Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярное моделирование и структурно-динамические особенности эукариотических катионных каналов

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярное моделирование и структурно-динамические особенности эукариотических катионных каналов"

005057552

На правах рукописи

Попинако Анна Владимировна

МОЛЕКУЛЯРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ И СТРУКТУРНО-ДИНАМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КАТИОННЫХ КАНАЛОВ

Специальность 03.01.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2013

1 "ДПРш

005057552

Работа выполнена на кафедре биоинженерии Биологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова».

Научные руководители: доктор физико-математических наук, профессор

кафедры биофизики биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова

Шайтан Константин Вольдемарович кандидат биологических наук, доцент кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова

Соколова Ольга Сергеевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор, главный

научный сотрудник лаборатории биологически активных наноструктур ФГБУ "НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России

Карягина-Жулина Анна Станиславовна кандидат физико-математических наук, старший научный сотрудник ИХФ РАН, руководитель группы компьютерного моделирования

Мазо Михаил Абрамович

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биофизики клетки Российской академии наук, г. Пущино.

Защита диссертации состоится "18" апреля 2013 г. в^Ч часов 0О_ мин. на заседании диссертационного совета Д 501.001.96 Биологического факультета Московского Государственного университета им. М.В. Ломоносова по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, д.1, стр.12, Биологический факультет МГУ, аудитория 389.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Московского Государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан марта 2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук ~ (. М.Г. Страховская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Ионные каналы формируют большой функциональный класс интегральных трансмембранных белков и участвуют в регуляции разнообразных клеточных процессов (Jegla et al., 2009). Основной функцией ионных каналов является селективное перемещение ионов через мембрану. Наиболее распространенные и многочисленные семейства ионных каналов представлены группами лиганд-зависимых (JI3) и потенциал-зависимых (ПЗ) (Yu et al., 2004; Minor, 2009) каналов, участвующих в межклеточной сигнализации. JI3 каналы генерируют электрический потенциал, превращая химические сигналы, приходящие к клетке, в электрические, ПЗ . каналы участвуют. в распространении потенциала действия.

Структурное и функциональное разнообразие ионных каналов, а также их участие в работе жизненно важных систем организма обуславливает повышенный интерес к их исследованию. На сегодняшний день клонировано более 500 генов, кодирующих субъединицы ионных каналов как эукариотического происхождения, так и их бактериальных аналогов (Jegla et al., 2009). Однако сложная молекулярная архитектура эукариотических ионных каналов, в состав которых входят крупные внемембранные домены, часто является препятствием для структурных исследований экспериментальными методами (Bill et al., 2011). Так, на сегодняшний день известна лишь одна атомарная структура ПЗ калиевого канала (Kv) млекопитающих Kvl.2 (Long et al., 2005), и полноразмерная структура ЛЗ канала, полученная методом крио-электронной микроскопии (Miyazawa et al, 2003; Unwin, 2005).

Нарушение функций JI3 и ПЗ ионных каналов может приводить к тяжелым неврологическим и наследственным заболеваниям (Bernard, Shevell, 2008). Молекулярные механизмы дисфункции ионных каналов к настоящему времени остаются не до конца изученными, что обусловлено, в частности,

недостатком данных об их структуре. Ионные каналы составляют третью по величине группу мишеней для фармацевтических препаратов (Оуепп^оп 2006), что во многом также обусловлено ограниченными структурными данными (\Vickenden е1 а1., 2012).

Известно, что трансмембранная часть гомологична у многих эукариотических каналов (более 20% гомологии). В связи с этим, актуальной задачей является моделирование неизвестной структуры каналов согласно опубликованным данным о гомологах и исследование поровых интерьеров и специфических участков для выявления универсальных молекулярных механизмов активности ионных каналов.

Целью данной диссертационной работы явилось исследование структурных и динамических свойств ЛЗ и ПЗ ионных каналов на примере моделей серотонинового 5-НТЗ рецептора человека и калиевых каналов Ку2.1 и КуЮ.2 человека.

Исходя из поставленной цели, были сформулированы следующие основные задачи:

1. Моделирование структур эукариотических катионных каналов (на примере 5-НТЗ рецептора и Ку каналов: Ку2.1, КуЮ.2).

2. Анализ динамики конформационных изменений канала Ку2.1 и 5-НТЗ рецептора.

3. Структурно-динамическое сравнение селективности катионных каналов с различной симметрией.

Научная новизна и практическая значимость работы. В данной диссертационной работе с помощью комплексного метода моделирования впервые были построены модели ЗБ структур Ку2.1 и Ку10.2 каналов и серотонинового 5-НТЗ рецептора в разных конформациях. Исследуемые каналы, до настоящего времени не были кристаллизованы, и их атомная структура не была получена.

На основе анализа физических и динамических свойств моделей в разных

конформациях впервые были получены важные структурные данные, о селективности и ^информационных переходах у каналов с различной симметрией (пентамерные и тетрамерные). Впервые были продемонстрированы общие структурные закономерности формирования интерьера поры у пентамерных и тетрамерных ионных каналов. Построенные модели каналов могут служить структурной основой при планировании экспериментов по сайт специфическому мутагенезу и для дальнейшего уточнения структурно-функциональных особенностей ионных каналов. Результаты исследования в перспективе могут стать основой для разработки фармацевтических препаратов нового поколения с заданной активностью и селективностью и минимальным числом побочных эффектов, а также для теоретических исследований в области строения мембранных белков и белок-белковых комплексов.

Построенные модели ПЗ калиевых каналов нашли практическое применение при интерпретации карт электронной плотности, рассчитанных по проекциям при проведении структурных исследований методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) (Соколова с соавт., 2012).

Достоверность результатов диссертации обеспечивается использованием универсальных законов и уравнений классической и квантовой механики, проведением тестовых расчетов систем. Результаты моделирования пространственной структуры ионных каналов согласуются с известными экспериментальными данными, полученными Соколовой О.С. и Гризель A.B. методом ПЭМ в лаборатории структурной биотехнологии на кафедре Биоинженерии Биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова (Соколова с соавт., 2012), что говорит об адекватности построенных моделей. В связи с этим результаты работы являются достоверными, а сделанные на их основе выводы научно обоснованными.

Апробация работы. Основные результаты и положения диссертации были представлены и обсуждены на XVI, XVII, XVIII и XIX международных

научных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (2009, 2010, 2011, 2012 - Москва); II III и IV студенческих симпозиумах по биоинженерии (2007, 2008, 2009 - Москва); XV, XVII, XVIII международных конференциях «Математика. Компьютер. Образование» (2008, 2010 - Дубна, 2011 - Пущино); XVII и XVIII Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (2010, 2011- Москва); XXIII Международной зимней школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (2011 - Москва); Межфакультетском и междисциплинарном семинаре биологов, математиков, физиков и химиков по перспективным направлениям науки, включая моделирование нано- и биоструктур (2009 - Москва); Международной Интернет-конференции «Молекулярные механизмы шизофрении» (2011); Международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (2011 - Пущино); 36-м конгрессе Международного союза биохимиков и молекулярных биологов (2011 - Турин); Международной конференции по молекулярной вычислительной биологии и биоинформатике (2011-Москва); Школе-конференции молодых ученых «Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины» (2011 - Москва); XXIII Международной зимней школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (2011 - Москва); IV Всероссийском научно-практическом семинаре молодых ученых с международным участием «Современные проблемы медицинской химии. Направленный поиск новых лекарственных средств» (2012 - Волгоград); семинаре кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (2012 - Москва).

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 26 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих перечню ВАК РФ — 4, тезисов докладов и материалов конференций — 22.

Личный вклад автора состоит в обзоре имеющихся данных литературы относительно структурных особенностей и филогении ионных каналов,

моделировании структур каналов, проведении расчетов, обработке, анализе и систематизации результатов, подготовке статей и докладов на конференциях.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста, состоит из: введения, трех глав (Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты исследования и их обсуждение) и Выводов. Работа проиллюстрирована 46 рисунками и 3 таблицами. Библиографический указатель содержит 243 источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во Введении сформулированы основные цели и задачи исследования, и обоснована его актуальность и практическая значимость. Глава I представляет собой обзор литературы. Он посвящен современным данным о структурных особенностях ПЗ и JI3 ионных каналов, конформационных перестройках при активации, а также их филогении и эволюции. Особое внимание уделено строению и функциям каналов Kv2.1, Kvl0.2 и 5-НТЗ рецептора, изучаемых в данной работе.

В Главе II дано описание методов и расчетных программ, использованных в работе. В Главе III приведены полученные результаты и их обсуждение, которые далее будут кратко изложены.

Моделирование структуры пентамерных и тетрамерных ионных каналов в открытой и закрытой коиформаииях

Моделирование структур проводили по разработанному нами алгоритму (рис.1), который включал несколько этапов. На каждом этапе моделирования применяли соответствующее программное обеспечение: поиск шаблона проводили с помощью сервера SWISS-MODEL (Schwede et al., 2003), выравнивание при помощи программы T-Coffee (Notredame et al., 2000), построение моделей проводили с использованием программы MODELLER (Fiser et al., 2003), стабильность построенных молекулярных моделей в

динамических условиях проверяли методами молекулярной динамики (МД) с использованием программных пакетов NAMD (Phillips et al., 2005) и GROMACS (Hess et al., 2008). При этом для оптимизации моделирования использовали метод фиттинга, который позволяет улучшить качество атомарной модели благодаря соотнесению данных моделирования и ПЭМ (Pandurangan, Topf., 2012).

Карта электронной плотности

о X

s re

X m

X s

Ф ш

5 Я!

« о.

s 3

, <2

Поиск шаблона

—Ч._

Выравнивание

Построение

модели

•' * "'

Фиттинг модели

ж

мд

Protein Data Bank

Рис. 1. Этапы алгоритма комплексного метода моделирования структур.

В ходе моделирования в качестве шаблонов использовали следующие структуры, опубликованные в базе данных PDB: ацетилхолиновый рецептор AChR Torpedo marmorata (коды pdb 2BG9 и 4AQ9 для моделирования 5-НТЗ рецептора закрытой и открытой конформаций соответственно), разрешение структур составило 4 А для закрытой и 6,2 Á для открытой. Структура калиевого канала Kvl.2 Rattus norvegicus (код pdb 2А79) служила в качестве шаблона для моделирования структуры канала Kv2.1 открытой конформации, разрешение структуры 2,9 Á). Трансмембранная часть сАМР-зависимого

канала MIotiKl Mesorhizobium loti (код pdb 2ZD9 разрешением структуры 4 Â) использовалась для моделирования канала Kvl0.2. Для моделирования цитоплазматических доменов Kvl0.2 в качестве шаблонов были выбраны следующие ЯМР структуры: N-концевые домены калиевого канала человека herg и бактериальный сАМР-зависимый канал М1оК1(коды pdb: 2L0W для моделирования N-концевых доменов PAS и РАС, 2KXL для cNBD домена).

Данные шаблоны были взяты из базы данных Protein Data Bank (Burley, 2013). Шаблон для моделирования закрытой конформации канала Kv2.1 (Delemotte et al., 2011) был любезно предоставлен лабораторией теоретической химии и биохимии под руководством проф. М.Тарека университета Нанси, Франция. Степень гомологии между шаблоном и объектом составила более 30%, что соответствует достаточно высокому уровню достоверности моделирования.

Построенные модели представляют собой гомомеры пирамидальной формы пятилучевой (пентамерный 5-НТЗ рецептор) и четырехсторонней (тетрамерные каналы Kv2.1, Kvl0.2) симметрии (рис. 2, таблица 1). Внешний диаметр Kv2.1 составил 8 нм, его высота - 8 нм. Внешний диаметр Kvl0.2 -12 нм, высота - 9,5 нм. Для пентамерного 5-НТЗ рецептора соответствующие величины составили 8 нм и 11 нм.

Внешняя поверхность трансмембранной части ПЗ и JI3 каналов преимущественно гидрофобна. Внутренняя поверхность поры моделей гидрофильна. Изученные ионные каналы при нормальном рН имеют отрицательный суммарный заряд. При этом значительная часть отрицательно заряженных остатков шутаминовой и аспарагиновой кислот локализованы во внемембранной части и взаимодействует с растворенными ионами (таблица 1). При функционировании каналов гидратная оболочка проходящих ионов частично разрушается за счет взаимодействия иона с зарядовыми центрами внутри канала.

Таблица1. Построенные модели тетрамерных Ку каналов Ку2.1, Ку10.2 и пентамерного 5-НТЗ рецептора, а. Открытый канал Ку2.1, выделены поровый домен (РО), УЭЭ, сферами показаны кислороды карбонильной группы аминокислотных остатков (а.о.), участвующих в образовании солевых мостиков, селективный фильтр (ЭР), где сферами выделены кислороды карбонильной группы селективного фильтра, и сегмент Э4. б. Открытый пентамерный 5-НТЗ рецептор, выделены петля С и сайт связывания с лигандом. в,г Внемембранные домены канала Ку10.2 и 5-НТЗ рецептора, сферами выделены отрицательно заряженные аминокислотные остатки, для 5-НТЗ рецептора показаны цистеиновая петля (СУ8-СУ8) и петля С. д, е Мембранные домены канала Ку2.1 (2 субъединицы) и 5-НТЗ рецептора (4 субъединицы), сферами выделены отрицательно заряженные а.о., гидрофобные а.о. визуализированы в виде каркаса.

Внемембранные домены

тетрамерный канал Ку10.2

РАЭ домен

домен

Мембранные домены

тетрамерный канал Ку2.1

Открытый канал

тетрамерный канал Ку2.1

5-НТЗ рецептор

с

Аналогичный эффект наблюдался и при моделировании калиевых Kv каналов, механочувствительных каналов, грамицидина А и других каналов (Maffeo et al., 2012). Кислороды карбонильной группы селективного фильтра (СФ) как открытой, так и закрытой конформации каналов Kv2.1 и Kvl0.2 ориентированы вовнутрь поры, что важно для проведения ионов и стабильности порового домена (Long et al., 2005). Потенциал-чувствительный домен (voltage sensing domain, VSD) ПЗ ионных каналов содержит солевые мостики, что дополнительно стабилизирует структуру и важно при активации канала (Delemotte et al., 2010).

Модель надмембранного домена 5-НТЗ рецептора сохраняет цистеиновый мостик, что также играет важную роль при активации (Cheng et al., 2006).

В целом, моделирование каналов Kv2.1, Kvl0.2 и 5-НТЗ рецептора привело к согласованным результатам в соответствии с имеющимися экспериментальными данными о механизмах активации и кинетике переноса ионов (Long et al., 2005; Cheng et al., 2006; Delemotte et al., 2010; Durdagi et al., 2012). Построенные нами модели трансмембранного домена каналов Kv2.1 и Kvl0.2 хорошо соответствуют по размерам картам электронной плотности, соответствующих каналов, полученных методом ПЭМ (рис. 2). Эксперименты по электронной микроскопии проводились Соколовой О.С. и Гризель А.В. (Соколова с соавт., 2012).

Структурные и динамические свойства тетрамерных ионных каналов в разных конформациях на примере канала Kv2.1.

Активация потенциал-чувствительных Kv каналов происходит при деполяризации мембраны, когда мембранный потенциал исчезает. Из-за отсутствия методов, позволяющих сохранить трансмембранный потенциал при приготовлении образцов каналов для изучения методами рентгеноструктурного анализа или спектроскопии ядерного магнитного

резонанса, в настоящее время опубликованы кристаллические структуры только открытых ПЗ каналов (Jensen et al., 2012). Структура неактивного (закрытого) канала в высоком разрешении и подробности цикла активации /инактивации может быть изучена методами молекулярной динамики (МД).

Рис. 2. Фитгинг построенных моделей в карты электронной плотности, полученные с помощью электронной микроскопии, а) Канал Kvl0.2. б) Канал Kv2.1. Каналы показаны с внемембранной стороны. Отмечены домены VSD и PD. Для визуализации полученных трехмерных структур и создания рисунков использовали программу Chimera (Goddard 2007).

Мы проводили вычислительные исследования моделей канала Kv2.1, встроенных в мембрану в открытой и закрытой конформации, для определения фрагментов белка, участвующих в конформационных изменениях при активации канала. Траектории МД позволили провести детальное сравнение динамики открытой и закрытой структур и оценить конформационную подвижность при активации ионных каналов на атомном уровне. Траектории МД рассчитывали в программном пакете NAMD (Phillips et al., 2005).

В моделировании участвовали следующие системы: построенные по гомологии модели Kv2.1 канала в открытом и закрытом состояниях были помещены в модельный бислой эукариотической фосфолипидной мембраны,

12

состоящей из пальмитоилолеоилфосфатидилхолиновых (ПОФХ) липидов. Для оценки стабильности и структурных изменений моделей Ку2. 1 в разных конформациях рассчитывали среднеквадратичное отклонение (ИМБО) координат Са-атомов относительно начального положения Са-атомов каналов (рис. 3). Было показано, что выход ЯМЯО на плато происходит после 10 не динамики для открытой конформации и 20 не для закрытой. Это свидетельствует о наибольшей стабильности открытой структуры.

Для изучения конформационных изменений и выделения наиболее подвижного домена, 1Ш8Б рассчитывали не только для целого канала , но для его порового региона и УБЭ. ЯМБО целого белка флуктуировал в пределах от 0,27 до 0,37 нм (в открытом состоянии) и от 0,37 до 0,55 нм (в закрытом состоянии). В свою очередь поровый участок оказался наиболее стабилен, особенно у открытой структуры. Минимальное значение его ЯМБО составило 2 А (рис. 3). Это может быть обусловлено тем, что в открытом состоянии пора канала заполнена ионами К+ (Шайтан с соавт., 2012). С другой стороны, значительные структурные изменения были показаны в ходе молекулярной динамики для УББ доменов. Максимальные значения ЯМБЮ -4 А в открытом состоянии и 6,7 А в закрытом состоянии. Эти данные свидетельствуют о большей подвижности УББ доменов по сравнению с поровыми участками в обеих системах.

В ходе динамики было показано, что при открытии канала УББ домен значительно изменяет положение (в направлении во внеклеточное пространство в пределах 4-6 А и наружу от оси поры в пределах 8-11 А) (рис. 3).

А ' »О

Открытый канал Kv2.1

«< 4.00 о

г

3.00

4.00

а i

к 3.00

■5 10 15 20 25 30 35 40

Время, не

Закрытый канал Kv2.1

30 40

Время, не

Целый — канал

= VSD

Рис. 3. RMSD С-альфа атомов для целого канала, порового домена (PD) и домена чувствительного к потенциалу (VSD) (черные, серые и двойные черные линии, соответственно) канал KV2.1 в открытой (А) и закрытой (Б) конформации.

Спирали Sl, S2, S3 и S4 вращаются по часовой стрелке - канал переходит из закрытой конформации в активированную конформацию. При этом спирали S3 и S4 двигаются вместе и имеют аналогичные смещения. Наибольшее движение в направлении во внеклеточное пространство и наружу от оси поры характерно для S4 сегмента. Эти данные хорошо согласуются с данными, полученными другими исследователями для химеры Kvl.2/ Kv2.1 (Jensen et al., 2012).

Структурные и динамические свойства пентамерного ионного канала в разных конформациях на примере 5-НТЗ рецептора.

Активация JI3 ионных каналов происходит в момент присоединения лиганда. Поэтому для изучения конформационной подвижности 5-НТЗ рецептора и роли различных факторов при активации проводили серию экспериментов, в которых изучали взаимодействие рецептора с лигандом. Расчет траекторий МД для систем 5-НТЗ рецептора и комплекса 5-НТЗ рецептора с лигандом проводили в программном пакете GROMACS (Hess et al„ 2008).

Рис. 4. (А) Модель 5-НТЗ рецептора и (Б) карман для связывания лиганда. Черным выделена отдельная субъединица. Подписаны важные для связывания лиганда петли.

Ранее было показано (Цп\ут, 2005), что сайт связывания с лигандом ЛЗ канала в надмембранной части (рис. 4) образован петлями А, В, С одной субъединицы й Е, Р другой субъединйцы.

При структурном сравнении разных конформаций надмембранных доменов было показано, что для структуры открытой конформации

15

характерен отгиб С-петли, поэтому карман связывания лиганда открыт (рис. 5А). Петля С модели серотонинового 5-НТЗ рецептора закрытой конформации прижата к поре. Следовательно, петля С претерпевает большое относительное смещение при присоединении лиганда.

Время, ПС

-Расстоянивмежду фиксированными

Рис. 5. Структурное сравнение моделей надмембранных доменов 5-НТЗ рецептора в разных конформациях: черным выделена открытая конформация, серым - закрытая. Структурное сравнение различных конформаций проводили в программе СЕ (Shindyalov, Bourne 1998). (А). Динамика петли С при взаимодействии с серотонином (Б).

В ходе динамики 5-НТЗ рецептора с серотонином С-петля изменила конформацию и приняла открытое положение: расстояние между петлей С и серотонином увеличилось, а расстояние между петлей С и фиксированными атомами изменилось, что подтверждает движение петли (рис.5 Б). При исследовании динамики комплекса 5-НТЗ рецептора с серотонином было показано, что стабилизация С-петли в открытом состоянии обусловлена реорганизацией водородных связей, удерживающих С-петлю в открытом положении.

Важную роль при взаимодействии с лигандом играют стекинг-взаимодействия: ароматические остатки кармана связывания (W85, Y148, W178) и серотонин лежат друг над другом в стопке, что обеспечивает дополнительную стабилизацию комплекса (Spier et al., 2000). Стабильность комплекса рецептора с лигандом изучали с помощью оценки изменения расстояний между молекулой серотонина и аминокислотными остатками

участвующими в связывании. Было показано, что расстояние для а.о.

W85, Y148, W178 изменяются в течение первых 1500 пс динамики и далее остаются стабильными в пределах 3,4 до 12 А. Это свидетельствует о том, что в течение 1500 пс происходит релаксация лиганда в комплексе. Далее комплекс остается стабильным в течение последующей динамики (рис. 6).

1.5

S

о.5

х г

к

0

1 о «

О-

-0.5 -1

Время, пс

■— Расстояние между серотонином и W85 первой субъединицы

—Расстояние между серотонином и У148 первой субъединицы

" ™ Расстояние между серотонином и W178 второй субъединицы

Рис. 6. Динамика сайта связывания с лигандом в комплексе с серотонином.

При этом величина расстояний соответствует длине стекинг-взаимодействий у белков: от 3,4 до 12 А. В течение первых 800 пс петля С смещается: начинается перестройка остатков, непосредственно взаимодействующих с лигандом. Далее конформация белка приходит в равновесное состояние.

В результате исследования динамики 5-НТЗ рецептора с серотонином было показано, что стабилизация комплекса рецептора с лигандом обусловлена реорганизацией водородных связей и стекинг-взаимодействиями. Сравнительный анализ динамик пентамерных и тетрамерных ионных каналов в разных конформациях проявил следующую закономерность: при активации открытая конформация канала является термодинамически более выгодной, чем закрытая. Это справедливо как для ЛЗ, так и для ПЗ ионных каналов.

Структурно-динамические особенности селективности катионных каналов с различной симметрией.

Построенные модели ПЗ и JI3 ионных каналов с различной симметрией позволили выявить общие закономерности и молекулярные механизмы их функционирования. Для изучения проведения ионов через пентамерные и тетрамерные ионные каналы было проведено сравнительное изучение строения поры каналов в разных конформациях на примере 5-НТЗ рецептора и канала Kv2.1

Строение PD пентамерного 5-НТЗ рецептора представлено пятью М2 спиралями, параллельными оси поры (таблица 1). Селективный фильтр открытой конформации 5-НТЗ рецептора проницаем для одновалентных и двувалентных катионов.

Четыре сегмента в составе PD тетрамерного канала Kv2.1 располагаются под углом относительно оси поры канала (рис. 7). Подобное расположение формирует узкий селективный фильтр с внеклеточной стороны и "вестибюль" с внутриклеточной стороны, позволяющий молекулам воды вместе с растворенными ионами проникать в открытый канал и взаимодействовать с канальным окружением, тем самым стабилизируя структуру (Шайтан с соавт., 2012). Согласно предложенному Jensen (Jensen et al., 2012) механизму "гидрофобной инактивации", при открытии канала пространство поры расширяется, что позволяет молекулам воды проникать в гидрофильную пору и стабилизировать структуру канала, взаимодействуя с канальным интерьером. Закрытие канала сопровождается сужением поры, что приводит к дегидратации порового пространства. Данный механизм является универсальным для ионных каналов (Jensen et al., 2010).

Для выделения закономерностей селективности ионных каналов мы рассчитывали эффективный радиус поры и выделили селективные ворота исследуемых каналов с помощью программы HOLE (Smart et al., 1996). Для

5-НТЗ в открытой конформации минимальный радиус поры, сформированной остатками Т279, составил 2.3 А. Для тетрамерного Ку2.1 самая узкая область канала открытой конформации имела радиус 1.5 А и также оказалась образована остатками Т192.

Подобное строение каналов имеет важное физиологическое значение: при передаче нервного импульса в химических синапсах важна скорость генерации электрического потенциала на постсинаптической мембране. Широкая пора ЛЗ каналов позволяет быстро транспортировать ионы одинакового заряда внутрь клетки и менять потенциал мембраны, что, в свою очередь, активирует ПЗ каналы. При деполяризации мембраны активируются ПЗ Ку каналы, которые, транспортируя К+ из клетки, вызывают реполяризацию мембраны, приводящее к снижению возбудимости нервной клетки.

ток ионов внеклеточное пространство

Ф

Пора канала 5-НТЗ рецептора Пора канала КУ2.1

Т

4

р % » | • • Селективный

о ¡¡р

I

фильтр

££ ^

Селективный фильтр

4 " -.* Ч , { § ,

С'- Л • ф Ж I

Е * аМ" гжж

Внутриклеточное к Ток11онов пространство

Рис. 7. Визуализация эффективного радиуса поры канала Ку2.1 сегмент) и 5-НТЗ рецептора (М2 спираль) в открытой конформации (вид сбоку). Выделены а.о., определяющие селективность ионных каналов и участвующие в проведении ионов. Слева находится модель целого в 5-НТЗ рецептора открытом состоянии. Ток ионов указан стрелками.

Сравнение фрагментов белка, обрамляющих пору (ТМ2 для 5-НТЗ рецептора и Б6 для Ку2.1) показало, что катион, попадая в канал, встречает в устье поры отрицательно заряженные а.о. Минимальный радиус поры и селективный фильтр соответствуют Т у всех исследованных каналов. На выходе катион также встречают отрицательно заряженные а.о. При этом последовательности с пролином Р-Т и Р-Р имеют важное структурообразующее значение: они создают изгиб поровой спирали, тем самым формируя "вестибюль" для молекул воды (рис.7) .

Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей поровых спиралей ЛЗ ионных каналов и фрагментов порового домена ПЗ ионных каналов показало, что Т оказывается консервативным для исследуемых групп каналов и создает стерический барьер для проходящих ионов (Таблица 2).

Таблица 2. Выравнивание аминокислотных последовательностей поровых доменов ЛЗ и ПЗ каналов. Черным выделены консервативные аминокислотные остатки (а.о.), создающие интерьер поры. Серым выделен фрагмент с пролином: Р-Т(У,Ь,8,Р). В скобках указана катион (+) или анион (-) проводимость для ЛЗ каналов.

бИС ( + ) ЕЬ1С(+) АСЬЯ{+) 5-НТЗА(+) 5-НТЗС ( + ) вАВИА(-)

сьуги-)

КУ2. 1 , СФ КVI . 2 , СФ М1оКI,СФ КVI О . 2 , СФ КУЮ . 1 , СФ

КУ2.1, КУ1.2, М1оКI,

Э6 Бб Эб

КуЮ . 2 , Бб КуЮ . 1 , ' Э6

РКЗТЗУВ^^^УУЗтНгАНГАРдГЬУ^ЭДрКТ ИЬЕЗРЗкЩЬ0дЗРдЬмЯтУУАУАГУТЗ!дГЬГ ^ зсЦЩ^Дьэ I ЗУЬДЗЬДурььуху^Ь I ьЯсУЭУРЫ ГУБИТЬ ^"ЗЛаАРПК ТдььЯсУКУРЬЬМММдЫ,

РТБ5 РРЫ< РАЕ!

ЫЕЕЗУрАЩТУРСУдТУЦТМТТЬЗ I ЗА^ЭЬ ЫМРАА[Р АДУС ЬС I Дт УцТМТ Т О Б Я СЗ^А 3 Ь

ТТСРСЫ

ТУБУСО

ТТСУСР

Т

ТЭУСРСЫ

1А 1У

|т I

IА ГА

РКТЬЬЗЗГУС гаЕИТ.ут а ртт хНЯЯтуагаИЯт.т т а Р о эр АЩУ Ь АЗаумм эфг Р Т Т ИУЗЗм Р Э VАМММ рзтдпдзт.РАУАтммтдд

РИГ, РЭТ РАТ

РАЗ РКУ РКУ

РТТ РКТ рог РТТ

ргт

ХР|1 гмгз^у^док |РУР|У I N Р N У Р У нЗЭт

|ЬУАТГЕ{ЗЯУТТ ТРОО |ЬУАТ I Р^ДУТТ'ТРОО

Из данных литературы (МоогЬоизе е1 а!., 2001) известно, что зарядовая

селективность (аниона по сравнению с катионом) для JT3 каналов создается с помощью а.о. в устье канала. Множественное выравнивание, проведенное нами, показало наличие консервативных заряженных колец D и Е также и в устье каналов Kv. Возможно, молекулярный механизм обеспечения зарядовой селективности у Kv каналов устроен схожим образом.

Кроме этого, анализ выравнивания Kv каналов показал наличие консервативного G в петлях между S4, S5 и S6 канала Kv2.1 и Kvl.2. Известно, что G может производить шарнирные движения, что придает этим регионам подвижность (Labro et al., 2008). Из-за отсутствия боковых цепей, G имеет большую степень свободы вращения вокруг двугранного угла фи и пси, что приводит к большей конформационной подвижности в области S4 спирали при активации ПЗ канала.

Анализ динамики движения катионов показал наличие неравномерного движения иона в поре, поскольку в ней наблюдались зоны торможения (рис. 8). Катионы К+ задерживаются в области Т в открытой конформации.

Время, пс

8

-закрытый канал KV2.1

6 ,

| -открытый канал KV2.1

5 -

га закрытый канал 5-НТЗ

4 я рецегттора

Í открытый канал 5-НТЗ

3 g рецептора

о

-> о 1 О -1

Рис.8. Движение иона К+ через пору ПЗ и ЛЗ каналов в разных конформациях.

Области отрицательно заряженных аминокислотных остатков Е, О выполняют роль кулоновского фильтра для ионных каналов в закрытой конформации. Для каналов открытой конформации. данные аминокислотные остатки оказывают влияние на ионную селективность канала и на разрыхление гидратной оболочки катионов.

Таким образом, результаты исследования структурно-динамических особенностей селективности катионных каналов с различной симметрией, полученные при использовании комплексного подхода к моделированию .структур и метода МД, свидетельствуют о том, что существуют некоторые общие структурные закономерности функционирования эукариотических ионных каналов с различной симметрией. В ходе моделирования было показано, что консервативная последовательность с пролином Р-Т для JI3 и Р-Р для ПЗ каналов создает изгиб спирали канала, а консервативный Т (для канала Kv2.1 - Т192 и для реептора 5-НТЗ - Т279) соответствует самой узкой области поры. Селективность ПЗ и JI3 ионных каналов определяется областью колец, сформированных консервативными остатками Е, D и стерическим фактором, образованным консервативным Т. Комбинация этих факторов и определяет селективность каналов.

Данные различных работ, представленных в научной литературе, подтверждают факт, что селективность канала по отношению к катиону и аниону для большинства ионных каналов определяется зарядовыми особенностями интерьера поры. Так, отсутствие компенсации положительно заряженных а.о. в устье анион-проводящих каналов глицинового рецептора и рецептора гаммааминомасляной кислоты отвечает за анионную проводимость (Moorhouse et al., 2001). Для ПЗ и катион проводящих ЛЗ каналов селективность определяет наличие отрицательно заряженных а.о. в устье каналов (Renart et al., 2012; Corryet al., 2012; Cymes et al., 2012). Экспериментальные исследования родственных ионных каналов обнаруживают консервативные аминокислотные остатки и сходные элементы структуры (Absalom et al., 2009; Connolly et al., 2004).

Результаты, полученные в настоящей диссертационной работе, согласуются с данными литературы и расширяют фундаментальное представление о закономерностях формирования специфической активности ионных каналов с различной симметрией.

выводы

1. Моделирование динамики построенных по гомологии моделей структур пентамерных и тетрамерных ионных каналов (серотонинового 5-НТЗ рецептора и Kv каналов: Kv2.1, Kvl0.2) приводит к согласующимся с экспериментальными данными об активации и кинетике переноса ионов результатам.

2. Установлено, что при открытии Kv2.1 канала сенсор потенциала VSD значительно изменяет свое положение, двигаясь в направлении во внеклеточное пространство в пределах 4-6 А и наружу от оси поры в пределах 8-11 А.

3. Показано, что при образовании комплекса 5-НТЗ рецептора с лигандом происходит отгиб петли С на 3-4 А, стабилизация комплекса обусловлена реорганизацией водородных связей и стекинг-взаимодействиями.

4. Выявлены общие структурные закономерности функционирования эукариотических катионных каналов с различной симметрией. Показано, что селективность катионного канала определяется областью колец, сформированных консервативными остатками Е и D и стерическим фактором, образованным консервативным Т.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в журналах, соответствующих перечню ВАК РФ:

1. Попинако A.B. Молекулярное моделирование и динамика комплексов серотонинового 5-НТЗ рецептора с лигандами // Компьютерные исследования и моделирование, 2011, Т. 3, № 1, стр. 329-334.

2. Попинако A.B.. Левцова О.В., Антонов М.Ю., Николаев И.Н., Шайтан К.В., - Структурная и динамическая модель серотонинового 5-НТЗ рецептора человека. Сравнительный анализ структуры канальной части пентамерных лиганд-зависимых ионных каналов // Биофизика, 2011, Т. 56, №6, стр. 1111-1116.

3. Соколова O.e., Шайтан К.В., Гризель A.B., Попинако A.B.. Карлова М.Г., М.П.Кирпичников. Трехмерная структура потенциалзависимого человеческого канала KvlO.2 по данным электронной микроскопии макромолекул и молекулярного моделирования // Биоорганическая химия, 2012, Т.38, стр. 177-184.

4- Попинако A.B.. Соколова О.С. Как предсказать неизвестную структуру белка // Природа, 2012, № 7, стр. 33-38.

Статьи в изданиях, не входящих в перечень ВАК РФ:

5. Соколова О.С., Попинако A.B. Структурные исследования в постгеномную эру - решение уравнения с несколькими неизвестными // сборник научно-популярных статей-победителей конкурса РФФИ за 2011 год "Биология и медицинские науки", 2012, стр. 167-175.

Тезисы докладов и материалы конференций:

6. Попинако A.B.. Антонов М.Ю., - Изучение лиганд-связывающего домена серотонинового 5-НТЗ рецептора методом молекулярной динамики. Research of Ligand -binding Domain of Serotonin 5-HT3 Receptor Using Molecular Dynamics Method // Сборник трудов Десятой Международной научно-практической конференции Высокие технологии, фундаментальные исследования, Санкт-Петербург, 2010, Т. 4, стр. 45-47.

7- Попинако_A.B.. Шайтан К.В. Сравнительный анализ динамики

функционирования пентамерных и тетрамерных структур ионных каналов. Вестник Волгоградского государственного медицинского университета// 2012, стр.161-162.

8. Попинако A.B. Моделирование 5-НТЗ рецептора методом по гомологии. Сборник тезисов второго студенческого симпозиума по биоинженерии М.: МГУ, 2007, Т. 1, стр. 19-20.

9. Попинако A.B.. Терёшкина К.Б., Шайтан К.В. Молекулярная динамика надмембранной части рецептора 5-НТЗ, полученной на основании гомологии. Сборник тезисов XV-ой международной конференции Математика. Компьютер. Образование. Ижевск: Научно-издателский центр «Регуляторная и хаотичная динамика», 2008, стр. 204.

10. Попинако A.B. Исследование серотонинового 5-НТЗ рецептора с помощью метода управляемой молекулярной динамики. Сборник тезисов третьего студенческого симпозиума по биоинженерии. М.: Макс Пресс, 2008, Т. 1, стр. 32-34.

11. Попинако A.B. Исследование серотонинового 5-НТЗ рецептора с помощью метода молекулярной динамики. Сборник тезисов четвертого студенческого симпозиума по биоинженерий. М.: Соцветие Красок 2009, Т. 1, стр. 49-51.

12. Попинано A.B. Исследование серотонинового 5-НТЗ рецептора с помощью метода молекулярной динамики. Сборник тезисов Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009», секция "Биология". М.: Макс Пресс, 2009, стр. 29-30.

13. Попинако A.B.. Левцова О.В., Шайтан К.В. Исследование серотонинового 5-НТЗ рецептора с помощью метода молекулярной динамики. Сборник тезисов XVII-ой международной конференции Математика. Компьютер. Образование. Ижевск: Научно-издателский центр «Регуляторная и хаотичная динамика», 2010, стр. 259.

14. Попинако A.B.. Левцова О.В., Шайтан К.В. Молекулярное моделирование структуры и функции серотонинового 5-НТЗ рецептора. Сборник тезисов XVII Российского национального конгресса "Человек и лекарство". 2010, стр.705-706.

15. Попинако A.B. Молекулярное моделирование структуры серотонинового 5-НТЗ рецептора. Сборник тезисов Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010», секция "Биология". Москва: Макс Пресс, 2010, стр. 33-34.

16. Попинако A.B.. Шайтан К.В. Сравнительный анализ структур пентамерных лиганд-зависимых ионных каналов. Сборник тезисов XVIII-ой международной конференции Математика. Компьютер. Образование. Ижевск: Научно-издателский центр «Регуляторная и хаотичная динамика», 2011, стр.56, 85.

17. Попинако A.B.. Шайтан К.В. Потенциал средней силы для канальной части серотонинового 5-НТЗ рецептора: анализ энергетических барьеров. Сборник тезисов XXIII-ой Международной зимней школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва, ИБХ РАН, 2011, стр.4.

18. Попинако A.B., Шайтан К.В. Изучение лиганд-связывающего домена серотонинового 5-НТЗ рецептора методом молекулярной динамики. Сборник тезисов XVIII Российского национального конгресса "Человек и лекарство". 2011, стр.627.

19. Большакова М.А., Попинако A.B.. Шайтан К.В. Сравнительный анализ структур и динамики катион проводящих лиганд-зависимых ионных каналов прокариот и эукариот. Сборник тезисов Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2011», секция "Биология". Москва: Макс Пресс, 2011, стр.21.

20. Попинако A.B. Исследование молекулярных патофизиологических механизмов шизофрении на примере различных мутаций серотонинового 5-НТЗ рецептора. Международная Интернет-конференция Молекулярные механизмы шизофрении. Казань: Казанский (Приволжский) федеральный университет, 2011, стр. 44-46.

21. Николаев И.Н., Попинако А.В.. Шайтан К.В. Исследование комплекса серотонин-серотониновый рецептор методами молекулярной динамики. Седьмые Курдюмовские чтения, Международная междисциплинарная научная конференция с элементами научной школы для молодёжи «Синергетика в естественных науках». 2011, стр. 244-247.

22. Попинако_А.В.. Антонов М.Ю., Шайтан К.В. Молекулярное

моделирование комплекса серотонинового 5-НТЗ рецептора с серотонином. Сборник трудов Международной конференции "Рецепторы и внутриклеточная сигнализация". 2011, стр. 710-714.

23. Popinako A.. Antonov М., Shaitan К. Structural features of serotonin 5-НТЗ receptors in native and modified forms. FEBS J. Wiley-Blackwell 2011 V. 278, S. 1, pp. 127. '

24. Popinako A., Homology Modeling and Comparative Analysis of Serotonin 5-HT3 Receptor Structure in Native and Modified Forms. The fifth International Moscow Conference on Computational Molecular Biology and Bioinformatics, MCCMB'll, Москва, 2011.

25. Попинако A.B.. Шайтан К.В. Поиск новых мишеней и моделирование перспективных лигандов лиганд-зависимых ионных каналов. Школа-конференция молодых ученых "Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины-2011". Москва, «Ваш полиграфический партнер» 2011, стр.54-56.

26. Попинако А.В. Сравнительный структурный анализ катион проводящих лиганд-зависимых ионных каналов. Сборник тезисов Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2012», секция "Биология". Москва: Макс Пресс, 2012, стр.25-26.

Соискатель Попинако А.В.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

а.о. — аминокислотный остаток МД - молекулярная динамика JI3 — лиганд-зависимые ПЗ — потенциал-зависимые

ПОФХ - пальмитоилолеоилфосфатидилхолиновые липиды ПЭМ - просвечивающая электронная микроскопия СФ — селективный фильтр

VSD - потенциал-чувствительный домен (voltage sensing domain) Kv — потенциал-зависимые калиевые каналы PD — поровый домен (pore domain)

RMSD - среднеквадратичное отклонению координат Са-атомов

Подписано в печать 05.03.2013 Формат 60x88 1/16. Объем 1.0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 1301 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Попинако, Анна Владимировна, Москва

Московский Государственный Университет имени М.В. Ломоносова

Биологический факультет Кафедра биоинженерии

На правах рукописи

04201354933

Попинако Анна Владимировна

МОЛЕКУЛЯРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ И СТРУКТУРНО-ДИНАМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КАТИОННЫХ КАНАЛОВ

Специальность 03.01.02 - биофизика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

доктор физ.-мат. наук, профессор Шайтан Константин Вольдемарович кандидат биол. наук ' Соколова Ольга Сергеевна

Москва-2013

Оглавление

Список сокращений...............................................................................................................4

Введение.................................................................................................................................5

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...........................................................................................7

1.1.Концепция ионных каналов...........................................................................................7

1.1.1.Общее строение ионных каналов...............................................................................7

1.1.2.Принципы наименования и классификации каналов...............................................9

1.1.3. Эволюция ионных каналов......................................................................................11

1.2.Тетрамерные потенциал-зависимые калиевые каналы: особенности строения и функционирования......................................................................................................................15

1.2.1. Структура и конформационные перестройки при активации ПЗ калиевых каналов..........................................................................................................................................15

1.2.2. Каналы Kv2.1,Kv 10.2..............................................................................................21

1.3.Пентамерные лиганд-зависимые каналы: особенности строения и функционирования......................................................................................................................25

1.3.1. Структура и конформационные перестройки при активации пентамерных J13 ионных каналов............................................................................................................................25

1.3.2. Серотониновый 5-НТЗ рецептор..............................................................................35

Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ................................................................................39

2.1. Комплексный метод моделирования атомной структуры ионных каналов...........39

2.1.1.Метод моделирования по гомологии........................................................................40

2.1.2. Фиттинг......................................................................................................................41

2.2. Метод молекулярной динамики..................................................................................44

2.2.¡.Физические основы метода МД................................................................................45

2.2.2 Валентные взаимодействия.......................................................................................46

2.2.3. Невалентные взаимодействия..................................................................................48

2.2.4 Численное интегрирование.......................................................................................50

2.2.5 Поддержание постоянной температуры...................................................................52

2.2.6. Поддержание постоянного давления.......................................................................55

2.2.7. Неравновесная молекулярная динамика.................................................................55

2.2.8. Понятие свободной энергии как потенциала средней силы. Метод Constraint force...............................................................................................................................................56

2.3. Анализ закрытой и открытой структуры канала. Программа HOLE......................58

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ........................59

3.1. Моделирование структуры пентамерных и тетрамерных ионных каналов в открытой и закрытой конформациях.........................................................................................59

3.1.1. Моделирование структуры пентамерных и тетрамерных ионных каналов в открытой и закрытой конформациях.........................................................................................59

3.1.2. Оптимизация моделирования...................................................................................60

3.1.3. Сравнительный анализ моделей ионных каналов с различной симметрией.......63

3.1.4. Особенности строения моделей каналов Кл/...........................................................67

3.1.5. Особенности строения моделей 5-НТЗ рецептора.................................................68

3.2. Структурные и динамические свойства тетрамерных ионных каналов в разных конформациях на примере канала Ку2. 1..................................................................................69

3.3. Структурные и динамические свойства пентамерного ионного канала в разных конформациях на примере 5-НТЗ рецептора............................................................................76

3.4. Структурно-динамические особенности селективности катионных каналов с различной симметрией................................................................................................................82

3.5. Потенциал средней силы для канала Ку2.1 и серотонинового 5-НТЗ рецептора: анализ энергетических барьеров................................................................................................87

Заключение...........................................................................................................................93

Выводы.................................................................................................................................96

Список литературы..............................................................................................................97

Приложение 1.....................................................................................................................110

Приложение 2.....................................................................................................................112

Список сокращений

а.о. - аминокислотный остаток МД - молекулярная динамика ММ - молекулярное моделирование

МДГФ - метод гибкого фиттинга с использованием молекулярной динамики JI3 - лиганд-зависимые ПЗ - потенциал-зависимые

ПОФХ - пальмитоилолеоилфосфатидилхолиновые липиды

СФ - селективный фильтр

УМД - управляемая молекулярная динамика

ТМ - трансмембранный

ЭМ - электронная микроскопия

ЯМР - ядерно-магнитный резонанс

AChBP - ацетилхолин связывающий белок (acetylcholine binding protein)

cNBD - домен, связывающий циклические нуклеотиды (cyclic nucleotide-binding domain)

СТА - С-концевой активацонный домен (C-terminal activation domain)

GABA - гамма аминомасляная кислота (aminobutyric acid)

ECD — внеклеточный домен (extracellular domain)

HGNC - Комитет Номенклатуры Генов Человека (The HUGO Gene Nomenclature Committee)

ICD - цитоплазматический домен

IUPHAR - Международный союз фундаментальной и клинической фармакологии

(International Union of Basic and Clinical Pharmacology)

Kv - потенциал-зависимые калиевые каналы (voltage-gated K+ channels)

LG1C - лиганд-зависимые ионные каналы (ligand-gated ion channel)

nAChR - никотиновый ацетилхолиновый рецептор (nicotinic acetylcholine receptor)

PD - поровый домен (pore domain)

RMSD - среднеквадратичное отклонение координат Са-атомов (root-mean-square deviation)

TMD - трансмембранный домен

VSD - потенциал-чувствительный домен (voltage sensing domain) WT - дикий тип (wild type)

Введение

Ионные каналы формируют большой функциональный класс интегральных трансмембранных белков и участвуют в регуляции разнообразных клеточных процессов (Jegla et al., 2009). Основной функцией ионных каналов является селективное перемещение ионов через мембрану. Наиболее распространенные и многочисленные семейства ионных каналов представлены группами лиганд-зависимых (JI3) и потенциал-зависимых (ПЗ) (Yu et al., 2004; Minor 2009) каналов, участвующих в межклеточной сигнализации. JI3 каналы генерируют электрический потенциал, превращая химические сигналы, приходящие к клетке, в электрические, а ПЗ каналы участвуют в распространении потенциала действия.

Структурное и функциональное разнообразие ионных каналов, а также их участие в работе жизненно важных систем организма обуславливает повышенный интерес к их исследованию. На сегодняшний день клонировано более 500 генов, кодирующих субъединицы ионных каналов как эукариотического происхождения, так и их бактериальных аналогов (Jegla et al., 2009). Однако сложная молекулярная архитектура эукариотических ионных каналов, в состав которых входят крупные внемембранные домены, часто является препятствием для структурных исследований экспериментальными методами (Bill et al., 2011). Так, на сегодняшний день известна лишь одна атомарная структура ПЗ калиевого канала (Kv) млекопитающих Kvl.2 (Long et al., 2005), и полноразмерная структура JI3 канала, полученная методом крио-электронной микроскопии (Miyazawa et al, 2003; Unwin 2005).

Нарушение функций JI3 и ПЗ ионных каналов может приводить к тяжелым неврологическим и наследственным заболеваниям (Bernard, Shevell, 2008; Kullmann, 2002; Kullmann, Hanna, 2002). Молекулярные механизмы дисфункции ионных каналов к настоящему времени остаются не до конца изученными, что обусловлено, в частности, недостатком данных об их структуре (Dabrowski et al., 2008, Terstappen, Reggiani, 2001). Ионные каналы составляют третью по величине группу мишеней для фармацевтических препаратов (Overington 2006; Hopkins, Groom, 2002), что во многом также обусловлено ограниченными структурными данными (Wickenden et al., 2012).

Известно, что трансмембранная часть гомологична у многих эукариотических каналов (более 20% гомологии). В связи с этим, актуальной задачей является моделирование неизвестной структуры каналов согласно опубликованным данным о гомологах и исследование поровых интерьеров и специфических участков для выявления универсальных молекулярных механизмов активности ионных каналов.

5

Целью данной диссертационной работы явилось исследование структурных и динамических свойств ЛЗ и ПЗ ионных каналов на примере моделей серотонинового 5-НТЗ рецептора человека и калиевых каналов Ку2.1 и Ку10.2 человека.

Исходя из поставленной цели, были сформулированы следующие основные задачи:

¡.Моделирование структур эукариотических катионных каналов (на примере 5-НТЗ рецептора и Ку каналов: Ку2.1, Ку10.2).

2. Анализ динамики конформационных изменений канала Ку2.1 и 5-НТЗ рецептора.

3. Структурно-динамическое сравнение селективности катионных каналов с различной симметрией.

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Ы.Концепция ионных каналов

В начале XIX века, в попытке осмыслить законы транспорта веществ в клетках, была принята концепция "водных пор", объясняющая пассивный вход и выход ионов из клетки согласно градиенту концентрации (Edwin, Jacyna, 1987; Kozuska, Paulsen, 2012). Современная концепция ионных каналов была утверждена спустя 200 лет (Brazier, 1988) после открытия существования ионов, клеточной мембраны и работы Ходжкина и Хаксли, показавшей всему миру структурные и функциональные основы действия ионных каналов (Hodgkin, Huxley, 1952). Метод локальной фиксации напряжения позволил Ходжкину и Хаксли определить кинетические основы активации для потенциал-зависимых Na + и К. + каналов в аксонах гигантского кальмара (Hodgkin, Huxley, 1952). Опытами Ходжкина и Хаксли было доказано, что ионные каналы являются водными порами, и процесс транспорта ионов может быть связан не только с градиентом концентрации, но и с мембранным потенциалом. Позднее Бернард Кац и соавторы (Katz et al. 1966) открыли кинетические правила для лиганд-зависимого никотинового ацетилхолинового рецептора (nAChR) в нервно-мышечном соединении лягушки.

За последние 50 лет сфера интересов относительно ионных каналов сместилась в область молекулярной и структурной биологии (Minor et al. 2009). Первые структурные данные (Cartaud et al. 1973) трансмиссионной электронной микроскопии о строении никотинового ацетилхолинового рецептора (nAChR) (рис. 11) открыли новую страницу в изучении ионных каналов. Последние десятилетия дополнили картину строения ионных каналов: электрофизиологические эксперименты (Hille, 2001), клонирование первых каналов (Nöda et al. 1986; Papazian et al., 1987), использование молекулярно-биологических методов, получение первой кристаллической структуры прокариотического калиевого ионного канала KscA (Doyle et al., 1998) a также последние данные о филогении и эволюции ионных каналов (Jegla et al. 2009) - все это привело к рождению идеи о модульной структурной организации ионных каналов (Capener et al., 2002; Minor, 2009).

1.1.1.0бщее строение ионных каналов

Общий принцип строения ионных каналов основан на модульной организации. Большинство ионных каналов имеют три важных функциональных модуля (Alberts et al., 2002; Minor, 2009):

1. Пора с узким селективным фильтром, проницаемая для ионов.

2. Ворота канала, предназначенные для гейтинга (открытия и закрытия) канала.

3. Сенсоры, реагирующие на внешние стимулы

Каждый модуль образован белковыми субъединицами (рис. 1), как правило,

обладающими радиальной симметрией. Фиксированное число субъединиц (от двух до шести) в подобной структуре обычно располагается вокруг центральной оси, формирующей пору для транспортируемых ионов.

хлорные каналы Р2Х рецепторы потенциал-зависимые семейства С1С каналы и рецептор

глатамата

лиганд-зависимые каналы

Рис.1. Схемы общего строения различных каналов: структура из 2, 3, 4, 5 и 6 субъединиц. Вид с внеклеточной стороны (по ^ШвсИ, 2002 с изменениями).

Число субъединиц связано с размером поры и ее селективными свойствами. Так, тетрамерные калиевые каналы, обладающие высокой селективностью к калию по сравнению с другими ионами, состоят из четырех одинаковых или высокогомологичных субъединиц, обрамляющих пору (Ооиаих, Масктпоп, 2005). Пентамерные каналы, соответствующие семейству лиганд-зависимых ионных каналов (ЛЗ), имеют большие поры, способные различать только положительные и отрицательные ионы, но не ионы одного зарядового класса. Поры гексамерных каналов, таких как щелевые контакты (коннексоны) позволяют ионам и небольшим молекулам растворителя перемещаться от клетки к клетке (Коуасв й а1., 2007). Аквапорины, состоящие из четырех субъединиц с порой в каждой, или "водные каналы", избирательно пропускают молекулы воды, позволяя ей поступать в клетку и покидать ее и в то же время препятствуя протоку ионов и других растворимых веществ.

Несмотря на широкое распространение "бочкообразной архитектуры" с радиально расположеными субъединицами вокруг центральной поры, среди ионных каналов это не единственное решение организации субъединиц. Существуют архитектуры ионных каналов с несколькими порами, например семейство димерных каналов (хлорные каналы

СЬС) с порой в каждой субъединице и тетрамерные аквапорины с пятью порами (.(сШзсЬ, 2002). Каждая субъединица данных ионных каналах создает свою проводимость (ОиЫег, 2007). Физиологические особенности подобных ионных каналов с несколькими порами мало изучены ЦегизсЬ, 2002).

Помимо того, что большинство ионных каналов состоят из нескольких субъединиц, идентичные субъединицы в составе канала образуют гомоолигомерные формы, а гетеромерные каналы представляют собой композиции из различных гомологичных субъединиц. При этом гетеромерные каналы часто имеют отличные от гомомерных функциональные свойства, что значительно увеличивает разнообразие структурных форм ионных каналов, продуцируемых геномом. Таким образом, сложность структурной организации (многообразие субъединиц, возможность формирования гетеротетрамеров внутри некоторых семейств и ассоциация с дополнительными белками) лежит в основе большого функционального разнообразия свойств и функций ионных каналов.

1.1.2.Принц1Шы наименования и классификации каналов

Система наименований ионных каналов на протяжении многих лет оставалась предметом постоянных споров. В литературе часто появлялись сообщения о клонировании "новых" генов ионных каналов, но по сути они дублировали данные других публикаций о клонировании того же гена под другим названием.

В настоящее время стандартизация названий генов ионных каналов основывается на решении конвенций Международного союза фундаментальной и клинической фармакологии (ШРНАЯ) и Комитета Номенклатуры Генов Человека (НвКС) (^1а й а1., 2009).

Обе конвенции в качестве уникального идентификатора используют гены ионных каналов, хотя имена ШРНАЛ, как правило, лучше отражают функции канала (например, Ку для К + потенциал-зависимых, ЬС1С для лиганд-зависимых каналов (СоШг^пс^е е1 а1., 2009)). Наименования ШРНАЯ удобны в классификации, и будут фигурировать в дальнейшем в тексте работы. Наименования НОГС более информативны, и в настоящее время широко распространены в сфере геномики, так как преследуют цель присвоения уникального имени, исходя из названия гена.

Следует отметить, что каждая система наименований имеет некоторые несоответствия с молекулярной филогенией, что часто приводит к ошибочному толкованию эволюционных отношений ионных каналов, особенно если на данный момент они малоизученны (в настоящем обзоре литературы эволюции ионных каналов будет посвящена отдельная глава).

Наименования HGNC классифицированы по генным семействам, но часто не дают различий по подсемействам генов. К примеру, HGNC обозначения для семейства генов восьми человеческих калиевых каналов KCNH1-8 (Ether-ago-go, сокращенно EAG — по схеме IUPHAR) не делают различия между тремя отдельными генами подсемейства: Eag (KCNH1, KCNH5), Erg (K.CNH2, KCNH6, KCNH7) и Elk (KCNH3, KCNH4, KCNH8).

Наименования IUPHAR указывают на функциональную роль ионных каналов, а не на филогенетическое происхождение. Следовательно, в тех случаях, когда различные семейства генов имеют функциональные сходства, наименования IUPHAR не отражают их филогенетические отношения. Так, наименования каналов Kvl до Kvl2 соответствуют трем генетически и структурно отличающимся семействам генов ионных каналов. Также нельзя сказать по IUPHAR наименованиям каналов Kvl0-12, принадлежащих EAG семейству, о их тесном родстве с циклическими нуклеотид-зависимыми катионными каналами. Таблицы соответствия наименований ионных каналов IUPHAR и HGNC представлены в работе (Yu, Catterall, 2004).

Создание единой унифицированн�