41. Kurchavyj G.G., Kalinina N.I., Vesselkin N.P., Antonov S.M., Magazanik L.G. The receptors in different excitatory inputs of the motoneurone. - In: International symp. "Workshop on cellular networks": Abstr. Palanga, 1992. P. 44.

42. Antonov S.M., Gmiro V.E., Lukomskaya N.Ya., Magazanik L.G., Potapjeva N.N. Novel channel blocker of insect muscle quisqualate receptors prevents A-methyl-D-aspartate

(NMDA) induced seizures in mice. - In: International symp. "Excitatory amino acids 1992": Abstr. Yosemite, 1992. P. 18.

43. Antonov S.M., Gmiro V.E., Johnson J.W. (1993). Adamantane derivatives induce flickering of Af-methyl-D-aspartate (NMDA)-activated channels// Soc. Neurosci. Abstr. 1993. V. 19. P. 467.

44. Antonov S.M., Johnson J.W. Ion flow contributes to the voltage dependence of open channel block of the NMDA-activated channels // Soc. Neurosci. Abstr. 1994. V. 20. P. 212.

45. Магазаник Л.Г., Антонов C.M., Лукомская Н.Я.. Потапьева Н.Н.. Гмиро В.Е., Джонсон Я. Блокада глутумат- и холинергических ионных каналов производными адамантана// Физиол. журнал им. И.М.Сеченова 1994. Т. 80. С. 99-112.

46. Antonov S.M., Johnson J.W. Differential effects of structurally related channel blockers on NMDA receptor gating//Soc. Neurosci. Abstr. 1995. V. 21. T. 352.

47. Antonov S.M., Johnson J.W., Lukomskaya N.Y., Potapyeva N.N., Gmiro V.E., Magazanik L.G. Novel adamantane derivatives act as blockers of open ligand-gated channels and as anticonvulsants // Molec. Pharmacol. 1995. V. 47. P. 558-567.

48. Johnson J.W., Antonov S.M., Blanpied T.A., Li-Smerin Y. Channel block of the NMDA receptor П Excitatory Amino Acids and Synaptic Function (2nd edition, eds. H. Wheal and A.Thomson). London: Academic Press, 1995. P. 99-113

49. Antonov S.M., Gmiro V.E., Johnson J.W. Interaction between permeant cations and channel blockers within the pore of the NMDA receptor // Soc. Neurosci. Abstr. 1996. V. 22. P. 69.

50. Antonov S.M., Johnson J.W. Voltage-dependent interaction of open channel blocking molecule with gating ofNMDA receptors in rat cortical neurons // J. Physiol. 1996. V. 493. P. 425445.

51. Antonov S.M., Gmiro V.E., Johnson J.W. Identification ofbinding sites for permeant ions in the channel ofNMDA receptors using channel block, (submitted).

Информация о работе

Антонов, Сергей Михайлович
доктора биологических наук
Санкт-Петербург, 1997
ВАК 03.00.13

Автореферат

Похожие работы